Electroforesis en geles de poliacrilamida

Integrantes:
Kevin Aguirre
Cristina Cajas
Cinthya Jiménez
Tatiana Lara
Jairo Quimbita
OBJETIVOS:
• Manipular adecuadamente los reactivos, materiales y equipos de
laboratorio para la preparación de soluciones, que permitan realizar un
corrimiento electroforético en geles de poliacrilamida.

• Determinar el funcionamiento de los reactivos empleados durante el

proceso de electroforesis.

• Preparar geles de poliacrilamida que intervienen en el proceso de

electroforesis discontinua, y describir su utilidad dentro del mismo.

• Realizar una corrida electroforética y determinar la existencia de proteínas

separadas en el gel.
 Poliacrilamida
La poliacrilamida es La acrilamida forma
un polímero polímeros lineales Es un soporte
entrecruzado que y la bisacrilamida empleado para
forma geles introduce uniones evitar
perturbaciones
porosos. cruzadas mecánicas

Forma geles que

permiten buena
En la electroforesis, visualización de las
bandas durante
forma la matriz del tiempo
gel y provoca el prolongado.
retardo
Es químicamente Tiene la ventaja de
dependiente del inerte, de que variando la
tamaño que marca propiedades concentración de
la separación. uniformes, capaz polímeros, se
de ser preparado puede modificar de
de forma rápida y manera controlada
reproducible. el tamaño del poro.
 Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE)
Técnica popular
Proteínas y pequeñas moléculas
para separar
de RNA
proteínas

PAGE: Proteínas SDS-PAGE: Para Resolución, Estos geles han reemplazado a los de
nativas o separar proteínas facilidad de uso y almidón por:
desnaturalizadas desnaturalizadas flexibilidad • Efecto como tamiz molecular
• Proporcionan el control del tamaño
de sus poros
• Presentan adsorción despreciable
del material proteico
Uso adecuado de poliacrilamida
 Trabajar bajo vitrina extractora.

No inhalar la sustancia.

Evítese la generación de vapores/aerosoles.

Protección preventiva de la piel.

En el caso de no poder sustituir la forma sólida

del producto en el proceso de pesada y
dilución, usar mascara para polvo de tipo 3.
 GEL DE POLIACRILAMIDA VS GEL DE AGAROSA
Agarosa+poliacrilamida: se consigue una porosidad
intermedia.

SEMEJANZAS

El espécimen se
Gran poder de puede añadir a
Reutilizable
resolución cualquier zona del
medio de soporte

Agarosa: polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se

disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar solidifica formando un gel, de alta porosidad.
Diferencias
mezclas complejas de proteínas.

Poliacrilamida pueden hacer en las

En agarosa se puede hacer concentraciones de 3,5 a 20 por ciento.
concentraciones de 1/2 a 2 Una ventaja importante
por ciento de agarosa en de los geles de
poliacrilamida es que
una solución tampón. La gama de gel de acrilamida es mucho son químicamente
inertes, transparentes y
más pequeño, menos de 500 pares de
estables en un amplio
bases.
Gel de agarosa puede rango de pHs,
temperatura y fuerza
separar fragmentos de ADN iónica.
La acrilamida es mejor para la separación
de 200 a 50.000 pares de de proteínas, ya que la resolución es mejor
bases. para el gel de agarosa. También se puede
utilizar para separar el ADN que difiere
únicamente por un solo par de bases.
Condiciones necesarias para una corrida electroforética
en geles de poliacrilamida
• +Voltaje: Excesivo calor • +catalizador:
• -Voltaje: Pobre separación Polimerización rápida
 deformar las bandas.
• -catalizador: Superficie del
Cantidad de gel desigual
Voltaje  romperse con facilidad.
catalizador

Tiempo de Pureza de los

corrida reactivos
• Corridas cortas: Impiden • Empleo de reactivos de
que las muestras avancen alta calidad “grado
el espacio necesario para molecular” y agua des
su separación. ionizada para hacer geles
de alta resolución.
 Formación del gel de poliacrilamida
Se detiene cuando
desaparecen los
Desgasificación radicales libres del
 Gel medio
Catalizadores: reproducible
- ión persulfato
Formación de (S2O8-)
radicales libres en  persulfato
el medio amónico. Velocidad: concentraciones de ión
Polimerización de - TEMED
acrilamida por persulfato y TEMED.
acción de un Porosidad: poliacrilamida y bis-acrilamida.
agente %Acril/Bis-acrilamida: rango de separación
entrecruzador, bis- del gel.
acrilamida.

Menor porcentaje
=
mejor separación de
proteínas grandes.
 Clasificación PAGE
(Electroforesis den geles de poliacrilamida)

Función del estado

de las proteínas

Electroforesis desnaturalizante Electroforesis nativa

Migración sin desnaturalización

Las proteínas se someten a migración  en función de la carga, tamaño y
 proporcional carga y tamaño forma.
molecular. Tris-Glicina (pH=8,3-9,5)
SDS Tris-borato (pH=7,0-8,5)
Tris-acetato (pH=7,2-8,5)
Metodología Resolving Stacking
Gel Gel
10 ml 5 ml
H2O 3.3 3.4
30%
4 830 ul
acril:bisacr
1.5 M Tris
2.5 630 ul
pH 8.8
10% SDS 0.1 50 ul
10% APS 0.1 50 ul
TEMED 4 ul 5 ul
Para 2
Para 2 geles
geles
 Preparación del BIS-Acril AL 30% Para SDS al 10% se tiene:
10𝑔 → 100 𝑚𝐿
𝐶1 : 40% de bis−acril 𝐶2 : 30% de bis−acril 𝑥 → 1 𝑚𝐿
𝑉1 : 𝑥 𝑉2 : 10𝑚𝐿 10𝑔×1𝑚𝐿
𝑥= = 0,1𝑔 en 1mL
100𝑚𝐿

• CIVI=C2V2
• 40VI=30x10
• VI=7.5ml
• Agua= 2.5 ml
Para APS al 10% se tiene:
10𝑔 → 100 𝑚𝐿
𝑥 → 1 𝑚𝐿
10𝑔×1𝑚𝐿
𝑥 = 100𝑚𝐿 = 0,1𝑔 en 1mL
 Reactivos para electroforesis
Tris-HCl SDS APS TEMED
- Catalizador
- Buffer - Desnaturalizante - Catalizador
- Tasa de
- Alcalinidad - Detergente - Radical
polimerización
MONTAJE DEL GEL
Buffer de carga: • Sacarosa: Peso a la muestra
para que precipite al fondo
de los pozos.
Para la muestra
• El azul de bromofenol:
Comprobar el progreso de
la electroforesis. Marca el
"frente de avance". SDS

• SDS para desnaturalizar y cubrir

a las proteínas de una carga
uniformemente negativa

• Mercaptoetanol para reducir

los puentes disulfuro
 1. Glicina carga - en el Tampón de
CORRIDA ELECTROFORÉTICA electroforesis a pH 8,8.
2. Campo eléctrico Gly, en Stacking Gel,
se aleja del electrodo negativo.
Buffer de Electroforesis 3. La Gly pierde carga a pH 6,8 y
ralentiza su movimiento. Los iones de
• Tris: mantiene el pH cloruro avanzan por delante de la
• Glicina: conductor Gly.
electricidad 4. Aumento de la resistencia, obliga a
• SDS: mantiene las proteínas las proteínas a alejarse, de forma
cargadas negativamente apilada

Cubrir el tanque con la tapa y

conectar los cables de los electrodos
en la fuente de poder

Tiempo: 1 hora y
media aprox.
CORRIDA ELECTROFORÉTICA
“Frente de avance“: de azul de
bromofenol alcanza la parte
inferior del gel, se desconecta
la fuente.

Se retiran los electrodos

Se sacan los geles de

acrilamida, separando los
cristales con una espátula.
 COLORACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS USANDO AZUL
BRILLANTE DE COOMASIE

Solución Colorante
Azul de Coomassie

Se deja el gel en Penetre y se fije a las • Colorante: 24horas

agitación suave. proteínas. • Decolorante: 7 días

Atracción Decolorante
electrostática
ácido sulfónico:
tautómero menos estable Proteínas
del ácido sulfuroso
 RESULTADOS

ESPERADOS OBTENIDOS
DISCUSIÓN
DESTINCIÓN
• La solución de destinción fue mal
elaborada.

• La solución de destinción tenía

mucho tiempo de elaboración.
DISCUSIÓN
• El voltaje que se aplica en los geles de
BANDAS agarosa depende de la resolución
requerida y del tamaño de los
fragmentos a separar.

• Si se cambia el voltaje, los fragmentos

cambian su movilidad electroforética,
sin que ésta guarde relación con su
. tamaño.
DISCUSIÓN
• Pocillos de poliacrilamida mal polimerizado.
BANDAS Mala homogeneización del APS y el TEMED en
la solución de poliacrilamida.

• La muestra no cayó de forma eficiente y se

difundió con el baffer de electroforesis en el
momento en que fue depositado en el
. pocillo.
CONCLUSIONES
• La correcta manipulación de reactivos, materiales y equipos dentro del laboratorio
permitieron realizar un corrimiento electroforético en geles de poliacrilamida.

• Se determinó el papel que cumple cada uno de los reactivos empleados durante el
proceso de electroforesis.

• Los pasos a seguir para la preparación de geles de poliacrilamida que intervienen en el

proceso de electroforesis discontinua fueron descritos minuciosamente, así como su
utilidad dentro del mismo.

• La manipulación del gel bajo condiciones cambiantes no permitió que se pueda

determinar la existencia de proteínas separadas en el gel tras el proceso de electroforesis