Investigacin / Innovacin

Terapia celular para la reparacin de las lesiones de la mdula espinal

Xavier Navarro Grupo de Neuroplasticidad y Regeneracin, Instituto de Neurociencias y Departamento de Biologa Celular, Fisiologa e Inmunologa, Universitat Autnoma de Barcelona. Centro de Investigacin Biomdica en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Institut Guttmann. Joaqun Hernndez Grupo de Neuroplasticidad y Regeneracin, Instituto de Neurociencias y Departamento de Biologa Celular, Fisiologa e Inmunologa, Universitat Autnoma de Barcelona.

La lesin traumtica de la mdula espinal causa una prdida de funciones motoras, sensoriales y autonmicas por debajo del nivel de la lesin, dejando parapljicos o tetrapljicos a los sujetos que las padecen. Los dficits funcionales provocados por la lesin medular se mantienen de por vida, ya que la ausencia de regeneracin en el sistema nervioso central (SNC) hace que las vas espinales queden interrumpidas indefinidamente. Esta ausencia de regeneracin no se debe a la incapacidad intrnseca de la prolongacin de las neuronas que transmiten los impulsos nerviosos (axones) del SNC para crecer, ya que stos generan brotes tras una lesin y son capaces de crecer a travs de implantes de nervio perifrico. Por otra parte, slo un nmero relativamente pequeo de neuronas de la mdula espinal muere inmediatamente como consecuencia directa del traumatismo. Sin embargo, un fenmeno ms insidioso, denominado muerte neuronal secundaria, extiende la prdida de clulas en el tiempo y en el espacio y es responsable de la muerte de muchas ms neuronas que la lesin primaria (figura 1). As, pues, los dos problemas fundamentales asociados a las lesiones de la mdula espinal son la muerte neuronal secundaria y la formacin en la zona afectada de un ambiente inhibitorio de la regeneracin axnica.

La neurociencia reparativa, que busca restituir las funciones neurales de la mdula espinal por debajo de los segmentos lesionados, debe plantearse hoy en da como complemento de la neurorrehabilitacin convencional, que tiende a concentrarse en la mejora de las funciones residuales y en la adquisicin de habilidades compensatorias. Empleando una variedad de estrategias, puede ser factible mejorar las disfunciones del sistema nervioso de forma que se derive un beneficio clnico para el paciente, ya que, probablemente, ningn tratamiento aislado por s slo tiene expectativas de llegar a conseguir la curacin. El conocimiento de los mecanismos celulares y moleculares de los procesos degenerativos que se suceden despus de una lesin medular ha permitido abordar tres tipos de estrategias en terapia celular (figura 2): H Neuroprotectora, para preservar o modular el dao generado durante la fase secundaria de la lesin; H Regenerativa, que permita crear un ambiente propicio para la regeneracin axnica de las neuronas; H Restitutiva de las neuronas daadas, ya sea por trasplante celular o favoreciendo la neurognesis endgena de la propia mdula.

16 / Institut Guttmann

La Entrevista | subsecci

Esquema de una lesin medular

Vas preservadas

Vas lesionadas Hemorragia

Microgla / Macrfagos Necrosis Astrocitos reactivos Lesin primaria

Lesin secundaria

El inters de los trasplantes celulares en las lesiones medulares radica en la posibilidad de afrontar varias estrategias en una sola terapia. Por ejemplo, en modelos animales los trasplantes de clulas mesenquimatosas (de tejido embrionario) o de clulas gliales (clulas con largas prolongaciones ramificadas que se encuentran tanto en la sustancia gris como en la blanca) han mostrado efectos neuroprotectores, inmunomoduladores y, en algunos casos, regenerativos.

alguno de estos frmacos no ha demostrado efectos notables, incluyendo la metilprednisolona, que es actualmente el nico frmaco de aplicacin tras una lesin medular. En un futuro, el desarrollo de frmacos que bloqueen varios de los mecanismos involucrados en la lesin secundaria, o bien la aplicacin conjunta de varios de ellos, puede ser un punto clave para el tratamiento agudo de las lesiones medulares.

Terapia neuroprotectora
Los daos provocados por la lesin primaria no se pueden evitar, ya que son consecuencia directa del traumatismo inicial. Sin embargo, s que se pueden evitar o modular los procesos lesivos durante la fase de la lesin secundaria. En las ltimas dcadas la investigacin bsica se ha centrado en frmacos que, administrados de forma temprana, sean capaces de frenar el inicio de alguno de los procesos implicados en la lesin secundaria. Diversos frmacos han mostrado propiedades neuroprotectoras en modelos experimentales de lesin medular. Sin embargo, la utilizacin clnica de

Terapia prorregeneradora de la mdula espinal

Cuando la mdula espinal sufre un traumatismo se destruyen las vas nerviosas motoras y sensoriales en el lugar de la lesin, lo que interrumpe la transmisin de impulsos nerviosos desde el cerebro y hacia el mismo. El fracaso de la regeneracin de los axones del SNC se debe, sobre todo, a una insuficiente produccin de factores neurotrficos, a la formacin de la cicatriz glial tras la lesin y a la presencia de molculas inhibidoras de la regeneracin asociadas a oligodendrocitos.

Sobre Ruedas / 17

Investigacin / Innovacin
Los axones seccionados de la mdula espinal son capaces de regenerarse en injertos de nervio perifrico, pero no a lo largo de la propia mdula espinal. La ausencia de regeneracin en el SNC parece debida ms a una limitacin que a una ausencia de la sntesis de factores neurotrficos. Los factores neurotrficos son molculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y la diferenciacin de las neuronas y de regular su plasticidad sinptica en el sistema nervioso. Existen gran variedad de estudios en los que se ha demostrado que la aplicacin de diferentes factores neurotrficos, tales como FGF, NGF, EGF, BDNF, GDNF, VEGF, PDGF, NT3 y NT4/5, aumenta la supervivencia de las neuronas supraespinales y tiende a promover la regeneracin en la mdula espinal, tanto de los axones procedentes de vas motoras como en los de las vas sensoriales, aunque en un grado limitado. Las lesiones del SNC se caracterizan por la activacin de los astrocitos, que da lugar al proceso conocido como reactividad glial. Los astrocitos (clulas nerviosas en forma estrellada presentes en el cerebro) reactivos colocan sus engrosadas prolongaciones alrededor de la zona de lesin, separando as la regin lesionada del resto del tejido medular. Ello constituye la denominada cicatriz glial. Esta cicatriz no slo est formada por los astrocitos reactivos, sino tambin por precursores de oligodendrocitos, clulas menngeas y fibroblastos, que ayudan a la formacin de una lmina rica en proteoglucanos alrededor de la zona lesionada. Los proteoglucanos limitan la regeneracin de los axones centrales a travs de la cicatriz glial. Se ha demostrado que el uso de condroitinasa-ABC, una enzima que degrada proteoglucanos, permite la regeneracin de los axones medulares a travs de la cicatriz glial y mejora las respuestas funcionales, ofreciendo resultados prometedores. La mielina del SNC representa otra de las fuentes con mayor poder inhibidor de la regeneracin axnica. En la actualidad se conocen tres inhibidores de la regeneracin asociados a la mielina: Nogo, la glicoprotena asociada a la mielina (MAG) y la glucoprotena mielnica del oligodendrocito (OMgp). Los tres inhibidores actan mediante el mismo receptor (NgR) y la misma va de transduccin intracelular (RhoA). Se han ensayado algunos tratamientos para bloquear los inhibidores asociados a la mielina con buenos resultados experimentales.

Estrategias multifactoriales para la reparacin de la lesin medular

Tratamiento farmacolgico Neuroproteccin Modulacin de la reactividad glial Guas sintticas Bloqueantes de inhibicin Factores neurotr cos Trasplante celular Trasplante celular

Promocin de la regeneracin

Promocin de la neurognesis

Clulas madre prediferenciadas

Restitucin neural

destacaron los injertos de nervio perifrico y los trasplantes de clulas de Schwann, de clulas de gla envolvente del bulbo olfatorio y de macrfagos activados. Posteriormente, con el desarrollo del conocimiento sobre las clulas madre, el inters por la terapia celular se ha generalizado a diversas patologas, incluidas las lesiones del SNC.

Trasplantes de clulas de Schwann

Las clulas de Schwann son las clulas gliales que sirven de soporte en el SNP Dado que las clulas de Schwann son . esenciales para la regeneracin axnica en las lesiones de los nervios perifricos, los injertos de clulas de Schwann aisladas se han estudiado ampliamente como posible terapia para promover la regeneracin axnica tras una lesin medular. Diferentes estudios han demostrado remielinizacin, regeneracin axnica y recuperacin funcional tras injertos de nervio perifrico, implantados mediante microciruga en una seccin medular, o de clulas de Schwann, trasplantadas en la regin de mdula lesionada, especialmente cuando se suplementan con algunos factores neurotrficos. A pesar de ello, esta estrategia tiene ciertas limitaciones, ya que los axones se regeneran en la regin del trasplante, pero son incapaces de atravesar la interfase injerto-SNC y, por lo tanto, no consiguen conectar nuevamente con sus dianas. Este hecho se debe a que las clulas de Schwann producen una influencia negativa sobre los astrocitos, de forma que stos forman una barrera en la interfase con el injerto con alto contenido en proteoglucanos que impiden la regeneracin axnica.

Terapia celular
Los trasplantes celulares o de tejido son la estrategia que probablemente ha ofrecido resultados ms esperanzadores en la reparacin de las lesiones de la mdula espinal en estudios experimentales. Los beneficios de trasplantar tejido o clulas en la mdula espinal daada podran deberse a que son capaces de rellenar la cavidad cstica originada tras la lesin, modular los procesos lesivos de la fase de lesin secundaria, proporcionar un soporte adecuado por donde los axones espinales puedan regenerarse, sintetizar factores de crecimiento necesarios para la regeneracin axnica y para la supervivencia de las neuronas afectadas tras la lesin y, en el caso de contener clulas madre, sustituir las neuronas y clulas gliales que han muerto tras el proceso de lesin. En las ltimas dos dcadas se han efectuado numerosos estudios experimentales trasplantando una gran variedad de clulas con el fin de reparar las lesiones medulares. Entre ellas, inicialmente

Trasplantes de clulas de gla envolvente

En el sistema olfatorio hay una renovacin constante de las neuronas sensoriales olfativas. Los axones de las neuronas generadas son capaces de crecer y cruzar la frontera SNP-SNC

18 / Institut Guttmann

Investigacin / Innovacin

Clulas de gla envolvente marcadas para p75.

para reconectar con neuronas del bulbo olfatorio. Esta inusual capacidad regenerativa parece deberse a un tipo de clula glial, denominada gla envolvente, que rodea los axones olfatorios, aislndolos del entorno inhibidor del SNC. Se ha demostrado que los trasplantes de gla envolvente pueden promover la neuroproteccin, remielinizacin y regeneracin axnica en la mdula espinal lesionada con mayor eficacia que los de clulas de Schwann. A diferencia de stas, la gla envolvente interacciona positivamente con los astrocitos, reduciendo su reactividad y expresin de proteoglucanos y favoreciendo que los axones puedan regenerarse ms all de la regin de trasplante. Tras una lesin medular moderada, se ha demostrado que el trasplante agudo de gla envolvente aumenta la preservacin de la mdula espinal lesionada y promueve la recuperacin funcional parcial, ejerciendo una accin inmunomoduladora. Tras la seccin completa de la mdula espinal en ratas, el trasplante favorece la recuperacin funcional y electrofisiolgica, lo que indica que se ha producido una reconexin entre las vas supraespinales y las motoneuronas lumbares. A pesar de la reconexin funcional de las vas descendentes, la recuperacin funcional an es escasa.

Clulas madre embrionarias, las cuales pueden generar la gran mayora de estirpes celulares del organismo. Su uso es controvertido por razones ticas derivadas de su obtencin. Clulas madre adultas, presentes en muchos tejidos del organismo como clulas no diferenciadas que pueden dividirse para restituir clulas daadas. Su uso no contempla problemas ticos. Pueden aislarse a partir de muestras de tejidos adultos y utilizarse tanto en modelos animales experimentales como en aplicaciones clnicas. Centrndonos en las clulas madre adultas, se han investigado diversos tipos como mtodo reparador de la mdula espinal lesionada en modelos experimentales.

Trasplantes de clulas madre

La terapia de restitucin celular pasa por trasplantar elementos con elevada potencialidad para integrarse en el parnquima medular lesionado y diferenciarse adecuadamente en neuronas o gla endgena. Las clulas madre (stem cells) presentan la pluripotencialidad que permite obtener diferentes tipos de neuronas y clulas gliales a partir de ellas. Las clulas madre pueden subdividirse en dos grandes grupos:

- Clulas madre neurales, que se originan en ciertas regiones cerebrales y tienen la capacidad de generar los diferentes linajes neurales del sistema nervioso. A pesar de que su purificacin no resulta fcil, son muy prometedoras para biomedicina. Tambin se han localizado en la mdula espinal y, si bien difieren ligeramente de las clulas madre neurales del cerebro, se han podido estudiar experimentalmente en mdulas lesionadas. Representan una fuente celular especfica a partir de la cual se estn desarrollando diferentes aplicaciones teraputicas. - Clulas mesenquimales, que se obtienen de diferentes tejidos, principalmente de mdula sea, y estn constituidas por clulas de estroma y hematopoyticas capaces de diferenciarse en diferentes estirpes celulares, incluyendo neuronas. Las clulas mesenquimales tienen una serie de ventajas, como la facilidad de obtencin y el potencial para trasplantes autlogos (de un

20 / Institut Guttmann

Investigacin / Innovacin | Terapia celular para la reparacin de las lesiones de la mdula espinal
individuo a s mismo), evitando as problemas de rechazo y, de hecho, son muy utilizadas en la clnica para tratar enfermedades hematopoyticas. Numerosos estudios experimentales relacionados con lesiones medulares se han realizado con clulas mesenquimatosas, con resultados positivos, incluyendo la reduccin de la cavidad lesional y la mejora de la recuperacin funcional de los animales. Sin embargo, la variedad de mtodos de trasplante, condiciones de cultivo y metodologa de evaluacin hacen que todava sea necesario establecer unos criterios comunes de anlisis. ya se han logrado varias generaciones de clulas pluripotentes inducidas con nuevos mtodos, el riesgo latente de una reprogramacin incompleta, o de la posible formacin de tumores, hace que an est limitada su aplicacin teraputica. En general, todos los tipos de clulas madre, al ser trasplantadas en la mdula espinal lesionada, han demostrado capacidad de integrarse en el tejido del husped y de diferenciarse en distintos tipos celulares: oligodendrocitos, astrocitos y neuronas. Sin embargo, la supervivencia de las clulas trasplantadas suele ser corta (semanas) y mayoritariamente se diferencian en astrocitos y slo un porcentaje muy bajo en neuronas. En algunos estudios se ha descrito que el trasplante de clulas madre favorece la recuperacin funcional motora y la remielinizacin de los axones desmielinizados. A pesar de ello, an es una incgnita si la reorganizacin tisular que se produce en la zona de la lesin se debe a la integracin de las clulas trasplantadas en el tejido husped, a factores trficos liberados por ellas o a su influencia en el tejido remanente.

- Clulas madre de cordn umbilical. La sangre de cordn umbilical se ha convertido en una fuente importante de clulas madre y constituye una alternativa a las clulas mesenquimatosas de mdula sea con una serie de ventajas inmunolgicas importantes en los trasplantes. El cordn umbilical contiene clulas madre progenitoras, hematopoyticas y endoteliales, entre otras. En modelos animales se han realizado pocos estudios con el fin de esclarecer el potencial de las clulas madre de cordn en lesiones medulares, con resultados prometedores, aunque quedan an por definir los mecanismos implicados. - Clulas pluripotentes inducidas. Descubiertas muy recientemente, las clulas pluripotenciales inducidas han despertado una gran expectacin en el campo de la terapia celular. Se trata de clulas somticas que, con la introduccin de varios factores de transcripcin, se reprograman a estadios prcticamente idnticos a los de las clulas madre embrionarias. A pesar de que

Terapia celular combinada

Dados los todava limitados efectos de los tratamientos con trasplantes celulares, que, como mucho, han demostrado una parcial aunque significativa mejora de la locomocin y de las pruebas electrofisiolgicas tras lesiones medulares en animales de laboratorio, algunos estudios experimentales recientes han empleado terapia celular, con clulas gliales

Sobre Ruedas / 21

Investigacin / Innovacin
o clulas madre neurales, al mismo tiempo que la administracin de molculas como la condroitinasa o factores de crecimiento, que promueven la plasticidad y la regeneracin axnica y han demostrado efectos sinrgicos. Una mejora que podra potenciar los efectos del trasplante celular viene dada por la manipulacin gnica de las clulas trasplantadas, consistente en el trasplante de clulas modificadas genticamente para la produccin controlada de determinados factores neurotrficos o de productos bloqueantes de los inhibidores que se reexpresan tras la lesin. En este sentido, se ha observado que el trasplante de gla que sobreexpresa GDNF, BDNF o NT-3 favorece la regeneracin axnica y, parcialmente, la recuperacin funcional. Por otra parte, el trasplante celular suele realizarse mediante microinyeccin en la zona de la lesin y el tejido medular adyacente. En el caso de lesiones crnicas en que se han desarrollado cavidades csticas tabicadas por la cicatriz glial, se ha planteado la conveniencia de emplear biomateriales, en forma de geles o microestructuras, que acten rellenando dichas cavidades, adems de ofrecer un soporte a las clulas trasplantadas. Estas estrategias de ingeniera tisular revisten una mayor complejidad, pero pueden suponer un avance si se consigue remedar la compleja microestructura de la mdula espinal. Otros estudios proponen una combinacin de terapia celular y programas intensivos de rehabilitacin, particularmente de la funcin locomotora, lo que sera siempre necesario desde un punto de vista clnico. H Replicar los resultados positivos de otros laboratorios independientes del primero; H Utilizar modelos de lesin clnicamente relevantes, especialmente modelos crnicos; H Desarrollar, de forma especfica, terapias combinadas con otros tratamientos, como terapias farmacolgicas o de rehabilitacin. En los ltimos aos la comunidad cientfica ha enunciado unas lneas generales de recomendacin de la metodologa idnea que debe seguirse en los ensayos clnicos futuros, ya que se ha planteado el paso a la fase de ensayo clnico de algunas de las terapias celulares ms prometedoras. Las dificultades de la traslacin clnica en las lesiones medulares son importantes. A ttulo de ejemplo, cabe destacar que, durante el 2009, en Estados Unidos, uno de los primeros ensayos clnicos con trasplante de clulas en lesionados medulares (de progenitores de oligodendrocitos derivados de clulas madre embrionarias, promovido por la empresa Geron), que haba sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration), tras analizar un extenso informe de datos experimentales fue pospuesto por razones de seguridad. Tampoco pudo finalizarse el ensayo clnico de trasplante de macrfagos activados que, tras superar la fase I de seguridad, se inici en fase II en centros de Israel y Norteamrica (Procord Clinical Trial) y fue suspendido por problemas econmicos. A pesar de tales dificultades, son necesarios ms estudios clnicos controlados y monitorizados para avanzar hacia la aplicacin de las terapias experimentales en la clnica. As, diferentes estudios se han encaminado a demostrar la seguridad de los trasplantes en pacientes, con resultados esperanzadores que han de servir para disear ensayos clnicos eficaces. SR

Perspectivas
Las lesiones medulares siguen un proceso fisiopatolgico multifactorial para el cual no hay un tratamiento nico que permita la restauracin total de la lesin. Muchos de los estudios experimentales en modelos animales estn revelando resultados prometedores, lo que ha generado grandes expectativas entre los cientficos y tambin entre los pacientes afectos sobre el potencial de las terapias celulares en las lesiones de la mdula espinal. Sin embargo, para llegar a aplicar clnicamente alguna de las terapias celulares ensayadas en el laboratorio, es necesario resolver una serie de aspectos tcnicos antes de promover su traslacin clnica. Algunos de estos aspectos hacen referencia al riesgo de formacin de tumores que suponen los trasplantes, al rechazo inmunitario o a inesperados cambios del fenotipo de las clulas injertadas. Otros aspectos que deben considerarse son el estado de las clulas en trminos de estadios de diferenciacin en el momento del trasplante. En definitiva, es esencial definir perfectamente los protocolos de actuacin en cuanto a esterilidad, pureza, potencialidad, identidad, estabilidad, seguridad y eficacia. Otras cuestiones an abiertas se refieren al mtodo de trasplante y a la fase posterior a la lesin en que pueden recomendarse. La opinin mayoritaria entre los investigadores sobre lesiones de mdula espinal es que deben realizarse ms estudios experimentales en modelos animales, fundamentalmente para: H Aclarar las diferencias de los resultados experimentales entre laboratorios independientes, atribuidas a orgenes celulares distintos, as como a metodologas desiguales;

BIBLIOGRAFIA Bunge MB, Pearse DD. Transplantation strategies to promote repair of the injured spinal cord. J Rehabil Res Dev 2003; 40: 55-62. Bunge MB. Novel combination strategies to repair the injured mammalian spinal cord. J Spinal Cord Med 2008; 31: 262-9. Coutts M, Keirstead HS. Stem cells for the treatment of spinal cord injury. Exp Neurol 2008; 209: 368-77. David S, Lacroix S. Molecular approaches to spinal cord repair. Annu Rev Neurosci 2003; 26: 411-40. Ronaghi M, Erceg S, Moreno-Manzano V, Stojkovic M. Challenges of stem cell therapy for spinal cord injury: human embryonic stem cells, endogenous neural stem cells, or induced pluripotent stem cells? Stem Cells 2010; 28: 93-9. Schwab JM, Brechtel K, Mueller CA, et al. Experimental strategies to promote spinal cord regeneration an integrative perspective. Prog Neurobiol 2006; 78: 91-116. Tator CH. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery 2006; 59: 957-82. Tetzlaff W, Okon EB, Karimi-Abdolrezaee S, et al. A systematic review of cellular transplantation therapies for spinal cord injury. J Neurotrauma 2010; Epub April 20. Thuret S, Moon LD, Gage FH. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci 2006; 7: 628-43.

22 / Institut Guttmann