MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CONTANINACION FECAL (Coliformes) I.

INTRODUCCIN

En el anlisis de alimentos se toman en cuenta algunos microorganismos que son indicadores de unas Buenas Practicas de Elaboracin y de unas buenas practicas de Higiene, considerndole ciertas especies como microorganismos indicadores de contaminacin Fecal. En esta practica se podr determinar mediante la identificacin de ciertos microorganismos si el alimento presenta o no contaminacin fecal, lo que significa que si el alimento a tenido contacto en el trayecto de su elaboracin con material fecal. Muchos microorganismos diferentes causantes de enfermedad, o patgenos, pueden contaminar los alimentos Las ETAs constituyen, segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) uno de los problemas de salud ms extendido en el mundo contemporneo y una causa importante de reduccin de la productividad econmica. Hay muchas infecciones diferentes transmitidas por los alimentos Se han descrito ms de 250 enfermedades diferentes transmitidas por los alimentos. La mayora de estas enfermedades son infecciones, ocasionadas por distintas bacterias, virus y parsitos que pueden ser transmitidos por los alimentos. II. OBJETIVOS a. Identificar los principales microorganismos indicadores de contaminacin fecal en alimentos (Coliformes) b. Determinar los principales alimentos con riesgos de contaminacin fecal.

III.

REVISION BIBLIOGRAFICA

Los microorganismos indicadores de la contaminacin fecal, principalmente son: Coliformes, Colifecales, Escherichia coli, Enterobacteriaceas totales y Streptococcus del Grupo D de Lancefield, por cuanto normalmente se les encuentra en el tracto digestivo del hombre y de animales de sangre caliente. COLIFORMES El trmino Coliformes comprende los gneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter las cuales se caracterizan por utilizar la Lactosa como fuente de Carbono. Los Coliformes distintos a la E. coli persisten en el suelo o sobre las superficies, tales como los granos, frutas y otros productos del campo. IV. MATERIALES Muestra : Alimentos varios 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Bao Maria a 45.5 C Incubador, 35 1.0C Balanza Matraces Pipetas esteriles Utensilios esteriles Tubos de dilucion Campanas de Durhan Caldo Bilis Verde Brillante (BGLB) 2% Caldo Lauryl Sulfato (LST) Caldo Azida de Sodio Glucosado Agar Mac Conkey Caldo Peptona Caldo MR-VP Agar citrate se simons Agar plate count en viales Reactivo de Kovacs Reactivo de Voges-Proskauer (VP) Colorantes para timcion Gram Indicador Rojo de metilo

V. METODO 1. PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y E COLI

NMP a. Realizar las diluciones necesarias segn el alimento como se muestra en el grafico.
1mL

Alimento 10g + 90m mL SSF 9mL SSF

1mL

1mL

1mL

9mL SSF

9mL SSF

b. De cada uno de los tubos de dilucin se inocularan en 3 tubos con caldo lauril sulfato 1mL 1mL 1mL 1mL que contienen campanas de Durhan, se incubaran por 24 horas a 35 C c. Observar la formacin de gas y turbidez, si los tubos no tuvieran formacin de gas pero si hay turbidez, incubar otras 24 horas para su evaluacin. d. Se continua a la prueba confirmativa de Coliformes con los tubos que sean positivos (presencia de gas y turbidez)
10-1 10-2 10-3 10-4

2. NMP Prueba confirmativa para coliformes a. Para cada tubo positivo se transfiere un inoculo usando el asa de cole a un tubo con
caldo bilis verde brillante que contiene campana de Durhan, incubar a 35C por 48 horas. b. Pasado el tiempo confirmar la presencia de gas y turbidez, posteriormente calcular el NMP a partir de la prueba confirmativa.

3. NMP Test de confirmacin para Coliformes fecales y E coli a. De cada tubo positivo de la prueba presuntiva colocar un inoculo con el asa de cole a
un tubo con caldo lauryl, incubar a 45.5C y examinar la formacin de gas, en caso de ser negativo incubar unas 48 horas extras. b. Calcular el NMP usando los resultados positivos de este test. Ejemplo: Prueba de coliformes fecales dieron positivos: -1= 3 -2=1 -3=0 Se inoculan en total 4 tubos con caldo peptona, los resultados positivos -1= 1 -2= 1 Se van a la tabla de coliformes fecales con este cdigo: 1, 1 , 0

4. NMP Test completo para E. coli a. Para confirmar E. coli, se agita el tubo con caldo peptona y se toma un inoculo al
agar Mac conkey y sembrar por estria. Incubar a 35C por 24 h. b. Examinar las placas sospechosas E. coli. c. Transferir 5 colonias sospechosas a viales con agar plate count, incubar a35C/24 h, realizar las pruebas bioqumicas para confirmar e coli. La identificacin de una sola colonia es suficiente para confirmar la presencia de E. coli. d. Realizar una tincion Gram (gram negativo) 5. PRUEBAS BIOQUMICAS De las cepas aisladas sembrar segn: Produccion de Indol Inocular en un tubo con caldo peptona e incubar por 24 h a 35C. realizar la prueba de indol aadiendo reactivo de Kovacs y observando la formacin de un anillo grosella para una prueba positiva. Reaccin de Voges-Proskauer (VP) Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar por 48 h a 35C. separar en dos tubos Aadir 0.6 mL de solucin -naphthol y 0.2 mL 40% KOH, agitar. Aadir cristales de creatina. Agitar y observar la formacin de un anillo rojo. Reaction de Rojo de Metilo

Incubar el tubo con el sobrante de caldo MR-VP 48 2 h a 35C. Aadir 5 gotas de rojo de metilo al tubo. Si el color rojo permanece es positivo, si cambia a amarillo es negativo Reaccin de Citrato Inocular con asa de cole a un tubo con agar citrato de Simmons, incubar por 48 horas. Detectar el cambio de color a azul para que sea positivo Formacin de gas a partir de lactosa. Inocular a un tubo con caldo lactosa y campaa de Durhan, incubar 48 2 h at 35C. Observar la produccin de Gas Prueba de Kliger Se utilizara en agar Kligler para la prueba de descarte de E. coli. El cual se lleva a pH 7,4 y se reparten a razn de 7 ml en tubos de ensayo y esterilizar a 121C x 20 minutos. INTERPRETACION PRUEBAS BIOQUMICAS IMVIC, PARA DETERMINAR E. coli Consiste en las siguientes pruebas: I M Vi C : Produccin de Indol : Prueba del Rojo de metilo : Produccin de Acetil Metil Carbinol o Prueba de Voges Proskauer : Asimilacin de Citrato

(I): CALDO PEPTONADO Se investiga el indol formado despus de la incubacin, agregando gotitas del reactivo de Kovacs, formado por la mezcla de alcohol isoamlico y de cido ntriconitroso (10 ml y 5 ml respectivamente), y agitarlo. La reaccin es positiva si la fase alcohlica est coloreada de rojo claro y oscuro y constante. (M): CALDO ROJO DE METILO Despus de haber incubado la siembra a 37C por 24 horas, agregar 5 gotitas de una solucin al 0.04% de rojo de metilo. La reaccin se considera positiva si la coloracin es roja y negativa si es amarilla. (Vi): CALDO VOGES PROSKAUER Caracteriza a grmenes que producen acetil metil carbinol a partir dc la glucosa que lleva el medio de cultivo. El acetil metil carbinol AMC se reconoce oxidandolo a diacetil (color rosado) Al tubo con el medio respectivo inoculado e incubado a 37 C por 24 horas, se le agrega unos mg de creatina p.a y 0.5 ml de una solucin de soda al 40% y agitar fuertemente por 3 minutos. La reaccin es positiva, si una coloracin rojo carmn aparece al cabo de 10 minutos. (C): AGAR CITRATO DE SIMMONS Una vez sembrado el inculo por estra superficial en el agar Citrato de Simmons inclinado, e incubado a 37C x 24 hr, la reaccin es positiva si el medio presenta una coloracin azul.Luego de obtener nmero de tres cifras (confirmados segn resultados del IMViC, Tabla N 1) , se logra el valor de la tabla del NMP, para despus calcular la

poblacin de Escherichia coli en la muestra problema de manera similar que los anteriores.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL DEL NMP PARA COLIFORMES

Prueba Presuntiva 1mL

Alimento 10g + 90m mL SSF 10-1 9mL SSF 10-2

1mL

1mL

9mL SSF 10-3

9mL SSF 10-4

Prueba Confirmativa Test de Eijkman

1mL c/u

de las pruebas positivas del CLVBB 2 cc

+
+ +

+
+

+
+

+
+

+
+

+
+

+
-

+ -

CLVBB y CLVBB 2cc

Incubar a 37C / 24

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL PARA E. COLI

+ + + + +
CLVB CP

Incubar a 44 C/24 h Prueba de Kligler para E. coli

+ Incubar a 37C/24 h Galeria IMVIC

CP

CRM CVO ACS

REPORTE DE DATOS Para reportar la cantidad de coliformes totales del recuento estndar en placa, emplear las reglas correspondientes. Para reportar los resultados con respecto a la determinacin del Nmero Ms Probable de coliformes totales, colifecales y E. coli se debe de seguir los pasos correspondientes a la regla del NMP Elegir la dilucin ms alta (la ms diluida), en la que sean positivos de formacin de gas los tres tubos, y las dos diluciones superiores (ms diluidas) ms prximas. S

esto no es posible, ya que ninguna de las diluciones trabajadas presentan tres tubos positivos, o porque no se hicieron diluciones ms altas de aquella que presenta tres tubos positivos, seleccionar las tres ltimas diluciones y anotar el nmero de tubos positivos en cada una. Por ejemplo: a. Si las tres ltimas diluciones positivas fueron: 1:100, 1:1000 Y 1:10000 y el nmero de tubos positivos en cada dilucin fuera 3, 1, 0, el resultado se anotara del siguiente modo: Diluciones: 1:100 = 1:1000 1:10000= = 0 3 1

Este valor 3, 1, 0, se busca en la tabla del N M P, de tres alcuotas, y nos dar de la poblacin de Coliformes totales. Ejemplo: CLAVE 3-0-2 3-1-0 3-1-1 NMP 6,5 4,5 7,5

FILA ESCOGIDA

A este nmero obtenido de la tabla debe multiplicrselo por la inversa de la menor dilucin en la que se han hallado 3 (+), es decir que corresponde a la dilucin de la primer cifra de la CLAVE caracterstica. La poblacin se calcula de la siguiente manera: Lectura: 3, 1, 0 (1:100, 1:1000, 1:10000) Valor Tabla N M P: 4,5 La dilucin escogida es 1:100 Por lo tanto seria: 4.5 x 102 UFC/ g de muestra Nota: Estos clculos han sido realizados considerando que se analizaron 10 g de muestra problema. VI. RESULTADOS VII.DISCUSIONES VIII. CONCLUSIONES IX. CUESTIONARIO 1. Indique cules son los microorganismos indicadores de la contaminacin fecal, y cul es su importancia en los alimentos. 2. Describa la funcin que desempean cada uno de los componentes de los medios de cultivo descritos en la presente prctica. 3. Qu finalidad tienen las diluciones? Dnde se requieren ms diluciones en una muestra fresca o en una muestra procesada, y por qu? 4. Exponga todo acerca de la influencia de los Coliformes, Colifecales y la E. coli en la salud del hombre.

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS FRAZIER. W. 1992. Microbiologa de los Alimentos. 4ta edicin. Editorial Acribia. Zaragoza HARRIGAN, W. 1992. Mtodos de Laboratorio en Microbiologa de los alimentos y productos. Lcteos. 3ra Edicin. Editorial Acribia. Zaragoza. JAY. J.1994. Microbiologa Moderna de los Alimentos. 2da Edicin. Editorial Acribia. Zaragoza. TABLA N 1 I Escherichia coli Enterobacter aerogena (o Aerobacter aerogenes Positivo Negativo M Positivo Negativo Vi Negativo Positivo C Negativo Positivo