WESTERN BLOT

Mtodo de biologa molecular para

detectar una protena de inters usando
un anticuerpo especfico.
El fundamento es una discriminacin de
los antgenos frente a los que se dirigen
los anticuerpos presentes en la muestra .

WESTERN BLOT

Requiere:
Anticuerpo monoclonal o policlonal.
Solucin que contenga la protena.
Pasos esenciales:
Transferencia de protenas de un gel a la
matriz
Marcado del eptope con un anticuerpo
especfico.

WESTERN BLOT

Se basa en la separacin de las protenas
(antgenos) obtenidas del VIH-1
procedentes del lisado del cultivo del
virus .
La protena viral as obtenida se coloca
en un gel de poliacrilamida en forma de
lminas delgadas y luego se efecta una
electroforesis .

WESTERN BLOT

Despus se transfieren a una tira de
nitrocelulosa.
Estas tiras se exponen al suero humano
diluido, despus de una incubacin se
lavan y se vuelven a incubar con una IgG
antihumana marcada con una enzima que
con la exposicin a un revelador
enzimtico producir una banda
coloreada en las zonas correspondientes
a los anticuerpos especficos que
contenga la muestra.

WESTERN BLOT
Las tiras pueden contener un nmero
variable de bandas :

Principales bandas del Western blot
Denominacin Protena gen
gp160 Presursora de la envoltura
env gp120 Glucoproteina externa
gp41 Glucoproteina transmembrana
p55
Precursora
gag
p40
p24 Proteina principal
p17 Proteina de la matriz
p66
Transcriptasa inversa
pol p51
p31 Endonucleasa
Criterios mnimos de positividad

Criterios mnimos de FDA
FDA: Existencia por lo menos de tres
bandas: p24, p31 y gp41 u otra
glucoprotena
ARC: Existencia de al menos 3 bandas
una por cada uno de los 3 genes
estructurales
CDC: Al menos dos bandas: p24, gp41 y
gp160/120
CRSS: Al menos una banda del core
(gag/pol) y otra de envoltura (env)
OMS: Al menos dos bandas de envoltura

Preparacin de la muestra
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo
celular.
Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin.
Despus se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para
grandes volmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras
pequeas) o por sonicacin.
Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el sobrenadante, la
fraccin no precipitada.
Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos.
Tambin pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la
lisis y solubilicen las protenas.
A veces se aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la
digestin por las enzimas celulares de las protenas y de las
fosfoprotenas, respectivamente.
Azul de
Bromofenol
Calentador Licuadora o
homogenizador MUESTRA
Tubos de
microcentrifugacin
Fuente de tejidos
Buffer de
extraccin
Electroforesis en gel
Las protenas de la muestra sern separadas mediante una
electroforesis en gel en funcin de uno o varios de estos
criterios: punto isoelctrico, peso molecular y carga elctrica.
La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la
muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-
PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampn con
dodecilsulfato (SDS).
En esta tcnica las protenas sufren un tratamiento por agentes
reductores que provocan la prdida de las estructuras
secundaria y terciaria y mantiene los polipptidos en este
estado desnaturalizado.
De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no
influye en la electroforesis, y pueden separarse nicamente en
funcin del tamao.

Fuente de
energa
Bandas de
protenas
separadas
Buffer del
nodo
Buffer del
cnodo
Gel
Polo (+) Polo (-)
Muestra
Jeringa
Cmara de
electrodo
negativo
Tanque
Transferencia
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos,
se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de
nitrocelulosa o de PVDF.
Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin
de un campo elctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por
su capacidad de unir protenas de forma inespecfica (es decir, se
adhieren a todas las protenas con idntica afinidad)
las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente
la naturaleza de las interacciones membrana - protena, se sabe con
cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de
naturaleza hidrfba.
en las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones
hidrofbicas y de dipolos entre la membrana y las protenas. Como
particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes
de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad
y a la ausencia de surfactantes.

Difusin simple
En la transferencia por difusin simple se ponen
en contacto las superficies del gel electrofortico y
de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco
de papeles de filtro.
Este protocolo no est muy extendido
actualmente, puesto que la cantidad de protena
transferida a la membrana es muy baja, mucho
menor que con la electrotransferencia.
Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por
una modificacin que permite obtener mltiples
transferencias de un mismo gel, permitiendo de
esta forma realizar varias pruebas sobre geles
virtualmente idnticos.
Esta modificacin es viable cuando no es
necesaria una transferencia cuantitativa de
protena.

Transferencia al vacio
En esta tcnica, se aade el poder de succin de
una bomba conectada a un sistema de secado de
planchas de gel, el cual lleva las protenas desde
el gel hasta la superficie de la membrana de
nitrocelulosa.

Este mtodo es vlido tanto para protenas de alto
como de bajo peso molecular
Electrotransferencia
Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un
tampn de transferencia para llevar las protenas
desde el gel hacia la membrana.
Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes
elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o
nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados
en buffer de transferencia, gel, membrana, ms
papeles de filtro empapados y otra esponja.
Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se
dispone en el sistema de transferencia y se aplica
una corriente elctrica, de magnitud acorde a los
materiales empleados, al tiempo disponible,
Las protenas del gel se desplazan hacia el polo
positivo y quedan atrapadas por la membrana
buffer de transferencia
Polo (-)
Polo (+)
Papel filtro
Papel filtro
Papel filtro
Membrana
Gel
Membrana con
protenas
transferidas
Bloqueo
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse
protenas de forma inespecfica, es preciso bloquear los
lugares de unin que han quedado libres tras la
transferencia.
En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica)
empleado en la deteccin puede unirse a ellos,
dificultando la distincin del complejo antgeno-antgeno
que se forma con la protena que se busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin
de protenas, tpicamente de albmina de suero bovino o
ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche
en polvo o casena, con una diminuta fraccin de
detergente, como Tween 20 o Tritn X-100.
Las protenas en solucin se unirn a todos aquellos
lugares de unin de la membrana que no estn ya
ocupados por las transferidas desde el gel.
De este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su
antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y
los falsos positivos.

Deteccin
En la deteccin se comprueba la presencia
en la membrana de una determinada
protena. Para ello se emplea un anticuerpo
especfico contra ella unido a enzima que, en
presencia de su sustrato, catalice una
reaccin colorimtrica (produce color). De
esta forma, se hace patente la unin con el
antgeno, la protena, as como su
localizacin.
El proceso tradicionalmente se ha realizado
en dos pasos, aunque ahora es posible la
deteccin en un nico paso, lo cual es til en
ciertos campos.

Secuencia del
Western Blot
Aplicaciones
Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms
usadas en el estudio de la biologa molecular
El Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando
el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es
de riesgo o en una poblacin donde la prevalencia del
virus es muy baja.
Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata
espongiforme bovina, comnmente llamada "enfermedad
de las vacas locas".
Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme
usan el Western blot.
En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot
para confirmar la presencia del FIV en gatos.
TEST DE WESTERN BLOT PARA PRUEBA
DEL VIH
Objetivo- Detectar anticuerpos especficos
contra el VIH1/2
Fundamento
Test Inmunolineal o ELISA en banda, que
detecta anticuerpos
Lisado viral de clulas infectadas,
sometidos a electroforsis en gel de
poliacrilamida y transferido a hojas de
nitrocelulosa


POSITIVO
- Si dos bandas presentan intensidad >1+ en
relacin al control ,
- Una banda de envoltura y la p24
- Presencia de bandas gp120, gp41, p31, p24 y p17
para HIV1
- Protenas gp105 y gp36 para HIV2
gp120 gp41 p31 p24 p17
3+ 1+ +/-
Control
gp105 gp36
INDETERMINADO
- Si dos o mas bandas presentan intensidad
+/-
- Si una banda presente intensidad <1+ y el
resto son negativos en relacin al control
Criterios de interpretacin
NEGATIVO
Si todas las bandas presentan valoracin <+/-
Ausencia de protenas

3+ 1+ +/-
Control
3+ 1+ +/-
Control
Gp120 p24