Principios bsicos del cultivo de tejidos y sus aplicaciones

ANA CRUZ MORILLO CORONADO I.A, PhD

UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y RECURSOS NATURALES ESCUELA DE INGENIERA EN CIENCIAS AGRICOLAS PROGRAMA DE INGENIERIA AGRONOMICA 2011

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Consiste en un conjunto de tcnicas y procedimientos que esencialmente se basan en aislar una porcin de la planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones fsicas y qumicas apropiadas para que las clulas expresen su potencial intrnseco o inducido.

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Se puede definir como la ciencia y arte del cultivo asptico, en un medio nutritivo, bajo condiciones ambientales controladas, de protoplastos, clulas, tejidos, rganos o plantas enteras, con continuidad protoplasmtica que han sido removidos desde un esporofito o gametofito, a los que se les entregan las condiciones adecuadas para extender su funcionalidad por extensos periodos de tiempo separados de la planta madre.

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Cultivo de Clulas

Cultivo asptico in vitro de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo

Cultivo de Tejidos

Cultivo de rganos

HISTORIA DEL CULTIVO DE TEJIDOS

Los orgenes del cultivo de tejidos se remontan al ao 1902. cuando Haberlandt intent cultivar clulas aisladas de plantas, postulando as el principio de la totipotencia vegetal. base terica sobre la que se sustentan todas las tcnicas de cultivo in vitro. En la dcada del 50 estuvieron disponibles los conocimientos sobre los reguladores de crecimiento y los medios de cultivo que hicieron posible el rpido desarrollo de estas herramientas.

Totipotencialidad

TOTIPOTENCIALIDAD CELULAR

La

totipotencia es la capacidad que tiene una clula somtica de regenerar un planta completa e igual a la planta madre.

La clula y el ncleo contiene los planos (genes) que

van a hacer que las plantas se regeneren.

Las clulas totipotentes son clulas somticas que han

retenido su capacidad de dividirse y diferenciarse en una planta madura si se coloca en el medio adecuado.

TOTIPOTENCIA CELULAR

FACTORES QUE AFECTAN EL CULTIVO DE TEJIDOS

1. AMBIENTE QUMICO Composicin del medio de cultivo PH 2. AMBIENTE FSICO Temperatura Luz y fotoperodo Humedad

ETAPAS DEL PROCESO DE MICROPROPAGACIN

Dentro del proceso de micropropagacin diferenciamos varias fases o etapas: 0: Seleccin y Preparacin de la planta madre 1: Desinfeccin de las yemas de la planta y/o desinfeccin de semillas 2: introduccin del material seleccionado in vitro 3: Multiplicacin de brotes 4: Enraizamiento 5: Aclimatacin

EXPLANTE
Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, clulas sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard,1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagacin depende de la especie con la que se est trabajando y de los objetivos que se persigan.. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir mltiples clones de una forma o variedad con caractersticas especiales que se desea mantener en el cultivo.

ETAPAS DEL CULTIVO IN VITRO

FASE 0: PREPARACIN DE LA PLANTA MADRE

Obtener explantes con buen nivel nutricional. Grado de desarrollo adecuado. Planta madre meses antes en invernadero bajo condiciones controladas. Condiciones sanitarias ptimas, libres de enfermedades

FASE 1: DESINFECCIN DE MATERIAL VEGETAL

Se requiere desinfectar superficialmente el explante escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirn ventajosamente con el explante. La desinfeccin del material se realiza con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluda durante un perodo de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

FASE 2: INTRODUCCIN DEL MATERIAL IN VITRO

Las semillas o yemas se ponen en medio de cultivo estril. Comienza el proceso de regeneracin o germinacin de nuevos tejidos. Iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

Tabla 1. Composicin de medios de cultivo para clulas vegetales

FASE 3: MULTIPLICACIN DE LOS BROTES

Se espera que los explantes generen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En base de cada hoja hay una yema que se desarrollar luego de ser puesta en contacto en el medio de cultivo. Peridicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio. El nmero de plantas que se obtiene depender de la especie vegetal y de las condiciones del medio,

FASE 4: ENRAIZAMIENTO
formacin de races con el fin de convertir los brotes o embriones somticos en plntulas completas. Los brotes se transfieren a medios que contengan hormonas del tipo auxinas. Algunas especies no pasan por esta etapa y emiten sus races en el mismo medio de cultivo en donde se desarrollan las yemas.

FASE 5 : ACLIMATIZACIN
Adaptacin de las plantas in vitro a las condiciones ambientales. Explantes poco adaptados se han enraizado y crecido en ambientes con humedad relativa muy alta y tienen estomas poco funcionales. Falta de una cutcula con cera bien desarrollada, que evite a prdida de agua.

In vitro No realiza fotosntesis Crecimiento en condiciones controladas Crecimiento en condiciones de asepsia Alta humedad relativa Estomas no funcionales Ausencia de pelos radiculares Ausencia de cera en la cutcula In vivo Realiza fotosntesis Crecimiento en condiciones no controladas Exposicin a los patgenos y grmenes del ambiente Humedad relativa variable Estomas funcionales Presencia de pelos radiculares Presencia de cera en la cutcula

ETAPAS DE REGENERACIN IN VITRO DE MAZ

EQUIPOS LABORATORIO

Genera condiciones de esterilidad. Hacen circular aire filtrado y estril, protegiendo la muestra que se trabaja.

CMARA DE FLUJO LAMINAR

INCUBADOR DE CO2

Esto son equipos que mantienen la temperatura, adems poseen un sistema de inyeccin de CO2 generalmente entre 4-7%, y finalmente controlan la humedad ambiente

MICROSCOPIOS
- Control microscpico del cultivo. - Evaluacin de crecimiento normal de estructuras

CONGELADORES Y EQUIPOS DE CRIOGENIA Frigorficos de almacenados medios o tampones. 4C: para mantener

Congeladores de -20C: para mantener suero, aditivos y enzimas. Congeladores de -80C: para mantener a largo plazo aditivos del medio de cultivo y para sustancias muy sensibles como enzimas, inductores, factores de crecimiento, etc. Unidad de almacenamiento en nitrgeno lquido (-196C): para el almacenamiento de lneas celulares

EQUIPO DE ESTERILIZACIN Y FILTRACIN

Esterilizacin de recipientes e instrumentos de trabajo. El mtodo ms utilizado es la autoclave (aproximadamente 121C, 1.0 bar, 15min). Esterilizacin con irradiacin con rayos gamma o rayos X, usando gases como xido de etileno o formaldehdo luz ultravioleta

Otros instrumentos

Aplicaciones del cultivo Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales de tejidos vegetales

Cultivo de Cultivo de meristemos, meristemos, pices y yemas pices y yemas

Rescate y cultivo de Rescate y cultivo de embriones somticos embriones somticos Cultivo de microesp. Cultivo de microesp. y anteras y anteras Hibridacin somtica Hibridacin somtica

Cultivo de Cultivo de clulas en clulas en suspensin suspensin

Micropropagacin Erradicacin de patg. Conservacin de germp. Intercambio de germp.

MEJORAMIENTO MEJORAMIENTO VEGETAL VEGETAL

Obtencin de Protoplastos Produccin de Metabolitos Secundarios

APLICACIONES DEL CULTIVO IN VITRO

Propagacin masiva de plantas, especialmente para especies de difcil propagacin por otros mtodos, o en vas de extincin. Clonacin de individuos de caractersticas agronmicas muy deseables durante todo el ao. Obtencin de plantas libres de virus Produccin de semillas sintticas Conservacin de germoplasma (conjunto de individuos que representan la variabilidad gentica de una poblacin vegetal)

APLICACIONES DEL CULTIVO IN VITRO Obtencin de metabolitos secundarios Produccin de nuevos hbridos Mejora gentica de plantas (incluyendo obtencin de plantas transgnicas) Germinacin de semillas. Produccin de haploides. Estudios fisiolgicos diversos.

VENTAJAS DEL CULTIVO IN VITRO

1. Se hace bajo condiciones uniformes o medios definidos. 2. Ciclos de cultivos sin efectos estacionales o ambientales. 3. Clulas no diferenciadas, mejor sistema de transporte y toma de sustancias del medio. 4. Rpida incorporacin y metabolismo. 5. Condiciones Aspticas microorganismos) (libre de

6. Facilitan los protocolos de transformacin gentica.

DESVENTAJAS DEL CULTIVO IN VITRO 1. Cancelacin de todas las ventajas fotosintticas de la planta. 2. Los costos son altos. 3. En el proceso de aclimatizacin se puede perder mucho material. 4. Variacin somaclonal

PREGUNTAS E INQUIETUDES