CURVA DE

CALIBRACION POR
FOTOCOLORIMETRIA
JEIMER KALEB USUGA LONDOO
JUAN DAVID LOPEZ NOREA

QUE
ES
LA
FOTOCOLORIMETRIA?

Mtodo que sirve para hallar concentraciones de diferentes

muestras coloreadas.
Consiste en medir la intensidad de luz absorbida(A) o
transmitida(T) por una solucin coloreada de compuestos.
El fundamento de la fotocolorimetria se debe a la capacidad de las
molculas para absorber radiaciones.
La absorcin de luz en un compuesto coloreado puede variar debido:
la longitud de onda(), concentracin del compuesto, longitud de
celda que contiene la muestra.

A QUE SE LLAMA LONGITUD DE

ONDA()?
La describe cun larga es la onda; y corresponde a la

distancia existente
consecutivos.

entre

dos

crestas

dos

valles

V=velocidad de propagacin.
F=frecuencia de onda.

SUSTANCIAS
COLOREADAS

Una sustancia es coloreada porque absorbe y transmite

radiacin
en
la
regin
visible
del
espectro
electromagntico.

Cuando una molcula absorbe radiacin u.v. o visible, lo

que fundamentalmente ocurre es que se excitan los

electrones de valencia.

QUE ES UNA ONDA?

Se entiende por onda a aquella perturbacin que transporta

energa, y que se propaga en el tiempo y espacio, la onda tiene

una vibracin de forma ondulada que se inicia en un punto y
contina hasta que choca con otro cuerpo.
Existen 3 tipos de ondas segn el medio en que se propagan:
las electromagnticas, las mecnicas y la gravitacionales.

REGION VISIBLE DEL ESPECTRO

Es la regin del espectro electromagntico que el ojo humano es

capaz de percibir. A la radiacin electromagntica en este rango de

longitudes de onda se le llama luz visible o simplemente luz.
El rango de las en las cuales la luz es visible es entre 400nm - 700nm

EL FOTOCOLORIMETRO

 Es un instrumento usado en la qumica para determinar la concentracin

de sustancias disueltas en lquidos o slidos mientras sean transparentes

a la luz visible, ultravioleta o infrarroja, midiendo y comparando sus
colores.
El aparato consta de un sistema lumnico para iluminar las muestras y se
mide con un sistema electrnico la cantidad de luz que pasa.
Los colormetros se basan en el principio de que la absorbancia de una
sustancia es proporcional a su concentracin, y es por eso que las
sustancias ms concentradas muestran una lectura ms elevada de
absorbancia.

ESPECTRO DE
ABSORCION
Es el nombre de una grafica, la cual muestra la intensidad

de la energa absorbida por una molcula, a partir de

diferentes longitudes de onda.

A partir de la grafica(espectro de absorcin), se puede

deducir la longitud de onda en la cual el compuesto

absorbe la mayor o menor intensidad de energa.
Al saber estas caractersticas, facilita segn sea el caso, la
deteccin de una sustancia, ya sea para determinar su
concentracin o diferenciarla de otros compuestos.

LA ABSORCION DE ENERGIA

La absorcin es el fenmeno por el cual la energa de un

fotn es tomada por otra partcula, como por ejemplo un

tomo cuyos electrones de valencia efectan una
transicin entre dos niveles de energa electrnica.
La cantidad de energa para lograr que los electrones de
valencia sean excitados se dan por la formula:

hc
E h

E = cantidad de energa (ergios).

v = frecuencia de la radiacin (Hertz).
h = constante de Planck.
c = velocidad de la radiacin en el vaco.
= longitud de onda de la radiacin (cm.).

TRANSICIONES ELECTRONICAS Y LONGITUDES DE

ONDA

Cuando una molcula absorbe energa, sus electrones de

valencia al absorber un fotn de energa el electrn puede

ocupar un orbital superior, los cuales se denominan orbital
antienlace.

-<165nm:compuestos saturados. ->165 nm: compuestos insaturados.

->185nm y >270nm: compuestos con pares de electrones libres.

EJEMPLO DE TRANSICIONES
ELECTRONICAS EN ALGUNOS
GRUPOS FUNCIONALES

TRANSMITANCIA
La transmitancia es una magnitud que expresa la

cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en la unidad

de tiempo.
La transmitancia ptica que se define como la fraccin
de luz incidente, a una longitud de onda especificada, que
pasa a travs de una muestra.

ABSORBANCIA
Medida de la cantidad de luz absorbida por la muestra.
La absorbancia A de una muestra se define como:

LEY DE BEER

La Ley de Beer es una ecuacin que relaciona la absorcin

de luz con las propiedades del material atravesado.

Cuando un rayo de luz monocromtica pasa a travs de un
medio absorbente se cumple que la absorbencia de este es
directamente proporcional a la concentracin de la muestra.
A=xcxl

 A = Absorcin (Intensidad de energa absorbida)

C = Concentracin de la muestra en mol/l

l = Longitud de la celda
= Coeficiente de extincin molar o absortividad molar.

La ley explica que hay una relacin exponencial entre la transmisin

de luz a travs de una sustancia y la concentracin de la sustancia,

as como tambin entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la
luz atraviesa. Si conocemos y , la concentracin de la sustancia
puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.

CONCENTRACION

La concentracin de una disolucin es la proporcin o relacin que

hay entre la cantidad de soluto y la cantidad de disolvente, donde el
soluto es la sustancia que se disuelve, el disolvente la sustancia que
disuelve al soluto, y la disolucin es el resultado de
la mezcla homognea de las dos anteriores. A menor proporcin de
soluto disuelto en el disolvente, menos concentrada est la
disolucin, y a mayor proporcin ms concentrada est.

USO DE LA LEY DE BEER

El uso o aplicacin mas importante de la ley de Beer es
la determinacion de concentraciones desconocidas de
soluciones de sustancias que absorben en la regin u.vvisible. Podemos calcular la concentracin de una
muestra problema, si las condiciones son iguales,
definimos las siguientes formulas:

CURVA DE CALIBRACION
Para determinar concentraciones desconocidas mas precisas por

medio de la ley de beer, usualmente se prepara una curva de

calibracin a partir de una series de soluciones patrn, cuyas
concentraciones sean prximas a la reales.

PRACTICA NO. 1
CURVA DE CALIBRACION POR
FOTOCOLORIMETRIA

REACTIVOS Y PRODUCTOS
Fotocolormetro.
Reactivo de Biuret.
Solucin de albmina, (solucin patrn, estndar de BSA (albmina de

suero)).
Solucin salina al 0.9%
Muestras problema: casena, suero sanguneo, gelatina (sin sabor).

DETERMINACION DEL ESPECTRO

DE ABSORCION DE LA ALBUMINA
En un tubo de ensayo agregue 4 ml. de las solucin de albmina y 1

ml. del reactivo de biuret. Agite y espere 30 minutos para que se

desarrolle el color.
Tome dos celdas del fotocolormetro y agregue, en una, agua
destilada que se emplear como blanco, y en otra, solucin coloreada
de la albmina. Llnela solo hasta las 3/4 partes de su volumen.
Lleve al instrumento ( fotocolormetro ) la celda que contiene el agua
destilada, y ajuste la lectura de absorbancia en cero.
Lleve luego la celda con la solucin coloreada y anote la absorbancia
que indica el instrumento.

ESPECTRO DE ABSORCION(GRAFICA
HIPOTETICA)
(nm)

ABS

400

0.172

420

0.136

440

0.196

460

0.303

480

0.520

500

0.590

520

0.600

540

0.570

560

0.488

580

0.415

600

0.392

620

0.360

640

0.324

PREPARACION DE LA CURVA DE
CALIBRACION DE LA ALBUMINA
Rotular diez tubos con las caractersticas

especificadas.
Agregar a cada tubo 4 ml del reactivo de
biuret.
Seleccionar en el fotocolormetro la de

mayor absorbancia y ajustar el cero de

absorbancia con el blanco.
Calcular la concentracin de la protena en
los tubos que tienen la solucin
patrn(c1v1=c2v2).

CURVA DE CALIBRACION DE LA
ALBUMINA(HIPOTETICA)

VID
EO