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INMUNOLOGA ESPECIAL

GENERALIDADES
Lic. TM Henry A. Campos Pajuelo
06/ 03/ 2013
Mtodos analticos basados en la reaccin
Antgeno - Anticuerpo (Ag-Ac).
Antgeno: Estructura capaza de generar una
respuesta inmunolgica
Y Propios
Y No propios
ANTGENO
EPTOPE
Protena producida por el cuerpo en respuesta a
algo extrao.
Analito: Todo lo que se mide en una prueba de
laboratorio:



Anticuerpo
Antgeno
CADENA LIGERA
CADENA PESADA
ZONA
BISAGRA
PUENTES DISULFURO (2)
REGIONES
CONSTANTES
REGIN
VARIABLE
SITIO DE UNIN
ANTIGNICA
(PARATOPO)
ESTRUCTURA DEL ANTICUERPO IgG
TIPOS DE ANTICUERPO
CASO HIPOTTICO
VIRUS EPTOPE
VIH A, B, C, D, E
HEP B A, B, D, E, F
CASO HIPOTTICO
VIRUS EPTOPE EPTOPE ESPECFICO
VIH A, B, C, D, E C
HEP B A, B, D, E, F F
Mezcla de anticuerpos (antisuero policlonal) cada
uno de los cuales puede unirse a diferentes puntos
de unin del antgeno o eptope.
ANTGENO
DETERMINANTES
ANTIGNICOS
INOCULACIN
DEL Ag EN
CONEJO
DESARROLLO DE CLULAS PLASMTICAS
(LINFOCITOS B ACTIVADOS) Y FORMACIN
DE ANTICUERPOS
CLULA PLASMTICA
ANTICUERPO
LOS DIVERSOS ANTICUERPOS FORMADOS ESTN
DIRIGIDOS A DIVERSOS EPTOPES
PURIFICACIN DE ANTICUERPOS





ANTISUERO:


MEZCLA DE
ANTICUERPOS
(POBLACIN
HETEROGNEA)
ANTICUERPOS POLICLONALES ANTI ANTGENO X
Reactivo anti antgeno X
A
d
nti Eptope 1
el Ag X
Anti Eptope 3
del Ag X
Anti Eptope 2
del Ag X
Anti Eptope 4
del Ag X
Anti Eptope 7
del Ag X
Anti Eptope 6
del Ag X
Anti Eptope 5
del Ag X
Muy especficos para un eptope simple en un
antgeno multivalente. Se producen a partir de
una lnea celular simple usando tecnologa para
hibridomas y lneas celulares de mieloma de ratn.
Hibridomas son clulas tumorales productoras de anticuerpos
que producen varias copias del mismo anticuerpo.
ANTGENO
DETERMINANTES
ANTIGNICOS
INOCULACIN
DEL Ag EN
RATN
DESARROLLO DE CLULAS PLASMTICAS
(LINFOCITOS B ACTIVADOS) Y FORMACIN
DE ANTICUERPOS
CLULA PLASMTICA
ANTICUERPO
LOS DIVERSOS ANTICUERPOS FORMADOS ESTN
DIRIGIDOS A DIVERSOS EPTOPES
CLULAS TUMORALES: Clulas de mieloma de ratn
Se van a fusionar con las clulas plasmticas (linfocitos B activados)
productoras de anticuerpos
Estas clulas pueden crecer
indefinidamente en cultivo
celular (inmortales)
LOS LINFOCITOS B OBTENIDOS DEL BAZO DEL RATN SE FUSIONAN CON
LAS CLULAS DE MIELOMA DE RATN PARA FORMAR LAS HIBRIDOMAS
HIBRIDOMAS
(inmortales)
SELECCIN Y
AISLAMIENTO DE
HIBRIDOMAS
FORMADAS
Los anticuerpos que forman las
diferentes colonias son analizados
para conocer su capacidad de unirse
a un antgeno determinado
El hibridoma ms eficiente y que
resulte de inters se expande
Y Por cultivo celular
Y Por induccin de tumores en ratones
LOS ANTICUERPOS
MONOCLONALES
PRODUCIDOS SE PURIFICAN
Reconocen especficamente a un nico eptope de
un determinado antgeno (poblacin homognea)
Inmunoensayos Directos: Medicin directa del
complejo Ag-Ac.
Precipitacin
Inmunodifusin
Aglutinacin
Reaccin de Widal
Floculacin
VDRL




Inmunoensayos Indirectos: Requieren el uso de
material marcado para medir el complejo Ag-Ac
LA MARCACIN DE ANTICUERPOS O DE ANTGENOS PERMITEN LA DETECCIN DEL
COMPLEJO Ag-Ac
-Ac
INMUNOENSAYOS INDIRECTOS
Clasificacin de los Inmunoensayos Indirectos
Segn el tipo de marcador
Radioinmunoensayos
Enzimoinmunoensayos
Fluoroinmunoensayos
Quimioinmunoensayos


Segn el mtodo de separacin
Homogneos
Heterogneos


Segn el diseo del ensayo
Competitivos
No competitivos (sndwich)
Radioinmunoensayos
125 3
Se utiliza un marcador radioactivo: I, H
La medicin se realiza con un contador de
centelleo
RIA (Radioinmunoensayo)
IRMA (Ensayo Inmunoradiomtrico)
R
R
RIA
COMPETITIVO
IRMA
NO COMPETITIVO
Enzimoinmunoensayos
Se utiliza una enzima como marcador: Fosfatasa
Alcalina, Peroxidasa
La medicin se realiza colorimtricamente
ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima)
WESTERN BLOT(Electroinmunotransferencia)
E
E
ELISA DIRECTO
POCILLO RECUBIERTO CON ANTICUERPOS
ELISA DIRECTO
INCUBACIN CON MUESTRA PROBLEMA
ELISA DIRECTO
RESULTADO DEL PRIMER LAVADO
ELISA DIRECTO
INCUBACIN CON CONJUGADO
ELISA DIRECTO
RESULTADO DEL SEGUNDO LAVADO
ELISA DIRECTO
INCUBACIN CON SUSTRATO
ELISA DIRECTO
FORMACIN DE PRODUCTOS COLOREADOS
ELISA DIRECTO
PRODUCTO FINAL LUEGO DE LA ADICIN DE SOLUCIN DE PARADA
WESTERN BLOT
Ac.
Primario
(muestra)



Bandas
(antgenos)
Ac. Secundario
(conjugado)
Sustrato
Membrana de
nitrocelulosa
Antgenos
Fluoroinmunoensayos
Se utiliza como marcador una sustancia
fluorescente: isotiocianato de fluorescena,
ficoeritrina, ficocianina
IFD (Inmunofluorescencia Directa)
IFI (Inmunofluorescencia Indirecta)
Citometra De Flujo
F
F
IFD
Tejido (muestra) que
presenta el Ag de inters
Ac marcado (reactivo)
que reconoc e el
antgeno de inters
Observacin del preparado
con el microscopio de
fluorescencia
Quimioinmunoensayos
Se utiliza como marcador una sustancia que
genera luminiscencia: luminol, isoluminol, ster de
acridina, rutenio
QL (Quimioluminiscencia)
EQL (Electroquimioluminiscencia) Q
Q
EQL
CT O AG O ELE ROD - M NET


Campo elctrico
Luminiscencia
Antgeno de inters
(muestra)
Homogneos: El complejo Ag-Ac no requiere ser
aislado para la lectura
Monitoreo teraputico de frmacos, deteccin
de drogas de abuso


Heterogneos: El complejo Ag-Ac requiere ser
aislado para la lectura (lavados)



ELISA
TUBO DE
REACCIN
REACTIVO DE Ac
DE FASE SLIDA
SE MIDE EL
COMPLEJO Ag-Ac
LAVAR Y AISLAR EL
COMPLEJO Ag-Ac
TCNICA HOMOGNEA
TCNICA HETEROGNEA
MUESTRA (Ag)
+


REACTIVO DE Ac
MARCADO
+
INMUNOENSAYOS HOMOGNEOS Y
HETEROGNEOS
Competitivos
No competitivos (sndwich)
COMPETITIVO
Cantidad limitada de
anticuerpos
FORMATO COMPETITIVO
CONCENTRACIN
L
E
C
T
U
R
A
RELACIN
INVERSA
NO COMPETITIVO (SNDWICH)
FORMATO NO COMPETITIVO
CONCENTRACIN
L
E
C
T
U
R
A
RELACIN
DIRECTA