MARA ALEJANDRA GONZLEZ MORA

Mat.1593148

FACULTAD DE MEDICINA
QUMICO CLNICO BILOGO

DIAGNSTICO MOLECULAR Y
BIOTECNOLOGA
Introduccin
presentadora de
antgeno por
La infeccin
excelencia
persistente parece indispensable en la
ser debida a diversas induccin y
estrategias virales de regulacin de la
respuesta inmune
evasin y especfica,
Problema de salud
pblica modificacin de la su modificacin
respuesta inmune inducida por el VHC
podra favorecer el
establecimiento de
la persistencia
viral.

En este artculo se describe la

construccin de un baculovirus
recombinante, diseado para
expresar la protena Core
completa (191 aminocidos) en
clulas de insecto y la
purificacin de dicha protena por
punto isoelctrico y
electroelucin
 Materiales y mtodos
Anticuerpos:
Clulas: Se utiliz el anticuerpo
Las lneas celulares Sf9, Sf21 monoclonal humano
(Spoboptera frugiperba) y H5 B12.F8
Higk five (Trickoplusia ni) anticuerpo de oveja anti-
(Invitrogen, Escocia) IgG humana marcada con
peroxidasa en los ensayos
de Western blot.
,
2x clulas de insecto Sf9
4 g
0,5 g
de
ADN
de
Bac-N-
se conserv a 4C,
Blue * pBlueBac4.5/V5-His
protegido de la luz.
para generar una
protena de fusin
Aislamiento del clon
*Se incubaron durante
recombinante
10 das diluciones
seriadas sobre
monocapas de clulas
Sf9 en placas de cultivo
de 48 pozos
Clonacin de la secuencia Core
en el sistema baculovirus:
la secuencia Core del VHC se
amplific a partir del
plsmido pSFV1-Core , con
los iniciadores Bac-Core5 y
Bac-Core3
Se obtuvo la
secuencia del
extremo 3 del
fragmento
clonado a
partir de pBS-
Core *E coli DH5a con pBS-Core,
fueron seleccionados segn el
anlisis de restriccin
se realizo la
Luego de la identificacin del
extraccin de ADN
con la tcnica de clon recombinante, el ttulo viral
fenol:cloroformo:alcohol se amplific por infecciones
botones isoamlico sucesivas de cultivos de
clulas H5.
 Materiales y mtodos

Cintica de produccin de la protena Core en Produccin en masa de la protena Obtencin de protenas

clulas H5 infectadas se resuspendieron en
recombinante 100 L/10 clulas de
6

Los botones celulares obtenidos a las Luego de identificar el punto de mayor tampn RIPA e
24, 48, 72 y 96 horas despus de la expresin de la protena recombinante inhibidores de
Core, se realiz la infeccin de monocapas proteasas
infeccin se conservaron a -20C
de clulas

Anlisis de protenas por *ensayos de purificacin

Deteccin de la protena recombinante electroforesis en gel de poliacrilamida la fraccin de protenas se

por Western blot (SDS-PACE) obtuvo utilizando el tampn
CHAPS, proteasas, como se
describi anteriormente. Los dos fracciones,
botones de clulas se protenas citoslicas
homogenizaron en hielo
. La fraccin de protenas
asociadas a membrana
Una alcuota de 30 g de protenas (botn) fue sometida a las
Las protenas se transfirieron a una citoslicas o protenas de membrana tcnicas de isoelectroenfoque
membrana Hybond- obtenidas de clulas control o clulas y electroelucin.
infectadas
polivinildifluoruro , en cmara
semiseca Separacin de protenas por punto Cuantificacin de protenas totales
isoelctrico
Las protenas se cuantificaron por
Se utiliz el sistema de rotofor, para separar el mtodo del cido bicinconnico
utilizando un estuche comercial
las protenas por punto isoelctrico
 Resultados
Amplificacin y clonacin de la secuencia
Core del VHC en el vector de transferencia
de baculovirus pBlueBac4.5/V5-His
El anlisis de la electroforesis de agarosa al
2% permiti identificar una banda de 600 pb,
aproximadamente
la cantidad de protena recombinante presente
en la fraccin de protenas de membrana es
netamente mayor que en la fraccin de
protenas citoslicas
Deteccin de la produccin de
la protena en clulas
cotransfectadas
La produccin de la protena se confirm por la
tcnica de Western blot
Cintica de produccin de Core
La expresin de la protena Core se demostr 24 horas
despus de la infeccin en los cultivos de clulas H5,
con mximo nivel de produccin 96 horas despus de
la infeccin
Aislamiento del clon recombinante
De las 32 diluciones evaluadas, slo en la
dilucin 18 se logr amplificar una banda
de 1 kb, en la dilucin 31 se logr amplificar
una banda de 839 pb que corresponde al
baculovirus silvestre
carril 1: peso molecular 1 kb ladder
(Promega) carril 2: control de
amplificacin a partir de clulas Sf9
no infectadas carril G: control de
amplificacin a partir del
BacNBlue carriles 4-l: infeccin
mixta en la que se observa la banda
de la amplificacin del baculovirus
silvestre de 800 pb,
aproximadamente, y la sonda de
amplificado del baculovirus
recombinante de 1 kb,
aproximadamente carril 6:
amplificacin del clon recombinante
baculovirus-Core de 1 kb.
 Resultados
Purificacin de la protena Core por electroelucin a partir de
gel

El anlisis por Mestern blot permiti identificar la

protena Core en las fracciones de pH 6,9 a 8,2
que corresponden a fracciones con menor carga
proteica, lo que facilita la purificacin a partir de Las fracciones proteicas aisladas por
gel. electroelucin se sembraron en dos geles revel la presencia de una o dos
Discusin: bandas de protena, como mximo,
Una ventaja de la tcnica de purificacin de protenas por por fraccin
punto isoelctrico es la eliminacin de otras protenas con un
peso molecular similar a la protena de inters pero con punto
isoelctrico diferente. Los ensayos de electroelucin
permitieron obtener la protena Core recombinante pura, con
predominancia de la isoforma p23 con relacin a la isoforma 1: protena electroeluida de 16 kd, aproximadamente
p21. Este mtodo de purificacin tambin tiene algunas carril 2: protenas electroeluidas a partir de gel con
desventajas, entre las que se encuentran la cantidad de peso aproximado entre 21 y 2G kd
protena purificada obtenida, aproximadamente, 300 ng de
protena Core a partir de 5x108 clulas H5
Considerando que la protena Core obtenida posee varias de
las condiciones de la protena nativa como peso molecular,
isoformas y localizacin subcelular, El anlisis por Mestern blot demostr que la
banda nmero 2, a partir del peso molecular
consideramos que la protena producida por este sistema es de 20 kd corresponde a la protena Core