Preparacin de Buffer Lisis: 100 ml Vo inicial NaCl = 0,1 M Tris HCl = 0,1 M MgCl2 = 0,05 M W = M * (P.

M * L) W NaCl = 0,1M * (58,5 grs * 0,1 Ltrs) = 0,585 grs W Tris HCl= 0,1M * (121,1 grs * 0,1 Ltrs) = 1,21 grs W MgCl2 = 0,05 M * (203,3 grs * 0,1 Ltrs) = 2,033 grs para regular el pH de la solucin se aadi 1200 l de HCl pH = 7

EXTRACCION DE ADN 1. Toma de muestra de sangre de 5 m l: Tubo # 1 Mauricio Tubo # 2 Mauricio Tubo # 3 Aid Tubo # 4 Aid 2. Se centrifugaron las muestras durante 10 minutos a velocidad mxima. 3. Se descarto la fase superior, se tomo la fase intermedia (capa blanca y delgada), en cada uno de los cuatro tubos y esta fase se lleva a otros nuevos tubos. Y se les agrega 4 ml de: Buffer Lisis a los tubos # 1 y # 2; y Buffer comercial Lytic Agent a los tubos # 3 y # 4. 4. Se centrifugan las muestras durante 10 minutos a velocidad mxima . 5. Descartamos el sobrenadantes y agregamos: Tubos # 1 y # 2 2ml Buffer Lisis + 1 ml SDS 2% Tubos # 3 y # 4 2ml Buffer comercial Lytic Agent 6. Se centrifugan las muestras durante 10 minutos a velocidad mxima. 7. Descartamos el sobrenadantes y agregamos: Tubos # 1 y # 2 1ml Buffer Lisis + 1 ml SDS 2% Tubos # 3 y # 4 1ml de agua desionizada Se mezclo bien hasta desintegrar las clulas. 8. Se paso 1ml de cada una de las soluciones trabajadas a tubos eppendorf de 2ml (4 tubos). 9. Se agrego a cada tubo 1ml de solucin 1:1 fenol cloroformo(0,5 ml de c/u); se mezclo bien. 10. Se llevaron a centrifuga para eppendorf UNIVERSAL 320R Heltich Zentrifugen, durante 5 minutos a 10000 rpm. 11. Se tomaron 0,5 ml de sobrenadante de cada tubo de muestra y se les aade 30 l de acetato de sodio 3M pH 5.2 + 1,5 ml de etanol absoluto (pre enfriado a -20 c). Se aplico el etanol absoluto de manera pausada para observar la formacin de hebras de ADN. 12. Se llevaron los 4 tubos a centrifuga para eppendorf UNIVERSAL 320R Heltich Zentrifugen, durante 10 minutos a 13000 rpm y a 4c. Se descarto el sobrenadantes.

13. El precipitado obtenido se lavo agregndole a cada uno de los 4 tubos de eppendorf 500 l de etanol absoluto al 70% pre enfriado (150 l de agua destilada + 350 l de etanol absoluto). Se centrifugaron los tubos durante 5 minutos a 13000 rpm y a 4c. Se descarto el sobrenadantes y se obtuvo el pellet. 14. Se procedi a secar el pellet agitando con cuidado sobre una tolla absorbente, y llevando los 4 tubos eppendorf abiertos al horno a 37c durante10 minutos. Se agrego a cada tubo 50 l de TE y se re suspendieron en el homogenizador.

ELECTROFORESIS 1. En papel sembramos 5 l de buffer de carga y 10 l de cada una de las muestras (7), para el control sembramos 5 l de buffer de carga y 10 l de TE; se re suspendi y se procedi a tomar cada muestra y sembrarla en los pocillos como se indica en el cuadro N 1. El gel corri durante 30 minutos, tiempo en el que las bandas azul y naranja se fijaron por completo, se saco la placa del gel y se coloco en el rotador durante 15 minutos para homogenizar la muestra. Pasado los 15 minutos se saco la placa y se coloco en agua para lavar la muestra. Se lleva la muestra al trans-iluminador. Cmara de electroforesis:

R = 129 v / 0,026 a = 4961,54 (ohmios) Se observaron bandas de ADN en los pozos P3 y P9, muestras del compaero Mauricio Seplveda.

PCR
Calculamos la temperatura melting para los primers que se emplearon: Tripanosoma 1 (5 AAATAATGTACGGG(T/G)GAGATGCATGA 3) 2 (5 GGTTCGATTGGGGTTGGTGTAATATA 3) Tm T1= 2(A+T) + 4(G+C) = 2(10+6) + 4(9+2) = 32 + 44 = 76 c Tm T2= 2(A+T) + 4(G+C) = 2(5+10) + 4(10+1) = 30 + 44 = 74 c + Tm 80 - 78 72 - 70

-globulina 1 (5 ACACAAACTGTGTTCACTAGC 3) 2 (5 CAACTTCATCCACGTTTTCACC 3) Tm -g1= 2(A+T) + 4(G+C) = 2(7+5) + 4(3+6) = 24 + 36 Tm -g1= 2(A+T) + 4(G+C) = 2(5+7) + 4(1+9) = 24 + 40 = 64 c + Tm 64 - 68 56 - 60

= 60 c

Posteriormente del clculo de la temperatura procedimos a: Desinfectar el rea y material de trabajo con hipoclorito para evitar contaminacin de las muestras con amplicones. 1. Se tomaron 4 tubos PCR en los que se agregaron los ingredientes de la mezcla patrn en el siguiente orden y cantidades: 27,5 l agua tipo 1 (desionizada, bidestilada y estril) 8 l MgCl2 5 l buffer PCR 2 l primers 2 l dNTPs 5 l DNA plantilla 0,5 l Taq gold

2. Despus de haber aplicado a cada tubo la mezcla patrn, se homogenizo la muestra, y se llevo a la centrifuga. 3. Los 4 tubos se llevaron al termociclador y se programo: 33 ciclos Se desnaturalizo durante 1 minuto a 94 c 1 luc 1 minuto a 98 c 2 minutos a 64c El ultimo ciclo se programo durante 10 minutos a 72c, para logra extender la muestra 4. Para realizar la electroforesis en el papel se sembraron 6 muestras: la primera fue el blanco, de la 2 a la 5 se aadi 5 l de buffer de carga + 15 l de las muestras, y en la sexta 3 l de marcador + 10 l H2O tipo III + 5 l de buffer de carga; se re suspendi y se procedi a tomar cada muestra y sembrarla en los pocillos como se indica en el cuadro N 3.