PRACTICA N2 NUMERACIN DE COLIFORMES TOTALES EN PRODUCTOS LCTEOS 1.-OBJETIVO 1.

1 Establecer y conocer el mtodo de ensayo para la determinacin de conformes totales. 2.FUNDAMENTO 2.1 La contaminacin con coliformes y E Coli, se produce por deficiencias en la limpieza y desinfeccin en la industrias, y por falta de higiene en los manipuladores, la contaminacin de un alimento con E coli lleva implcito el riesgo de que tambin hayan podido llegar a! alimento microorganismos entricos patgenos haciendo peligroso su consumo. 2.2 La determinacin se efecta en placas de vidrio con agar VRB o en placas Petrifm de E. Coli. Las placas de Petrifm se presentan en forma de dos laminas plsticas que contienen todos los elementos deshidratados necesarios para la bsqueda de y numeracin de coliformes y E. Coli. El film interior est cubirto por un medio de cultivo, VRBL(cristal violeta rojo neutro lactosa). Este film es impermeable. El agar VRB contiene cristal violeta y sales biliares que inhiben el crecimiento de la flora acompaante gran positiva, La degradacin de lactosa a acido esta indicada por el indicador de pH rojo neutro, que cambia su color a rojo y por la precipitacin de cidos biliares. 3.-DEFINICIONES Coliformes: son bacilos cortos, gran negativos aerobios y anaerobios. Facultativos que fermentan la lactosa, con produccin de gas: dentro de los que se incluye E Coli y Enterobacter Aerogenes. Estos organismos crecen entre -2 Cy 502C y a ph comprendido entre 4.4 y 9.0. Microorganismos gran Positivos: En la coloracin de Gram no decoloran el alcohol acetona manteniendo el color del crista! violeta. Poseen paredes celulares que contienen muy pocos lpidos y se puede considerar como una caja rgida que retiene el colorante cristal violeta. Microorganismo gran Negativo: en la coloracin d G'ri decoloran con i alcohol acetona y toman el color de la safranina que es un colorante de contraste. Sus paredes son ms complejas que las de la clula gran positiva, posee una cutcula exterior rica en lpidos. 4.- EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS 4.1 Equipos Estufa de incubacin. Autoclave. Balanza de platillo con precisin 0.01 g. Cocinilla elctrica Contador de colonias. Mechero.
9

Horno de aire caliente para esterilizacin de material.

4.2 Materiales

 Frasco de vidrio con tapa rosca de plstico de 250 mi. > Matraz de 500 mi. > Placas Petri ds vidrio. Pipetas (con algodn en extremo) de 1 y 10 mi. .

Probeta de vidrio de 200 mi. Tapones para tubos de ensayo. Gradillas de tubos de ensaco. Canastillas metlicas. Esptula

Tubos de ensayo aproximadamente de 2 cm de dimetro x 15 cm de longitud.

4.3 Reactivos AgarVRB. Peptona para uso microbiolgico. Alcohol al 70% v/v

5.- PROCEDIMIENTO 5.1 Preparacin de la sala, en la ejecucin del anlisis microbiolgico, se debe trabajar en condiciones aspticas, para ello preparar el ambiente de trabajo adecuadamente, limpiando las su erficies con alcohol a! 70?^ 'vA.'^ !ueo con otra solucin desinfectante. Finalmente dejar el ambiente cerrado y sometido a una radiacin ultravioleta por lo menos 30 rnin. 5.2 Preparacin del agua peptonada al 0.1%, se prepara con agua desionizada, llevada a pH 7 de acuerdo a as indicaciones tiei proveedor del medio de cultivo. Dispensar en un frasco con tapa o en un matraz 90 mi del agua peptonada y en tubos de ensayo, 9 mi en cada uno, colocar los respectivos tapones, ubicar los tubos en la canastilla, y junto con el frasco de 90 mi esterilizar en autoclave a 121c por 15 min. 5.3 Preparacin del agar VRB, preparar de acuerdo a las indicaciones del proveedor utilizando agua destilada, llevar a ebullicin para disolver completamente el agar. Dispensar entre 15 y 18 mi del medio en tubos de ensayo, esterilizar en autoclave a 100C por 30 min. mantener el medio licuado y temperado a 45 C hasta el momento de la siembra.
C A Dranoro/'n Aa I-a wnorfi-o Dfan-af-ai- lo A 11 t *-'\ A r* 1^.1 Aa lo rifriiianfa T3* 2T2 *

Limpiar el exterior del envase con algodones de alcohol, y desinfectante. Bajo la llama del mechero, extraer la muestra con material estril humedecido con alcohol o flameado.

Extraer 10 mi de la muestra, y agregar directamente en el frasco con 90 mi de agua peptonada 0.1%.

Agitar el irasco mediante inversiones sucesivas para homogenizar convenientemente el contenido.

i ornar i mi ae esta muestra con una pipeta estril y transTenno a un tuDO con y mi ae agua peptonada estril. As se obtendr la dilucin 10-1

Agitar la dilucin 10-1, medir lml y transvasar a un tobo con 9 mi de agua peptonada obtenindose as la dilucin 10-2.

Repetir el paso anterior para la solucin deseada.

5.5 Ejecucin del anlisis Agregar 1 mi de la solucin correspondiente aadir el agar licuado, mezclar con movimientos de rotacin y dejar solidificar. Sobre la superficie, verter aproximadamente 2 mi del mismo medio, para evitar el desarrollo en la superficie Incubar en placas en posicin invertida a 32C +/-TC durante 24 hr +/-3 horas 5.6 Expresin de resultados. En el agar VRB tanto coliformes como E Coli, aparecen de color rojo (elegir colonias tpicas y someterlas a pruebas bioqumicas para confirmar la presencia o ausencia de Ecoii. El recuento se hace en un contador estndar de colonias, no se debe de contar las colonias desarrolladas sobre la zona blanca ya que no estn bajo la influencia selectiva del medio. Para efectuar el recuento se debe de elegir las placas que contengan entre 30 y 300 colonias Multiplicar el nmero de colonias por el inverso de la dilucin utilizada. Expresar los resultados en ufc/g. 6,- Cuestionario 6.1 Comparar los resultados obtenidos con lo establecido con la norma tcnica peruana para leche fresca. 6.2 Por que es importante la determinacin de coliformes en alimentos? 6.3 Qu condiciones promueven el desarrollo de las enterobacterias? 6.4 Indique que especies pertenecen al genero enterobacteriae. 6.5 Mencione que enfermedades produce la ingesta de alimentos contaminados con entero bacterias en alimentos.