MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

CUANTITATIVA

PROFESOR:
Mg. Wilmer Paredes Fernández
 CARACTERISTICAS GENERALES:
El Microscopio confocal, es un microscopio óptico que
incorpora dos diafragmas:
• un diafragma de iluminación localizado tras la fuente
luminosa denominado Pinhole de Excitación, cuya
utilidad es eliminar la luz proveniente de planos
superiores e inferiores al plano focal, aumentando con
ello la claridad y resolución de la imagen;
• un diafragma de detección, de tamaño variable situado
delante del fotodetector, denominado Pinhole de
Emisión
• Un detector y un pinhole por canal
• Un filtro optoacústico para el control de cada láser
• Disminución del ruido
• Escaneos seriados para la realización del objeto en 3D
 USOS:
• expresión y localización de moléculas en 2 o 3
dimensiones permitiendo reconstrucciones
tridimensionales, tanto en cultivos celulares
como tejidos histológicos;
• estudios de colocalización de proteínas u otro
tipo de moléculas;
• transporte intracelular, endocitosis;
• medidas de concentraciones de iones
intracelulares;
• desarrollo y expresión génica;
• hibridación in situ con sondas fluorescentes
Conventional
Fluorescent
Microscopy
 Confocal Microscopy Core

Inverted Scope Upright Scope

Absorption Spectra of Fluors Commonly
Conjugated to Secondary Antibodies

Fluorochrome Absorption Emission

Cascade Blue 400 420

Fluorescein 494 518
Rhodamine 570 590
Texas Red 595 615
Cy5 650 670
CCBB Confocal Core Facility (1999-2006) UV 351,364nM
Zeiss LSM510 with 4 color capability Argon 488nM
HeNe I 543nM
HeNe 2 633nM

Building 37 Room 1035

 Applications
1. Colocalization

2. Live Cell Imaging

FRAP/FLIP
GFP-Fusion

3. FRET
 Colocalization of Proteins

Colocalization of up to 4
different proteins

Colocalization does not

mean interaction

Decreased cross talk with

multitracking feature
Colocalization of insulin and calcitonin receptor-like receptor

Insulin-Cy5 CRLR-FITC

Glucagon-Rhodamine
Colocalization
p53 a-tubulin

Proteins may colocalize but not necessarily interact

Fluorescence Resonance Energy Transfer

The high resolution of

a confocal microscope
allows us to study the
physical interaction of
protein partners.
 Figura . Imagen de fluorescencia tomada con microscopio confocal y no confocal.
Células endoteliales de rata canguro teñidas con fluoresceina (para teñir filamentos de
actina) y con ioduro de propidio (para teñir DNA y cromosomas. Schibler, M.J. y Spivak,
C.M. Cell
Imaging Facility, UCLA Brain Research Institute.