Inmunologa General, 2 Medicina (2005-2006)

TEMA 7 SINTESIS DE INMUNOGLOBULINAS.

7.1 Estructura de los genes para las cadenas pesadas y ligeras de Inmunoglobulinas: diversidad potencial. La eficacia del sistema inmune depende de su mayor o menor capacidad de reconocer antgenos de forma especfica. Tanto las clulas B como las clulas T se encuentran implicadas en este reconocimiento, y aunque lo hacen de forma diferente, ambas poblaciones celulares pueden interaccionar con un gran nmero de antgenos distintos. El nmero total de receptores (tanto del linfocito T como del linfocito B) se denomina repertorio. Y se ha estimado que el repertorio de anticuerpos necesarios asciende a 109 molculas diferentes. La totalidad del genoma humano se empieza, apenas, a conocer, pero el nmero de genes no exceder en cualquier caso de los 50.000. Por lo tanto no tenemos un gen para cada posible anticuerpo, porque no nos caben 109 genes para anticuerpos en un total de 50.000. Para resolver esta aparente imposibilidad, los genes para los receptores especficos del sistema inmune (BcR y TcR) se han organizado en la evolucin de un modo especial. La organizacin de los genes que codifican las inmunoglobulinas (diapositivas 7.3 y 7.4) es caracterstica y asegura la generacin de la diversidad de anticerupos necesaria para responder a casi cualquier antgeno. La mayor parte de las protenas del organismo son codificadas por genes nicos. Esto no es as en el caso de las inmunoglobulinas, ya que para codificar los dominios variables, y a veces, los constantes de sus protenas, el genoma contiene mltiples versiones, ligeramente distintas, que se combinan entre s al azar. Genes para las cadenas pesadas: Todos los genes de las cadenas pesadas se encuentran localizados en el cromosoma 14. Los dominios constantes de las cadenas pesadas (CH) son codificados por un nico gen para cada isotipo. De modo que existen 9 genes C (constante) que no contribuyen a la diversidad ya que estos dominios slo modifican el isotipo y no la especifidad para Ag. El orden de estos genes C en el cromosoma 14 es siempre el mismo (diapositiva 7.4) y se nombran igual que el isotipo (o subclase) para el que codifican pero con la correspondiente legra griega (, , , ). En cambio, para codificar el dominio variable de la cadena pesada (VH), los genes se organizan en 3 grupos: V, D y J. Los genes V (variable) en un nmero de 50, a continuacin 30 genes D (diversidad) y 6 genes J (unin). Cada combinacin particular V-D-J codificar para un dominio variable diferente. La diversidad potencial de la cadena pesada de una inmunoglobulina es pues de: (50) x (30) x (6)= 9000 cadenas pesadas distintas Genes para las cadenas ligeras: Los genes de la cadena ligera se localizan en el cromosoma 2, y los de en el cromosoma 22. La disposicin de fragmentos en dichos cromosomas es siempre la misma (diapositiva 7.4). En el caso de : 40 genes V y 5 genes J que al unirse al azar (V-J) codifican para los distintos dominios variables (VL), y a continuacin un nico gen C. Para la cadena : 30 genes V, 3 genes J 3 genes C. La diversidad potencial de las cadenas ligeras es de 200 y 270 respectivamente (lo que suma 470). De este modo la diversidad potencial de anticuerpos = 9000 x ( 270 + 200) = 4 . 106 Igs posibles. Esta cantidad potencial queda lejos del repertorio necesario, como hemos dicho al inicio.
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Reordenamiento de los genes de Inmunoglobulinas: pesadas y ligeras:

Los segmentos gnicos que codifican las regiones variables de las inmunoglobulinas se encuentran muy separados en el genoma en todas las clulas del organismo, excepto en las del linaje B. La aproximacin de estos genes se produce en la mdula sea durante el proceso de maduracin de los linfocitos B y tiene lugar por un proceso de recombinacin entre los diferentes segmentos gnicos denominado recombinacin somtica. En el caso de la cadena ligera (diapositiva 7.5) uno de los fragmentos V se yuxtapone a un fragmento J por recombinacin somtica, eliminndose un gran segmento de DNA. Este fenmeno de reordenamiento de genes ocurre durante la maduracin del linfocito B en la mdula sea. Esta recombinacin posibilita la sntesis de un RNA mensajero con los segmentos V, J y C necesarios, que se alinearn por excisin intrnica (se eliminan grandes segmentos de RNA en el procesamiento). As el dominio variable de la cadena ligera est codificado por los segmentos V-J yuxtapuestos, y el dominio constante est codificado por el segmento C. En las cadenas pesadas (diapositivas 7.6, 7.9, 7.12 y 7.13), y tambin en los precursores de linfocitos B, una de las versiones del fragmento D se yuxtapone a una versin del fragmento J en un primer paso de recombinacin. Despus una versin de V se recluta para yuxtaponerse a las anteriores. Em ambas recombinaciones, hay prdidas de grandes fragmentos de DNA. Ahora ser posible la transcripcin de un RNAm con los segmentos V-D-J-C necesarios. Estos segmentos se alinearn definitivamente durante el procesamiento (ayuste) del RNA mensajero. La inmunoglobulina resultante tendr el dominio variable codificado por los fragmentos V-D-J, y los dominios constantes codificados por el fragmento C. El que dicha inmunoglobulina sea de membrana o soluble depender de que en el procesamiento del RNA se incluyan o no los exones que codifican para la porcin transmembranal y citoplasmtica de la protena. Y la inmunoglobulina ser IgM o IgD tambin dependiendo de dicho procesamiento del RNA. El resto de isotipos no se pueden producir inicialmente, ya que requieren cambios adicionales en el DNA. De modo que las inmunoglobulinas que puede producir un linfocito B maduro inicialmente son: -mIgM, sIgM, mIgD, sIgD (donde s y m indican soluble o membrana). No se conocen en detalle los mecanismos moleculares de recombinacin somtica, pero se han encontrado secuencias muy repetitivas antes y despus de cada fragmento gnico y que parecen actuar como seales de recombinacin. Estas seales (diapositiva 7.7) constan de una secuencia de 7 pares de bases (heptmero) y otra de 9 (nonmero) separadas por una regin espaciadora de 12 o 23 bases. Estas seales de recombinacin son reconocidas por enzimas especializadas (recombinasas) RAG1 y RAG2, que al aproximarse entre s, son responsables de la aproximacin al azar entre los fragmentos formando un bucle en el ADN, que se estabiliza por los palndromos entre los heptmeros y nonmeros sealizadores. A continuacin, las recombinasas, resuelven el bucle cortando, ligando los 2 fragmentos y esciendiendo los flecos (en forma de ADN circular). En este corte y empalme de los fragmentos, que tiene imprecisiones se arrastran nucletidos al azar (son los llamados nucletidos P, de palindrmicos). Debido a que el sistema de reordenamiento tiene muchas imprecisiones, tanto en los linfocitos B como en los T pueden ocurrir errores al reordenar los fragmentos produciendose protenas abortivas (codn STOP o cambio en la pauta de lectura) al
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azar que no valen para nada. Son los reordenamientos no productivos (diapositiva 7.8). Por ello, tanto en el procesamiento de cadenas pesadas como ligeras pueden rescatarse reordenamientos iniciales no productivos y volver a reordenar los cromosomas correspondientes al azar hasta obtener reordenamientos productivos. Una vez conseguido un reordenamiento productivo existe una seal que paraliza el proceso. 7.3 Mecanismos de amplificacin del repertorio: Diversidad de unin y Mutacin somtica (diapositiva 7.10) Hemos dicho que con las combinaciones de todas las cadenas ligeras y pesadas se pueden obtener 4 millones de Ac distintos. Se sabe que el organismo puede producir hasta 109 clases de Ac. Por tanto se hacen necesarios una serie de mecanismos que permitan aumentar ms an la diversidad de Ac en el organismo. a) Diversidad de las uniones. Estos mecanismos actan en la mdula sea. Se produce porque la recombinacin somtica VDJ (en cadenas pesadas) VJ (en cadenas ligeras) no es un mecanismo de alta precisin. De modo que el corte y empalme entre los diferentes fragmentos no es siempre igual, aunque participen los mismos fragmentos. Los nucletidos arrastrados al azar en los procesos de recombinacin somtica reciben el nombre de nucletidos P (y son responsables de un gran incremento en la variabilidad, pero tambin de posibles cambios en la pauta de lectura que daran lugar a protenas abortivas). Los nucletidos P se aaden tanto en las cadenas ligeras como en las pesadas. Adems el punto de corte en el DNA de los 2 fragmentos puede variar, producindose codones alternativos que codificaran para diferentes aminocidos (diapositiva 7.10 inferior izquierda). Pero adems, y slo en cadenas pesadas, le enzima deoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) puede aadir unos pocos nucletidos al azar sin molde en las zonas de uniones VD y DJ. Su incorporacin genera una considerable diversidad. A estos nucletidos se les denomina nucletidos N. (diapositiva 7.10 superior izquierda). b) Mutaciones somticas. (diapositiva 7.10 derecha). Ocurre en linfocitos B maduros cuando se encuentra en los rganos linfoides secundarios activndose frente a un antgeno. Experimentalmente se ha podido comprobar que al introducir un antgeno en un ratn al cabo de unos das aparecen mutaciones en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras. Despus, si existe inmunizacin secundaria se observan an muchas ms mutaciones en las regiones variables. Como resultado de estas mutaciones se originan anticuerpos mucho ms especficos que los originales (tambin pueden aparecer anticuerpos peores o truncados, en cuyo caso esos linfocitos B no progresan). 7.4 Expresin de las Igs en el BCR: Exclusin allica y Cambios de Isotipo

Se denomina exclusin allica al fenmeno por el cual tras la sntesis de una Ig funcional o productiva se detiene el reordenamiento (las recombinasas se paran y no se producen ms bucles). As cada clula B slo tiene un tipo de Ac en su superficie o secretado. La clula B madura solo puede sintetizar IgM o IgD como hemos visto anteriormente. Para sintetizar otros isotipos tiene que pdoducirse el denominado cambio de isotipo. El cambio de isotipo se produce varias veces en una lnea clonal (diapositivas 7.11 y 7.14) y no implica a las regiones variables (que se mantienen constantes, por ejemplo V1D3J9),
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sino a los genes constantes. Es muy frecuente en clulas B en la mdula sea. El cambio de isotipo, es un nuevo proceso de reordenamiento del ADN, en el que se van perdiendo genes constantes de las diferentes cadenas pesadas. Se puede producir mltiples veces en la vida de un clon, pero es irreversible (si se ha cambiado de IgM a IgE, esa clula jams producir IgM de nuevo). El lmite lo pone cuando se cambia al isotipo IgA2 (puesto que el gen C2 es el ltimo gen constante en el cromosoma 14) El cambio de isotipo es inducido durante la cooperacin entre Linfocitos B y T, las clulas T obligan a las clulas B activadas a reordenar de nuevo su DNA para moverse a nuevos segmentos constantes adyacentes a los segmentos VDJ. Estas clulas y su progenie cambian de secretar Ig M a otros isotipos. Para esto es preciso un contacto clula a clula entre T y B que esta mediado por el CD40L y CD40, respectivamente. Pero adems, el linfocito T secreta diferentes citocinas (diapositiva 7.15) que le dan la seal de cambio de isotipo especfica al linfocito B: as IL 4 , que activa la sntesis de IgE, IFN activa la sntesis de IgG, TGF induce el cambio al isotipo IgA, y por ltimo la accin conjunta de IL-4 e IL-13 induce la sntesis de IgM sin cambio de isotipo.

7.5 Maduracin de los linfocitos B: Secuencia de eventos genticos, Cooperacin T-B, Delecin de clones autorreactivos y Subtipos de linfocitos B Como ya hemos dicho al inicio, el proceso de maduracin sucede en la mdula sea. (diapositiva 7.16) Las clulas pro-B tempranas reordenan en primer lugar los fragmentos D-J de la cadena pesada. A continuacin en la etapa pro-B tarda se reordenan V-DJ. Cuando se produzca un reordenamiento productivo, se prodr sintetizar cadena pesada. Esto le permite en la fase pre-B grande expresar una inmunoglobulina incompleta (pre-BcR), con cadena pesada adecuada pero una cadena ligera alternativa. Es en el estado pre-B pequeas cuando se reordenan las cadenas ligeras (primero y luego , si fall la primera). Cuando se expresa una cadena ligera productiva, ya se expresa una inmunoglobulina completa en superficie (B inmadura) del isotipo IgM. Finalmente, en la ltima etapa de maduracin se co-expresarn en superficie IgM e IgD (B madura). Los pasos que sigue la clula en los procesos de reordenamiento de las cadenas pesadas y ligeras en los diferentes estados de diferenciacin se resumen en la diapositiva 7.17 a modo de algoritmo. Como se aprecia hay mltiples posibilidades, por eso aunque los procesos de reordenamiento sean imprecisos, hay bastantes posibilidades de que los precursores B progresen y maduren. Para que un linfocito B se active y sintetice inmunoglobulinas es casi siempre necesario la denominada Cooperacin entre las clulas B y clulas T (diapositiva 7.18). La clula T (normalmente TH2) se adhiere a la clula B por medio de las molculas de adhesin CD40L (en el linfocito T) y CD40 (en el linfocito B). Tras la unin el Linfocito T reorienta su aparato secretor (como se aprecia con la talina) hacia la zona de contacto con el linfocito B. Y justo en la zona de contacto es donde secreta las citocinas (no en toda la superficie celular como podra pensarse, ver tincin de secreccin de IL-4). La citocina le dar al linfocito B la seal correspondiente para el cambio de isotipo, si este es necesario. La clula B se diferenciar a clulas plasmtica y sintetizar anticuerpos (diapositiva 7.19) habitualmente en la mdula sea.

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Pero adems de inducir el cambio de isotipo, la cooperacin entre LB / LT juega un papel importante en la eliminacin de clones autorreactivos (en linfocitos B maduros). As, en la mdula sea en la fase B-inmadura, si los linfocitos B que expresan IgM reconocen autoantgenos (diapositiva 7.22) en las clulas del estroma de la mdula sea: al no recibir seales de cooperacin por parte de una clula T, entran en apoptosis y mueren (Deleccin clonal). Alternativamente, si la IgM de las clulas B inmaduras reconoce sustancias propias en solucin, como la albmina: dicha clula cambia su isotipo a IgD y se vuelve anrgica. (intil, no se podr activar nunca). As que las cluas B inmaduras cuya IgM no reconozca nada propio en la mdula, sufrirn la ltima etapa de diferenciacin, co-expresarn IgM e IgD (B-maduras) y migrarn a la periferia. Pero en la mdula sea no estan representados todas las protenas de nuestro organismo (potenciales autoantgenos). Si los linfocitos B maduros se encuentran que al entrar en algn tejido su inmunoglobulina de superficie es especfica para protenas propias: si el autoantgeno es de superficie, en ausencia de cooperacin, entrarn en apoptosis y morirn. Si el autoantgeno es soluble, en ausencia de cooperacin, dejan de expresar IgM, expresan slo IgD y por lo tanto entran en anergia. Todo lo que hemos comentado en este captulo hasta el momento, hace referencia a una subpoblacin de linfocitos B mayoritaria, son las denominadas clulas B-2. Pero hay otra poblacin minoritaria, menos evolucionada que se diferencia antes (en el feto) y que se denominan clulas B-1 (diapositiva 7.20). Estas clulas se distinguen por expresar en su superficie el antgeno CD5 (las B-2 no lo expresan) y se han implicado en algunas enfermedades autoinmunes. Son clulas mas primitivas, aparecen antes en el desarrollo, carecen de algunas enzimas importantes, y se han equiparado a las clulas T-. Tienen una especificidad menor (diapositiva 7.21), no sufren mutacin somtica y apenas cambio de isotipo (producen IgM mayoritariamente), pero producen ms cantidad de anticuerpos que las clulas convencionales B-2.