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Tema 13
tiempo que se consigue con los instrumentos automatizados y a que las mquinas no se fatigan. * Menores costos laborales, ya que, el personal encargado de un instrumento automatizado puede tener menor grado de cualificacin, y, por tanto, ser menos costoso, que el necesario para desarrollar un mtodo no automtico. Entre los inconvenientes, pueden citarse: * Menor versatilidad que los sistemas no automticos. * La inversin inicial suele ser elevada, lo cual requiere que el volumen de trabajo sea lo bastante grande para amortizar aquella inversin.
efectan unas acciones previamente programadas para realizarse en unos puntos del proceso sin intervencin humana. As, por ejemplo, un valorador automtico registra una curva de valoracin o
Los dispositivos automticos son aquellos que simplemente interrumpe la valoracin en un punto por medio de un dispositivo mecnico o elctrico, en lugar de hacerlo manualmente. El sistema no toma decisiones, y la secuencia de operaciones es siempre la misma.
Por otra parte, un dispositivo automatizado, se disea para que un sistema de realimentacin* le permita tomar decisiones sin intervencin humana. El control de un proceso automatizado se lleva a cabo por medio de un dispositivo que consta, al menos, de tres componentes: un elemento de percepcin sensible a la variable a controlar, un sistema que compare la variable medida con un valor de referencia y produzca una seal proporcional a esa diferencia, y, finalmente, un dispositivo que acte sobre algn mecanismo para reducir la diferencia medida (figura 13.1.) Un valorador automatizado puede programarse para mantener una muestra a un determinado valor de pH por ejemplo, 7 , para lo cual mide el pH y lo compara con el valor de 7, originando una seal proporcional a la diferencia, que acta sobre un mecanismo mediante el cual se aada cido o base a la muestra para mantenerla al pH deseado. Tambin, por ejemplo, puede programarse de forma que compare el potencial de un electrodo de vidrio con el potencial terico en el punto de equivalencia, usando
* Tambien se utiliza el trmino "retroalimentacin".
Mtodos automticos de anlisis esa diferencia para controlar la velocidad de adicin del reactivo valorante. . PROCESO variable manipulada Mecanismo
(p.ej. vlvula)
seal de salida
Es preciso sealar que, aunque la diferencia entre sistemas automticos y automatizados es clara, no es seguida por la mayora de los autores, incluyndose en el trmino "AUTOMATICO" ambos tipos de metodologas.
CLASIFICACION
Los mtodos automticos para el anlisis de muestras en disolucin suelen clasificarse segn el siguiente esquema*
.
Muestreador
R1
mezcla, etc.
R2
tra. etc.
Detector
Desecho
Figura 13.2. Esquema de analizador automtico discontinuo.
En los sistemas continuos, la muestra se incorpora a un flujo de lquido o gas, donde es sometida a una serie de procesos desde que se inyecta hasta que se hace llegar al detector. En los mtodos continuos segmentados, las muestras son introducidas de forma secuencial, y entre ellas se sitan burbujas de aire para separarlas entre s. Dichas burbujas, generalmente se eliminan antes de que las muestras alcancen el detector. Por su parte, en los mtodos no segmentados, la muestra es inyectada directamente en el flujo, sin utilizar burbujas de aire para la separacin. En estos mtodos, puede no alcanzarse el equilibrio fsico ni qumico en el momento de la deteccin, y su instrumentacin suele ser ms sencilla y barata que en los anteriores. Los mtodos robotizados consisten en la utilizacin de un mini-robot que mimetiza las operaciones llevadas a cabo por una persona para desarrollar un mtodo analtico. Desde un punto de vista general, estos mtodos pueden considerarse como una modalidad de los mtodos analticos discontinuos, si bien, hasta el momento no se han utilizado demasiado en la prctica analtica ordinaria. De todos los mtodos automticos de anlisis, el ms representativo es el denominado Anlisis por Inyeccin en Flujo (FIA)*, que se tratar seguidamente.
* La abreviatura FIA corresponde a las siglas de la versin anglosajona "Flow Injection Analysis".
INSTRUMENTACION
Los componentes bsicos de un sistema FIA estn representados en la figura 13.3., si bien, para que tenga la categora de automtico, es preciso incorporar un muestreador, un sistema de aspiracin de la muestra y un sistema de inyeccin controlado electrnicamente y que funcione de forma coordinada con el muestreador. .
Muestra (Ej. Cl )
Registro
Tubo de reaccin
reactivo o carrier
Sistema de propulsin
Sistema de inyeccin
Detector
(Ej. FeSCN 2+ , rojo)
Desecho
Sistemas de propulsin
En la mayor parte de las aplicaciones, se opera con tubos de 0.5 a 1 mm de dimetro, y velocidades de flujo comprendidas entre 0.5 y 5 mL/min. La unidad de propulsin tiene como misin establecer un flujo de caudal lo ms constante posible, ausente de impulsos y perfectamente reproducible. Esto puede conseguirse por la simple accin de la gravedad, mediante un sistema de presin gaseosa, o con una bomba peristltica. La forma ms sencilla de obtener un flujo no pulsante de reactivo o carrier, consiste en colocar el depsito a mayor altura que el resto del sistema FIA. El mayor inconveniente reside en mantener un flujo constante, lo cual puede conseguirse usando depsitos de gran superficie, para que el nivel del lquido se mantenga esencialmente constante. Otra forma de obtener un flujo libre de impulsos es utilizar la presin de un gas sobre la superficie del lquido portador (figura 13.4.a.)
Gas inerte
.
Reactivo a
El mayor inconveniente de este mtodo se encuentra cuando se trata de suministrar flujos iguales a travs de 2 ms tubos. Por otra parte, existe la posibilidad de formacin de burbujas segn sea la solubilidad del gas utilizado. La forma ms generalizada de propulsin se basa en la utilizacin de bombas peristlticas. Consisten bsicamente en un tambor conteniendo una serie de rodillos, los cuales comprimen un tubo flexible por el que circula el reactivo o el carrier (figura 10.4.b.). Este sistema de impulsin proporciona un flujo pulsante, aunque es posible evitarlo mediante la introduccin de un sistema amortiguador consistente en un tubo largo situado entre la bomba y el sistema de inyeccin de la muestra.
Sistemas de inyeccin
Este componente del sistema FIA tiene como misin situar una cantidad perfectamente definida de muestra en la corriente del carrier. Es importante que el volumen de muestra insertada sea exacto, perfectamente reproducible y variable dentro de un margen amplio. Los primitivos sistemas FIA utilizaban para insertar la muestra jeringas, sin o con aguja. En la figura 13.5.a. se muestra esquemticamente uno de los dispositivos de inyeccin consistente en dos bloques que comprimen un disco de silicona que acta de septum. Este puede recambiarse fcilmente cuando se deteriore, si bien, es posible efectuar varios cientos de inyecciones antes de que eso suceda. La utilizacin de jeringas para introducir la muestra tiene nicamente inters histrico, ya que la inyeccin propiamente dicha produce un cambio transitorio en el flujo, lo que produce un pico agudo e irreproducible. Actualmente, casi todos los sistemas FIA utilizan vlvulas rotatorias para insertar la muestra en el flujo. En la figura 13.5.b. se ha representado una vlvula rotatoria sencilla. La muestra, contenida en un tubo de volumen conocido, se introduce en la corriente de fluido portador mediante un giro de 90. Generalmente, la muestra est contenida en un bucle de volumen variable. Con este sistema, se consigue una buena reproducibilidad de los volmenes suministrados, rapidez y facilidad de manejo, as como una aceptable capacidad de automatizacin. muestra
extremo de la aguja
septum
tubo de plstico
Sistemas de deteccin
Un detector, para que resulte adecuado en FIA, deber poseer las siguientes caractersticas: pequeo volumen, bajo nivel de ruido, seal independiente del caudal, respuesta rpida y lineal en un amplio margen de concentracin y alta sensibilidad.
Los sistemas de deteccin usados en FIA comprenden una gran variedad de mtodos analticos: electroqumicos (potenciomtricos, conductimtricos, amperomtricos, etc), pticos (espectrofotomtricos, fluorimtricos, etc.) y otros (termoqumicos). La eleccin de una u otra tcnica depende del problema a resolver, del volumen de muestra y de su concentracin. Detectores electroqumicos. El mayor problema de los detectores electroqumicos lo constituye el electrodo de trabajo o indicador, por la posibilidad de que se contamine su superficie por adsorcin, con la correspondiente prdida de estabilidad. Prcticamente el nico electrodo que no presenta estos problemas es el de gotas de mercurio, pero el crecimiento y cada de la gota origina unas oscilaciones que se traducen como ruido de fondo en la lnea base. La deteccin potenciomtrica puede llevarse a cabo en un dispositivo experimental como el representado en la figura 13.6.
flujo
electrodo de trabajo
electrodo de referencia
Figura 13.6. Deteccin potenciomtrica.
Se han utilizado electrodos selectivos de iones para la determinacin por FIA de un cierto nmero de sustancias. En estos casos, se han diseado diferentes dispositivos que tienden a minimizar el espesor de la capa de fluido sobre la superficie del electrodo. Asimismo, es posible usar series de electrodos para obtener la seal de diferentes especies sobre la misma muestra. La deteccin amperomtrica, en sus diversas modalidades (DC, impulsos, diferencial, etc.) se ha usado con cierta extensin en determinaciones por FIA. El electrodo de trabajo ms usado es el de carbn vitrificado, si bien, tambin se han utilizado el de gotas de mercurio y otros para determinadas aplicaciones puntuales.
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As, por ejemplo, se ha utilizado un electrodo de plata para la deteccin amperomtrica de cianuro, segn el diseo representado en la figura 13.7.
electrodo de referencia
Ag
(electrodo de trabajo)
flujo
(electrodo auxiliar)
tubo de acero
La limpieza y reactivacin de los electrodos slidos se consigue mediante la aplicacin de series de impulsos de corriente. Dentro de los detectores basados en tcnicas electroqumicas, pueden citarse tambin los culombimtricos y los conductimtricos, si bien, su uso est menos extendido que los anteriores. Detectores pticos. Los detectores basados en mtodos pticos son, con gran diferencia, los sistemas ms utilizados en FIA. Dentro de ellos, los detectores espectrofotomtricos pueden considerarse como los de mayor importancia, debido a la gran cantidad de especies capaces de absorber radiacin de forma selectiva en las regiones ultravioleta y visible. Las tpicas clulas de flujo comerciales suelen aplicarse con buenos resultados a la deteccin fotomtrica en FIA, si bien, tambin se utilizan clulas en forma de Z (figura 13.8.) y otras construidas con alguna finalidad concreta.
paredes de cuarzo
radiacin
radiacin
flujo
Figura 13.8. Clula de flujo en forma de Z.
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En orden decreciente, en cuanto al nmero de aplicaciones, est la deteccin fluorimtrica. Este sistema de deteccin tiene el inconveniente derivado del limitado nmero de compuestos fluorescentes, si bien, presenta una serie de ventajas inherentes a la tcnica fluorimtrica en orden a su selectividad, bajos lmites de deteccin y coste relativamente bajo. La deteccin de elementos metlicos en un sistema FIA puede llevarse a cabo utilizando tcnicas atmicas con o sin llama. Una caracterstica importante de estos sistemas de deteccin es que no precisan clulas de flujo, pues el portador se aspira continuamente hasta el nebulizador del instrumento de absorcin atmica, fotometra de llama o unidad ICP.
. . h
ta T
inyeccin
t T'
Para la caracterizacin del fiagrama pueden utilizarse los siguientes parmetros: altura de pico, h, que se relaciona con la concentracin del analito, tiempo de residencia, T, que es el tiempo transcurrido desde la inyeccin hasta que se alcanza la seal mxima, tiempo de retorno, T', que es el comprendido desde que se alcanza la
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seal mxima hasta que vuelve de nuevo a la base, tiempo de arranque o de aparicin, ta, (el transcurrido entre la inyeccin y el inicio del fiagrama) y tiempo durante el cual aparece la seal, t. Para que un fiagrama quede definido, hay que conocer el tiempo de arranque, las coordenadas del mximo (T, h) y t.
SEPARACIONES EN FIA
La versatilidad del anlisis por inyeccin en flujo se pone de manifiesto al poder incorporar sistemas continuos de separaciones por dilisis, difusin de gases y extraccin lquido-lquido en los montajes ordinarios. Dilisis y difusin de gases. La determinacin de iones inorgnicos (Cl, Na+, PO43, etc) y molculas orgnicas de bajo peso molecular (glucosa, urea, etc) en muestras biolgicas requiere la separacin previa de especies de peso molecular elevado, como las protenas. Estos procesos pueden llevarse a cabo en un montaje FIA utilizando membranas hidroflicas de acetato de celulosa con dispositivos como el representado esquemticamente en la figura 13.10.
reactivo
membrana
detector
muestra
Figura 13.10. Separaciones por dilisis.
desecho
Los iones y las molculas pequeas pasan a travs de la membrana, mientras que las molculas grandes no lo hacen. La determinacin de amoniaco en sangre puede llevarse a cabo en un sistema FIA en el cual la muestra se inyecta en una disolucin de NaOH, con lo que se libera NH3, el cual difunde a travs de una membrana de tefln, y por reaccin posterior con un indicador puede determinarse su concentracin fotomtricamente. Un procedimiento anlogo se utiliza para la determinacin de CO2 en plasma. La muestra se inyecta en una disolucin de H2SO4, con lo que se libera CO2, el cual atraviesa una membrana de dimetil-silicona y posteriormente se pone en contacto con una disolucin reguladora de CO32/HCO3 conteniendo rojo cresol, midiendo
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Extraccin. La extraccin lquido-lquido es una tcnica de separacin utilizada en un cierto nmero de procedimientos analticos. Esta tcnica puede adaptarse con relativa facilidad al anlisis por inyeccin en flujo, para lo cual se requieren los componentes bsicos que se representan en la figura 13.11. La misin del segmentador es la obtencin de segmentos alternados y regulares de los lquidos inmiscibles correspondientes a las fases 1 y 2. En el serpentn de extraccin (reactor) tiene lugar la transferencia de materia entre los segmentos de ambas fases, y, finalmente, en el separador de fases se produce la separacin del fluido segmentado que entra, en dos flujos, cada uno con una de las fases.
Detector fase 2
Es importante indicar que ninguno de los mtodos de separacin de los sistemas de flujo llega a ser completo. De todas formas, esto no tiene consecuencias, debido a que las secuencias de tiempo son lo suficientemente reproducibles para que no se produzcan prdidas de precisin y exactitud,y, por otra parte, las muestras y los patrones se tratan de la misma manera.
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FACTORES FISICOS
Una muestra introducida, con una vlvula rotatoria, en un sistema de flujo presenta un perfil, en el momento de la insercin, como el representado en la figura 13.12.a. Si el perfil se mantuviera, por no existir dispersin, la seal producida en el detector (fiagrama) sera la indicada en la misma figura 13.12.a.
.
En realidad, el perfil de la muestra insertada se modifica debido al flujo laminar y a causa de la difusin. El transporte de materia en los sistemas FIA se produce en rgimen laminar, lo cual origina un perfil parablico de velocidades (figura 13.13.a.) ya que las partculas materiales del fluido que circulan por el centro del tubo lo hacen ms rpidamente que las partculas prximas a las paredes. El transporte por difusin se debe a la existencia de gradientes de concentracin, pudindose distinguir dos tipos: difusin axial (figura 13.13.b.), debida a gradientes horizontales de concentracin, y difusin radial (figura 13.13.c.), debida a diferencias de concentracin entre puntos situados perpendicularmente a la direccin del flujo. Mientras que la dispersin axial no es significativa en tubos estrechos, la radial es siempre importante en cualquier circunstancia. .
a. Flujo laminar
b. Difusin axial
c . Difusin radial
Por otra parte, el perfil de la muestra insertada depende del tiempo transcurrido
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desde la insercin. En los primeros momentos predomina el transporte por conveccin y el perfil es tpicamente parablico (figura 13.12.b.). El fiagrama terico estara constituido por un tramo vertical inicial, correspondiente a la salida del extremo de la parbola y una cola de cada de la seal. Al cabo de algn tiempo, la contribucin de la difusin radial comienza a ser significativa, por lo que se frena el avance por el centro y se redondean las colas finales (figura 13.12.c.). El fiagrama presenta un crecimiento casi vertical y una cola de retorno a la lnea base. Si el transporte se realiza durante bastante tiempo, la difusin radial puede colaborar en mayor medida que el transporte por conveccin. El perfil del bolo es ms redondeado, y la forma del fiagrama es una gaussiana casi perfecta (figura 13.12.d.). Este tipo no se da casi nunca, ya que debe transcurrir mucho tiempo o trabajar con caudales muy bajos, lo cual no suele ser habitual. Para caracterizar la dispersin suele utilizarse el parmetro propuesto por Ruzicka en 1977, denominado dispersin prctica, y definido por la expresin:
D= Co C
siendo Co la concentracin del analito de la muestra inyectada, y C la concentracin del pico en el detector despus de que haya tenido lugar el proceso de transporte en un determinado sistema FIA. El coeficiente de dispersin de un determinado sistema FIA puede determinarse fcilmente inyectando una muestra de un colorante y obteniendo la altura del pico, h, que ser proporcional a la concentracin, C. (figura 13.14.a.). Seguidamente, se sustituye el portador por el colorante, llenando completamente el sistema, con lo que se obtiene la seal ho, proporcional a Co. El coeficiente de dispersin siempre es un nmero superior a la unidad. Cuanto mayor sea D, menor es la seal obtenida (menor sensibilidad) y ms ancho es el fiagrama obtenido, con lo que disminuye la capacidad de muestreo (menor nmero de bandas por unidad de tiempo).
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colorante
portador
Detector
a
s colorante
Detector
ho
D
1
Q
2
Q > Q >Q3 1 2 Q3 .
t
b
Figura 13.15. Influencia del volumen de muestra y del caudal sobre la dispersin.
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La influencia de la longitud del tubo sobre la dispersin se muestra en la figura 13.16., donde se han representado diversos fiagramas superpuestos realizados con tubos de las longitudes que se indican en la figura, y manteniendo constante la velocidad de bombeo y el tamao de muestra.
.
s
20 cm
2
50 cm
D
100 cm 200 cm
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Se observa que tanto D, como ta e t aumentan con la longitud del tubo. Hay que mencionar que, adems de la longitud del tubo, influyen su forma (recto, serpentn, etc.) y, por supuesto, el relleno que eventualmente pueda contener.
FACTORES QUIMICOS
Las conclusiones expuestas anteriormente respecto a la influencia de diferentes parmetros sobre la dispersin, pueden no ser totalmente vlidas si existe una reaccin qumica adicional. En este caso, es imprescindible conocer la contribucin de la cintica a la dispersin, toda vez que las medidas en FIA se efectan en condiciones de no equilibrio. Si entrar en demasiados detalles, de forma general, si se produce una reaccin qumica en el sistema FIA y se mide una propiedad de algn producto de la reaccin, la contribucin qumica hace disminuir el valor del coeficiente de dispersin. Por el contrario, cuando se mide alguna propiedad de uno de los reactivos, el coeficiente de dispersin aumenta, como consecuencia de la reaccin qumica.
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Versatilidad. La sustitucin de cualquiera de los componentes de un sistema FIA y la incorporacin de otros es una operacin sencilla, lo cual permite la adaptacin segn las necesidades. Por otra parte, es posible incorporar a sistemas FIA instrumentos de uso normal en los laboratorios, como pH-metros, espectrofotmetros, fluormetros, etc. mediante clulas de flujo convencionales. Cuando se utilizan tcnicas espectroscpicas atmicas como sistemas de deteccin, incluso no es necesario utilizar esas clulas.
APLICACIONES
Un gran nmero de determinaciones por FIA se llevan a cabo en relacin con problemas de contaminacin ambiental y en el campo de la qumica clnica. En la figura 13.17. se muestra un esquema del sistema FIA usado para la determinacin de NH4+ mediante la reaccin de Nessler, as como las seales de tres patrones y una muestra, inyectados por triplicado, lo cual es prctica habitual en FIA.
Muestra
NaOH 2M
Detector
NaOH 2M
= 410 nm
R. Nessler
Bomba
Calibrado
Muestra
.
Figura 13.17. Montaje FIA para la determinacin de NH4+.
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Especie NH4+ Na+, K+ Ca2+, Mg2+ Al3+ NO3 NO2 SO42 PO43
Reaccin Nessler
rojo de pirogalol y n-tetradeciltrimetilamonio
Sensibilidad 200 g/L 0.22.4 mg/L 00.3 p.p.m. 105102 M 80800 mg/mL 5200 g/mL 3x107 M
Muestras/hora
40 500 80 20 90 70 60
Las determinaciones por FIA en el rea clnica suelen clasificarse en enzimticas y no enzimticas, en funcin de la utilizacin de enzimas como reactivos analticos. Cuando se utilizan enzimas poco caros y relativamente estables, pueden usarse en sistemas cerrados y directamente en disolucin, mientras que si son relativamente caros, suelen utilizarse inmovilizados. En la tabla 13.2. se muestran algunos ejemplos de aplicaciones del FIA a la determinacin de especies de inters clnico.
Tabla 13.2. Aplicaciones del FIA en Qumica Clnica
Especie NH3 Ca2+ Na+, K+ glucosa urea ac. rico ac. ascrbico
Tipo de muestras
Muestras/hora
sangre, plasma