Manual de Prcticas

Mdulo profesional II Tcnico en Biotecnologa

Realizar el anlisis fsico-qumico y microbiolgico en muestras de alimentos bajo normas de seguridad e higiene.

Sub mdulo II
Realizar el anlisis microbiolgico en muestras de alimentos

Versin 1.0
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Enero de 2010 Profesores que elaboraron el manual de estudio de la carrera de Tcnico en Biotecnologa Nombre del Maestro Aguilar Rocha Ma. Catalina Jimnez Magdaleno Luis Antonio Ricaud Ortiz Sandra Vzquez Martnez Rosalba Plantel Irapuato I Irapuato I Villagrn Villagrn

REALIZAR ANALISIS MICROBIOLOGICOS EN MUESTRAS DE ALIMENTOS BAJO NORMAS DE SEGURIDAD E HIGIENE

Habilidades y destrezas para

1. Preparar material para esterilizar y Aplicar mtodos de esterilizacin: Calor seco. Calor hmedo. Filtracin. Radiacin UV.

2. Preparar medios de cultivo: Medios lquidos. Medios slidos. Medios semislidos.

3. Realizar tcnicas de inoculacin: Estra simple. Estra cruzada. Puncin.

4. Toma de muestras para el posterior anlisis microbiolgico.

5. Aplicar las tcnicas de anlisis microbiolgicos a efectuar en una muestra de alimentos, bajo la NOM. a) Recuento de mesfilos aerobios totales. b) Recuento de hongos y levaduras. c) Recuento de coliformes totales y fecales. d) Recuento de staphylococcus aureus. e) Recuento de Salmonella y Shigella

Actitudes Orden. Limpieza responsabilidad

Conocimiento sobre: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994,Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta aerobias en placa. 08-25-95 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM -113-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. 10-19-95 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. 09-13-95 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-111-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. 09-25-95NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de estaphylococcus aureus en alimentos. 09-22-95 NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Samonella en alimentos.

Justificacin de la Carrera
En los albores del siglo XXI nuestro pas esta experimentando grandes retos cientficos, tecnolgicos, sociales, y polticos, generando grandes cambios para los cuales debemos estar preparados. El proceso de globalizacin esta colocando a la biotecnologa en un primer plano, al hacer uso de microorganismos, clulas vegetales, animales, sus partes o fracciones se pueden generar bienes o servicios con el fin de contribuir a una mejor calidad de vida participando activamente en el desarrollo sustentable, generando beneficios ambientales, alimenticios farmacuticos e industriales. En los CECYTEs nos preocupamos por formar tcnicos en el rea de biotecnologa que puedan insertarse en los sitios laborales, donde ofrezcan servicios de anlisis fsico qumico, identificacin de microorganismos, procesamiento de alimentos de origen vegetal y animal, elaboracin de productos fermentados, reas donde se lleven a cabo procesos biotecnolgicos, propagacin de plantas en agricultura protegida, as como almacenamiento de granos y semillas. Con la adquisicin de estas capacidades, los alumnos egresados de los colegios aportarn sus conocimientos, habilidades, destrezas, en el desarrollo sustentable del pas, comprometido con la sociedad y el medio ambiente.

Estructura de la Carrera de Tcnico en Biotecnologa

Propsito de la Carrera: Al trmino de la carrera el egresado ser capaz de realizar anlisis fsico qumico y microbiolgico, procesos fermentativos y aplicar procesos biotecnolgicos en las reas alimentaras, agropecuarias, ambientales, optimizando los recursos naturales bajo el esquema del desarrollo sustentable.

Perfil Profesional: Al trmino de la carrera el egresado ser capaz de laborar en reas alimentaras, agropecuarias y ambientales, donde se utilicen procesos biotecnolgicos. As mismo contar con los principios para auto emplearse mediante el desarrollo de proyectos de tipo empresarial.

PRESENTACION: El laboratorio de microbiologa tiene como principal objetivo desarrollar habilidades y destrezas en el estudiante (competencias), las cuales le permitirn en su momento, desenvolverse en un laboratorio de control de calidad, el presente manual se divide en dos secciones, la primera da a conocer las tcnicas bsicas de esterilizacin de material, preparacin de medios de cultivo y tcnicas de inoculacin. En la segunda seccin se pretende ensear las aplicaciones en la realizacin del anlisis microbiolgico basndose en las normas oficiales para la cuantificacin de microorganismos indicadores (cuenta total, coliformes en placa y por la tcnica del NMP, hongos y levaduras, y estafilococos ureos). METODOLOGA: Las practicas se desarrollaran cada semana (pueden ser hasta 2 sesiones por practica), para ingresar al laboratorio el alumno deber revisar anticipadamente la prctica del da, debiendo realizar un diagrama de flujo, este se revisara al ingresar al laboratorio. Durante la realizacin el alumno deber documentar todas las actividades realizadas en su manual o cuadernillo de laboratorio (bitcora), para lo anterior el manual cuanta con dos hojas interpuestas entre cada una de los temas NO SE ACEPTAN HOJAS SUELTAS. Las practicas requieren en la mayora de los casos un seguimiento, pues los microorganismos una vez inoculados sobre los medios y despus del periodo de incubacin (24 a 48 hrs.) crecern y se harn evidentes, es entonces cuando se describen o contabilizan, por lo que el alumno deber asistir FUERA DE HORARIO DE CLASE a revisar el material y hacer las observaciones pertinentes.

OBJETIVO: El alumno ser capaz de realizar anlisis microbiolgicos en muestras de alimentos, aplicando Normas Oficiales vigentes y siguiendo las reglas de seguridad e higiene estipuladas en las mismas.

REGLAMENTO:
1. Esta estrictamente prohibido comer. 2. Es obligatorio guardar disciplina en el interior del laboratorio. 3. Utilizar bata de laboratorio, preferentemente de manga larga y debidamente abotonada. El alumno ingresara con la bata puesta y saldr con ella del laboratorio. 4. nicamente se permite tener sobre la mesa de trabajo el cuadernillo de notas, los dems tiles escolares se colocaran en la parte inferior de las mesas, en el rea destinada para este fin.
5.

es necesario solicitar el material llenando previamente el vale, este ampara el material indicado y es responsabilidad de todo el equipo, no nicamente de quien firma. Se deber entregar junto con el vale la credencial escolar de quien firma, la credencial es intransferible y nicamente el titular podr solicitar el material.

6. la solicitud y entrega del material se deber hacer en orden y de forma progresiva por equipo. 7. Al inicio y al final de la prctica deber de limpiar el rea de trabajo y las tarjas empleadas. 8. el material que adeude el alumno deber de ser restituido al almacn en un periodo mximo de una semana. 9. el material es responsabilidad de los alumnos que lo solicitan y deber de tratarse con cuidado, en el caso in fortuito de que algn alumno quebrara por accidente un material de un precio considerable este ser pagado por todo el grupo, solidarizndose sus compaeros. Este punto deber tratarse en plenaria de acuerdos y deber hacerse del conocimiento de todos.

INDICE. Mapa curricular Justificacin de la carrera Estructura de la carrera Presentacin Objetivo general Reglamento Preparacin y esterilizacin de material Preparacin de medios de cultivo Tcnicas de inoculacin Morfologa colonial y crecimiento en medio lquido y slido. Identificacin de bacterias Manejo y uso de microscopio Aislamiento e identificacin de hongos Muestreo Aplicar tcnicas de anlisis microbiolgico a efectuar en una muestra de alimentos.

Prctica 1 Prctica 2 Prctica 3 Prctica 4 Prctica 5 Prctica 6 Prctica 7 Prctica 8

3 4 5 6 6 7 10 16 20 26 31 36 41 48 54

Recuentos de mesfilos areos totales.

Recuento de hongos y levaduras.

Recuento de estaphylococcus aureus. Recuento de Salmonella y Shigella.

APLICACIONES: Anexos
Anexo 1 NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en
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Anexo 2

placa. Anexo 3 08-25-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-113-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. 10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. 09-13-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. 09-25-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. 09-22-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de salmonella en alimentos. Lista de cotejo y gua de observacin.

Anexo 4

Anexo 5

Anexo 6

Anexo 7 Anexo 8

PRACTICA 1 PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIAL

I. COMPETENCIA

Conocer las tcnicas de esterilizacin y la preparacin del material previo al proceso, seleccionara la tcnica ms adecuada dependiendo de la naturaleza del material a esterilizar.
II.

OBJETIVO Preparar para esterilizar el material de vidrio ms usado en el laboratorio de

Microbiologa. Conocer el material y equipo ms comn para la esterilizacin y trabajo en condiciones de esterilidad. III. INTRODUCCIN La esterilizacin es un proceso mediante el cual se eliminan por remocin o muerte todos los microorganismos viables de un objeto, superficie o medio. Un objeto libre de cualquier forma de vida se dice que esta estril. El concepto de esterilidad es absoluto, es decir, no existe un material casi, ms o menos, o 99% estril. En el trabajo cotidiano de un laboratorio de Microbiologa es necesario que todo el material como pipetas, tubos de ensaye, cajas de Petri de vidrio o de plstico, medios de cultivo y soluciones estn estriles. Debe prevenirse que el material esterilizado se conserve estril. As, antes de esterilizarse, a los matraces con medio de cultivo se les pone un tapn de algodn que evitara el acceso de microorganismos del ambiente al medio de cultivo. Tambin es necesario proteger este tapn con papel para evitar que se humedezca durante la esterilizacin con calor hmedo, algunos laboratorios utilizan tapones de plstico o metlicos con la misma finalidad. Existen varios mtodos fsicos y qumicos de esterilizacin, la seleccin de uno o de otro depende de la naturaleza del material que se piensa esterilizar. Por ejemplo, la esterilizacin con calos hmedo, generalmente se realiza en un autoclave a 1210 C durante 15 minutos, la temperatura se alcanza utilizando vapor de agua a una presin de 15 lb/pulg2 (2 atm/cm2). Estas condiciones de esterilizacin con calor hmedo pueden variar de acuerdo al volumen y tipo de la autoclave que se usa y del material a

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esterilizar. El material que se esteriliza en la autoclave no debe estar hermticamente cerrado. La muerte de los organismos contaminantes ocurre principalmente por desnaturalizacin de las macromolculas (protenas, ARN y ADN) y coagulacin de protenas. La esterilizacin con calor seco se usa principalmente para material de vidrio y materiales slidos estables al calor, requiere mayor duracin e intensidad porque la conduccin del calor es menos rpida que en un ambiente hmedo. La temperatura que se utiliza es generalmente entre 160 y 1800C durante 1.5 horas. Las cajas de Petri de vidrio y las pipetas se colocan en cilindros de metal con aberturas que permitan el paso del aire caliente. La inactivacin de los contaminantes ocurre por perdida de agua y oxidacin de todos sus componentes esenciales. La filtracin a travs de membranas es usada para esterilizar soluciones de sustancias termolbiles en donde los microorganismos son retenidos en el filtro, el filtrado estril debe recibirse en un recipiente tambin estril. Los virus y algunos tipos de bacterias muy pequeas como - dellovibrio y algunas espiroquetas atraviesan estos filtros de membrana. En las campanas de flujo laminar que se usan como reas estriles en el trabajo en microbiologa, el aire se esteriliza por filtracin a travs de mallas de fibras de diversos materiales (filtros absolutos). El gas oxido de etileno y las radiaciones ionizantes son utilizados para esterilizar material de plstico sensible al calor, porque este gas difunde fcilmente a travs de polietileno, papel y cartn. Estos mtodos no son recomendados para esterilizar soluciones o medios de cultivo. Para determinar la eficiencia del proceso de esterilizacin se emplean los indicadores biolgicos de esterilizacin. Especficamente, cuando se esteriliza con calor hmedo se utilizan, junto al material que es esteriliza, ampolletas que contienen esporas viables de Bacillus stearothermophilus que son inactivadas a 121 0 C durante 12 min. Despus de la esterilizacin, se incuban las esporas y se analiza si estas sobrevivieron o no al proceso de esterilizacin. Tambin existen cintas que con un vire

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de un indicador qumico indican si se alcanzaron las condiciones de la esterilizacin por calor o con oxido de etileno.

MATERIAL y EQUIPO
Matraz Erlenmeyer 250 ml Tubos de ensaye de 16 x 150 Tubos de ensaye de 13 x 100.
Frascos para dilucin

REACTIVOS y MUESTRAS
Agua destilada
Organismos indicadores (estreptococo estearotermophylus)

Pipetas de 1, 5 y 10 ml. Cajas de Petri de vidrio. Algodn, papel de envoltura, gasa de cielo, papel aluminio, cinta testigo y masking tape Autoclave Horno Pasteur Sistema de filtracin millipore Cilindros de acero inoxidable para cajas petri y pipetas. Pinzas de diseccin, mechero bunsen, tijeras,

Para la parte demostrativa: Equipo Millipore de esterilizacin por filtracin, filtros pequeos para esterilizar soluciones. Tapones de plstico o metal para tubos de ensaye, pipeteros y recipientes metlicos para cajas de Petri.

V. PROCEDIMIENTO 1. . Preparacin de tubos de ensayo y matraces para esterilizar en la autoclave: a) Colocar con una pipeta de 10 ml de capacidad 9 ml de agua destilada en cada uno de los tubos de 16 x 150. b) Tanto a estos tubos con agua como a los de 13 x 100 vacos y matraces hacerles a cada uno un tapn de algodn con ayuda de las pinzas como lo indicara el profesor.

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c) Colocar los tubos en una canastilla y protegerlos con papel. d) Anotar en el material preparado nombre, equipo, seccin y grupo. 2. Preparacin de pipetas para esterilizar en la autoclave: a) Colocar en la boca de la pipeta un filtro de algodn con ayuda de un clip desdoblado. El algodn no debe quedar ni muy apretado ni muy flojo, debe permitir el paso del aire pero sin moverse. b) Flamear con el mechero los restos de algodn que salen de la boca de la pipeta. c) Envolver con papel cada pipeta siguiendo las instrucciones del profesor. d) Marcar el volumen de cada pipeta en la envoltura. 3. Preparacin de cajas de Petri para esterilizar en la autoclave: a) Colocar 10 cajas de Petri de cinco en cinco. b) Envolverlas con papel siguiendo las instrucciones del profesor. c) Anotar los datos necesarios para su fcil identificacin. 4. Ensamblaje del sistema Millipore de filtracin (demostrativo): el profesor enseara el equipo Millipore de filtracin explicando la forma como funciona. Asimismo soluciones.
5.

se

mostraran algunos filtros pequeos y membranas para la esterilizacin de Otros aditamentos usados para esterilizar material en microbiologa (demostrativo): el profesor enseara tapones, pipeteros y recipientes metlicos para cajas de Petri usados en la esterilizacin por calor seco. 6. Observacin de las autoclaves del laboratorio: acudir acompaados del profesor a conocer las autoclaves usadas para esterilizar material y se explicara su funcionamiento. VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS.

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VII. CONCLUSIONES.

VIII. CUESTIONARIO. 1.Con que finalidad se les pone a las pipetas un filtro de algodn? 2.Cul es el mtodo ms apropiado para esterilizar el siguiente material? -Solucin de vitaminas. -Cajas de Petri de plstico. -Cajas de Petri de plstico de desecho.

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-Aceite mineral. -Instrumento de ciruga. -Cadveres de animales de experimentacin de laboratorio. -Sangre de desecho. 3.Cmo deben obtenerse los lquidos biolgicos (por ejemplo sangre) para preparar un medio de cultivo?

IX. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA.

PRCTICA 2 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

I.COMPETENCIA

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El alumno preparara y esterilizara

el material y medios de cultivo para el anlisis

microbiolgico de alimentos, conocer la tcnica de trabajo en condiciones aspticas para prevenir contaminaciones de microorganismos no deseados. II. OBJETIVOS: Conocer algunos medios de cultivo de empleo comn en el Laboratorio de Microbiologa. Conocer la composicin y principales aplicaciones de los medios de cultivo. Adquirir habilidad en la correcta preparacin, evaluacin y almacenamiento de los medios de cultivo.

III. INTRODUCCIN
Los medios de cultivo son esenciales para el trabajo en el Laboratorio de Microbiologa, especficamente en bacteriologa cuando se tienen que aislar e identificar bacterias. El uso de los medios de cultivo no slo se reduce al diagnstico clnico, sino que incluye tambin reas tan importantes como es el control de calidad de alimentos y medicamentos, entre muchas aplicaciones. Como se sabe, de forma general los medios de cultivo se definen como mezclas de sustancias que promueven el desarrollo de los microorganismos. Existen diversas clasificaciones segn la composicin u objetivo que se persiga, incluso en base a su consistencia tenemos que se clasifican en: slidos, semislidos y lquidos. La mayor parte de los medios de cultivo comnmente empleados, se encuentran disponibles en el comercio bajo la forma de productos deshidratados, los cuales se reconstituyen con agua destilada y despus son esterilizados en la forma convencional; las instrucciones del fabricante deben seguirse al pie de la letra para obtener resultados satisfactorios.

MATERIAL y EQUIPO
Tubos De ensayo con tapn de rosca

REACTIVOS y MUESTRAS
Caldo nutritivo

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Placas de Petri Botellas de dilucin de leche Agitador magntico Gradillas Probeta graduada Pipetas graduadas Esptula Mechero Fisher Balanza granataria Autoclave Campana de flujo laminar Parrilla elctrica Incubadora bacteriolgica Refrigerador V. PROCEDIMIENTO:

Agar nutritivo Agua destilada Agar bacteriolgico

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS (AGARES) 1. En una balanza granatara, pesar la cantidad de medio requerida, tomando en cuenta la relacin peso-volumen indicada por el fabricante en la etiqueta. 2. Colocar el polvo dentro de un matraz Erlenmeyer con ayuda de una probeta graduada adicionar la cantidad correspondiente de agua destilada, agitar suavemente la mezcla para homogenizarla. 3. Calentar el medio de cultivo ya reconstituido, hasta ebullicin cuidando que no se derrame y con agitacin continua. 4. Tapar el matraz sin apretar el tapn e introducirlo en el autoclave, cerrar ste perfectamente y esterilizar el medio de cultivo a 15 lb de presin por un tiempo de 15 min. 5. Una vez alcanzadas las condiciones de esterilizacin y transcurrido el tiempo, abrir el autoclave (previo descenso de la presin) y sacar el matraz con el medio de cultivo, dejar enfriar hasta una temperatura aproximada de 45 grados centgrados. 6. Dentro de una campana de flujo laminar, empleando cofia y cubre boca, adicionar a cada una de las placas de Petri (ESTRILES) entre 15 y 20 ml. Del medio.

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7.

Dejar solidificar, rotular (indicando contenido, fecha de preparacin, etc.), invertir las placas y en esa posicin incubarlas por un tiempo de 24 horas a 35C.

8. Sacar las placas de la incubadora una vez que ha concluido el tiempo de incubacin; revisar cuidadosamente una por una, desechando aquellas que presenten algn tipo de desarrollo microbiano (contaminacin). 9. Almacenar en el refrigerador (temp. Promedio de 5C) todas aquellas placas con medio de cultivo que satisficieron la prueba de esterilidad, hasta su uso y/o caducidad.

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SEMISLIDOS Y LQUIDOS (CALDOS)

Se siguen exactamente los mismo pasos, con la diferencia de que en estos casos los medios son vaciados (con medida) antes de la esterilizacin. VI. OBSERVACIN Y RESULTADOS

VII. CONCLUSIN

VIII. CUESTIONARIO 1. Que funcin tiene la peptona?

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2. Que es el agar - agar? 3. Cmo define medio selectivo? IX. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

PRACTICA 3

TCNICAS DE INOCULACIN
I. COMPETENCIA El alumno conocer y aplicar las tcnicas de inoculacin del microorganismo dependiendo de la naturaleza fsica del medio a inocular, conocer las tcnicas

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cualitativas (estra simple y cruzada) y cuantitativas (siembra en superficie y vertido en placa) consideradas en las Normas Oficiales Mexicanas.

OBJETIVO El alumno aprender a utilizar las distintas tcnicas de inoculacin para bacterias (las tcnicas de aislamiento de hongos se manejaran en otra practica).
II.

INTRODUCCIN. Se entiende por cultivo un medio en el cual crecen bacterias u otros

microorganismos. Las diferentes especies de hongos y bacterias, cuando crecen en el mismo medio de cultivo lo hacen en forma completamente distinta; por este motivo, conviene conocer la apariencia o caractersticas de la colonia de cada especie en particular, para poder reconocer y as aislar los microorganismos de inters. Por esta razn se han ideado distintos mtodos de inoculacin; para bacterias se tienen el de estra cruzada, siembra en picad, siembra en tubo inclinado, inoculacin en caldo, vertido en placa, entre otros. En hongos se tienen el monocultivo, las diluciones, etc.

MATERIAL y EQUIPO
Matraz con medio de cultivo licuado y estril. Cajas de petri con medio estril. Tubos de ensaye con medio estril inclinado Tubos de ensaye con medio estril vertical. Tubos de ensaye con caldo estril. Mechero de Bunsen

REACTIVOS y MUESTRAS
Cultivos bacterianos en tubo y en placa (E.coli, B.subtilis)
Alcohol

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Asa bacteriolgica con extremo recto y circular Varilla de vidrio en forma de L. Pipetas granuladas de 1ml estriles Algodn Incubadora a 37 C Atomizadores

V. METODOLOGA. 1. Siembra en estra cruzada. Con ayuda del asa bacteriolgica previamente flameada y fra, tomar una muestra del material bacteriano y depositarla sobre la superficie del medio slido, distribuirla sobre la mitad de la placa en forma de zig zag, procurando no romper el medio, flamear y enfriar nuevamente el asa, tocar por una sola ocasin la ltima lnea del rayado anterior y distribuir nuevamente, pero en esta ocasin solamente sobre un cuarto de la placa, volver a flamear el asa, enfriar, tocar con el asa la ltima lnea del segundo rayado y distribuir en el ltimo cuarto de la placa. Observa la siguiente imagen:

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2.

Tcnica de siembra en picada.

Esta tcnica se realiza en un tubo con medio (no inclinado). Se toma la muestra bacteriana con una asa de punta recta y se introduce dentro del tubo, sin tocar sus paredes y al llegar a la altura del medio se clava por el centro hasta el fondo de tal manera que la picadura quede lo ms rectamente posible, observa la siguiente figura.

3.

Tcnica de inoculacin en caldo.

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El asa que contiene la muestra se introduce en un tubo que contiene un medio liquido (caldo) y al llegar a este se agita y posteriormente se retira. Posteriormente se incuba a37o C durante 24 horas, observa la siguiente imagen.

4.

Tcnica de vertido en placa.

a) Medio liquido. Con una pipeta estril se coloca 0.1 ml de la muestra bacteriana sobre la superficie de una placa estril, despus se agrega el medio de cultivo, el cual debe estar a una temperatura aproximada de 450 C, se tapa, se gira la placa sobre su centro, ocho veces a la izquierda y ocho veces a la derecha, se cierra e incuba. b) Medio slido. Con una pipeta estril se coloca 0.1 ml de la muestra bacteriana sobre la superficie de una placa estril conteniendo medio de cultivo ya solidificado, se distribuye esta con la ayuda de una L de vidrio flameada y fra. Posteriormente se deja incubar a 370 C durante 24 horas, observa la siguiente imagen.

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VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS.

VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO. 1.Cmo se realiza la tcnica de cultivo en tubo inclinado? 2.Cundo se emplea cada una de las tcnicas antes descritas? 3.Qu modificacin se realiza al asa bacteriolgica par utilizarse en la tcnica de picadura?

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IX. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

PRACTICA 4 MORFOLOGA COLONIAL Y CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO Y SLIDO

I. COMPETENCIA

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El alumno aprender a describir las UFC en su morfologa colonial macroscpica en medios slidos y el habito de crecimiento en medios lquidos, conocer mediante esto los requerimientos de oxigeno de los microorganismos presentes. II. OBJETIVO El alumno aprender a describir las caractersticas de la morfologa colonial de las bacterias as como su crecimiento en medios lquidos.

III. INTRODUCCIN Los microorganismos que crecen sobre superficies slidas, tienden a formar agrupaciones que se denominan colonias. Las colonias suelen ser de caractersticas constantes para el medio de cultivo usado, la temperatura de incubacin, y el microorganismo del que se trate, por lo que su estudio es de gran utilidad tanto en la clasificacin como en la identificacin. Una colonia microbiana est constituida por individuos de la misma especie provenientes de una clula o de un grupo de ellas, llamados unidad formadora de colonias (UFC). Las caractersticas consideradas para la descripcin de la morfologa colonial de las bacterias son: 1. Tamao. Se da en milmetros, y puede variar desde colonias extremadamente pequeas que miden apenas unos mm de dimetro hasta aquellas que llegan a medir 10 mm o ms. Algunas especies bacterianas pueden extenderse en toda la superficie del Agar. 2. Color. Pueden ser de muy variados colores. 3. Forma. Puntiforme, circular o irregular. 4. Bordes. Pueden ser enteros o mostrar irregularidades como lbulos, filamentos, proyecciones como dientes de sierra o enrollados. 5. Elevacin. Las colonias pueden ser planas, convexas, pulvinadas, umbonadas y umbilicadas. 6. Superficie. Puede ser lisa, rugosa o granulada. 7. Aspecto. Hmedo o seco.

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8. Luz reflejada. Brillante o mate. 9. Luz transmitida. Transparente, Translcida y opaca. 10. Consistencia. Suave (butirosa, mucoide o friable) y dura. Esta caracterstica se determina tocando la colonia con el asa y por lo tanto debe ser la ltima en describirse. 11. Produccin de pigmentos. Algunas bacterias producen pigmento soluble en agua, que puede difundir al medio de cultivo. (Figura 1) Con experiencia en la observacin de cultivos, las caractersticas de morfologa colonial vienen a constituir una gua muy til en el reconocimiento de los principales grupos de microorganismos, por lo que el estudiante de esta disciplina debe prestar atencin a estas caractersticas que son informacin importante en el estudio de los cultivos en el laboratorio. En el laboratorio es frecuente el uso de medios de cultivo lquido y los microorganismos presentan un tipo caracterstico de crecimiento en dichos medios, propiedad que se utiliza para facilitar su estudio. Los diferentes tipos de crecimiento en medio lquido se ilustran en el esquema.

MATERIAL y EQUIPO
Portaobjetos y cubreobjetos Asas bacteriolgicas Microscopio ptico Mecheros bunsen. Lupas Puentes de coloracin

REACTIVOS y MUESTRAS
Cultivos de la prctica anterior. Colorantes de Gram. Aceite de inmersin

V.PROCEDIMIENTO A) Morfologa colonial. Describir tres colonias aisladas ( a partir de muestras de suelo o agua) anotando cada una de las caractersticas de morfologa colonial indicadas en la introduccin. B) Crecimiento en medio liquido.

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1. Marcar correctamente un tubo con caldo nutritivo y sembrar con el asa cada una de las colonias anteriormente descritas. 2. Incubar su material a 37oC durante 24 horas. 3. Identificar el tipo de crecimiento de cada microorganismo con base en el esquema. Fig. 1 MORFOLOGA COLONIAL

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS 1. Incluir en el informe una introduccin acerca de la morfologa colonial y crecimiento en medio lquido y slido. 2. Realizar un diagrama de flujo de los mtodos utilizados en la prctica. 3. Describir la morfologa de las tres colonias seleccionadas en la tabla siguiente:

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Caractersticas Tamao (mm) Color Forma Elevacin Superficie Aspecto Bordes Luz reflejada Luz trasmitida Consistencia Pigmento difusible Medio de cultivo

Colonia 1

Colonia 2

Colonia 3

4. Describir el tipo de crecimiento que presenta en los tubos con caldo nutritivo 5. Indicar cuntas colonias diferentes se observan aproximadamente por placa. Tiene esto algn significado? VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO 1.Qu es una UFC? 2. Existe alguna relacin entre la forma de crecimiento de las bacterias en medio liquido con la tensin superficial del medio y los requerimientos de oxgeno del microorganismo?. 3.Qu es el fenmeno de Swarning?. Diga el nombre de un microorganismo que lo presente.

IX. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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PRACTICA 5 IDENTIFICACIN DE BACTERIAS POR EL MTODO DE TINCIN DE GRAM

I. COMPETENCIA El alumno realizar frotis el cual teir empleando la tincin de GRAM, con la finalidad de describir la morfologa colonial microscpica, clasificara las bacterias en dos grandes grupos Gram positivo y Gram negativo (G + G-) utilizando para ello el microscopio ptico diferenciando cada una de sus partes. II. OBJETIVO

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El alumno aplicara la tincin de Gram para la identificacin de bacterias III. INTRODUCCIN Las coloraciones diferenciales se emplean junto con otras tcnicas en la identificacin y diferenciacin de las bacterias. Uno de los procedimientos ms importantes para identificar las bacterias, es la tincin de Gram que permite separar a las bacterias en dos grandes grupos, las Gram Positivas y las Gram Negativas. En esta tcnica se utiliza el cristal violeta como colorante primario, el lugol como mordente, una mezcla de etanol-acetona o etanol como agente decolorante y safranina como colorante de contraste. Las bacterias que retienen el cristal violeta despus de la decoloracin se observan de color morado y son Gram positivas. Las bacterias Gram Negativas, por el contrario, pierden el colorante primario por el tratamiento diferencial y toman el colorante de contraste, se observa de color rojo. La capa de peptidoglicana de la pared celular bacteriana, juega un papel fundamental en la coloracin. El cristal violeta y el lugol forman una placa en el interior de las bacterias. Al aplicar el agente decolorante, las bacterias Gram. positivas sufren una deshidratacin y la red de peptidoglicana que es muy abundante, se condensa y constituye un obstculo para la salida del complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias Gram. Negativas tambin poseen peptidoglicana pero en menor cantidad por lo que constituye una barrera laxa, de modo que las bacterias quedan ms permeables que las Gram. Positivas y el complejo cristal violeta-lugol sale con ms facilidad dejando as lugar a las safranina. A la coloracin de Gram. estn asociadas otras propiedades de las bacterias como son: su sensibilidad a diferentes antibiticos, a los colorantes del grupo del trifenil metano, a la lisozima, su capacidad de producir toxinas diferentes entre si, etc.

MATERIAL y EQUIPO

REACTIVOS y MUESTRAS

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Mechero Pinzas de diseccin Pizeta Puente de coloracin Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos Asas bacteriolgicas V.PROCEDIMIENTO A) Tcnica.

Solucin de Cristal Violeta. Solucin de lugol. Solucin de alcohol-acetona Solucin de safranina Puentes de Coloracin Cepas que se disponga en el laboratorio Aceite de inmersin

1. Hacer un frotis de cada una de las cepas proporcionadas y dejarlos secar al aire . 2. Fijar los frotis al calor. 3. Cubrir los frotis con cristal violeta y dejarlo actuar durante 1 minuto. Escurrir el colorante y lavar con un chorro suave de agua. 4. Cubrir los frotis con lugol y dejarlos actuar durante 1 minuto, escurrir y lavar con agua. 5. Decolorar con alcohol-acetona, de 5 a 15 segundos siguiendo las instrucciones del profesor y lavar con agua. 6. Cubrir los frotis con safranina y dejarla actuar durante 1 minuto. 7. Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire. 8. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin. B) Influencia del tiempo de decoloracin en la tcnica de Gram.

1. Hacer dos frotis con una mezcla de las cepas proporcionadas y fijarlas al calor. 2. Teir los dos frotis con la tcnica de Gram, dejando actuar al alcohol-acetona 3 segundos en un frotis y 2 minutos en el otro. 3. Observar ambas preparaciones con el objetivo de inmersin.

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Staphylococcus aureus bacteria G+

Neisseria meningitidis bacteria G-

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS 1. Incluir en el informe una introduccin de la tincin de Gram. 2. Hacer un diagrama de flujo de los mtodos utilizados en la prctica. 3. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas en el punto A). 4. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas del punto B). 5. Hacer esquemas a colores de cada una de las preparaciones observadas del punto C). VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO a) Cul es el propsito de teir a las bacterias? b) Porqu se utilizan colorantes bsicos para teir a las bacterias? c) Elabora una tabla en la que seales las diferencias que existen entre las bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas. d) Qu importancia tiene la tcnica de la coloracin de Gram en las identificacin de las bacterias? e) Cul es el paso crtico en la tincin de Gram?. Diga por qu? f) Explique el fundamento de la tincin de Gram relacionndolo con las propiedades de las clulas bacterianas. g) Diga el nombre de tres bacterias (genero y especie) Gram positivas y tres de Gram negativas.

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h) Porqu. En general, las eubacterias son el nico grupo microbiano que responden a la tincin de Gram?. i) Escriba el nombre de cuatro microorganismos esporulados y su importancia. j) Qu es la espora bacteriana y porqu se forma?

IX. BIBLIOGRAFA CONSULTADA Incluir por lo menos tres citas bibliogrficas consultadas

PRACTICA 6 MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO

I. COMPETENCIA El alumno aprender a diferenciar los sistemas que conforman el microscopio y manejara el mismo como una herramienta de precisin en la observacin de organismos microscpicos (bacterias y hongos) II. OBJETIVO El alumno aprender a conocer las partes y funciones de los componentes del microscopio de luz visible. III. INTRODUCCIN El microscopio de luz visible es un instrumento que ha sido utilizado por los estudiantes en cursos previos. Se ha incluido esta prctica para familiarizarlos con su funcionamiento, manejo y cuidados, as como para desarrollar su habilidad para trabajar con el objetivo de inmersin cuyo uso es indispensable en la observacin de microorganismos y sus estructuras. Las partes que lo constituyen estn representadas en la figura.

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Este microscopio est formado por tres tipos de lentes: el ocular, los objetivos "seco dbil", "seco fuerte" e "inmersin", y el condensador. Los dos primeros intervienen en la amplificacin de la imagen, mientras que el condensador forma parte del sistema de iluminacin. Cada objetivo tiene grabada una inscripcin. Para lograr una buena observacin es fundamental el sistema de iluminacin. Con la finalidad de enfocar la luz que proviene de la lmpara sobre la muestra se usa un sistema de lentes llamado condensador, el cual posee un diafragma iris que controla el dimetro del crculo de luz que sale del condensador para que llene exactamente el objetivo. Si el diafragma, est demasiado abierto, parte de la luz no llegar al objetivo, sino alrededor de l , originando brillos. Las muestras varan en su grado de contraste y la luz deber ajustarse cuidadosamente con cada preparacin que se observa. Es de importancia recalcar que, de la limpieza y cuidados que se den al microscopio depender el mantener a dicho instrumento en ptimas condiciones de uso.

MATERIAL y EQUIPO

REACTIVOS y MUESTRAS

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Microscpio Tela suave Hisopos de algodn Lpices de colores

Etanol comercial
Aceite de inmersin Frotis

V. PROCEDIMIENTO A) Cuidados del microscopio: 1.- Transportar el microscopio en forma vertical, tomndolo del brazo con una mano y de la base o pie con la otra. 2. Colocar cuidadosamente el microscopio en su mesa de trabajo, asegurndose de que no haya vibraciones en ella. 3. Limpiar el microscopio en el orden que sigue: a) Sistema mecnico, con un trapo suave que no deje pelusa. b) Sistema ptico, tanto ocular como objetivos y condensador con un hisopo humedecido en alcohol. B) Manejo del microscopio: 1. Iluminacin del campo visual. a) Conectar y prender la lmpara. b) Acercar el objetivo a la preparacin. c) Subir el condensador hasta el tope. d) Abrir o cerrar el diafragma hasta tener un campo adecuadamente iluminado. 2. Colocar la preparacin en la, platina y sujetarla con las pinzas. 3.- Enfoque de la preparacin: a) Cuando sea necesario colocar el cubreobjetos sobre la preparacin.

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b) Enfocar la preparacin con el objetivo seco dbil (10X) usando el tornillo macromtrico. A continuacin para obtener una imagen clara y ntida, mover lentamente el tornillo micromtrico. c) Enfocar con el objetivo seco fuerte (40X). d) Colocar una gota pequea de aceite de inmersin sobre la preparacin, sin tocarla con el gotero y enfocar con el objetivo de inmersin. 4.- Examinar las preparaciones proporcionadas. 5.- Desconectar, enrollar el cable y sujetarlo con una liga. 6.- Bajar la platina hasta el tope y colocar el revlver en la posicin del objetivo de menor aumento. C) Limpieza del microscopio: 1. Quitar el aceite del objetivo de inmersin, con un hisopo seco. 2. Limpiar el objetivo con un hisopo humedecido en alcohol. 3. Colocar el microscopio en su lugar y cubrirlo con la funda.

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS. 1.- Hacer esquemas de las preparaciones observadas al microscopio guardando las proporciones entre cada uno de los aumentos. 2. Incluir en el informe una introduccin acerca del uso y cuidados del microscopio, as como un esquema donde indique sus principales partes y describe cada una de ellas. 3. Hacer un diagrama de flujo donde describa las principales pasos de esta prctica. 4 Investigar los principales tipos de microscopios utilizados para fines de investigacin.

Preparacin 1

Seco dbil

Seco Fuerte

Inmersin

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Preparacin 2

Inmersin

Preparacin 3

Inmersin

Preparacin 4 VII. CONCLUSIONES

Seco dbil

Seco Fuerte

Inmersin

VIII. CUESTIONARIO a) Qu diferencia hay entre un microscopio biolgico y un estereoscpico? b) Cules son las caractersticas principales de un microscopio? c) Defina los siguientes conceptos: Condensador, Ocular, Aberracin y Poder de Resolucin. d) Cul es la importancia de utilizar aceite de inmersin? e) Mencione con qu objetivo observamos las preparaciones frescas y con qu las preparaciones fijas. IX. BIBLIOGRAFA CONSULTADA Incluir por lo menos tres citas bibliogrficas consultadas

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PRACTICA 7 AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE HONGOS

I.

COMPETENCIA

El alumno aislara y describir la morfologa colonial macroscpica y microscpica de mohos y levaduras, adems conocer sus tcnicas de aislamiento y medios de cultivo empleados, su hbitat y condiciones de cultivo, comprender su importancia en la naturaleza como organismos saprofitos desintegradores de los alimentos.
II.

OBJETIVO

El alumno conocer las tcnicas de aislamiento de hongos, los medios de cultivo empleados, su hbitat y condiciones de cultivo. III. INTRODUCCION Los hongos se encuentran en una variedad de formas y tamaos. Pueden abarcar desde clulas individuales hasta multicelulares, son organismos eucariontes (su ADN est contenido en un ncleo). Muchos de ellos pueden semejarse a las plantas, pero los hongos no fabrican su propio alimento a partir de la energa solar como lo hacen las plantas. Los hongos comprenden criaturas de una sola clula que existen individualmente, es el caso de las levaduras, y como agregados multicelulares, los mohos o los championes. Las levaduras semejan gotas redondas u ovaladas. Son muy pequeas para poderlas apreciar individualmente, pero las puedes observar cuando estn agrupadas como un polvo blanco que cubre las frutas o las hojas de las plantas.

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Los mohos se describen como filamentos, debido a que forman cadenas largas de clulas denominadas hifas. Esas hifas le dan al moho su aspecto felpudo. Tambin forman el cuerpo carnoso de los championes, el cual contiene las esporas de algunas especies. Puede parecer extrao considerar algo tan grande como un champin como un microbio. Pero las clulas de las hifas que forman el champin estn conectadas de una forma ms estrecha que las clulas de otros organismos multicelulares. Las paredes celulares que separan las clulas de la hifa tienen usualmente poros que permiten que el protoplasma, es decir el fluido que llena las clulas, fluya entre ellas. En esencia, una hifa de un hongo es un tubo que se extiende continuamente. En general, los hongos crecen mejor en medio ambientes ligeramente cidos (un pH de 5,0; un pH de 7,0 es neutral). Pueden crecer en sustancias con baja humedad. Los hongos viven en el suelo, en tu cuerpo, en tu casa, en plantas y en animales, en agua dulce y en agua salada. Una cucharadita de tierra contiene alrededor de 120.000 hongos. Los hongos bsicamente son estticos. Pero se pueden diseminar formando esporas que viajan en el viento y en la lluvia, o por crecimiento y extensin de sus hifas. Recuerda que las hifas son cadenas de clulas fngicas que crecen en el extremo, creando cadenas ms largas que se ramifican. Es difcil detener su crecimiento. Las hifas son lo suficientemente fuertes como para abrir huecos a travs de la pared celular de las plantas y el duro exoesqueleto de los insectos. Los hongos absorben nutrientes de la materia orgnica viva o muerta (plantas, animales) sobre la cual crecen. Simplemente absorben a travs de su pared celular nutrientes que se disuelven fcilmente, como son los azcares, o secretan enzimas que rompen los nutrientes ms complejos en formas sencillas para poderlas absorber.

MATERIAL y EQUIPO
Mechero

REACTIVOS y MUESTRAS
Solucin de azul de algodn en lactofenol. Solucin de glicerol al 10%.* Solucin de formaldehido al 10%* Solucin de safranina Puentes de Coloracin Solucin de azul de metileno al 1% Dextrosa y papa o Dextrosa

Pinzas de diseccin Pizeta Puente de coloracin Microscopio Sistema de micro cultivo (caja de petri, v de vidrio, portaobjetos y cubreobjetos) Asa micolgica Agar

saboraud, medio de Martn o rosa de Cinta diurex bengala cido tartrico al 10% *

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*Nota: Estos reactivos deben estar estriles

V. PROCEDIMIENTO A) Aislamiento por diluciones. Preparar una serie de diluciones decimales a partir de una muestra de suelo, hasta la dilucin 1:100,000 (1 X 10-5). 2. Sembrar las tres ltimas diluciones en los medios proporcionados, depositando una alcuota de 0.1 ml en la superficie. 3. Extender con la varilla de vidrio previamente esterilizada. 4. Incubar a 28oC durante 48-72 horas.
1.

B) Descripcin de la morfologa colonial. Para describir la morfologa colonial de los hongos se utilizan las siguientes caractersticas: a) Tamao en cm. b) Aspecto, algodonoso, polvoriento, aterciopelado y granuloso. c) Color del micelio vegetativo. d) Color del micelio areo. e) Produccin de pigmento difusible. f) Color del reverso de la colonia. C) Descripcin de la morfologa microscpica. Preparaciones en fresco. 1. Colocar una gota de azul de algodn lactofenol en el centro de un portaobjetos limpio. 2. Tomar una pequea porcin de la colonia que se desea observar y colocarla en la gota sin extenderla. 3. Poner un cubreobjetos y examinar la preparacin al microscopio con los objetivos seco dbil y seco fuerte. 4. Observar las caractersticas del micelio vegetativo: a) Dimetro de las hifas. b) Presencia o ausencia de septos: septado o cenoctico. c) Color de las hifas: hialino o pigmentado. 5. Observar las caractersticas del micelio reproductor: tipo de esporas (comparar con los esquemas).

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D) Microcultivos (ver figura).

1. Utilizando las pinzas estriles, colocar el portaobjetos sobre la varilla de vidrio. 2. Con un bistur cortar cuadritos de 1.5 cm2 de medio de Sabouraud. 3. Con ayuda de las pinzas estriles colocar el cuadrito de medio sobre el portaobjetos. 4. Con el asa doblada en ngulo recto inocular el hongo proporcionado en los cuatro costados del cuadrito de agar. 5. Colocar el cubreobjetos estril sobre el agar. 6. Agregar cuidadosamente el glicerol al 10 % en el fondo de la base de la caja de Petri. 7. Tapar la caja e incubarla a 28 0C durante 48-72 horas, con la tapa hacia arriba. 8. Extraer el glicerol con una pipeta Pasteur y desecharlo en un tubo de ensaye despus de terminado el perodo e incubacin. 9. Agregar el formaldehido al 10 % y dejarlo en la caja durante 2 horas. 10. Eliminar el formaldehido utilizando una pipeta Pasteur. 11. Desprender cuidadosamente el cubreobjetos y colocarlo sobre un portaobjetos que tenga una gota de azul de algodn lactofenol. 12. Sellar la preparacin con barniz de uas transparente, siguiendo las instrucciones del profesor. 13. Desprender el cuadrito de medio de cultivo del portaobjetos y desecharlo en la caja, aadir una gota de azul de algodn lactofenol al portaobjetos y colocarle un cubreobjetos limpio. Sellar la preparacin con barniz de uas. 14. Observar las preparaciones a seco dbil y fuerte.

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VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS. 1. Incluir en el informe una introduccin del aislamiento y cultivo de hongos. 2. Hacer un diagrama de flujo de los mtodos empleados en la prctica. 3.-Hacer una tabla donde se indique el nmero de colonias de hongos obtenidas en las placas de Sabouraud y Rosa de Bengala, indicando el numero de dilucin, numero de H/ g de suelo. 4.- Morfologa colonial. Hacer una tabla donde se indique las caractersticas morfolgicas de tres diferentes colonias de hongos, indicando el tamao, aspecto, color del micelio si es vegetativo o areo, pigmento difusible, color reverso de la colonia y medio de cultivo donde se sembr. 5.- Morfologa a microscpica. Anotar en una tabla las caractersticas de la morfologa microscpica de las colonias (descritas anteriormente en el punto 2 del informe) anotando el dimetro, presencia de septos, color de la hifas. 6.- Hacer esquemas a colores de las estructuras observadas en las preparaciones en fresco. 7.- Morfologa microscpica a partir del micro cultivo. Realizar una tabla en donde se indiquen las caractersticas de la morfologa microscpica sembrados en micro cultivo, indicando el dimetro, presencia de septos, color de hifas, tipo de espora asexual, nombre del hongo. 8.- Haga esquemas a colores de las estructuras observadas en las preparaciones a partir de los micro cultivos.

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TIPOS DE MICELIOS

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46

VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO 1. Cul es la composicin qumica de la pared y membrana celular de los hongos? 2. Defina lo siguiente: micelio vegetativo, micelio areo, micelio cenoctico, espora sexual y espora asexual. 3. Que es un organismo saprfito? 4. Mencione tres diferencias entre las esporas de hongos y las esporas bacterianas. 5. Qu tipo de condiciones se deben de tener para el crecimiento de hongos?

IX. BIBLIOGRAFA CONSULTADA. Incluir por lo menos tres citas bibliogrficas consultadas

PRACTICA 8

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MUESTREO
I. COMPETENCIA El alumno seleccionara la tcnica ms adecuada para tomar muestras representativas considerando las condiciones aspticas necesarias para evitar la contaminacin de organismos no deseados, incluyendo nicamente los presentes en la muestra, considerara la temperatura ptima de transporte. II. OBJETIVO El alumno tomara una muestra representativa de un lote de alimentos previamente seleccionado. III. INTRODUCCIN El control de calidad sanitaria de los alimentos encuentra un valioso apoyo en los anlisis microbiolgicos. Si bien la inspeccin a los sitios de fabricacin, almacenamiento, preparacin, expendio e incluso a los transportes de alimento son parte fundamental en sus programas de control, no es posible, en la mayora de los casos, tomar una decisin ante un problema especfico, sin un reporte de laboratorio. A travs de estos anlisis se ponen de manifiesto riesgos, en ocasiones muy serios de salud, que pueden pasar inadvertidos an a la ms rigurosa inspeccin. Los datos proporcionados por los anlisis, sin embargo, solo son tiles si se cumplen 3 condiciones fundamentales. 1. La muestra colectada y utilizada en el anlisis es representativa e idnea. 2. La tcnica de anlisis es ejecutada con estricto apego a la metodologa establecida en cada caso particular. 3. Existen normas o estndares de calidad para las pruebas empleadas. Las tcnicas que se describen en este manual han sido utilizadas durante muchos aos en el Laboratorio Nacional de Salubridad. Provienen en la mayora de los casos, de las recomendaciones hechas por el Comit Internacional sobre

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Especificaciones Microbiolgicas para los Alimentos, conscientes de la importancia de lograr la mxima uniformidad en la metodologa utilizada entre todos los pases. No obstante, teniendo en cuenta el nivel de desarrollo tcnico de nuestro pas en esta especialidad, y por razones de carcter econmico, se han introducida modificaciones a fin de hacerlas ms accesibles y prcticas. De cualquier modo, se insiste en la necesidad de seguir cada tcnica, precisamente en los trminos que en cada caso sealan. MATERIAL y EQUIPO Papel alumnio y de envoltura Cinta masking tape Mechero Marcador permanente Frascos estriles Hisopos V.PROCEDIMIENTO I. Muestreo y transporte de la muestra La tcnica de recoleccin de una muestra para su anlisis microbiolgico REACTIVOS y MUESTRAS Etanol comercial

establece una serie de precauciones y condiciones que deben ser observadas a fin de obtener resultados significativos en el trabajo. Ello implica, en primer lugar, precisar el objetivo del estudio. Puede tratarse de un alimento sospechoso de haber causado una infeccin o intoxicacin, puede tratarse de un control de calidad rutinario en una fbrica, puede ser el caso de un alimento con un grado de frescura incierto, puede ser un problema de investigacin sobre la causa de su descomposicin, etc. El tamao de la muestra (peso o volumen si es solo un producto aparentemente homogneo; o el nmero de unidades si se trata de un lote est determinado por ese objetivo, y por supuesto, en la prctica, por la cantidad de alimento posible.

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Para cada alimento o grupo de alimento particular se seala en el manual las directrices que permiten obtener muestras tiles para el anlisis. Pueden hacerse sin embargo, las siguientes recomendaciones generales: 1. - Utilizar recipientes, bolsas y material, estriles para la recoleccin. Para esto hacer uso, segn el caso de autoclave a 121 durante 20 minutos, o de horno a 180 C durante 30 minutos (o 170 C durante 1 hora). No basta esterilizar el material; es necesario cubrirlo con papel de aluminio o papel de estraza resistente, para protegerlo de contaminacin ulterior durante su manejo. 2.- Al colectar la muestra evitar contaminaciones del ambiente tales como naturaleza. El polvo, tierra , saliva, descargas nasofaringeas o de cualquier otra

recipiente o bolsa se abrir justamente lo necesario para introducir la muestra, y hecho esto volver a cubrirse o cerrarse, tanto con su tapa como con el papel que l a protege. No es requisito el uso de mechero de alcohol durante la maniobra. 3.- Es esencial que el recipiente y los dispositivos empleados para extraer la muestra no solo se encuentren estriles, sino adems limpios, libres de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos. 4.- Es recomendable identificar claramente ha de obtener ms de una . 5.- En el informe o acta anexa se consignar toda la informacin pertinente que pudiera afectar la prueba o el significado del resultado, a fin de que el laboratorio lo tome en consideracin al desarrollar el anlisis e interpretar su resultado. Por ejemplo: la posibilidad de la presencia del algn conservador en el alimento, un olor o color desiguales, sus condiciones de conservacin: temperatura, proteccin contra contaminantes, etc. 6.- Si se trata de alimentos envasados colectar las unidades requeridas de acuerdo al propsito del anlisis. Tomarlas al azar si se encuentran por ejemplo en cajas o situadas en estanteras; si es el caso de un producto de fabricacin, obtener muestras sucesivas distribuidas a lo largo inspeccin. del perodo en el que se realice la mediante rtulo o etiqueta (indelebles ) el recipiente, antes de colocar la muestra, a fin de evitar confusiones si se

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7.- Si se trata de alimentos a granel, o de recipientes o piezas grandes de las que hay que retirar una porcin, obtenerla de diferentes localidades. Si se estima de inters, conviene obtener muestras independientes que pudieran poner de manifiesto problemas distintos (no mezclar en el mismo recipiente por ejemplo, porciones que muestren alguna alteracin, an pequea, con porciones regulares). 8.- Transportar las muestras de alimentos perecederos o semi perecederos al laboratorio bajo refrigeracin (2 a 8 C), o en congelacin si se trata de alimentos congelados. Utilizar para el efecto hielo de agua o hielo seco respectivamente. 9.- Evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine los alimentos muestreados. Es recomendable el empleo de hielo contenido en bolsas de plstico impermeable para evitar estos inconvenientes, lo que adems facilita el acomodamiento de los diferentes envases dentro de la caja de transporte. 10.- Toda medida que se tome para acortar el tiempo comprendido entre la recoleccin de las muestras y su entrega al laboratorio, contribuir notoriamente a evitar falseamientos en la imagen microbiolgica de un alimento al anlisis. Los cambios que pueden sufrir durante su transporte son tanto cualitativos como cuantitativos: pueden encontrarse cifras mayores a las originalmente presentes como resultado de la proliferacin de un grupo particular de microorganismos o menores si hay un efecto antagnico de otro grupo de grmenes. Las bacterias patgenas pueden incluso morir, o llegar a encontrarse en tal desventaja con el resto de la flora, que no sea posible ponerlas de manifiesto con las tcnicas de anlisis utilizadas. Es evidente que cada situacin plantea problemas especficos en el muestreo. Estimamos sin embargo que la consideracin de estas recomendaciones y las que se sealan para cada alimento, permitirn al inspector seguir una metodologa adecuada a los objetivos del muestreo de alimentos para su control sanitario. II. Recepcin de la muestra Es importante la intervencin de un qumico en la supervisin del trabajo de recepcin de muestras que se reciban en el laboratorio:

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1. Para constatar el correcto cumplimiento de las instrucciones que se indican. 2. Para aclarar con los remitentes cualquier duda que se suscitara en relacin con la idoneidad de la muestra y la aplicabilidad de las determinaciones que se soliciten o procedan. 3. Para la adecuada distribucin de la nuestra, si han de intervenir ms de un laboratorio en su estudio. El procedimiento a seguir es el siguiente: 1. Al recibir la muestra en el laboratorio constatar la clave escrita en el recipiente con el acta o documento que lo acompae. 2. Dar el nmero de control interno con el cual ser manejada la muestra dentro del laboratorio. 3. Tomar nota de las pruebas de laboratorio solicitadas en el Acta de Muestreo o de inspeccin. 4. Registrar la fecha y hora de recepcin de la muestra en el laboratorio. 5. Comprobar que no ha habido derramamiento del contenido del recipiente y que el envase se mantiene integro, libre de perforaciones, rasgaduras o roturas de cualquier tipo. En este ltimo caso, la muestra es impropia del estudio. 6. Examinar el contenido del recipiente (envases trasparentes) y consignar cualquier caracterstica que sugiera algn cambio o alteracin del producto: coloraciones, olores, enturbiamiento, formacin de pelcula o sedimento, desintegracin, etc. 7. Siempre que sea posible obtener la temperatura de la muestra al recibir en el laboratorio cuando se trate de alimentos que requieran una transportacin refrigerada. 8. Distribuir las muestras recibidas con la mayor brevedad posible al laboratorio o laboratorios que han de intervenir en su anlisis. VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

VII. CONCLUSIONES

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VIII. CUESTIONARIO
1. En base a qu aspectos se escoge la tcnica de recoleccin de muestras.

2. Cul es la finalidad de manejar condiciones aspticas y el control de la temperatura, para el muestreo. 3. Porque debe tomarse un tamao de muestra especfico. 4. Con que finalidad se hace la rotulacin de las muestras

IX. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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Los anlisis microbiolgicos se harn mediante los siguientes anexos, son tcnicas de rutina que se llevan a cabo de manera obligatoria en todos los laboratorios de control de calidad en la industria alimentaria.

ANEXOS APLICACIONES

NORMA Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. NORMA Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa. 08-25-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-113-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. 10-19-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes. Tcnica del nmero ms probable. 09-13-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. 09-25-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. 09-22-95 NORMA Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de salmonella en alimentos.

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