Doctorado en Ciencias

en Alimentos

2003
2008
 CENTRO DE INVESTIGACION
EN ALIMENTACION Y DESARROLLO, A.C.
CIAD
SEP-CONACYT-UNAM-IPN-GOBIERNO DE SONORA-GOBIERNO DE SINALOA-GOBIERNO DE CHIHUAHUA-SAGARPA

Evaluación de la incidencia y niveles de aflatoxina M1 en

leche materna de madres donadoras en la región centro-
sur de México
Dr. Adrián Hernández Mendoza

ahernandez@ciad.mx

Febrero 2015
Laboratorio de Química & Biotecnología de Productos Lácteos
Química del Sabor, Trazabilidad & Autenticidad de Alimentos
 LINEAS DE INVESTIGACIÓN

PROBIÓTICOS

CÁNCE
R

METABOLITOS XENOBIÓTICOS
 Origen de los xenobióticos en los alimentos
Xenobiótico (xeno = extraño y bio =vida)
Sustancia química (orgánica o inorgánica) ajena al organismo que en
concentraciones significativas causa anormalidades fisiológicas y/o
anatómicas
Intencionales: Accidentales

Xenobióticos en los alimentos

Naturales Generados durante el proceso

Valle-Vega y Lucas-Florentino, 2000; Iovdijová y Bencko, 2010
Xenobióticos alimentarios: Nivel de riesgo en la salud

Microorganismos patógenos
Biocontaminantes
Aditivos

OGM
Metales pesados

Contaminantes industriales
Micotoxinas
Residuos de pesticidas
Residuos de medicamentos

Toximet, 2012
Xenobióticos alimentarios: Riesgo en función del nivel de
exposición

Alto
Exposición aguda Exposición crónica
Microorganismos patógenos Micotoxinas
Ficotoxinas Contaminantes antropogénicos
Fitotoxinas Fitotoxinas
Micotoxinas Ficotoxinas
Contaminantes antropogénicos Microorganismos patógenos
Aditivos Aditivos
Pesticidas Pesticidas

Bajo

Toximet, 2012
 Principales micotoxinas presentes en los alimentos

Hongo Micotoxina

Aflatoxina
Aspergillus Sterigmatocistina Hígado
Ocratoxina Cancerígeno
Aflatoxinas
Tricotecenos S. reproductivo
Tricotecenos
Zearelanonas S. digestivo
Fusarium Fumonisinas Fumonisina
S. nervioso
Fusarina Ocratoxinas Pulmones
Moniliformina Zearalenona S. inmune
Patulina Riñones
Penicillium Citrinina S. endócrino
Ocratoxina
Alternariol
Alternaria
Ácido tennazónico
Claviceps Alcaloides

Guzmán de Peña, 1989; Antón y Lizaso 2001

 Aflatoxinas (AFs)

Aspergillus
R=H Aflatoxina B1
(A. flavus, A.
R = OH Aflatoxina M1
parasiticus)

• Estable a 250 ºC
• Carcinógeno para humano (Clase-1)

• Arma biológica

Aflatoxina G1

• Grado de Toxicidad:
B1 > G1 > G2 > B2 > M1

Buchi y Rea 1980; García, 2002; IARC 2010

 Aflatoxicosis

Vómito Hepatotóxica
• Aguda Dolor abdominal • Crónica Cancerígena
Edema pulmonar Teratogénica
Necrosis del hígado

Hipoplasia del timo

• Inmunosupresión
Reducción de IgA, IgG

Neoglucogénesis
• Efecto sobre el metabolismo
Metabolismo lipídico

Dwayne, 2001
 Alimentos susceptibles a contaminación por AFs
Granos, cereales
Frutos Secos
y especias

Productos derivados

Food and Environmental Hygiene Department Hong Kong, 2001; Filazi y Sireli, 2013
Población en riesgo a la exposición crónica
no controlada de AFs

Williams et al., 2004

 Concentración máxima permitida de AFs en alimentos de consumo humano

Leche paraCereales,
elaborar productos y leche
frutos secos tratada procesados
y productos con calor

País Organización
Organización Micotoxina
Micotoxina NivelNivel
max.max.
(g/L)
(g/Kg)

Codex AFM1 0.05

EUA FDA FDA AFM1 AFs totales* 0.5 20.0
NOM-184-SSA1-2002 AFM1 0.5

Comunidad Codex Fórmulas infantiles

AFB1 2.0
Europea AFs totales 4.0
País Organización Micotoxina Nivel max. (g/L)
México NOM-188-SSA1-20 AFs totales 20.0
Comunidad Codex AFM1 0.025
Europea

Suiza *AFs totalesLegislación

= AFB1+AFB Suiza AFM1 0.01
2+AFG1+AFG2

FAO, 2003; Official Journal of the European Union, 2004

 Exposición a AFs
Directa vía oral

Indirecta
Proceso de destoxificación de las AFs en rumiantes
 Ruta de las AFs en rumiantes

AFB1 AFM1
AFB1 AFM1

- Tejido
AFB1 AFM1
AFB1
- Glandulas AFB1
mamarias

AFM1
AFB1
Metabolitos
Bacteria

AFB1 AFM1 AFB1

AFM1

AFB1
AFM1
AFB1

AFB1 AFM1 AFB1 AFM1

AFM1

Modificado de Bavera, 2012

 Distribución de la AFs residual en el tejido de AFM1
rumiantes (15 min)

Tejido AFB1 AFM1

Cerebro 0.70 0.17
Vesícula biliar 1.98 8.52
Intestino 1.34 2.34
Corazón 0.43 1.73
Riñon 1.32 56.64
Hígado 7.12 6.09 AFM1
Pulmones 0.60 0.90 (4 h)

Glandula mamaria 0.60 24.5

Vaso 0.75 1.4
Lengua 0.87 1.74
Datos expresados en ng/g o ng/mL

Stubblefield, 1983
 piel pulmón
intestino riñón
pero

Absorción y distribución de AFs en humanos F

oxi
Metabolizació
Metabolizació
Hígado

Tejidos de metabolización

piel pulmón
intestino riñón

Hígado
Componentes
Componentesdel
Componentes delsitem
del sistem
sitem
Absorción pasiva Tejidos de metabolizació
Sangre
NADPH
Citocromo
Busby y Wogan, 1981; Chu, 1991
P450
 Biotransformación y destoxificación de AFs en humanos
Aflatoxina B1 Citocromo Metabolitos hidroxilados
p450 AFM1, AFQ1, AFP1
Citocromo p450 Leche materna

Aflatoxina B1 -8,9-epóxido
(endo y exo) Aductos ADN ADN reparado
Microsomal
epoxido Mutación
Glutatión S hidrolasa (?)
transferasa (s)
Aflatoxina B1 -8,9- Unión a proteínas
dihidrodiol
Aflatoxina B1 glutatión Cáncer
conjugado pH fisiológico

Dialdehído fenolato
Toxicidad
Aflatoxina B1 Biomarcadores:
aldehído reductasa
AFB1-N7-Gua
Aflatoxina B1 dialcohol AFB1- Lisina
AFM1
Excreción Orina/Bilis
Bammier et al., 2000
 Factores que influencian la toxicidad de las AFs en humanos

a) La biodisponibilidad de la aflatoxina;
b) Sinergismos con otras micotoxinas;
c) La cantidad y frecuencia de aflatoxina ingerida;
d) El peso, estado fisiológico y de salud del individuo
Aflatoxicosis
Cambios en cabello
Cambios mentales
Alteración del crecimiento

Mujer < Hombre < Infante

Perdida de músculo
Anemia
AFM1
Hígado graso
Diarrea
Despigmentación

Edema

Owaga et al., 2011; Gimeno, 2013

 Evaluación del riesgo de la exposicíon a las AFs
y su efecto tóxico
Exposición externa (Ingesta alimentaria)

Incidencia en los alimentos Datos de consumo

Biodisponibilidad

Indica la magnitud Exposición interna Indica la magnitud de la

de la exposición respuesta biológica

Biomarcadores de exposición Biomarcadores de efecto

Adaptado de Filazi y Sireli, 2013

Incidencia y niveles de AFs en granos, cereales y leche
en diferentes países

Adaptado de Filazi y Sireli, 2013

Cuantificación de exposición interna a la AFB1 mediante
biomarcadores
Biomarcadores
de efecto

Tiempo de
Aflatoxina Biomarcador Correlación Referencia
exposición

AFB1 AFB11- Lisina 1 semana 0.86 Sabbioni et al., 1990

AFB1 AFB11-N77-Gua 1 semana 0.65 Groopman et al., 1992

AFB1 AFB11-RNA 4 semanas 0.91 Sotomayor et al., 2003

Incidencia y niveles de AFM1 en leche materna de mujeres en
diferentes países
Exposición Biomarcador
Externa de exposición
Número de Muestras Concentración
País
muestras Positivas (%) (µg AFM1/L)
Sierra león 113 30.9 0.2-9.9
Emiratos Árabes Unidos 64 6.4 0.3-1.3
Australia 73 69.4 0.028 -1.031
Tailandia 11 73.4 0.039 -1.73
10 20 0.5 - 5
Egipto
120 55 0.02-2.09
Sudan 94 54.3 0.40- 0.52
Sudan/Kenia 800 77 0.005 -1.379
Italia 75 100 0.006 - 0.229
Turquía 63 70 0.054 - 0.65
Irán 160 98 0.00030-0.0267

Adaptado de Mulunda et al., 2013

Incidencia y niveles de AFs en diferentes productos en México

Incidencia Concentración
Aflatoxina Estado Año Alimento
(%) (µg/Kg o µg/L)

Estado de
Guanajuato 1983 Mazapán
Maíz 33 (>1)
Jalisco 1996-1997
1987 Leche fluida 10
48 (0.011)
México Fécula de maíz
1987 Sorgo 44
Tamaulipas
1989 Maíz
Leche fluida 100
49 (>0.05)
Sonora 1997/1998 Maíz en grano 33
Hermosillo, Son. 2002-2003
Edo. de México 1988 LecheMaíz
en polvo 4
100 0.026
AFB1
Sonora 2001/2002 Barras de granola 18
Altiplano Leche orgánica y
AFM
AFs totales
1 2006-2007 59 (1.59)
Mexicano leche fluida
Chiapas 2004
1989 Salsa
Maízbotanera
blanco 100
10 8
Distrito
Estado Federal
de 2005
2007-2008 Refresco de cola
Queso fresco 100
22.2 1
(>0.5)
México
Sonora 2014 Cerveza (0.002-0.012)
2006-2007 Tortillas delager
maíz 100
14 91
Hermosillo, Son. 2010-2011 Leche fluida 30 (>0.5)
Estado de
México 2005-2006 Frijoles 100 7.3
Chiapas 2010-2011 Leche orgánica 23.3 (>0.5)

Carvajal et al., 2003; Sandoval, 2003; Moreno, 2005; Pérez et al., 2008; Hernández-Mendoza, 2008;
Cantú, 2012; Carvajal, 2012; Gutiérrez et al., 2013; Álvarez-Segovia, 2014
Cuantificación de exposición interna a la AFB1 de la población
Mexicana
Biomarcadores
de efecto
Concentración
Estado Muestra Incidencia (µg/Kg de Referencia
albumina)

Nuevo Suero 18.7% 2.70 ± 1.18 Soini et al.,

León (AFB1- Lisina) 1996

Estado de Orina Hepatitis B= 50% 1.0-38.8 Bañuelos et

México (AFB1-N7-Gua) Cirrosis hepáticas=26% 0.4-290 al., 2000
Cirrosis alcoholica = 10% 1.38
Grupo control= 10%
AFM1, factor de riesgo para la población infantil mexicana?

La heterogeneidad de la presencia de aflatoxinas en los

diferentes alimentos dificulta determinar los niveles exactos de
exposición a está toxina, y por lo tanto, es dificil establecer una
asociación entre la exposición y la salud de infantes lactantes.

De forma particular, la presencia de AFM1 en leche materna ha

evidenciado la alta incidencia y niveles de exposición de la
población infantil en distintos paises desarrollados o en vía de
desarrollo.
¿Cuál es la incidencia y niveles de aflatoxina M1 en leche
materna de madres Mexicanas, en diferentes periodos de
muestreo y etapas de lactación. Y cuáles son los posibles
factores que están relacionados con la presencia de está
micotoxina en la leche materna?
 Bancos de leche materna en México
Hospital de la Mujer Zacatecana y General

Centro de Especialidades Médicas

Hospital Regional de Alta

Especialidad de la Mujer

Hospital Materno-Infantil

- Hospital Materno-Infantil Toluca

- Hospital General de Naucalpan
- Hospital General de Ecatepec
Hospital General de la Ciudad de México
 Estrategia general de trabajo

Carta de ética
Recolección de
muestras de leche
Criterios del estudio

Preparación de
muestras
Tamaño de
muestra
Determinación de
AFM1 por ELISA

Análisis estadístico
Carta de ética
 Criterios del estudio

Criterios de inclusión Criterios de exclusión

1. Mujeres con mayoría de 1. Mujeres que hayan sufrido

edad en periodo de lactancia y defectos estructurales (e.g.
que asistían voluntariamente a agenesia, cirugía mamaria,
donar leche materna al banco hipoplasia de la glándula)
de leche participante
2. Que presenten: mastitis, Cáncer
mamario y/o quimioterapia
 Tamaño de la muestra

Fórmula para población desconocida

z2 (p) (q) n= 96 muestras

n=
β2

z= nivel de confianza (1.96)

p= proporción esperada de encontrar la variable a evaluar (0.5)

q= proporción asignada de no encontrar la variable a evaluar (0.5)

β = nivel de precisión (0.1)

Navas et al., 2005; Gurbay et al., 2010; Adejumo et al., 2013

 Muestreo en banco de leche materna

Hospital General de Naucalpan de Juárez

“Dr. Maximiliano Ruiz Castañeda”

Muestreo:
Naucalpan, Edo. de México Cuestionario de
frecuencia de
Enero–Agosto, 2014
consumo de
alimentos
Extracción de muestra
 El volumen de las muestras fue de 15 – 20 mL
 Nombre, edad, peso, talla y
Información ocupación
 básica
Las muestras
de las fueron transportadas (4 0C) al Laboratorio de Química
 Nivel de estudios
y Bioquímica de Productos
participantes Lácteos
 Numero en CIAD, A.C., y almacenadas
de hijos
0
(-20 C) hasta su análisis.
 Meses de lactancia
 Algún tipo de padecimiento
 Cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos
GRUPOS DE FRECUENCIA CANTIDAD OBSERVACIONES
ALIMENTOS
ALIMENTOS (por semana) APROXIMADA (g)

Pan (caja, salado, dulce) 4 194

Cacahuate 1 15
Pasta 2 400
Nueces 0 0
Arroz 2 400
Oleaginosas Pistache 0 0
Tortilla de maíz 7 1470

Aceituna 1 10
Cereales Tortilla de harina 0 0

Cereal de caja 6 150 Almendra 1 10

Avena 1 200
Frutos secos (ciruela,
Fruta dátil, higos, pasas)
1 5
Elote (mazorca o grano) 1 120

Galletas 2 160
Refresco de cola 5 2424
Leche 5 1032

Leche y Queso 4 50
Cerveza 0 0
productos
Yogurt 5 1169.2 Vino (tinto) 0 0
lácteos
Crema 4 120
Girasol/c
7 706.4
Frijoles 3 600 ártamo
Otros
Lentejas 0 0 Olivo 0 0
Aceite
Leguminosas Habas 0 0
Maíz 0 0
Garbanzo 0 0
Manteca
Soya 0 0 0 0
vegetal
Pollo 2 300
Res 2 240 Café 7 1400
Carnes Cerdo 1 120
Embutidos 6 315

Huevo 3 360 Sadeghi et al., 2009; Gurbay et al., 2010

 Preparación de las muestras

Descongelar Pasteurizar
muestras (62.5 0C, 30 minutos) Muestras

• 12 mL de muestra
• 3500 g /5 0C /15min

Human Milk Banking Association of North America, 2015 (https://www.hmbana.org)

 Evaluación de las muestras por ELISA
Reactivos
 Conjugado enzimático
 Anticuerpo (anti- aflatoxina)
 Tetrametilbenzidina (cromógeno)
 Ácido sulfúrico 1N (solución stop)
 Estándar de AFM1
(0, 0.005, 0.010, 0.02, 0.04 y 0.08 μg/L)
ELISA competitivo

Software Rida®Soft
Cálculos Absorbancia 450 nm

Ridascreen FAST Aflatoxin M1 (www.r-biopharm.com)

 Análisis estadístico
Los niveles de AFM1, determinados en diferentes periodos y la etapa de lactación, se analizaron mediante:

 Diseño complemente al azar de ANOVA de una vía

AFM1 = M + Ti + Eij
Las medias fueron comparadas por la prueba de Tukey Kramer (p<0.05)

 Los niveles de AFM1 fueron comparados con los Límites Máximos permitidos por la FDA, la
NOM-184-SSA1, la Unión Europea y la legislación Suiza

 La información básica de las participantes se analizó mediante estadística descriptiva

 Se determinó la correlación de la información básica, y los resultados de los cuestionarios de

frecuencia de consumo de alimentos por medio de regresión lineal múltiple
X1i …Xni = grupos de alimentos
AFM1 = β0 + β1X1i + β2X2i + … + βkXki (e.g., cereales, leche, carnes)
en gramos

X1i … Xni= información

NCSS, 2007 básica (e.g., edad, peso,
estatura, entre otros)
 Resultados

Características generales de la población de estudio

Estado de salud Sano

Edad (años) 25.46 ± 4.388

Peso (Kg) 72.63 ± 6.634

Estatura (m) 1.64 ± 0.053

Nivel máximo de estudio 87% nivel básico

13% nivel medio superior
Ocupación 90% trabajo doméstico
Periodo de lactancia 2-90 días

FAO, 1996; Polychronaki et al., 2006; Adejumo et al., 2013

 Cuantificación de AFM1 en leche materna

País Incidencia Concentración

112 muestras (%) (µg/L)
analizadas
Gambia y África 100 0.002-0.009

Emiratos 91 0.053-3.4
Árabes Unidos
95% de Incidencia
Irán 98 0.0003-0.026

Turquía 100 0.060-0.299

RangoTailandia 45 0.039-1.736
0.0012 - 0.034 µg/L
Nigeria 18 4.0

Sudan 54 0.401-0.525
Promedio
0.0098 µg/L

Zarba et al., 1992; El-Nezami et al., 1995; Abdulrazzaq et al., 2003; Atanda et al., 2007; Sedeghi et al., 2009; Gurbay
et al., 2010; Elzupir et al., 2012
 Cuantificación de AFM1 por Mes
 marzo de 0.027 µg/L
 abril de 0.0031 µg/L
NOM-184-SSA1-
2002 y FDA
Leche y sus
 Los niveles AFM1 determinados
derivados en época de

Unión Europea
Invierno fueron mayor (p<0.05) que
Primavera y Verano
Silo en invierno
 Lamplugh et al., 1988 y Maxwell, 1998.
Informaron previamente que los niveles de
Unión Europea
AFs pueden variar según la época del año
Fórmulas
Infantiles
Suiza

Invierno Primavera Verano

Silo en verano
Niveles de contaminación de AFM1 (Media ± DS). Letras diferentes indican
diferencias significativas entre meses (p<0.05).
Cuantificación de AFM1 por etapa de lactación
0.025

AFM1 (µg/L)
0.020 Contaminados/total, (incidencia)
Primeros días de lactación (calostro)
a
AFM1 (g/L)

0.015 a
a 14/24, (58%)

Diferencias significativas (p<0.05)

0.010

0.005 Organoclorados (µg/L)

0.000 Calostro Leche madura

o

ón

ra
tr

0.174 0.0157
u
os

ci

ad
si
al

M
an
C

Tr

Etapas de lactación

Literales diferentes indican diferencias significativas

(p<0.05)

Polychronaki et al., 2006; Waliszewski et al., 2001; Yu et al., 2007

 Promedio de Ingesta diaria
Consumo el periodo
durantedurante el período estudio
del de estudio(g)
(g)

100
200
300
400
500
600

0
C
Le er
ch ea
e le
y s

245 g
de
riv
ad
Le os
123 g

gu
m
in
os
as
23.2 g
C
ar
ne
O s
le
96.2 g

ag
in
os
Fr a s

Grupos de alimentos
12 g

ut
as
se
ca
s
2.1 g

O
tr
os
≈ 110 g
Registro de consumo de alimentos

2012

2003
Alimentos consumidos por periodo (%)

Invierno
Invierno Primavera
Primavera Verano
Verano

HuevoTortilla
(14.0) HuevoTortilla
(12.0) Tortilla (11.0)
Huevo
de maíz (18.0) de maíz (15.5) de maíz (14.0)
Pollo (8.2) Pollo (9.0) Pollo (8.2)
Pasta (9.0) Pasta (5.0) Pasta (5.5)
Res (5.3) Res (4.50) Embutidos (6.5)
Carnes
Cereales Arroz (7.0) Arroz (4.0) Arroz (4.0)
Cerdo (4.7) Embutidos (3.7) Cerdo (4.0)
Pan (4.0) Pan (3.5) Pan (3.20)
Embutidos (3.1) Cerdo (3.0) Res (2.5)
Cereal (2.5) Galletas (2.0) Galletas (2.6)
Refresco de cola Refresco de cola Refresco de cola
(23.0) Leche (25.3) (13.0) Leche (21.0) Leche (23.30)
(16.0)

Yogurt (4.3) Yogurt (9.3) Yogurt (6.0)

Leche y Café (13.10) Café (12.0) Café (14.8)
Otros
productos
Crema (2.3) Aceite Queso (1.87) Crema (2.0)
lácteos Aceite de girasol (1.8) de girasol (1.3) Manteca vegetal (1.4)

Queso
Cerveza (0.6)(1.50) Crema
Cerveza (0.4) (1.27) Quesode
Aceite (1.65)
girasol (1.1)

Aceite de maíz (0.5) Aceite de maíz (0.3) Aceite de maíz (0.6)

 Regresión lineal multiple

Ecuación del modelo estimado:

 Coeficiente de determinación
AFM1= 0.0345 - 0.0004* Café - 0.0022* Carne de cerdo - (R2) de 0.8018
0.0029* Cereal + 0.0007* Refresco de cola - 0.0011*
 El modelo fue significativo
Crema de leche - 0.0011* Frijoles + 0.0014* Aceite de (p<0.05)
girasol - 0.0023* Tortillas de maíz - 0.0013* Pan + 0.0010*
Pasta + 0.0009* Pollo + 0.0014* Queso - 0.0016* Yogurt

Los niveles de AFM1 no se correlacionaron con:

 Peso-estatura
 Nivel de estudio-socioeconómico
 Edad
Alimentos que podrían estar relacionados con la presencia de
AFM1 en la leche materna
Covariable Probabilidad

Café 0.2243

Carne de cerdo 0.0382

Alimentos
Cereal 0.0076• Cereales y
Refresco de cola 0.0799 subproductos
(Arroz, Maíz)
Crema 0.1252
• Leche
Frijoles 0.1025
• Cacahuates
0.0003
Aceite de girasol • Otros
Tortillas de maíz 0.0188(Aceite y Café)

Pan 0.0196

Pasta 0.1870

Pollo 0.1299

Queso 0.1182

Yogurt Turconi et0.0296

al., 2004; Polychronaki et al., 2007;
Sadeghi et al., 2009; Adejumo et al., 2013
 Resumen de hallazgos
- Se determinó y se cuantificó la presencia de AFM1 en la leche materna, encontrando una incidencia de 95%,
y un nivel promedio de 0.00986 µg AFM1/L.

- Se determinó que el 5% de las muestras superó los límites establecidos por la Unión Europea (0.025 µg/L)
para fórmulas infantiles y el 28% para la legislación Suiza (0.01 µg/L).

- No se encontró diferencias en los niveles de AFM1 en las muestras colectadas en las diferentes etapas de
lactación (calostro, leche de transición y leche madura).

- La presencia de AFM1 fue dependiente del mes de muestro, observándose los mayores niveles de
contaminación en invierno.

- Alimentos como carne de cerdo, cereal, aceite de girasol, tortillas de maíz, pan y yogurt podrían ser aquellos
que influyen sobre la presencia de AFM1 en la leche materna. El peso-estatura, nivel de estudio-
socioeconómico y edad, no se correlacionaron con los niveles de AFM1 determinados.
 Conclusiones

Estos hallazgos, revelan el riesgo latente de exposición de los lactantes

a la Aflatoxina M1, por lo tanto, se evidencia la necesidad de continuar
con más estudios al respecto que permitan conocer la variabilidad de los
niveles de contaminación en diferentes regiones y épocas del año, y
finalmente estudiar los posibles efectos en la salud por la exposición de
los infantes a la AFM1 a través de la leche materna.
Por su atención….
GRACIAs!!!