Introduccin a la espectroscopa
vibracional
1. .Conceptos bsicos
Estados vibracionales y energa
Modos normales de vibracin
frecuencia de vibraciones
2. .Tcnicas
Espectroscopa infrarroja 3.
Regiones del IR
Grupos funcionales
"Huellas digitales"
Nmero de ondas e intensidad
Reglas de seleccin
FTIR y sus ventajas
Espectroscopa Raman
Dispersin inelstica de
fotones (Stokes y anti-Stokes)
Reglas de seleccin
Ventajas sobre el IR
Resonanacia Raman
.Aplicaciones a protenas
Anlisis de estructura
secundaria
Clculos
Asignaciones
Uso de istopos
Grupos laterales
1
Bibliografa

Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin

Cummings (1984)
Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2,
(1984).
Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and
Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem.
38; (1986), p. 180
Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform
Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p
290
Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman
Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311

2
 Introduccin a la espectroscopa
vibracional
Espectro electromagntico

Longitud de onda Tipo de radiacin Tipos de transicin

Frecuencia (Hz)
1020 - 1024 10-12 - 10-16 m Rayos gamma Nuclear
1017 - 1020 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos
1015 - 1017 400 - 1 nm Ultravioleta Electrones externos
4.3x1014 - 7.5x1014 700 - 400 nm Visible Electrones externos
1012-1014 2.5 m - 700 nm Infrarrojo Vibraciones
108 - 1012 1 mm - 2.5 m Microondas Rotaciones
100 - 108 108 - 1 m Radiofrecuencia Inversin de spin
3
E Estados vibracionales y energa

Distancia internuclear

4
3
2
1
0 1 k
Frecuencia de la vibracin
2
k = constante de fuerza del enlace F = -kx
m1m2
= masa reducida, para un sistema diatmico
m1 m42
Modos normales de vibracin (3N - 5)

cm-1 IR RAMAN

estiramiento
O C O 1340 - +
(sim)

estiramiento
O C O 2349 + -
(asim)

deformacin O C O
667 + -

deformacin O C O 667 + -

5
Tcnicas: INFRARROJO
Reglas de seleccin:

No todas las vibraciones sern activas

en IR

Slo aquellas en las que cambie el

momento dipolar permanente durante la
vibracin
6
INFRARROJO

7
 O

NH CH3
INFRARROJO

N-H C-H

C=O

8
 FTIR
Espectrometra IR con
Transformada de Fourier
1. Mejor relacin seal/ruido ya
que la luz no debe pasar por un
monocromador.
2. Se miden todas las frecuencias
a la vez lo que da mucha mayor
rapidez
3. Puede tener una resolucin de
menos de 0.01 cm-1
4. Los espectros pasan
necesariamente por una
computadora lo que facilita el
anlisis y manejo espectral 9
 Modos normales de vibracin del grupo amida
(valores para metilacetamida)
C H C H C H C H

C N C N C N C N

O C O C O C O C
estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida II (1567 F) amida III (1299 M)

C H

C N C H C H C H

C N C N C N

O C O C O C O C

amida IV (627 D) amida V (725 F) amida VI (600 M) amida VII (206 M)

C H C H C H C H

C N C N C N C N

O C O C O C O C

estiramiento NC estiramiento CN y CC deformacin CCN deformacin CNC

(1096 D) (881 D) (436 D)
10
(289 D)
11
 Estructura secundaria

ovillo estadstico

hlice

transicin

antiparalela

Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol

Chem (1967) 242, 5460-5466
12
 Estructura secundaria
Estructura

Estructura
13
Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V
Biophysical Journal Volume 90 April 2006 29462957
 Porcentajes de hlice y cadena
extendida obtenidas por rayos X y
FTIR

Protena % Hlice % Cadena

extendida
FTIR RX FTIR RX
Carboxipeptidasa 40 39 33 30
-Quimotripsina 12 10 50 49
Concanavalina A 4 2 60 60
Lisozima 41 45 21 19
Papana 27 29 32 29
Ribonucleasa A 21 22 50 46

14
15
 Uso de istopos
1
H2O

C H

C N

O C

2
H2O

Efecto de la deuteracin de la
protena sobre la posicin de la
banda amida I

J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777

16
 Uso de
istopos

BIAP (A) apo BIAP (B) Asignacin tentativa

1682 C=O amida I (hoja )
Asignacin tentativa de 1660 C=O amida I (giro)
las diferentes bandas en 16511652 1652 C=O amida I (hlice )
el espectro FTIR de 1633 1633 C=O amida I (hoja )
BIAP y apoBIAP en
15861577 15861571 C=O COO Asp o Glu
2
H2O, pH 6.6
1547 1547 N-H amida II
15161517 15161517 OH anillo Tyr
1443 1455 17
N-2H amida II y 2HOH
 Uso de
istopos
C H

C N

O C 1 = 27 min
2 = 63 min
3 = 180 min
4 = 21 h

Efecto del tiempo en la deuteracin de tripsina en 2H2O a 25 C, pD = 3.1

Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974) 18

Istopos y posicin de las bandas

FTIR de monxido
de carbono unido a
citocromo c aa3 de
T. termophilus.

19
Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867.
Unin de ligandos

20
 Tcnicas: Raman
Dispersin inelstica de fotones
estados electrnicos virtuales

Sir Chandrasekhara Venkata Raman,

( )
Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888
Bangalore, Karnataka - 21/11/1970

Premio Nobel de Fsica 1930

21
 muestra
Lser, luz monocromtica

Regla de seleccin:

Para que la vibracin sea

Monocromador,
activa en Raman debe
provocar un cambio en la espectrgrafo
polarizabilidad de la
molcula.

Ventajas de Raman con respecto a IR

1. Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho
ms sensibles
2. El agua produce una dispersin Raman muy dbil
3. La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a
cromforos con una sensibilidad 102- 104 veces mayor
22
N N

23
24
25
 Resonancia Raman

estado electrnico excitado

estado energtico virtual

Resonancia
Raman Raman

estado electrnico basal

La resonancia Raman es ms intensa que la dispersin Raman,

pero necesita que exista un cromforo y slo se intensifican las
bandas debidas al cromforo
26
 = 406.7 nm

Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur

J Biochem 254(3): 662-70
27
 [hemo] = 0.34 mM
[SO42-] = 400 mM
SO42-

Spiro, T. C. and Strekas, T. G.

(1973) JACS 96: 338

28
Uso de istopos

Unin de xido ntrico a

superxido reductasa de
Pyrococcus furiosus

= 476 nm

29
Espectro IR de BSA slida (azul) y espectro Raman de BSA en
solucin en amortiguador de fosfato (rojo).

30
 Infrarrojo y Raman
El fenmeno de absorcin Se mide en el visible o UV
es ms intenso por lo que donde los detectores son
se requieren muestras mucho ms sensibles
menores El agua produce una
El equipamiento es ms dispersin Raman muy
sencillo y de uso ms dbil
flexible El Raman resonante
No presenta interferencias permite sondear grupos
con otros fenmenos asociados a cromforos
fsicos (p. ej. con una sensibilidad
fluorescencia) varios rdenes de
magnitud mayor

31
 Introduccin a la espectroscopa
vibracional
1. .Conceptos bsicos
Estados vibracionales y energa
Modos normales de vibracin
frecuencia de vibraciones
2. .Tcnicas
Espectroscopa infrarroja 3.
Regiones del IR
Grupos funcionales
"Huellas digitales"
Nmero de ondas e intensidad
Reglas de seleccin
FTIR y sus ventajas
Espectroscopa Raman
Dispersin inelstica de
fotones (Stokes y anti-Stokes)
Reglas de seleccin
Ventajas sobre el IR
Resonanacia Raman
.Aplicaciones a protenas
Anlisis de estructura
secundaria
Clculos
Asignaciones
Uso de istopos
Grupos laterales
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