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UNIVERSIDAD ARTURO PRAT DEPARTAMENTO CIENCIAS DEL MAR BIOTECNOLOGA ACUCOLA.

Cultivo de Microalgas en un Sistema Esttico.

Alumna: Claudia Corts Vergara. Carrera: Biologa Marina. Profesor: Karen Guisen. Fecha: 08 Octubre 2010.

INTRODUCCION

Son llamadas microalgas la cantidad de especies que constituyen el fitoplancton que abarca desde organismos auttrofos hasta microflagelados y microciliados auxtrofos. Su posicin taxonmica ha sido de gran polmica entre botnicos y zologos, como ejemplo el grupo de los dinoflagelados, conocidos por unos como microalgas y por otros como protozoarios. Se trabajo en el laboratorio con dos grupos de microalgas: Diatomeas y Dinoflagelados. Las Diatomeas son organismos fotosintticos que viven en agua dulce o marina constituyendo una parte muy importante del fitoplancton. Uno de los rasgos caractersticos de las clulas de Diatomeas es la presencia de una cubierta de slice (dixido de silicio hidratado) llamado frstulo y que muestran una gran diversidad de formas, algunos muy bellos y ornamentados y generalmente constan de dos partes asimtricas o valvas con una divisin entre ellas, de ah el nombre del grupo. Muchas especies aparecen formando encadenamientos u otros agregados ordenados. Los Dinoflagelados corresponden a un grupo del fitoplancton marino de carcter cosmopolita. Sus caractersticas morfolgicas y requerimientos nutritivos los hacen exitosos desde el punto de vista reproductivo y de crecimiento, en aguas tropicales, donde la estabilidad en la columna de agua es mayor y la concentracin de nutrientes ms baja. Su tamao flucta entre 50 y 500 m, por lo que se les ubica dentro del microplancton, y pueden ser divididos en dos grandes grupos diferenciados por la presencia o ausencia de placas de naturaleza celulsica en su pared celular o anfiesma, de acuerdo a esta caracterstica se les denomina Tecados o Atecados respectivamente. Se trabaj con cuatro especies correspondiente a Dinoflagelados: Isochrysis galbana, Nannochloropsis sp., Dunaliella sp. y Tetraselmis suecica y una especie correspondiente a Diatomeas: Chaetoceros sp.

Estas especies aportan un alto contenido nutricional para peces, crustceos y moluscos, adems de ofrecer facilidades de manejo en sistemas de cultivo tanto en laboratorio como en produccin a gran escala con fines comerciales. Su cultivo se realizo por etapas sucesivas en volmenes de capacidades crecientes. Las microalgas empleadas como alimento larval deben sacarse y utilizarse durante la fase de crecimiento de su cultivo para que su calidad sea ptima. Adems, se debe tener un cuidado muy particular en las diferentes manipulaciones, para evitar que las cepas sufran cualquier contaminacin de organismos exteriores y su degeneracin. Las microalgas pueden utilizarse de dos maneras: Uso directo, en estanques de cra larval y reproductores o como inoculum en cultivos intermedios. Muchos factores contribuyen para el desarrollo ptimo de los cultivos de microalgas, algunos de stos afectan las caractersticas del crecimiento. Los recipientes de cultivo ms comnmente usados son de materiales no txicos como las cajas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, carboys o garrafas, etc., adecuados para cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plstico y/o acrlico son recomendables. En cultivos masivos la aireacin es un factor muy importante para la homogenizacin de los nutrientes y para evitar la sedimentacin de las microalgas. Las microalgas suelen acumularse en lugares donde el agua no se mezcla, esto tambin depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado retarda el crecimiento. Otro factor importante es la penetracin de la luz en el cultivo; en los cultivos masivos la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz incidente no es suficiente para la fotosntesis, hasta el fondo del tanque. En los cultivos masivos a la intemperie la penetracin de la luz es ms

efectiva, pero se debe reducir la intensidad de la luz fuerte, cubriendo estos estanques con una malla. En cultivos a gran escala es recomendable la inyeccin de CO2 (0.5%) para contribuir al proceso fotosinttico. Para muchas especies de microalgas la temperatura ptima oscila entre los 15 y 20C, adems el crecimiento y la divisin celular son afectados por la intensidad de la luz y el fotoperiodo (horas de iluminacin y oscuridad) donde relaciones optimas de crecimiento varan con las especie.

OBJETIVO GENERAL Realizar cultivo de microalgas utilizando el mtodo estacionario escalonado

OBJETIVOS ESPECIFICOS
Esterilizar el material a emplear Filtrar y esterilizar el agua de mar Crear medio de cultivo

Escalar diferentes volmenes de cultivo microalgal


Obtener

microalgas ptimas para la alimentacin de especies

hidrobiolgicas.

METODOLOGIA Se utilizaron dos especies de microalgas provenientes del centro de cultivo de la Universidad Arturo Prat (Campus Huayquique). Tetraselmis suecica
Nannochloropsis sp.

Ambas especies de microalgas corresponden a cultivos monoclonales y son utilizadas para la alimentacin de especies en estanques de cra larval de especies hidrobiolgicas. Para comenzar se realizo la desinfeccin con autoclavado de todo el material de laboratorio: Matraz Erlenmeyer, pipetas, gotarios, vasos precipitados, bidones, karwall, etc., y tambin se realizo la desinfeccin de las manos con alcohol. El agua de mar utilizada fue filtrada a 1m por filtros de cartucho, Radiacin Ultravioleta y autoclave durante 15 minutos a 110C. El cultivo se realizo por etapas sucesivas en volmenes de capacidades crecientes (mtodo estacionario escalonado), comenzando por Matraz

Erlenmeyer con 200 ml Matraz Erlenmeyer con 5 Litros recipiente (botelln) con 20 litros Karwall con 100 litros (en sala de algas). Se utilizaron como medio de cultivo los siguientes nutrientes: (Na NO3) y (PO4 H2 Na H2O).

Preparacin de la cepa Se comenz utilizando un matraz Erlenmeyer de 500 mL donde se agrego 200 mL de agua de mar filtrada y esterilizada, se adiciono 2 mL de stock (tetraselmis sucica), ms 0,2 mL de (Na NO3) y 0,2 mL de (PO4 H2 Na H2O), obteniendo un volumen final de 202.4 mL. Tabla n1: Composicin de cultivo de Tretraselmis suecica en 200mL. Volumen 202,4 mL Agua de mar 200 mL Inoculo 2 mL Medio 0,4 mL

Cultivo Intermedio Se preparo en un matraz Erlenmeyer 4 Litros de agua de mar filtrada y esterilizada, se adiciono un Litro de inoculo ms 2 mL de (Na NO3) y 2 mL de (PO4 H2 Na H2O), y se mantuvo por siete das. Tabla n2: Composicin de cultivo de Tretraselmis suecica en 5 Litros Volumen 5 Litros Agua de mar 4 Litros Inoculo 1 Litro Medio 4 mL

Transcurridos los siete das se procedi a realizar el traspaso de los 5 litros a un recipiente con capacidad de 20 litros, donde se utilizaron 15 Litros de agua de mar filtrada y esterilizada, 5 Litros de inoculo, ms 20 mL de cada nutriente

(Na NO3) y (PO4 H2 Na H2O). Se mantuvieron por dos semanas y murieron debido a la falta de agitacin y luz. Tabla n3: Composicin de cultivo de Tretraselmis suecica en 20 Litros Volumen 20 Litros Agua de mar 15 Litros Inoculo 5 Litro Medio 40 mL

Cultivo masivo Se realizo el traspaso de 20 Litros de una nueva microalga

(Nannochloropsis sp.) a un Karwall. Para realizar este procedimiento fue necesario lavar dos veces con detergente el Karwall para retirar todo tipo de impurezas utilizando una escobilla y un posterior enjuague con cido, tambin se enjuago la tapa y el capilar. Se agrego al Karwall 80 Litros de agua de mar filtrada y esterilizada, se adiciono 100 mL de cada nutriente.

Tabla n4: Composicin de cultivo de Nannochloropsis sp. en 100 Litros. Volumen 100 Litros Agua de mar 80 Litros Inoculo 20 Litro Medio 200 mL

RESULTADOS
Las resultados se obtuvieron a travs de conteo del nmero de clulas ubicadas en un Hematcitometro (Cmara de Neubauer), el cual consiste en, una cmara sub dividida en cuadriculas utilizadas para obtener densidad ptima. Este conteo se realizo observando en un microscopio y con la ayuda de un contador manual. Se calcularon las tasas de crecimiento a partir de recuentos diarios al microscopio, utilizando la siguiente frmula: = [ln(Nt) - ln(N0)]/ln2 (t-t0)

Tabla N 5: Resultados de las mediciones realizadas en el cultivo de Tetraselmis suecica en 200 mL. Semana 0 1 2 3 4 5 Fecha 27/08 03/09 10/07 24/09 01/10 06/10 N Clulas 34 17 24 42 44 45 Densidad (cel./mL) 8.500.000 4.250.000 6.000.000 10.500.000 11.000.000 11.250.000

Grafico n1: Corresponde al crecimiento microalgal de Tetraselmis suecica en un cultivo de 200 mL. Tabla N 6: Resultados de las mediciones realizadas diariamente en los cultivos de Nannochloropsis sp. en 20 y 100 Litros. (Los nmeros que en esta tabla se ven sin negrita, han sido asumidos, con el fin interpolar los datos). N
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Fecha
24/09 27/09 28/09 29/09 30/09 01/10 02/10 03/10 04/10 05/10 06/10

Volumen 20 L (cel./mL)
1.125.000 2.500.000 2.750.000 3.000.000 3.3750.000 4.000.000 4.100.000 4.200.000 4.325.000 4.750.000 3.050.000

Volumen 100 L (cel./mL)


1.275.000 3.250.000 4.150.000 3.750.000 4.000.000 5.500.000 5.400.000 5.200.000 5.000.000 6.250.000 7.900.000

Grafico n2: Corresponde al crecimiento microalgal de Nannochloropsis sp. en un cultivo de 20 Litros.

Grafico n 3: Corresponde al crecimiento microalgal de Nannochloropsis sp. en un cultivo de 100 Litros. Tabla 7: Corresponde a las tasas de crecimiento microalgal. Volumen (mL) Tasa de crecimiento (/dia)

200 20.000 100.000

0,093 0,207 0,2499

DISCUSION Y CONCLUSION

El cultivo de Tetraselmis suecica. Presento un su primera semana una disminucin en el crecimiento debido a la falta de agitacin durante esta primera semana, a partir de la segunda semana comienza a recuperarse hasta alcanzar un buen un incremeto el cual mantuvo como fase

exponencial hasta la cuarta semana desde donde comienza una fase ya ms estable la cual se mantiene hasta hoy. El cultivo de Nannochloropsis para los 20 Litros presenta un progreso muy irregular, el cual se puede observar claramente en el grafico n 2, donde hay crecimiento exponencial y a pesar de que el grafico no se vea estable muy estable, la tendencia exponencial es notoria. Tambin en la etapa final ocurre una baja en el crecimiento, esto se puede explicar por varios factores, ya sea mala manipulacin, contaminacin de las algas o un error en el conteo. Para los 100 Litros como se puede observar en el grafico n 3 se ve que el crecimiento es constante, por lo que se puede concluir que se encuentra en una fase exponencial.

BIBLIOGRAFIA
CCERES MARTNEZ, C. Tesis Cultivo continuo de la microalga Monochrysis lutheri bajo condiciones rudimentarias. Ensenada, B.C., U.A.B.C. 1979.

Round, F. E. and Crawford, R. M. (1990). The Diatoms. Biology and Morphology of the Genera, Cambridge University Press, UK. Canter-Lund, H. and Lund, J.W.G. (1995). Freshwater Algae, Biopress Limited. Mann, D. G. (1999). The species concept in diatoms. Phycologia.