MODULO

I: Metodos de Estudios

TECNICAS HISTOLOGICAS:

DEFINICION: Es el conjunto de operaciones que se somete un material organizado para hacer posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la observacin de las estructuras no visibles al ojo humano.

METODOS HISTOLOGICOS:
1-Examen inmediato o in vivo: a) En fresco: animales unicelulares y clulas libres. b) Coloracin vital: usando soluciones de colorantes no txicos (colorantes vitales), coloracin intravital o in vivo, y la coloracin supravital, donde pueden colorearse clulas libres o porciones de rganos. 2- Examen mediato o post-morten: Requiere de la muerte celular y supone seguir una serie de pasos, la Tcnica histolgica

PASOS DE LA TECNICA:
1- Obtencin del material:
Pueden provenir de: * biopsias quirrgicas * material obtenido de necropsias * utilizando animales de laboratorio * estudios experimentales en animales * material de cultivos de tejidos * frotis o extendidos

2- Fijacin:
Es el proceso Fsico (Histoqumico) que logra una situacin estable de los constituyentes tisulares, interrumpiendo las reacciones enzimticas de autlisis.

Cualidades de un buen fijador:

1)

Actuar con rapidez y detener los procesos autolticos. 2) Buen poder de penetracin. 3) Conservar lo mas fielmente la estructura del tejido. 4) No interferir y facilitar los procesos posteriores. 5) Endurecer el tejido y darle mayor consistencia. 6) Insolubilizar los componentes de los tejidos. 7) No producir estructuras artificiales.

Clasificacin de los fijadores:

1- Fijadores qumicos: son los ms empleados y pueden ser:

a) Simples: constituido por una sola sustancia:

Formol al 10%: Es muy usado. Aldehdo glutrico o glutaraldehido Acetona en fro.

b) Compuestos o mezclas fijadoras: constituidas por varias sustancias.

Liquido de Flemming: (mezcla cromo-osmio-actica) para estudios citolgicos. Liquido de Bouin: (mezcla picro-formol-actica). El mejor fijador para los trabajos corrientes. Muy penetrante.

2- Fijadores fsicos:
Desecacin: Calor seco: Calor hmedo: Fro: Congelacin y desecacin: (Mtodo de Altmann-Gersh)

Mecanismo de accin de los fijadores:

a) Por coagulacin de las protenas, sin combinarse con ellas: alcohol, formol, cido Pcrico, etc. b) Formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas: cido crmico, bicromato de potasio, de amoniaco, etc. c) Por reduccin, al contacto con las sustancias orgnicas formando un precipitado fino: cido smico, bicloruro de mercurio. d) Por oxidacin: bicromato de potasio.

3- Inclusin
Es impregnar la pieza con una sustancia que le confiere dureza y permite obtener cortes uniformes y delgados. En la tcnica corriente, se utiliza la parafina; que es insoluble en agua, est condicionada por la extraccin de toda el agua del material a incluir. Los pasos de la inclusin son los siguientes:

c) Impregnacin en parafina:
Es la inclusin propiamente dicha.

d) Confeccin del taco:

Es la inclusin definitiva del trozo de tejido. Se utiliza un molde metlico especial denominado barras de Leuckart, donde se vierte parafina liquida (60C).

4- Obtencin del corte:

Para obtener cortes finos se utilizan aparatos denominados micrtomos, hay varios tipos.

Tipo Minot: (Mas Usados) dispone de 4 posiciones de ajuste, segn el corte sea de 1-10 m, 11-20 m, 21-30 m o 31-40 m as como ajuste del ngulo de la cuchilla graduado, inmovilizacin de la rueda y mecanismo de avance de gran precisin

Montaje del corte:

Se colocan sobre una platina con agua caliente. Luego se levantan los cortes con un portaobjeto, se extiende sobre una pelcula de Albmina de Mayer, que es una mezcla de partes iguales de albmina de huevo, glicerina con un cristal de timol. Los portaobjetos con los cortes adheridos se llevan a la estufa.

5 COLORACION:
Los colorantes se pueden clasificar de diferente manera: 1-Colorantes naturales: a) animales: carmn. b) vegetales: hematoxilina, orceina. 2-Colorantes artificiales o sintticos: (colorantes de anilina). a) cidos: Son colorantes citoplasmticos. b) bsicos: Son colorantes nucleares. c) neutros: Tien citoplasma y ncleo de diferente color 3-Colorantes indiferentes: no forman sales. Sudan III, rojo escarlata, etc. Sustancias basofilas se tien con los colorantes bsicos Sustancias acidofilas se tien con los colorantes cidos Sustancias neutrofilas se tien con los colorantes neutros.

Tcnica de la hematoxilina y eosina: Hematoxilina:

Es un colorante nuclear, esta cargado positivamente por lo tanto es un colorante bsico. De origen vegetal (hematoxilom compechianum). Es incoloro y tiene que ser trasformado por oxidacin en hemateina, que es el autntico colorante.

Eosina:
Es un colorante artificial, dbilmente cido, que pertenece al grupo de las fluorescenas, soluble en agua. Colorea el citoplasma, el tejido conjuntivo y las fibras colgenas de un rosado intenso.

Los pasos de la coloracin son:

a) Desparafinizacin: b) Hidratacin: c) Coloracin propiamente dicha:

6) Montaje final
Las fases del montaje final son:
a) Deshidratacin: mediante la accin de alcoholes de gradacin creciente: 70, 80, 90 y 100, sucesivamente. b) Homogenizacin o aclaracin: se emplea el benzol o xilol a los que se le puede agregar cido carbnico o fnico para aumentar su eficacia, estos son muy vidos de agua. c) Colocacin del cubreobjeto: con el objeto de proteger el preparado, se la recubre con una laminilla de vidrio de 0,2 mm de espesor, o cubreobjeto. Para adherir el cubreobjeto al portaobjeto, se emplea una resina, el Blsamo de Canad.

TECNICAS HISTOQUIMICAS:
Son tcnicas utilizadas para determinar la presencia y localizacin de elementos qumicos en el tejido mediante ciertos colorantes afines. A-cidos nucleicos: Azul de Metileno o de Toluidina y la hematoxilina. La reaccin de Feulgen, que es especifica para ADN. B-Hidratos de carbono: se utiliza la Reaccin del PAS (cido peryodico y reactivo de Schiff) y para polisacridos cidos el mtodo del Azul de Alcian (Alcian Blue).

C-Lpidos: colorantes del tipo Sudan III, el Escarlata R o Sudan IV, el Sudan negro B (Sudan black B).
Tambin se pueden determinar ciertas sustancias utilizando las Tcnicas inmunohistoquimicas, usando anticuerpos especficos marcados para ciertos elementos puntuales.

MICROSCOPIO
Microscopio simple: o lupa, consta de una sola lente y se utiliza en materiales vivos Microscopio compuesto: Llamado as por estar formado por tres tipos de lente: Ocular, Objetivos y el Condensador

Descripcin del microscopio

Consta de dos partes fundamentales:
1- Parte ptica: Ocular. Objetivo. Sist. De inluminacion. 2- Parte mecnica: 1- Pie. 2- Columna. 3- Tubo. 4- Mecanismo de movimiento. 5- Platina.

Ocular
Es cilindro hueco metlico, provisto de una lente o un sistema de lentes convergentes, cuya finalidad es aumentar la imagen real e invertida enviada por el objetivo. Acta como una lupa y forma una imagen virtual, significa que se forma del lado del objeto.

Objetivo
Es la parte mas importante de un microscopio. Consta de varios lentes, que actan en conjunto como si fuera uno solo, tratando de corregir las llamadas aberraciones de esfericidad y cromtica.
El objetivo manda al ocular una imagen magnificada, real, e invertida del objeto que observamos, el lado derecho de la preparacin, aparece a la izquierda de la imagen, el lado superior del preparado, se ve en el lado inferior de la imagen.

Aparatos de iluminacin
Son:

1- el espejo. 2- el condensador.
3- el diafragmairis.

Parte mecnica:
Tambin denominado estativo o montura del microscopio. Se compone de las siguientes partes: 1- Pie. 2- Tubo.. 3- Columna 4- Mecanismo de movimiento.

5- Platina.

Mecanismo de movimiento:
Para facilitar el desplazamiento del tubo y lograr un enfoque correcto, estan provistos de un dispositivo de tornillos, denominados, sistema de movimiento rpido y sistema de movimiento lento.

MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO 1) Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2) Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3) Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. 4) Para realizar el enfoque: a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntido la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5) Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: Incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.

TECNICA DE MICROSCOPIA ELECTRONICA:

1- Utilizar fragmentos de menos de 1mm. 2- Proceder ms rpidamente a la fijacin, con tetrxido de osmio, aldehdo glutrico o glutaraldehido agregando o no cido tnico. 3- Deshidratacin. 4- Inclusin en resinas epoxi quedan la dureza necesaria para obtener los cortes finos que la observacin exige (200 a 0,1 micrmetro). 5- Cortar con ultramicrotomo de avance muy lento y cuchillas de vidrio o diamante. 6- Recepcin de los cortes en agua, luego en rejilla de cobre y recubierta por una delgada pelcula plstica, la que ser la que sostenga el corte. 7- Pase por cido osmico, acetato de uranilo, sales de plomo, etc. 8- Observacin en pantalla fluorescente. 9- Toma de fotografas y ampliaciones a voluntad.

Diferentes tipos de Microscopios

1) Microscopio Electronico
Es el instrumento que por su alto poder de resolucin nos permite ver y conocer la ultraestructura de la clula. Las lentes son remplazadas por bobinas electromagnticas. La fuente de energa utilizada, es un haz de electrones. El que se genera calentando un filamento de tungsteno y son acelerados con alto voltaje. Los electrones son invisibles y la imagen que forman se observa mediante una pantalla fluorescente o se registra fotogrficamente. Se requiere el mximo de delgadez del espcimen para la mejor absorcin de los electrones y para que estos puedan atravesarlos. Los cortes son de 1/40 u (250 A) de espesor, que se logra con el ultramicrotomo

11) Los instrumentos modernos permiten aumentos de ms de 160.000 veces, que mediante amplificaciones fotogrficas pueden aumentarse ms de 1.000.000 de veces.

12) Este aparato es el denominado Microscopio Electrnico de Transmisin (MET). Existen microscopios electrnicas de alto voltaje que se usan en metalurgia y tambin en biologa.
13) Tambin tenemos el Microscopio Electrnico de Barrido (MEB) o de Scanning, con el que se estudian imgenes tridimensionales ya que la observacin se produce sobre la superficie del espcimen.

Microscopio de fluorescencia
Con este microscopio la observacin se realiza con luz ultravioleta, y los componentes se reconocen por la fluorescencia que emiten en el espectro visible. En la prctica la luz ultravioleta se enfoca sobre el espcimen, la luz es absorbida por ciertas estructuras, qua luego la emite dentro de la banda visible. La radiacin emitida por el compuesto, aparece brillante sobre fondo oscuro.

Microscopio de luz ultravioleta

Emplea luz ultrvioleta en lugar de luz visible. La imagen se registra en pelculas fotogrficas dado que la luz ultravioleta es invisible. Posee una resolucin mayor que el microscopio ptico. Se lo emplea para estudiar estructuras que posan cidos nucleicos.

OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS

Ultramicroscopio. Microscopio de contraste de fase. Microscopio de interferencia. Microscopio confocal. Microscopio de polarizacion. Microscopio de fuerza atomica.

Unidades de medida en microscopia

Denominacin:
Antigua
micrn o micra

Actual
micrmetro
m

Valor
milsima de milmetro

milimicra
m

manmetro
nm

millonsima de milmetro

ngstrom

dcima de nanmetro

diez millonsima de milmetro