Review of sample preparation strategies for MS -based

metabolomic studies in industrial biotechnology

INTEGRANTES: JULIANA OSORIO ECHAVARRIA

Keywords: industrial biotechnology, metabolic engineering, clean up, derivatisation,
enrichment, high performance liquid chromatography
 METABOLOMICA

ESTUDIO Y COMPARACIÓN DE LOS METABOLOMAS (COLECCIÓN DE TODOS LOS METABOLITOS PRESENTES EN

UNA CELULA, TEJIDO U ORGANISMO) EN UN MOMENTO DADO

Objetivo: Detectar, cuantificar y

elucidar la estructura de los
metabolitos, caracterizados por
una gran diversidad fisicoquímica
en sus estructuras moleculares.
Metabolitos endógenos (producidos
de manera natural).
Metabolitos exógenos (provienen de
la interacción con el exterior)
Se refleja en

Metaboloma dinámico

Cuello de botella
La metabolómica completa la información Amplia gama de polaridades.
bioquímica obtenida de los genes y las Pesos moleculares.
proteínas, facilitando las reconstrucciones Grupos funcionales.
IDENTIFICACION
genómicas del metabolismo y mejorando Estabilidad y reactividad
la comprensión de la biología celular y química.
fisiología de diferentes sistemas.
 BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL DE CULTIVO DE CELULAS
“CELL FACTORIES”

Producción de moléculas orgánicas de gran tamaño (proteínas,

CUANTIFICACION
DE METABOLITOS
Diversidad de metabolitos.
Intervalos de concentración
Extracción y determinación
analítica de todas las partes
de un metaboloma es
imposible
farmacéuticos, etc.) y de menor tamaño para una amplia
diversidad de aplicaciones
METABOLOMICA ANALITICA
Tiene un papel fundamental
en:
• Estudio detallado de rutas
criticas (cuantificación de
metabolitos)
• Identificación de
compuestos intermedios
• Diferenciación de fenotipo
• Elucidación de vías
DESAFIO!!!!
Proteómica
Procesos de optimización de la ingeniería
metabólica asociados a modificaciones
genéticas o alteraciones de las condiciones
de producción
La integración de los datos del metaboloma
con los datos del transcriptoma y
proteoma es un objetivo esencial de los
métodos dirigidos y no dirigidos que
abordan los objetivos de optimización de
la producción
Objetivo del articulo.
Evaluar el potencial de estrategias de preparación de muestras
aplicadas en estudios metabolómicos de “cell factories” utilizando
plataformas basadas en espectrometría de masas (MS) acoplada a
cromatografía liquida (LC) o electroforesis capilar

Se evalúan teniendo en cuenta mejora en la selectividad y grado de

enriquecimiento, así como a las exigencias de velocidad, cuantificación absoluta,
robustez y consideración de soluciones analíticas integradas que optimicen el
manejo y rendimiento de la muestra
 EVALUACIÓN DEL METABOLOMA

Desde el punto de vista analítico requiere

Muestreo optimizado, temple, extracción y protocolos adicionales de

preparación de muestra antes de la ejecución de mediciones analíticas
basadas en resonancia magnética nuclear (RMN), espectrometría de masas
(MS) o su combinación con técnicas de separación.

Procedimientos de preparación
de muestras son generalmente la
principal fuente de error en los
resultados analíticos

Para el desarrollo y validación de modelos metabolómicos, solo

la determinación cuantitativa de los metabolitos seleccionados
será suficiente

Las metodologías analíticas de metabolómica de alto y mediano rendimiento requieren limpieza

de la muestra o enriquecimiento de los metabolitos presentes en baja abundancia, además de
los protocolos de extracción y enfriamiento normales, que permitan una evaluación precisa y sin
interferencias.
 Espectrometría de masas por ionización por
electropulverización y HPLC-MS para biotecnología
Ionización mediante ESI a partir de la muestra en solución permite su
acoplamiento a técnicas de cromatografía liquida.

Producción de iones por Analizar muestras complejas con alta

evaporación de gotas
cargadas eléctricamente sensibilidad

Fragmentación de “todas” las Fragmentación de unos

especies (exclusión dinámica) determinados compuestos
(monitorización de iones aislados)
→ Conocimiento de la masa

ESI-MS ofrece ventajas de sensibilidad, disminución del tiempo de medición,

facilidad de acoplamiento con técnicas de separación en fase líquida
 La elección de protocolos de extracción posteriores es un paso critico que dicta la naturaleza de las preguntas
biológicas que pueden abordarse con flujos de trabajo analíticos empleados. Es importante evaluar de manera
critica la filtración de metabolitos y optimizar los pasos de enfriamiento, debido a la importancia que estos
tienen para la metabolómica en general y también para las “cell factories”.

Limpieza de la muestra: Filtración, precipitación de La naturaleza diversa de los componentes presentes en

proteínas o lípidos, y evaporación /reconstitución
también se usa para mejorar los aspectos del extractos típicos de las “cell factories” hacen necesario eliminar
rendimiento del método mediante la transferencia de los componentes que interfieren con los ensayos de HPLC-MS,
metabolitos de interés a un disolvente adecuado con el
consiguiente enriquecimiento debido a la reducción del CE-MS y FIMS, aparte de la eliminación de restos celulares.
volumen.
Representación esquemática de (a) muestreo primario, y (b) pasos de preparación
de muestra secundaria usados para estudios de “cell factories” (c) mediciones
basadas en ESI-MS.

Estrategias secundarias de enriquecimiento para muestras líquidas
Extracción Liquido-Liquido
(LLE)
Implica el uso de fases
inmiscibles para lograr la
extracción selectiva de
componentes polares o no
polares → se limita
principalmente al análisis de
lípidos.
Ejemplo de aplicación: Evaluación
lipidómica de microsomas de P.
pastoris, incluidas las estrategias LLE
clásicas seguidas por HPLC-MS para
la elucidación estructural y la
confirmación de la identidad de los
fosfolípidos
Extracción en Fase Sólida
(SPE)
Utiliza propiedades de afinidad masiva como la
polaridad y el carácter iónico. Para metabolitos
polares se debe usar fases con igual o mayor
retención para estos componentes en
comparación con la columna de HPLC utilizada. En
una técnica pertinente para los experimentos no
dirigidos en los que la elección del material de SPE
influye tanto en el fondo de MS observado como
en el rango y la cantidad de metabolitos
recuperados. Los protocolos de SPE desarrollados
para estudios de “cell factories” → Identificación
de productos intermedios biosintéticos a partir de
procesos de producción de biotecnología.
Ejemplos tabla diapositiva 12 y 13
Resultan como solución a problemas
presentados en técnicas comunes de
enriquecimiento (resultados erráticos
por oxidación de los metabolitos,
concentraciones bajas o sensibilidad
analítica insuficiente)
Extracción en Fase Sólida
Dispersa (SPE)
Implican una adición directa de material
sorbente a la fase orgánica, que luego se agita
para fomentar la separación de los compuestos
de interés de los componentes de la matriz
antes de la eliminación de la fase mediante
centrifugación. Posibles ventajas de este
enfoque si, antes del paso dSPE, extracción
monofásica de la muestra con solvente
orgánico seguido de la división del líquido
licuado también se realiza, son la cantidad
mínima de material utilizado, así como la
oportunidad de optimizar el procedimiento a
través de la mezcla de más de una fase de SPE
 Otras técnicas y perspectivas de enriquecimiento / limpieza

Extracción asistida por microondas y microextracción en fase sólida (SPME) son aplicaciones investigadas hasta ahora
para la metabolómica en general. Estos enfoques no se han extendido a los estudios de “cell factories” debido a que no se
obtienen resultados precisos porque estas técnicas de medición incluyen miniaturización, los requisitos de facilidad y
velocidad de entrega de muestras y los requisitos cuantitativos son mas exigentes, lo que significa que la matriz
normalización o estandarización interna basada en isótopos. Sin embargo, algunas técnicas de enriquecimiento
alternativas podrían resultar valiosas para los estudios de fábrica de células, especialmente cuando es deseable aumentar
la velocidad de preparación de la muestra.

Microextracción por sorbente empaquetado (MEP) propuestas para diversas aplicaciones bioanalíticas, permite la
determinación rápida de productos farmacéuticos y metabolitos en matrices biológicas complejas y volúmenes pequeños
no se aplican directamente a estudios de fábricas celulares, la miniaturización general de cartuchos SPE puede ser atractiva
para largas secuencias analíticas cuando todas las muestras requieren una limpieza en línea inmediatamente antes del
análisis o en el caso de configuraciones donde el cultivo / la fermentación se miniaturizan para permitir los enfoques
analíticos en línea directamente en un robot de manejo de muestras.

Medios de acceso restringido (RAM) utilizados frecuentemente para la purificación del ADN, las perlas magnéticas son
particularmente atractivas para las estrategias de enriquecimiento. RAM es una clase especial de materiales SPE
generalmente diseñados para el enriquecimiento o la exclusión de moléculas en función de un efecto de exclusión de
tamaño. Como RAM representa esencialmente una combinación de exclusión de tamaño con uno o más modos
cromatográficos diferentes, optimización de la estructura micro y nanoporosa y química de la superficie son
fundamentales en el desarrollo de materiales.
 Derivatización y estrategias de enriquecimiento selectivo

Derivatización: Transformar un compuesto químico en un producto que posee una estructura química
similar. Por lo general, se aprovecha un grupo funcional especifico del compuesto parental en la reacción
de derivatización transformando el reactivo en un derivado que posee características o propiedades
diferentes a las originales. Estas nuevas propiedades químicas pueden ser utilizadas para la cuantificación
o separación del producto.

Razones analíticas para su utilización

Comportamiento cromatográfico mejorado
(por ejemplo, mayor retención, selectividad
mejorada), criterios de detección (por ejemplo,
eficacia de ionización) o como mecanismo que
permite el enriquecimiento directo o la
limpieza de subclases de analitos.
Dentro del alcance de las mediciones metabolómicas de ESI-
MS, varias clases de metabolitos basadas en grupos
funcionales o rutas particulares pueden ser dirigidas para la
derivación química o el enriquecimiento, mientras que las
estrategias quimioselectivas han surgido más recientemente
como un medio para enriquecer (unir) y liberar (eluir)
subclases con un alto grado de
selectividad en ambos pasos.

Para que tales enfoques sean válidos, se debe llevar a cabo una reacción/enriquecimiento repetible en condiciones
suaves para evitar la degradación de metabolitos lábiles, cualquier derivado debe ser estable y no se deben formar
productos secundarios interferentes, y la reacción de derivatización necesita generar especies adecuadas para la
detección de MS
 Enfoques emergentes de enriquecimiento y derivatización química de clase

Metabolitos centrales de carbono Metabolitos fosforilados Metabolitos de la ruta del azufre

Metabolitos pequeños que contienen
carbonilo en el metabolismo central de
carbono presentan un número de
desafíos analíticos para el análisis
basado en ESI-MS: Estabilidad (p. Ej.,
Descarboxilación de ácidos
βketocarboxílicos), degradación en la
fuente e interferencias potenciales con
iones de fondo (por ejemplo, lactato y
poli (ácido láctico)).
Los compuestos con funcionalidad de
fosfato que incluyen nucleótidos, azúcares
fosfatos y coenzimas participan en la
glucólisis, la ruta de la pentosa fosfato y el
ciclo de TCA. El contenido de energía de
estos metabolitos aumenta de mono a
trifosfato, pero la estabilidad con respecto
a la hidrólisis empeora, lo que significa que
la manipulación y el tratamiento
cuidadosos de la muestra son críticos para
una evaluación precisa del metaboloma
Son particularmente propensos a la
degradación durante los procedimientos de
preparación de muestras, por lo que los
estándares internos marcados isotópicamente
se usan para estudios cuantitativos de
metabolitos clave como GSH, mientras que
numerosas reacciones de protección contra
tiol también se desarrollan y utilizan para
impartir estabilidad antes del análisis.

HPLC de intercambio aniónico y la electroforesis capilar como enfoques Estrategia de enriquecimiento para HPLC-MS o,
adecuados para su determinación directamente a partir de muestras alternativamente, derivatización química para permitir el
extraídas debido a las características polares e iónicas de estos análisis por GC-MS para estudios cuantitativos.
metabolitos.
Enriquecimiento y orientación a través de interacciones chemoselectivas
 Plataformas on-line integradas

Las plataformas capaces de pasos de preparación de muestras altamente repetibles integradas con
mediciones de MS han surgido como una opción particularmente atractiva para los estudios de
metabolómica.

¿Por qué?

Cuando se planifican largas secuencias analíticas para generar

datos de alta calidad, tanto no orientados como cuantitativos,
existen dos factores determinantes que son la repetibilidad y la
reproducibilidad (es decir, que implican diferentes usuarios, Aurora Biomed
ubicaciones y / o sistemas de medición) de pasos de
preparación de muestras. Como los pasos de preparación
manual de muestras son laboriosos y pueden ser una
importante fuente de error analítico.
CONCLUSIONES
• La amplia gama de concentraciones de metabolitos presentes en extractos de
fábrica de células, que también cambian sustancialmente durante el curso de la
producción, es un aspecto desafiante para estudios de metabolómica como
diluciones, concentración de patrones internos y la influencia de la muestra, la
matriz; puede ser todas variables que influyen en la medición final.
• Desafíos analíticos para proporcionar datos precisos con métodos robustos.
• Producir extractos de células marcadas isotópicamente que representan un
estándar interno ideal para casi todos los metabolitos de interés ya que todo el
metaboloma está marcado 13C uniformemente y el isótopo 12C natural altamente
abundante está casi completamente ausente.
• El enriquecimiento selectivo de subclases es necesario para la elucidación de la vía
o la identificación de intermedios biosintéticos → Para estudios de fábrica de
células
Fuente: Metabolómica: la ciencia ómica más multidisciplinaria, Oscar Yanes