BIOLOGIA CELULAR

Ingeniera en Biotecnologa

1.- Introduccin
1. 2. 3. 4. Que es la Biologa Celular. Aspectos Histricos de la Biologa Celular. Teora Celular. Concepto de clula Evolucin de la teora celular principales herramientas Microscopia. Tcnicas histolgicas

1.1. Biologa celular.

disciplina cientfica que se encarga de estudiar las propiedades, la estructura, las funciones y el ciclo vital de las clulas.

La citologa o biologa celular es la rama de la biologa que estudia las clulas en lo que concierne a su estructura, sus funciones y su importancia en la complejidad de los seres vivos.

1.2. Aspectos histricos de la biologa celular

Ya en la antigedad, los filsofos y naturalistas haban llegado a la conclusin de que tanto los animales como los vegetales, estaban constituidos por diversos elementos comunes.

 Estos elementos eran las estructuras macroscpicas, como races, tallos y flores en los vegetales y segmentos y rganos en los animales Como en esta poca no existan aparatos ni tcnicas para observar las estructuras microscpicas, los componentes celulares ms importantes pasaron inadvertidos.

 En el siglo XVII, con el invento del microscopio, fue posible aumentar la imagen de los materiales vivientes, lo que permiti establecer las bases de la Biologa Celular, disciplina moderna que apoya en la bioqumica, gentica, fisiologa, biofsica e histologa, para dilucidar la estructura, organizacin y funcionamiento de la clula. As se ha logrado describir el movimiento de diferentes molculas hacia adentro y fuera de la clula a travs de la membrana en apariencia, impermeable. El transporte de sustancias es vital, pues proporciona a la clula compuestos que proveen energa y, por otra parte, elimina aquellos que resulta nocivos.

1665

Emple por primera vez la palabra clula. observ al microscopio un corte de corcho que describi como una estructura formada por huecos o espacios similares a las celdillas de un panal. Holands Antonio van Leeuwenhoek, contribuy de manera especial al desarrollo de la Biologa Celular con el descubrimiento de los microbios en el agua.

1675

1824

Investigador francs H. Dutrochet, observ al microscopio porciones de plantas y animales, despus de lo cual propuso que stas se encontraban formadas por clulas, las que constituan las unidades bsicas de la estructura de los seres vivos. ingls Robert Brown en 1831, fue el primero en reconocer el ncleo celular, lo descubri en estructuras vegetales como una estructura central y pequea

1831

1839

Jan E. Purkinje, fisilogo checo, acu el trmino protoplasma para designar el contenido vivo de la clula

ACTIVIDAD 1
Realizar una lnea del tiempo con los acontecimientos mas importantes en la historia de la biologa celular.

1.3 Teora Celular.

Mathias Schleiden, botnico alemn y Theodor Schwann zologo de la misma nacionalidad, relacionaron todos los descubrimientos anteriores y los ampliaron con sus propias observaciones en tejidos vegetales y animales, lo que los llev elaborar la Teora Celular.

1838 1839

Esta teora constituye uno de los conceptos generales y fundamentales de la Biologa y establece que la clula es la Unidad Bsica Estructural y Funcional de los seres vivos, y que todos los organismos estn constituidos por una o ms clulas.

A mediados del siglo XIX, se ampli la investigacin celular. Rudolf Virchow, investigador alemn, aplic la teora celular al estudiar las clulas de tejidos enfermos, consider a la clula como la Unidad Estructural, y tambin estableci que todas las clulas se originan a partir de otras.

En 1855, escribi el tratado Omnis cellula e cellula (Toda clula proviene de otra clula).

Tamao celular
Las clulas son las unidades bsicas de los seres vivos. La mayora de ellas son de pequeo tamao por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualizacin. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 m), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos lneas separadas 1mm de distancia; si hay dos lneas a 200 m de distancia, veremos una sola lnea. Los microscopios se utilizan para mejorar la resolucin.

 La invencin del microscopio en el siglo XVII posibilit la serie de descubrimientos posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio ptico simple, examin un corte de corteza, encontr que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cmaras, que llam clulas, en realidad slo vi las paredes celulares, ya que este tejido est muerto a la madurez y las clulas ya no tienen contenido. Mas tarde, Hoock y algunos de sus contemporneos observaron clulas vivas.

4.-Principales herramientas
1.4.1. Microscopa
Microscopa (o tambin sin tilde microscopia) es el conjunto de tcnicas y mtodos destinados a hacer visible los objetos de estudio que por su pequeez estn fuera del rango de resolucin del ojo normal.
Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopa, el uso del mismo se requiere para producir las imgenes adecuadas, de todo un conjunto de mtodos y tcnicas afines pero extrnsecas al aparato.

 Algunas de ellas son, tcnicas de preparacin y manejo de los objetos de estudio, tcnicas de salida, procesamiento, interpretacin y registro de imgenes, etc.

la microscopa generalmente implica la difraccin, reflexin o refraccin de algn tipo de radiacin incidente en el sujeto de estudio

 Microscopa ptica
Microscopa ptica (microscopa de luz clsica), consiste en hacer pasar luz visible de una fuente (difractada, reflejada o refractada en el sujeto de estudio) a travs de lentes pticos simples o mltiples, para lograr una vista ampliada de la muestra. La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo humano, impresa en una placa fotogrfica o registrada y mostrada digitalmente.
Microscopio estereoscpico

 El microscopio ptico compuesto tiene los siguientes Sistemas o partes:

1.- SISTEMA MECNICO: Soporte Brazo Base pie Tubo del ocular Cabezal Revolver Platina Tornillos de enfoque: Tornillo macromtrico Tornillo micromtrico

SISTEMA MECANICO

SISTEMA OPTICO

Ocular Objetivos

Sistema de iluminacin

Condensador Diafragma Portafiltro Espejo Fuente de Luz

ACTIVIDAD 2
Realizar una investigacin de los diferentes tipos de microscopios.

Existen distintas variantes de observacin en MO

Traqueidas del leo de Pinus Coloracin: safranina Microscopa ptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes especficos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera Microscopa de campo brillante: el material se observa sin coloracin. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estn naturalmente coloreados. El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espcimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minsculos que se estn analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminacin normal.

 Microscopa en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las clulas sin colorear. Es ideal para espcimenes delgados, o clulas aisladas. El microscopio de fase ilumina el espcimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es ms estrecho y entra en el campo de visin del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminacin provoca variaciones minsculas en el ndice de refraccin de un espcimen transparente, hacindolo visible. Este tipo de microscopio es muy til a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biologa y medicina.

 Nomarski, microscopa diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imgenes combinadas aparecen como si la clula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseado para observar relieves de especimenes muy difciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilizacin in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espcimen es muy grueso para usar contraste de fases

 Microscopa de fluorescencia: una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayas luminosos: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante.
Clulas epiteliales , triple coloracin: ncleo (azul), microtubulos (verdes), actina (rejo). 200X (izq.) y 1000X (der.).

1.4.2 Tcnicas histolgicas

Se denomina tcnica histolgica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada (tejido biolgico), a fin de que sea posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la observacin de estructuras no visibles al ojo humano.

Se denomina TCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un material biolgico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones ptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes morfolgicos a travs de los microscopios fotnicos y electrnicos.

 Obtencin del material histolgico Los tejidos se pueden obtener de diferentes formas: Biopsia - Biopsa excisional - Biopsia incisional - Biopsa endoscpica - Biopsia colposcpica - Puncin aspiracin con aguja fina (PAAF) - Biopsia por puncin con aguja gruesa (Tru-cut) Abiopsia Necrociruga (llamada vulgarmente autopsia)

Sinopsis general
Paso Obtencin Objetivos -Proveer el material para su estudio al microscopio - Preservar el material - Evitar la autlisis - Eliminar los m.o. - Embeber el material en un medio fcil de cortar en fetas muy delgadas - Lograr lminas muy delgadas que sean atravesadas por la luz - Visualizar los tejidos - Identificar molculas en ellos (Histoqumica) - Preservar el corte, mantenindolo aislado del aire y deshidratado Medios usuales - Biopsia - Reseccin quirrgica - Autopsia - Formol al 10 % - Bouin - Glutaraldehdo - Parafina - Acrlicos - Resinas Epoxi - Micrtomo rotatorio - M. de deslizamiento - Ultramicrtomo - Hematoxilina - eosina - Tricrmicos - Histoqumica Blsamo del Canad - Medios plsticos

Fijacin

Inclusin

Corte

Coloracin

Montaje

Proceso de fijacin
La fijacin es en esencia un mtodo para la preservacin de la morfologa y la composicin qumica de las clulas y los tejidos. Consiste en que las clulas conserven su estructura con un mnimo de modificaciones. Asimismo algunos mtodos tratan de conservar intacta su composicin qumica. La fijacin debe realizarse inmediatamente de extraer las clulas del organismo, para evitar las lesiones , cambios osmticos y luego alteraciones estructurales y bioqumicas ms profundas, autolisis. Deben actuar sobre fragmentos relativamente pequeos de tejidos (como regla general menos de 1 cm cbico), para que la difusin del fijador desde las superficies.

 Propiedades de los fijadores: - Producen una rpida muerte celular, evitando la autlisis - Preservan la morfologa celular y tisular - Preservan la composicin qumica - Penetran a los tejidos con relativa rapidez - Facilitan la coloracin posterior - Inhiben el crecimiento microbiano y por lo tanto la putrefaccin - Aumentan la consistencia de los tejidos - Algunos de ellos colorean sustancias de los tejidos.

 Efectos indeseables de algunos fijadores: - Retraen los tejidos - Precipitan en forma de cristales - Endurecen demasiado las muestras - Poseen olor desagradable e irritan la piel y las mucosas - Producen alteraciones importantes a nivel molecular - Producen alteraciones importantes a nivel ultraestructural

Clasificacin general fijadores Fsicos - Calor - Desecacin - Microondas - Alcoholes

Qumicos simples

-Metanol -Etanol - Formaldehdo -Glutaraldehdo - Actico - Pcrico -Osmico - Bicromato de potasio -Bicloruro de mercurio Alcohol etlico +Acido actico Acido pcrico + Formol +Acido actico Bicromato de potasio + Bicloruro de mercurio + Acido actico Formaldehdo + Glutaraldehdo

- Aldehdos

- cidos

- Sales Mezclas de Carnoy qumicos Bouin Zenker

FaGlu

 Lavados Se debe lavar el tejido para quitar el exceso de fijador. Generalmente se emplea agua destilada o agua corriente a chorro medio, para no eliminar la preparacin. Deshidratacin. El exceso de fijador al momento de la infiltracin, incluso en la microtoma, podra afectar los cortes histolgicos, y por ello se debe lavar. La deshidratacin se hace empleando diferentes soluciones de alcohol de concentracin creciente.

Aclaramiento
En este paso se sustituye el alcohol por un disolvente de parafina. El ms usado es el xilol (xileno) ya que como la muestra est deshidratada, el xilol entrar hasta lo ms profundo del tejido. Tambin el tejido pierde color y adquiere un tono acaramelado.

Infiltracin
En este paso la muestra se coloca en parafina lquida, cabe mencionar que se debe usar parafina histolgica. Como se ha dicho en el paso anterior el tejido est completamente lleno de xilol, ahora debido a smosis sale el xilol y entra la parafina. La deshidratacin, aclaramiento e infiltracin pueden ser realizadas manualmente pero hoy en da se realizan de modo automtico en mquinas especficas.

Inclusin
Para la obtencin de cortes finos es un requisito indispensable que el tejido haya sido previamente endurecido: hasta un cierto punto, cuanto mayor sea la firmeza del tejido, tanto ms delgada resulta el corte histolgico. Con el fin de endurecer los tejidos existen dos mtodos principales: la congelacin o la inclusin

 El tejido se impregna en un material que le confiere una consistencia adecuada para el corte. Para el microscopio ptico se usa casi exclusivamente la parafina. despus por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno (aclarantes). O con acrlicos de bajo peso molecular como el metilmetacrilato, lo que permite obtener cortes ms delgados. Para microscopa electrnica se incluye casi invariablemente en resinas epoxi. Se deben poner a enfriar en un congelador para su corte.

Proceso de fijacin Lavados Deshidratacin Aclaramiento Infiltracin Inclusin Microtoma Tincin Observacin
http://es.wikipedia.org/wiki/T%C3%A9cnica_histol%C3%B3gica

Microtoma
Se realizan cortes histolgicos muy delgados segn lo requerido o la costumbre del laboratorio donde se realice la tcnica. Los cortes van desde 0,5 micras hasta 8 u 10 micras. Los cortes se echan al bao de flotacin y se pescan con un portaobjetos, se marcan con la fecha, el tipo de tejido y la tincin con que se van a procesar. El ngulo de corte entre el cuchillo del microtomo y el bloque ha de estar entre 10 y 15. Una vez realizado el corte se da un bao de agua destilada, para que la parafina se estire. Un buen corte histolgico debe tener un grosor aproximado de 3-5 micras para que sea fcilmente atravesado por la luz.

Los microtomos ms usados son

Microtomo para parafina: Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 m de grosor, para observar con el microscopio ptico. Vibratomo: Corta material no incluido, aunque s fijado o duro, en secciones de 30 a centenares de m de grosor, para observar con el microscopio ptico. Microtomo de congelacin: Con l se consiguen secciones de 30 a unas 100 m de material congelado para su observacin con el microscopio ptico. Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y se obtienen grosores de 10 a 40 m, para observar con el microscopio ptico. Ultramicrotomo: Con l se corta material incluido en resinas y se obtienen secciones del orden de nanometros de grosor, para observar con el microscopio electrnico de transmisin. Ultracriotomo: Su uso no est muy extendido pero se suele emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanometro de material que no se debe incluir, para observar con el microscopio electrnico de transmisin.

Tincin
Hay muchos tipos de tinciones para diferenciar en los tejidos las diferentes estructuras o sustancias. La tincion ms usada o tambin llamada "de rutina" es la de hematoxilina y eosina (H&E). Se usa un colorante llamado hematoxilina que tie las sustacias cidas o que las contengan, como el ncleo que contiene cido desoxirriboncleico (ADN) La eosina amarillenta tie las estructuras bsicas como el citoplasma y dems orgnulos eosinoflicos de la clula.

Ejemplos
Masson PAS Perls Plata metenamina Warthin-Starry Ziehl-Neelsen Van Gieson Azul alcian Sudn III Rojo Congo Tinciones diferenciales : Gram

Histoqumica
La histoqumica es el conjunto de tcnicas de coloracin destinadas a visualizar sustancias especficas en los tejidos. El mtodo histoqumico en sentido estricto es microscpico debe cumplirse varias condiciones: 1) la sustancia original debe ser inmovilizada y visualizada por el microscopio en su localizacin celular original 2) la sustancia debe ser identificada por un procedimiento que sea especfico para ella o para el grupo qumico al que pertenece

Ubicacin general
Lpidos - Sudanes - Aceite rojo 0 - Tetrxido de osmio - PAS - Azul de Alcian - Metacromasia - Acidofilia y basofilia - Impregnacin argntica - Histoenzimologa - Inmunohistoqumica - Verde de metilo - Pironina - Anaranjado de acridina - Reaccin de Feulgen - Hibridacin in situ

Hidratos de carbono

Protenas

Acidos nucleicos

Observacin
Es el ultimo paso de una preparacin histolgica que es muy empleada en laboratorios y hospitales, y se realiza a travs del microscopio ptico o microscopio electrnico.

 http://biologiadelacelula.files.wordpress.com/2008/04/senalizacioncelular.pdf http://bibliotecadeinvestigaciones.wordpress.com/biologia/la-biologiacelular/ http://microscopia.galeon.com/productos1689173.html http://www.biologia.edu.ar/microscopia/microscopia1.htm http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/2-fijacion.php www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/.../3_tecnica_histologica.pdf http://www.dermato101.com.ar/tecnica.pdf