Manual de Prácticas de Inmunobiología

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOSSUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
SECCIÓN CIENCIAS DE LA SALUD HUMANA
MANUAL BÁSICO DE LABORATORIO

DE INMUNOBIOLOGÍA
BIOQUÍMICA DIAGNÓSTICA
Coordinador de Edición y Revisión: Ladislao Palomar Morales

Edición y Revisión: Fonseca Coronado Salvador, Martínez Sosa Ángel Germán, Palomar
Morales Ladislao, Vega López Marco Antonio, Romero Rojas Andrés, González Ballesteros
Eric
Enero 2020
1
INDICE
Programa de la asignatura 3
Reglamento general para los laboratorios 6
1 Seguridad en el laboratorio de inmunobiología 7
2 Morfología de las células del sistema inmunitario 13
3 Técnicas de separación y purificación de células del sistema inmunitario 17
4 Fagocitosis 25
5 Funciones de los Anticuerpos 31
6 Citometría de flujo 35
7 Ensayo Inmuno Enzimático (ELISA) 41
8 Anatomía del sistema inmunitario 47
9 Histología e inmunohistoquímica 50
10 Electroforesis en gel de poliacrilamida 58
11 Inmunoelectrotransferencia 65
12 Modelos experimentales y vías de inmunización 72
2
Programa de la Asignatura
3
4
5
6
PRÁCTICA 1
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
INMUNOBIOLOGÍA
QFB Ladislao Palomar Morales
OBJETIVO
 Introducir las medidas de seguridad, químicas y biológicas, en el laboratorio de
Inmunobiología para que el alumno las ponga en práctica y pueda minimizar los riesgos de
trabajo.
RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO

Es fundamental que el alumno conozca las medidas mínimas de seguridad, química y biológica,
que deben seguirse en un laboratorio donde se manejan reactivos químicos y muestras
biológicas, por esto se plantea en el programa de la asignatura como primera práctica del curso.
INTRODUCCIÓN
Existe un riesgo evidente de contaminación al que está expuesto el personal de salud
(profesionales, estudiantes, investigadores, etc., personal de limpieza), al tratar con pacientes
infectados o potencialmente infectados, en especial cuando el personal de salud, está en contacto
con sangre o hemoderivados, con agujas, jeringas e instrumental contaminado, pudiendo adquirir
infecciones como el HIV, Hepatitis B, C, etc., así como el riesgo de toxicidad, cuando en su trabajo
emplea substancias químicas, ya sea como reactivos, o como productos de desinfección, los
cuales pueden dañar también el medio ambiente.
Según la NOM-018-STPS-2000 se definen como: peligro a la capacidad intrínseca de una

sustancia química para generar un daño y riesgo, a la probabilidad de que una sustancia química
peligrosa afecte la salud de los trabajadores o dañe el centro de trabajo. Es necesario ampliar
estas definiciones para ser aplicadas a y microorganismos y. productos de origen biológico.
7
Aunque existe una gran variedad de sistemas para la identificación de riesgos los más usados a
nivel nacional e internacional son dos. Ambos sistemas son muy amigables por el uso de colores
y números para identificar los riesgos, y por tal razón son los recomendados por la NOM-018-
STPS-2000. A mediados del siglo XX, la Agencia Nacional de Protección al Fuego (NFPA, por
sus siglas en inglés) diseña el Código 704 para la identificación de riesgos de las sustancias
químicas.
Rombo (o diamante) del Sistema NFPA
Algunos años más tarde la Asociación Nacional de productores de Pinturas y Recubrimientos

(NPCA, por sus siglas en inglés) desarrolla un sistema alterno para la identificación de materiales
peligrosos. Hay que mencionar que tienen ligeras diferencias en su aplicación, debido a su origen.
Rectángulo HMIS
Las sustancias químicas son producidas en una región determinada y posteriormente se

trasladan al lugar donde se van a utilizar, para esto se deben seguir en México, y en el mundo,
las recomendaciones de la ONU para el transporte de materiales peligrosos, estas
8
recomendaciones surgen por la movilidad de estos materiales después de la Segunda Guerra
Mundial. En México se debe aplicar la NOM-003-SCT-2008, que obliga a los transportistas a
identificar mediante un código el tipo de material que se está transportando, utilizando colores y
números. Existe un sistema alterno llamado HazChem, utilizado en Europa.
Gas inflamable Sólido inflamable Misceláneos

Paneles del Sistema de Identificación para el Transporte de
Materiales Peligrosos Sistema HazChem
Una vez en el lugar donde se utilizaran las sustancias químicas, deben ser almacenadas en base
a sus características químicas, y no en orden alfabético. Aunque existen varios sistemas para
almacenamiento, los más amigables son aquellos que utilizan, simultáneamente, colores,
números y pictogramas. Estos sistemas toman el nombre de las empresas productoras que los
crearon, y todos ellos fueron creados a principios de la década de los 80’s del siglo pasado.
Sistema Baker Saf-T-Date Sistema ChemAlert Sistema Winkler
Los colores asignados en base al tipo de riesgo, en estos tres sistemas, son los siguientes:
Tipo de riesgo Baker Saf-T-Data ChemAlert Winkler
Salud Azul Azul Azul
Inflamabilidad Rojo Rojo Rojo
Reactividad Amarillo Amarillo Amarillo
Contacto Blanco Blanco Blanco
General (riesgo menor o igual
Verde Gris Verde
a 2 en cualquiera de los tipos)
Incompatibles con otras del Color asignado a Color asignado y la
NO EXISTE
mismo grupo rayas diagonales leyenda SEPARADO
9
En el año 2015 la NOM-018-SPS tiene una modificación que armoniza y unifica los sistemas
antes descritos en uno solo, el cual será obligatorio a partir de octubre de 2018.
Por otro lado la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó la primera edición del Manual
de bioseguridad en el laboratorio en 1983. En ella se alentaba a los países a aceptar y aplicar
conceptos básicos en materia de seguridad biológica y a elaborar códigos nacionales de prácticas
para la manipulación sin riesgo de microorganismos patógenos en los laboratorios que se
encuentran dentro de sus fronteras nacionales. Desde 1983, muchos países han seguido la
orientación especializada que se ofrece en el manual para elaborar esos códigos de prácticas.
La OMS establece que la clasificación por grupos de riesgo se utilizará exclusivamente para
el trabajo de laboratorio. Y hace referencia a los peligros relativos que entrañan los
microorganismos infecciosos, clasificados por grupos de riesgo (grupos de riesgo 1, 2, 3 y 4).
Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo

Grupo de riesgo 1(riesgo individual y poblacional escaso o nulo)
Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar
enfermedades en el ser humano o los animales.
Grupo de riesgo 2(riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)

Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o
animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave
para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente.
La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero
existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de
propagación es limitado.
Grupo de riesgo 3(riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)

Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o
animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a
otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.
Grupo de riesgo 4(riesgo individual y poblacional elevado)

Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser
humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a
otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas
y terapéuticas eficaces.
En el siguiente cuadro se relacionan, no se equiparan, los grupos de riesgo con el nivel de

bioseguridad de los laboratorios destinados al trabajo con microorganismos de cada uno de esos
grupos.
10
Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las prácticas y el
equipo
GRUPO DE NIVEL DE TIPO DE PRÁCTICAS DE EQUIPO DE
RIESGO BIOSEGURIDAD LABORATORIO LABORATORIO SEGURIDAD
Enseñanza básica, TMA Ninguno; trabajo en
Básico
1 Nivel 1
investigación mesa de laboratorio al
descubierto
Servicios de TMA y ropa Trabajo en mesa al
Básico atención primaria; protectora; señal de descubierto y CSB
2 Nivel 2 diagnóstico, riesgo biológico para posibles
investigación aerosoles
Diagnóstico Prácticas de nivel 2 CSB además de otros
especial, más ropa especial, medios de contención
Contención
3 Nivel 3
investigación acceso controlado y primaria para todas
flujo direccional del las actividades
aire
Unidades de Prácticas de nivel 3 CSB de clase III o
patógenos más cámara de trajes presurizados
Contención peligrosos entrada con cierre junto con CSB de
4 máxima hermético, salida clase II, autoclave de
Nivel 4 con ducha y doble puerta (a través
eliminación especial de la pared), aire
de residuos filtrado
En todo laboratorio escolar, o de diagnóstico clínico, se generan residuos de diferentes tipos,

cada uno de los cuales requiere diferentes condiciones para su recolección, traslado,
almacenamiento y disposición definitiva. De acuerdo con las NOM-052-SEMARNAT-2005 y
NOM-087-ECOL-SSA1-2002 los residuos deben separarse de acuerdo con el código CRETIB
(acrónimo de Corrosivo, Reactivo, Explosivo, Toxico, Inflamable y Biológico infeccioso).
Cada residuo debe segregarse de los otros y ser depositado en contenedores adecuados, sin
mezclarse entre sí. En nuestra facultad debemos seguir las indicaciones proporcionadas en la
“Instrucción de trabajo específica para la identificación clasificación y eliminación de residuos
peligrosos”, elaborada por profesores del Departamento de Ciencias Biológicas, que engloba las
normas anteriores.
Cada contenedor de residuos químicos debe etiquetarse de la siguiente forma:
 Laboratorio que lo generó.

 Tipo de residuos según la clave CRETIB, y de ser posible el
pictograma correspondiente.
 Composición aproximada de la mezcla.
 Fecha de inicio y término de la recolección.
 Generador del residuo
11
Los residuos biológicos deben ser segregados de acuerdo con la NOM-087-ECOL-SSA1-2002
de la siguiente forma:
TIPO DE RESIDUOS ESTADO FISICO ENVASE COLOR

Recipiente
Sangre y derivados Líquido Rojo
hermético
Cultivos y cepas de Bolsa de
Sólido Rojo
agentes infecciosos polietileno
Bolsa de
Sólidos Amarillo
polietileno
Patológicos
Recipiente
Líquidos Amarillo
hermético
Bolsa de
Sólidos Rojo
Residuos no polietileno
anatómicos Recipientes
Líquidos Rojo
herméticos
Recipiente
Objetos punzocortantes Sólidos rígido de Rojo
polipropileno
DISCUSIÓN
Discutir la importancia de conocer, implementar, y trabajar con las normas de seguridad
adecuadas al laboratorio de esta asignatura.
BIBLIOGRAFÍA
1. Funes Espinoza Fátima, Panozo Meneces Adela y Cardozo Salinas Teresa. (2005). Bioseguridad y
Seguridad Química en Laboratorio. [En línea] http://www.swisscontact.bo/sw_files/mvhvmxjnomq.pdf
obtenido el 12 de junio de 2011.
2. NOM-018-STPS-2000. Sistema para la identificación y comunicación de peligros y riesgos por
sustancias químicas peligrosas en los centros de trabajo. [En línea]
http://132.248.50.5/CLS/INFORMACIONPARACONSULTA/DERRAMESDEQUIMICOS/NOM-018-
STPS-2000.pdf, consultada el 12 de junio de 2011.
3. NOM-087-ECOL-SSA1-2002. Protección ambiental- Salud ambiental-Residuos peligrosos biológico-
Infecciosos-Clasificación y especificaciones de manejo. [En línea]
http://www.semarnat.gob.mx/leyesynormas/Normas%20Oficiales%20Mexicanas%20vigentes/NOM-
087-ECOL-SSA1-2002.pdf, obtenida el 12 de junio de 2011.
4. NOM-052-SEMARNAT-2005. Que establece las características, el procedimiento de identificación,
clasificación y los listados de los residuos peligrosos. [En línea]
http://www.semarnat.gob.mx/leyesynormas/Normas%20Oficiales%20Mexicanas%20vigentes/NOM%
20052_23_JUN_2006.pdf, consultada el 12 de junio de 2011.
5. NOM-003-SCT-2008, Características de las etiquetas de envases y embalajes, destinadas al
transporte de substancias, materiales y residuos peligrosos. [En línea]
http://www.sct.gob.mx/fileadmin/normatividad/transporte_terrestre/43.pdf, obtenida el 12 de junio de
2011.
6. Organización Mundial de la Salud. (2005). Manual de Bioseguridad en el laboratorio. [En línea]
http://whqlibdoc.who.int/publications/2005/9243546503_spa.pdf, obtenido el 12 de junio de 2011.
12
PRÁCTICA 2
MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS DEL

SISTEMA INMUNITARIO
OBJETIVOS
 Conocer y aplicar la metodología y cálculos para el conteo de células en cámara de
Neubauer.
 Identificar microscópicamente a las células del sistema inmune presentes en circulación y

conocer sus principales características fenotípicas.

En la unidad 2 se abordan los Mecanismos Inespecíficos y parcialmente específicos de Defensa
(MID), en el punto 2.5 se deben describir el fenotipo y la función de las células que participan en
los MID Y MPE.
INTRODUCCIÓN
El conteo de leucocitos se refiere a la cantidad total
de leucocitos en sangre, contados utilizando la
cámara de Neubauer; La cámara de Neubauer tiene
dibujado en el centro un gran cuadrado, subdividido
en nueve cuadros más pequeños. Los cuatro
cuadrados de las esquinas se utilizan para el
recuento leucocitario y, a su vez, están subdivididos
en dieciséis cuadrados terciarios.
El cuadro central es el de cuenta de eritrocitos.
13
La Cuenta Diferencial consiste en evaluar la proporción y la morfología de los diferentes tipos de
leucocitos que hay en sangre periférica. El examen de una extensión de sangre, es parte
importante de la evaluación de la serie blanca, la fiabilidad de la información obtenida depende
principalmente de lo bien hechas y bien teñidas que estén las extensiones, las cuales son
sistemáticamente examinadas.
MATERIAL REACTIVOS
Placa de 96 pozos Solución de Turk
Cámara de Neubauer EDTA
Microscopio Colorante de Wright
Juego de micropipetas y puntas Aceite de Inmersión
Portaobjetos Amortiguador de fosfatos con pH 6.6
Tubo Capilar Agua destilada
Algodón
Piano Contador
DIAGRAMA DE FLUJO
Sangre con R1
anticoagulante
Recuento de Cuenta
leucocitos diferencial
Diluir 1/20 con Teñir con R2

líquido de Turk Wright
Llenar la
Contar a 100X
cámara de
Neubauer
Contar a 10X
R1: Aguja, al contenedor de punzocortantes; Algodón, basura municipal; tubo con sangre a contenedor con
cloro
R2: Residuos de Wright, Contenedor especial
14
METODOLOGÍA
Tomar una muestra de sangre con sistema Vacutainer®, utilizando EDTA como anticoagulante.
1. Conteo de leucocitos
En un pozo de una microplaca, colocar 5 L de sangre completa y adicionar 95 L de líquido de
Turk, mezclar suavemente. Tomar 10 L de la sangre diluida y llenar un lado de la cámara de
Neubauer. Dejar reposar durante 1 minuto.
Colocar la cámara de Neubauer en el microscopio y buscar la cuadricula con el objetivo de 10X.

Realizar el conteo de leucocitos con el objetivo de 40X, en forma de culebra. Reportar el valor
en: leucocitos/mm3 y leucocitos/mL.
2. Cuenta diferencial de la serie blanca

Colocar una gota del tubo capilar en el extremo de un portaobjetos. Extenderla con otro
portaobjetos con un movimiento suave, haciendo la extensión de sangre lo más delgada y fina
que se pueda. Secar al aire rápidamente. Cubrir con colorante de Wright durante 5 a 8 minutos.
Agregar el amortiguador, sin tirar el colorante, hasta que se forme una capa metálica que cubra
el frotis y dejarlo reposar de 5 a 8 minutos. Enjuagar con agua destilada y secar.
Colocar el frotis en el microscopio y enfocar con el objetivo de 40X, colocar una gota de aceite de
inmersión y realizar la cuenta con el objetivo 100X, en forma de culebra, contando un mínimo de
200 células.
15
RESULTADOS
Valores absolutos y relativos de los leucocitos.
DISCUSIÓN
Discuta los valores obtenidos contra los valores de referencia y las implicaciones que tienen un
aumento y/o una disminución de estas células del sistema inmune.
BIBLIOGRAFÍA
1. Bernard, Henry John. (1993). Diagnóstico y Tratamiento Clínico por el Laboratorio, 9ª edición, Ed.
Salvat Medicina, México, DF. 1509 pp.
2. Velez A, Hernan. (1992). Fundamentos de Medicina Hematología. 4ª edición. Editorial Corporación
para Investigaciones Biológicas. Medellín, Colombia. 395 pp.
3. Williams, William J. (1979). Hematología. 1ª edición. Salvat Editores, S.A. Barcelona, España.1503
pp.
16
PRÁCTICA 3
TÉCNICAS DE SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN

DE CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO
Dr. Salvador Fonseca Coronado y QFB Ladislao Palomar Morales
OBJETIVO Y COMPETENCIAS
Al finalizar el procedimiento experimental es deseable que el alumno haya adquirido las siguientes
competencias:
 Conocer las principales técnicas de separación y purificación de células a partir de sangre
periférica.
 Realizar el procedimiento de estratificación de sangre sobre Ficoll-Hypaque y la obtención de
las células mononucleares.
 Conocer y aplicar los principios de purificación de células por el método de perlas
superparamagnéticas acopladas a anticuerpos específicos.

En la unidad 3 se describen los mecanismos específicos de defensa (MED) y específicamente en
el apartado 3.1 se hace mención del fenotipo y función de las células de los MED y en el 3.9 de
la estructura y función de los receptores celulares, en esta práctica se lleva a cabo un
procedimiento para la separación de células mononucleares, entre las que se encuentran células
de la inmunidad innata, y un procedimiento para la purificación específica de células NK las cuales
son células fundamentales en los MID por su función citotóxica.
INTRODUCCIÓN
En inmunología, al igual que en la mayoría de las ciencias de la vida, para describir un fenómeno
particular, es necesario aislarlo del conjunto de variables con los que coexiste.
17
En la actualidad, casi todos los estudios con células del sistema inmune requieren su aislamiento
y purificación, bien para describir funciones específicas, o para el estudio delos efectos de otras
células, agentes o moléculas sobre ellas; el conocimiento de todas las funciones descritas de las
células hasta el momento, ha sido posible gracias a que se cuenta con técnicas para la
purificación de una estirpe en particular, a partir de un grupo heterogéneo de estas.
Las células inmunes se pueden separar por varios métodos

Métodos físicos
 Aislamiento por centrifugación en gradiente de densidad (Ficoll-Hypaque): Con esta técnica
podemos obtener de forma separada las células mononucleares (linfocitos y monocitos) delos
granulocitos.
 Separación por adhesión selectiva:
 Los monocitos se adhieren a superficies de vidrio o plástico y se separan de los linfocitos.
 Los linfocitos B se fijan a columnas o jeringas en lana de nylon o algodón (se obtienen
poblaciones separadas de LB y LT).
Estudio de marcadores y antígenos de membrana (diferencia poblaciones y

subpoblaciones de células). Las técnicas más empleadas son:
 Citometría de flujo con FACS (separador celular activado por fluorescencia)
 Formación de rosetas por linfocitos B y T
 Separación por sus antígenos de membrana:
 Separación magnética
 Separación por afinidad en columnas
MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOS

Sistema Vacutainer® para obtención de Ficoll-hypaque
sangre con anticoagulante SSF o PBS
Cámara de Neubauer. Colorante de Wright
Microscopio. Aceite de Inmersión
Tubos cónicos de 15 mL Amortiguador de fosfatos con pH 6.6
Tubos de vidrio 13x100 Solución de Turk
Algodón (Torundas)
Contador de células.
Micropipetas de 10 y 100 μL. con puntas
Pipetas de 5 y 10 mL y Pipetas Pasteur
Centrífuga clínica
Balanza de dos platos
Portaobjetos
18
Opcional Opcional
Equipo magnético para purificación de Medio RPMI 1640 suplementado
células Mezcla de anticuerpos monoclonales
contra marcadores de identidad
acoplados a biotina
Anticuerpos monoclonales anti-biotina
acoplados a perlas magnéticas
Amortiguador de purificación: PBS albúmina-
EDTA
DIAGRAMA DE FLUJO
Obtener 2 tubos de
sangre periférica R1
Centrifugar un Estratificar el contenido del otro

tubo tubo sobre Ficoll-hipaque
Obtener la capa Centrifugar y obtener la

R3 de Leucocitos capa de mononucleares R2
Resuspender
en 1 mL
R4
Contar en cámara Preparar un frotis, teñir con

de Neubauer Wright y observar morfología
R1: Aguja, al contenedor de punzocortantes; Algodón, basura municipal; tubo con sangre a contenedor
con cloro
R2 y R3:Palangana con cloro
R4:Residuos de Wrigth, Contenedor especial
METODOLOGÍA
1. Obtener dos tubos de sangre, 5 mL en cada uno, con anticoagulante (heparina de
preferencia).
19
Obtención de Buffy Coat
2. Centrifugar, uno de los tubos, a 700 g
durante 5 minutos.
3. Con pipeta Pasteur extraer y desechar el
plasma.
4. Con pipeta Pasteur obtener la capa de
Leucocitos (1 mm aproximadamente) y
colocar en un tubo de ensaye.
5. Completar a 1 mL con SSF o PBS.
6. Realizar el conteo de las células
obtenidas en la cámara de Neubauer.
7. Preparar un frotis con la suspensión y
teñir con Wright. Observar morfología a
100X.
Separación por gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque.

8. Colocar 2 mL de Ficoll-hypaque en un tubo de ensaye de 13x100, estratificar lentamente la
sangre de un tubo sobre la superficie del Ficoll con ayuda de una pipeta Pasteur, de tal manera
que se formen dos fases.
9. Centrifugar a 300 g por 15 minutos.
10. Como se observa en la figura se forman cuatro
estratos diferentes introducir una pipeta Pasteur
hasta el estrato de células mononucleares (PBMC
del inglés: Peripheral blood Mononuclear Cells) y
extraer el anillo en forma circular evitando extraer
la menor cantidad de Ficoll posible.
11. Colocar las PBMC en otro tubo, adicionar 5 mL de
PBS y centrifugar 5 min a 300 g, repetir el lavado
una vez más. Resuspender en 1 mL de PBS
12. Prepara un frotis con la suspensión de PBMC y teñir con Wright; Observar la morfología a
100X.
13. Realizar el conteo de las células obtenidas en la cámara de Neubauer.
20
RESULTADOS
Indicar la cantidad de células/mL de suspensión y morfología de las células obtenidas por cada
método.
DISCUSIÓN
El alumno debe comprender y describir detalladamente el fundamento de la purificación de
células por selección negativa con perlas magnéticas.
REFERENCIAS
Current Protocols in Immunology. (1997) A.3F.1-A.3F.2 Common Immunologic Techniques. Supplement
21, John Wiley & Sons, Inc. DOI: 10.1002/0471142735.ima03fs21
URL´s
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471142735.ima03fs21/pdf (Libre acceso dentro de la UNAM).
www.miltenyibiotec.com/download/datasheets_en/253/MiltenyiBiotec_DataSheet_CD4+-T-Cell-Isolation-
Kit-II,-human_130-091-155.pdf
21
Opcional:
Purificación de células por perlas superparamagnéticas (MACS)
DIAGRAMA DE FLUJO
22
Importancia: La purificación de una población celular en particular, nos permite
evaluar una gran variedad de funciones específicas y de respuestas a diferentes
estímulos entre ellos por supuesto, los efectos de un determinado fármaco.
1. De acuerdo al número de células contadas, ajuste una solución de 1x107 células en 40 L de
buffer y adicione la cantidad de cocktail de anticuerpos anti-CD indicado en el instructivo del
producto. (La finalidad de esto es familiarizar al estudiante con insertos en idioma inglés).
2. Incube 10 minutos en hielo
3. Adicione 10 μL de anticuerpos anti biotina acoplados a perlas magnéticas mezcle y deje en
incubación por 15 minutos.
4. Mientras esta en incubación la suspensión, coloque una columna LS sobre él magneto y lave
tres ocasiones por adición de 3 mL de PBS-albúmina.
5. Adicione la suspensión en la columna y colecte el eluato en un tubo cónico, lave en tres
ocasiones por adición de 2 mL de PBS-albúmina colectando el eluato en el mismo tubo (esta
fracción es rica en células purificadas).
6. Separe la columna del magneto y adicione en tres ocasiones 3 mL de buffer para sacar de la
columna las células marcadas (Esta fracción es rica en las poblaciones no purificadas).
7. Realice el conteo de ambas fracciones y calcule la eficacia del proceso, compare su resultado
experimental con el teórico esperado de acuerdo a la población purificada.
23
APÉNDICE
Preparación de medio RPMI 1640
Dependiendo del fabricante, el medio puede venir en varias presentaciones, hay presentaciones
de 100 mL listas para su uso, sobres con polvo para disolver en un litro y frascos con polvo para
preparar 10 litros, en este último caso se pesa la cantidad adecuada para los mL que se desee
preparar. El polvo debe ser disuelto en agua tridestilada y desionizada o en agua milliQ.
Para preparar un litro de medio:

Disolver la cantidad de polvo indicada en aproximadamente 970 mL de agua; agregar 2 gramos
de bicarbonato de sodio en polvo (grado cultivo celular) y 1 gramo de HEPES; adicionar 10 mL
de L-glutamina 100 mM y 10 mL de antibiótico-antimicótico (penicilina/estreptomicina-Fungizona);
ajustar el pH a 7 con NaOH 0.1 N y aforar a 1 litro. Filtrar en una unidad de esterilización de 0.22
μm y etiquetar como medio base. El medio para cultivo celular se suplementa por adición de 10
% de suero fetal bovino estéril.
Preparación de solución amortiguadora de fosfatos (PBS) pH 7.2

Pesar 8 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 0.16 g de KH2PO4 y 0.79 g de Na2HPO4 anhidro, disolver en
agua desionizada y ajustar el pH a 7.2 con NaOH o HCl según sea el caso.
Esterilizar por filtración y almacenar a 4 °C.
Preparación de solución amortiguadora de separación para MACS.

Preparar 1 litro de PBS 1X y adicionar 0.5 % de albúmina sérica bovina y EDTA 2 mM
24
PRÁCTICA 4
FAGOCITOSIS
OBJETIVO
 Evaluar la función fagocítica en células de sangre periférica humana para determinar:
a) Porcentaje de células con capacidad fagocítica
b) Porcentaje de células con capacidad de producir radicales intermediarios del oxígeno
c) Número de levaduras, en promedio, que fagocita una célula

Mecanismos inespecíficos y parcialmente específicos de defensa (MID), Unidad 2, punto 2.7
INTRODUCCIÓN
En la fagocitosis (del griego -phagos, 'el que come', kytos, 'célula') algunas células rodean con su
membrana citoplasmática a una sustancia extracelular (un sólido generalmente) y la introducen
al interior celular.
Células fagocíticas
En los animales superiores, la fagocitosis es una función de células especializadas (fagocitos
profesionales) del sistema inmune capaces de remover cuerpos extraños y combatir infecciones
como primera línea de defensa natural. Varias células ejercen funciones fagocíticas: Neutrófilos,
monocitos y macrófagos.
Los macrófagos son células fagocíticas de gran tamaño presentes en la

mayoría de los tejidos y cavidades, proceden de los monocitos que migran
desde la sangre hacia los tejidos. Algunos permanecen en los tejidos
durante años y otros circulan por los tejidos linfoides secundarios. También
pueden actuar como células presentadoras de antígenos.
25
Su cinética de diferenciación es la siguiente: monocito (en sangre),
Histiocito (células de Kupffer, osteoclastos, células de la microglia, células
del mesangio, etc.), macrófagos inflamatorios y finalmente los macrófagos
clásicamente (M1/CAM) y alternativamente activados (M2/AAM).
Los macrófagos expresan receptores de membrana para numerosos antígenos bacterianos, por
ejemplo: receptor para lipopolisacárido (CD14), receptores CD11b/CD18, receptores para
manosa, y receptor para glúcidos entre otros. Los macrófagos participan en gran medida de la
respuesta inmune innata a infecciones gracias a sus receptores "scavengers", o barredores, que
poseen una especificidad a ligandos muy amplia como: lipoproteínas, proteínas, poli y
oligonucleótidos, polisacáridos aniónicos, fosfolípidos y otras moléculas.
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes (>70 %). Su tamaño
es de 10-20 m de diámetro y se clasifican como granulocitos debido
a sus gránulos citoplasmáticos de lisozimas y de lactoferrina. Pasan
menos de 48 horas en la circulación antes de migrar a los tejidos,
debido a la influencia de los estímulos quimiotácticos. Es en ellos
donde ejercen su acción fagocítica y eventualmente mueren.
Los monocitos son células circulares cuyo diámetro oscila entre 15 a 30 μm

y poseen una alta relación núcleo/citoplasma. Se originan en la médula ósea
y constituyen cerca del 5 % del total de leucocitos de la sangre, donde
permanecen sólo unos tres días. Después atraviesan las paredes de las
vénulas y capilares (diapédesis) donde la circulación es lenta. Una vez en los
órganos, se transforman en macrófagos, lo que se refleja en el aumento de
su capacidad fagocítica, de la síntesis de proteínas, el número de lisosomas
y la cantidad de aparato de Golgi, microtúbulos y microfilamentos. Estos
últimos se relacionan con la formación de seudópodos, responsables del
movimiento de los macrófagos.
Reconocimiento y unión de partículas por fagocitos

A pesar de que la fagocitosis de partículas fue demostrada por Haeckel en 1862 y que los
macrófagos y micrófagos fueron descritos por Metchnikoff en 1892, el rol de los factores séricos
que intervienen en este proceso fue puesto en evidencia hasta 1904 cuando Wright y Douglas
determinaron que dichas sustancias eran fundamentales para una óptima ingestión.
26
Etapas de la fagocitosis
1- Quimiotáxis
Es la etapa de movilización y reclutamiento de células fagocíticas por medio de interacciones
celulares con la zona o tejido lesionado. El fagocito se adhiere a la superficie del endotelio
previamente activado por citocinas, a través de uniones moleculares de baja afinidad entre
receptores del fagocito y selectinas presentes en el endotelio.
En un punto específico, determinado por la presencia y activación de quimiocinas, los fagocitos

movilizados establecen interacciones intercelulares de gran afinidad con el endotelio por medio
de integrinas y otros ligandos endoteliales. En especial las moléculas endoteliales selectina-E,
ICAM-1,2,3; VCAM-1 se adhieren a ligandos específicos sobre los fagocitos, entre ellos CLA,
LFA-1 y Mac-1.
Los fagocitos atraídos por gradientes de concentración de las quimiocinas, atraviesan entonces
el endotelio vascular hacia el foco de infección patógena.
2- Opsonización
La opsonización se consigue recubriendo las partículas con anticuerpos específicos de la clase
IgG, con o sin complemento. Debido a que los fagocitos tienen receptores de membrana para el
fragmento Fc de IgG, reconocen a estas partículas recubiertas por los anticuerpos. La IgM no
tiene capacidad de opsonizar, pero su unión a las partículas induce la activación del sistema de
complemento. Esto lleva a que el componente C3b se deposite sobre las partículas, las cuales
son reconocidas por los receptores CR1, CR3 y CR4, de los fagocitos para el fragmento C3b.
A pesar que el reconocimiento de partículas recubiertas con IgG y/o C3b vía los receptores Fc y
C3b, es el principal mecanismo de ingestión de partículas extrañas, llamado “fagocitosis inmune”,
existen otros factores que median o ejercen su influencia sobre este proceso.
3- Adherencia
Receptores específicos sobre la membrana de los fagocitos permiten la adherencia sobre los
microorganismos, ya sea a productos microbianos específicos o sobre opsoninas del sistema
inmune del hospedador.
Algunos receptores de membrana presentes en las células fagocíticas son: receptor de manosa,
receptor para el complejo LPS-LBP (LBP: proteína de unión al LPS) que está formado por el TLR4
y el CD14, receptores para los fragmentos Fc de los anticuerpos opsonizantes IgG 2 e IgG3.
27
4- Ingestión
La unión a receptores de adherencia promueve señales de comunicación intracelular que resultan
en la invaginación de la membrana del fagocito rodeando al receptor y su ligando patogénico. Al
rodear por completo al complejo receptor-molécula, la membrana se une en sus extremos y libera
al interior de la célula un fagosoma. Esto puede ocurrir en más de un punto de la membrana
celular.
5- Digestión
Los fagocitos cuentan con variados mecanismos microbicidas, los cuales se activan al fusionarse
el fagosoma con un lisosoma intracelular. Las enzimas del lisosoma se liberan dentro del
fagolisosoma recién formado actuando sobre su contenido. Otros componentes tóxicos usados
en la digestión de microorganismos son los intermediarios reactivos del O 2 y el óxido nítrico.
La Autofagia es un proceso del fagocito en el cual su retículo endoplásmico crea un autofagosoma

en su misma mitocondria liberando gránulos para la destrucción de la misma mitocondria y así
liberar los gránulos contenidos de la mitocondria que son los gránulos secundarios específicos.
MATERIAL REACTIVOS
1 Tubo vacutainer® con heparina Suspensión de levaduras en SSF
1 pipeta Pasteur Nitroazul de Tetrazolio al 0.1 % en SSF (NBT)
2 portaobjetos Colorante de Wright
Baño María Solución amortiguadora pH 5.5 a 7.2
Charola para Tinción Aceite de inmersión
Microscopio óptico
Contador de Células
28
DIAGRAMA DE FLUJO
Obtención de sangre periférica R1
Obtención de buffy coat R2
Dividir en dos tubos eppendorf
Agregar Levaduras Opsonizadas Agregar Levaduras sin opsonizar
Centrifugar 1 500 rpm 2 min
Decantar
Agregar 200 mL de NBT R2
Incubar 30 min a 37 °C
Realizar frotis y teñir con Realizar frotis y teñir con safranina

Hemocolorante rápido
R3 Observar y contar a 100X R3
R1: Aguja, al contenedor de punzocortante; Algodón, basura municipal

R2: Sangre con levaduras, Contenedor con cloro
R3: Residuos de Wright y safranina, Recipiente para resíduos de wrigth o safranina
METODOLOGIA
1. Obtener 5 mL de sangre venosa en un tubo con Heparina.
2. Obtener la capa leucocitaria (aproximadamente 500 L).
3. Agregar 200 L de levaduras opsonizadas/sin opsonizar.
4. Mezclar y centrifugar a 1 500 rpm durante 2 minutos. Decantar el sobrenadante y agregar
200 L de nitroazul de tetrazolio (NBT). Incubar 30 minutos a 37 °C.
5. Realizar dos frotis; uno de ellos fijarlo con metanol y teñirlo 5-7 minutos con safranina. Lavar
suavemente con agua destilada. El segundo frotis teñirlo con hemocolorante rápido.
6. Observar a 100X, contando por lo menos 200 células, distinguiendo lo siguiente:
29
  C) Reduce el NBT
 
 A) Célula fagocitando  D) No reduce el NBT
 E)Levadurasfagocitadas
 
 B) Célula que no fagocito

NOTA: A+B > 200
RESULTADOS
Expresar los resultados como:
A C
% de fagocitosis= (100) % de reducción del NBT= (100)
AB CD
E
Índice fagocitico=
A
DISCUSIÓN
Discuta la importancia de la fagocitosis como un mecanismo inespecífico y parcialmente
específico de defensa.
BIBLIOGRAFÍA
1. Aguilar Torrenta, Faviola. (2001). Manual del Curso Practico de Inmunología, 1ª edición, Editorial ENCB
IPN, México DF, 204 pp.
2. Gradwohl, RBH; Sonnenwirth, AC; Jarett, L; Zlochevsky Landes, D. (1986). Métodos y Diagnósticos del
Laboratorio Clínico, Volumen I, 8ª edición, Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 1110 pp.
3. Palomar Morales, Ladislao. (1988). Fagocitosis en cerdos alimentados con diferentes niveles de
aflatoxina B1. Tesis UNAM. FES Cuautitlán.
4. Roitt, Ivan. (2000). Inmunología, 5ª edición. Harcourt ediciones. Madrid, España. 423 pp.
30
PRÁCTICA 5
Funciones de los Anticuerpos

OBJETIVOS
 Que el estudiante comprenda las bases teóricas de la reacción de aglutinación, los diferentes
factores que contribuyen a la reacción, y sus aplicaciones clínicas para el diagnóstico de
algunas patologías.
 Determinar la presencia de inmunoglobulinas (Ig’s) séricas llevando a cabo la prueba de

precipitación de sulfito de sodio.

En la unidad 3, Mecanismos específicos de defensa, se describen los conceptos de antígeno,
antigenicidad e inmunoglobulinas. En la parte del contenido práctico se hace mención de las
reacciones antígeno-cognato.
INTRODUCCIÓN
Jules Bordet propuso que la aglutinación tomaba lugar en dos fases: a) la combinación específica
del anticuerpo y el antígeno y b) la agregación visible de las partículas. Ambas fases son
mediadas por la atracción específica entre el anticuerpo y el antígeno.
A principios del siglo XX, Karl Landsteiner, menciona que en los eritrocitos deben existir
aglutinógenos (hoy llamados antígenos) que reaccionaban con las aglutininas del suero (hoy
llamados anticuerpos) formando agregados de gran tamaño visibles a simple vista.
Las reacciones de aglutinación y de precipitación son la base de la mayor parte de las técnicas
inmunológicas. Su principio se basa en la reacción antígeno-anticuerpo. Para comprender lo
anterior es necesario recordar qué es un antígeno y un anticuerpo.
31
Antígeno es una sustancia de alto peso molecular, con cierta rigidez estructural y que tiene la
particularidad de ser parcialmente “metabolizado” por células especializadas llamadas
macrófagos, por lo tanto es capaz de generar una respuesta inmune en un organismo que la
detecte como un agente extraño. Mientras que un anticuerpo es una glicoproteína, producida por
linfocitos B activados, llamados células plasmáticas, como respuesta a la presencia de un
antígeno en el organismo, a su vez los anticuerpos pueden ser producidos por líneas celulares in
vitro, como es el caso de la producción de anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos
llamados también inmunoglobulinas, se presentan en cinco clases principales, IgG, IgM, IgA, IgD
e IgE, que se diferencian entre sí por sus características físicas, químicas y biológicas.
La capacidad inmunogénica de distintas partículas, es en orden decreciente la siguiente:

proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, lípidos y azúcares. Las técnicas de aglutinación son sólo
semicuantitativas y algo más difíciles. La aglutinación de los antígenos nativos insolubles o de las
partículas recubiertas por el antígeno puede evaluarse a simple vista con o sin la ayuda del
microscopio. Entre las ventajas de las reacciones de aglutinación están su alto grado de
sensibilidad y la enorme variedad de substancias identificables a través del uso de partículas que
están recubiertas por antígeno o por anticuerpo.
Según Coombs existen 3 requerimientos principales en las pruebas de aglutinación:

1. Disponibilidad de una suspensión estable de células o de partículas.
2. Presencia de uno o más antígenos cercanos a la superficie.
3. Conocimiento de que los anticuerpos "incompletos" o no aglutinables no son localizables
sin modificación (reacciones antiglobulina).
Existen algunas variantes de la técnica de aglutinación, entre las cuales podemos mencionar:
 Aglutinación Directa: Anticuerpo soluble y antígeno presente en una célula o partícula

insoluble.
 Aglutinación Indirecta: Anticuerpo unido a una célula o partícula insoluble y antígeno
soluble.
 Inhibición de la Aglutinación: Reacción en dos pasos; primero se ponen a reaccionar el
anticuerpo y el antígeno (ambos en forma soluble) y en una segunda etapa se agrega uno
de ellos unido a una célula o partícula insoluble.
 Floculación: El complejo antígeno-anticuerpo no es tan grande como en las reacciones
de aglutinación, y en ocasiones el complejo puede ser inestable.
32
MATERIAL REACTIVOS
Placas de cristal fondo transparente Equipos de diagnóstico grupos sanguíneos
Gradilla con 14 tubos de ensaye 10X75 Antiesptreptolisina O Liofilizada
3 tubos de ensaye 12x75 Solución reguladora de fosfatos pH 6.6 a 7.2
Centrifuga
Balanza de dos platos
Juego de micropipetas y puntas
DIAGRAMA DE FLUJO
Obtención de sangre periférica

R1
Plasma Paquete celular
Cuantificación de Determinación de
R2
Antiestreptolisina O Grupo sanguíneo R3
R1: Aguja: Contenedor de punzocortantes, Algodón: contenedor municipal, Paquete eritrocitario:

Contenedor con hipoclorito de sodio.
R2 y R3: Contenedor con hipoclorito de sodio.
METODOLOGÍA
1. Obtener 5 mL de sangre venosa en un tubo con anticoagulante.
2. Centrifugar 5 min a 3 000 rpm.
Determinación de Antiestreptolisina O
3. Preparar 2.5 mL de una dilución 1/10 de suero; 3 mL de una dilución 1/100 y 3 mL
de una dilución 1/500.
4. Preparar los siguientes sistemas:
Muestra Controles
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Dilución del 1/10 1/100 1/500 SLO Eritroc
suero (mL)
0.4 0.1 0.5 0.4 0.3 0.2 0.15 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -------- --------
Regulador
(mL)
0.1 0.4 0.0 0.1 0.2 0.3 0.35 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.75
Estreptolisi
na O (mL)
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.00
Mezclar e incubar a 37 °C durante 15 minutos
Eritrocitos
al 5 % (mL)
0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Mezclar e incubar a 37 °C durante 15 minutos
Resuspender eritrocitos e incubar a 37 °C durante 15 minutos (2 veces).
Unidades No
Todd
12 50 100 125 166 250 333 500 625 833 1250 2500 Hemolisis hemo…
33
Determinación de grupos sanguíneos
5. En una placa de cristal de tres pozos, colocar 25 L del paquete de eritrocitos;
agregar una gota de los antisueros (A, B, D).
RESULTADOS
El título de antiestreptolisina O corresponde a la inversa de la mayor dilución de suero en
cuyo tubo no se detecta hemólisis en el sobrenadante.
Se considera valores normales títulos hasta 166-250 unidades Todd.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
1. Aguilar-García, Vicente. (2004). VI. Reacciones de aglutinación. Gac Méd Méx Vol. 140, Suplemento
No. 3. Pp: S50-S52.
2. Martínez Romero, Aurora y Ortega Sánchez, José Luis. (2011). Manual de Laboratorio de
Inmunología Básica y Clínica. Universidad Autónoma de Chapingo y Revista electrónica de
Veterinaria [En línea] http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n040411/041108.pdf, obtenido el 26
de agosto de 2013.
3. Morales de Ramírez, Ana Margarita Paz y Gaitán Fernández, Isabel Cristina. (2011). Manual de
procedimientos de laboratorio: INMUNOLOGÍA. Universidad Mariano Galvez. Guatemala.
34
PRÁCTICA 6
CITOMETRÍA DE FLUJO
Dr. Salvador Fonseca Coronado
OBJETIVO
 Comprender los fundamentos de la Citometría de flujo y sus aplicaciones en la determinación
de marcadores celulares en investigación básica, clínica y diagnóstica.
RELACIÓN CON LOS CONTENIDOS TEORICOS DEL PROGRAMA

Se relaciona con los Mecanismos Específicos de Defensa, con la estructura y función de los
receptores celulares para el antígeno, con la estructura y función de inmunoglobulinas y con la
interacción antígeno-anticuerpo.
FUNDAMENTOS
La citometría de flujo (CF) es un método que permite el análisis de múltiples características
celulares como su morfología, la presencia de moléculas de superficie, intracelulares y
secretadas, así como su dinámica de expresión, tanto de células eucariotas como procariotas. El
equipo utilizado para estos fines es el citofluorómetro de flujo (denominado FACS, del inglés:
Fluorescence Activated Cell Sorter), el cual permite la detección de los parámetros de tamaño,
granularidad (o complejidad de la célula) y la emisión de fluorescencia.
El principio básico de la CF (Figura 1) consiste en obtener una suspensión celular (las células se
pueden marcar con anticuerpos u otras proteínas acopladas a fluorocromos capaces de unirse
en la superficie o intracelularmente a las moléculas a evaluar) y hacerlas pasar de forma individual
a través de un capilar, a una cámara donde incide sobre ellas un rayo láser. El haz de luz láser
cuando atraviesa una célula sufre una dispersión que puede ser evidenciada en un fotodetector
situado enfrente de la fuente emisora, como una disminución de la luz incidente. El tiempo que
dure el corte en la llegada de fotones al detector será proporcional al diámetro, y por tanto al
volumen o tamaño celular. Este estudio de interrupción frontal del haz láser se denomina como
Forward Scatter (FSC). Además del detector de luz situado frente al haz láser, existe otro grupo
35
óptico, que detecta la luz dispersada por las células y que se coloca formando un ángulo de 90º
con el haz láser. Esta luz es descompuesta, mediante los filtros apropiados para poder estudiar
tanto la dispersión de luz de la misma longitud de onda del láser como la emitida por los
fluorocromos. La mayor o menor dispersión de la luz y por tanto la mayor o menor detección de
luz en éste detector, será proporcional a la complejidad de la superficie celular y a las estructuras
y organelos celulares, denominándose Side Scatter (SSC); con estos parámetros, el equipo
amplifica las señales eléctricas y las convierte, mediante un sistema de tarjetas electrónicas, en
un gráfico en dos dimensiones que permite la separación de las diferentes poblaciones celulares
de acuerdo a su tamaño y granularidad (Figura 2).
Figura 1. Esquema de los sistemas de detección del citómetro de flujo.
Como se observa en la figura 1, existen una serie de detectores incorporados en el citómetro que
permiten detectar estas señales de fluorescencia. El marcaje de toda una amplia gama de
moléculas, permite que la CF sea una herramienta poderosa para realizar la caracterización de
múltiples funciones celulares.
36
Figura 2. Diagrama de tamaño vs granularidad (DOT-PLOT) de una muestra
de sangre periférica donde se muestra la capacidad de separación de las
diferentes poblaciones celulares mediante los sistemas detectores FSC y SSC.
Como se mencionó, las células pueden ser marcadas con fluorocromos libres o acoplados a
moléculas con afinidad por el componente celular que se desee evaluar, las moléculas más
utilizadas para este fin son los anticuerpos (debido a su especificidad), mediante los cuales es
posible analizar marcadores de la superficie celular (CD4, CD8 y todos los marcadores de
identidad); marcadores intracelulares (citocinas, caspasas, cinasas, proteínas virales, etc.) y
marcadores nucleares (DNA, RNA).
Los fluorocromos son una serie de compuestos químicos que tienen la capacidad de absorber la
luz del rayo láser en forma de fotones y emitirlos con menor energía (mayor longitud de onda), si
estos compuestos se encuentran acoplados a anticuerpos contra una molécula en particular, la
intensidad de la emisión será directamente proporcional a la concentración o cantidad de la citada
molécula. En la figura 3 se muestra el espectro de emisión de algunos fluorocromos utilizados en
CF.
37
Figura 3. Principales fluorocromos utilizados en CF, se muestran los excitados
por un rayo láser de argón (488 nm) y de helio-Neón (630 nm). FITC:
Isotiocianato de fluoresceína, PE: Ficoeritrina, ECD: Electron Coupled Dye
A partir de la grafica FSC vs SSC se pueden generar regiones para realizar el análisis de
poblaciones en particular, por ejemplo, en la figura, 1 se señala en rojo la región correspondiente
a los linfocitos, si se marcó esta suspensión con anticuerpos acoplados a fluorocromos contra las
subpoblaciones de linfocitos cooperadores (CD4-PE) y citotóxicos (CD8-FITC), estos se pueden
visualizar en un gráfico denominado histograma en el que se grafica la intensidad del fluorocromo
en cuestión contra el número de eventos (células) positivos a dicha molécula (Figura 4).
Figura 4. Histogramas de la región correspondiente a los linfocitos donde se

observan las poblaciones positivas a CD8 y a CD4
A partir del diagrama FSC vs SSC también se puede generar un gráfico Dot Plot donde se
esquematice la emisión de dos fluorocromos de manera simultánea, por ejemplo, si la muestra
38
marcada con el anticuerpo anti CD4-PE, se marca también con un anticuerpo anti CD69-FITC (el
cual es un marcador de activación celular), se puede identificar en el dot-plot el porcentaje de
células CD4 que están activadas (cuadrante superior derecho) de las que no lo están (cuadrante
superior izquierdo), figura 5.
La CF tiene múltiples aplicaciones en investigación básica, en la clínica y en la terapéutica de las

cuales se mencionan algunas a continuación:
ALTERACIONES EN LA MORFOLOGIA CELULAR:

• Cambios en tamaño
• Cambios en granularidad
ALTERACIONES EN EL INMUNOFENOTIPO:
• Inmunoproliferación/ Inmunodeficiencia
• Inmunodisfunción
ALTERACIONES EN EL GENOTIPO:
• Cambios en el contenido de ADN (ploidía)
• Cambios en la expresión de genes
ALTERACIONES EN LA BIOQUIMICA INTRACELULAR:

• Cambios en la síntesis y concentración de moléculas
• Cambios en la actividad de enzimas y en el flujo a través de rutas de activación
• Alteraciones en el número y la función de orgánelos subcelulares
• Cambios en la respuesta bioquímica a estímulos controlados
DETECCION DE CELULAS INFRECUENTES (“CELULAS RARAS”)

• Detección de células tumorales circulantes
• Detección de células fetales en sangre materna
39
• Detección de células activadas o antígeno-específicas circulantes
PARAMETROS IMPLICADOS DIRECTAMENTE EN EL PROCESO PATOLOGICO:

• Análisis de parámetros específicos de la patología
SELECCION DE CELULAS EN LA TERAPIA CELULAR:

• Análisis de progenitores en el transplante autólogo
• Pruebas cruzadas (“cross-match”) en transplantes heterólogos
• Detección y cuantificación de leucocitos residuales en hemopreparados
ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL CELULAR:

• Cambios en parámetros estructurales
• Cambios en parámetros funcionales
ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL DEL PACIENTE:

• Detección de recidivas y enfermedad mínima residual
• Establecimiento de patrones pronósticos de éxito terapéutico
DETECCION Y ANALISIS DE RESISTENCIA A LA TERAPIA:

• Análisis de la captación y retención de fármacos (fenotipo MDR)
• Análisis del metabolismo de fármacos
CARACTERIZACION DE LOS MECANISMOS DE MUERTE CELULAR:

• Identificación y análisis de células apoptóticas
• Identificación de células necróticas
Discusión
Discuta con sus compañeros otras aplicaciones de la citometría de flujo como la cuantificación
de citocinas con perlas fluorescentes, estudios del ciclo celular, purificación de subpoblaciones
celulares, identificación de vías de señalización, etc.
REFERENCIAS
1. Shevach, Ethan M. (2009). Immunofluorescence and Cell Sorting. Current Protocols in Immunology
5.0.1-5.0.3, Published online November 2009 in Wiley Interscience (www.interscience.wiley.com). DOI:
10.1002/0471142735.im0500s87
2. Darzynkiewicz, Z., Robinson, J.P., and Crissman, H.A. (eds.) (1994). Flow Cytometry, 2nd ed. Methods
Cell Biol.: 41 & 42. Academic Press, San Diego.
3. Mason, D.W. and Williams, A.F. (1980). The kinetics of antibody binding to membrane antigens in
solution and at the cell surface. Biochem. J.187:1-9.
4. Shapiro, H. M. (1988). Practical Flow Cytometry, 2nd ed. Wiley-Liss, New York.
40
PRÁCTICA 7
ENSAYO INMUNO ENZIMÁTICO (ELISA)

Dr. Marco Antonio Vega López
OBJETIVO
 Determinar la presencia de anticuerpos en muestras biológicas, para el diagnóstico indirecto
de patologías como el sarampión a través del inmunoensayo enzimático ELISA.
INTRODUCCIÓN
Los inmunoanálisis ligados a enzimas son técnicas en las cuales uno de los reactantes, el
anticuerpo o el antígeno, se fija en un soporte sólido, casi siempre una placa de plástico, antes
de su interacción con la muestra del paciente y el reactante revelador de la reacción que, por lo
general, es un anticuerpo conjugado a una enzima que actúa sobre un substrato-cromógeno, que
indica y detecta la presencia del reactante a analizar virando a un color.
Las pruebas de ELISA o EIA, (enzyme-linked-immuno-sorbent-assay), se basan en dos

fenómenos biológicos importantes:
1 La especificidad de los anticuerpos (Ab).
2 La amplificación de la señal generada a través de la acción de una enzima.
La sencillez metodológica del ELISA y sus reducidos requerimientos de equipos especiales,

sumada a la especificidad de los Ab monoclonales (MAb), hace que sean sencillos, baratos y de
sensibilidad aceptable para su uso en el laboratorio, por encima de los basados en la utilización
de un trazador radiactivo, (radioinmunoanálisis –RIA-), un trazador emisor de luz
(quimioluminiscencia) o un trazador fluorescente (fluorografía).
Clasificación de las pruebas inmuno enzimáticas:

Las pruebas inmuno enzimáticas pueden clasificarse en:
a) Homogéneas.
b) Heterogéneas.
41
Las primeras se realizan exclusivamente en fase liquida y con los reactivos añadidos en forma
simultánea. Se emplean para aparatos automatizados y no son de uso común. Las segundas
emplean un soporte sólido para inmovilizar a uno de los inmunorreactantes y, a partir de ello, se
realiza la reacción específica de detección. Estas últimas son las de mayor uso en el laboratorio.
En las pruebas heterogéneas, existen muchas variantes, dependiendo del tipo de analito que se
busque. Las pruebas más comunes son las de detección indirecta, donde se busca la presencia
de anticuerpos (Ab) en los pacientes. En ellas se fija el Ag de interés (de un virus o bacteria) en
la placa y sobre él se aplica la muestra (suero, saliva, líquido cefalorraquídeo, etc.). Los
anticuerpos específicos en la muestra (anticuerpo primario) se fijarán en el Ag y se harán
evidentes usando otro anticuerpo (secundario) que reconozca al primero y que está conjugado
con una enzima. El Ab secundario reaccionará con el sustrato, que debe ser incoloro y soluble y
éste, al ser degradado, deberá convertirse en un producto colorido y soluble, cuya concentración
se medirá por espectrofotometría.
También existe la variante de “sándwich”, donde se fija en la placa un anticuerpo primario (Ab de
captura), específico para el analito que se busca (por ejemplo citocinas), se coloca la muestra y
el analito capturado por el Ab primario se identifica mediante otro Ab que está conjugado con una
enzima y que también reacciona con el analito, pero en otro epítopo. El revelado se hace como
ya se explicó.
Finalmente, existe la variante competitiva, donde se trata de cuantificar la cantidad de analito de

interés. En este caso se usa una variante de la técnica de “sándwich”, donde al pozo con el Ab
de captura se añade tanto la muestra como una cantidad conocida del analito marcado con un
fluorocromo o una enzima. Esto establecerá una competencia entre el analito de la muestra y el
que nosotros añadimos en cantidades conocidas. En este caso, si la muestra no contiene al
analito, nuestro conjugado se unirá por completo al Ab de captura y tendremos la máxima señal.
Si la muestra contiene cantidades altas del analito, éste competirá con el conjugado que
añadimos y evitará que se fije al Ab de captura, de esta manera, entre más concentración de
analito tenga nuestra muestra, menos señal tendremos porque no se fijará el conjugado.
Haciendo curvas de concentración puede cuantificarse la cantidad de analito en la muestra.
42
Diagrama con los componentes principales de las pruebas de ELISA. Se
esquematiza la prueba de “sándwich”.
Sistemas alternativos de reconocimiento.

Es posible aumentar la sensibilidad de la técnica usando conjugados con otras proteínas distintas
a los Abs. Uno de esos sistemas involucra a la estreptavidina que es una proteína producida por
estreptococos y ciertas levaduras y que tiene elevada afinidad por la biotina (Ka = 1015 M 1 ).
Debido a que la biotina puede conjugarse fácilmente a distintas proteínas (entre ellas, Ab y
enzimas) por unión covalente, sin afectar su actividad biológica, se han desarrollado métodos
inmunoenzimáticos basados en la interacción estreptavidina/biotina.
Proteína A.
Es una proteína de la pared de Staphylococus aureus (cepa Cowan I) que tiene alta afinidad (Ka
= 10 8 M 1 ) por el Fc de algunos isotipos de las Ig. Tiene 4 sitios de unión pero usualmente sólo
reaccionan dos. Estas propiedades permitieron el desarrollo de diversos ELISA con proteína A.
En la presente práctica se realizará un ELISA indirecto, que consiste en buscar Ab contra Ag

conocidos, los pozos se recubren con el Ag, después se lavan y se tratan con proteína
bloqueadora irrelevante y luego se incuban con en el suero problema. Los Ab, retenidos por el
Ag se detectan por adición de un segundo Ab conjugado a una enzima (conjugado), que después
se revela adicionando el substrato de la enzima y un cromógeno. El resultado de la reacción es
la formación de un producto coloreado soluble, se realiza para diagnosticar sarampión.
43
MATERIAL REACTIVOS
1 gradilla con 10 tubos de ensayo de 12x75 IgG humana purificada por Salting Out
1 placa con micropozos Suero de ratón inmunizado con IgG humana
1 Juego de micropipetas Leche descremada al 5 % en PBS
1 Pipeta multicanal (8 ó 12 puntas) Solución de lavado (PBS-Tween 20)
Cubetas para micropipetas Conjugado de cabra anti-IgG de Ratón
Puntas para micropipetas Sustrato para peroxidasa
Estufa de incubación Solución de paro (HCl 2 N)
DIAGRAMA DE FLUJO
IgG Humana diluida en

Placa de micropozos
amortiguador de carbonatos
Incubar
Lavar R1
Solución bloqueadora
Incubar
Lavar
Suero de ratón diluido

Incubar
Lavar
Conjugado
Incubar
Lavar
Sustrato/cromógeno
Incubar
Sustrato/cromógeno
Leer absorbancia
R1: Sobrenadantes y residuos de los lavados al contenedor con agua clorada
44
METODOLOGÍA
Búsqueda de Ab de ratón contra -Globulina Humana, IgG)
Los pasos 1 al 6 se realizan previamente en otra sesión
1. Sensibilizar una placa de micropozos con 100 μL de IgG humana (50 μg/pozo) en
amortiguador de carbonatos pH 9.6, incubar durante 1 hora a 37 °C (o toda la noche a 4 °C).
2. Vaciar el contenido en recipiente con cloro, sacudir contra papel absorbente.
3. Agregar 300 μL de la solución de lavado, vaciar el contenido al recipiente con cloro (lavar tres
veces).
4. Agregar 200 μL de caseína (leche descremada) al 5 % en PBS-Tween, incubar durante

1 hora a 37 °C (o toda la noche a 4 °C).
5. Vaciar el contenido en un recipiente con cloro, sacudir contra papel absorbente.
6. Agregar 300 μL de la solución de lavado, vaciar el contenido al recipiente con cloro (tres
veces). Dejar secar, cubrir con papel parafilm hasta el momento de su uso y guardar en
refrigeración.
El día de la práctica
7. Realizar una serie de diluciones dobles, empezando por 1/10 de suero de ratón (inmunizado
con IgG); el volumen final de cada dilución debe ser de 100 L.
8. Colocar 100 L de los sueros diluidos en cada pozo. Cubrir los pozos con papel parafilm,
agitar suavemente 15 segundos. Incubar 40 minutos a temperatura ambiente.
10. Agregar 300 μL de la solución de lavado (PBS-Tween), vaciar el contenido al recipiente con
cloro (lavar tres veces).
11. Agregar 100 μL del conjugado (anti IgG de ratón, producido en cabra, unido a peroxidasa)
diluido 1/10 000 con solución bloqueadora a cada pozo. Agitar suavemente 15 segundos,
incubar 30 minutos a temperatura ambiente.
45
13. Agregar 300 μL de la solución de lavado, vaciar el contenido al recipiente con cloro (tres
veces).
14. Agregar 50 μL de solución reveladora (diaminobencidina/peróxido de hidrógeno) a cada

pozo. Agitar suavemente 15 segundos. Incubar 10 minutos en obscuridad.
15. Agregar 50 μL de la solución de paro a cada pozo.
16. Una coloración amarilla indica prueba positiva y negativa si es incolora.
RESULTADOS
Si se cuenta con un lector de ELISA el resultado (+) se asignará a la lectura mayor del valor de
la densidad óptica por sobre los controles, en caso de no contar con el lector de ELISA se hará
la lectura de manera visual.
BIBLIOGRAFÍA
1. Aguilar Torrenta, Faviola. (2001). Manual del Curso Practico de Inmunología, 1ª edición, Editorial ENCB
IPN, México DF, 204 pp.
2. Margini, Ricardo, Anibal. (1996). Inmunología e Inmunoquímica. 5ª edición. Editorial Panamericana.
Buenos Aires, Argentina. 976 pp.
3. Rojas Espinosa, Oscar. (2001). Inmunología (de memoria), 2ª edición, Editorial Panamericana. México,
DF. 374 pp.
4. Campbell, MA. (2002). ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay). [En línea]
http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/ELISA.html consultado el 30 de enero 2014.
5. The Biology Project Home. (2000). Introduction to ELISA Activity. [En línea]
http://www.biology.arizona.edu/immunology/activities/elisa/technique.html consultado el 30 de enero
2014.
46
PRÁCTICA 8
ANATOMÍA DEL SISTEMA INMUNITARIO

MVZ Ángel Germán Martínez Sosa
OBJETIVOS
 Que el estudiante identifique in situ los órganos linfáticos visibles del ratón (ganglios linfáticos
axilares, inguinales y mesentéricos; timo, bazo y placas de Peyer) haciendo énfasis en su
posición anatómica, apariencia, color y textura.
 Que logren la separación de células de un órgano linfoide primario (timo) y uno secundario
(bazo y placas de Peyer) y su identificación.

En la unidad Mecanismos específicos de defensa, los órganos primarios y secundarios del
sistema inmune y la circulación de células del sistema inmune son analizados; y a su vez
complementados con el desarrollo experimental de esta práctica.
INTRODUCCIÓN
El Sistema Inmune está formado por células, tejidos y órganos con un origen embriológico
común: el mesodermo; está constituido por alrededor de 1011 linfocitos B y 1018 linfocitos T con
diferentes receptores para el antígeno, que realizan una función de patrullaje o vigilancia de
antígenos procedentes tanto de nuestro medio ambiente interno como externo.
Los órganos linfáticos primarios, centrales o independientes son el Timo para los linfocitos T
y la Bursa de Fabricio, dependiendo de la especie animal, para los linfocitos B; su función
primordial es la maduración de las células, con la eliminación por apoptosis de las células
autorreactivas.
Los órganos linfáticos secundarios, periféricos o antígeno-dependientes son los ganglios

linfáticos que constituyen cadenas ganglionares en diversas partes del cuerpo, el bazo y las
placas de Peyer; su función primordial es filtrar la linfa formada durante los procesos inflamatorios
47
en los tejidos circunvecinos; en su interior se activa y desarrolla la respuesta inmune y mediante
los vasos linfáticos eferentes egresan los linfocitos B y T activados/memoria para posteriormente
ingresar a la circulación sanguínea sistémica.
Los órganos linfáticos terciarios son aquellos que alojan a las células de memoria y en los
procesos inflamatorios crónicos son los sitios ectópicos donde se organizan estructuras linfoides
in situ.
A nivel celular es importante tener presente que cada estirpe celular, así como sus diferentes
estadios funcionales se caracterizan por la expresión de un fenotipo o marcadores celulares
específicos; los cuales debemos conocer para su identificación y purificación que pueden
realizarse tanto por de citometría de flujo, como por purificación por perlas magnéticas MACS (del
inglés: Magnetic Antibody Cell Sorter).
MATERIAL REACTIVOS
Equipo de disección 100 mL de SSF o PBS pH 7.4
1 gradilla con 10 tubos de ensayo de 13x100 Tinción de Giemsa
3 pipetas Pasteur
3 coladeras y 3 émbolos de jeringa
2 cajas Petri y 3 portaobjetos
2 pipetas de 2 mL
Microscopio
DIAGRAMA DE FLUJO
Sacrificar un ratón por Incidir en la piel para localizar e identificar
dislocación cervical los ganglios linfáticos inguinales y axilares
R
1
Macerar y lavar las células Obtener bazo, timo y
obtenidas placas de Peyer
R
2
Resuspender en 1 mL de Realizar frotis y teñir con
PBS Giemsa
Observar a 100X para

realizar conteo diferencial
R1: Los cadáveres de ratón y órganos, envolverlos en papel y depositarlos en bolsa amarilla para
congelarlos hasta el momento de su incineración.
R2: Todos los residuos líquidos depositarlos en el contenedor que contiene agua con cloro.
R3:Contenedor para residuos de Giemsa o Wright.
48
METODOLOGÍA
1. Sacrificar un ratón por alumno, por dislocación
cervical.
2. Cortar la piel sin interesar órganos internos, desde

la laringe hasta la pelvis, para localizar e identificar
los ganglios linfáticos inguinales y axilares.
3. Realizar la identificación y disección de los

siguientes órganos, bazo, timo y placas de Peyer,
colocándolos en una caja de Petri con un poco de
SSF.
4. Macerar individualmente los órganos anteriores en

una coladera, con el extremo plano del émbolo de
una jeringa, agregar 1 ó 2 mL de SSF.
5. Lavar, centrifugando 2 veces con SSF.
6. Resuspender las células en 1 mL de SSF.
7. Realizar un frotis con cada una de las poblaciones

celulares obtenidas y teñir con Giemsa o Wright.
RESULTADOS
Describir el aspecto macroscópico de los ganglios y órganos linfáticos del ratón-
Reportar lo observado en los frotis de cada suspensión celular.
BIBLIOGRAFÍA
1. Goldsby, RA.; Kindt, TJ.; Osborne, BA. & Kuby, J. (2004). Inmunobiología. Quinta edición Mc Graw
Hill, Iztapalapa, México D.F.; 665 pp.
2. Roitt, I. (2000). Inmunología. Quinta edición Harcourt Editions; Madrid, España. 423 pp.
49
PRÁCTICA 9
HISTOLOGÍA E INMUNOCITOQUÍMICA
M. en C. Erik González Ballesteros
OBJETIVO
Conocer y comprender los fundamentos y metodología básicos de las técnicas
inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, así como sus aplicaciones en la inmunología básica,
clínica y diagnóstica.

Morfología y fisiología de los órganos y tejidos del sistema inmune e interacción antígeno
anticuerpo.
INTRODUCCIÓN
Se conocen como técnicas inmunocitoquímicas e Tabla 1. Historia de la inmunohistoquímica
inmunohistoquímicas a aquellas metodologías que
permiten la detección y localización de antígenos
determinados en preparaciones citológicas e
histológicas, esto mediante el uso de anticuerpos
específicos y sistemas de detección conjugados
principalmente con moléculas fluorescentes o
enzimas, y que en mayor o menor grado permiten la
observación simultanea de las características
morfológicas celulares y tisulares utilizando varios
tipos de microscopía.
La inmunohistoquímica comienza a utilizarse en la

década de 1940 con técnicas de
inmunofluorescencia en cortes de tejidos congelados
y es hasta la década de 1990 que adquiere mayor
relevancia sobre todo por su utilidad en patología
quirúrgica para la clasificación y diagnóstico de
neoplasias, gracias a una serie de
50
avances técnicos que de manera acumulada permitieron mejorar diversos aspectos de la
metodología.La posibilidad de conjugar anticuerpos con enzimas como la peroxidasa de rábano
y su empleo en conjunto con diferentes sustratos cromogénicos, permitieron la localización de los
antígenos al poder observar las preparaciones en el microscopio oṕtico compuesto convencional,
en técnicas comúnmente conocidas como de inmunoperoxidasa. Otros de estos avances técnicos
fueron la posibilidad de detectar antígenos en muestras fijadas con formalina y embebidas en
parafina, así como la capacidad de incrementar la sensibilidad de las técnicas empleando
marcajes indirectos que emplean anticuerpos secundarios, sistemas de detección con avidina o
estreptavidina - biotina, y más recientemente uso de sistemas de amplificación basados en
polímeros con los que se logra una elevada sensibilidad. El desarrollo de la tecnología para
producir anticuerpos monoclonales impacto de manera similar a lo observado con la mayoría de
las técnicas inmunológicas: incrementando la especificidad y la reproducibilidad de las técnicas
en las cuales son empleados estos reactivos.
FUNDAMENTOS TECNICOS
Origen, selección y preparación de la muestra.
El origen de las células y tejidos pueden ser muestras de órganos obtenidas postmortem, biopsias
obtenidas en procedimientos quirúrgicos incluyendo la obtención en el transoperatorio o en
cirugías ambulatorias, improntas de tejidos o mucosas, aspirados de órganos parenquimatosos,
frotis de líquidos corporales, preparaciones obtenidas por citocentrifugación a partir de líquidos
con baja concentración celular o a partir de cultivos celulares. Las muestras empleadas en
técnicas de inmunohistoquímica o inmunocitoquímica en la mayoría de los casos se encuentran
fijadas mediante el uso de agentes químicos como formaldehído y etanol con el fin de preservar
la morfología celular y tisular, pero con el inconveniente de la probable pérdida de las
características antigénicas de las células de la muestra. A pesar de los problemas que representa
la perdida y necesaria recuperación de antígenos la formalina amortiguada con pH neutro
continúa representando la mejor opción para conservar las características morfológicas del tejido
y la retención de moléculas de bajo peso molecular que podrían perderse en los procesos
subsecuentes. En casos donde no se conozca el resultado sobre la antigenicidad después de la
fijación de la muestra, se podrían emplear preparaciones hechas a partir de cortes de tejido
congelado en las cuales la morfología puede alterarse en diferentes grados pero garantizando el
reconocimiento de los antígenos de interés con los anticuerpos disponibles. En la actualidad
muchos de los reactivos que se encuentran disponibles en el mercado son obtenidos con
metodologías que garantizan la utilidad de los mismos en muestras fijadas y embebidas en
parafina.
51
Con el fin de lograr un resultado óptimo en Tabla 2. Esquema de estandarización para
recuperación de antígenos
las técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas es necesario realizar
un proceso de recuperación de antígenos
con el fin de que los anticuerpos puedan
reconocer los determinantes antigénicos
conformacionales que resulten alterados por
la acción del agente fijador, ya sea que actúe
coagulando y precipitando (etanol y metanol)
o formando ligamientos cruzados
(formaldehído y glutaraldehído) en las
proteínas celulares.
Existen múltiples métodos para la recuperación de antígenos que principalmente se basan en

aplicación de calor, pH o acción de enzimas proteolíticas para lograr revertir el efecto del agente
fijador particularmente el ligamiento cruzado provocado por el formaldehído.Las condiciones
particulares de estos dos factores para cada caso dependerán de las características de la
muestra, el método de fijación empleado, objetivo de la tinción y antígeno en estudio. Se colocan
las preparaciones en agua destilada o diversas soluciones con pH ácido o básico y se calientan
temperaturas alrededor a los 100 ºC dado que las proteínas fijadas resisten más altas
temperaturas que las proteínas nativas e incluso se puede emplear un horno de microondas
convencional para calentar la muestra, aunque se debe estandarizar la metodología en cada
laboratorio.
Proceso de tinción y reactivos utilizados.

Dependiendo de las células o tejidos utilizados se deberán realizar uno o varios pasos de bloqueo
con los cuales se busca reducir al máximo el fondo por uniones inespecíficas en la tinción. En
algunos casos se buscará bloquear sitios de unión inespecíficos empleando soluciones con
proteínas ajenas al sistema, esto es no relacionadas con el antígeno o con los reactivos de
detección, por ejemplo soluciones de leche descremada o suero normal de la especie en las cual
se generó el anticuerpo secundario.
En otros casos se deberá bloquear la actividad endógena de enzimas en el tejido como es el caso
de peroxidasas o la presencia de biotina que podría interferir con el paso de detección en caso
de utilizar el sistema avidina o estreptavidina con biotina.
52
Después de cada uno de los pasos que
requieran incubación con alguno de los Figura 1. Sistemas de detección en
reactivos se deberán realizar lavados inmunohistoquímica
adecuados comúnmente con soluciones

isotónicas balanceadas y neutras como alguna
de las diferentes formulaciones de PBS. Una
vez que se tiene la muestra bloqueada
comúnmente se utiliza un anticuerpo primario
monoclonal o policlonal específico para los
antígenos que se busca detectar y
dependiendo de la disponibilidad de reactivos o
si de las características y objetivo de la tinción,
se busque incrementar la sensibilidad o la
especificidad de la técnica. A pesar de que el
emplear técnicas indirectas puede incrementar
el fondo de la tinción, en muchos casos es
necesario incrementar la sensibilidad para
conseguir la detección del antígeno en
cuestión. También cabe mencionar que
muchas de las técnicas tienen como objetivo la
detección de anticuerpos específicos en el
suero de los individuos, como sucede en
fenómenos de autoinmunidad. En cualquiera de
los casos se deben estandarizar los periodos y
temperatura de incubación con cada uno de los
reactivos, así como realizar la titulación de los
mismos con el fin de determinar la
concentración óptima obtener en la tinción la
máxima señal específica y el menor fondo
inespecífico.
En todos los casos en la incubación se debe evitar que la muestra se deshidrate mediante el
empleo de cámaras húmedas, ya que si la muestra se seca en cualquiera de los pasos de
incubación se incrementará el pegado inespecífico y con ello el fondo de la tinción.
53
La incubación con los reactivos para detección sigue los mismos principios que los mencionados
para los anticuerpos primarios, con la diferencia que en la mayoría o prácticamente todos los
casos los anticuerpos empleados son de tipo policlonal. También pueden emplearse avidina o
estreptavidina como sistema de detección cuando el anticuerpo primario se encuentra conjugado
con biotina. Existen sistemas de detección que utilizan moléculas con las cuáles se permite que
exista un mayor número de anticuerpos conjugados que detecten los antígenos, como ejemplo
se tiene a moléculas de dextrana con múltiples anticuerpos unidos a ella y permiten la
amplificación de la señal, sobretodo cuando los antígenos a detectar se encuentran en baja
cantidad en la muestra. En todos los casos estos reactivos secundarios estarán conjugados con
moléculas que permitan la detección del antígeno en la muestra directamente o mediante la
adición posterior de una solución reveladora que contendrá por ejemplo el sustrato y una
sustancia cromogénica en caso de que el sistema de detección dependa de la acción de una o
varias enzimas en el caso de la tinción múltiple. Es importante en este paso que la totalidad de la
muestra este inmersa o cubierta con la dilución del conjugado.
Después de lavar adecuadamente las preparaciones para eliminar al máximo el exceso de

conjugado si la técnica es inmunoenzimática se procede a agregar la solución reveladora que
contiene el sustrato y el cromógeno específicos para la enzima del sistema de detección. Existen
varias sustancias cromogénicas utilizadas en las tinciones inmunohistoquímicas que pueden ser
utilizadas con las enzimas más comúnmente utilizadas como peroxidasa de rábano, fosfatasa
alcalina y glucosa oxidasa, y que tienen diferentes características de color y solubilidad, lo que
permite implementar técnicas de tinción doble con la selección adecuada de reactivos para
detectar dos antígenos simultáneamente en la misma preparación. Es importante la
estandarización de los tiempos necesarios para el desarrollo de la coloración óptima de la tinción,
frecuentemente esto se realiza directamente con la observación de las laminillas en el
microscopio. También se pueden realizar tinciones dobles empleando conjugados fluorescentes
en las cuales se detectan los antígenos diferentes empleando fluorocromos que se exciten con
luz de la misma o diferente longitud de onda y que emitan luz con diferente longitud de onda, para
realizar el análisis de microscopia de fluorescencia e incluso por microscopia confocal para
determinar colocalización.
La preparación finalmente debe ser contrateñida en las técnicas que permitan la observación
simultanea de los detalles morfológicos de las células o tejidos estudiados, como sucede en
técnicas enzimáticas, en las cuales comúnmente se utiliza hematoxilina para evidenciar los
54
núcleos de las células y en este caso también debe estandarizarse el tiempo óptimo para la
contratinción o tinción de contraste. En esta caso se debe considerar el solvente en el cual se
encuentra preparado el colorante para no eliminar de la muestra el cromógeno en caso de que el
producto colorido sea soluble en dicho solvente, por ello en muchos casos se prefiere evitar
tinciones con hematoxilina en alcohol. Otra consideración en este tipo de técnicas es el interés
en poder conservar las preparaciones mediante montaje permanente, para lo cual también se
debe tomar en cuenta las características de solubilidad en alcohol del producto colorido. Como
en toda prueba o técnica para diagnóstico o investigación es importante el contemplar controles
positivos, negativos y otros que sean necesarios para dar soporte a los resultados obtenidos.
Tabla 3: Cromógenos utilizados en

inmunohistoquímica.
Figura 2. Tinción inmunohistoquímica doble. Se

muestra la tinción secuencial con peroxidasa de
rábano y fosfatasa alcalina de un corte de
linfonodo para la detección de cadenas ligeras y
.
USOS DE LAS TÉCNICAS INMUNOCITOQUÍMICAS E INMUNOHISTOQUÍMICAS

Las técnicas de inmunocitoquímica e inmunohistoquímica tienen diversas aplicaciones en
diferentes campos de las ciencias biomédicas sin limitarse a uno de ellos en particular tanto en
estudios in vitro como in vivo. En inmunología tiene aplicaciones en inmunología básica
55
utilizándose en una gran variedad de estudios morfológicos y fisiológicos de células, tejidos y
órganos del sistema inmune; inducción y activación de la respuesta inmune, ontogenia y filogenia
del sistema inmune o en estudios de inmunología comparada; en inmunología clínica en estudios
de inmunopatología como en hipersensibilidades, autoinmunidad e inmunodeficiencias; en
inmunología diagnóstica para el diagnóstico de enfermedades infecciosas virales, bacterianas,
micóticas y parasitarias. En biología celular y molecular para estudios de morfología y fisiología
celular como aquellos que involucran el citoesqueleto, marcadores celulares, ciclo celular, etc.
Una de las áreas con mayor desarrollo en el campo de la inmunocitoquímica e
inmunohistoquímica es la patología, en particular en estudios oncológicos que permiten el
diagnóstico, clasificación y determinación del grado de malignidad de neoplasias a partir de
biopsias o aspirados de tejido neoplásico o de linfonodos regionales con el fin de determinar
metástasis a partir del tumor primario, detección de las alteraciones a nivel genético asociadas
con diferentes neoplasias para lo cual pueden complementarse con técnicas moleculares como
hibridación in situ, detección de marcadores de linaje o diferenciación celular.
DESPARAFINIZADO Y TINCIÓN DE DE MUESTRAS EMBEBIDAS EN PARAFINA

POR INMUNOHISTOQUÍMICA (Técnica empleada en CINVESTAV)
Todas las incubaciones se hacen en cámara húmeda y debe evitarse que la muestra se seque
una vez desparafinizada.
1. La laminilla deberá haber estado a 40 °C toda la noche en horno para adherir bien el tejido
al vidrio.
2. La laminilla se sumerge en xilol por 15’ y se repite la operación en otro baño de xilol.
3. Se procede a rehidratar la muestra 2 veces en alcohol absoluto.
4. Se bloquea la peroxidasa endógena en metanol absoluto adicionado con 2 % de peróxido
de hidrógeno, por 45’.
5. El tejido se lava con PBS tres veces (3’ c/u) y se pone suero normal de cabra (frasco 1) por
45’ en cámara húmeda.
6. Se decanta el suero y se pone el anticuerpo monoclonal (MAb) a la concentración óptima.
Se incuba 2 hrs en cámara húmeda.
7. Se lava con PBS, tres veces y se incuba con el anticuerpo secundario (cabra anti-ratón
biotinilado, frasco 2), 45’ en cámara húmeda.
8. Se vuelve a lavar con PBS, tres veces, y se incuba con estreptavidina-peroxidasa (frasco 3)
por 45’ en cámara húmeda.
9. Se lava 3 veces con PBS y se añade el substrato (DAB), vigilando la reacción bajo
microscopio y deteniéndola sumergiendo la laminilla en PBS o agua.
56
10. Se contratiñe con hematoxilina de Harris por unos segundos, se azulea con agua de la llave
y, de ser necesario, se destiñe con alcohol ácido.
11. La laminilla se deshidrata con alcoholes seriados (70-100 %) y en xilol dos veces.
12. Se monta en resina sintética y se deja secar 12 hrs.
Con esta técnica las células que fueron reconocidas por el anticuerpo, y que posteriormente son
reveladas con DAB se tiñen de color café y la hematoxilina nos sirve como color de contraste.
METODOLOGÍA
Se observaran al microscopio diferentes cortes histológicos de órganos y/o tejidos teñidos como
se describió en la técnica.
BIBLIOGRAFÍA
1. Dabbs DJ. (2010). Diagnostic Immunohistochemistry.. Theranostics and Genomic Applications, 3rd
edition. Saunders Elsevier, USA.
2. Hofman FM & Taylo CR. (2013). Immunohistochemistry. En Current Protocols in Immunology 21.4.21-
21.4.26, DOI: 10.1002/0471142735.im2104s103, John Wiley & Sons, Inc. USA
3. Taylor, CR. & Rudbeck L. (editors). (2013). Immunochemical Staining Methods Handbook, 6rd edition.
Dako, Agilent Technologies. USA.
57
PRÁCTICA 10
ELECTROFORESIS
Dr. Marco Antonio Vega López y QFB Ladislao Palomar Morales
OBJETIVO
 Realizar la separación de una mezcla de proteínas sometiéndolas a un campo eléctrico
utilizando como soporte un gel de poliacrilamida.

En la Unidad tres se estudian los Mecanismos Específicos de Defensa, abordándose en el punto
3.3 y 3.10 los conceptos de Antígeno e inmunoglobulinas, respectivamente, ambos de naturaleza
proteínica principalmente. Planteándose además como contenido práctico la separación y
purificación de anticuerpos.
INTRODUCCIÓN
La electroforesis puede definirse como un tamizado molecular a través de un gel de corrimiento.
En algunos geles, como los de agarosa, los poros no son homogéneos y son suficientemente
grandes como para no impedir la migración de la mayoría de las moléculas proteínicas, por lo
que aquí la separación dependerá fundamentalmente de su carga neta. En los geles de
poliacrilamida, modificando las condiciones de la polimerización, pueden producirse poros de
diferentes diámetros, por lo que, para un gel de determinado poro, el tamaño molecular y la carga
neta serán los factores determinantes de la separación de las moléculas de una mezcla.
Los geles de poliacrilamida son el resultado de la polimerización, de la acrilamida

(CH 2  CH  CO  NH2 ) y de su entrecruzamiento con la N-N-metilen bisacrilamida
(CH2  CH  CO  NH  CH2  NH  CO  CH  CH2 ) . El poro del gel formado dependerá de las
concentraciones relativas de ambos reactivos durante la polimerización. La polimerización de la

acrilamida necesita de un iniciador del proceso. Los más comúnmente usados son el persulfato
58
de amonio y la riboflavina. Se añade, además, como catalizador N,N,N',N'-tetrametil etilendiamina
(TEMED). El persulfato de amonio-TEMED cataliza la formación de radicales libres, lo que inicia
la polimerización. La base libre TEMED retarda la polimerización.
La electroforesis en geles de poliacrilamida se realiza en condiciones fijas de pH, conteniendo

dodecilsulfato de sodio (SDS),para eliminar la carga intrínseca del péptido ante el exceso de
carga negativa del SDS; como consecuencia, la carga de todas las moléculas será prácticamente
idéntica, por lo que su desplazamiento en un campo eléctrico, en un gel de determinada
porosidad, dependerá exclusivamente de su tamaño molecular. Por lo que comparando su
movilidad con sustancias de peso molecular conocido, que se corren simultáneamente, se
determina el peso molecular relativo de las proteínas a analizar.
La electroforesis en gel de poliacrilamida se desarrolla usando sistema amortiguadores continuos

o discontinuos. En el primer caso, los iones que constituyen la solución amortiguadora durante
todo el recorrido de la muestra (gel separador) son los mismos y el pH es constante. En algunas
situaciones sólo puede variar la concentración iónica en los vasos de contención o tanques.
Cuando se usan estos sistemas, las muestras a analizar se colocan directamente en el gel
separador. En los sistemas discontinuos, la solución amortiguadora de los geles y el de los
tanques de los electrodos son diferentes. Normalmente el pH de ambas soluciones
amortiguadoras es diferente. Las muestras a analizar se colocan en un gel de poro grueso (gel
concentrador), que se ha hecho polimerizar sobre el gel separador (pH 8.8). La solución
amortiguadora del recipiente que contiene el cátodo es Tris-glicina con pH 8.3.
Si la muestra ha sido reducida con 2-mercaptoetanol (u otro reductor como el ditiotreitol), los
enlaces disulfuro intra e intercatenarios se disocian, la estructura cuaternaria se pierde y las
subunidades se separan como cadenas polipeptídicas individuales.
TINCIÓN CON AZUL DE COOMASSIE

Una vez terminado el corrimiento electroforético, el gel se coloca en azul de Coomassie, para
teñir las proteínas corridas. Este colorante permite detectar de cantidades hasta a 0.1 g de
cualquier proteína en una banda fina. Dado que el colorante es preparado con ácido acético, la
fijación de las proteínas y su coloración ocurren al mismo tiempo.
59
MATERIAL REACTIVOS
Cámara de electroforesis con accesorios Solución de monómeros
Fuente de poder TEMED
1 vaso de precipitados de 500 mL SDS al 10%
1 matraz Erlenmeyer Persulfato de amonio al 10%
1 pipeta Pasteur y propipeta Amortiguador TRIS-HCl pH = 6.8 y pH = 8.8.
1 triángulo de porcelana Agar noble al 1%
1 tripie Agua destilada
Tela de asbesto Solución reguladora de corrimiento
Mechero Solución reguladora de muestra
Tubos Eppendorf Marcadores de peso molecular
Micropipetas y puntas para micropipetas Muestras a separar
Gradilla de unicel para colocar muestras Solución de azul de Coomassie
Baño María Soluciones decolorantes I y II
Recipiente hermético Carbón activado
Agitador
Embudo y triángulo de porcelana
Transluminador
Regla *Opcional
2-mercaptoetanol, urea 6 M o enzimas
DIAGRAMA DE FLUJO
Preparación de Preparación de R1
las muestras la cámara
Colocar las muestras en la

cámara
R2 Correr la
electroforesis
Determinar el Rf de las
diferentes proteínas y calcular
R3 Teñir el gel
sus pesos moleculares
R1:El polímero de acrilamida aunque no es un residuo peligroso, se debe incinerar

R2:La solución de corrimiento del tanque inferior puede reutilizarse dos o tres veces; la del tanque superior
deberá neutralizarse antes de ser desechada al drenaje
R3: Los decolorantes I y II deben filtrarse con carbón activado para su recuperación y posterior reutilización;
En caso de desecharse deben guardarse en contenedores destinados para ello. El papel filtro debe
ser incinerado.
60
METODOLOGÍA
1. Ensamblar los cristales de la cámara de electroforesis, sellar tres lados con agar y dejar secar.
2. Preparar el gel separador, a la concentración deseada (ver tabla en el anexo), el persulfato

de amonio y el TEMED, se agregan a la mezcla justo antes de verterla en la cámara; verter
el gel hasta una altura de aproximadamente 75% de la cámara, cubrir con 150 µl de
isopropanol, dejar gelificar y desechar el isopropanol.
3. Preparación del gel concentrador, en forma semejante al gel separador, y verter en la cámara;
colocar el peine para formar los carriles.
4. En tubos Eppendorf colocar de 20 a 30 µg de la muestra a separar y agregar el mismo

volumen de la solución reguladora de muestra; hervir 3 minutos en baño María.
5. Llenar los tanques superior e inferior con la solución de corrimiento.
6. Colocar las muestras y marcadores de peso molecular, en los carriles, con micropipeta.
7. Conectar los cables de la corriente eléctrica en los polos correspondientes, prender la fuente
de poder a 100 volts, dejar correr hasta la separación total de los antígenos.
8. Una vez terminada la electroforesis desmontar la cámara y retirar el gel; teñir el gel con azul
de Coomassie.
9. Desteñir el gel con el decolorante I (ácido acético, metanol y agua), se deben observar bandas
de antígeno reveladas y finalmente colocar en decolorante II.
10. Colocar en el transluminador y medir la distancia recorrida por el frente del disolvente y cada
una de las muestras, para calcular el Rf de cada proteína y de los marcadores de peso
molecular.
distancia recorrida por la muestra

Rf 
distancia del frente de corrimiento
61
Ejemplo de bandas de Proteínas en una electroforesis
RESULTADOS
Grafica de Rf vs. Log del peso molecular de los marcadores de peso molecular.
Tabla de Rf y peso molecular de las proteínas de las muestras.
PRECAUCIONES
1. La cámara de electroforesis debe quedar bien ensamblada y bien sellada con el
agar.
2. Manejar con guantes la acrilamida y bisacrilamida, ya que son carcinógenos.
3. Preparar correctamente los geles, ya que pueden fragmentarse, no gelificar o no
separar adecuadamente las proteínas.
4. Cuidar el proceso de decoloración, para evitar decolorar totalmente las proteínas
DISCUSIÓN
Discutir la importancia de la electroforesis para la separación, purificación e identificación de
antígenos y anticuerpos.
BIBLIOGRAFÍA
1. Cultek. (2006). Soluciones Western Blot. [En línea]
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/CULTEK-TecnicaWB.pdf, obtenida el 31 de junio de 2011.
2. Laemmli, V. K. (1970). Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head Bacteriophage
t. Nature. 227: 680-685.
3. Margini, Ricardo Anibal. (1996). Inmunología e Inmunoquímica. 5ª edición. Editorial Panamericana.
Buenos Aires, Argentina. p. 976.
4. Towbin. H. Stahehelin, T, Gordon. (1979). Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide
Gels to Nitrocellulose-Sheets; procedure and some applications, proc, Nat, Acad. Sci, USA, 76 (9):
4350-4354.
62
APÉNDICE: PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Tris/HCl 1.5 M pH 8.8
Pesar 18.15 g de Tris
Disolver el Tris en 50 mL de agua destilada
Añadir gota a gota HCl concentrado para ajustar el pH a 8.8
Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL)
Tris/HCl 1 M pH 6.8
Pesar 12.1 g de Tris
Disolver el Tris en 50 mL de agua destilada
Añadir gota a gota HCl concentrado para ajustar el pH a 6.8
Completar con agua destilada hasta el volumen final (100 mL)
SDS 10 % (p/v)
Pesar 10 g de SDS
Añadir agua destilada hasta completar el volumen de 100 mL
Glicerol 50 % (v/v)
Tomar un volumen de 50 mL de glicerol al 100 %
Añadir 50 mL de agua destilada
Azul de bromofenol 1 % (p/v)

Pesar 100 mg de azul de bromofenol
Completar con agua destilada hasta 10 mL y mezclar hasta disolver
Filtrar la solución en papel Whatman No 1 para eliminar el colorante no disuelto
Acrilamida 30%
La solución de acrilamida al 30 % (p/v) es una mezcla de acrilamida (29.2 g) y bisacrilamida
(0.8 g).
Pesar ambos reactivos y añadir agua destilada hasta 100 mL
Filtrar en papel de filtro Whatman No1
Persulfato de amonio al 10 % (p/v)

Pesar 0.5 g de sulfato de amonio
Disolver en 5 mL de agua destilada
Solución Amortiguadora de Corrimiento

Pesar 3 g de Tris (25 mM)
Pesar 14.4 g de glicina (192 mM)
Pesar 1 g de SDS (0.1 %)
Añadir agua destilada hasta completar 1 L
NOTA: El pH debería ser de aproximadamente 8.3. Se puede preparar una solución 10 veces
más concentrada y diluir el volumen necesario en el momento del corrimiento. Esta solución
puede almacenarse indefinidamente a temperatura ambiente.
Solución Reguladora de muestra 2X

0.24 mL de Tris/HCl 1M pH 6.8
2 mL de Glicerol 50 %
0.8 mL de SDS 10 %
0.5 mL de 2-mercaptoetanol* Opcional
0.5 mL de azul de bromofenol
0.96 mL de agua destilada
63
CANTIDADES PARA LA PREPARACIÓN DE GELES POLIACRILAMIDA.
Gel Separador Cantidad a preparar
6% 5 mL 10mL 15 mL 20 mL 25 mL 30 mL 40 mL 50 mL
H2O 2.7 5.3 8.0 10.6 13.3 15.9 21.1 26.5
30 % Acrilamida Mix 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10 % SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10 % APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04
H2O 2.3 4.6 7.0 9.3 11.6 13.9 18.6 23.2
30 % Acrilamida Mix 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.4
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10 % SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10 % APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03
H2O 2.0 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.8 20.0
30 % Acrilamida Mix 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.6
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10 % SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10 % APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
H2O 1.7 3.3 5.0 6.6 8.3 9.9 13.2 16.4
30 % Acrilamida Mix 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 20.0
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10 % SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10 % APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
H2O 1.2 2.3 3.5 4.6 5.7 6.9 9.2 11.4
30 % Acrilamida Mix 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 20.0 25.0
1.5 M Tris (pH 8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5
10 % SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
10 % APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5
TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02
Gel Concentrador 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL 6 mL 8 mL 10 mL
H2O 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8
30 % Acrilamida Mix 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7
1.0 M Tris (pH 6.8) 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0.75 1.0 1.25
10 % SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
10 % APS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1
TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01
64
PRÁCTICA 11
INMUNOELECTROTRANSFERENCIA
OBJETIVO
 Realizar la transferencia de proteínas separadas electroforéticamente de un gel de
poliacrilamida hacia una membrana, de tal manera que se conserve el perfil electroforético.
 Realizar el reconocimiento de proteínas, separadas por electroforesis y transferidas a un

soporte sólido (por ejemplo: papel de nitrocelulosa), por medio de anticuerpos y su posterior
revelado con el uso de conjugados, sustratos y cromógenos.

En la Unidad 3 se estudian los Mecanismos Específicos de Defensa (MED); en los puntos 3.3
antígenos y antigenicidad, 3.10 Estructura y función de inmunoglobulinas y 3.11 reacción
antígeno cognato, planteándose además como práctica de laboratorio la conjugación y
manipulación de inmunoglobulinas.
INTRODUCCIÓN
La inmunoelectrotransferencia (o Western blot) se realiza en tres etapas:
1. Electroforesis
2. Transferencia
3. Revelado
La primera de ellas, la electroforesis, es semejante a la realizada la clase pasada. La

electroforesis difiere en que sólo se forman dos carriles en el gel; uno pequeño para los
marcadores de peso molecular y otro grande para la muestra.
La segunda de ellas, la transferencia de proteínas o blotín supone la inmovilización de las

proteínas sobre membranas sintéticas, seguido de la detección empleando sistemas
especialmente diseñados para la tinción de blots.
65
El método para proteínas más potente es el denominado Western blot en el que las proteínas
son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes Y posteriormente se transfieren a una membrana, mediante la aplicación de un
campo eléctrico perpendicular al gel (electroblotting). Una vez completada esta operación las
proteínas de interés son reveladas por el agregado de un anticuerpo específico.
El nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Brúñete (Analytical
Biochemistry, 112:195-203, 1981) como un juego de palabras por los nombres Southern y
Northern de las técnicas que se usan con el mismo fin pero que son aplicadas a los ácidos
nucleicos. Luego que Edwin Southern diseñara la técnica que lleva su nombre para detectar ADN,
por oposición se denominó Northern a la técnica aplicada al ARN. Finalmente como una broma,
la técnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para proteínas fue denominada Western
El electroblotting es el método donde las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana
electroforéticamente. El procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja plana
papel de filtro empapado en buffer de transferencia, el gel, la membrana en contacto directo con
el gel, más papel de filtro y finalmente una esponja plana. Este conjunto se recoge entre dos
capas de plástico perforado (cartucho) y se introduce en una cámara en la que se encuentra una
solución amortiguadora de transferencia y dos electrodos planos (diseñados para conseguir un
campo uniforme en toda la superficie del gel). Se dispone de forma que el gel quede hacia el
ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+) (figura 1). La carga neta de las proteínas en el caso
de los geles de SDS-PAGE es negativa debida a la carga del SDS.
Figura 1. Armado del cartucho de transferencia
66
La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separación entre electrodos), que suele corresponder
a 0.3 a 2 Ampere, de 1 a 4 horas. La velocidad de transferencia es inversamente proporcional al
tamaño de la proteína. El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solución por lo que se
recomienda refrigerar el sistema y recircular el amortiguador.
Una vez realizada la transferencia la membrana se puede analizar inmediatamente o bien

conservarla en frío (2 a 8 ºC) durante meses.
La tercera etapa consta de tres reacciones sobre la membrana, las primeras dos de ellas son
reacciones inmunológicas, cuya velocidad puede ser modificada por factores como: La
concentración de los reactivos, la temperatura, el pH, etc.
En la primera reacción el antígeno pegado al papel de nitrocelulosa interacciona con su

anticuerpo específico:
Ag + Ab  AgAb
Una segunda reacción ocurre entre este complejo y un anticuerpo ligado a una molécula para
hacer visible la reacción:
AgAb + AbM  AgAbAbM
Y finalmente esta molécula reacciona para hacer visible la reacción.
Esta molécula puede ser una enzima, un flourocromo, o un isótopo radiactivo:

En el caso de la enzima se agrega el sustrato y un cromógeno;
En el caso de un flourocromo se hace incidir luz de determinada longitud de onda.
Figura 2. Esquema de las reacciones en el papel de nitrocelulosa
67
Parte importante de esta técnica es la eliminación de las moléculas que no han reaccionado,
formando enlaces permanentes (covalentes), mediante el uso de tensoactivos suaves como el
tween 20.
DIAGRAMA DE FLUJO
Hidratar membrana de
Electroforesis de Formar el “cartucho” nitrocelulosa, papel filtro y
IgG Humana para transferir esponjas en amortiguador de
transferencia
Transferir R2
R1
Revisar la transferencia
con rojo de Ponceau R3
Eliminar el colorante con

R3 agua destilada
Bloquear la membrana con

Leche descremada R4
Cortar el papel de nitrocelulosa

R5
en tiras de3 a 5 mm
Colocar el número de tiras

Diluir el suero de necesarias en los carriles
ratón con solución
de bloqueo
Agregar el suero problema e
incubar. Lavar R6
Diluir el conjugado
Agregar el conjugado e
con solución de R7
incubar
bloqueo
Preparar el Agregar el sustrato y cromógeno

sustrato/cromógeno Detener la reacción R8
R1: Residuos de electroforesis, ver práctica anterior.

R2: Amortiguador de transferencia, puede ser reutilizado dos o tres veces, el residuo final se coloca en un
contenedor adecuado.
R3: La solución de rojo de Ponceau, puede ser reutilizada varias veces.
R3a: El agua de los lavados del rojo de Ponceau, se puede tirar al drenaje.
R4, R5, R6, R7 y R8: Se colocan en la palangana con cloro, antes de desecharlos al drenaje.
68
MATERIAL REACTIVOS
Cámara de electroforesis con accesorios Solución de monómeros
Cámara de transferencia con accesorios TEMED
Micropipetas y puntas para micropipetas SDS al 10%
Papel de nitrocelulosa Persulfato de amonio al 10%
Fuente de poder Amortiguador TRIS-HCl pH = 6.8 y pH = 8.8.
2 vasos de precipitados de 50 mL Muestras a separar (IgG humana purificada)
2 vasos de precipitados de 200 mL Marcadores de peso molecular
1 vaso de precipitados de 500 mL Agar noble al 1 %
1 matraz Erlenmeyer Agua destilada
1 pipeta Pasteur y propipeta Solución reguladora de corrimiento
1 triángulo de porcelana Solución reguladora de muestra
1 tripie Amortiguador de transferencia
Tela de asbesto Tiras de papel de nitrocelulosa
Mechero Rojo de Ponceau
Tubos Eppendorf Solución bloqueadora
Gradilla de unicel para colocar muestras Sueros problema
Baño María Conjugado (anticuerpo-enzima)
Pipeta. Solución de lavado: PBS-tween 20
Pinzas y Bisturí. Sustrato para la enzima y cromógeno
Regla
Placa de pozos para tiras de papel de
nitrocelulosa *Opcional
Agitador 2-mercaptoetanol, urea 6 M o enzimas
METODOLOGÍA
1. Una vez terminada la electroforesis, desmontar el gel y colocar en solución reguladora de
transferencia
2. Hidratar la membrana de nitrocelulosa durante 10 segundos en metanol, aclarar en agua
destilada y poner en la solución reguladora de transferencia.
3. Hidratar en la solución reguladora de transferencia las esponjas y el papel filtro.
4. Llenar con la solución amortiguadora de transferencia la cámara de transferencia hasta el
85 %.
5. Colocar en la posición adecuada en función de los electrodos, una esponja, un papel de filtro
y el gel PAGE-SDS.
6. Sobre el gel perfectamente plano, colocar cuidadosamente la nitrocelulosa, y alisar varias
veces MUY CUIDADOSAMENTE con un tubo de ensayo para eliminar las burbujas de aire.
7. Cubrir de nuevo con papel de filtro y esponja. Colocar el cartucho en la cámara de
transferencia; Transferir a 125 mA, por 1 hora.
69
8. Teñir el papel de nitrocelulosa con rojo de Ponceau, para comprobar si se realizó la
transferencia.
9. Decolorar con agua destilada, incubar con la solución bloqueadora durante 2 Hr a temperatura
ambiente o toda la noche a 4 °C.
10. Cortar el papel de nitrocelulosa en tiras de 3 a 5 mm de ancho.
11. Colocar las tiras de papel de nitrocelulosa en los carriles de la placa.
12. Incubar las tiras de papel, con 1.5 mL de los sueros problema diluidos 1/100 con solución
bloqueadora, e incubar 20 minutos a temperatura ambiente; decantar el sobrenadante.
13. Lavar 5 veces, con la solución de lavado, por 1 minuto cada vez.
14. Incubar las tiras de papel, con 1.5 mL del conjugado diluido 1/10 000 en solución bloqueadora,
por 20 minutos a temperatura ambiente; decantar el sobrenadante.
15. Lavar 5 veces con la solución de lavado, por 1 minuto cada vez.
16. Incubar las tiras de papel, con 1.5 mL de la mezcla sustrato/cromógeno hasta la aparición de
las bandas.
17. Agregar 0.5 mL de la solución de paro; decantar el sobrenadante.
18. Secar las tiras al aire.
RESULTADOS
Indicar el PM de las proteínas del extracto antigénico que son reconocidas por cada uno de los
sueros problemas.
BIBLIOGRAFÍA
1. CulteK. (2006). Soluciones Western Blot. [En línea]
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/CULTEK-TecnicaWB.pdf, obtenida el 31 de junio de 2011.
2. Laemmli, V. K. (1970). Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head Bacteriophage
Nature . 227: 680-685 pp.
3. Margini, Ricardo (Anibal). 1996 Inmunología e Inmunoquímica. 5ª edición. Editorial Panamericana.
Buenos Aires, Argentina. 976 pp.
4. Towbin. H. Stahehelin, T, Gordon. (1979). Electrophoretic Transfer of Proteins from Polyacrylamide
Gels to Nirtocellulose-Sheets; procedure and some applications, proc Nat Acad Sci, USA, 76 (9): 4350-
4354 pp.
70
ANEXO PREPARACIÓN DE REACTIVOS
Reactivos para la electroforesis
Ver práctica anterior
Amortiguador de transferencia (según Laemmli)

Tris -HCL 50 mM, glicina 0.196 M, pH 8,3 con 20 % de metanol añadido
Solución de rojo de Ponceau

Rojo Ponceau S al 0.5 % y ácido tricloroacético al 5 % en agua destilada.
Solución Bloqueadora
Debe ser una proteína inerte al sistema inmune, las más usadas son albúmina, caseína o gelatina.
Albúmina bovina al 1 % (caseína al 1% o gelatina al 1 %) en PBS pH 7.2; no utilizar azida de
sodio (inhibe la peroxidasa). Para algunos procedimientos se puede agregar Tween 20 al 0.05 %.
Sueros y anticuerpos
Todos los sueros y anticuerpos deben ser diluidos en solución bloqueadora.
Solución de lavado
PBS pH 7.2 con Tween-20 al 0.05%.
Solución de paro
Ácido sulfúrico 2N.
Solución de sustrato cromógeno (para peroxidasa)

Para 60 mL, disolver 30 mg de 4-Cloro-1-naftol en 10 mL de metanol (proteger de la luz). Agregar
50 mL del amortiguador Tris pH 7.5 y 25 μL de peróxido de hidrógeno concentrado (35 %).
71
PRÁCTICA 12
MODELOS EXPERIMENTALES Y VÍAS

DE INMUNIZACIÓN
Dr. Salvador Fonseca Coronado
OBJETIVOS Y COMPETENCIAS
 Al finalizar el procedimiento experimental es deseable que el alumno haya adquirido las
siguientes competencias:
 Conocer la importancia de los modelos de experimentación en el ámbito de la investigación

básica, clínica y diagnóstica en inmunología.
 Entender los procedimientos y manejar de manera adecuada y ética a los ratones sujetos de
experimentación en el curso.
 Conocer las vías de inoculación de antígenos y adquirir la habilidad de realizar la

inoculación de antígenos por vía intraperitoneal.
 Comprender la importancia del uso de adyuvantes en la activación de los MID y los MED.

En la unidad 3 se abordan los mecanismos específicos de defensa (MED), en esta práctica se
lleva a cabo una introducción a la forma en que se da lugar a la activación de los MED mediante
la inoculación (exposición) a agentes inmunógenicos y a la importancia de los adyuvantes como
activadores de los MID.
Manejo de animales de laboratorio e identificación de las principales vías de inoculación

en ratón.
Importancia: Un profesional del área debe adquirir la competencia de conocer y manejar
adecuadamente modelos experimentales y animales de experimentación.
72
INTRODUCCIÓN
Un modelo experimental es un sistema que nos permite imitar un fenómeno en condiciones
controladas con la finalidad de describirlo lo más detalladamente posible. Casi todo lo que damos
por sentado del conocimiento en inmunología se ha estudiado y descrito a partir de modelos
experimentales tanto in vitro como in vivo.
Las líneas celulares y los cultivos primarios constituyen el principal modelo in vitro, en tanto que
el estudio en ratones es, por mucho, el modelo in vivo que más aportaciones a dado en el estudio
de la inmunología.
Con respecto a los modelos in vitro, en esta práctica, el alumno adquirirá los conocimientos para
el establecimiento de un cultivo primario y el mantenimiento de una línea celular. En este punto
el alumno ya ha trabajado modelos experimentales in vivo en asignaturas como farmacología,
ahora se abordara el modelo en ratón para conocer y analizar uno de los fenómenos más
relevantes en el campo: la reacción antígeno-anticuerpo.
El reconocimiento Ag-Ab es una reacción de complementariedad, se efectúa a través de múltiples

enlaces no covalentes entre una parte del antígeno (denominada epítopo) y los aminoácidos del
sitio de unión del anticuerpo. La reacción se caracteriza por su especificidad, espontaneidad y
reversibilidad.
Especificidad: Capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno que lo estimuló. La unión dada
por la especificidad es muy precisa y permite distinguir entre grupos químicos con diferencias
mínimas a pesar de su similitud; además, permite la detención de un sólo antígeno en cuestión.
Espontaneidad: La reacción Ag-Ab no requiere energía adicional para efectuarse.
Reversibilidad: Dado que la reacción se debe a fuerzas no covalentes, es reversible y, en

consecuencia, se ve afectada por factores como la temperatura, la proporción de Ag-Ab, el pH y
la fuerza iónica.
En este primer acercamiento se conocerán las principales vías de inoculación de antígenos en

ratón y las implicaciones inmunológicas dependientes de cada vía, en particular la activación de
linfocitos B con la consiguiente producción de anticuerpos, los cuales serán posteriormente
obtenidos y utilizados en las pruebas de ELISA y Western blot.
73
MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOS
Jeringas de 1 y 3 mL Ácido pícrico
Cánulas de alimentación oral para neonatos Adyuvante completo de Freund
Adyuvante incompleto de Freund
Solución inyectable
Albúmina Sérica Bovina
Gama Globulinas Humanas
DIAGRAMA DE FLUJO
Repartición de ratones
y aprendizaje de
manipulación
Demostración de las diferentes

vías de inoculación para
animales de laboratorio:
Oral, Subcutánea, Intraperitoneal
Formación de grupos de
experimentación e inoculación
intraperitoneal
Lote 1 Lote 2 Lote 3

100 L de solución 20 g de IgG purificadas 20 g de IgG
inyectable/ratón en 100L de solución purificadas en 100L
inyectable/ratón de adyuvante/ratón
R1 R1
Mantener a los ratones e inmunizar

nuevamente a los 7, 14 y 21 días.
El día 28 se obtiene muestra de

sangre y se sacrifican los ratones
R1: Aguja (contenedor rígido para punzocortantes), Jeringas (bolsa roja)
74
METODOLOGÍA
Calendario de actividades de esta práctica
Actividad Día
Manejo e inmunización de ratones I
puntos 1 al 5 y (6, 7 u 8)
0
Inmunización de ratones II
puntos 6, 7 o 9
7
Inmunización de ratones III
puntos 6, 7 o 9
14
Sacrificio y muestreo
Práctica Anatomía del Sistema Inmune
21
1. A cada alumno se le proporcionará un ratón y será responsable de su cuidado durante el

tiempo de desarrollo del proceso experimental.
2. Se hará una demostración del manejo adecuado de los ratones y los cuidados y riesgos de
su manipulación.
3. Se hará una demostración de las diferentes rutas de administración de sustancias a los

ratones (oral, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea) y cada alumno seleccionará una ruta
para practicar evitando al máximo maltratos innecesarios de los animales.
4. Se enseñara a los alumnos las técnicas de marcaje, la selección e importancia estadística de

los grupos de experimentación, y se llevará a cabo la primera inoculación en ratones, con las
inmunoglobulinas humanas purificadas y cuantificadas en las prácticas anteriores (las cuales
se comportarán ahora como inmunógenos).
5. Se formarán tres grupos de experimentación de 6 ratones cada uno, los alumnos llevarán a
cabo el marcaje de sus animales.
6. Al grupo 1 se le administrarán 100 µL de solución inyectable a cada ratón por vía

intraperitoneal.
7. Al grupo 2 se le administrarán 20 µg de Ig´s en 100 µL de solución inyectable a cada ratón

por vía intraperitoneal.
8. Al grupo 3 se le administrarán 20 µg de Ig´s en 100 µL del adyuvante seleccionado a cada

ratón por vía intraperitoneal.
9. Se administrará la misma dosis a cada grupo a los 7, 14 y 21 días, solo se sustituirá el

adyuvante completo por adyuvante incompleto.
75
10. Los animales serán mantenidos en condiciones adecuadas con agua y alimento ad libitum
durante todo el periodo de experimentación.
11. El día 28 se tomara una muestra de sangre y se sacrificaran los animales, para utilizarlos en
la Práctica de Anatomía del Sistema Inmune,
Discusión
El alumno en base a la información previa obtenida, discutirá las implicaciones de la
administración de un determinado antígeno por cada una de las vías analizadas y que órganos y
células se ven implicadas en cada caso.
Los alumnos tendrán una mesa de discusión acerca de la importancia de los adyuvantes.
Referencias
1. Delgado, N; Revuelta, M. (1993). Guía Práctica para el Manejo de Animales de Laboratorio. UNAM.
Facultad de estudios Superiores Cuautitlán. México, D.F. 115 p.
2. Donovan, J. C. and Brown, P. (2007). Care and Handling of Laboratory Animals. Current Protocols in
Immunology. 76:1.0.1–1.0.4. DOI: 10.1002/0471142735.im0100s76
3. Shevach, E. M. (2010). Animal Models for Infectious Diseases. Current Protocols in Immunology.
91:19.0.1–19.0.4. DOI: 10.1002/0471142735.im1900s91
76

Manual de Prácticas de Inmunobiología

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOSSUPERIORES CUAUTITLÁN

MANUAL BÁSICO DE LABORATORIO

Coordinador de Edición y Revisión: Ladislao Palomar Morales

Reglamento general para los laboratorios 6

1 Seguridad en el laboratorio de inmunobiología 7

2 Morfología de las células del sistema inmunitario 13

3 Técnicas de separación y purificación de células del sistema inmunitario 17

5 Funciones de los Anticuerpos 31

7 Ensayo Inmuno Enzimático (ELISA) 41

8 Anatomía del sistema inmunitario 47

10 Electroforesis en gel de poliacrilamida 58

12 Modelos experimentales y vías de inmunización 72

RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO

Según la NOM-018-STPS-2000 se definen como: peligro a la capacidad intrínseca de una

Rombo (o diamante) del Sistema NFPA

Algunos años más tarde la Asociación Nacional de productores de Pinturas y Recubrimientos

Las sustancias químicas son producidas en una región determinada y posteriormente se

Gas inflamable Sólido inflamable Misceláneos

Sistema Baker Saf-T-Date Sistema ChemAlert Sistema Winkler

Clasificación de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo

Grupo de riesgo 2(riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)

Grupo de riesgo 3(riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)

Grupo de riesgo 4(riesgo individual y poblacional elevado)

En el siguiente cuadro se relacionan, no se equiparan, los grupos de riesgo con el nivel de

En todo laboratorio escolar, o de diagnóstico clínico, se generan residuos de diferentes tipos,

Cada contenedor de residuos químicos debe etiquetarse de la siguiente forma:

 Laboratorio que lo generó.

TIPO DE RESIDUOS ESTADO FISICO ENVASE COLOR

MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS DEL

 Identificar microscópicamente a las células del sistema inmune presentes en circulación y

RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO

El cuadro central es el de cuenta de eritrocitos.

Diluir 1/20 con Teñir con R2

Colocar la cámara de Neubauer en el microscopio y buscar la cuadricula con el objetivo de 10X.

2. Cuenta diferencial de la serie blanca

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN

RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO

Las células inmunes se pueden separar por varios métodos

Estudio de marcadores y antígenos de membrana (diferencia poblaciones y

MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOS

Centrifugar un Estratificar el contenido del otro

Obtener la capa Centrifugar y obtener la

Contar en cámara Preparar un frotis, teñir con

Separación por gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque.

Para preparar un litro de medio:

Preparación de solución amortiguadora de fosfatos (PBS) pH 7.2

Preparación de solución amortiguadora de separación para MACS.

RELACIÓN CON EL CONTENIDO DEL PROGRAMA TEÓRICO

Los macrófagos son células fagocíticas de gran tamaño presentes en la

Los monocitos son células circulares cuyo diámetro oscila entre 15 a 30 μm

Reconocimiento y unión de partículas por fagocitos

En un punto específico, determinado por la presencia y activación de quimiocinas, los fagocitos

La Autofagia es un proceso del fagocito en el cual su retículo endoplásmico crea un autofagosoma

Obtención de sangre periférica R1

Obtención de buffy coat R2

Dividir en dos tubos eppendorf

Agregar Levaduras Opsonizadas Agregar Levaduras sin opsonizar

Centrifugar 1 500 rpm 2 min

Realizar frotis y teñir con Realizar frotis y teñir con safranina

R3 Observar y contar a 100X R3

R1: Aguja, al contenedor de punzocortante; Algodón, basura municipal

6. Observar a 100X, contando por lo menos 200 células, distinguiendo lo siguiente:

NOTA: A+B > 200