PRODUCCIN DE UNA PROTENA

UNICELULAR DEL EXTRACTO DE YACON USANDO UNA CEPA MUTANTE DE ALTA TERMO SENSIBILIDAD Y PERMEABILIDAD DE LA LEVADURA MARINA

CRYPTOCOCCUS AUREUS G7A Y SU ANLISIS NUTRITIVO.

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Chun-Hai Zhao, Tong Zhang, Zhen-Ming Chi (2009) Single cell protein production from yacon extract using a highly thermosensitive and permeable mutant of the marine yeast Cryptococcus aureus G7a and its nutritive analysis. Bioprocess Biosyst Eng 33, 549-556

INTRODUCCIN

Qu es una protena unicelular?

Usos principales Costos Desventajas

INTRODUCCIN

33 cepas de levaduras marinas

Microorganismo Cepa Cantidad de protena cruda

Candida
Debaryomyces hansenii Dipodascus capitatus Dipadascus sp Candida utilis

M15 ACM 4784 ACM 4779

ACM 47801

38.5 a 70.4% 23 % 32 %
36 % 42 %
3

ACM 4774

INSTRUCCIN

Levadura Cryptococcus aureus G7a

Carbono Insulina 10.1 g/medio litro 53g protena cruda/100g peso seco celular

5.4 g/L

INTRODUCCIN

Caractersticas de una levadura

Pared Manoproteinas, un problema?

INTRODUCCIN

Cepas mutantes

Saccharomyces cerevisiae Candida albicans Schzosaccharomyces pombe Aspergillus nidulans

La temperatura como un factor importante

37 C

INTRODUCCIN
Cryptococcus aureus G7a Cepa mutante Z114

Contenido de protena cruda

Protena total

57.1 %

65.3 %

Fuente de sustrato: YACN

INTRODUCCIN

Yacn

Smallanthus sonchifolius Tubrculos Rico en inulina y oligosacaridos y fructosados 3 al 10 %

OBJETIVO

Estudiar las condiciones adecuadas para la obtencin de protenas unicelulares de la cepa mutante MTP Z114 altamente termo sentible y permeable de la levadura marina Cryptococcus aureus G7a y realizar su anlisis nutritivo

MATERIALES
Cepas de las levaduras Crypstococcus aureus cepa G7a Condiciones: 20 C, pH 8.1 y 2.89% de salinidad Medio YPD
20 g/L glucosa 10 g/L extracto de levadura 20 g/L polipeptona

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MATERIALES
Preparacin del extracto de yacn 100 g de tubrculos suspendidos en 500 ml de agua destilada El jugo fue filtrado bajo vacio y diluido

60, 80, 100, 120, 140, 160, 180 y 200 g/L

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MATERIALES
Preparacin del hidrolizado de la torta de soya (soybean cake) 32 gramos con 250 mL de agua con un contenido 0.25 M HCL. Autoclavada a 14 b por 25 min. pH de la mezcla se ajusto a 5.5 con 1.0 M de una solucin de NaOH El filtro fue diluido a 200 ml (160 g/L)

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MTODOS
Arreglo ortogonal Matriz ortogonal L9 (3 a la 3) Examinar los factores 3x3 de produccin Software Qualitek-4 (2000) basado en el mtodo Taguchi.

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INTERMEDIO

Qu es un arreglo ortogonal?

Son herramientas que permiten al ingeniero evaluar qu tan robustos son los diseos del proceso y del producto con respecto a los factores de ruido.

El mtodo del Dr. Taguchi Objetivos:

Contribucin de los factores individuales que influyen Mejor condicin para un proceso o un producto

La(b)C
L = Indica que es un arreglo ortogonal a = Nmero de corridas experimentales b = Nmero de niveles para cada factor c = Nmero de columnas o factores de un arreglo ortogonal.

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MTODOS

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MTODOS
Produccin de la protena unicelular Clulas en 50 mL de YPD Se transfiri (45 ml):
25 g/L de hidrolasa de torta de soja 15 g/L de sulfato de amonio 180 g/L de extracto de levadura agitacin a 170 rpm y 28 C por 3 dias

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MTODOS
Medicin de la protena liberada a partir de MTP Las clulas se cosecharon y lavaron
agua salina estril centrifugacin a 5000xg y 4C.

El sedimento se suspendi:
agua destilada estril Densidad:108 clulas/mL.

Se incubo a 28 y 37C Mtodo de Bradford.

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MTODO
Estimacin del contenido de protena en las clulas de levadura

Coladas y lavadas con agua salina Centrifugo 5000 4C por 10 min

Grnulos obtenidos Drenados a 80C Hasta que el peso de las clulas fue constante

Asimiladas a 180 C Digestor de Alta Temperatura KDN-08 por 1.5 h 0.50 mg de clulas drenadas

Protena cruda mtodo Kjehldah

10 ml de clulas

La solucin con 20 mg de albumina de suero de bovino fue usado como estndar

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MTODOS
Determinacin de la reduccin de azcar y azcar total fermentada en el medio

Mtodo NelsonSomogyi Cu+2 Cu+1 Mo+4(Cu+1)Mo+2 complejo de color azul.

Medido como la azcar reducida despus de la hidrolisis de la inicial y el medio fermentado.

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MTODOS
Determinacin de contenido de acido nucledo

Ensayo de vitamina C

DNA y RNA fue estimado por anlisis de colorimetra con difenilamina y orcinol

Mtodos descritos por Hancock. L-acido ascrbico fue usado como el estndar.

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MTODOS
Anlisis de aminocidos
Hidrolizado
Filtrado Calentado para evaporar el HCl

Hidrolizadas 110C por 24 h 6 M HCl

Disuelto en citrato de sodio buffer (0.1 M pH2.2)

40 mg clulas

Hidrolizado

En la mezcla fueron analizados usando un High Performance Automatical Amino Acid Analyser 835
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MTODOS

Los aminocidos esenciales fueron calculados acorde la siguiente ecuacin:

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MTODOS
Anlisis de cidos grasos

Al incubado

5 mL de 0.4 M hidrxido de potasio Se incubo a 50C

100 mg de clulas drenadas

5 mL de 14% trifloruro de boro metanol se aadi incubado a 50 C por una hora. 50 mL de hexano se aadi 2 mL de cloruro de sodio

5890-II inyector de temperatura: 250 C

Cromatografa de columna

Los cidos grasos con C19:0 fueron usados como un estndar interno.

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RESULTADOS
Efectos del extracto de yacn La mayor produccin de la clula proteica fue lograda en el medio que contena 160 g/L de extracto de yacn. Cerca de 51.5 g de protena cruda por 100 g de peso seco de la clula fue obtenido.

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RESULTADOS
Efectos de las fuentes de nitrgeno Varias fuentes de nitrgeno:
sulfato de amonio peptona extracto de levadura torta de soja

el extracto de levadura (35 g/L) peptona (40 g/L)

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RESULTADOS
Diseo experimental para la matriz ortogonal Seleccin de la torta de soja hidrolizada y el sulfato de amonio Las condiciones del cultivo

28C pH natural 50 mL 170 rpm 10% (el cultivo alimentado OD600nm=30 mL/100 mL) 3 das
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A= torta de soya B= sulfato de amonio C= extracto de yacn

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RESULTADOS

Cuales son los que realmente son significantes

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RESULTADOS
Transcurso de tiempo del crecimiento celular y la produccin de protena unicelular

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RESULTADOS

Agua destilada Incubadas a 28-37C

Se suspendieron las clulas

Concentraciones de protena

61.84% 37C

4.25% 28 C

Concentraciones de protena

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RESULTADOS
Anlisis del azcar

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RESULTADOS
Anlisis de cidos nucledos

Anlisis de vitamina C

Las clulas Z114:

Las clulas Z114:

2.1 g de cidos nuclecos por 100 gramos de peso seco de la clula 2.6 g de cidos nuclecos por 100g de peso seco de la clula

contiene 2.3 mg de vitamina C por 100 g de peso seco de clula tiene 1.9 mg de vitamina C por 100g de peso seco de clula

La cepa G7a

La cepa G7a:

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RESULTADOS
Anlisis de cidos grasos Solo una pequea cantidad de C17:0 cidos grasos Pero una larga cantidad de C16:0, C18:0, C18:1, y C18:2 de cidos grasos

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RESULTADOS
Anlisis de aminocidos Ambos contuvieron una alto nivel de aminocidos esenciales
lisina metionina leucina.

Entre los nos esenciales que tuvieron altas concentraciones (2.6-13.68%)., fueron
aspartato glutamina

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EAAI: ndice de aminocidos esenciales. Indica que es >0.95 0.86-0.95: buena calidad 0.75-0.86: til 0.75: inadecuado

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CONCLUSIONES
Los tubrculos de yacn contienen un alto contenido de inulina. El extracto de yacn puede ser usado como medio para la produccin de la protena unicelular para MTP. contenido de protena cruda en la mutante fue de 59.1% y cerca de 61% de la protena total. Las clulas seguan conteniendo altos niveles de aminocidos esenciales y otros nutrientes

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