SPLICING ALTERNATIVO

DECODIFICANDO UNA EXTENSA CAPA REGULATORIA

Splicing alternativo (AS)

Seleccin diferencial de sitios de empalme en el pre-mRNA

objetivo

Produccin de Mltiples mRNAs

Protenas isoformicas

Espliceosoma
5 snRNAs 200 protenas Regulacin por elementos Cis y Trans

Cdigo splicing
Complejo de combinacin de los elementos Cis Identifica los splicing correctos Dirige la base y los patrones del splicing

Cadenas de exones, mapas de protenas de unin a RNA y el cdigo splicing

Avances que han permitido la comprensin de eventos regulados por AS: Microarrays. Secuenciacin de RNA (RNA-Seq) Para ello se ha implentado: Procesos de diferenciacin celular; diferenciacin completa de tejidos. Estudio secuencial de organismos completos en periodos de tiempo. Estudio de los ritmos circadianos. Comparativas entre estados de normalidad versus enfermedad. Eventos de AS en respuesta a cambios de la fisiologa normal y a los asociados a enfermedad (ej. estrs genotxico)

Esta informacin se revela resultado de alteracin de los mecanismos de AS por modificaciones experimentales: Destruccin mediada por siRNA. Eliminacin de factores de splicing. Perturbaciones en la transcripcin.

Estudios complementarios: Mapeo de interacciones de protenas vinculadas a RNA in vivo:

Extraccin de fragmentos & protenas asociadas Vinculacin con un anticuerpo de afinidad
inmunoprecipitacin

Control por RNA-Seq

Obtencin del mapeo de los sitios de interaccin de las protenas a transcritos por secuenciacin PAR-CLIP

* Para la secuenciacin tipo PAR-CLIP:

Incorporacin de ribonucletido fotosensible en el surgimiento del pre-mRNA

Entrelazamiento a ciertas protenas despus de la exposicin a la luz de longitudes de onda especficas

Elaboracin de un mapeo preciso de los sitios de unin de la protena inmunoprecipitada y el

RNA.

Protenas acopladas a RNA suscrito (RBPs)

CLIP-Seq y mtodos relacionados han sido usados para generar
el mapeo suscrito de docenas de RBPs. Mtodo aplicado originalmente al regulador de splicing Nova neuroespecfico. RBPs tienden a unirse a zonas de exones alternativos y/o se adosan a secuencias intrnicas relacionadas con el aumento en el salto u omisin de exones o la inclusin de los mismos . Cuando RBPs se enlazan a secuencias alternativas, la inclusin de exones es inhibida, mientras que en secuencias de regiones cuesta abajo la inclusin resalta.

SA simultneamente en otros procesos posttranscripcionales como la poliadenilacin alternativa. Estabilizan la aparicin de mRNAs reguladores de AS. La naturaleza multifuncional de RBPs podran facilitar la coordinacin entre diferentes etapas regulacin del AS.

RBPs se involucran en la regulacin de la aparicin del

*El cdigo splicing

Su elucidacin es proporcional al avance en la recopilacin de datos del transcriptoma y el avance de maquinaria de algoritmos de aprendizaje. Ej.: Empleando mtodos de HITS/CLIP-Seq y microarreglos, se ha llegado a identificar aprox. 700 eventos en el regulador Nova de SA. La identificacin de estos set de informacin permiten ampliar el conocimiento de sitios esenciales de unin a intrones de protenas Rbfox que funcionan flanqueando los exones regulados por Nova.

El objetivo principal de los hallazgos en el cdigo splicing es definir desde la sola secuencia genmica, sets integrales de elementos de AS en el rango ms amplio posible en cuanto a tipo y condiciones celulares

Fin: Prediccin certera de las consecuencias de las variaciones y mutaciones genticas en torno al splicing.
Gracias a los avances tecnolgicos se han logrado agrupar un compendio de cerca de 1000 elementos cis asociados a splicing especficos.

 Un mtodo computacional ha sido desarrollado para

predecir las variaciones patgenas de splicing causada por mutaciones
Se basa en la identificacin del sitio de unin de un factor de splicing especfico con su sitio de empalme Dada una mutacin, se establece un sitio de unin distinto para el factor

El mecanismo de SA se perturba

Los autores concluyeron con ello que aprox. 1/3 de las mutaciones genticas en humanos afectan el AS

Comunicacin regulatoria entre cromatina, transcripcin y splicing

Definicin exnica

Modificaci n
Modificacin en la cromatina, nucleosomas

Compactacin, trimetilacin

Afecta

La regulacin AS, reclutamiento de factores de regulacin

Rol

Metilacin de la histona 3 en lisina 36

Exhiben una densidad caracterstica al redor de los sitios de splicing 5`y 3

Histonas modificadas

Afectan el AS

Reclutamiento de reguladores de AS Taza de elongacin de la RNA polimerasa II

Niveles de H3K36me3
Niveles de H3K36me3 trimetilada

Sobre determinadas regiones exnicas

Influyen en el nacimiento de RNA

Lo que facilita el reclutamiento de represores PTBP1

Asociados a acumulacin del represor transcripcional HP1

Elongacin reducida de pol II

Cambios en el splicing CD44

Actividad splicing

Influencia el reclutamiento

H3K36me metiltranferasa a RNA pol II

Daos en el DNA por UV afectan (AS) Genes Ciclo celular, apoptosis, Tasas de elongacin de Pol II. (fosforilacin) Que afectan los genes que funcionan en unin y procesamiento de RNA Contribuyen al decrecimiento de los niveles de transcripcin, terminacion temprana de codones, (NMD) Esto sirve como mecanismo de respuesta rpida ante estrs celular y otras condiciones de crecimiento celular

Cualquier evento componente de la cromatina o factores de transcripcin

Factor de unin CCCTC

Que afectan la elongacin de Pol II

Efectos en el nucleosoma y la actividad aislante

Que afectan los eventos de AS

Controlada por Factores de metilacin por CpG.

Nuevos roles para el AS en el desarrollo y la enfermedad

En comparativa de especies separadas por ms de 70 millones de aos de evolucin (Ej. Humanos y ratones): Se afirma que los eventos de AS son especficos para cada especie. Participan en una gran cantidad de roles funcionales

 Se han definido varios sets de AS asociados con cambios en

la diferenciacin celular y el desarrollo.
Un complejo isofrmico de AS durante la diferenciacin hace que particularmente las clulas madre embrionarias (ESCs )se especialicen.

Varios eventos de AS en ESCs se involucran en: Procesos de control transcripcional

Determinacin de factores de sealizacin en estado de pluripotencia

Esta determinacin ha permitido facilitar la reprogramacin inducida de clulas somticas a embrionarias pluripotentes.

La regulacin est dada por un switch de AS especficos para ESCs

Promueve la unin del DNA con el factor FOX1 de transcripcin

FOX1 estimula la expresin de factores de pluripotencia: OCT4; NANOG & reprime genes de diferenciacin

Varios switches de AS actan como reguladores transcripcionales en el control de: neurognesis, desarrollo, comportamiento, sexo, entre otros.

* Seq- de alta capacidad estn esclareciendo la relacin de

eventos de AS alterados con la progresin de la enfermedad

Esto permite proyectar nuevos mtodos de manejo de enfermedades

Para ello se ha empleado: identificacin de la secuencia exnica de clulas tumorales y la maquinaria splicing especfica en enfermedades como mielodiplasia, leucemia crnica linfoctica, desorden del espectro autista, la enfermedad de Alzheimer, entre otras.

La perfilacin de eventos de AS han sido involucrados en estudios de la Biologa tumoral

Expresiones alteradas de reguladores e inhibidores de AS tienen importante relevancia en la aparicin y desarrollo clulas cancergenas.

I n cc o r m e p Rm el e e vjn oi t l do uad cde ,

Futuras direcciones

i rl nea s

g t ut l r ae acc ni n o sl cno ,

biotecnologa

Mapa completo de los elementos Cis Rendimiento de un cdigo gentico completo

Aprovechamien to experimental

Logros futuros
Determinacin de las variantes del splicing Perfilacin ribosmica Pruebas automatizadas de las variantes de SA Identificacin de nuevos snRNAs Entendimiento de como se integran los diferentes estratos de la regulacin gnica

Comienzo de la progresin de los eventos SA y las enfermedades humanas

Para una nueva generacin De terapias para Tratamientos medicamente benficos