Tecnolgico de Monterrey del Sistema Tecnolgico de Monterrey

Campus Estado de Mxico Laboratorio de Ingeniera Gentica

M. en C. Abril Saint Martn Lab. Octavio Snchez

Prctica 12 Caracterizacin del vector recombinante por restriccin

Alex Alberto Ramrez Rodrguez 968004 Michelle Roth San Vicente 1161458 Anel Aline Acosta Navarro 1161160 Jorge Mauricio Mancilla Morena 1166613

25/11/11

Introduccin
En 1971 Daniel Nathans y Kathleen Danna escribieron el artculo Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae (1) en el cual describen el aislamiento de una enzima de cepa bacteriana que se utiliz para cortar DNA vrico por secuencias especficas de nucletidos (2). Estas enzimas son llamadas enzimas de restriccin o endonucleasas(3) las cuales se producen como un mecanismo de defensa contra las infecciones vricas por las bacterias, se han logrado identificar ms de 200 enzimas de restriccin de las cuales aproximadamente 100 son utilizadas por los cientficos de manera rutinaria. Las enzimas de restriccin actan unindose al DNA al reconocer una secuencia especfica de nucleotidos, mejor conocida como secuencia de reconocimiento; una vez que se ha unido a esta secuencia corta ambas cadenas siguiendo un patrn de corte especfico. Estas enzimas se utilizan mucho en la clonacin por su capacidad de cortar DNA de forma muy precisa y reproducible en fragmentos llamados fragmentos de restriccin, el tamao de estos fragmentos va a depender del nmero de cortes realizados por la enzima de restriccin usada, sin embargo el tamao real va a ser variable ya que el nmero y la ubicacin de las secuencias de reconocimiento no siempre van a estar distribuidas aleatoriamente en el DNA (2). Una de las primeras enzimas de restriccin que se identifico fue la EcoRI la cual fue aislada de la cepa R de Escherichia coli (2). Existen tres tipos de enzimas de restriccin (3): Actividad Tipo I Tienen actividad de restriccin y modificacin (metilacin) Cortan lejos de la secuencia de reconocimiento (ro arriba o ro abajo) Necesitan ATP para moverse desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio donde cortaran Tipo II Tipo III Solo tienen actividad Tienen actividad de de restriccin restriccin y modificacin (metilacin) Cortan dentro de la Cortan 5-8 bases secuencia que antes o despus de la reconocen secuencia que reconocen No necesitan de ATP, Necesitan ATP para solo necesitan Mg++ moverse desde el como cofactor lugar de reconocimiento hasta el sitio donde cortaran

Sitio de corte

Requerimientos

Tabla 1. Podemos ver las caractersticas de cada uno de los tipos de enzimas de restriccin que existen.

Al cortan, las enzimas de restriccin pueden producir 2 tipos de cortes(4): Cohesivos: estos extremos se generan cuando la enzima corta las dos hebras asimtricamente dejando los extremos de cada hebra como complementarios entre si.

Figura 1. En esta imagen se puede ver la forma en que cortan las enzimas de restriccin provocando la formacin de los extremos cohesivos. Obtenida de: http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologia-del-adnrecombinante/como_cortar_y_pegar_el_adn_tij.php

Romos: estos extremos se generan cuando la enzima corta a ambas hebras en el mismo lugar lo que genera dos extremos de doble cadena.

Figura 2. En esta imagen se puede ver la forma en que cortan las enzimas de restriccin provocando la formacin de los extremos romos. Obtenida de: http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologia-del-adnrecombinante/como_cortar_y_pegar_el_adn_tij.php

Las enzimas de restriccin reciben se nombran a partir de la bacteria de donde son extradas; la primera letra se toma del gnero de la bacteria, las siguientes dos letras indican la especie, la cuarta nos indica la cepa y el nmero nos indica el nmero de enzimas que se han aislado de esa cepa. Por ejemplo en EcoRI (3): E porque pertenece al gnero de Escherichia co porque pertenece a la especie de coli R proviene de la cepa RV 13 I por ser la primera enzima de restriccin aislada de esta cepa

Existen diversos factores que se deben tomar en cuenta al trabajar con las enzimas de restriccin, ya que pueden llegar a afectar su actividad, como (3): La pureza del DNA, ya que si existe una contaminacin de protenas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, entre otras puede llegar a inhibir la actividad de las enzimas de restriccin. La temperatura y el pH pueden llegar a afectar tanto su actividad como su estabilidad Si hay presencia de DNAsas pueden provocar la degradacin del DNA cuando hay presencia de Mg++

 Algunas enzimas de restriccin pueden ser degradas cuando existe la metilacin Se debe poner el buffer adecuado para que la enzima cuente con las condiciones ptimas para que pueda llevar a cabo su trabajo. En esta prctica utilizaremos diferentes enzimas de restriccin para cortar nuestro vector recombinante (TOPO-TA + gen de actina de Rattus Norvergicus) con el objetivo de determinar si nuestro DNA recombinante fue realizado correctamente, esto se comprobara mediante la visualizacin del producto de la digestin en un gel de electroforesis.

Metodologa
1. Se saca el vector pGFPuv, que previamente fue extrado utilizando la tcnica de lisis alcalina y precipitacin con isopropanol; del congelador de -20C y se calienta con las manos hasta que se derrita y se pueda tomar con una micropipeta, posteriormente se pone en hielo junto con el vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina-ITESM el cual fue preparado en esta ocasin por la maestra Abril Saint Martn. Objetivo: Se debe de descongelar el vector pGFPuv para que pueda ser succionado por la micropipeta y se mantiene en hielo para evitar la degradacin del DNA por ese mismo motivo el vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina-ITESM tambin se encuentra en hielo. Nota: Durante este experimento se utiliz el vector pGFPuv como control positivo ya que es un vector que se encuentra inicialmente cerrado, y el vector pcDNA4/HisMax-TOPO - ITESM actina ser el vector experimental que se someter a la digestin con tres enzimas de restriccin diferentes. 2. En un tubo eppendorf de 0.5ml se adicionan los siguientes reactivos en el orden en el que aparecen: Agua (bidestilada), este tipo de agua se encuentra extremadamente desionizada y se considera de gran pureza, ya que est en su gran mayora libre de sales y otros contaminantes. Objetivo: Se utiliza el agua para aforar hasta 20l y as tener un volumen considerable para poder realizar el corrimiento de un gel electrofortico. BSA, por sus siglas en ingls, es la albmina de suero bovino y se utiliza solamente con aquellas soluciones que contengan la enzima de restriccin NotI. (5) Objetivo: la finalidad de usar este aditivo es evitar la adherencia de la enzima de restriccin NotI a la superficie del tubo de reaccin o a la punta de la micropipeta, aunque tambin tiene capacidad para brindar estabilidad a algunas protenas y enzimas durante el perodo de incubacin de la muestra. Nota: En caso de que no se use la enzima de restriccin NotI se deber de agregar el volumen proporcional de agua bidestilada. Buffer: En caso de usar como enzima de restriccin EcoRI se requiere del buffer 1X NEBuffer EcoRI que est compuesto por: (6) * 50 mM NaCl ayuda a crear una ambiente isotnico o hipertnico de sales

y ayuda a tener un pH entre 7.4 y 8. (7) * 100 mM Tris-HCl amortigua una variacin grande de pH. * 10 mM MgCl2 ayuda como cofactor para que se lleva a cabo la reaccin enzimtica. * 0.025 % Triton X-100 Es un surfactante inico empleado para facilitar la disolucin de proteasas en agua. (8) El cual tiene un pH de 7.5 a una temperatura aproximada de 25C En caso de usar como enzima de restriccin NotI o ScaI se utiliza el buffer NEbuffer3 el cual contiene: *100 mM NaCl ayuda a crear una ambiente isotnico o hipertnico de sales y ayuda a tener un pH entre 7.4 y 8. (7) *50 mM Tris-HCl amortigua una variacin grande de pH. *10 mM MgCl2 ayuda como cofactor para que se lleve a cabo la reaccin enzimtica. *1 mM Dithiothreitol conocido como DTT es una molcula que acta como un fuerte agente reductor, y sirve para evitar la dimerizacin del DNA y aumentar el grado de xito de las reacciones al hacer que ms cadenas de DNA reaccionen. (9) Y tiene un pH de aproximadamente 7.9 a una temperatura de 25C. Objetivo: El objetivo de aadir el buffer es proteger al DNA de variaciones en el pH y facilitar la actividad de las enzimas de restriccin creando un entorno ptimo para su funcionamiento. Nota: Todos los buffers empleados durante esta prctica son del proveedor New England BioLabs Inc. Y sus datos de nombre, nmero de lote y nmero de serie son los siguientes: 1X NEBuffer EcoRI Lote: 0031003 Nmero de serie: B0101S NEBUFFER 3 10X concentrado Lote: 0021101 Nmero de serie: B7003S

Despus de le aadi el vector todos los equipos aadieron el vector pGFPuv para el control positivo junto con la enzima EcoRI y para la parte experimental se utiliz el vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina -ITESM.

Objetivo: Que las enzimas de restriccin pudieran cortar en distintas secuencias el vector ara identificar diferentes bandas dependiendo de las enzimas empleadas. El pGFPuv se utiliza como control ya que est cerrado por lo que un corte y su linearizacin corroborara la actividad de las enzimas; mientras que el vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina-ITESM se encuentra linearizado. Se le aade la(s) enzimas de restriccin a la mezcla, cada equipo utiliz diferentes enzimas las cuales se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 muestra las enzimas con las que trabajo cada equipo.

Equipo Equipo 1 Equipo 2 Equipo 3 Equipo 4 Control

Enzimas de Restriccin ScaI NotI + EcoRI EcoRI NotI EcoRI

Vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM pGFPv

Las cantidades que cada equipo utiliz en la elaboracin de su experimento se muestran en la tabla 3.
Tabla 3 Muestra los componentes de los tubos de eppendorf de cada equipo

Vector ER Buffer

Agua (bidestilada) BSA Total de l

Equipo 1 Topo ScaI 1l 1l 2l NEbuff er3 16l --20 l

Equipo 2 TOPO EcoRI + NotI 1 l 1 l (c/u) 2 l NEbuffer3 14 l 1 l 20 l

Equipo 3 TOPO EcoRI 1 l 1 l 2 l NEBuffer EcoRI 15 l 1 l 20 l

Equipo 4 TOPO NotI 1 l 1 l 2 l 1X NEbuffer3

Control Equipo 1 pGFPuv EcoRI 4.1588l 1g 1l 2l 1X NEBuffer EcoRI

16 l ---20 l

12.84l --20 l

La concentracin del vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM era de 1M ya que estaba en una relacin de 1g/l; y del vector pGFPuv se utilizaron los l correspondientes a 1g. Objetivo: Que cada equipo obtenga diferentes patrones de banda dependiendo de las enzimas de restriccin empleadas. La finalidad del control positivo, en este caso el vector pGFPuv es verificar que las enzimas efectivamente corten.

3. Los tubos se colocan en un termoblock a una temperatura de 37C y se dejan incubar toda la noche, aproximadamente de 12:30pm hasta las 7:00am (Morales, comunicacin personal). Objetivo: se debe de esperar a que las enzimas acten sobre el vector para que se puedan realizar los cortes correspondientes y verificar los resultados en un gel de electroforesis. 4. Despus de que hayan pasado 17 horas aproximadamente se sacan los tubos del termoblock, se secan y se colocan en el congelador de -20C. Objetivo: preservar la muestra para posteriormente hacer el corrimiento de un gel de electroforesis. Procedimiento post prctica (Saint, comunicacin personal) 5. Se pes 0.4g de agarosa en un vaso de precipitados y se afor hasta 50ml con buffer 0.8%TBE 0.5X.

Objetivo: Preparar el gel de corrimiento para la electroforesis, la agarosa es el reactivo que gelificar y creara una red con pequeos conductos por la que pasar el DNA. (6) El buffer TBE es ampliamente utilizado para la electroforesis, especialmente para separar fragmentos de DNA pequeos con un peso molecular menor a 1000g/mol. Este buffer se prepara utilizando TRIS como buffer para amortiguar el pH que se encuentra en un rango de 7-7.5 y evitar as que la muestra de DNA se degrade, Adems de esto cuenta con Boratos que poseen una fuerza inica fuerte que permiten y facilitan el flujo de la carga. Finalmente cuenta tambin con EDTA como agente quelante para prevenir la degradacin del DNA. (Saint, comunicacin personal) (10) Nota: Se debe tarar el vaso de precipitados antes de medir la agarosa, y se vaca lo necesario dentro del vaso con pequeos golpes controlados en la base de la bolsa, con el fin de que sea cuidadoso el proceso y reducir as los desperdicios. La balanza empleada en este proceso fue modelo (Sartorius T615025) 6. Se calent la solucin en el horno de microondas por minuto y medio Objetivo: Solubilizar la agarosa de tal modo que quede una mezcla homognea. Nota: Cada 30 segundos se tiene que detener el horno de microondas y agitar con la mano y movimiento oscilatorio, ya que de otra forma seria imposible solubilizarla. (Saint, comunicacin personal) 7. Mientras se disolva la agarosa se procedi a colocar el equipo para la electroforesis, primero se coloc la base para el gel, la cual es un plato transparente sostenido en una base, que se ajust de tal forma que la superficie quedar totalmente plana. Objetivo: Permitir que la agarosa gelificar sin problemas ni desniveles. Nota: El ajuste se realiz con dos perillas en los extremos del equipo, y cada una modific la inclinacin de los extremos de la base obteniendo una superficie plana totalmente para el gel. Se coloc el peine y se aadi 5l de Syber Green a la solucin de agarosa caliente, se mezcl y se deposit sobre la base. Objetivo: Del peine crear los pozos donde se pondrn las muestras, del Syber-Green que se una especficamente al ADN cuando lo encuentre y al absorber una longitud de onda dentro del 8.

espectro UV emita una longitud de onda de 520nm que nos d una fluorescencia al observar la muestra en el transiluminador, de tal forma que nos permita ubicar el corrimiento que sufri el DNA y su posicin dentro del gel. (11) 9. Se esper 25 minutos aproximadamente y retir el peine del pozo, se sumergi la base en la cmara de electroforesis BIO-RAD Wide Mini-Sub Cell y se llen con buffer TBE hasta cubrir el gel por completo, aproximadamente 600ml Objetivo: Dejar que gelificar la solucin para tener los pozos bien definidos, pasar a la cmara de electroforesis para llenar los pozos y el TBE ayudar a que no se degrade el DNA, a que la carga se difunda bien por el gel y a regular e pH del proceso.

10. En un cuadro de parafilm con la parte estril boca arriba se colocan las siguientes cantidades de reactivos. (Tabla 1) Se homogenizan en 9 diferentes y se depositan en los carriles del gel. Objetivo: Del LB hacer ms densa la muestra para que no se salga del pozo y corra por el gel. Esta vez el TBE solamente se agrega para aadir volumen a la muestra y que todas puedan ser introducidas en el pozo. Las diferentes muestras de DNA se colocan para poder visualizar las bandas generadas por las enzimas de restriccin. El 1 KB plus se utiliza como marcador para poder determinar el peso molecular de nuestros fragmentos de DNA, este es un producto de Invitrogen. Nota: En caso de que se salga la muestra del pozo, en alguno de los carriles del DNA plasmdico significa que no se retir todo el etanol, y por lo tanto la densidad del etanol, que es menor a la del agua (0.7893 g/cm3 a 20C del etanol < 0.9998 g/cm3 a 20C del agua) (12) (13) ocasiona que la muestra se salga de pozo. En este caso se deber de poner 4l de glicerol puro para aumentar drsticamente la densidad. En este caso se puede depositar en el mismo pozo, si se err por primera vez.
Tabla 4: Muestra los componentes de los carriles del gel de electroforesis

Gota 1 Carril LB TBE VECTOR Enzima de restriccin Marcador 1 KB Plus l de muestra correspondiente

Gota 2

1 2 1l 1l 5 l X Sin vector Topo Sin enzima de Sin enzima restriccin 1 l 0 l 0 l 5 l

Gota 3 (Equipo 1) 3 1l X TOPO ScaI 0 l 5 l

Gota 4 (Equipo 2) 5 1l X TOPO EcoRI + NotI 0 l 5 l

Gota 5 (Equipo 3) 7 1l X TOPO EcoRI 0 l 5 l

Gota 6 Gota 7,8,9 y (Equipo 4) 10 9 4,6,8,10 1l 1l X X TOPO pGFPuv NotI EcoRI 0 l 5 l 0 l 5 l

*Nota: el gel no fue realizado por los alumnos durante el laboratorio fue elaborado por Manuel Jaime y por lo tanto las cantidades se transmitieron por comunicacin personal. 11. Posteriormente se debe tomar una foto por medio de un fotodocumentador BIO-RAD ChemiDoc XRS+ y el software ImageLab Objetivo: Poder hacer la comparacin de las bandas, as como discutir los resultados del equipo.

Resultados

12kb 5kb 3kb 2kb 1.65kb 12kb

Lo

9 10

Fig. 3: Muestra el gel de electroforesis y los patrones de corte al usar las diferentes enzimas de restriccin.

Los resultados que obtuvimos al analizar las bandas fueron los siguientes y se pudieron interpretar gracias al mapa de restriccin del vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM. (Fig. 5) Carril 2 vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM sin enzima de restriccin. Este carril muestra el vector sin haber sido sometido a la digestin por algunas enzimas de restriccin, se observa un barrido del DNA lo que puede significar una variedad de isoformas del

plsmido, que pueden corresponder a una topologa relajada del DNA plasmdico que es incapaz de recorrer una distancia grande dentro del gel de electroforesis. (Fig. 3) Carril 3 vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM con ScaI Existe un sitio de restriccin como lo muestra la figura 4, por lo que se lineariza el vector y queda una banda del peso total del plsmido, que coincide con el marcador al encontrarse a una distancia que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 6500pb, y el peso terico del vector es de 6601pb. Las bandas que se pueden llegar a observar en la parte superior del carril pueden atribuirse al hecho de que la concentracin empleada de la enzima fue muy poca y por lo tanto no se alcanz a digerir toda la muestra de DNA, por lo que algunos vectores siguen con una conformacin circular y una topologa relajada. (Fig. 3) Carril 5 vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM con NotI + EcoRI En este caso se detectaron solamente dos bandas, sin embargo se realiza el corte en cuatro sitios lo que nos debi de generar 3 fragmentos de DNA. Si revisamos el vector encontramos que el primer fragmento es el gen de la -actina que es flanqueado por EcoRI y NotI lo que nos da un fragmento de 1318pb lo que corresponde a la distancia que recorri una banda dentro del gel. Posteriormente el prximo corte se hace en los pares de base de 1359 con EcoRI lo que nos da un fragmento de 38pares de bases, lo cual es muy pequeo como para ser detectado como una banda en el gel, por ello no se observa alguna. Finalmente la enzima NotI corta en la posicin 1386 lo que nos da un tercer fragmento con peso de 27pb que tambin resulta muy pequeo como para que se pueda observar. El fragmento restante del vector tiene un peso molecular de 5215pb lo que corresponde con la otra banda que se encuentra en el gel. (Fig. 3) Carril 7 vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM con EcoRI En este caso solamente se puede observar una banda, a pesar de ello el vector tiene dos sitios de restriccin para EcoRI lo que significa que al menos deberamos de tener dos bandas una con un peso de 1356pb y otra con un peso molecular de 5245pb, y solamente aparece una banda con un a un distancia que corresponde aproximadamente a 6000pb, por lo que se puede deducir que la concentracin de enzima empleada fue muy poca y solo logr realizar el corte en un punto por lo que el nico efecto que se nota seria la linearizacin del vector y corresponde esta interpretacin con la banda en el gel. (Fig.3) Carril 9 vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina ITESM con NotI El vector tambin tiene dos sitios de restriccin en donde corta NotI, sin embargo el fragmento ms pequeo que provocan tiene un peso molecular de 65pb y el fragmento ms grande tiene un peso molecular de 6536. El fragmento de 65pb es muy pequeo como para observarse por ello solamente se ve una banda de 6536pb. (Fig. 3)

Carril 4, 6, 8 y10 vector pGFPuv con EcoRI. Esta digestin del vector GFP solamente sirvi como control ya que el vector GFP es un vector que se encuentra cerrado originalmente, y solamente tiene un sitio de restriccin para EcoRI en la posicin 1010 (Fig. 4), por lo que solo se genera un corte y se obtendra un linearizado de 3.3kb. (Fig.4) Todos los equipos hicieron su propio control pero los resultados son constantes para los 4 equipo y la distancia recorrida por el DNA plasmdico es congruente con los 3.3kb. Solamente que el equipo tres seguramente puso una concentracin de DNA mayor a 1 g al momento de hacer la digestin y por ello les sale una banda mucho ms pronunciada. (Fig. 3)

Fig. 4 Muestra el esquema del vector pGFPuv as como sus sitios de restriccin. (14)

Las enzimas de restriccin empleadas fueron las siguientes:

Tabla 5 muestra las caractersticas de las enzimas de restriccin empleadas. (15)

Enzima # de serie # de lote

EcoRI #R0122S 0281008

Enzimas empleadas en el vector TOPO NotI #R0189S 0521103

ScaI #R0101S 0321101

Concentracin Gnero Especie Cepa # de endonucleasa Sitio de restriccin

10U/ l E = Escherichia co = especie coli R = cepa RV 13 I endonucleasa aislada de esta cepa

5'G/AATTC 3'CTTAA/G

10U/ l N = Nocardia ot = otitidis No hay subespecie I endonucleasa aislada de esta cepa

5'GC/GGCCGC 3'CGCCGG/CG

20U/l S = Streptomyces ca = caespitosus N hay subespecie I endonucleasa aislada de esta cepa

5'AGT/ACT 3'TCA/TGA

Temperatura de incubacin Tiempo de incubacin recomendado por New England Biolabs Tiempo de incubacin experimental

37C

37C

37C

16 horas

16 horas

16 horas

17 horas

17 horas

17 horas

La concentracin de DNA utilizado para hacer el experimento con el vector pcDNA4/HisMaxTOPO actina ITESM fue equivalente a 1M lo que es igual a 1g/l. Para el control se utiliz 1 del vector pGFPuv lo que en nuestro caso equivale a 4.1588l Bsicamente se utiliza este procedimiento para determinar el xito de nuestra sntesis de DNA recombinante, ya que en caso de que se haga la comprobacin con los medios de cultivo selectivos, se puede correr el riesgo de que el gen no haya sido insertado de la forma correcta o solamente haya sido introducido el vector sin gen, por ello el hacer un ensayo de enzimas de restriccin y posteriormente correr el gel con los resultados nos da un patrn de bandas, que debe de corresponder en tamao y peso molecular al mapa de restriccin del vector empleado. Este patrn de bandas se logra ya que las enzimas de restriccin son capaces de reconocer secuencias especficas de nucletidos y cortar el enlace fosfodiester de forma especfica entre dos bases. Por ello se puede linearizar un vector que originalmente es circular e incluso se pueden generar varios fragmentos de diferentes tamaos. Se utiliza el vector pGFPuv como control positivo ya que este se encuentra originalmente cerrado por lo que nos sirve para corroborar si la enzima de restriccin fue capaz de actuar sobre el vector, en este caso slo se us EcoRI en el vector ya que pGFPuv no tiene sitios de restriccin para ScaI y NotI.

Discusin
Las enzimas de restriccin son protenas con accin de endonucleasa con las que se puede crear un patrn de cortes en una cadena de DNA que contiene las secuencias en donde la enzima interacta con el DNA y corta la secuencia para as poder obtener pedazos de la secuencia a analizar para verificar nuestro vector fue correctamente clonado.(16) En este caso se realiz una clonacin del gen de -actina extrado de DNA genmico de un individuo de Rattus Norvegicus

cepa Wistar e insertado en el vector pcDNA4/HisMax-TOPO actina-ITESM para la trasformacin de bacterias quimiocompetentes de E. coli cepa DH5-. El objetivo de este procedimiento con enzimas de restriccin es obtener los cortes del vector clonado para verificar la existencia de la secuencia de clonacin dentro del vector, contrastando los cortes realizados tericamente con los cortes mostrados en las bandas de la electroforesis realizada con los vectores previamente cortados con diferentes enzimas de restriccin.(17) La figura 1 nos muestra el mapa del vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM en el cual tenemos los diferentes sitios de restriccin con los que interaccionan las diferentes enzimas y a partir de este podremos hacer las estimaciones tericas de los cortes y las bandas que deberamos obtener en los ensayos experimentales de corte con enzimas de restriccin.

Figura 5. Mapa del vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM que tiene un peso molecular de 6601 pares de bases y muestra los diferentes sitios de corte dentro de las secuencias.

Las enzimas de restriccin utilizadas en este ensayo experimental fueron las siguientes: EcoR1, Not1 y Sca1, con las cuales se realizaron cortes en dos diferentes tipos de vectores utilizados previamente para la transformacin de bacterias quimio y electrocompetentes, dichos vectores fueron pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM y pGFPuv. Ambos vectores se cortaron con la enzima de restriccin EcoR1, aunque primero de debe de realizar un anlisis terico para obtener el patrn de bandas que se espera ver en la electroforesis una vez realizados los cortes.

Tabla 6. Patrones de corte de los vectores pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM y pGFPuv, con diferentes enzimas de restriccin para obtener las bandas tericas esperadas ver en el ensayo de electroforesis.

Enzima de restriccin EcoR1

BstEII

NotI

ScaI

EcoRI + NotI

pcDNA4/HisMax-TOPOactina-ITESM Sitios de corte en 3 y 1359. Se obtienen 2 bandas con peso molecular de: 1356 pb y 5245 pb. Sitios de corte en 160, 721 y 1083. Se obtienen 3 bandas con peso molecular de: 362 pb, 561 pb y 5678 pb. Sitios de corte en 1321 y 1386. Se obtienen 2 bandas con peso molecular de: 65 pb y 6536 pb. Sitio de corte 4975 que se encuentra en la secuencia de ampicilina usada como marcador para identificar en transformantes. Se obtiene 1 banda de 6601 pb. Sitios de corte en 3, 1321, 1359 y 1386. Se obtienen 4 bandas con pesos moleculares de: 1318 pb, 27 pb, 38 pb y 5218 pb.

PGFPuv Sitio de corte en 1010. Se obtiene 1 banda con peso molecular de 3.3 kpb. NA

NA

NA

NA

En base a los resultados tericos obtenidos se pueden contrastar con los resultados experimentales obtenidos en la electroforesis con gel de agarosa al 0.8% en donde se colocaron cada una de las muestras a las que se les agregaron las enzimas de corte y se hicieron interaccionar durante toda la noche para poder obtener el patrn de corte. En la figura 6 se muestran los resultados de los patrones de corte experimentales. Es importante recalcar que los vectores se muestran en diferentes bandas cuando se encuentran cerrados y por medio de la extraccin de DNA plasmdico se encuentran diversas isoformas, sin embargo cuando se realiza un patrn de restriccin entonces el vector se lineariza y se obtiene una cadena lineal de DNA por lo que el corrimiento es totalmente uniforme sobre la matriz de agarosa. (18)

10

Figura 6. Patrones de corte de los vectores pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM y pGFPuv en el ensayo experimental y visualizado mediante una electroforesis de DNA comparado con el marcador 1KB plus DNA Ladder y teido con SybrGreen

Como se puede apreciar en la primera columna se encuentra la comparacin del marcador molecular 1 KB plus DNA Ladder con la fotografa estndar proporcionada por el proveedor para poder saber de qu banda se trata cada una de las que podemos visualizar en el corrimiento y as comparar las bandas obtenidas con el patrn de cortes realizados. En la segunda columna se aprecia el corrimiento del vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM completo, sin haber sufrido ningn corte an, sin embargo este se encuentra fuera del rango del marcador molecular y adems se encuentra de manera difuminada por lo que se puede corroborar que el vector se encontraba cerrado. Por lo tanto, la difuminacin del vector en el gel de agarosa se refiere a las isoformas presentes del vector, sin embargo se encuentran laxas ya que no se aprecian bandas definidas de las diferentes formas de los plsmidos cerrados. (Saint Martin, A. comunicacin personal) (18) La tercer columna muestra el primer patrn de corte del vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actinaITESM el corte realizado fue con la enzima ScaI que muestra un patrn de corte como la figura 7.

5-AGTACT-3 3-TCATGA-5
Figura 7. Patrn de corte de Sca I en el sitio de restriccin de DNA(19)

Esta secuencia se encuentra en la secuencia de Ampicilina que funciona como resistencia y sirve para la identificacin de transformantes. En el corte terico esta secuencia se encuentra en 4975 pb del vector clonado; y solamente cuenta con un solo sitio de restriccin en toda la secuencia del vector, por lo tanto se obtuvo una sola banda como los resultados tericos mostraron. Ya que el

vector cuenta con un peso molecular de 6601 pb, y solo existi un solo corte en el vector, la banda presente muestra un peso molecular alrededor de 6500 pb, por lo que podemos decir que el vector efectivamente cuenta con un peso molecular de 6601 pb. La cuarta, sexta, octava y dcima columnas se presenta el patrn de corte de EcoRI utilizado sobre el vector pGFPuv en la cual se muestra una sola banda ya que esta secuencia cuenta solamente con un sitio de restriccin a EcoRI en la posicin 1010 por lo que se obtuvo el mismo resultado que el anlisis terico. Este vector cuenta con un peso molecular de 3.3kpb y se puede corroborar con la banda que se obtuvo en el corrimiento electrofortico que se muestra entre la banda de 2000 y 5000 pb lo cual indica que se encuentra en el rango de medicin. Este ensayo se realiz por duplicado como control positivo en donde el vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM realizado previamente se contrasta con el vector pGFPuv que fue prefabricado y as podremos verificar que efectivamente la enzima de corte EcoRI se encuentra en un buen estado y est ejerciendo su actividad normalmente para poder obtener diversos patrones de corte. Una diferenciacin de las pruebas sobre pGFPuv se muestra en la columna nmero ocho en donde se obtuvo el mismo peso molecular con la enzima de restriccin pero en esta muestra se observa una concentracin mucho mayor que en las dems muestras; esto puede ser a causa de un exceso de muestra o exceso de concentracin en un volumen muy pequeo. La quinta columna se muestra el patrn de corte de dos enzimas interaccionando con el vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM; dichas enzimas son EcoRI y NotI las cuales tienen diferentes tipos de corte figura 4 y figura 5. En el vector a analizar contiene 2 sitios de restriccin a EcoRI, que se encuentran en las posicines 3 y 1359; as mismo, dos sitios de restriccin a NotI, que se encuentran en las posiciones 1321 y 1386. Del anlisis de corte terico resultaron 4 bandas patrn diferentes, sin embargo se obtuvieron dos bandas muy pequeas por lo que son despreciables en el momento del conteo y la electroforesis y las bandas de importancia son de pesos moleculares 1318 y 5218. El corte realizado con estas dos enzimas se realiz para la verificacin de la presencia del gen -actina-ITESM dentro del vector de transporte. En prcticas anteriores se realiz el conteo manual de las pares de bases que conforman el gen -actina-ITESM y se obtuvo un peso molecular de 1342 pb ya que se debieron contar con primers y sitios de restriccin. Sin embargo, en el momento del anlisis por restriccin el valor terico de la secuencia es de 1318 pb, el resto de la secuencia del vector es de 5218. como se puede apreciar en la figura 2, se obtuvieron 2 bandas en lugar de 4 ya que dos son muy pequeas y se descartan, la primera banda en forma ascendente tiene un peso molecular alrededor de 1,300 pb debido a que se encuentra por encima de la banda marcador de 1000 pb mostrando as una aproximacin a 1,300 pb. En la segunda banda localizada en el patrn de restriccin se obtuvo un clculo que sobrepasa la banda marcador de 5000 pb, lo cual indica que es similar al valor terico obtenido de la secuencia cortada con EcoRI y NotI. Con este corte con ambas enzimas se obtuvo un resultado positivo a la clonacin del gen de -actina-ITESM, los resultados esperados de dos bandas diferentes en el corrimiento y aproximadas con las bandas marcador concuerdan con los pesos moleculares del vector TOPO y la secuencia de -actina-ITESM por separado.

5-GCGGCCGC-3 3-CGCCGGCG-5
Figura 8. Patrn de corte de Not I en el sitio de restriccin de DNA (19)

5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5

Figura 9. Patrn de corte de EcoR I en el sitio de restriccin de DNA (19)

En la columna nmero 7 se muestra el patrn de corte de la enzima EcoRI interaccionando con el vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM que tiene un corte palindrmico como se muestra en la figura 5. Tericamente, los cortes realizados por EcoRI se dan en la posicin 3 y 1359, por lo que se obtienen 2 bandas patrn de pesos moleculares de 1356 pb y 5245 pb, sin embargo en el ensayo electrofortico se muestra solamente una banda que se encuentra aproximadamente en la banda marcador de 6000 pb. Por lo tanto se presume que no hubo un corte en dicho vector, ya que de lo contrario se hubiesen obtenido las mismas bandas patrn que en resultado terico. La causa de este resultado el probable que se deba a la baja concentracin de la enzima dentro de la muestra y esta, al realizar el primer corte y linearizar el vector TOPO, ya no alcanzo a tener una segunda reaccin y no se realiz el segundo corte; esto se puede solucionar mediante la elevacin de concentracin de la enzima en la muestra. (20) En el caso de la muestra de la columna 9 en donde se realiz un corte al vector pcDNA4/HisMaxTOPO- -actina-ITESM con la enzima de restriccin NotI se puede apreciar una sola banda patrn ya que las posiciones de corte de dicha enzima son 1321 y 1386, dando como resultado dos bandas de peso molecular 65 pb y 6536 pb, por lo que la banda de 65pb es insignificante ya que no se alcanza a visualizar en este gel de agarosa; el motivo podra ser la concentracin en la que se encuentra el gel de agarosa y por ello es muy fcil que esta secuencia emigre totalmente por la matriz en el momento del corrimiento. En cuanto a la segunda banda de 6536 pb es la que se muestra como resultado en la banda mostrada en el corrimiento ya que esta se encuentra cerca del rango de 6000 pb comparado con la banda marcador. Analizando Si en la misma reaccin se realizara el corte con las enzimas ScaI y NotI se obtendran 3 bandas diferentes de corte. ScaI tiene como corte en la posicin 4975, asimismo la enzima Not I tiene como sitios de corte las posiciones 1321 y 1386, por lo que se obtendran 3 bandas patrn de corte; estas bandas tericamente equivaldran a 65 pb, 2947 pb y 3589 pb. En un caso aislado, se puede llevar a cabo el corte con la enzima de restriccin ScaI sobre el vector vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM, la cual tiene un sitio de corte en la posicin 4975, la cual se encuentra dentro de la secuencia de ampicilina que funciona como resistencia de identificacin de transformantes. Este corte nos puede proporcionar la verificacin del peso molecular del vector clonado, sin embargo no es suficiente para verificar si en nuestro vector se encuentra la secuencia insertada de -actina-ITESM puesto que no se tiene la certeza de la presencia de sta en el vector, pues puede existir alguna variacin en el inserto y no encontrarse dentro del vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM En el mismo caso de corte nicamente con la enzima de restriccin NotI, la cual tiene sitios de restriccin en las posiciones 1321 y 1386, nos muestra tericamente 2 bandas diferentes dentro del vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM, que tendran un peso molecular de 65 pb y 6536 pb. De igual manera que en el corte realizado con la enzima ScaI se puede verificar el peso molecular del vector analizado, sin embargo no es suficiente informacin para poder verificar la presencia certera del inserto de -actina-ITESM ya que no se muestra una banda que contenga el peso molecular de dicho gen y puede no estar presente en este vector o en un sitio diferente.

Por otro lado, se puede realizar los patrones de corte con la enzima EcoRI sobre el vector pcDNA4/HisMax-TOPO- -actina-ITESM, la cual tiene sitios de restriccin en las posiciones 3 y 1359, obteniendo as 2 bandas diferentes de pesos moleculares 1356 y 5245, tericamente. Con estos resultados Se puede diferenciar efectivamente la presencia del inserto al vector TOPO debido a que los sitios de restriccin de EcoRI se encuentran flanqueando la secuencia inserto de -actina-ITESM como se muestra en la figura 1. La banda de 5245 pb correspondera al resto del vector TOPO y la banda de 1352 pb correspondera al inserto. Por lo que se puede deducir que con la enzima EcoRI es posible realizar la verificacin del gen insertado en el vector -actina-ITESM.

Conclusiones
Como se mencion en la introduccin las enzimas de restriccin son muy usadas en la clonacin por su capacidad de reconocer una secuencia especfica que al unirse a ella la corta de manera muy precisa, en esta prctica se usaron las enzimas de restriccin EcoRI, Not I y ScaI para poder conocer si nuestro vector recombinante, el cul fue realizado con xito en las prcticas anteriores, contena el inserto. El conocer el mapa de restriccin del vector as como la secuencia del inserto nos permite elegir las enzimas de restriccin que ms nos convengan, de esta forma podemos obtener mayor informacin sobre si el vector contiene el inserto y en qu direccin fue ligado el inserto; el tener un conocimiento del mapa de restriccin del vector tambin nos permite inferir los fragmentos tericos que se formarn al cortar con alguna enzima de restriccin de esta forma podemos comparar los resultados tericos con los experimentales. En esta prctica se prepar una solucin de 20 l, primero se agreg el agua bidestilada, la cual actu como disolvente, despus se agreg un buffer (el cual es especfico para cada enzima de restriccin) y en el caso de NotI se agrega BSA para brindar estabilidad a protenas y enzimas durante el perodo de incubacin y evitar la adherencia de la enzima al tubo de reaccin. Finalmente se aadi la enzima de restriccin que se va a usar as como nuestro vector recombinante. Al llevar a cabo este proceso pudimos saber si realmente se llev a cabo la ligacin del vector pcDNA 4/HisMax-TOPO con el gen -actina, el cual fue extrado del musculo esqueltico de Rattus norvergicus, y por lo tanto podemos concluir que tuvimos una sntesis exitosa del vector recombinante, ya que al momento de hacer la digestin utilizando las enzimas de restriccin NotI y EcoRI al mismo tiempo se logr extraer el gen del vector demostrando que si se encontraba dentro. Si bien no todos los resultados fueron los esperados, como en el caso en que slo obtuvimos una banda al digerir con EcoRI, se le puede atribuir al efecto de una baja concentracin de las enzimas de restriccin. Los controles positivos empleados por los cuatro equipos demostraron que efectivamente las enzimas de restriccin cortaban en sus sitios de restriccin, y finalmente los resultados al emplear NotI y ScaI fueron congruentes ya que se linearizo el vector y los fragmentos que no aparecieron fue porque estos posean un peso molecular muy pequeo.

Cuestionario
1.-Investigue que es un isosquizmero y mencione al menos un ejemplo. La palabra isosquizmero proviene del griego iso que significa igual y de skhizein que es partir. Los isosquizmeros son endonucleasas de restriccin que reconocen la misma secuencia, aunque provienen de distintas cepas bacterianas y tienen constantes fsicas diferentes. La primera endonucleasa de restriccin se le conoce como prototipo y todas la enzimas subsecuentes que reconocen la misma secuencia son isosquizmeros del prototipo. Existen isosquizmeros que pueden o no reconocer un mismo sito, si es que este se encuentra metilado o no. Tal es el caso de MspI que puede cortar tanto en C/CGG y C/Cm GG (donde Cm es citosina metilada) y su isosquizmero solamente corta en C/CGG y no en citosina metilada (21). Estas enzimas son usadas en el estudio de la expresin de un gen en distintos tejidos para conocer que secuencias tienen citosina metilada y cuales no, ya que la metilacin detiene la expresin (21).

Enzima AanI AasI AatI AccI AccII AccIII Acc16I Acc36I AccB1I AccB7I AccBSI EclHKI EclXI Eco24I Eco31I Eco32I Eco47I Eco47III Eco52I Eco57I Eco72I Eco81I

Secuencia TTA/TAA GACNNNN/NNGTC AGG/CCT GT/MKAC CG/CG T/CCGGA TGC/GCA ACCTGC (4/8) G/GYRCC CCANNNN/NTGG CCGCTC (-3/-3) GACNNN/NNGTC C/GGCCG GRGCY/C GGTCTC (1/5) GAT/ATC G/GWCC AGC/GCT C/GGCCG CTGAAG (16/14) CAC/GTG CC/TNAGG

Isosquizmero PsiI DrdI, DseDI Eco147I, PceI, SseBI, StuI FblI, XmiI Bsh1236I, BspFNI, BstFNI, BstUI, MvnI Aor13HI, BseAI, Bsp13I, BspEI, Kpn2I, MroI AviII, FspI, NsbI BfuAI, BspMI, BveI BanI, BshNI, BspT107I PflBI, PflMI,Van91I BsrBI, MbiI AhdI, AspEI, BmeRI, DriI, EclHKI BseX3I, BstZI, EagI, Eco52I BanII, EcoT38I, FriOI BsaI, Bso31I, BspTNI EcoRV AvaII, Bme18I, SinI,VpaK11BI AfeI, Aor51HI BseX3I, BstZI, EagI, EclXI AcuI AcvI, BbrPI, PmaCI, PmlI, PspCI AxyI, Bse21I, Bsu36I

2.-Usualmente se utilizan 2 o ms enzimas para realizar un anlisis de un vector recombinante, lo cual deje en claro que en efecto la ligacin del gen insertado fue un xito. Sin embargo en algunos casos el anlisis con una sola enzima es suficiente. En el caso del vector recombinante que usted creo: Es suficiente una enzima de restriccin? Por qu si o porque no? Para la creacin del vector recombinante se uso el vector pcDNA4/HisMaxTOPO y se le inserto un fragmento de B-actina de un individuo de Rattus Norvegicus cepa Wistar. En el caso de usar la

enzima de restriccin Ava I esta corta tanto el vector como el inserto por lo cual se necesitara saber el lugar donde cortara y si este es el mismo pares de bases que el inserto de B-actina. Se prefiere usar una enzima de restriccin que no corte el vector para que al usar solamente esa enzima nos puede decir si el fragmento de b-actina esta o no. Si el fragmento de b-actina esta, la enzima cortara, lo que quiere decir que la insercin del gen fue un xito; mientras que si esta no corta quiere decir que no se inserto el gen correctamente (22). Ya que en el corrimiento electrofortico se lineariza el vector y se obtiene una sola banda que se compara con las bandas marcador y deber tener el peso molecular del vector; en este caso se obtiene tericamente un peso molecular de 6601 pb el cual debera ser exactamente igual en el ensayo del corrimiento.

3.-Se sabe que la enzima de restriccin AvaI solo corta en el genoma de beta actina de rata y no en el vector HisMaxTopoTA. Qu pasara si corto mi vector recombinante con AvaI? Cuntos fragmentos obtendr? Qu informacin me proporcionara esta enzima de restriccin? Si es vector recombinante TOPO-TA-b-actina se corta con la enzima de restriccin AvaI se obtendr un corte en el genoma de beta actina de rata. Lo cual es un indicador de que la insercin del gen fue un xito (22). Ava I tiene 5 cortes dentro del vector que se encuentran en : 960pb, 1249pb, 2339pb, 2525pb y
2535pb. Dentro del inserto de B-actina de de un individuo de Rattus Norvegicus cepa Wistar se hace 1 corte

en:
Restriction table: Enzyme Recognition frequency Positions __________________________________________________________________ AvaI C'yCGr_G 1 1014

Se obtendrn 6 fragmentos de distinta longitud. 1.-373 pb 2.-1090 pb 3.-186 pb 4.- 10 pb 5.-3699 pb 6.-1243 pb

Fuentes de Consulta
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