Proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo

es lograr la concentracin diferencial de una

protena o molcula de inters

Caractersticas

Procedimiento

Solubilidad

1. Salting in
2. Salting out

Carga inica

1. Cromatografia de intercambio
inico
2. Electroforesis

Polaridad

1.
2.
3.
4.

Tamao molecular

1. Dialisis y ultrafiltracin
2. Electroforesis en gel
3. Cromatografa en filtracin en
gel
4. Ultracentrifugacin

Especificidad de unin

1. Cromatografa de afinidad

Cromatografa
Cromatografa
Cromatografa
Cromatografa
hidrfoba

de adsorcin
en papel
fase inversa
interaccin

kDa

MASA

TAMAO

Cromatografa
Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de
una mezcla, permitiendo identificar dichos componentes.
Muestra
aplicadaEluyente

Volumen
de columna

Matriz
Tapn
poroso

Eluyente

Protenas separadas

Matriz de la columna. Sustancia que est empapada de

solvente y que se empaqueta en la columna. Tambin se
denomina fase estacionaria o lecho de la columna.
Fase Mvil. Solucin Tamponada que se hace pasar a
travs de la columnaLongitud de la columna. Longitud del
dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es
importante en algunos tipos de cromatografa como la de
filtracin en gel y poco importante en otras como la
cromatografa de afinidad.
Volumen de la columna. Volumen total de gel que se
empaqueta en una columna cromatogrfica.
Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que
tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha
reemplazado completamente.

PRINCIPIO:
Tamao de partcula y masa
molecular.
Mayor masa molecular eluye prime
El gel retiene particuas de menor
masa molecular

TIPOS DE MATRIZ

APLICACIONES

Desalado de
protenas
Purificacin de
protenas
Determinacin del
peso molecular de
las protenas

GRANULOS DE UN
MATERIAL ESPONJOSO E
HIDRATADO

Dextranos con
enlaces cruzados

Agarosa

Poliacridamida

FASE ESTACIONARIA
En esta prctica se utilizar el gel dextrano.
Tipo

Peso molecular
Lmite de
fraccionamiento

Agua retenida
(g/g gel sec)

Volumen de gel
hidratado (ml/g
gel seco)

G10

Hasta 700

1.0

G15

Hasta 1500

1.5

G25

1000 - 5000

2.5

G50

1500 - 30 000

5.0

10

G75

3000-80 000

7.5

12-15

G100

4000 - 150000

10.0

15-20

G150

5000 400 000

15.0

20-30

G200

5000 800 000

20.0

30-40

Cromatografa de intercambio
inico

Intercambio catinico
Fase estacionaria cargada
negativamente
Intercambio aninico
Fase estacionaria cargada

GRADIENTE DE CONCENTRACIN

Cromatografa de Afinidad

Utiliza la alta especificidad entre

las molculas biolgicas para
separar componentes especficos
de mezclas complejas.

VENTAJAS:
No hay restriccin por volumen.
Especificidad
Pureza del producto final
DESVENTAJAS:
Precio (alto)
Condiciones de elucin drsticas
Ligando especfico no disponible o
inadecuado

Mtodos
espectrofotomtricos
Ventajas de la tcnica
Rpida
Precisa
Verstil
Fcil de usar
Eficiente en costo

ESPECTROFOTOMETRA
Son mtodos cuantitativos de
anlisis qumico que utilizan la luz
para medir la concentracin de las
sustancias qumicas.

Espectrofotomtria de absorcin
visible (Colorimetra)
Absorcin ultravioleta (UV)
Infrarroja

Radiaci Efecto
n

Tcnica

Informacin
Obtenida

Espectroscpic
a
UV- VIS

Transiciones electrnicas
entre los orbitales
atmicos y moleculares

Espectroscopa
ultravioletavisible

Existencia de
cromforos y/o
conjugacin en la
molcula a las
absorciones
observadas

Tungsteno (visible)
Deuterio (UV)

LEY DE LAMBERT Y BEER

Establece que la absorbancia es proporcional
al nmero de molculas absorbentes por las
que pasa la luz.

A = *C*b
A = absorbancia
C= concentracin
b=longitud de la celda

= coeficiente de extincin o absortividad

molar?

Coeficiente de extincin o absortividad m

Es una propiedad intrnseca de los
compuestos.
Es una medida de absorcin de luz de las
especies qumicas a una determinada
longitud de onda
Unidades

=M cm
-1

-1

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN
DE PROTENA
Los mtodos ms usuales son:
-Absorcin
-Reaccin

en el ultravioleta.

del Biuret.

-Mtodo

de Lowry.

-Mtodo

de Bradford.

Absorcin en el ultravioleta

Es

un mtodo no destructivo.

El

intervalo de concentracin que se puede

determinar depende del contenido de los
aminocidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y 2
mg/ml.
La

presencia de sustancias absorbentes a 280

nm conduce a interferencias.

Mtodo de Biuret

Las caractersticas ms importantes de la reaccin son:

La reaccin del Biuret se aplica, a partir de los tetrapptidos, a
todos los pptidos y protenas.
Su intervalo de determinacin es de 1 a 6 mg/ml.
No depende de la composicin de aminocidos.
Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.) dan la reaccin.

Complejo protena-Cu(II)
(Protena en solucin alcalina)

Coloracin violeta-prpura (540nm)

Mtodo de LOWRY
REACCIN DE BIURET + REACTIVO DE FOLIN-CIOCALTEU

(750 nm)
Esta
coloracin
se
atribuye
a
la
reduccin
del
cido
fosfomolbdico/fosfotngstico a azul de
heteropolimolibdeno de composicin no definida, por medio de los residuos
tirosilos, triptofanilos, y en menor grado, cisteinilos e histidilos de las protenas
que forman el complejo con el Cu2+.

Mtodo de BRADFORD

El

rango de determinacin de protena es de 1-10

mg/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo
estndar).
La intensidad de absorcin depende del contenido
de aminocidos bsicos y aromticos.

MTODO

VENTAJAS

DESVENTAJAS

Mtodo de Absorcin

No se pierden las
muestras

Interfieren
compuestos que
absorben en el UV

Biuret

Especfico para
protenas, muestra
pocas interferencias
es barato

Poca sensibilidad
1 a 6 mg/mL

Lowry

Tiene bastante
sensibilidad
de 0,1-1 mg/mL.

No todas las protenas

reaccionan igual.
Muestra interferencias
con detergentes no
inicos, sulfato de
amonio

Bradford

Muy sensible
0,5 -1,4 mg/mL

Muestra interferencias
con detergentes

MTODOS
COLORIMTRICOS

Curva Patrn

Es un marco de referencia que se construye de

cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la
albmina srica bovina) que se utiliza para determinar
la cantidad de protenas presente en una muestra
incgnita.
A
280n

A595n
m

BSA (g)

BSA (g)