-APOPTOSISLa apoptosis o muerte celular programada es el proceso ordenado por el que la clula muere ante estmulos extra o intracelulares.

La apoptosis es fundamental en el desarrollo de rganos y sistemas, en el mantenimiento de la homeostasis del nmero de clulas y en la defensa frente a patgenos. Es un proceso finamente regulado que cuando se altera produce graves patologas como malformaciones, defectos en el desarrollo, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas o aparicin de tumores. La apoptosis o muerte celular programada es el proceso ordenado de muerte de una clula ante estmulos extra o intracelulares. La apoptosis es fundamental en los siguientes procesos: Remodelado durante el desarrollo embrionario. Un ejemplo puede ser la eliminacin de las zonas interdigitales Desarrollo de rganos y sistemas. El establecimiento del correcto circuito de conexiones neuronales durante el desarrollo necesita que las neuronas que no establezcan contactos sinpticos mueran por apoptosis. Tambin en el establecimiento de un repertorio inmune adecuado es necesario que los linfocitos T que reconocen antgenos propios mueran en el proceso de seleccin negativa Mantenimiento de la homeostasis celular. Es crucial el manteniendo de un nmero determinado de clulas estableciendo un equilibrio entre divisin y muerte celular. En sistemas como la mdula sea o el aparato digestivo es especialmente importante que los procesos de apoptosis funcionen adecuadamente Defensa frente a patgenos. Clulas infectadas por virus o bacterias disparan procesos de apoptosis como defensa. Defensa frente al desarrollo de tumores. Procesos de apoptosis tambin protegen frente al desarrollo de algunos tipos de tumores. Los estmulos que inducen apoptosis pueden ser extra o intracelulares. Citoquinas como el TNF, radiaciones, falta de seales hormonales o de factores trficos son algunos ejemplos de estmulos extracelulares que inducen apoptosis. Mitosis incompleta, aumento de las especies reactivas de oxgeno, aumento del calcio citoplasmtico o daos irreparables del ADN mediados por la molcula p53 son ejemplos de estmulos intracelulares que disparan procesos de apoptosis. La apoptosis comienza con la activacin de unas protenas llamadas caspasas, que producen una cascada proteoltica que culmina con la hidrlisis de protenas estructurales y de enzimas reparadoras de ADN y con la activacin de enzimas hidrolticas como las endonucleasas. Los estmulos extracelulares activan la caspasa 8 mientras que los intracelulares activan protenas pro-apoptticas e inhiben protenas anti-apoptticas de la familia Bcl-2. En respuesta a estmulos intracelulares o como va alternativa promovida por la caspasa 8 (que vehicula los estmulos extracelulares) se forma el apoptosoma. La mitocondria est involucrada en la apoptosis inducida por dao o stress. En un primer momento se libera citocromo c al citoplasma. ste se une a la protena Apaf-1 que activa a la caspasa 9. La apoptosis es un proceso ordenado, con una serie de fases: disminucin del volumen celular y prdida de las caractersticas de adhesin, degradacin de protenas y fragmentacin del ADN, condensacin cromatnica, aparicin de burbujas en superficie, fragmentacin del ncleo, formacin de los cuerpos apoptticos (rodeados de membrana) y fagocitosis de estos cuerpos apoptticos por macrfagos. En ningn caso se vierte el contenido celular al exterior. La apoptosis es un proceso muy finamente regulado. Si ocurre un exceso o un defecto de apoptosis, se producen diversas patologas como malformaciones, defectos en el desarrollo, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas o aparicin de tumores.

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PAPEL DE LA APOPTOSIS EN EL SISTEMA INMUNITARIO

La muerte celular programada es muy importante para el desarrollo y funcionamiento del sistema inmunitario, debido a que interviene en los eventos de formacin del repertorio de clulas T y B, en los mecanismos de tolerancia central y perifrica, en la eliminacin de clulas autorreactivas, en el establecimiento de la memoria inmunolgica y en los mecanismos citolticos de clulas asesinas naturales y linfocitos T citotxicos. Es conocido que el 95 % de los timocitos son eliminados en el timo por mecanismos de apoptosis, proceso denominado seleccin negativa (delecin clonal), el cual elimina la existencia de clones T autorreactivos. Tambin en la mdula sea existe un proceso similar de delecin de clones B, autorreactivos en el estadio B inmaduro por entrecruzamiento de la inmunoglobulina de superficie en ausencia de seales coestimulatorias. No obstante, la apoptosis no se restringe a las clulas inmaduras. Tambin los linfocitos T maduros, bajo ciertas condiciones, pueden sufrir apoptosis, lo que corrobora su papel inmunorregulador. Entre los factores que pueden inducir apoptosis en clulas maduras estn: los glucocorticoides y las radiaciones gamma, la estimulacin del complejo TCR/CD3 por anticuerpos monoclonales, Ags nominales y superantgenos y la estimulacin de los receptores CD2, Fas/Apo-1 y TNF. Se ha demostrado que la sensibilidad para lograr la apoptosis es ms lenta en clulas maduras y requiere previa activacin. La ruta que siguen los linfocitos T al ser estimulados depende de una serie de elementos que determinan si la clula prolifera, o si muere por apoptosis.

FORMACION DEL APOPTOSOMA

La formacin de la estructura del apoptosoma se desencadena con la liberacin de la mitocondria del citocromo c mediada por la familia Bcl-2. Una vez liberado, el citocromo c se une a Apaf-1 formando un primer complejo. Esta unin viene definida por la existencia en el extremo C-terminal de Apaf-1 de varios dominios WD40 de unin protena-protena como los presentes en la subunidad b de las protenas G heterotrimricas. Apaf-1 presenta tambin un dominio de reclutamiento de caspasas (CARD) que, en condiciones de inactividad, estara secuestrado por dos de los dominios WD40, pero que se libera con la unin del citocromo c. La exposicin de los dominios CARD permite a Apaf-1 reclutar a la procaspasa-9 en presencia de dATP que media la oligomerizacin del complejo. Una vez unida, la procaspasa-9 sufre un autoprocesamiento dando lugar a su forma activa de caspasa-9, una caspasa iniciadora capaz de activar caspasas efectoras como la caspasa-3. Esta sucesin de acontecimientos acaba desembocando en la activacin de otras caspasas y de factores de degradacin de ADN que se encargaran de fragmentar el material gentico.

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La apoptosis: sus caractersticas y su papel en la transformacin maligna de la clula

Dra. Mara del Carmen Arango Prado,1 Lic. Leticia Llanes Fernndez,2 Dr. Toms Daz Romn1 y Dra. Mara Elena Faxas Garca1

RESUMEN
La apoptosis o "muerte celular programada" es una forma de suicidio celular genticamente definida, que ocurre de manera fisiolgica durante la morfognesis, la renovacin tisular y en la regulacin del sistema inmunitario. Determinados hechos celulares pueden ser explicados por trastornos en la regulacin de los genes responsables de la apoptosis, como es el caso de la transformacin y la progresin tumorales. En este trabajo revisamos las caractersticas fundamentales de este mecanismo de muerte celular, sus variaciones morfolgicas, bioqumicas, los genes involucrados y su papel en el desarrollo de malignidades, entre otros aspectos de inters.

Descriptores DecS: APOPTOSIS/inmunologa; APOPTOSIS/gentica; TRANSFORMACION CELULAR NEOPLASICA. Los mecanismos que regulan la muerte celular son esenciales para el normal desarrollo y mantenimiento de la homeostasia. Las clulas crecen controladamente gracias a la expresin de nuevos genes que inducen seales de muerte en estadios definidos de diferenciacin y en respuesta a estmulos fisiolgicos determinados.1,2 En los aos 803 se introduce el trmino griego de apoptosis que significa "cada de las hojas de un rbol o de los ptalos de una flor", para definir las caractersticas morfolgicas particulares de un tipo de muerte celular fisiolgica, programada genticamente, que difiere de la muerte celular patolgica o necrosis celular.4,5 Se considera a la apoptosis como un mecanismo fisiolgico de muerte (inherente al desarrollo celular), que se desencadena por diversas seales, las cuales pueden ser fisiolgicas, o por estimulaciones exgenes ambientales. Estas seales pueden actuar sobre receptores de superficie y causar la activacin en cascada de protenas citoplasmticas; ello trae como resultado la activacin de un programa gentico que conduce, generalmente, a la nucleolisis por la accin de las endonucleasas.6 Este mecanismo de muerte celular interviene en importantes fenmenos fisiolgicos como: embriognesis, mantenimiento de la homeostasia, renovacin tisular y desarrollo y funcionamiento del sistema inmunitario.7 Los trastornos en la regulacin de la apoptosis por diferentes vas, estn presentes en la etiopatogenia de diversas enfermeddes autoinmunes, neurodegenerativas, y tambin se sugiere que participen en el Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA).7,8 Debido a que la apoptosis puede considerarse como un proceso de eliminacin de clulas defectuosas, la desregulacin de los genes que codifican las protenas relacionadas con la apoptosis, puede ser la causa del desarrollo de diversos tumores.9
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CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE LA APOPTOSIS

Las caractersticas de la clula apopttica difieren de las observadas en las clulas que sufren necrosis. En este ltimo fenmeno la muerte es un proceso "pasivo" que no requiere de sntesis proteica, y es causado por la prdida de la homeostasia. Se caracteriza por dao mitocondrial, rotura de la membrana, lisis celular y liberacin de su contenido al medio extracelular.3,10

Contrariamente, la apoptosis es un proceso activo que implica sntesis proteica, en el cual la clula sufre una condensacin nuclear y citoplasmtica. Sus caractersticas morfolgicas revelan condensacin de la cromatina nuclear, desintegracin nucleolar, disminucin del tamao nuclear, compactacin del citoplasma y de organelo (excepto mitocondrias y ribosomas), alteraciones del citoesqueleto y aspecto de burbuja de la membrana, aunque no se rompa. Durante el proceso final ocurre fragmentacin del DNA debido a una ruptura internucleosomal del DNA y se forman fragmentos nucleares recubiertos de membrana (cuerpos apoptticos), que son fagocitados sin evidencia de reaccin inflamatoria.11,12 RECEPTORES DE MEMBRANA CELULAR QUE MEDIAN APOPTOSIS
Un avance importante para la investigacin de la apoptosis se logr cuando se indentific un antgeno (Ag) de membrana celular capaz de inducir seales de apoptosis. Este receptor se denomin Fas o Apo-1, cluster de diferenciacin (CD) 95, y es una protena transmembrana tipo II glicosilada de aproximadamente 43 kD que se expresa constituitivamente en gran variedad de tejidos normales y lneas tumorales.13

El inters en este receptor aument cuando se demostr, en modelos murinos, que las mutaciones en el gen que codifica a este receptor, se relacionan con trastornos linfoproliferativos por la incapacidad de producir apoptosis.14 El Fas/Apo-1 es miembro de la superfamilia de los Factores de Necrosis Tumoral (TNF), entre los que se encuentran los Receptores TNF tipo I y II, el receptor del factor de crecimiento neuronal (NGF), CD40 y CD27.15,16 El ligando del Fas/Apo-1 es una protena de membrana tipo II de 40 kD miembro de la familia del TNF que est altamente expresado en linfocitos activados.17 La unin del Ag de membrana Fas/Apo-1 con su ligando y con anticuerpos antagonistas, es una de las vas de inicio de seales para la apoptosis.18 Existe una relacin estrecha entre la participacin del ligando Fas y la citotoxicidad mediada por los linfocitos T CD8+, mecanismo efector de gran importancia en la respuesta inmune antitumoral.19 El papel de la interaccin Fas/Apo-1 y su ligando en cncer no est bien establecido; sin embargo, su papel en la apoptosis sugiere su participacin como supresores del tumor. Por ejemplo, la inactivacin de las seales va Fas debido a la baja expresin de este Ag en la membrana, puede llevar a la clula a una supervivencia anormal y contribuir al desarrollo y progresin de malignidades.20 MECANISMOS BIOQUMICOS DE LA APOPTOSIS

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Las vas bioqumicas involucradas en la apoptosis se encuentran actualmente en investigacin. Se conoce que los linfocitos y la mayora de las clulas nucleadas experimentan ruptura internucleosomal del DNA mediante endonucleasas Ca2+ Mg2+ dependiente, entre las que se encuentran la NUC-18, la DNAsa I y la DNAsa II.

Sin embargo, existen mltiples evidencias de apoptosis en clulas enucleadas, por tanto el mecanismo apopttico puede no interesar al ncleo. Ciertos experimentos realizados en clulas enucleadas de nematodos que sufren apoptosis, han evidenciado la existencia de ms de una va de apoptosis, donde los cambios citoplasmticos pueden ser decisivos. En esta especie se han definido varios genes que codifican protenas citoplasmticas relacionadas con la apoptosis, como la Ced-3 (ICE-enzima convertidora de IL1 b), Ced-4 y la Ced-9. En los mamferos existe la proteasa "ICE like" que forma una familia de proteasas suicidas y es homloga a la protena Ced-3 de nematodos, tambin se observa homologa entre los genes Ced-9 nematodos y bcl-2 de mamferos, ambos inhibidores de la apoptosis.5,21 GENES INVOLUCRADOS EN LA APOPTOSIS FAMILIA DE GENES bcl-2
El bcl-2 (B cell leukemia/lymphoma 2 genes) fue el primer proto-oncogen detectado y fue asociado con procesos malignos de las clulas B. Durante la maduracin de las clulas B puede ocurrir una traslocacin cromosomal 14,18 en el gen bcl-2; ello provoca un aumento en la expresin de la protena citoplasmtica Bcl-2, que origina inhibicin de la apoptosis en clulas B y da por resultado la supervivencia de la clula transformada.22 Est demostrado que la sobreexpresin del gen bcl-2 en linformas inducidos experimentalmente, se asocia con la proliferacin neoplsica por los efectos inhibitorios de Bcl-2 sobre las vas de apoptosis.23 Este gen facilita el aumento de la supervivencia de la clula transformada y de este modo aumenta la posibilidad de futuras aberraciones genticas que pueden conducir a la progresin maligna.24,25 La expresin de este gen en algunos tipos de cncer es un marcador de mal pronstico.26

El gen bcl-2 forma parte de una familia de genes que intervienen en la regulacin de la supervivencia de la clula. Los miembros de la familia Bcl-2 estn integrados por: Bcl-2, Bax, Bad, Bcl-X1, Bcl-Xs, Mcl-1. El destino de una clula de morir o sobrevivir est determinado por las diferencias en la expresin de estas protenas, actuando algunas como promotoras y otras como inhibidoras de las seales de apoptosis.27-29 La figura 1 nos muestra la regulacin de la apoptosis por la familia Bcl-2. Debe observarse como el heterodmero Bcl-2Bax y la variante Bcl-X1 tienen efecto inhibitorio de la muerte celular, al impedir la accin de las proteasas cistenas que median seales de apoptosis. Sin embargo, la formacin de homodmeros Bax-Bax, as como elevados niveles de Bax o BclXs, pueden favorecer la muerte programada de la clula.4,29

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FIGURA 1. Regulacin de la apoptosis por la familia Bol-2.

Es importante destacar que Bcl-2 no confiere proteccin a la clula contra la apoptosis, ni en la seleccin negativa de clulas autorreactivas del timo, ni en los mecanismos citotxicos de los linfocitos T citotxicos (CTL). Tampoco se aprecia su efecto protector sobre las clulas B inmaduras que sufren apoptosis por entrecruzamiento IgM ni en la activacin de la clula va receptor Fas/TNF.26 El bcl-2 se expresa de manera importante durante estadios muy tempranos de la diferenciacin de clulas B y T, y tambin est altamente expresado en la etapa de diferenciacin final de los linfocitos; es por ello que las clulas en estadios intermedios de desarrollo son ms susceptibles a la muerte celular.4 OTROS GENES
Es conocido que ciertos oncogenes y genes supresores de tumor influyen en el mecanismo de muerte celular programada; tal es el caso de los genes c-myc y nur-77,26,30 que a pesar de estar asociados con la progresin del ciclo celular participan en la induccin de apoptosis en algunas clulas, tambin se encuentra el gen bcl-2 que como ya ha sido descrito, bloquea la apoptosis cuando es sobreexpresado23 y el gen p53, cuyo requerimiento se produce en casos de dao genmico.26 La expresin de estos genes puede inducir a algunos tipos de cncer a la apoptosis. Esto sugiere que la muerte celular programada es un mecanismo de defensa contra la transformacin maligna.31

El gen p53 ha sido llamado guardin del genoma por ser el encargado de bloquear la divisin celular cuando las clulas han sufrido dao en su material gentico. Este bloqueo lo lleva a cabo deteniendo las clulas en la fase G1 del ciclo celular, con el objetivo de que se produzca la reparacin del DNA antes de que se replique.32,33 Este gen mantiene la integridad del genoma ya que estimula la apoptosis en las clulas en las que el dao en el DNA ha sido sustancial.34 En diversos tipos celulares incluyendo los linfocitos, la sobreexpresin de p53 conduce directamente a la apoptosis.4 La prdida de la funcin normal del gen p53 puede conducir al desarrollo de neoplasias malignas; de hecho son muy frecuentes las alteraciones en este gen en una variedad de cnceres humanos (ms del 50 % de los tumores humanos estn asociados a mutaciones en p53).4,33 Hay evidencias que hacen pensar que el alto riesgo de la transformacin maligna en ausencia de p53 funcional, probablemente origina una oportunidad reducida de reparar el DNA y una incapacidad de eliminar por apoptosis la clula daada no reparada. Aunque es desconocida la base real de la apoptosis inducida por este gen.35 Los timocitos de ratn que pierden copias funcionales del p53 son incapaces de desarrollar apoptosis luego de ser irradiados; estas clulas responden normalmente a glucocorticoides y a seales a travs del receptor.34 Se ha evidenciado que los genes involucrados en una va de apoptosis no necesariamente juegan una importante funcin en otra va. As por ejemplo nur77 se requiere para la apoptosis mediada por el receptor de clulas T (TCR), no siendo importante en la muerte celular por glucocorticoides o radiacin ionizante. A pesar de esto, se ha observado en
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ratones deficientes de nur77, muerte celular mediada por el receptor, sugirindose que, o bien este gen no es requerido in vivo para la apoptosis, o existe un gen estrechamente relacionado con l que puede compensar su deficiencia.36 Estudios anteriores sugieren la influencia de la expresin de nur77 en la proliferacin o la diferenciacin celular.26 El producto de nur77 es una protena que pertenece a la familia del receptor nuclear de hormonas esteroides y su efecto en la apoptosis est dado porque acta como un factor de transcripcin que regula la expresin de genes involucrados en la muerte celular.30 Otro regulador fisiolgico del ciclo celular que participa en la apoptosis es la protena Myc, que es producto del proto-oncogen c-myc. La sobreexpresin del gen c-myc pudiera resultar en mitosis o apoptosis en dependencia de la disponibilidad de otros factores que estimulan el crecimiento celular.32 De esta forma la expresin incrementada de Bcl-2 en presencia de un aumento de c-myc prococa una inhibicin de la apoptosis mediada por cmyc, lo que explica la cooperacin que se produce entre ambos genes en el origen de las neoplasias.4 Adems del papel que juega la apoptosis en el origen del cncer, su modulacin tambin pudiera influir en el tratamiento de esta enfermedad.31 PAPEL DE LA APOPTOSIS EN EL SISTEMA INMUNITARIO
La muerte celular programada es muy importante para el desarrollo y funcionamiento del sistema inmunitario, debido a que interviene en los eventos de formacin del repertorio de clulas T y B, en los mecanismos de tolerancia central y perifrica, en la eliminacin de clulas autorreactivas, en el establecimiento de la memoria inmunolgica y en los mecanismos citolticos de clulas asesinas naturales y linfocitos T citotxicos.36

Es conocido que el 95 % de los timocitos son eliminados en el timo por mecanismos de apoptosis, proceso denominado seleccin negativa (delecin clonal), el cual elimina la existencia de clones T autorreactivos.37 Tambin en la mdula sea existe un proceso similar de delecin de clones B, autorreactivos en el estadio B inmaduro por entrecruzamiento de la inmunoglobulina de superficie en ausencia de seales coestimulatorias.38 No obstante, la apoptosis no se restringe a las clulas inmaduras.

FIGURA 2. Factores que regulan la ruta de las clulas T activadas, despus del reencuentro con el Aq.

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Tambin los linfocitos T maduros, bajo ciertas condiciones, pueden sufrir apoptosis, lo que corrobora su papel inmunorregulador. Entre los factores que pueden inducir apoptosis en clulas maduras estn: los glucocorticoides y las radiaciones gamma, la estimulacin del complejo TCR/CD3 por anticuerpos monoclonales,26 Ags nominales y superantgenos y la estimulacin de los receptores CD2, Fas/Apo-1 y TNF.16,18 Se ha demostrado que la sensibilidad para lograr la apoptosis es ms lenta en clulas maduras y requiere previa activacin. La ruta que siguen los linfocitos T al ser estimulados depende de una serie de elementos que determinan si la clula prolifera, o si muere por apoptosis. La figura 1 muestra los diversos factores que influyen en dicha decisin.39,40

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