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mRNA
Kim, 2005
miR172
A. thaliana miRNA genes
21-nts 21-nts
Ligation of linkers
5’adapter 3’adapter
miRNA-OH
P-
20
miRNA RT-PCR
3’RT primer
5’ primer
Cloning
A
MYB101 5’ UAGAGCUUCCUUCAA CCAAA 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
U
MYB33 5’ UGGAGCUCCCUUCA UCCAAG 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
0 dias 1 dia 2 dias
identificación de miRNAs
Clonación de miRNAs
miRNA RT-PCR
3’RT primer
5’ primer
Clonación
-ABA +ABA
0 24 48 0 2 4 8 12 24 48 t (hr)
- miR159
1.0 0.9 0.3 1.0 2.1 5.1 4.1 2.7 2.2 3.3
- 5S rRNA
miR159
Cómo identificamos los blancos?
…y los mRNAs blanco?
MYB101 mRNA
UAGAGCUUCCUUCAAACCAAA
|||||||:||||||| ||||| A
miR159a 3’AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’ AA
UAGAGCUUCCU
UCAAACCAAA
A
AA
5’RACE
G
OH RNA degradado
mRNA
P
RNA cortado + rRNA
linker RNA
1000
500
300
100
miR159 regula los mRNAs de MYB101 y MYB33
5’RACE
A
MYB101 5’ UAGAGCUUCCUUCAA CCAAA 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
5’RACE
U
MYB 33 5’ UGGAGCUCCCUUCA UCCAAG 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
Cómo funciona miR159 en respuesta a ABA?
señal (ABA)
miRNA
mRNA blanco
microarreglos
Supresores virales!
Genes HOX en Mamíferos y Drosophila
Como funcionan los miRNAs en Plantas?
mRNA blanco
respuesta
miR159a 5’ UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA 3’
miR-PDS159 5’ UUUGGAAAUAUGGGAUCUCUU 3’
miR159a 5’ UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA
3’
miR-PDS159 5’ UUUGGAAAUAUGGGAUCUCUU
vector miR-PDS
3’
1 2 3 1 2 3 dpi
40
30
miR-PDS 20
miRNA*
5’
miR-PDS* 3’
miRNA
miR159
miRNAs artificiales
#
A *
B
C
miR159 regula negativamente la respuesta a ABA
60 60
40 40
% germinación % germinació
20 20
0 0
0.0 0.5 1.0 3.0 5.0 0.25 0.5 1.0
ABA [µM] ABA [µM]
HC/Pro
Mutaciones en MYB101 para generar un mRNA resistente
A
MYB101 5’ UAGAGCUUCCUUCAA CCAAA 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
AAGU A
MYB101AAGU 5’ UAGAGCUUCC A CCAAA 3’
miR159a 3’ AUCUCGAGGGAAGUUAGGUUU 5’
La sobreexpresión de un mMYB101 resulta en
hipersensibilidad a ABA
100
90
80
70
60
WT
50
40
30
% germination (7dag)
20
10
0
AAGU
Col-0
(WT)
(AAGU)
0.5µM ABA pBA-MYB101pBA-MYB101
MYB33
ABA MYB101 Respuesta a ABA
(detener crecimiento)
miR159