Rendimiento de la prueba Xpert MTB/RIF

en muestras respiratorias en el escenario

real de trabajo en un país en desarrollo
Santiago Atehortúa, Faiver Ramírez, Lina María Echeverri, Adrian Peñata, Sigifredo Ospina

Manuela Loaiza Oliva

Escuela de Microbiología y Bioanálisis
Universidad de Antioquia
INTRODUCCIÓN: Tuberculosis
La tuberculosis es una enfermedad infectocontagiosa granulomatosa
crónica producida por el Mycobacterium tuberculosis o bacilo de
Koch, que se localiza generalmente en el pulmón, aunque puede
afectar otros órganos

Se transmite de persona a persona por inhalación de aerosoles

contaminados por el bacilo, que han sido eliminados por los
individuos enfermos al toser, hablar o estornudar.

Tuberculosis pulmonar: Inicialmente suele pasar inadvertida,

apareciendo los primeros síntomas a las pocas semanas. Los
síntomas son: fatiga, fiebre, sudoración (sobre todo nocturna),
expectoraciones (a veces sanguinolentas) y dolor torácico.

Tuberculosis extrapulmonar : La infección puede progresar y

propagarse a otros órganos: al sistema nervioso central, al sistema
linfático, al sistema circulatorio,, al sistema gastrointestinal, a los
huesos, a las articulaciones.
 Epidemiología

Se calcula que una cuarta parte de

• La tuberculosis es una de las .
la población mundial tiene
10 principales causas de
tuberculosis latente, término este
mortalidad en el mundo.
aplicado a las personas infectadas
• La tuberculosis
por el bacilo pero que aún no han
multirresistente (TB-MDR)
enfermado ni pueden transmitir la
sigue constituyendo una crisis
infección.
de salud pública.
• Hubo 600 000 nuevos casos
En 2016, 10,4 millones de
de resistencia a la rifampicina
personas enfermaron de
(el fármaco de primera línea
tuberculosis y 1,7 millones
más eficaz)
murieron por esta enfermedad

4
Epidemiología: Colombia
• 2017 se notificaron al Sivigila 14 480 casos de tuberculosis
de los cuales, 12056 casos (83,3%) tuberculosis pulmonar
y 2424 casos (16,7 %) de tuberculosis extrapulmonar

• El 11,1% (n=1610) de los casos de tuberculosis todas las

formas corresponden a coinfección TB-VIH,
Epidemiología: Colombia

Para el 2017 las entidades territoriales con mayor carga fueron:

Antioquia (18,3%),
Valle del Cauca (13,3%)
Bogotá con el 7,8%. Se notificaron 46 casos procedentes del exterior de los
cuales el 63,3% tienen nacionalidad venezolana
 ABSTRACT NETWORK DESIGN
Diagnóstico
Baciloscopía. Las dos técnicas más
comunes son la tinción de Ziehl
Neelsen y la microscopía de
fluorescencia con fluorocromo
auraminarodamina B y microscopios
LED (light emision diode) donde se
aprecian los bacilos como puntos
brillantes sobre fondo negro.
+++: más de 10 baar x campo.
++: 1-10 baar x campo.
+: 1-10 baar x 10 campos
Número de baar en 100 campos (1-10)
El medio líquido MGIT.
En el medio de Löwenstein-
El crecimiento se detecta por la
Jensen las colonias de M.
emisión de fluorescencia del tubo, la
tuberculosis empiezan a
que aumenta proporcionalmente a
observarse a las 2-3 semanas de
medida que las bacterias utilizan el
incubación. La mayor desventaja
oxígeno y
de estos medios es la lentitud de
Permitiendo en 10-13 días obtener
crecimiento de las micobacterias,
resultados positivos. 42 días
negativos
7
 ABSTRACT NETWORK DESIGN
Diagnóstico: El método Xpert MTB/RIF

El método Xpert MTB/RIF A pesar de que ya se ha comprobado la

es una prueba de utilidad de la amplificación molecular
amplificación del ácido para diagnosticar la tuberculosis, los
nucleico totalmente demás métodos existentes son
automatizada que emplea demasiado complejos para que puedan
un cartucho para incorporarse de manera sistemática y
diagnosticar MT y la generalizada en los países en desarrollo.
resistencia a la rifampicina

Este método purifica, concentra, amplifica (mediante una prueba de

Reacción en Cadena de Polimerasa – RCP ‐ rápida en tiempo real) e
identifica secuencias de ácido nucleico específicas del genoma de MT.
procesar en menos de 2 horas, con empleo de tiempo mínimo por parte de
personal técnico

8
Diagnóstico: El método Xpert MTB/RIF
Esta técnica amplifica una secuencia específica
de 81 pares de bases del gen rpoB que codifica
para una subunidad de la ARN
polimerasa 9,12,13 y utiliza sondas del tipo
“molecular beacons’’ para detectar el producto
de la amplificación y la presencia de
mutaciones en el mismo.

La prueba Xpert® MTB/RIF entrega resultados semi-cuantitativos, de acuerdo al ciclo

umbral de amplificación (cycle threshold, CT), el que muestra una relación logarítmica
lineal con la cantidad de ADN presente en las muestras clínicas

El único paso que se realiza de forma manual, es la adición del reactivo bactericida a la
muestra (esputo) justo antes de introducirlo en la máquina cartucho plástico conteniendo
todos los reactivos necesarios para realizar la lisis Bacteriana a extracción de ácido
nucléico, amplificación y detección del amplicon.
Objetivo
El objetivo de este estudio fue evaluar el rendimiento de la prueba
Xpert MTB / RIF® para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en
muestras respiratorias en comparación con el cultivo y su correlación
con la prueba de susceptibilidad fenotípica en condiciones de trabajo
"reales" en un hospital de un país en desarrollo con alta prevalencia de
la enfermedad y recursos limitados.
 METODOLOGÍA

Las muestras respiratorias las muestras se tiñeron con la

Pacientes >12 años
analizadas fueron esputo, tinción de Ziehl-Neelsen (ZN),
con sospecha clínica
Se realizó un estudio transversal lavado broncoalveolar o se inocularon en el cultivo
de tuberculosis
para evaluar la exactitud de la aspirado traqueal Kudoh (OK) y analizadas con
pulmonar.
prueba diagnóstica de Xpert MTB / el ensayo Xpert MTB / RIF ®
RIF en la identificación de
tuberculosis pulmonar en pacientes
del Hospital Universitario San
Vicente Fundación en Medellín,
Colombia, de septiembre de 2010 a
diciembre de 2011

11
METODOLOGÍA
Las muestras de cultivo microbiológico se descontaminaron con hidróxido
de sodio (NaOH) al 4% y se cultivaron utilizando el método de hisopo
Kudoh (método directo) en dos tubos con medio Ogawa-Kudoh
37 ° C en posición
horizontal durante 8
semanas y lectura
cada semana

El reactivo que contiene hidróxido de sodio e isopropanol se añadió a la

muestra en una relación de 2: 1 (v / v).
Vortex 5 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos.
2 ml al cartucho Xpert MTB / RIF®, que luego se cargó en el instrumento
GeneXpert® donde la extracción de ADN, la PCR en tiempo real y los
procesos de detección están completamente automatizados. Cada muestra
clínica se probó una vez independientemente del resultado.
METODOLOGÍA
Resultado positivo: La detección de las cinco sondas específicas para M.
tuberculosis complejo rpo gen B
Resultado negativo: Los ensayos en los que la señal de M. tuberculosis fue negativa
pero positiva para la extracción y el control interno de amplificación
La resistencia a la rifampina se determinó mediante hibridación fallida o retardada
de al menos una o más sondas específicas del gen rpo B.

Prueba de susceptibilidad convencional . El método de proporciones múltiples es la

prueba utilizada para detectar la sensibilidad de los medicamentos antituberculosos de
primera línea (isoniazida, rifampina, etambutol y estreptomicina)

En que se comparan las colonias crecidas en diferentes diluciones con las presentes
en medio sin antibiótico, interpretando el resultado a través de la proporción de
colonias capaces de crecer en presencia del fármaco.
METODOLOGÍA
Análisis estadístico
• Microsoft Excel® 2010 se usó para la
base de datos y para calcular las
frecuencias y las medidas de tendencia
central.
• El software Epidat 3.1 (Organización
Panamericana de la Salud) se usó para
los cálculos de la sensibilidad de la
prueba, la especificidad y los valores
predictivos. Se calcularon con
referencia al cultivo en medio sólido.
Resultados
Desde septiembre de 2010 hasta diciembre de 2011, se
seleccionaron 152 pacientes, de los cuales 108 fueron elegibles
para el estudio y 103 se incluyeron en el análisis.

lavado broncoalveolar representó el 61% (63) de las muestras, el

esputo, el 35% (36) y el aspirado traqueal, el 4% (4).
Resultados
La prueba Xpert MTB / RIF® fue positiva en 35 de las 103 muestras.
En el 5,6% (6) de los casos, la prueba fue positiva con cultivo negativo, El 2,9% (3) fueron positivos para cultivo y negativa
para Xpert MTB/ RIF
Resultados
La sensibilidad general de la prueba Xpert MTB / RIF® fue del 91%, especificidad, 92%, PPV, 83% y VPN, 96%.
de 35 muestras positivas, el 91.4% (31) fueron sensibles al RIF y el 8.6% (3) fueron resistentes.
Los resultados con respecto a la sensibilidad y resistencia a la rifampicina fueron concordantes con la prueba de
susceptibilidad usando el método de proporciones múltiples (Kappa = 1 p <0,0001).
Discusión
La prueba Xpert MTB / RIF® es una herramienta útil para el diagnóstico precoz y el
tratamiento de la tuberculosis pulmonar.

La prueba Xpert MTB/RIF como herramienta de diagnóstico es primordial cuando las

muestras respiratorias son ZN-negativas porque reduce el tiempo de inicio del
tratamiento y no es necesario esperar los resultados del cultivo

La interpretación de los resultados de las pruebas en un contexto clínico del paciente

es muy importante. Dado que no existe un estándar de oro perfecto, la decisión de
tratar o no a un paciente cuando la prueba es positiva y el cultivo es negativo
depende de la probabilidad clínica previa a la prueba.
En un estudio de 105 pacientes con muestras negativas para el cultivo que habían
sido tratadas por tuberculosis sobre la base de síntomas clínicos, el 29.3%
positivos en la prueba Xpert MTB / RIF
Discusión

• Tener los resultados con respecto a la resistencia a la rifampicina en dos

horas permite elegir la terapia de forma adecuada y, por lo tanto, reducir la
probabilidad de resistencia a otras drogas durante el tratamiento, así como
disminuir el tiempo de infectividad del paciente y la aparición de las
consecuencias.

• Hubo una alta correlación entre el método estándar de oro (método de

proporción) y las pruebas moleculares para detectar sensibilidad /
resistencia a RIF, de forma similar a la descrita por otros estudios, lo que
confirma que es una prueba confiable y reproducible

• Permite detectar resistencia temprana e iniciar un tratamiento rápido que

previene la diseminación o selección de cepas resistentes debido a un
tratamiento inadecuado.
Discusión
No se realizó centrifugación rutinaria de esputo. No disponibilidad de
microscopía de fluorescencia para procesar muestras con tinción de
auramina / rodamina.

• Estas condiciones pueden haber resultado en algunas muestras

clasificadas como muestras ZN-negativas que podrían haber sido
realmente positivas

• Se requieren estudios más amplios para evaluar el verdadero impacto

de la implementación masiva de esta prueba como método de
diagnóstico en esta población, ya que tiene la grande ventajas sin
embargo, su costo (aproximadamente USD $ 250 por prueba en
Colombia) es una desventaja.
Conclusión
• La prueba Xpert MTB / RIF® es una herramienta adicional para el
diagnóstico de la tuberculosis pulmonar en los países en desarrollo
que muestra un mejor rendimiento en las muestras negativas para
ZN, lo que se informó anteriormente en la literatura.
• El resultado de la detección de resistencia a RIF o sensibilidad a
través de la identificación de mutaciones en el gen rpoB es
consistente con la prueba fenotípica, lo que significa que la prueba
es confiable y reproducible.
GRACIAS
• “Muy escasa cantidad” (CT > 28), “Escasa cantidad” (CT entre 22-
28), “Moderada cantidad” (CT entre 16-22) y “Elevada cantidad” (CT
< 16) para la presencia de MTBc. Esta técnica ha demostrado tener
sensibilidad y especificidad muy elevada para muestras respiratorias
en relación a otros métodos14–17, siendo el método recomendado
por la OMS pues además detecta resistencia a rifampicina
Usa un ensayo de reacción en
cadena de la polimerasa (PCR)
En tiempo real anidado para
amplificar una secuencia
especifica del gen rpoB del MTB.
• Se realiza en una plataforma
que integra el procesamiento de
las muestras y el PCR al interior
de un cartucho plástico
conteniendo todos los reactivos
necesarios para realizar la lisis
Bacteriana a extracción de ácido
nucléico, amplificación y
detección del amplicon.
Por el contrario, en el “Xpert MTB/RIF”, el único paso que se realiza de
forma manual, es la adición del reactivo bactericida a la muestra (esputo)
justo antes de introducirlo en la máquina. La utilización del diagnóstico por
el “Xpert MTB/RIF” elimina así el inconveniente de necesitar laboratorios
de alta bioseguridad ya que todas las reacciones se realizan después de
inactivar los gérmenes presentes en el esputo. El test automático MTB/RIF
integra una modificación de la reacción convencional de polimerasa en
cadena, PCR, con la que se reduce la contaminación del producto
amplificado, en este caso el gen llamado rpoB ; mutaciones en este gen,
que codifica para la subunidad beta de la ARN polimerasa, están
implicadas en la resistencia a rifampicina. Contiene además todos los
reactivos necesarios para la lisis bacteriana, extracción del ADN y
detección del producto amplificado.
Resultados y discusión

Hubo un mayor número de

casos leves (70,3%) y una baja
letalidad (2,7%), hallazgos que
coinciden con un reporte que
refiere un mayor número de
casos pediátricos con formas
clínicas leves y baja mortalidad
Resultados y discusión

• La respuesta mas prevalente

de anticuerpos fue contra
Leptospira santarosai
serogrupo Grippotyphosa
serovar Alice (25%) y
Leptospira interrogans
serogrupo Hardjo (16%).

• Los pacientes positivos a

serogrupos de origen silvestre
tuvieron títulos superiores a
1:800, mientras que los títulos
contra los serogrupos de origen
pecuario fueron menores a
1:400.
Resultados y discusión

Ausencia del serovar Canicola

como serogrupo único detectado
por MAT en los sueros
Resultados y discusión

Las variables clínicas de

deshidratación, ictericia,
hepatomegalia y petequias
presentaron valores p por
debajo de 0,05.
Resultados y discusión

NO se encontró diferencia
significativa entre las
variables vs la enfermedad

Solo se presentó
asociación de los casos
severos de la
enfermedad con la
presencia de animales
domésticos en la vivienda
Conclusiones
• La leptospirosis es una enfermedad de importancia epidemiologica
a nivel global, con manifestaciones clinicas variadas por lo que se
debe considerar en el diagnostico diferencial de otros sindromes,
sobretodo en pacientes con de áreas endémicas o con trabajos de
riesgo
Conclusiones
• Problemas en el diagnóstico clínico y de laboratorio de la
leptospirosis en la mayoría de los países endémicos afectan el
reporte y las estadísticas reales de la ocurrencia; por lo cual es una
enfermedad olvidada tanto para los tomadores de decisiones en el
área de la salud como para los tomadores de decisiones en las
agencias financiadoras de la investigación en nuestros países.
Conclusiones
• Se han identificado debilidades en el proceso de vigilancia de la
leptospirosis, dado por el difícil acceso a las pruebas diagnosticas y
el poco conocimiento de la enfermedad por parte de los médicos en
el manejo, cuadro clinico, diagnostico y tratamiento, lo que da
como resultado el subregistro menor de casos, la demora en el
diagnostico y la presentacion de cuadros clínicos severos.
Conclusiones
• Los niños pueden estar expuestos a diferentes fuentes de
contaminación con Leptospira spp: domiciliarias, peridomiciliarias,
en las instituciones educativas o en las actividades recreativas (20),
ya que a esta edad el contacto espontáneo con múltiples objetos,
superficies, aguas o mascotas, puede tener riesgos inherentes,
epidemiológicamente diversos, teniendo en cuenta el
comportamiento dinámico de la bacteria en zonas endémicas.
Conclusiones
• Este estudio presenta una frecuencia significativa de la enfermedad
en la población infantil y resalta la importancia de las variables
ambientales en el conocimiento de la leptospirosis pediátrica
concluyendo que la tenencia de animales domésticos dentro de la
vivienda, representa un factor de riesgo para leptospirosis en este
grupo poblacional
Conclusiones
• Se deben realizar esfuerzos para identificar los focos de contagio,
brindar educación a la población de riesgo sobre las medidas de
prevención con el fin de evitar la aparición de nuevos casos y
conocer la prevalencia de serotipos específicos en una población
determinada.

La detección de leptospiras mediante el
cultivo representa un diagnóstico definitivo.
Desafortunadamente, esta técnica no
constituye un examen de rutina práctico para
el diagnóstico por diferentes razones: período
de incubación prolongado (hasta 3 meses,
con exámenes semanales), requerimiento de
muestras frescas de individuos que no hayan
sido sometidos a tratamiento, peligro alto de
contaminación del cultivo y baja especificidad
(falsos negativos). El medio más usado para
el cultivo es el medio semisólido Fletcher con
adición de suero de conejo. En este se puede
observar el crecimiento de las leptospiras
macroscópicamente expresado en la
formación de un halo, anillo de Dinge
En sanfre la muestra debe tomarse en los primeros cinco días después de
la aparición de los síntomas(4). Dependiendo de la evolución de la
enfermedad, este microorganismo puede cultivarse de otros fluidos
biológicos como orina, liquido cefalorraquideo, peritoneal y amniótico.
Todas las serovariedades de L. interrogans tienen los mismos
requerimientos de cultivo: son aerobias obligadas, crecen en medios
enriquecidos con albúmina sérica bovina (medio EMJH) y suero de conejo
(medios de Korthof, Stuart y Fletcher). Las leptospiras incorporan en sus
ácidos nucleicos las bases púricas, pero no las pirimidínicas, por esta
razón, son resistentes a la actividad antibacteriana de los análogos
pirimidínicos como el 5-fluoracilo, que al ser incorporado a los medios de
cultivo los hace selectivos (4). El cultivo debe incubarse a 30o C y
examinarse cada semana al microscopio de campo oscuro por lo menos
durante dos meses antes de descartarse como negativo
PCR: reacción en cadena de la polimerasa, llevada a cabo con
oligonucleótidos específicos y que se puede realizar en muestras de
sangre, orina y tejidos.

es un procedimiento laborioso (6-10 semanas) que de ordinario no está

disponible sino en laboratorios de investigación o de referencia. Pero es
muy importante porque permite la obtención de aislados locales para
tipificar serológica y molecularmente las cepas circulantes en un área
determinada.
 Epidemiología
OMS incidencia media anual de esta
enfermedad es de cinco casos por 100 000
habitantes. África, Pacífico Occidental y las
Américas son las regiones con las mayores
incidencias medias, correspondiendo a 95,5,
66,4 y 12,5 casos por 100 000 habitantes, respectivamente.
500 000 muertes anuales en el mundo
El primer registro de leptospirosis humana
severa fue reportado en 1966 (63), y la primera
epidemia urbana de leptospirosis severa
ocurrió en Barranquilla (Colombia) en 1995,
durante un período de inundación; cuatro muertes fueron reportadas, y por
la ténica de
MAT, el serogrupo presuntivo de la epidemia
fue el Icterohaemorrhagiae (64, 65).
en Colombia se reportan prevalencias
desde el 6% en el departamento del Tolima hasta el
82,7% en la zona cafetera, y en Antioquia se reporta
una prevalencia del 35,6% (4). De acuerdo con las cifras
oficiales epidemiológicas, la región de Urabá registró el
58,1% de los casos reportados en el departamento de
Antioquia, durante el año 2014
En general, las formas anictéricas son las
predominantes, y la fiebre, cefalea, mialgias
e ictericia son las presentaciones clínicas
más frecuentes, y se pueden confundir con
dengue
 La investigación sobre
Blastocystis spp. se ha
incrementado en la última
década, no obstante, su
papel patogénico continúa
siendo controvertido. El
parásito ha sido recuperado
de individuos sintomáticos y
asintomáticos.

En consecuencia, a nivel asistencial y en algunos círculos académicos, Blastocystis spp. sigue siendo
considerado un comensal o, en otros casos, un parásito de "patogenicidad desconocida". Es decir, la
blastocistosis, cuya prevalencia a nivel global es cada vez mayor, continúa siendo un problema de salud
subdimensionado.
Objetivo
• Revisar lo publicado sobre las evidencias en favor de la
patogenicidad de Blastocystis spp. y hasta dónde la información
acumulada permite exponer los mecanismos por los cuales este
parásito puede causar daños en el hospedero humano.
Evidencias fenotípicas
• La forma ameboide, es más frecuente en los aislamientos
provenientes de personas sintomáticas.
• Cuando se utiliza microscopía electrónica de barrido, la superficie
de las células de aislamientos obtenidos de personas con
manifestaciones digestivas se observa más rugosa que la de los
parásitos provenientes de aislamientos de individuos asintomáticos
• Investigaciones in vivo: los aislamientos de Blastocystis spp.
provenientes de pacientes inducían cambios patológicos moderados
a severos en la mucosa intestinal de las ratas infectadas
• Blastocystis spp. Desencadenó una respuesta inflamatoria en los
diferentes tejidos analizados. En el ciego el parásito fue encontrado
en la túnica muscular mostrando su carácter invasivo. Los inóculos
más grandes desencadenaron procesos inflamatorios más
precozmente (7 días)
 Patogénesis
Degradación de la IgA, Se ha demostrado que
mediante la liberación de proteasas cisteíno-
Estudios endoscópicos dependientes, degrada dichas inmunoglobulinas y
y biopsias realizados a con ello evade barrera defensiva del hospedero

pacientes demuestran Secreción de hialuronidasa, conduce a la

que Blastocystis spp. degradación de proteínas de la matriz
extracelular
puede dar lugar a
inflamación, a pérdida Estudios experimentales en ratas y
ensayos in vitro han demostrado
de su función de que Blastocystis sp. estimula respuestas
proinflamatorias, con incremento en la
barrera y, vinculado con secreción de IL-8, Interferón γ, IL-12 y factor
ello, a cambios en la de necrosis tumoral alfa por células del
hospedero
permeabilidad.
 Conclusiones
• En preparaciones parasitológicas se ha evidenciado Blastocystis spp. como único
agente presente en muestras diarreicas de individuos, lo que permite suponer
que este parásito es capaz de alterar el metabolismo intestinal al punto de
producir el desequilibrio electrolítico que desencadena la patología
• Las crecientes cifras de prevalencia de infección por Blastocystis sp. en la mayoría
de los estudios realizados en prácticamente todo el planeta, muy relacionadas
con la mayor atención que hoy se presta a su detección, y el mejor conocimiento
sobre sus múltiples impactos sobre la salud humana han conducido a que pueda
considerar a la blastocistosis una parasitosis emergente.
Conclusiones
• Finalmente, es relevante considerar que la abundante evidencia clínica sobre la
capacidad de este parásito para producir cuadros diarreicos debe estimular a la
comunidad científica a investigar más a fondo

• El papel patogénico de Blastocystis spp. continúa en debate. Estandarizar el

cultivo in vitro, desarrollar nuevas herramientas para el diagnóstico molecular y
la identificación de los factores de virulencia, definir el modelo animal más
adecuado y realizar estudios que permitan reconocer los factores de riesgo y la
relación entre la presentación clínica y la infección con Blastocystis spp. son
algunos de los desafíos que se deberán superar para avanzar en este debate.
GRACIAS