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viticultura

Brettanomyces
bruxellensis
Paisaje de La Rioja Alavesa
en la bodega
Brettanomyces/Dekkera bruxellensis es una
levadura contaminante con graves consecuencias
Graves sensoriales en vinos de alta calidad. En este
consecuencias artículo se describe brevemente su metabolismo
sensoriales y su ecología en las bodegas. Igualmente se
comparan las técnicas utilizadas en los laboratorios
para su detección y cuales son las limitaciones de
los diferentes métodos. Finalmente se analizan las
I. Hernández y F. Barbero estrategias desarrolladas para su eliminación de las
Departamento Técnico Guserbiot S.L.
bodegas y se dan una serie de recomendaciones
para su control.

E
l vino en un producto fermentado El etanol producido durante la fer- medious, B. lambicus, B. custerseii o D.
que se elabora a partir de materia mentación alcohólica impide el creci- intermedia son sinónimos de B. bruxe-
prima sin tratar, se consume crudo y miento de casi todas estas levaduras “in- llensis (2), por lo que estas denomina-
tiene un tiempo de almacenamiento pro- deseadas”. Sin embargo, Brettanomy- ciones han quedado en desuso.
longado, con el riesgo de sufrir contami- ces/Dekkera bruxellensis es capaz de Los microorganismos de este género
naciones microbiológicas, alterantes de resistir esta purga, siendo la causa de las presentan dos formas, una capaz de re-
su aroma y sabor. mayores pérdidas en vinos envejecidos producirse sexualmente (Dekkera) y otra
La microflora presente en la uva está en barrica. Este artículo intenta aclarar que lo hace asexualmente (Brettanomy-
presente se mantiene al comenzar la algunos puntos sobre esta levadura, so- ces). También se llaman, respectivamen-
vinificación, de tal manera que las leva- bre su metabolismo y mostrar algunos de te, forma perfecta y forma imperfecta.
duras S. cerevisiae que tiene la uva en los pasos que se dan para combatirla. En algunos casos, la forma perfecta y la
imperfecta reciben nombres diferentes,
S. cerevisiae y B. bruxellensis Taxonomía de Brettanomyces como ocurre con B. anomalus y D. ano-
tienen metabolismos similares, La taxonomía científica sobre Bretta- mala. En otros casos el nombre es simi-
muy adaptados a las condicio- nomyces ha cambiado en los últimos lar, como las pertenecientes a la especie
nes de vinificación años. Brettanomyces está clasificado bruxellensis, que pueden aparecer como
dentro de la misma familia que Saccha- D. bruxellensis, como B. bruxellensis o
origen participan, junto con las añadidas romyces (familia Saccharomycetaceae). como Dekkera/Brettanomyces bruxellen-
en el cultivo iniciador, en la transforma- Actualmente, dentro del género Bretta- sis. A efectos prácticos en la bodega, es-
ción del mosto en vino. Sin embargo, de- nomyces, se aceptan cinco especies di- tos dos estados son similares.
bemos ser conscientes de que junto con ferentes (B. bruxellensis, B. anomalus, Cuando vemos referencias a Bretta-
las levaduras beneficiosas también per- B. custersianus, B. nanas y B. naarde- nomyces como contaminante, en la
manecen microorganismos que pueden nensis) (1). Las técnicas de biología mayor parte de los casos se refieren a
perjudicar al vino. molecular han demostrado que B. inter- Dekkera/Brettanomyces bruxellensis, ya

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Brettanomyces

Tabla 1. Relación de los principales azucares que pueden utilizar


diferentes cepas de B. bruxellensis (3) y su concentración media en EN SÍNTESIS...
vino tinto (13).
Fuente de carbono B. bruxellensis En vino(g/L) 1.  rettanomyces/Dekkera
B
bruxellensis puede sobrevivir
y crecer tras la fermentación
Arabinosa * 0,30
alcohólica, cuando no tiene
Citrato * 0,20 competidores.

2.
Lactosa * Detc. A lgunas cepas de B. bruxe-
Manitol * 0,21 llensis generan altas concen-
traciones de etil fenoles que
Raffinosa * <0,5 aportan olores desagradables
Etanol ** 130,00 al vino

Glicerol
Lactato
**
**
5,90
3,10
3. E n la actualidad, tenemos
técnicas moleculares que per-
miten detectarlo en el vino en
Succinato ** 0,55 pocas horas

Malato
Galactosa
**
***
5,20
0,13
4. L os estudios muestran que los
focos de contaminación son
diversos, aunque sería con-
Celobiosa *** Detc. veniente ampliar el estudio a
otras añadas
Maltosa *** Trazas
Trealosa *** 0,30 5.  La limpieza y la desinfección
de instalaciones y unas co-
rrectas prácticas enológicas
Sacarosa *** Trazas
son las claves para prevenir el
* Utilizable por entre 10-25 % de las cepas; ** Utilizable por entre 25-75 % de las cepas; problema
*** Utilizable por entre 75-100 % de las cepas. Detc.: Detectados en vino.

que este es el responsable de las altera- presentes en el vino y no consumibles En resumen, B. bruxellensis crece
ciones en el vino. por S. cerevisiae (3). más despacio que S. cerevisiae, es re-
Otra de las ventajas que presenta sistente a concentraciones altas de alco-
Características fisiológicas frente a S. cerevisiae (y frente a la mayo- hol, puede utilizar otros az´´ucares como
S. cerevisiae y B. bruxellensis tienen ría de las levaduras) es que puede utili- fuentes de energía y nitrato como fuente
metabolismos similares, muy adaptados zar los nitratos como fuente de nitrógeno de nitrógeno. Esto explica que pueda re-
a las condiciones de vinificación. (3). Debido a que S. cerevisiae sólo uti- producirse cuando la fermentación alco-
Tras la fermentación alcohólica, S hólica ha terminado, a partir de nutrien-
cerevisiae es la levadura mayoritaria de- Brettanomyces debe alcanzar tes no consumibles por S. cerevisiae y
bido a que las condiciones nutricionales una concentración mínima (de- cuando no tiene competidores.
del vino son muy estrictas (altas concen- nominada población crítica) de
traciones de etanol y bajas concentra- 103 UFC/mLl para comenzar a Producción de compuestos alterantes
ciones de nutrientes). En este momen- liberar etil fenoles Desde hace mucho tiempo se ha asocia-
to, Brettanomyces continúa creciendo do la presencia de Brettanomyces con la
gracias a que utiliza nutrientes que S. liza el nitrógeno amoniacal y los aminoá- aparición de olores extraños en el vino.
cerevisiae no ha podido consumir, sobre cidos libres, estos se consumen con rela- La mayoría de los catadores definen
todo algunos azúcares y fuentes de ni- tiva rapidez. Al final de la fermentación estos olores como “a cuadra” o “a ca-
trógeno. el nitrógeno amoniacal es escaso y se ballo”. Generalmente, estos olores son
Una de las características que di- favorece el crecimiento de las levaduras atribuidos a etil fenoles derivados del
ferencia a Brettanomyces es la gran que pueden utilizar otras fuentes de ni- metabolismo de Brettanomyces, como
diversidad de azúcares que puede fer- trógeno. Además, Brettanomyces puede el 4-etilfenol (4-EP), 4-etilguaiacol (4-
mentar. Como se puede ver en la tabla crecer con concentraciones de fosfato EG) o el 4-etilcatecol (4-EC). Las conse-
1, la mayoría de las cepas pueden crecer diamónico tan bajas como 0,5g/l, o a cuencias de la presencia de estos com-
utilizando trealosa y celobiosa, azucares partir de diversos aminoácidos (3). puestos dependen en gran medida de su

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concentración en el vino. Por ejemplo,


se detecta un defecto en el aroma si la Tabla 2. Análisis de algunos métodos para detectar B. bruxellensis
concentración de 4-EP supera los 620
µg/l, pero este compuesto aporta notas Técnicas de cultivo Técnicas de PCR
favorables al aroma si su concentración
es cercana a 400 µg/l. Son los denomi- A favor A favor
nados límites de tolerancia. -Fácil de interpretar -Rápido (horas)

En vino, podemos detectar -No necesita personal especializado -Específico


Brettanomyces en horas (me- -Precio bajo -Detecta VNC
diante PCR) cuando la pobla-
ción está cercana a la población -Cuantitativo
crítica para la producción de En contra En contra
etil fenoles (103 UFC/mL)
-Requiere personal especializado y mate-
-Tiempo hasta los resultados largo
Cuando se comparan diferentes cepas de rial costoso
Brettanomyces se observan grandes dife- -Posible contaminación -No cuantifica
rencias en la producción de etil fenoles,
-No cuantifica VNC -No diferencia vivas-muertas
por lo que podemos encontrar vinos con
tasas altas de Brettanomyces pero que -Numero de células mínimo alto
no presentan defectos sensoriales. Hay
que señalar que Brettanomyces debe VNC: microorganismos viables pero no cultivables
alcanzar una concentración mínima
(denominada población crítica) de 103
UFC/ml para comenzar a liberar etil fe- vinos que pasan por la cuba. Durante el se describen las ventajas e inconvenien-
noles. Por debajo de esta concentración envejecimiento del vino, las poblaciones tes de este tipo de métodos.
la levadura sería metabolitamente activa de Brettanomyces serían máximas entre Actualmente, para identificar y diferen-
pero no produciría compuestos alteran- cinco y siete meses tras la vinificación. ciar entre las especies de Brettanomyces,
tes a niveles detectables. Finalmente, cuando se lavan las cubas se utilizan las técnicas de biología molecu-
tras retirar el vino, incluso el agua resi- lar de forma rutinaria. Las más extendidas
Ecología de B. bruxellensis dual y las cañerías de desagüe contienen se centran en diferencias en la secuencia
En la mayoría de los estudios se ha bus- Brettanomyces (4). de RNA ribosómico (4, 7), pero también se
cado Brettanomyces en el producto final El problema de Brettanomyces no es han puesto a punto técnicas como el cario-
(el vino), y son pocos los informes sobre un problema que se da sólo en los vinos tipado, la secuenciación genética, RFLP,
el origen de la contaminación. actuales. Analizando 20 añadas (entre RAPD-PCR, intron-PCR o AFLP. La mayo-
Los estudios sobre Brettanomyces en 1909 y 2003) de cinco denominaciones ría de los casos se requiere partir de ce-
uva son escasos, pero, en general, los in- diferentes de vinos franceses, en todas pas aisladas y crecidas en placa. Algunos
vestigadores señalan que Brettanomyces ellas se ha encontrado Bret El tratamiento autores han descrito protocolos de PCR
está presente desde los estadios iniciales de Brettanomyces una vez que ha apa- que permiten identificar Brettanomyces
de la maduración de la uva, que su pro- recido es complejo e implica una serie en muestras de vino sin tener que aislar y
porción respecto al total de microorga- de riesgos para la calidad final del vino crecer los microorganismos (4, 8). Estas
nismos es pequeña y que se incrementa tanomyces (4). técnicas sobre vino tienen límites de de-
en casos donde la uva esta dañada. Estu- tección de aproximadamente 103 CFU/ml.
diando cuatro tipos de uva diferentes en Métodos de detección Viendo en conjunto el límite de detección
tres bodegas, Reunouf y cols (4) no han Los sistemas de detección más clásicos de las técnicas descritas, observamos que,
encontrado relación entre el tipo de uva, se basan en el aislamiento y cultivo de en vino, podemos detectar Brettanomyces
la bodega y la presencia de Brettanomy- los microorganismos en medios selecti- en horas (mediante PCR) cuando la po-
ces en uva. vos o semi-selectivos, seguido de prue- blación está cercana a la población críti-
Ya dentro de la bodega, Renouf y bas bioquímicas que confirmen la identi- ca para la producción de etil fenoles (103
cols (4) han encontrado Dekkera/Bretta- dad de los microorganismos aislados. Se UFC/ml). Sin embargo, necesitamos días
nomyces en toda la cadena de elabora- han desarrollado diversos medios de cul- (cultivos en placa) para poder detectarlo
ción, empezando en la uva, pasando por tivo que tienen etanol como única fuente a concentraciones menores, en las que
la maquinaria, los tanques de fermenta- de carbono y p-cumárico para detectar todavía no producen etil fenoles. La tabla
ción y acabando en el vino embotellado. la presencia de Brettanomyces, compro- 2 resume las ventajas e inconvenientes de
Igualmente, las cubas de envejecimien- bando así la capacidad de producir 4-EP cada metodología.
to se han demostrado ser una fuente de (5,6). Algunos autores han descrito pro-
contaminación importante, ya que son tocolos que se basan en la inoculación Prevención y control de Brettanomyces
muy difíciles de limpiar y se utilizan de directamente con vino de un medio de Uno de los grandes problemas con
forma repetitiva, contaminando todos los cultivo semi-selectivo (6). En la tabla 2 Brettanomyces es que es resistente a la

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Brettanomyces

Brettanomyces al microscopio (x400)

Identificación de Brettanomyces mediante


PCR. Lineas 1-9: colonias aisladas de B.
bruxellensis. Linea 10: S. cerevisiae. Linea
11: Agua. M: Marcador de tamaño (EZ Load
100 bp Molecular Ruler, Bio-Rad)

Colonias de Brett en medio específico

mayoría de los tratamientos de control depósitos, barricas, botellas y demás -Se deben vigilar los niveles de azúcar
microbiológico habituales en bodega, y elementos de las bodegas. Una de las residual en los vinos, ya que es mucho
que, al tener un metabolismo similar a propiedades que hacen de Brettanomy- mas fácil que aparezcan las levaduras
S. cerevisiae, cualquier tratamiento ten- ces una levadura difícil de eliminar es alterantes en vinos con altos niveles de
dente a eliminar Brettanomyces afectará su capacidad para formar biofilms. Los azucares. Junto con la obtención de un
a la viabilidad de esta. biofilms son agrupaciones de microor- vino “seco”, el uso adecuado del SO 2
Conterno y cols. (3) estudiaron las ca- ganismos que se fijan a las superficies, puede ayudarnos a la estabilización mi-
racterísticas fisiológicas de 35 cepas de generando una intrincada red que sirve crobiológica de los vinos.
B. bruxellensis, encontrando que todas de “refugio” ante “agresiones” como El tratamiento de Brettanomyces una
los tratamientos de desinfección. Lucky vez que ha aparecido es complejo e im-
El tratamiento de Brettanomy- Joseph y colaboradores (9) testaron di- plica una serie de riesgos para la calidad
ces una vez que ha aparecido ferentes agentes limpiadores con cepas final del vino. Las condiciones que de-
es complejo e implica riesgos de Brettanomyces, observando que los bería cumplir un tratamiento para ser
para la calidad final del vino detergentes alcalinos y los basados en considerado apropiado se pueden resu-
amonio cuaternario eran los prepara- mir en:
podían reproducirse en medios con 10% dos utilizables en bodega más efectivos -Debe ser específico, ya que no debe
de alcohol, el 94% crecían a pH=2.0 y para eliminar las células adheridas a la eliminar las bacterias responsables de la
el 30% pueden crecer a 10 ºC. Tampoco superficie. Estos investigadores sugie- fermentación maloláctica (o estas deben
se ven afectadas por el sulfitado, ya que ren que su uso frecuente puede evitar la de ser sembradas a posteriori).
el 49 % de las cepas crecían con con- formación de biofilms. También se han -Debe ser eficaz eliminando concen-
centraciones mayores de 30 mg SO2/l obtenido resultados esperanzadores para traciones muy pequeñas de Brettanomy-
a pH=3.4, llegando incluso a 50 mg/l. el control de Brettanomyces en barricas ces, para impedir que proliferen durante
Además, las cepas resistentes al SO2 tratándolas con ozono (10). Se debe los largos tiempos de crianza.
eran las mayores productoras de 4-EP y prestar especial atención al adecuado -No debe modificar las características
4-EG. Ya que pueden reproducirse en el mantenimiento de las barricas, ya que del mosto/vino. Esto descarta tratamien-
vino, hace falta un número muy pequeño son una fuente importante de contami- tos donde se incrementa en exceso la
de levaduras inicial para desencadenar nación y están mucho tiempo en contac- temperatura o modifica el pH.
el problema. to con el vino. -Debe ser escalable con facilidad a
Ante esta situación, caben dos acti- -Las uvas también pueden estar con- nivel industrial, tener un costo razonable
tudes complementarias: la prevención taminadas con Brettanomyces. Sin em- y no ser un tratamiento difícil de aplicar.
para evitar el problema y el tratamiento bargo, la utilización de uva en buenas Además, es de lógica que no debe ser tóxi-
cuando este ya ha aparecido. Los puntos condiciones higiénicas reduciría parte co para los consumidores y que debe de
clave para la prevención serían: del problema, porque ya hemos visto que estar de acuerdo con la legislación. Bien
-La limpieza y desinfección de las la población es mayor en uva dañada que por una legislación que los prohíbe o por
instalaciones, incluyendo maquinaria, en uva sana. cuestiones de imagen, añadir otros conser-

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vantes/fungicidas químicos al vino (ade- que intervienen en la fermentación se- algunas de las características fisiológicas
más del sulfitado) no es una opción real. cundaria, en la fermentación maloláctica de Brettanomyces, como la supervivencia
En un medio con tanto etanol como o en los procesos de envejecimiento. en medios con poco nitrógeno asimilable
el vino, la sensibilidad de los microorga- La filtración a través de membranas de o las rutas de degradación de azucares
nismos a la temperatura es muy alta. Por poro pequeño es otro de los recursos que diferentes a la glucosa. Cuanto más se-
esta razón, Couto y col. (11) estudiaron se utilizan para eliminar Brettanomyces pamos, más fácil nos será combatirla.
la sensibilidad de B. bruxellensis y B. en los vinos, pero tiene el inconveniente En general, el mundo enológico se ha
anomalus al calor, demostrando que en de que el filtro puede retener compuestos dado cuenta de las dimensiones del pro-
vinos modelo bastaba con menos de un que contribuyen a la calidad sensorial blema que representa Brettanomyces,
segundo a 42 ºC para eliminar el 99.9% del vino. Además, durante la filtración se tanto por las pérdidas económicas que su-
de las células viables. En la misma línea pueden perder parte de la fase volátil del pone como por el daño en la imagen de la
de tratamientos físicos del vino está la vino. Por último, recordar que de nada bodega. Las prácticas de prevención aquí
tecnología de pulsos eléctricos de alto vale filtrar si el depósito donde almace- descritas pueden reducir su incidencia,
voltaje (PEAV), que se basa en aplicar al namos el vino filtrado está contaminado pero se antoja necesaria la implantación
mosto campos eléctricos de alto voltaje con Brettanomyces. de un plan de control microbiológico de
de forma intermitente. Los campos eléc- Finalmente, el estudio del genoma de Brettanomyces antes y durante la elabo-
tricos distorsionan la membrana externa Brettanomyces, del cual conocemos casi ración del vino, así como previo al embo-
de los microorganismos, reduciendo su la mitad de la secuencia completa (12), tellado, para poder detectar y evitar los
viabilidad. Esta técnica ha sido proba- permitirá conocer mejor el metabolismo problemas antes de que sea tarde.
da con éxito para eliminar D. anomala de esta levadura contaminante, y desa-
en mosto comercial, pero también tiene rrollar nuevas armas específicas con- Referencia bibliográfica de autores
puntos negros, ya que eliminaría de igual tra ella. Los resultados aportados hasta La bibliografía completa de este artículo puede
manera al resto de los microorganismos ahora son muy interesantes, explicando ser solicitada en vinoteq@rbi.es

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24 octubre | diciembre ‘07