Asignatura: MICROBIOLOGA Carrera: Enfermera Profesora: Carmen Teuber L.

PRCTICO N 1 TCNICAS

A) MTODOS DE ESTERILIZACIN Objetivos: Adquirir experiencia en el manejo de equipos de esterilizacin y aplicar mtodos de desinfeccin y esterilizacin empleando distintos agentes fsicos o qumicos.

Agentes fsicos Calor hmedo (autoclave) El uso del autoclave que incluye: 1) Preparacin del material a autoclavar. 2) Carga del autoclave con el material a esterilizar o decontaminar. 3) Cierre del autoclave y encendido. 4) Eliminacin del aire contenido en su interior (hasta emisin de chorro continuo de vapor por la espita o vlvula de descarga). 5) Cierre de la vlvula de descarga y control hasta llegar a la presin y temperatura de esterilizacin deseada. (1,5 atmsfera a 121 C). 6) Control del tiempo de esterilizacin requerido. (15). 7) Apagado del autoclave. 8) Al bajar la presin, se abre la vlvula. 9) Retirado del material autoclavado. 10) El material decontaminado se lava y se lleva a la estufa de secado quedando listo para reutilizarse.

Se esterilizan distintos materiales de vidrio y otros que resistan la temperatura, como as tambin soluciones y medios de cultivo. Tambin se decontamina material que contenga cultivos bacterianos (en especial cultivos de microorganismos que forman esporas). Se realizan controles de esterilidad despus del autoclavado para verificar que el proceso fue eficiente. Calor seco (horno) 1) Preparacin del material a esterilizar. (Envuelto y taponado). 2) Carga del horno. 3) Control hasta llegar a la temperatura de esterilizacin. (180 C). 4) Control del tiempo de esterilizacin. (2 horas). 5) Apagado, enfriado y apertura del horno. Se esterilizan materiales que no puedan autoclavados y/o que resistan altas temperaturas. ser

Incineracin por llama Flameado de la boca de botellas, frascos y tubos y esterilizacin y decontaminacin del ansa que se emplea para transferir cultivos bacterianos.

Radiacin ultravioleta Se emplea la radiacin ultravioleta como agente desinfectante o esterilizante. La radiacin ms germicida es aquella con una longitud de onda de 254 nanmetros. El ADN expuesto a esta energa presenta un mximo de absorcin, producindose una inactivacin irreversible en el crecimiento de los grmenes. Se ponen debajo de la luz U.V. objetos que no puedan autoclavarse ni hornearse ( Ej: tapas plsticas, membranas filtrantes, etc.). Tambin se utiliza en la desinfeccin de agua.

Filtracin Esterilizar lquidos que contienen componentes sensibles al calor como protenas, vitaminas, antibiticos y soluciones salinas definidas. Se emplean filtros de celulosa utilizando vaco o presin positiva.

Agentes qumicos Se emplean distintos agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de hipoclorito de sodio, cloroxilenol, formaldehido, alohol iodado, etc.) para desinfectar superficies. Se analizar la reduccin de la cantidad de microorganismos presentes en una mesa de trabajo, pasando un hisopo con el que se sembrarn placas conteniendo agar nutritivo, antes y despus de haber sido tratada con el desinfectante en cuestin.

B) TCNICAS MICROBIOLGICAS BSICAS Objetivos: Adquirir experiencia en el manejo de los materiales y tcnicas bsicas que se utilizan en los trabajos prcticos de Microbiologa. Reforzar los conocimientos previos sobre el trabajo de laboratorio en condiciones de esterilidad. Coordinar la operativa de trabajo en el laboratorio y las normas de seguridad.

En todos los prcticos que se realicen en condiciones de esterilidad se debe, en primer lugar, limpiar el rea de trabajo del mesn con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero. Preparar material de vidrio estril para ser utilizado en los prcticos. Esterilizar en Horno Pasteur a 180 C por 2 horas. Placas de Petri: limpias y secas, envolver en papel. Pipetas: taponar con algodn hidrfobo y envolver Preparar medios de cultivo. Se pesa la cantidad proporcional al volumen que se va a preparar (la referencia del fabricante est dada en gramos de medio por litro de agua destilada). Esterilizar en autoclave a 121 C por 15. Lquido: disolver en un matraz y distribuir en tubos. Taponar y esterilizar en autoclave Slido: disolver en un matraz a baomara, taponar y esterilizar en autoclave. Distribuir en placas de Petri. Esperar que el medio solidifique y luego secar las placas invertidas en estufa a 37 C. Preparar tubos con 9 ml de solucin salina para realizar diluciones seriadas decimales desde 10-1 hasta 10-4. Esterilizar en autoclave: Agregar al tubo rotulado 10-1, 1 ml de de muestra. Descartar la pipeta. Homogeneizar en agitador. Con una nueva pipeta tomar 1 ml del tubo anterior y descargar en el tubo rotulado 10-2. Continuar haciendo las diluciones hasta 10-4. Preparar medios de cultivo en tubos con campana Durham para determinacin de NMP de coliformes. Sembrar: con ansa por estriado sobre agar con pipeta y posterior rastrillado sobre agar

C) TCNICAS BSICAS DE SIEMBRA

Procedimiento para obtener colonias aisladas estriando en placa: A) Flamear el ansa B) Obtener un inculo con ella (en forma estril) C) Estriar con el ansa en medio estril contenido en una placa de Petri siguiendo uno de los modelos mostrados en D.

Procedimiento para preparar una placa por volcado (aislamiento en profundidad). A) Fundir el medio contenido en un tubo y luego enfriarlo hasta que se lo pueda tomar con la mano sin quemarse. B) Flamear el ansa C) y D) Transferir microorganismos al medio con el ansa. E) Agitar rotando el tubo entre las manos para que se homogenice bien. F) Volcar en una placa de Petri estril. G) Agitar con un movimiento rotatorio hasta asegurar una buena distribucin. H) Incubar boca abajo. Un mtodo alternativo muy usado es volcar en la placa vaca una suspensin bacteriana y luego con el medio fundido y enfriado segn A) volcarlo y efectuar los pasos G) y H).

Siembra en agar inclinado (pico de flauta) por estra. A) Flamear el ansa B) Obtener material a sembrar C) Apoyar el ansa sobre la superficie del agar y estriar con el diseo mostrado en D)

Inoculacin por puncin A) Flamear un ansa recta B) Sumergirla una vez fra, en una suspensin bacteriana C) Punzar cuidadosamente en el centro del tubo hasta el fondo y retirar el ansa cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino que para la inoculacin. D) Flamear el ansa E) Incubar el tubo