Tcnicas de Centrifugacin

Fundamentos
Tipos de centrifugacin

Tcnicas de rotura de clulas y tejidos

El primer paso en la purificacin de la mayora de las
protenas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos
o de las clulas para obtener un lisado celular.
Los procedimientos de homogenizacin ms comunes son :
sonicacin. consiste en la aplicacin de ultrasonidos a una
suspensin celular. La intensa agitacin producida destruye
las membranas celulares.
Detergentes que solubilicen las membranas celulares.
Homogenizadores. Se trata de romper las clulas con la
ayuda de un mbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a
las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el
homogenizador.

Centrifugacin
Una vez obtenido el lisado o homogenizado celular se
ha de proceder a su fraccionamiento.
Una de las tcnicas ms empleadas es la centrifugacin.
Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma
que se produzca la acumulacin en el fondo del mismo
de las partculas que tienden a hundirse por tener una
densidad menor que la del medio en que se encuentran.
As, despus de la centrifugacin la muestra,
homognea, se habr separado en dos fracciones :
sobrenadante ('supernatant'), fraccin homognea que
no ha sedimentado, y el sedimento ('pellet') que ha
quedado adherida al fondo del tubo.

Centrifugacin

Centrifuga
Las centrfugas son instrumentos que permiten someter a
las muestras a intensas fuerzas que producen la
sedimentacin en poco tiempo de las partculas que
tienen una densidad mayor que la del medio que las
rodea.
En general se diferencian en funcin de los mrgenes de
aceleracin a que someten a las muestras en:
centrfugas (de pocas g a aprox. 3000xg)
super-centrfugas (o centrfugas de alta velocidad, rango
de 2000 xg a 20000 xg)
ultracentrfugas (de 15000 xg a 600000xg).
En las centrfugas se suele controlar la temperatura de la
cmara para evitar sobrecalentamiento de las muestras
debido a la friccin.

Partes de una centrifuga

En una centrfuga el elemento determinante es el rotor,
dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos.
Existen varios tipos :
rotor basculante. Los tubos se colocan en un
dispositivos (cestilla) que, al girar el rotor, se coloca en
disposicin perpendicular al eje de giro. As pues los
tubos siempre giran situados perpendicularmente al eje
de giro.
rotor de ngulo fijo. Los tubos se insertan en orificios
en el interior de rotores macizos. El caso extremo es el
de los rotores verticales en los que el tubo se sita
paralelo al eje de giro. Este tipo de rotores es tpico de
ultra centrfugas

Parmetros en cualquier centrifugacin

Los parmetros a
centrifugacin son:

tener

presentes

en

cualquier

volumen de solucin a centrifugar, que determinar el

tipo de tubos y rotores a emplear.
naturaleza qumica de la solucin, que determinar la
naturaleza del tubo a emplear
diferencia de densidad entre la partcula a sedimentar y
la densidad del medio en el que se encuentra. En
general cuanto mayor sea esa diferencia antes (menor
tiempo y menor fuerza de aceleracin) sedimentar.

Fundamentos
Las tcnicas de centrifugacin se basan
en el comportamiento de las partculas
ante un campo centrifugo aplicado.
Las partculas que difieren en densidad, en
tamao o en forma sedimentan con
diferentes velocidades cuando se someten
a un campo centrifugo.
La velocidad de sedimentacin depende
del campo centrifugo (G) aplicado,
dirigido radialmente hacia fuera.

Fundamentos
G = 2 r
G: Campo centrifugo
2 Velocidad angular del rotor (radianes/seg)
r: Distancia radial de la partcula al eje de
rotacin (en cm)

Fundamentos
G = 2 r
Dado que una revolucin del rotor es 2 radianes, la velocidad
angular del rotor en revoluciones por minuto (rpm)

2 (r.p.m) = /t
= ---------------60 seg
42 (r.p.m) 2 r
3600

G = ------------------

Fundamentos
El campo centrifugo generalmente se expresa como Campo
Centrifugo relativo (CCR) en mltiplos de g, la constante
gravitatoria es (980 cm/s)

42 (r.p.m) 2 r
CCR = ---------------(3600)(980)

Nomograma relacionado a CCR

Velocidad de sedimentacin
La velocidad de sedimentacin de una
partcula esfrica depende no solo del
campo centrifugo aplicado, si no tambin
del radio, la densidad de la partcula y de
la viscosidad del medio de suspensin.
d2 (p - l)
vs = ---------------- x 2r
18

Velocidad de sedimentacin
d2 (p - l)
vs = ---------------- x 2r
18

Vs: Velocidad de sedimentacin

d : Diamentro de la particula
p: Densidad de la particula
l: Densidad del liquido
: Viscosidad del medio

Tipos de Centrifugacin
Centrifugacin Preparativa

Centrifugacin diferencial
Centrifugacin de sedimentacin zonal
Centrifugacin Isopicnica (de igual densidad)
Centrifugacin Isopicnica de equilibrio

Centrifugacin en Gradientes
Tcnica de gradiente de densidad discontinuo o en
estratos
Tcnica de gradiente de densidad continuo

Centrifugacin Preparativa
Centrifugacin Diferencial
Basado en las diferencias de sedimentacin entre
partculas de distinto tamao y densidad.
til
para
separar
partculas
uniformemente
distribuidos en el homogenizado
Se debe realizar varias centrifugaciones para obtener
pastillas relativamente puras
Es muy eficaz para separar partculas cuyo orden de
magnitud
en
tamao
y
densidad
difieran
significativamente

Centrifugacin Preparativa
Centrifugacin de sedimentacin zonal.
La tcnica de centrifugacin zonal (s), implica la
formacin de una capa de la muestra en un gradiente
de densidad liquido continuo
La muestra se somete a centrifugacin hasta que se
haya efectuada la separacin deseada, esto es antes
de su sedimentacin completa
Metodo utilizado en la separacin de hibridos RNADNA, subunidades ribosomales y de otros
componentes celulares.

Centrifugacin Preparativa
Centrifugacin Isopicnica.
Se puede realizar con o sin el empleo una gradiente
de densidad.
En ausencia de una gradiente de densidad continuo
se centrifuga la muestra a una velocidad suficiente
como para que sedimente las partculas mas
pesadas y separarlas.
La muestra ahora se suspende en un medio que
tenga la misma densidad que la fraccin que hay que
aislar.

Centrifugacin Preparativa
Centrifugacin Isopicnica de equilibrio.
Se hace uso generalmente de sales de metales
pesados (Cs y Rb), para la preparacin de la
gradiente, tambin puede emplearse sacarosa.
La muestra se mezcla homogneamente con la
disolucin concentrada de cloruro de Cesio, esta
produce una gradiente de concentracin de cloruro
de Cesio, y por tanto una gradiente de densidad que
se formo a la gran densidad del Cesio

CENTRIFUGACIN EN GRADIENTE DE CsCl

<Tw

Centrifugacin en gradientes
Tecnica
de
gradiente
discontinuo o en estratos.

de

densidad

Se depositan cuidadosamente disoluciones de

densidad decreciente formando capas unas sobre
otras en el tubo de centrifuga, ayudado con una
pipeta
La muestra se colocara cuidadosamente en la parte
superior

Centrifugacin en gradientes
Tcnica de gradiente de densidad continuo.
Se utiliza un aparato especial formador de gradientes,
el cual consiste en dos cmaras cilndricas de
idntico dimetro, conectadas por sus bases,
permitiendo el mezclado
Una de las cmaras contiene la solucin mas densa y
la otra contiene una solucin menos densa, al abrir la
llave que comunica ambos vasos se produce la
mezcla de las soluciones de forma ascendente
Mientras se forma la gradiente se coloca en un tubo
de centrifuga, luego de terminado la gradiente se
coloca la muestra en la parte superior

Gradiente de Sucrosa

Consideraciones para seleccionar una

gradiente
Su rango de densidad debe ser suficiente para
permitir la separacin de partculas de inters
No debe afectar la actividad biolgica ni la integridad
de la muestra
No debe ser hiper osmtica ni hipo osmtica (Cuando
se trata de organelas)
Debe ser removible del producto purificado
No debe absorber en el rango UV o visible
No debe ser corrosivo para el rotor
No debe ser inflamable o toxico

Medios de gradientes utilizados con mayor

frecuencia
A) Inicos:

Cesio
Sales de Sodio y Potasio

B) No Inicos:

Sucrosa
Glicerol
Polisacaridos (Ficoll)
Silica coloidal (Percoll)