Especie en peligro de extincin

O Canis lupus

Universidad Nacional de Sel

Materiales y mtodos
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2 perras , de 1 y 3 aos Se utilizo una clula de la piel de la oreja de una hembra de la especie Canis lupus Se utilizaron vulos de perros como recipientes de los genes de la loba y tambin hembras de perro para llevar adelante la gestacin Anlisis de los niveles de progesterona , citologa vaginal 4.0 to 7.5 ng/mL da de inicio de la ovulacin Preparacin de clulas donadoras SCNT Maduracin in vivo de ovocitos Preparacin de recipiente de ovocitos Microinyeccin , fusin , activacin y cultivo de embriones Transferencia de embriones y diagnstico de embarazo.

Preparacin de clulas donadoras SCNT

Aislamientos de fibroblasto, se corto el tejido . Tres lavados con PBS O Se utilizo Dulbeccos Modified Eagles medium DMEM Suplementacin O 0,25% (w / v) de tripsina y 1 mM EDTA (Invitrogen) durante 1 hora a 37 C. Las clulas se lavaron con DPBS por centrifugacin a 300 g durante 2 minutos Se cultivaron posteriormente durante 6 a 8 das en DMEM suplementado con 10% (v / v) suero bovino fetal (FBS), 1 mM de glutamina, 25 mM de NaHCO3, y 1% (v / v) aminocido no esencial (Invitrogen) a 39 C en una atmsfera humidificada atmsfera de 5% de CO2 y 95% de aire Eliminacin de grupos de clulas no unidas o explantes, clulas adheridas se cultivaron Estas clulas se subcultivaron a intervalos de 4 a 6 dias y fueron congelados . El medio de congelacin consisti de 80% (v / v) DMEM, 10% (v / v) dimetil sulfxido, y% 10 (v / v) de FBS. Antes de SCNT, clulas Se descongelaron, se cultivaron durante 3 a 4 das hasta 100% y se recuperan de la monocapa por tripsinizacin durante 1 min.

Preparacin de recipiente de ovocitos

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Obtencin de ovocitos maduros in vivo mediante lavado . Remocin de las clulas del cumulus de los ovocitos maduros , mediante pipeteo con hialuranidasa (0,1%) en buffer HEPES y medio con aminocidos . Tincin y observacin de los ovocitos en un microscopio invertido . Enucleoneacin con micromanipulador Los ovocitos enucleados se colocaron en TCM-199 suplementado con (v / v) 10% de FBS y se utiliza para SCNT. se eliminaron usando una pipeta de aspiracin El primer cuerpo polar y adyacentes citoplasma, que contiene los cromosomas de metafase II,

Microinyeccin , fusin , activacin y cultivo de embriones O Transferencia de embriones y diagnstico de embarazo.

SNUWOLF, 129 das

SNUWOLFFY,
121 das

Verificacin :

El lunes 26 de marzo del 2005 ,se anuncio que por primera vez se haba clonado exitosamente en el mundo dos lobas. En dos de estos casos el proceso concluy con xito y las lobas parieron mediante cesrea unos lobeznos que pesaron al nacer 430 y 530 gramos, hacia el 2007 su peso era de 20 Kg Clonaron otros seis lobos grises coreanos, todos hembras, pero tres de ellos fallecieron.

Se transfiri 251 embriones a 12 madres adoptivas 16,7% [2 lobos de 12 madres adoptivas , de 251 embriones (0,80%)],