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Acreditación para
Laboratorios microbiológicos

Tercera Edición 2023


Agradecimientos
Esta edición ha sido producida por un grupo de
trabajo ad hoc de Eurachem con la composición que
se muestra (derecha). Los editores agradecen a todas
estas organizaciones e individuos que han contribuido
con comentarios, consejos y asistencia.
Acreditación de Laboratorios
Microbiológicos
Tercera edición (2023)
Editores
Bertil Magnusson (SE)
Kyriacos C Tsimilis (CY)
Composición del Grupo de Trabajo ad hoc*
AM Ferrini, Istituto Superiore di Sanità (IT) D
Charalambous, Frederick University (CY) B
Magnusson, Trollboken AB (SE)
F Marinheiro, Águas de Portugal (PT)
O Molinier, AGLAE (FR)
G Papageorgiou, Laboratorio General del Estado (CY)
M Patriarca, Istituto Superiore di Sanità (IT)
E Theodorsson, Universidad de Linköping (SE)
KC Tsimillis, Unión Panchipriana de Químicos (CY) I
Vercruysse, APB (BE)
* Al momento de la aprobación del documento
Citación
Esta publicación debe citarse†como: “B Magnusson y KC
Tsimilis (eds.) Acreditación de laboratorios
microbiológicos (3terceroed. 2023). ISBN
978-91-519-6581-9. Disponible en www.eurachem.org”.
Sujeto a los requisitos de la revista.
†
Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

Acreditación de Laboratorios Microbiológicos

edición en inglés

Tercera edición 2023

ISBN 978-91-519-6581-9

Derechos de autor © 2023

Los derechos de autor de este documento pertenecen a los autores contribuyentes. Todas las consultas relativas a la reproducción en
cualquier medio, incluida la traducción, deben dirigirse a la secretaría de Eurachem.
Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

Prefacio
Esta tercera edición de la Guía Eurachem “Acreditación para laboratorios microbiológicos” es una revisión de la
segunda edición publicada en 2013. La primera edición de 2002 fue producida por un grupo de trabajo conjunto EA/
Eurachem.

La Guía se centra en los requisitos de ISO/IEC 17025 [1]; sin embargo, el contenido también debe ser de utilidad para
organizaciones que buscan acreditación o certificación según los requisitos de estándares como ISO 15189 [2], GLP (Buenas
Prácticas de Laboratorio) [3], GMP (Buenas Prácticas de Fabricación) [4] y GCP. (Buenas Prácticas Clínicas) [5]). Las regulaciones
nacionales específicas pueden anular las orientaciones proporcionadas en este documento. La Guía también proporcionará
información útil para los laboratorios que deseen establecer un sistema de gestión de la calidad pero que no busquen un
reconocimiento formal.

Esta revisión refleja principalmente los cambios que se introdujeron con la publicación de la versión 2017 de
ISO/IEC 17025.

Los principales cambios en la tercera edición son:

• actualización sobre tendencias recientes en microbiología, por ejemplo, técnicas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para la
detección de microorganismos;

• adición de una lista de abreviaturas y símbolos;

• adición de una sección sobre pensamiento basado en riesgos;

• secciones actualizadas sobre verificación y validación de métodos para reflejar las normas ISO actuales;

• referencias al uso de una regla de decisión;

• Anexo A actualizado sobre terminología relevante para la microbiología;

• nuevo Anexo C sobre intervalos de confianza para la presentación de informes;

• nuevo Anexo D sobre estimación de la incertidumbre a partir del muestreo;

• el orden de las secciones de acuerdo con la norma ISO/IEC 17025.

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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

Símbolos y abreviaturas
Los siguientes símbolos y abreviaturas aparecen con frecuencia en esta guía. Otros símbolos y abreviaturas se definen
en el primer uso.

Abreviaturas Símbolos

ANOVA Análisis de variación sIR Desviación estándar relativa

intralaboratorio

AFNOR Asociación Francesa de scontrol de calidad Desviación estándar relativa del control de
Normalización/Francés calidad
Asociación de estandarización

AOAC Asociación Internacional de tuC Conjunto relativo estándar

Colaboración Analítica Oficial incertidumbre

citac Cooperación sobre trazabilidad tuconfinar Incertidumbre relativa debido al resultado

internacional en química analítica de la confirmación

UFC Unidad de formación de Colonia tud Incertidumbre distribucional o intrínseca

relativa debido a la toma de una porción de
prueba de una muestra de laboratorio

OGM Organismos genéticamente modificados tumatriz Incertidumbre relativa por mezcla

imperfecta de la muestra de laboratorio.

CHICLE Guía para la expresión de la Incertidumbre tuoh Incertidumbre operativa

en la Medición (técnica) relativa
CEI Comisión Electrotécnica ?̂? Límite de confianza superior (UCL)
Internacional unilateral para la estimación de la
incertidumbre operativa

ILAC Cooperación internacional para la acreditación tusémola gruesa de maíz Incertidumbre relativa del muestreo
de laboratorios

ISBN Libro estándar internacionalNúmero Ud. Incertidumbre relativa ampliada

NMP Numero mas probable Ud.máx. Límite superior del intervalo de

incertidumbre

PCR Reacción en cadena de la polimerasa Ud.mín. Límite inferior del intervalo de

incertidumbre

PT Prueba de aptitud
EMPUJE Vocabulario Internacional de Metrología

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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

Contenido

1 Introducción y alcance 1

2 Normas para la acreditación de laboratorios microbiológicos. 1

3 Pensamiento basado en riesgos 3

4 Requerimientos generales 3
4.1 Imparcialidad 3
4.2 Confidencialidad 3
5 Personal 5
5.1 Competencia 5
5.2 Competencia inicial y permanente 5
5.3 Monitoreo 5
6 Instalaciones y condiciones ambientales. 7
6.1 Locales 7
6.2 Seguridad 7
6.3 Monitoreo ambiental 8
6.4 Eliminación de residuos contaminados 9
7 Equipo 11
7.1 Generalidades 11
7.2 Mantenimiento 11
8 Reactivos y medios de cultivo. 13
8.1 Reactivos 13
8.2 Medios preparados internamente 13
8.3 Medios listos para usar 13
8.4 Etiquetado 14
8.5 Materiales de referencia 14
8.6 Culturas de referencia 14
9 Trazabilidad metrológica 15
9.1 Calibración y verificación 15
9.2 Dispositivos de medición de temperatura 15
9.3 Incubadoras, baños de agua, hornos, congeladores y refrigeradores 15
9.4 Autoclaves, incluidos los preparadores de medios. 15
9.5 Pesos y balanzas 15
9.6 Equipo volumétrico dieciséis

9.7 Termocicladores (PCR) dieciséis

9.8 Otros equipos dieciséis

10 Selección, verificación y validación de métodos. 17

10.1 General 17
10.2 Selección de métodos 17
10.3 Verificación 17
10.4 Validación 18
11 Muestreo y manipulación de elementos de prueba. 19
11.1 Muestreo 19
11.2 Manejo de los elementos de prueba 19
ALA 2023 III
Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

12 Evaluación de la incertidumbre de la medición. 21

12.1 Generalidades 21
12.2 Incertidumbre de medición en microbiología 21
12.3 Componentes de la incertidumbre 21
12.4 Distribución de microorganismos dentro de matrices. 21
12.5 Pruebas cualitativas 22
12.6 Métodos moleculares 22
12.7 Incertidumbre muestral 22
13 Garantizar la validez de los resultados. 23
13.1 Control de calidad interno 23
13.2 Pruebas de competencia 23
14 Informe de resultados 25
14.1 Generalidades 25
14.2 Métodos cuantitativos 25
14.3 Métodos cualitativos 26
14.4 Informe de una declaración de conformidad – Uso de una regla de decisión 26
14.5 Informes de opiniones e interpretaciones 26
14.6 Control de datos y gestión de la información 26
Anexo A – Glosario de términos 27

Anexo B – Cultivos de referencia 29

Anexo C – Intervalos de confianza para la presentación de informes 31

Anexo D – Incertidumbre muestral 39

Anexo E – Orientación sobre calibración de instrumentos de medida 43

Anexo F – Orientación sobre validación y verificación de equipos 45

Bibliografía 49

ALA 2023 IV
Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

1 Introducción y alcance
Las pruebas microbiológicas incluyen pruebas de esterilidad, detección, aislamiento, enumeración e identificación de
microorganismos (virus, bacterias, hongos y protozoos) y sus metabolitos, o cualquier tipo de ensayo que utilice
microorganismos como parte de un sistema de detección, así como el uso de microorganismos. para pruebas ecológicas.

Según el Reg (UE) 2017/625 para alimentos y piensos [6] y el Dir (UE) 2020/2184 [7] para el agua destinada al consumo
humano, los laboratorios de los Estados miembros deberán disponer de un sistema de gestión de la calidad, documentado
según ISO/IEC 17025[1] e incluyendo métodos de prueba validados y, siempre que sea posible, acreditados. Tenga en cuenta
que también los laboratorios fuera de la UE deberán cumplir los criterios al proporcionar los certificados que acompañan a los
alimentos.

Esta guía proporciona a los laboratorios que realizan pruebas microbiológicas información adecuada sobre cómo cumplir con
los requisitos de ISO/IEC 17025, brindando orientación detallada sobre dichos requisitos. Aunque esta guía está escrita
principalmente para pruebas microbiológicas ambientales, de agua y de alimentos, los principios generales pueden aplicarse a
otras áreas.

2 Normas para la acreditación de laboratorios microbiológicos

En la Bibliografía se dan referencias detalladas de las normas. Principales

estándares utilizados para la acreditación de laboratorios

ISO/IEC 17025 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de pruebas y

calibración ISO 15189 Laboratorios médicos – Requisitos de calidad y competencia

Estándares básicos para microbiología.

ISO 7218 Microbiología de alimentos y piensos para animales. Requisitos generales para exámenes
microbiológicos.
ISO 8199 Calidad del agua: requisitos generales y orientación para exámenes microbiológicos por cultivo.

ISO 19036 Microbiología de la cadena alimentaria. Estimación de la incertidumbre de medición para determinaciones
cuantitativas.

ISO 29201 Calidad del agua: la variabilidad de los resultados de las pruebas y la incertidumbre de la medición de los
métodos de enumeración microbiológica.

Serie ISO 16140, Microbiología de la cadena alimentaria.－validación del método

ISO 13843 Calidad del agua－Requisitos para establecer las características de desempeño de los métodos
microbiológicos cuantitativos.

ISO 11133 Microbiología de alimentos, piensos y agua.－Preparación, producción, almacenamiento y pruebas de rendimiento
de medios de cultivo.

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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
3 Pensamiento basado en riesgos
La introducción del pensamiento basado en el riesgo es el
principal cambio en la filosofía de los estándares utilizados
para la acreditación. ISO/IEC 17025 [1] prevé una
consideración más amplia que debe realizar el laboratorio con
respecto a todos los aspectos del sistema del laboratorio y de
su funcionamiento diario.
El pensamiento basado en riesgos está integrado en
todo el estándar. Se debe hacer referencia
especialmente a la imparcialidad, las declaraciones de
conformidad, la gestión de trabajos no conformes y las
revisiones por la dirección.
4 Requisitos generales
4.1 Imparcialidad
La dirección del laboratorio y todo el personal deben
comprometerse a ser imparciales; El laboratorio debe identificar
los riesgos para su imparcialidad y demostrar cómo gestiona en
los casos en que se identifiquen dichos riesgos.
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Guía de Eurachem
Se espera que el laboratorio haga sus consideraciones
basándose en la correlación de la probabilidad de un
riesgo y su impacto. Se da mucho más énfasis a los
casos con alto impacto y alta probabilidad de ocurrir. El
análisis FODA (fortalezas, debilidades, oportunidades y
amenazas) es una herramienta útil; véase más
adelante Eurolab Cookbook nº 18 [8].
No es necesario que el laboratorio tenga una gestión de
riesgos detallada basada en normas pertinentes, por ejemplo,
ISO 31000 [9]; sin embargo, puede resultar útil conocer sus
elementos básicos. Esto ayudará al laboratorio a priorizar,
basándose en la experiencia existente con las no
conformidades y las acciones preventivas requeridas
previamente. No es necesario abordar todos los aspectos
desde el principio; Inicialmente, el laboratorio puede incluir
los aspectos principales con documentación adecuada de las
acciones tomadas y comentarios. Durante la próxima revisión
de la gestión, se revisarán las opciones y se impulsarán los
ajustes necesarios.
4.2 Confidencialidad
El laboratorio y todo el personal deben mantener
confidencial toda la información obtenida o creada
durante el desempeño de las actividades del laboratorio.
Se requiere especial cuidado con respecto a la divulgación
de dicha información. En caso de que así lo exija la ley, se
seguirán las disposiciones pertinentes. En otros casos, se
deberá informar al cliente con antelación.
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
5 personal
5.1 Competencia
Las pruebas microbiológicas deben ser realizadas o
supervisadas por una persona experimentada, con una
calificación de grado (o equivalente) en microbiología o un
tema relacionado. Las cualificaciones alternativas pueden
cumplir requisitos cuando un miembro del personal tenga
una amplia experiencia relevante para el alcance de la
acreditación del laboratorio. El personal debe tener
experiencia laboral práctica relevante antes de que se le
permita trabajar sin supervisión, o antes de ser considerado
como experimentado para la supervisión de un trabajo
acreditado. Las regulaciones nacionales específicas pueden
anular las orientaciones proporcionadas en este documento.
5.2 Competencia inicial y permanente
La dirección del laboratorio debería garantizar que todo el
personal haya recibido la formación adecuada para la
realización competente de las pruebas y el funcionamiento
del equipo. Esto debería incluir capacitación en técnicas
básicas, por ejemplo, vertido en placas, recuento de colonias,
técnica aséptica, etc., cuya aceptabilidad se determinará
utilizando criterios objetivos. Es importante que la
competencia de las actividades de laboratorio también esté
vinculada al conocimiento de la evaluación de desviaciones.
En caso de que un método no se use regularmente, puede ser
necesario verificar el desempeño del personal antes de
AML2023
Guía de Eurachem
Las pruebas se realizan y se registran las pruebas pertinentes.
Debería establecerse y documentarse el intervalo de tiempo
entre la realización de las pruebas, después del cual se
requeriría la verificación de la competencia del analista. La
interpretación de los resultados de las pruebas para la
identificación y verificación de microorganismos está
fuertemente relacionada con la experiencia del analista que la
realiza y debe ser monitoreada por cada analista de manera
regular.
Una lista de competencias debe estar disponible en el
laboratorio. La competencia del personal debe dividirse
en diferentes niveles de análisis, como pretratamiento de
muestras, validación de métodos, desempeño de rutina,
informes de resultados, garantía de calidad, competencia
para trabajar con instrumentos específicos,
interpretaciones, etc.
5.3 Monitoreo
La competencia del personal para realizar pruebas debe ser
monitoreada y documentada en relación con los resultados
del control de calidad (PT) interno y externo. Sobre la base de
estos resultados también se debe evaluar la eficacia del
programa de formación y la identificación de necesidades de
formación adicional.
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
6 Instalaciones y condiciones ambientales
6.1 Locales
Existen requisitos ambientales específicos para las
instalaciones de prueba (ver 6.3). Dependiendo del tipo de
prueba que se realice, es posible que sea necesario
restringir el acceso al laboratorio microbiológico al
personal autorizado. Cuando tales restricciones estén
vigentes, el personal debería ser consciente de:
• el uso previsto de un área particular;
• las restricciones impuestas al trabajo dentro de dichas
áreas;
• las razones para imponer tales restricciones;
• los niveles de seguridad de contención adecuados.
El laboratorio debería estar dispuesto de manera que se
minimicen los riesgos de contaminación cruzada, cuando
éstos puedan ser importantes para el tipo de prueba que se
realiza. Las formas de lograr estos objetivos son, por ejemplo:
• organizar el laboratorio según el principio de
distribución de las muestras "sin vuelta atrás";
• llevar a cabo procedimientos de manera secuencial utilizando las
precauciones adecuadas para garantizar la integridad de la
prueba y la muestra (por ejemplo, uso de recipientes sellados);
• Segregar las actividades por espacio (si es posible) o,
cuando esto no sea práctico, por tiempo cuando sea
necesario.
6.2 Seguridad
Según ISO 7218 [10], el diseño del laboratorio deberá
cumplir con requisitos de seguridad que dependerán
del tipo de microorganismo bajo prueba.
Para ello, los microorganismos se clasifican en cuatro
categorías de riesgo:
• Categoría de riesgo 1–Riesgo nulo o muy bajo
para el individuo y la comunidad (por ejemplo,
cepa no patógena deE. coli);
• Categoría de riesgo 2–riesgo moderado para el
individuo, riesgo bajo para la comunidad (por
ejemplo, VIH, Estafilococo aureus);
• Categoría de riesgo 3–alto riesgo para el individuo, bajo
riesgo para la comunidad (por ejemplo, fiebre amarilla, virus
del Nilo Occidental,Tuberculosis micobacteriana, virus SARS-
CoV-2);
• Categoría de riesgo 4–alto riesgo para el individuo y la
comunidad (por ejemplo, el virus del Ébola).
Las instalaciones de laboratorio están designadas como:
básica – Nivel de Bioseguridad 1 (BSL1); básico – Nivel de
Bioseguridad 2 (BSL2); contención – Nivel de bioseguridad 3
(BSL3); y máxima contención – Nivel de Bioseguridad 4
AML2023
Guía de Eurachem
(BSL4). Las designaciones de niveles de bioseguridad se basan
en una combinación de características de diseño,
construcción, instalaciones de contención, equipos, prácticas
y procedimientos operativos necesarios para trabajar con
agentes de los distintos grupos de riesgo.
La tercera edición del manual de bioseguridad de la OMS [11]
y el libro del Instituto Nacional de Salud (NIH) “Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories” [12]
proporciona principios y recomendaciones detallados en esta
área. Este último detalla los principios de bioseguridad de los
laboratorios clínicos, incluidos los patógenos de alto riesgo
como el Ébola.
Para los exámenes realizados para la detección de
microorganismos pertenecientes a las categorías de riesgo 1
y 2, generalmente se considera una buena práctica tener
ubicaciones separadas, o áreas claramente designadas, para
lo siguiente:
• recepción y almacenamiento de muestras;
• preparación de muestras (por ejemplo, se debería utilizar un
lugar separado para la preparación de productos en polvo
que probablemente estén muy contaminados);
• examen de muestras, incluida la incubación;
• mantenimiento de organismos de referencia;
• manipulación de presuntos patógenos;
• almacenamiento de medios de cultivo y reactivos;
• preparación de medios y equipos, incluida la
esterilización;
• evaluación de esterilidad;
• descontaminación;
• limpieza de cristalería y otros equipos;
• almacenamiento de productos químicos peligrosos.
El área de lavado (después de la descontaminación) podrá
compartirse con otras partes del laboratorio siempre que
se tomen las precauciones necesarias para evitar la
transferencia de trazas de sustancias que podrían afectar
negativamente al crecimiento microbiano. La necesidad
de separación física debe evaluarse en función de las
actividades específicas del laboratorio (por ejemplo,
número y tipo de pruebas realizadas).
El equipo de laboratorio no debe moverse rutinariamente
entre áreas para evitar una contaminación cruzada
accidental. En el laboratorio de biología molecular, se
deben ubicar en cada área de trabajo pipetas, puntas,
centrífugas, tubos, ropa protectora adecuada, viales,
bloques calefactores, etc., es decir, en entornos de trabajo
con ADN bajo-medio-alto. Donde los cebadores de PCR
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
y se preparan las sondas, se debe garantizar una
separación adecuada de estas tareas para minimizar la
contaminación cruzada del ADN. La amplificación del ADN
debe realizarse en una sección exclusiva del laboratorio.
El espacio debe ser suficiente para permitir que las áreas de
trabajo se mantengan limpias y ordenadas. El espacio
requerido debe ser apropiado para el volumen de análisis
manejados y la organización interna general del laboratorio.
Las instalaciones de prueba deben estar adecuadamente
ventiladas y a una temperatura adecuada, por ejemplo, entre 18 y
27 ℃. Esto se puede hacer mediante ventilación natural o forzada,
o utilizando un aire acondicionado. Cuando se utilizan
acondicionadores de aire, los filtros deben ser apropiados,
inspeccionados, mantenidos y reemplazados de acuerdo con el
tipo de trabajo que se realiza.
Se debe tener en cuenta la dirección del flujo de aire para
minimizar el riesgo de contaminación cruzada. La ventilación
del aire en el laboratorio debe ser unidireccional y
preferentemente “limpiando” el volumen máximo de aire de
la sala; esto significa que los dispositivos de entrada de aire
deben estar en el lado opuesto de los dispositivos de salida de
aire (y no uno al lado del otro). Esto permite una calidad del
aire mejor y más saludable para los usuarios del laboratorio.
La contaminación se puede prevenir abordando los
siguientes puntos:
• Utilice superficies lisas en paredes, techos, pisos y bancos.
No se recomiendan las baldosas como material para
cubrir bancos;
• utilice juntas cóncavas entre el suelo, las paredes y el
techo;
• siempre que sea posible, utilizar materiales de construcción
de baja rugosidad, porosidad, absorción de agua o humedad
y que sean fáciles de limpiar y desinfectar;
• Coloque sombrillas en el exterior de las ventanas. Si esto no
es posible, garantice un fácil acceso para la limpieza de las
sombrillas internas;
• instalar tuberías de transporte de fluidos debajo de las áreas
técnicas de los bancos;
• utilice una entrada de aire con filtro de polvo para el sistema de
ventilación;
• disponer de medios separados para el lavado de manos,
preferiblemente controlados de forma no manual;
• instalar armarios con techo inclinado en la parte superior
para facilitar la limpieza (normalmente acero inoxidable o
laminado sólido, aunque se pueden considerar otros
materiales que sean fáciles de limpiar y desinfectar);
• evite la madera rugosa y desnuda; garantizar que las superficies
de madera de los accesorios y accesorios estén adecuadamente
selladas;
• organizar los artículos y equipos almacenados para
facilitar la limpieza;
AML2023
Guía de Eurachem
• asegurar que las instalaciones de prueba no contengan
muebles, documentos u otros elementos excepto los
estrictamente necesarios para las actividades de prueba;
• asegúrese de que las ventanas y puertas puedan estar cerradas al
realizar las pruebas para minimizar las corrientes de aire. Se
debe controlar la temperatura ambiente (de 18 °C a 27 °C) y la
calidad del aire (contenido de microorganismos, velocidad de
dispersión del polvo, etc.);
• instalar una extracción adecuada para evitar la exposición al
polvo proveniente del manejo de medios de cultivo
deshidratados y muestras polvorientas o pulverizadas;
• Cuando las pruebas se van a realizar en una atmósfera de
baja contaminación, la sala debe estar especialmente
equipada con una cabina de flujo de aire laminar limpio
y/o una cabina de seguridad.
Esta lista no es exhaustiva y no todos los ejemplos se
aplicarán en todas las situaciones. Los techos, idealmente,
deberían tener una superficie lisa con iluminación empotrada.
Cuando esto no sea posible (como ocurre con los techos
suspendidos y las luces colgantes), el laboratorio debe tener
pruebas documentadas de que están controlados y de que
existen medios eficaces para superarlos, por ejemplo, un
programa de inspección y limpieza de superficies.
Cuando los laboratorios estén operando en
instalaciones de fabricación, el personal debe ser
consciente del potencial de contaminación de las áreas
de producción y el laboratorio debe demostrar que se
han tomado las medidas adecuadas para evitar que
esto ocurra.
En el laboratorio de biología molecular, la PCR es un método
de detección sensible. Los aerosoles, el polvo y otras
partículas son portadores de ADN contaminante. Por tanto, es
fundamental separar en el espacio y/o el tiempo las
diferentes etapas del análisis. En particular, proporcione
áreas, materiales y equipos dedicados separados para las
etapas previas y posteriores a la amplificación. Las cabinas de
bioseguridad de PCR también se pueden utilizar para
preparar todas las reacciones de PCR y garantizar que se
observe una contaminación ambiental y de muestras limitada.
Se debe tener especial cuidado en la sala de extracción de
ADN (antes de la PCR) en relación con la Bioseguridad según
las directrices BSL de la OMS [11].
Se requieren salas o equipos con presión negativa para la
manipulación de organismos de categoría de riesgo 3.
Para organismos de categoría de riesgo 4, se deben
considerar otros medios de protección.
6.3 Monitoreo ambiental
Se debe diseñar un programa apropiado para monitorear,
controlar y registrar las condiciones ambientales. Como
ejemplo, este programa puede incluir el uso frecuente de
placas de asentamiento de aire para contaminantes
bacterianos y fúngicos (ISO 14698 [13]
Página 8
Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
y EN 17141 [14]), así como limpieza periódica de la superficie
(ISO 18593 [15]) para una variedad de microorganismos
relevantes. Se deben asignar recuentos de antecedentes
aceptables y debe haber un procedimiento documentado
para abordar situaciones en las que se excedan estos límites.
El análisis de los datos debería permitir determinar las
tendencias en los niveles de contaminación.
Si la presión ambiente y el número de cambios de aire por
hora son parámetros críticos para los requisitos de
bioseguridad o para la limpieza del aire (libre de
partículas), se deben proporcionar medios para su
seguimiento y control. Se deben tomar medidas para
evitar la acumulación de polvo. Debe haber un programa
de limpieza documentado para el laboratorio. Se deben
tener en cuenta los resultados del seguimiento ambiental.
AML2023
Guía de Eurachem
y la posibilidad de contaminación cruzada. Debería existir un
procedimiento para hacer frente a los derrames.
En el laboratorio microbiológico se debe usar ropa protectora
adecuada al tipo de prueba que se realiza (incluida, si es
necesario, protección para el cabello, la barba, las manos, los
zapatos, etc.), y se la debe quitar antes de abandonar el área.
Esto es particularmente importante en el laboratorio de
biología molecular, donde, por ejemplo, los movimientos
desde un área con alta carga de ADN a un área con baja carga
de ADN pueden introducir contaminación cruzada.
6.4 Eliminación de residuos contaminados
Los procedimientos para la eliminación de materiales
contaminados deben diseñarse para minimizar la
posibilidad de contaminar el entorno de prueba.
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
7 Equipo
7.1 Generalidades
El equipo debe identificarse claramente y los detalles
relevantes deben registrarse adecuadamente, por
ejemplo, en hojas de datos. Deberán indicarse las
prescripciones de mantenimiento y, en su caso,
calibración, así como la frecuencia. Se deben definir y
registrar los criterios que deben cumplirse después del
mantenimiento y, para los equipos que requieren
calibración, los criterios de aceptación/rechazo de la
calibración. Deberían mantenerse registros de dichas
operaciones, así como de cualquier evento que
requiera reparación del equipo. La Guía Eurachem/
CITAC “Guide to Quality in Analytical Chemistry” [16]
describe con más detalle la cualificación de
instrumentos y los requisitos generales de ISO/IEC
17025 [1] para la gestión de equipos.
7.2 Mantenimiento
El mantenimiento del equipo esencial debe realizarse a
intervalos específicos según lo determinen factores
como la frecuencia de uso y el riesgo esperado de
cambios en el rendimiento fuera de los límites
aceptables (análisis de riesgos). Se debe establecer y
registrar la frecuencia del mantenimiento. En el Anexo
G se dan ejemplos de mantenimiento de equipos e
intervalos. Se debe prestar atención a evitar la
contaminación cruzada derivada del equipo utilizado,
por ejemplo:
AML2023
Guía de Eurachem
• el equipo debe estar limpio y, cuando corresponda,
esterilizado;
• Idealmente, los laboratorios deberían tener un
autoclave separado para la descontaminación. Sin
embargo, un autoclave es aceptable siempre que
se tomen las precauciones adecuadas para
separar las cargas de descontaminación y
esterilización. Se debe implementar un programa
de limpieza documentado para abordar tanto el
entorno interno como externo del autoclave.
Normalmente, los siguientes elementos del equipo se
mantendrán mediante limpieza y mantenimiento, inspección para
daños, verificación general de idoneidad y,
cuando proceda, esterilizar:
• equipo de servicio general: aparatos de filtración,
recipientes de vidrio o plástico (botellas, tubos de
ensayo), placas de Petri de vidrio o plástico,
instrumentos de muestreo, alambres o bucles
(platino, níquel/cromo o plástico desechable);
• baños María, incubadoras, cabinas microbiológicas (de
flujo laminar y de seguridad), autoclaves,
homogeneizadores, frigoríficos, congeladores;
• equipos volumétricos: pipetas, dispensadores
automáticos, planchas en espiral;
• instrumentos de medición: termómetros, higrómetros, CO
sensores, temporizadores, balanzas, medidores de pH,
2
contadores de colonias.
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
8 Reactivos y medios de cultivo
8.1 Reactivos
Los laboratorios deben garantizar que la calidad de los
reactivos utilizados sea la adecuada para la prueba. Deben
verificar la idoneidad de cada lote de reactivos críticos
para la prueba antes de su uso y durante su vida útil,
utilizando organismos de control positivos y negativos
que sean rastreables hasta colecciones de cultivos
nacionales o internacionales reconocidas. Los reactivos
producidos comercialmente deben almacenarse y
utilizarse según las instrucciones del fabricante.
8.2 Medios preparados internamente
Se deberá comprobar el adecuado comportamiento de los medios
de cultivo, diluyentes y otros líquidos de suspensión de
elaboración propia, en su caso, respecto de:
• recuperación o mantenimiento de la supervivencia de los
organismos objetivo;
• inhibición o supresión de organismos no objetivo;
en pruebas iniciales para cada nuevo fabricante y pruebas indirectas.
• pruebas bioquímicas (diferenciales y diagnósticas) mediante procedimientos internos de control de calidad. En
propiedades;
• propiedades físicas (p. ej., pH, volumen y
esterilidad).
Todos los procedimientos relevantes se describen en ISO
11133 [17]. Si el laboratorio utiliza métodos estándar
publicados (p. ej., normas ISO), se puede encontrar
información adicional para las pruebas de rendimiento de
medios de cultivo específicos en la documentación del
método.
Las materias primas, las formulaciones comerciales deshidratadas
y los componentes individuales deben almacenarse en
condiciones adecuadas. Todos los contenedores, especialmente
aquellos para medios deshidratados, deben sellarse
herméticamente. No se deben utilizar medios deshidratados que
estén apelmazados o agrietados, o que muestren un cambio de
color. Para la preparación se debe utilizar agua destilada,
desionizada o de ósmosis inversa, libre de sustancias bactericidas,
inhibidoras o que interfieran, a menos que el método de prueba
especifique lo contrario.
Se debe determinar y verificar la vida útil de los medios
preparados en condiciones de almacenamiento definidas. A
menos que se especifique lo contrario en el método, los
medios de cultivo listos para usar deben almacenarse en un
refrigerador a 5 °C ± 3 °C.
* Un lote es una unidad homogénea y totalmente trazable de un
medio de cultivo o reactivo que hace referencia a una cantidad
definida de producto a granel, producto semiacabado o producto final,
que es consistente en tipo y calidad, y que ha pasado la prueba.
AML2023
Guía de Eurachem
8.3 Medios listos para usar
Todos los medios, incluidos los diluyentes y otros fluidos de
suspensión, obtenidos listos para usar o parcialmente completos,
requieren una evaluación de rendimiento antes de su uso. La
evaluación del desempeño en la recuperación o supervivencia de
organismos objetivo y la inhibición o supresión de organismos no
objetivo debe estar completamente documentada.
Atributos como las propiedades físicas y
bioquímicas deben evaluarse utilizando criterios
objetivos.
Cuando el fabricante de los medios comprados listos para
usar o parcialmente completos está cubierto por un
sistema de gestión de calidad reconocido (ver ISO 9000
[18]), y la calidad de los medios se controla de acuerdo
con la norma ISO 11133 [17], se debe revisar la
información relevante para aceptabilidad.
Los controles por parte del laboratorio usuario sólo podrán consistir
En otras circunstancias, el control de calidad debe realizarse
íntegramente de acuerdo con la norma ISO 11133.
El laboratorio necesita tener un conocimiento adecuado
de las especificaciones del producto del fabricante, que
incluyen al menos lo siguiente:
• nombre del medio y lista de componentes,
incluidos los suplementos;
• vida útil y criterios de aceptabilidad aplicados;
• condiciones de almacenaje;
• control de esterilidad;
• verificación del crecimiento de los organismos de control
objetivo y no objetivo utilizados (con sus referencias de
colección de cultivos) y criterios de aceptabilidad;
• controles físicos y criterios de aceptabilidad
aplicados;
• fecha de emisión de la especificación.
Lotes*de los medios debe ser identificable. Cada lote
recibido debe ir acompañado de evidencia de que cumple
con las especificaciones de calidad. El laboratorio debe
asegurarse de que el fabricante informará de cualquier
cambio en la especificación.
requisito de producción (control en proceso) y pruebas de
desempeño y que ha sido producido dentro de un período
de producción definido, habiéndosele asignado el mismo
número.
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
8.4 Etiquetado
Los laboratorios deben asegurarse de que todos los reactivos,
incluidas las soluciones madre, los medios, los diluyentes y otros
líquidos de suspensión, estén etiquetados adecuadamente para
indicar la identidad, la concentración, las condiciones de
almacenamiento, la fecha de apertura, la fecha de preparación, la
fecha de caducidad validada y/o el período de almacenamiento
recomendado. La persona responsable de la preparación del
reactivo debe ser identificable en los registros.
8.5 Materiales de referencia
Los materiales de referencia proporcionan una trazabilidad
esencial en las mediciones y se utilizan, por ejemplo, para:
• demostrar la exactitud de los resultados;
• calibrar equipos;
• monitorear el desempeño del laboratorio;
• validar métodos;
• permitir la comparación de métodos;
• demostrar la calidad de los medios de cultivo;
• demostrar el rendimiento constante de los kits.
Cuando sea apropiado y posible, se deben utilizar materiales
de referencia en matrices apropiadas.
Se recomienda que los materiales de referencia
provengan de productores acreditados según la norma
ISO 17034 [19].
AML2023
Guía de Eurachem
8.6 Culturas de referencia
Se requieren cultivos de referencia (ver Anexo B) para
establecer el desempeño aceptable de los medios
(incluidos los kits de prueba), validar métodos y evaluar
el desempeño continuo. Para demostrar la
trazabilidad, los laboratorios deben utilizar cepas de
referencia de microorganismos obtenidas
directamente de una colección nacional o internacional
reconocida, cuando exista. Cuando no se disponga
fácilmente de cultivos de referencia trazables, se
podrían utilizar alternativamente derivados
comerciales trazables a ellos, siempre que el
laboratorio haya demostrado que las propiedades
pertinentes para el uso previsto son equivalentes.
Las cepas de referencia se pueden subcultivar una vez para
proporcionar reservas de referencia. Los controles de pureza
y bioquímicos deberían realizarse en paralelo, según
corresponda. Se recomienda almacenar las existencias de
referencia en alícuotas ya sea congeladas o liofilizadas. Los
cultivos de trabajo para uso rutinario deben ser subcultivos
primarios del stock de referencia (ver Apéndice B sobre la
preparación de stocks de trabajo). Si las existencias de
referencia se han descongelado, no se deben volver a
congelar ni reutilizar.
Los cultivos de trabajo no deben subcultivarse a menos que sea
requerido y definido por un método estándar o que los
laboratorios puedan proporcionar evidencia documentada de que
no ha habido cambios en ninguna propiedad relevante. Las
poblaciones de trabajo no deben subcultivarse para reemplazar
las poblaciones de referencia. Los derivados comerciales de cepas
de referencia sólo podrán utilizarse como cultivos de trabajo.
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
9 Trazabilidad metrológica
9.1 Calibración y verificación
El laboratorio debe establecer un programa para la
calibración y verificación de las propiedades de los
sistemas de medición que influyen directamente en los
resultados de la medición según ISO/IEC 17025 [1]. La
frecuencia de dicha calibración y verificación estará
justificada por la experiencia y el análisis de riesgos
basado, por ejemplo, en la necesidad, el tipo y el
rendimiento previo del equipo. Puede encontrarse más
orientación sobre la trazabilidad metrológica en la Guía
Eurachem pertinente [20].
Siempre que sea posible y apropiado, la calibración debe
ser realizada por laboratorios de calibración acreditados.
Las calibraciones internas son aceptables dentro de las
disposiciones de ILAC P10 [21] junto con las políticas del
organismo nacional de acreditación.
El rendimiento del equipo calibrado debe verificarse antes de
su uso. Además de los planes de verificación programados,
los equipos deben verificarse con respecto a los valores
iniciales después de cada reparación o modificación
significativa y, si corresponde, cambio de ubicación. Una
verificación del rendimiento del equipo también puede ser
parte de la investigación de la causa raíz después de una falla
en el control de calidad.
En los Anexos E y F se dan ejemplos de intervalos de
calibración y verificación y comprobaciones de
rendimiento típicas para diversos instrumentos de
laboratorio, respectivamente.
9.2 Dispositivos de medición de
temperatura
Los dispositivos de medición de temperatura (por
ejemplo, termopares y termómetros de resistencia de
platino (PRT) utilizados en incubadoras y autoclaves)
deben ser de una calidad adecuada para lograr la
precisión requerida. Por razones de salud y seguridad,
los termómetros de vidrio líquido de mercurio y
tolueno están prohibidos. Se recomienda el uso de
registradores de datos de temperatura.
Dichos registradores de temperatura pueden usarse, por ejemplo,
para monitorear refrigeradores de almacenamiento, así como
congeladores e incubadoras y baños de agua donde se garantiza una
tolerancia aceptable alrededor de la temperatura objetivo.
9.3 Incubadoras, baños de agua, hornos,
congeladores y refrigeradores
La estabilidad de la temperatura y la uniformidad de la
distribución de la temperatura (homogeneidad) deben ser
AML2023
Guía de Eurachem
verificado teniendo en cuenta el tiempo necesario para
alcanzar las condiciones de equilibrio en incubadoras, baños
de agua, hornos y salas de temperatura controlada. La
estabilidad de la temperatura debe verificarse inicialmente y
después de cualquier reparación o modificación [10] con
respecto, por ejemplo, a la posición, el espacio entre y la
altura de las pilas de placas de Petri ISO 7218 [10].
En equipos con atmósfera controlada (por ejemplo, incubadoras)
la humedad y el gas (principalmente CO2) el contenido también
está controlado.
Los laboratorios deben monitorear diariamente, o según
su uso, el funcionamiento de este tipo de equipos y
conservar registros.
9.4 Autoclaves, incluidos los
preparadores de medios.
Los autoclaves deben ser capaces de cumplir tolerancias
especificadas de tiempo, presión y temperatura. No se
aceptan ollas a presión equipadas únicamente con un
manómetro. Los sensores utilizados para controlar o
monitorear los ciclos operativos requieren calibración y se
debe verificar el desempeño de los temporizadores.
Según la experiencia, se pueden colocar sensores de
temperatura dentro de la carga (por ejemplo, en
contenedores llenos de líquido/medio) para permitir
demostrar las diferencias de ubicación. En el caso de
preparadores de medios, donde no se puede demostrar un
calentamiento uniforme por otros medios, generalmente se
consideraría apropiado utilizar dos sensores, uno adyacente a
la sonda de control y otro remoto.
El control de la temperatura se puede lograr mediante uno de los
siguientes:
• usando continuamente un termopar en línea;
• Observación directa cuando está en uso.
Además de controlar directamente la temperatura de un
autoclave, la eficacia de su funcionamiento durante un ciclo
puede comprobarse mediante el uso de indicadores químicos
o biológicos para
esterilización/descontaminación.
9.5 Pesos y balanzas
Las pesas y balanzas deben calibrarse y verificarse a
intervalos regulares (según su uso previsto) o
después de cualquier reparación o cambio de
ubicación).
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

9.6 Equipo volumétrico 9.7 Termocicladores (PCR)

Calibraciones de equipos volumétricos.*Se puede
realizar mediante métodos gravimétricos. Se debe
comprobar el sesgo del volumen administrado con
respecto al volumen establecido (para varios ajustes
diferentes en el caso de instrumentos de volumen
variable). Se debe determinar la precisión de las
entregas repetidas. En el laboratorio de microbiología
se pueden utilizar equipos volumétricos como
dispensadores automáticos, dispensadores/diluyentes,
micropipetas y pipetas desechables.
La verificación no debería ser necesaria para el material de vidrio que
haya sido certificado con una tolerancia específica.
Los laboratorios deben verificar la temperatura, la velocidad de rampa,
los excesos/faltas de temperatura y el tiempo de espera. Las pruebas
cuantitativas de materiales y elementos procesados por
termocicladores también pueden proporcionar pruebas equivalentes
del rendimiento satisfactorio del equipo.
9.8 Otros equipos
Equipo semejante comoconductividad metros,
higrómetros, centrífugas, oxigenometros, pHmetros, CO2
Los sensores y microscopios deben verificarse
periódicamente o antes de cada uso.

Para equipos volumétricos desechables de "un solo uso",

pipetas, matraces, etc., los laboratorios deben obtener
suministros de empresas de confianza. Después de la
validación inicial de la idoneidad del equipo, se
recomienda realizar comprobaciones aleatorias.

* Los requisitos para una pipeta normalmente los establece el volumen de 0,1 a 5 ml para pipetas de émbolo: desviación
laboratorio. ISO 8655-1 [22], por ejemplo, recomienda para un máxima del 0,8 % y desviación estándar máxima del 0,3 %.

AML2023
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10 Selección, verificación y validación de métodos
10.1 Generalidades
La validación/verificación de los métodos de prueba
microbiológicos debe reflejar las condiciones reales de la
prueba. Esto se puede lograr utilizando muestras
contaminadas naturalmente o muestras enriquecidas con
un nivel predeterminado de material (microorganismo). El
analista debe tener en cuenta que las muestras
enriquecidas sólo imitan superficialmente la presencia de
microorganismos naturales. El alcance de la validación/
verificación debe cubrir el alcance del método.
A diferencia de los métodos químicos cuantitativos, la
verificación y validación de los métodos microbiológicos
cuantitativos incluye la determinación de verdaderos y
falsos positivos y negativos, similar a la validación de los
métodos cualitativos [23]. A partir de los resultados
obtenidos se pueden calcular las siguientes
características: sensibilidad, especificidad, tasa de falsos
positivos y falsos negativos, selectividad y eficiencia.
Las siguientes normas pueden ayudar a los laboratorios en la
validación y verificación de métodos:
• Matriz de agua ISO 13843 [24], ISO/TS 12869 [25]
e ISO 29201 [26];
• Matriz alimentaria ISO 7218 [10], ISO 16140 [27 –
32], ISO 17468 [33], ISO 19036 [34] y.
10.2 Selección de métodos
El laboratorio debe utilizar métodos de prueba apropiados
para satisfacer las necesidades específicas y es preferible
utilizar métodos estándar, como los publicados, por ejemplo,
por ISO o ASTM. Estos métodos normalmente se validan antes
de su publicación como método estándar. En estos casos no
es necesaria la validación por parte del laboratorio. Sin
embargo, el laboratorio debe verificar el rendimiento del
método como se detalla en la norma ISO/IEC 17025, cláusula
7.2.1.5 [1].
Se podrán utilizar métodos no estándar siempre que
estén validados por el laboratorio de acuerdo con la
norma ISO/IEC 17025 Cláusula 7.2.2.1. Esto se refiere a
métodos desarrollados en laboratorio, métodos
estándar utilizados fuera de su alcance previsto y
métodos descritos en la literatura científica o
proporcionados por los fabricantes. El procedimiento
detallado a seguir en cada caso varía según la
naturaleza del método, es decir, cualitativo,
semicuantitativo y cuantitativo.
AML2023
Guía de Eurachem
10.3 Verificación
10.3.1 Generalidades
En el caso de métodos estándar, que hayan sido
validados antes de su publicación, el laboratorio debe
demostrar que puede implementarlos de manera
confiable. El desempeño obtenido en la verificación se
compara con las características de desempeño
reportadas en el estudio de validación. Hay varios
estándares y un procedimiento de NMKL que describe
la verificación y a continuación se ofrece una breve
descripción, con ejemplos de estándares ISO; para
obtener detalles sobre los criterios de implementación
y aceptación, consulte la norma específica.
Ejemplo 1
Verificación de unMétodo cuantitativopara una
matriz de agua según ISO 13843 [24].
Para verificar el método el laboratorio debe:
• enriquecer un mínimo de cinco muestras y determinar
las siguientes características de rendimiento;
sensibilidad, especificidad, eficiencia, selectividad,
tasas de falsos positivos y falsos negativos;
• analizar un mínimo de tres muestras (diferentes fuentes y
niveles de organismos objetivo) en condiciones de
repetibilidad para obtener un conjunto de 10 réplicas por
muestra para determinar la repetibilidad;
• realizar conteos repetidos de la misma placa o
tubos positivos para NMP (Número Más Probable),
para determinar la incertidumbre del conteo (30
placas o tubos, preferiblemente pero no necesario,
de diferentes muestras).
Para conocer los criterios de aceptación para la verificación, consulte el
método ISO utilizado y la norma ISO 13843.
Ejemplo 2
Verificación de uncuantitativométodo para una matriz
alimentaria según Tabla 2 ISO 16140-3 [32].
La verificación de un método se realiza en dos
partes:
• analizar un mínimo de 10 duplicados, en diversos
niveles de contaminación, de una matriz alimentaria
seleccionada, que fue probada en el estudio de
validación de la norma, en condiciones de prueba
variables para determinar la incertidumbre operativa
(incertidumbre técnica),tuoh;
• analizar muestras de alimentos contaminados
artificialmente por duplicado, en tres niveles de
contaminación y determinar el sesgo: el
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
diferencia absoluta en los resultados entre las muestras
de prueba de alimentos contaminados artificialmente y
el valor medio de la suspensión del inóculo. Elija una
matriz de alimentos adecuada para cada categoría de
alimentos dentro del alcance de la acreditación.
Para conocer los criterios de aceptación para la verificación,
consulte el método ISO utilizado y la norma ISO 16140-3 [32].
10.3.1 Verificación de métodos moleculares
En lo que respecta a los métodos moleculares, ISO 20836
[36], ISO 20837 [37], ISO 20838 [38] e ISO 22119 [39]
proporcionan el marco, incluidos los requisitos y las
características de rendimiento, para los distintos pasos
para realizar análisis en esta área, desde la extracción y
amplificación de ADN hasta el rendimiento de los
termocicladores estandarizados.
10.4 Validación
10.4.1 Generalidades
Para los métodos de prueba microbiológicos cuantitativos, se
deben considerar y, si corresponde, determinar
cuantitativamente los siguientes parámetros: sensibilidad,
especificidad, tasas de falsos positivos y falsos negativos.
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Guía de Eurachem
selectividad, eficiencia, repetibilidad,
reproducibilidad intralaboratorio, incertidumbre del
conteo y límite de determinación. Las diferencias
debidas a las matrices deben tenerse en cuenta
probando diferentes tipos de muestras.
Los métodos de prueba microbiológicos cualitativos, en
los que el resultado se expresa como detectado/no
detectado y se utilizan procedimientos de confirmación/
identificación, deben validarse determinando, si procede:
sensibilidad, especificidad, tasas de falsos positivos y
falsos negativos, selectividad, efecto de matriz, límite de
detección.
10.4.2 Kits de prueba comerciales
Los laboratorios deben conservar los datos de validación
de los sistemas de prueba comerciales (kits) utilizados en
el laboratorio. Estos datos de validación se pueden
obtener mediante pruebas colaborativas y a partir de
datos de validación enviados por los fabricantes y sujetos
a evaluación de terceros, por ejemplo, ΑFNOR, NordVal,
Microval, AOAC. El laboratorio necesita verificar los kits de
prueba. Si los datos de validación no están disponibles o
no son totalmente aplicables, el laboratorio debe ser
responsable de completar la validación del método.
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11 Muestreo y manipulación de elementos de prueba.
11.1 Muestreo
Se recomienda encarecidamente que el muestreo esté
cubierto por el control de calidad e, idealmente, por la
acreditación. Las siguientes normas pueden ayudar a los
laboratorios en el muestreo y submuestreo: ISO 19458
[40], ISO 6887 [41 – 45], ISO 7218 [10].
El muestreo lo realiza el laboratorio analítico o como
actividad independiente. En cualquier caso debe
basarse en un plan de muestreo y realizarse por
personal capacitado.
El muestreo debe realizarse de forma aséptica utilizando
equipo estéril. Si procede, las condiciones ambientales, por
ejemplo, la contaminación del aire y la temperatura, deberían
controlarse y registrarse en el lugar de muestreo. Se debe
registrar el momento del muestreo.
El transporte y el almacenamiento deben realizarse en
condiciones que minimicen cualquier alteración de su flora
microbiana, por ejemplo, refrigerados o congelados, cuando
corresponda. Se deben monitorear las condiciones y mantener
registros. Cuando corresponda, debería documentarse
claramente la responsabilidad del transporte y almacenamiento,
entre el muestreo y la llegada al laboratorio de pruebas.
Las pruebas de las muestras deben realizarse lo antes
posible después del muestreo.
11.2 Manejo de los elementos de prueba
La flora microbiana puede ser sensible a factores como la
temperatura o la duración del almacenamiento y transporte,
por lo que es importante comprobar y registrar el estado de
la muestra al recibirla en el laboratorio.
El laboratorio debe contar con procedimientos que
cubran la entrega de muestras y su identificación. Si no
hay muestra suficiente o la muestra está en malas
condiciones, por ejemplo debido a deterioro físico,
temperatura incorrecta, embalaje dañado o etiquetado
deficiente, el laboratorio debe consultar con el
AML2023
Guía de Eurachem
cliente antes de decidir si probar o rechazar la
muestra.
El laboratorio debería registrar toda la información
pertinente, en particular la siguiente:
• fecha y, en su caso, hora de recepción;
• estado de la muestra al recibirla y, cuando sea
necesario, temperatura;
• características de la operación de muestreo (fecha de
muestreo, condiciones de muestreo, etc.);
• plan/procedimiento/protocolo de muestreo aplicado, y cualquier
desviación que se haya realizado del mismo.
Las muestras en espera de análisis deben almacenarse en condiciones
adecuadas para minimizar los cambios en cualquier población
microbiana presente. Las condiciones de almacenamiento deben
definirse y registrarse.
El paquete de muestras puede estar muy contaminado y debe
manipularse y almacenarse con cuidado para evitar la
propagación de la contaminación.
El submuestreo por parte del laboratorio inmediatamente
antes de la prueba es parte del método de prueba. Debe
realizarse de acuerdo con estándares nacionales o
internacionales, cuando existan, o mediante métodos
internos validados. Los procedimientos de submuestreo
deben diseñarse para tener en cuenta la distribución desigual
de los microorganismos (orientación general proporcionada
en las normas ISO 6887 [41 – 45] e ISO 7218 [10]).
Se debe escribir un procedimiento para la retención y
eliminación de muestras. Las muestras deben almacenarse
hasta que se obtengan los resultados de la prueba o más, si
es necesario y aplicable, según los requisitos legislativos o la
solicitud del cliente. Las porciones de muestras de laboratorio
que se sabe que están altamente contaminadas deben
descontaminarse antes de desecharse.
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
12 Evaluación de la incertidumbre de la medición
12.1 Generalidades
Según el 'Vocabulario internacional de metrología –
Conceptos básicos y generales y términos
asociados' (VIM 3) [46], el resultado de una medición
compromete el valor de la cantidad medida, la
unidad y la incertidumbre de la medición.
El concepto general se trata en la Guía Eurachem sobre
incertidumbre [47]. ISO/IEC 17025 [1] especifica requisitos
detallados relacionados con la estimación de la
incertidumbre de la medición y cómo debe indicarse en
los informes de prueba; Los laboratorios deben identificar
las contribuciones a la incertidumbre de la medición y, al
estimar la incertidumbre de la medición, se deben tener
en cuenta todas las contribuciones que sean significativas,
incluidas las que surgen del muestreo. También se
reconoce que la naturaleza del método de prueba puede
impedir una estimación rigurosa de la incertidumbre de la
medición; en tales casos, se debe hacer una estimación
basada en la comprensión de los principios teóricos o la
experiencia práctica del desempeño del método.
12.2 Incertidumbre de medición en
microbiología
Los enfoques generales para estimar y expresar la
incertidumbre de la medición en pruebas microbiológicas,
basados en la norma ISO 19036 [34] para alimentos y la
norma ISO 29201 [26] para agua, consideran distintos tipos
de componentes de incertidumbre: 1) incertidumbre
distributiva asociada con la distribución aleatoria de
microorganismos, 2) incertidumbre técnica/operacional que
surge del impacto de la variabilidad asociada con los pasos
técnicos en el procedimiento analítico, 3) incertidumbre de
confirmación y 4) incertidumbre de la matriz.
La norma ISO 19036 es aplicable al análisis cuantitativo
de productos destinados al consumo humano o la
alimentación de animales; muestras ambientales en la
producción y manipulación de alimentos y muestras en
la etapa de producción primaria. Es aplicable a análisis
cuantitativos mediante la técnica de recuento de
colonias, técnicas NMP, métodos instrumentales, como
la impediometría, análisis de trifosfato de adenosina
(ATP), así como citometría de flujo y métodos
moleculares, como los basados en la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). .
ISO 29201 cubre tanto los recuentos de colonias de enumeración
como los métodos NMP y presenta dos enfoques diferentes para
la estimación de la incertidumbre (enfoque de componentes y
enfoque global) que se pueden utilizar para diferentes matrices.
Resumen de la incertidumbre
AML2023
Guía de Eurachem
En el Anexo C de esta Guía se presentan estimaciones de los
componentes de incertidumbre y una introducción a la
presentación de informes de intervalos de confianza
asimétricos basados en la incertidumbre relativa/
logarítmica. Además, la cuestión de la obtención de
resultados negativos al estimar la incertidumbre operativa a
partir de duplicados se trata en la última sección del Anexo C.
La Asociación Estadounidense para la Acreditación de
Laboratorios (A2LA) [48] ofrece un enfoque práctico
con varios ejemplos para estimar y expresar la
incertidumbre de la medición.
12.3 Componentes de la incertidumbre
Generalmente es apropiado basar la estimación de la
incertidumbre de la medición en la repetibilidad y en los
niveles intermedios. precisión (intralaboratorio
reproducibilidad) datos. Se deben identificar los componentes
individuales de la incertidumbre y demostrar que están bajo
control y se debe evaluar su contribución a la variabilidad de
los resultados. Algunos componentes de la incertidumbre,
como por ejemplo el pipeteo, el pesaje, los efectos de la
dilución y los efectos de la incubadora, pueden medirse y
estimarse fácilmente para demostrar una contribución
insignificante a la incertidumbre general de la medición.
Otros componentes, como la estabilidad y la preparación de
la muestra, no se pueden medir directamente. Aunque su
contribución no puede estimarse de manera estadística,
también debe considerarse su importancia para la
variabilidad de los resultados.
12.4 Distribución de microorganismos
dentro de matrices.
Se espera que los laboratorios de pruebas microbiológicas
acreditados tengan un buen conocimiento de las
distribuciones de organismos dentro de las matrices que
prueban y lo tengan en cuenta al realizar submuestreos
siguiendo buenas prácticas de laboratorio y/o requisitos
reglamentarios cuando corresponda. Sin embargo, no
siempre es práctico incluir este componente en las
estimaciones de incertidumbre a menos que las
necesidades del cliente indiquen lo contrario. Las
principales razones de esto son:
• la incertidumbre debida a la distribución de
organismos dentro de la matriz del producto no es
una función del desempeño del laboratorio y puede
ser exclusiva de las muestras individuales analizadas;
• Los métodos de prueba deben especificar el tamaño de la
muestra que se utilizará teniendo en cuenta la posible falta
de homogeneidad.
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
12.5 Pruebas cualitativas
El concepto de incertidumbre de medición no se puede
aplicar directamente a los resultados de pruebas
cualitativas, como los de las pruebas de detección o la
determinación de atributos para la identificación. Sin
embargo, se deben identificar y demostrar que están bajo
control las fuentes individuales de variabilidad, por
ejemplo, la consistencia del desempeño de los reactivos y
la interpretación del analista. Además, para las pruebas en
las que el límite de detección es una indicación importante
de idoneidad, se debe estimar la incertidumbre de
medición asociada con los inóculos utilizados para
determinar el límite y evaluar su importancia.
Para mediciones cuantitativas donde los resultados finales
se expresan de manera cualitativa (por ejemplo, pasa/no
pasa), la estimación de la incertidumbre de la medición
sigue siendo aplicable' según ILAC G17 [49].
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Guía de Eurachem
12.6 Métodos moleculares
En el caso de la detección y cuantificación de
organismos genéticamente modificados (OGM), la
incertidumbre de la medición se estima de acuerdo
con la Guía EUR 22756 EN [50] del JRC/IRMM y se
analiza con más detalle en el Anexo C de esta Guía.
12.7 Incertidumbre muestral
Se ha vuelto cada vez más evidente que el muestreo es a
menudo la contribución más importante a la
incertidumbre y requiere una gestión y un control
igualmente cuidadosos. La incertidumbre del muestreo se
puede estimar utilizando duplicados como se describe en
el Anexo D. Se recomienda utilizar muestras
contaminadas con UFC más altas. Si la incertidumbre del
muestreo es baja, puede que no sea posible estimarla y
sólo se puede calcular y citar un límite de confianza
superior para la incertidumbre del muestreo.
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13 Garantizar la validez de los resultados
13.1 Control de calidad interno
El control de calidad interno consiste en todos los
procedimientos que lleva a cabo un laboratorio para la
evaluación continua de su trabajo monitoreando así la
validez de los resultados. El principal objetivo es garantizar
la coherencia de los resultados día a día y su conformidad
con los criterios definidos. La orientación contenida en ISO
8199 [51] y Nordtest 569 [52] puede ayudar a los
laboratorios a establecer el control de calidad.
El programa de control de calidad interno debe
planificarse y revisarse periódicamente para mantener
el control de todas las pruebas en el alcance de
acreditación del laboratorio. El programa puede incluir
(entre otros) el uso de:
• materiales de referencia y materiales de control de calidad;
• controles funcionales de equipos de medición y
prueba;
• muestras naturales/enriquecidas;
• muestra(s) ciega(s).
El programa también podrá realizar:
• replicar pruebas;
• replicar la evaluación de los resultados de las pruebas, es decir, el recuento
de colonias en placas de Petri por parte de dos analistas;
• revisión de los resultados reportados.
Para los métodos moleculares se deben utilizar controles de
amplificación positivos y negativos, internos y externos. Las
tasas de falsos positivos y falsos negativos también deben
documentarse de acuerdo con la norma ISO 22118 [53].
El programa de control de calidad interno debe adaptarse a la
frecuencia real de los ensayos realizados por el laboratorio.
Para la interpretación diaria de los valores de control se deben
aplicar reglas estadísticas [51, 52]. Se debe realizar un gráfico
de los valores de control para ayudar en la evaluación de las
tendencias de manera visual.
En los casos en que un laboratorio esté acreditado para una
prueba que rara vez se realiza, se debe llevar a cabo un
control de calidad más intensivo en paralelo con la prueba.
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Guía de Eurachem
En cualquier caso, el laboratorio debe ser consciente del
riesgo inherente asociado con tal enfoque y tomar todas
las medidas de precaución apropiadas.
13.2 Pruebas de competencia
Los laboratorios deben participar periódicamente en
comparaciones entre laboratorios, como pruebas de
competencia (PT) o evaluaciones de calidad externas
(EQA), relevantes para su alcance de acreditación. Se debe
dar preferencia a los esquemas de prueba de PT que
utilizan matrices apropiadas. ISO 22117 [54] especifica
requisitos y brinda orientación para la organización de
esquemas de PT.
La participación en programas de PT es obligatoria,
siempre que existan programas adecuados disponibles. Si
este no es el caso, el laboratorio debe participar en
comparaciones entre laboratorios organizadas por un
número suficiente de otros laboratorios sobre la base de
un protocolo bien documentado.
Aunque los organismos de acreditación pueden
especificar una participación mínima en los esquemas
de PT, es responsabilidad del laboratorio demostrar
que la frecuencia y el alcance de la participación son
apropiados para el alcance de sus actividades. EA-4/18
[55] puede proporcionar un apoyo útil con el uso de
subdisciplinas, es decir, un área de competencia
técnica definida por al menos una técnica de medición,
propiedad y producto, que estén relacionados. Esto
facilita la optimización del grado de participación en PT.
Además de esto, la Guía de Eurachem sobre selección,
uso e interpretación de esquemas de PT [56] puede
ayudar en la interpretación de los resultados de la
participación en PT.
Se anima a los laboratorios a suscribirse a esquemas
de PT acreditados según ISO/IEC 17043 [57]. Sólo se
deben utilizar otros proveedores cuando el laboratorio
haya evaluado su competencia basándose en criterios
suficientes.
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14 Informe de resultados

14.1 Generalidades

La presentación de informes de resultados sigue requisitos
generales y específicos y debe incluir la información necesaria
para la interpretación de los resultados.
14.2 Métodos cuantitativos
Los métodos microbiológicos cuantitativos se basan en el
recuento de partículas microbianas, ya sea directamente con
la ayuda de un microscopio o indirectamente basándose en el
crecimiento (multiplicación) en colonias, la turbidez, un
cambio de color o la fluorescencia. Con los métodos
cuantitativos, los resultados se expresan como el número de
unidades formadoras de colonias (UFC) o como el número
más probable (MPN) por volumen o masa de muestra. En el
caso del muestreo de una superficie, los resultados se
reportan en UFC/cm2. Los resultados de un dispositivo con
una superficie no mensurable se informan en UFC/dispositivo.
Por debajo del límite de determinación, que es 10 UFC [51], la
desviación estándar relativa aumenta significativamente. Por
debajo del nivel de detección, que es de media 3 células por
volumen de material analizado, la probabilidad de resultados
positivos cae por debajo del 95 %.
Se recomienda a los laboratorios que reflejen esto en sus informes de
pruebas, pero la expresión recomendada de los resultados puede
diferir según los diferentes estándares. La Tabla 1 presenta
indicaciones sobre cómo informar resultados para matrices de agua.
según ISO 8199 [51] y para matrices alimentarias
según ISO 7218 [10]. Según solicitud del cliente y/
o legislación, en el informe se debe indicar la
incertidumbre de medición para resultados ≥ 10
UFC.
El nivel de detección de los métodos MPN se puede
razonar de la misma manera que para los métodos de
colonias y tiene el mismo valor de 3 partículas por
volumen del material probado según ISO 13843 [24]. Para
concentraciones muy bajas, se supone que la
incertidumbre distributiva asociada con la distribución
aleatoria de microorganismos prevalece en todas las
suspensiones de los sistemas NMP. A este respecto, el
enfoque presentado en la Tabla 1 también puede ser
aplicable a los sistemas MPN.
Cuando la incertidumbre expandida es superior al 30 – 40
% se recomiendaasimétricoSe deben indicar los intervalos
de confianza en lugar de la incertidumbre expandida para
el resultado del recuento en % o unidades logarítmicas. En
el Anexo C se brinda una recomendación sobre cómo
informar el intervalo de confianza para los métodos UFC y
MPN en función de la incertidumbre de medición
calculada. Cualquier limitación en la estimación de la
incertidumbre debe quedar clara para el cliente, por
ejemplo, si solo se incluye la incertidumbre distributiva.

Tabla 1 – Expresión de los resultados en UFC/ml o por porción de prueba analítica

contado Informe de resultados

colonias
ISO 8199 [51] ISO 7218 [10]

0 No detectado o < 1 <1

1-2 Los microorganismos están presentes. Microorganismos presentes pero < 4

3 Informar los resultados como una estimación Microorganismos presentes pero < 4

4-9 Informar los resultados como una estimación Informar los resultados como una estimación

≥ 10 Informar resultados Informar resultados

NOTA 1 La legislación puede exigir diferentes formas de presentación de informes.

NOTA 2 Se debe considerar el volumen del inóculo/placa y la eventual dilución, por ejemplo, 3 UFC
obtenidas en una muestra de alimento diluida 10 veces (inóculo=1 mg/placa) se informarán como:
microorganismos presentes pero < 40 UFC.

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14.3 Métodos cualitativos
Los resultados de las pruebas cualitativas deben informarse
como "detectados/no detectados en una cantidad definida de
muestra analizada". También pueden expresarse como
“menos de un número específico de organismos” cuando el
número especificado de organismos excede el límite de
detección del método y esto ha sido acordado por el cliente.
14.4 Notificación de una declaración de
conformidad – Uso de una regla de decisión
En los casos en que la especificación o la norma
pertinente no haga referencia a una regla de decisión,
el laboratorio debería, cuando se requiera una
declaración de conformidad, documentar y aplicar la
regla de decisión utilizada; esta regla debe tener en
cuenta el nivel de riesgo y comunicarse y acordarse con
el cliente; consulte ILAC G8 [58], así como la Guía
Eurachem [59] y el folleto [60] pertinentes.
14.5 Informes de opiniones e
interpretaciones
Si el laboratorio proporciona opiniones
interpretaciones de los resultados de las pruebas en los informes, esto debe ser
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Guía de Eurachem
realizado por personal autorizado con
experiencia y conocimiento adecuados de la
aplicación específica, así como de los requisitos
legislativos y tecnológicos. Tales opiniones e
interpretaciones deben basarse en los resultados
obtenidos únicamente del artículo probado.
14.6 Control de datos y gestión de la
información
Según ISO/IEC 17025 [1] “sistema(s) de gestión de
información de laboratorio” incluye la gestión de datos
e información contenidos en sistemas computarizados
y no computarizados. Las normas especifican
requisitos relacionados con el acceso del laboratorio a
los datos y la información necesarios para realizar sus
actividades. Además, se establecen requisitos para la
recopilación, procesamiento, registro, almacenamiento
y recuperación de datos. Todas estas actividades deben
validarse para su funcionalidad y operar dentro de un
marco descrito.
y
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Anexo A – Glosario de términos

La terminología para mediciones químicas, biológicas y clínicas se presenta en la Guía de terminología de

Eurachem [61]. A continuación se presenta terminología específica para mediciones microbiológicas.

Límite de detección Aplicado a pruebas microbiológicas cualitativas: El menor número de microorganismos que se
pueden detectar, pero en números que no se pueden estimar con precisión.

Véase también la definición en ISO 16140-1 [28].

Nivel de detección Concentración mínima de organismos que producen evidencia de crecimiento con una
probabilidad de P = 0,95 cuando se inoculan en un medio de cultivo específico y se
incuban en condiciones definidas (ISO 16140-1 [28] e ISO 13843 [24]).
Nota 1: El nivel teórico que se ajusta a esta definición es un promedio de tres células
viables en un volumen de inóculo.

intralaboratorio Estrechez de acuerdo entre los resultados de las pruebas obtenidos con el mismo método en
reproducibilidad materiales de prueba iguales o similares en el mismo laboratorio con diferentes operadores que
(intermedio utilizan diferentes equipos (ISO 8199 [51]). El símbolo utilizado essIR.
precisión)
Limite de Concentración de analito más baja por porción analítica donde la incertidumbre estándar
determinación relativa esperada es igual a un valor especificado (ISO 13843 [24]).

NOTA: En la guía de Eurachem también se utiliza el LOQ, límite de cuantificación.

Desviación negativa Ocurre cuando el método alternativo da un resultado negativo sin confirmación cuando el método
de referencia da un resultado positivo. Esta desviación se convierte en un resultado falso negativo
cuando se puede demostrar que el resultado verdadero es positivo.

Desviación positiva Ocurre cuando el método alternativo da un resultado positivo sin confirmación cuando el método de
referencia da un resultado negativo. Esta desviación se convierte en un resultado falso positivo
cuando se puede demostrar que el resultado verdadero es negativo.

Culturas de referencia Término colectivo para cepa de referencia, cepas de referencia y culturas de trabajo.

Material de referencia Material suficientemente homogéneo y estable con referencia a propiedades

especificadas, que se ha demostrado que es apto para el uso previsto en la medición
o examen de propiedades nominales. (VIM[46]).
Valor de referencia Conjunto de cultivos idénticos distintos obtenidos de un subcultivo de la cepa de referencia
preparado en el laboratorio u obtenido de un proveedor (ISO 11133 [17]).

Cepa de referencia Microorganismos obtenidos directamente de una colección de cultivos de referencia, es decir, una
colección de cultivos que es miembro de la Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC) o
de la Organización Europea de Colecciones de Cultivos (ECCO), definida al menos a nivel de género y
especie, clasificada y descrito de acuerdo con sus características y preferiblemente derivado de
alimentos, productos alimenticios para animales, el entorno de producción de alimentos o piensos o
agua según se aplique (ISO 11133 [17]).

Recuperación relativa Eficiencia con la que un método recupera organismos objetivo de una muestra en comparación
con otro procedimiento. Esta comparación debe realizarse cuando exista un método
alternativo para el mismo organismo. Se prefiere la comparación con un método de referencia
ISO (ISO 13843 [24], ISO 17994 [62]).

Sensibilidad La fracción del número total de cultivos o colonias positivas asignadas correctamente en
la inspección presuntiva (ISO 13843 [24]).

Especificidad La fracción del número total de cultivos o colonias negativas asignadas correctamente en
la inspección presuntiva (ISO 13843 [24]).

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Validación VVerificación, cuando los requisitos especificados son adecuados para el uso previsto.(VIM[46]).

Validación primaria. Un proceso exploratorio con el objetivo de establecer los límites operativos
y las características de rendimiento de un método nuevo, modificado o caracterizado de otro
modo inadecuadamente. Debe dar como resultado especificaciones numéricas y descriptivas
del desempeño e incluir una descripción detallada e inequívoca del objetivo de interés (colonia,
tubo o placa positiva) (ISO 13843 [24]).

Caracterización: el estudio de los parámetros que pueden medirse para describir cómo es
probable que funcione el método en un conjunto determinado de condiciones, que pueden
describirse como características de rendimiento. Es un proceso exploratorio con el objetivo de
establecer el conjunto probable de características de rendimiento de un método nuevo,
modificado o caracterizado de otro modo inadecuadamente. Debe dar como resultado
especificaciones numéricas y descriptivas del desempeño e incluir una descripción detallada e
inequívoca del objetivo de interés (como colonia, tubo o placa positiva). Sin embargo, los
valores generados no deben usarse como límites ya que pueden cambiar dependiendo del
laboratorio, matriz o incluso muestras específicas (ISO 13843).

La caracterización la realiza un solo laboratorio en primera instancia para determinar el desempeño

probable de un método de prueba en un laboratorio específico.

Se puede realizar un estudio de rendimiento del método colaborativo como paso adicional para
evaluar las características de rendimiento entre laboratorios.

Verificación Suministro de evidencia objetiva de que un artículo determinado cumple con requisitos específicos (VIM
[46]).

NOTA: La verificación (validación secundaria) se lleva a cabo cuando un laboratorio procede a

implementar un método desarrollado en otro lugar. La verificación se centra en recopilar evidencia
de que el laboratorio puede cumplir con las especificaciones establecidas en la validación primaria
(adoptada de (ISO 13843 [24]).

Realización de una segunda caracterización por un laboratorio diferente para confirmar los
resultados de la caracterización original (ISO 13843).

La verificación tiene lugar cuando un laboratorio procede a implementar un método desarrollado en

otro lugar. La verificación se centra en recopilar evidencia de que el laboratorio puede generar datos
de desempeño similares a los establecidos en la caracterización primaria. No es útil establecer límites
a los diversos componentes de la caracterización del método, ya que estos pueden variar
dependiendo de muchos aspectos del método, tipo de muestra y laboratorio que los realiza. Los
datos de verificación deben utilizarse para establecer el tipo y la calidad de los datos que
probablemente generará el laboratorio con un procedimiento determinado y cualquier tipo de
muestra determinado.

Normalmente, la verificación utiliza formas seleccionadas y simplificadas de los mismos procedimientos utilizados en la
caracterización del método, pero posiblemente extendidas a lo largo de un tiempo más largo.

Cultura laboral Un subcultivo primario de una población de referencia (ISO 13843 [24]).

NOTA: Subcultivo a partir de una población de referencia, un cultivo primario o un material de referencia, ya
sea certificado o no.

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Anexo B – Cultivos de referencia

Cepa de referencia de una fuente reconocida por un organismo

de acreditación, por ejemplo, selección de cultivo nacional.

Figura B 1 ─ Uso general de las culturas de referencia y de trabajo

* Controles paralelos de pureza y pruebas bioquímicas según corresponda.

NOTA: Todas las partes del proceso deben estar completamente documentadas y se deben mantener registros detallados de
todos los pasos.

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Anexo C – Intervalos de confianza para la presentación de informes

Alcance C1
El objetivo principal de este Anexo es presentar brevemente el cálculo de intervalos de confianza asimétricos para métodos
microbiológicos. Las principales referencias son ISO 29201 [26] e ISO 8199 [51] para matrices de agua, ISO 19036 [34] para
matrices de alimentos y G108 para ambas matrices [52]. Cuando la incertidumbre expandida es superior al 30 – 40 % se
recomienda indicarasimétricointervalos de confianza en lugar de simplemente dar la incertidumbre expandida para el resultado
del recuento en % o unidades logarítmicas. Un intervalo de confianza para los resultados será más informativo para el cliente
que simplemente dar el resultado con incertidumbre, por ejemplo, 50 UFC ± 42 % también se puede informar como 50 [33, 76]
UFC, donde 33 – 76 es el intervalo de confianza asimétrico para el resultado. 50 UFC.

Introducción C2
En microbiología, los principales componentes de la incertidumbre estándar para la incertidumbre analítica de una
muestra entregada al laboratorio,tuanal, son según ISO 29201 [26] e ISO 19036 [34]:

1.tuoh– incertidumbre operacional (técnica) relativa debido al uso del procedimiento;

2.tud– incertidumbre distributiva o intrínseca relativa debida a la toma de una porción de prueba de una muestra de
laboratorio. La variabilidad distributiva es la variación inevitable y sin causa que está asociada con la distribución de
partículas en la suspensión final y en el instrumento de detección. En las suspensiones microbiológicas,
generalmente se cree que sigue la distribución de Poisson; consulte el Anexo C en ISO 29201. Nota: Normalmente se
toma una porción de prueba de la muestra de laboratorio, pero en el caso de queentero muestra de laboratorio* se
utiliza para el análisistudse pone a cero;

3.tuconfinar– aumento de la incertidumbre distributiva debido al resultado de la confirmación.

Contribuciones adicionales a la incertidumbre para sólidos y fluidos viscosos en particular:

tumatriz– incertidumbre relativa derivada de una mezcla imperfecta de la muestra de laboratorio. Siempre que toda la muestra
de laboratorio pueda hacerse homogénea,tumatrizse puede configurar en 0,10 log10UFC/g (≈ 23 %) según apartado 6.2 de la
norma ISO 19036.

Incertidumbre adicional del muestreo:

sémola gruesa de maíz–La incertidumbre relativa debida al muestreo se analiza en el Anexo D.

En ISO 8199 [51] el único componente de incertidumbre considerado es el distributivo,tudcuando se desconoce la

incertidumbre operativa. En recuentos bajos (< 15 UFC), la incertidumbre distributiva domina, pero en recuentos más
altos esto dará como resultado una subestimación de la incertidumbre.

La incertidumbre relativa se puede dar en % o en unidades de natural (ln o logmi) o logaritmos comunes (log10)†.

La incertidumbre estándar combinada relativa ( )para una muestra de laboratorio se puede calcular a partir de laimportante
componentes de incertidumbre relativa:

=√d 2+ 2 +2 2
confinar+ matriz
(C.1)

Un componente se puede considerar relevante si el tamaño es 1/5 o más del componente más grande.

* Muestra de laboratorio es “Muestra preparada para enviar al laboratorio y destinada a inspección o prueba”, de
ISO19036 [34].

† Tenga en cuenta que una incertidumbre determinada inferior al 50 % se puede recalcular en cualquiera de las unidades; consulte ISO
29201 [26]; por ejemplo, una incertidumbre del 20 % es aproximadamente igual a 0,20 en logaritmo natural (ln) y 0,087 en logaritmo
común (log10). El factor de logaritmos naturales a comunes es 0,4343 y de logaritmos comunes a naturales es 2,303 (ln 10).

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Un intervalo de confianza asimétrico del 95 % alrededor del valor medido,norte, se puede calcular según la sección
N3.4 de ISO 29201* de la incertidumbre estándar dada en %:
2
= /exp ( ) (C.2)
100
y

= × exp (2 ) (C.3)
100

y según el apartado 9.1 de la norma ISO 19036†de lo dado en el registro10unidades:

mín.= /102
(C.4)
y
máximo= × 102
(C.5)
Esta forma de calcular un intervalo asimétrico se ha denominado factor de incertidumbre (FUd.) ya que divides o multiplicas con
el mismo factor [64]. Para una incertidumbre estándar dada en unidades relativas (%) el factor de incertidumbre es:

= exp (2 ) (C.6)
100

y luego:
= ⁄
(C.7)
y

= ×
(C.8)
Por ejemplo, paranorte=15 UFC y una incertidumbre estándar combinada detuC= 30 % el factor de incertidumbre es =
1,82. tLuego se puede calcular que el intervalo es = 8UFC y = 27UFC. En este Anexo se proporciona información sobre:

• informar intervalos de confianza asimétricos basados en la incertidumbre relativa en % para recuentos de colonias comunes en el
sector del agua;

• informar intervalos de confianza asimétricos basados en unidades log10 comunes en el sector alimentario;

• informar intervalos de confianza asimétricos para un método MPN;

• estimación de incertidumbre para métodos moleculares; y

• una posible solución al problema cuando se obtienen resultados negativos en un estudio para estimar la incertidumbre
operativa (tuoh) a partir de duplicados.

* En la mayoría de los casos, se puede suponer que la incertidumbre estándar absoluta calculada en escala logarítmica natural y la incertidumbre
estándar relativa son numéricamente iguales (ISO 29201 [26]). Por lo tanto, los logaritmos naturales se pueden aproximar con la incertidumbre
relativa en porcentaje dividido por 100. Esto es válido para una incertidumbre relativa < 50 %.

† ISO 19036 [34] utiliza una fórmula equivalente, por ejemplo, donde y = iniciar sesión10(n) yUd.=2tuCen registro10unidades.

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C3 Estimación de la incertidumbre (%) para un recuento de colonias (UFC) en agua e

intervalos de confianza asimétricos
La Tabla C 1 ofrece un ejemplo de intervalos de confianza asimétricos basados en la incertidumbre en % para recuentos de colonias
comunes en el sector del agua con una incertidumbre operativa del 15 %.

Tabla C 1 ─ Estimación de la incertidumbre operativa ( ) e incertidumbre distributiva ( ) en

unidades de % y cálculo de un intervalo de confianza asimétrico del 95 % que indica y

Contar
(UFC) (%) (%) (%) (%) (UFC) (UFC)
3 15 58 60 120 1 10
4 15 50 52 104 1 11
5 15 45 47 94 2 13
6 15 41 44 88 2 14
8 15 35 38 76 4 17
10 15 32 35 70 5 20
15 15 26 30 60 8 27
20 15 22 27 54 12 34
25 15 20 25 50 15 41
30 15 18 23 46 19 48
40 15 dieciséis 22 44 26 62
50 15 14 21 42 33 76
75 15 12 19 38 51 110
100 15 10 18 36 70 143
150 15 8 17 34 107 211
200 15 7 17 34 142 281
250 15 6 dieciséis 32 182 344
300 15 6 dieciséis 32 218 413
NOTA: Cálculo de un intervalo de confianza asimétrico según las
ecuaciones C.2 y C.3.

En la Tabla C 1 se puede ver que con este ejemplo específico de unincertidumbre operativaDel 15 % la incertidumbre
distributiva predomina en la parte más baja del rango de trabajo. Por ejemplo, calcular la incertidumbre combinada
utilizando solo la incertidumbre distributiva del 32 % para 10 UFC da como resultado un intervalo de confianza de [5,19].
Esto es muy similar al intervalo [5,20] indicado en la Tabla C1 obtenido teniendo en cuenta la incertidumbre operativa del
15 %.

Un ejemplo de cómo utilizar la Tabla C 1 para un método con incertidumbre operativatuohigual al 15 % que requiere
confirmación parcial se presenta en la Tabla C 2 y Tabla C 3. El recuento presuntivo fue de 25 UFC.

Tabla C 2 ─ Resultado antes de la confirmación de la Tabla C 1 – recuento presuntivo 25 UFC

Contar
(UFC) (%) (%) (%) (%) (UFC) (UFC)
25 15 20 25 50 15 41

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Confirmación: 10 colonias (nortez) de 25 presuntas colonias (norteC) de un tipo en el método de placa. De los 10 (
nortez) colonias analizadas, 8 colonias (nortek) se confirman positivos. El recuento confirmado (norte)son entonces
20 colonias de las 25 presuntas colonias según la fórmula:

= × / = (C.9)

Tabla C 3 ─ Resultado después de la confirmación – recuento confirmado calculado a 20 UFC

1 2
Contar tuconfinar

(UFC) (%) (%) (%) (%) (%) (UFC) (UFC)

20 15 20 dieciséis 30 59 11 36
1 incertidumbre distributiva para las 25 presuntas colonias.
tuconfinarcalculado aproximadamente con la ecuación E3 (segundo término) en ISO
2
29201 [26].

C4 Estimación de la incertidumbre (log10) para el recuento de colonias (UFC) en alimentos e

intervalos de confianza asimétricos
La Tabla C 4 muestra intervalos de confianza asimétricos basados en la incertidumbre en log10unidades para recuento de
colonias comunes en el sector alimentario con una incertidumbre operativa del 35 % (0,15 log10) y una incertidumbre matricial
del 23 % (0,10 log10).

Tabla C 4 ─ Estimación de la incertidumbre operativa (tuoh), distribucional

(tud) y matriz (tumatriz) incertidumbre1en registro10unidades y cálculo de un
intervalo de confianza asimétrico del 95 %2indicandoUd.mín.yUd.máximo

Contar3 tuoh tud tumatriz tuC Ud. Ud.mín. Ud.máximo

(UFC) (registro10) (registro10) (registro10) (registro10) (registro10) (UFC) (UFC)

3 0,15 0,25 0,10 0.308 0,618 1 12
4 0,15 0,22 0,10 0,282 0.564 1 15
5 0,15 0,19 0,10 0.265 0.530 1 17
6 0,15 0,18 0,10 0.253 0.506 2 19
8 0,15 0,15 0,10 0.237 0,474 3 24
10 0,15 0,14 0,10 0.227 0.453 4 28
15 0,15 0,11 0,10 0.212 0.425 6 40
20 0,15 0,10 0,10 0.205 0.410 8 51
30 0,15 0,08 0,10 0,197 0,394 12 74
40 0,15 0,07 0,10 0,193 0.386 dieciséis 97
50 0,15 0,06 0,10 0.190 0.381 21 120
75 0,15 0,05 0,10 0,187 0.374 32 178
100 0,15 0,04 0,10 0,185 0.371 43 235
150 0,15 0,04 0,10 0,184 0.367 64 350
200 0,15 0,03 0,10 0.183 0.366 86 464
250 0,15 0,03 0,10 0,182 0.365 108 579
300 0,15 0,03 0,10 0,182 0.364 130 694
1 Cuando se aplica la confirmación se debe incluir un componente de incertidumbre adicional.
– véanse la Tabla C 2 y la Tabla C 3 e ISO 29201 [26].
2Los intervalos se pueden dar en unidades de UFC o en unidades de log.10UFC; aquí en la UFC.
3Número total de colonias contadas.
NOTA: Cálculo de un intervalo de confianza asimétrico según las ecuaciones C.4 y C.5.

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Un ejemplo de cómo utilizar la Tabla C 4 para un método validado que tiene una incertidumbre operativa (técnica),tuoh
= 0,15 registro10UFC/g y una incertidumbre de matriz,tumatriz= 0,10 registro10UFC/g se muestra a continuación. Porciones de
prueba de 1,0 ml en una placa de cada una de dos diluciones sucesivas dieron los siguientes resultados; A las 10−3dilución, 102
colonias y a las 10−4dilución, 8 colonias. Los cálculos se resumen en la Tabla C 5 para un método con una incertidumbre
operativa de 0,15 log10UFC/g. El intervalo de incertidumbre se puede calcular a partir detuC= 0,185 registro10UFC/g utilizando la
Tabla C 4 teniendo en cuenta las diluciones:

Ud.mín.= 0,43 × 105yUd.máximo= 2,35 × 105UFC/g

Tabla C 5 ─ Ejemplo de estimación de la incertidumbre (tuC)

para una muestra con 2 diluciones*

Análisis Valor Unidad Comentario

Dilución 10-3 102 UFC/g

Dilución 10-4 8 UFC/g
media ponderada 1,0 × 105 UFC/g (102 + 8)/1,1 × 103= 1,0 × 105
media ponderada 5.0 registro10UFC/g

Incertidumbre Valor Unidad Comentario

tuoh 0,15 registro10UFC/g Operacional

tud 0.041 registro10UFC/g distribucional,norte=102 +8

tumatriz 0,10 registro10UFC/g Matriz

tuC 0,185 registro10UFC/g Incertidumbre combinada

√ 2+ 2 + 2

* Ejemplo de la sección 8.3.1 de ISO 19036 [34] dondetumatrizse establece en 0,10 para una matriz
homogénea y la incertidumbre distributiva en unidades log10 se calcula utilizando
el número total de colonias, 110 (102 + 8) usando la ecuacióntud= 0,4343/√110.

C5 Estimación de la incertidumbre para un método NMP e intervalos de confianza

asimétricos
Un ejemplo con 2 resultados MPN para un método con incertidumbre operativatuohde 0,071 registro10(≈ 16 %) se
muestra a continuación. La Tabla C 6 muestra el intervalo de confianza para el método MPN (MPNUd.mín.y MPNUd.máximo)
e intervalos de confianza teniendo en cuenta también la incertidumbre operativa.

Tabla C 6 ─ Ejemplo de estimación de la incertidumbre combinada en log10unidades para un método MPN

de la incertidumbre distributiva (tud) y operativo (tuoh) incertidumbre y cálculo de
un intervalo de confianza asimétrico del 95 % que indicaUd.mín.yUd.máximo

NMP NMPUd.mín. NMPUd.máximo tu1d tuoh tuC Ud. Ud.mín. Ud.máximo

UFC registro10 UFC registro10 (registro10) (registro10) (registro10) (registro10) NMP NMP
6.2 2.4 0.380 13.7 1.137 0,193 0,071 0.206 0.412 2 dieciséis

1986 1222 3.087 3300 3.519 0.110 0,071 0.131 0.262 1086 3636
1 Fórmulatud= (Ud.máximo-Ud.mín.)/3.92 de ISO 29201 [26] Ecuación D.2

NOTA: Cálculo de un intervalo de confianza asimétrico según: = /102 y = ∗ 102

dóndetuCse da en el registro10unidades.

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En la Tabla C 6, se puede ver en recuentos bajos con una incertidumbre operativa de 0,071 log10(≈ 16 %), predomina la
incertidumbre distributiva, 0,193 log10(≈ 44 %), y la incertidumbre combinada se puede calcular utilizando únicamente la
incertidumbre distributiva. En este caso, el intervalo de confianza para 6,2 UFC contuC= 0,193 registro10es [3,15]. Esto
debe compararse con el intervalo indicado en la Tabla C 6, que es [2,16] teniendo en cuenta la incertidumbre operativa.

C6 Métodos moleculares
La estimación de la incertidumbre de medición para métodos moleculares (análisis cuantitativos) está dentro del alcance de la norma ISO
19036 [34]. Por tanto, los cálculos basados en log10Se pueden preferir los datos transformados.

Se pueden consultar normas específicas para métodos como la PCR, ya que pueden incluir enfoques particulares para
determinar la incertidumbre. Por ejemplo, en calidad del agua, ISO/TS 12869 [25] especifica un método para detectar y
cuantificar Legionella spp. y L. pneumophila mediante PCR. Se dedica una sección específica a estimar la incertidumbre
de todo el método, incluida la recuperación.

Para los laboratorios médicos, el Anexo A de ISO/TS 20914 [63] también brinda ejemplos prácticos de estimación de la incertidumbre, por
ejemplo, método de amplificación por PCR del ADN y cuantificación mediante detección de la intensidad de la emisión de fluorescencia:
determinación de la incertidumbre estándar en el registro.10escala utilizando materiales de prueba del control de calidad interno.

C7 Estimación de la incertidumbre operativa a partir de datos de control de calidad

La incertidumbre operativa (técnica) se puede calcular a partir de datos de control de calidad restando el cuadrado del
componente distributivo,tudde la desviación estándar observada de los resultados de la medición de una muestra de
control:

=√2 − 2 (C.10)

Ejemplo: La desviación estándar para la muestra de control de calidad con un valor medio de 42 UFC es 17,6 %. La
incertidumbre distributiva para 42 UFC es del 15,4 %. La incertidumbre operativa es entonces:

= √17,62− 15,42= 8,5 (C.11)

C8 Estimación de la incertidumbre operativa a partir de duplicados: la cuestión de los

resultados negativos
La incertidumbre operativa (técnica) se puede calcular de acuerdo con la norma ISO 29201 [26] o ISO 19036 [34] a partir
de resultados duplicados* en un estudio en el que se maximizan las variaciones experimentales dentro del laboratorio.
La variación entre los duplicados se debe a la incertidumbre tanto operativa como distributiva (Poisson). Si la
incertidumbre operativa real es baja, pueden ocurrir estimaciones negativas en los cálculos. En este caso, la
incertidumbre operativa no se puede estimar y a partir del estudio solo se puede informar comotuoh<x. En la Tabla C 7 se
muestran los resultados de las simulaciones; el límite de confianza unilateral se tabula al estimar la incertidumbre
operativa de 10 a 100 duplicados para varias UFC.

* La incertidumbre operativa se estima restando la varianza distributiva media de la varianza media de reproducibilidad
(la variación entre los duplicados), cuidando que ambas se expresen en la misma unidad (sección F.3.3 en ISO 29201
[26]).

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Tabla C 7 ─ Límite de confianza unilateral estimado para la incertidumbre operativa mediante simulaciones

Número Mediana tud ?̂? *

de duplicados
(UFC) (%) (%)
10 30 18 15
20 30 18 11
30 30 18 9
10 50 14 11
20 50 14 8
30 50 14 6
10 75 11.5 9
20 75 11.5 7
30 75 11.5 6
10 100 10 8
20 100 10 6
30 100 10 5
100 100 10 3
* ?̂? se basa en un límite de confianza superior (UCL)
unilateral aproximado para la estimación de la
incertidumbre operativa cuando la varianza calculada
es cero o negativa.

NOTA: Duplicados según el Anexo F de ISO 29201. Cada

simulación con muestreo de duplicados de una
distribución se repitió entre 2000 y 5000 veces.

Ejemplo de uso de la Tabla C 7: En un estudio para calculartuohde 30 duplicados con recuentos entre 25 y 75 UFC
con una mediana de recuento de 50 UFC se obtuvo resultado negativo. Al leer la fila para el número de duplicados
30 y UFC = 50, se puede ver que el límite de confianza superior unilateral (UCL) aproximado para la estimación de
tuohes del 6%. Por lo tanto, se puede concluir quetuohes ≤ 6 %; entre el 0 y el 6 %. Este valor máximo,
= 6 %, se puede utilizar en el cálculo de la incertidumbre estándar de los resultados.

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Anexo D – Incertidumbre muestral

Alcance D1
El objetivo principal de este Anexo es presentar brevemente la estimación de la incertidumbre del muestreo a partir de
duplicados siguiendo las orientaciones de la Guía Eurachem.Incertidumbre de medición que surge del muestreo[64] y Nordtest
TR 604 [65]. La incertidumbre del muestreo no se trata en las normas ISO, pero en el Anexo H de la norma ISO 29201 [26] la
incertidumbre debida al submuestreo (efecto matriz) de una muestra de laboratorio se estima mediante ANOVA. Para simplificar
los cálculos de ANOVA utilizamos un complemento de Excel, RANOVA3 [66].

Introducción D2
Cuando se incluye el muestreo, la incertidumbre de la medición consta tanto de la incertidumbre del muestreo como de la
incertidumbre analítica.*. El diseño experimental para estimar la incertidumbre muestral consiste en tomar varias muestras
duplicadas y cada muestra se analiza por duplicado. La incertidumbre muestral se estima como una diferencia de la variación
total, medirsegún la Ecuación 3 en Nordtest 604 [65]:

sémola gruesa de maíz= √ 2 eas − 2 anal

(D.1)

dónde anal= √ 2 + 2 oh… (D. 2)

El diseño experimental y los cálculos están bien descritos en la Guía Eurachem [64] utilizando el complemento AMC para
Microsoft Excel RANOVA3 [66]. El número mínimo de muestras duplicadas es ocho, pero si el sémola gruesa de maíz
es mas bajo que analSe recomiendan más duplicados (30-40). La incertidumbre del muestreo se informa en unidades de % para
recuentos de colonias comunes en el sector del agua, y en log10Unidades habituales en el sector alimentario.

Dado que la incertidumbre analítica en microbiología a menudo puede ser relativamente alta, puede resultar difícil estimar la
incertidumbre del muestreo. Cuando la incertidumbre del muestreo es menor que la incertidumbre analítica, es posible
obtenerestimaciones negativasde 2 − 2 .La estimación normalmente se informa como muestreo cero.
incertidumbre que no podemos recomendar. Esta cuestión deestimaciones negativasse trata en este Anexo y es similar
al problema de los resultados negativos al estimar una incertidumbre operacional descrito en el Anexo C.

D3 Estimación de la incertidumbre del muestreo

La incertidumbre del muestreo se estima a partir de un diseño experimental equilibrado con duplicados que figuran en la
Sección 9.4.2 de la Guía Eurachem [64]. A continuación se analiza el uso de ANOVA clásico asumiendo una distribución lognormal
con el complemento de Excel RANOVA [66] para estimar la incertidumbre muestral.

Ejemplo: Se tomaron muestras de agua de manantial natural (contaminada) del mismo pozo. Se tomaron diez muestras
diferentes por duplicado en 10 días diferentes. Cada muestra C1 y C2 fue analizada en paralelo (C1.1 / C1.2; C2.1 /C2.2
para bacterias coliformes usando filtración por membrana (ISO 9308-1:2014 [67]) por diferentes operadores, usando el
mismo lote. de consumibles y misma incubadora. Los resultados se muestran en la Tabla D 1. La media aritmética es 35
UFC y la mediana es 31 UFC para estos resultados.

* Para aplicaciones con bajas UFC (< 20), la incertidumbre estándar, es alto por lo que en la mayoría de los casos
la incertidumbre del muestreo para objetivos de muestreo homogéneos puede despreciarse.

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Tabla D 1 ─ Resultados de las pruebas para diez muestras diferentes tomadas por duplicado en 10 días diferentes.
Cada muestra C1 y C2 se analizó en paralelo, para
Bacterias coliformes con filtración por membrana.

Muestra C 1 Muestra C 2

UFCC1.1 UFCC1.2 UFCC2.1 UFCC2.2

63 45 41 45
37 26 28 30
21 23 31 30
18 20 24 18
18 14 14 18
68 45 40 67
62 42 42 46
29 20 17 19
41 28 41 32
61 50 50 48

Cálculos D4
Los resultados de las pruebas en la Tabla D 1 se proporcionaron como entrada para RANOVA3 [66] y las incertidumbres se calcularon
utilizando ANOVA clásico.*. Las incertidumbres estimadas se muestran a continuación y la incertidumbre del muestreo se da como cero,
lo que indica una estimación negativa para ( 2 − 2 ).

Figura D 1 ─ Salida del software RANOVA3 de AMC utilizando los datos de la Tabla D 1 como entrada

Suponiendo una distribución lognormal, utilizamos el factor de incertidumbre proporcionado en el resultado de RANOVA3 para calcular
la incertidumbre. Elincertidumbre analítica estándaren registro10las unidades se calculan a partir del factor de incertidumbre dado en la
Figura D 1 usando la siguiente ecuación:

anal.log10= ( )/2 = (registro 1,47)/2 = 0,084

(D.3)
y en logaritmos naturales

anal= . 10× ln(10) = 0,084 × 2,303 = 0,19

(D.4)
que es 19 % de incertidumbre relativa†.

* El complemento RANOVA3 de Excel calcula ANOVA tanto clásico como robusto. En aplicaciones de microbiología se recomienda el
ANOVA clásico. RANOVA3 toma sus entradas como valores de medición sin procesar, pero los valores del factor de incertidumbre se
calculan después de hacer un registro.mitransformación dentro del programa.

†Según ISO 29201 [26], ¿se pueden aproximar los logaritmos naturales con incertidumbre relativa en porcentaje dividido por
100 (para incertidumbre relativa < 50 %).

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D5 Estimación del límite superior de confianza cuando la incertidumbre muestral es cero

En este caso se estima que la incertidumbre del muestreo es cero. Lo que podemos decir es que la incertidumbre muestral
ampliada es probablemente menor que un valor particular. Este valor es ellímite superior de confianzapara la estimación de la
incertidumbre de muestreo cero. El software AMC puede proporcionar límites de confianza para las incertidumbres expandidas
estimadas en una salida separada (CI RANOVA). La Figura D 2 muestra los límites de confianza para la incertidumbre del
muestreo. Suponiendo una distribución lognormal, los límites de confianza superiores para el factor de incertidumbre debería
ser usado.

Figura D 2 ─ Salida del software AMC RANOVA3 donde la confianza

Los límites se añaden como información adicional.

En registro10unidades el límite superior de confianza para elestándarLa incertidumbre se puede calcular a partir del límite
superior de confianza del factor de incertidumbre. dado en la Figura D 2 (1.4932) usando la siguiente ecuación:

El límite de confianza superior para la incertidumbre del muestreo es:

?̂?registro= ( )/2 = (registro 1,49)/2 = 0,087

(D.5)
y en logaritmos naturales el límite superior de confianza relativa es

?̂? = ?̂? × ln(10) = 0,087 × 2,303 = 0,20 ≈ 20 %

(D.6)
Esta estimación*no es la incertidumbre estándar de muestreo. Hemos estimado la incertidumbre del muestreo en cero %
y ahora sabemos que la incertidumbre estándar del muestreo probablemente esté entre el 0 % y el 20 %.

Si queremos reducir la estimación del 20 % necesitamos tomar más muestras duplicadas. Utilizando una simulación con 40
puntos de datos en lugar de 10 con las mismas condiciones experimentales y una media de 35 UFC, el límite de confianza
superior ?̂? rondará el 11 %.

* ?̂? se basa en un límite de confianza superior (UCL) unilateral aproximado para la estimación de la incertidumbre de muestreo

estándar cuando la varianza media calculada a partir de duplicados es cero o negativa.

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Conclusiones del D6
La incertidumbre del muestreo se puede estimar con ANOVA utilizando resultados de duplicados. Sin embargo, dado que la
incertidumbre del muestreo se calcula como una diferencia, es difícil estimar una incertidumbre de muestreo con UFC bajas
cuando la incertidumbre analítica es alta; la estimación de incertidumbre obtenida tiene por tanto una alta “incertidumbre”.

Cuando la incertidumbre del muestreo es menor que la incertidumbre analítica, puede ocurrir una estimación de cero para la
incertidumbre del muestreo. Entonces sólo podemos informar un límite de confianza superior para la incertidumbre del muestreo; en
otras palabras, la incertidumbre del muestreo está en algún lugar entre cero y ese límite de confianza superior. Para abordar este
problema se recomienda lo siguiente:
1. Se recomiendan muestras con valores de UFC más altos. Dado que la incertidumbre distributiva (que es parte de la incertidumbre
analítica) disminuye con unas UFC más altas, se puede estimar una incertidumbre de muestreo más baja con unas UFC más
altas;
2. en general, se recomiendan 30 muestras duplicadas; entonces el límite de confianza superior para la incertidumbre del
muestreo es un poco más de la mitad de la incertidumbre analítica.
Cuando se estima que la incertidumbre del muestreo es cero utilizando más duplicados, por ejemplo 40, la contribución de la
incertidumbre del muestreo puede considerarse en la mayoría de los casos insignificante. Si deseamos calcular la contribución
con una incertidumbre analítica del 19 % y una incertidumbre muestral del 11 % o menos, la estimación de ?̂? ,la incertidumbre
estándar de medición (muestreo + analítica) será sólo del 22 %. Por lo tanto, en este caso podemos suponer medir≈ anal.

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Anexo E – Orientación sobre calibración de instrumentos de medida

La calibración, destinada a proporcionar trazabilidad a las unidades SI pertinentes, debe realizarse en todo el rango de
medición utilizando estándares de medición, procedimientos de referencia y personal calificado adecuados. Los servicios
proporcionados por laboratorios de calibración acreditados cumplen con estos requisitos. Todo el equipo debe calibrarse
antes de ponerse en uso. La frecuencia de la calibración estará justificada por la experiencia y el análisis de riesgos
basado, por ejemplo, en la necesidad, el tipo, las recomendaciones del fabricante y el rendimiento previo del equipo. La
siguiente tabla presenta una guía general para la frecuencia de calibración.

Tipo de equipamiento Requisito Frecuencia sugerida

Referencia Calibración Cada 5 años

termómetros (por ejemplo
Comprobación de un solo punto (por ejemplo, punto de hielo) Anualmente
líquido en vidrio)

Referencia Calibración Cada 3 años

termopares
Comprobar con el termómetro de referencia. Anualmente

Termómetros de trabajo Calibración Anualmente en los primeros 3 años,

& Laboral seguido con menor frecuencia, según
termopares resultados satisfactorios.
actuación
Compruébelo con el termómetro de referencia en el punto de Anualmente
congelación y/o en el rango de temperatura de trabajo.

Saldos Calibración en todo el rango Anualmente en los primeros 3 años,

seguido con menor frecuencia, según
resultados satisfactorios.
actuación
Pesas de calibración Calibración Cada 5 años
Verificar peso(s) Verifique con el peso calibrado o verifique la Cada 3 años
balanza inmediatamente después de la calibración
de la balanza.

cristalería volumétrica, Calibración gravimétrica según la tolerancia requerida, a menos Anualmente

incluyendo pipetas de vidrio que vaya acompañada de los certificados adecuados. La
cristalería esterilizada en un horno esterilizador debe
controlarse periódicamente, incluso si está certificada.

Pipetas/micropipetas Calibración Anualmente

Higrómetros Calibración Anualmente

medidores de pH Calibración con soluciones tampón estándar Anualmente o con mayor frecuencia si es
trazables necesario

Analizadores de gases Calibración Anualmente

Autoclaves, medios Calibración de sensores de temperatura y presión si es Anualmente

preparadores crítico.

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Anexo F – Orientación sobre validación y verificación de equipos
Esta información se proporciona a modo orientativo y la frecuencia se basará en la necesidad, tipo
y rendimiento previo del equipo.
Tipo de equipamiento
Temperatura controlada
equipos (incubadoras,
baños, frigoríficos, congeladores)
Atmósfera controlada
equipo
(incubadoras, etc.)
Termocicladores (PCR
y PCR en tiempo real)
Hornos esterilizadores
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Requisito
(a) Definir límites de aceptabilidad para la
estabilidad y homogeneidad de la
temperatura.
(b) Determinar la estabilidad y homogeneidad
de la temperatura y compararla con los
límites de aceptabilidad.
(c) Definir/confirmar el rango de
funcionamiento y los límites de
alarma correspondientes
(d) Monitorear la temperatura
(a) Definir límites de aceptabilidad para la
estabilidad y homogeneidad de la
composición de la atmósfera
(generalmente, humedad y CO2contenido)
(b) Determinar la estabilidad y
homogeneidad de la composición de
la atmósfera y compararla con los
límites de aceptabilidad.
(c) Definir/confirmar el rango de
funcionamiento y los límites de
alarma correspondientes
(d) Monitorear la composición de la atmósfera.
Determinar la estabilidad y homogeneidad
de la temperatura y compararla con los
límites de aceptabilidad para garantizar el
rendimiento.
(a) Definir límites de aceptabilidad para la
estabilidad y homogeneidad de la
temperatura.
(b) Determinar la estabilidad y homogeneidad
de la temperatura y compararla con los
límites de aceptabilidad.
(c) Monitorear la temperatura
Guía de Eurachem
Frecuencia sugerida
(a) Inicialmente
(b) Inicialmente, y después de cualquier reparación/
modificación/cambio de ubicación, que pueda
tener efecto en el
control de temperatura
(c) Inicialmente y en cada ocasión posterior de
evaluación
(d) Al menos diariamente / en cada uso o
mediante monitoreo y registro continuo
durante el tiempo de uso
(a) Inicialmente
(b) Inicialmente, y después de cualquier reparación/
modificación/cambio de ubicación, que pueda
tener efecto en el
control de temperatura
(c) Inicialmente y en cada ocasión posterior de
evaluación
(d) Al menos diariamente / en cada uso o
mediante monitoreo y registro continuo
durante el tiempo de uso
Inicialmente y diariamente/semanalmente
dependiendo de la frecuencia y número de análisis de
muestras
(a) Inicialmente
(b) Inicialmente, y después de cualquier reparación/
modificación/cambio de ubicación que pueda tener
un efecto en el control de temperatura.
(c) Al menos diariamente / en cada uso o
mediante monitoreo y registro continuo
durante el tiempo de uso
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 Acreditación de Laboratorios Microbiológicos
Tipo de equipamiento
Autoclaves
Centrífugas
Armarios de seguridad
Flujo de aire laminar
gabinetes
Temporizadores
microscopios
medidores de pH
Saldos
Desionizadores y
Unidades de ósmosis inversa
Diluidores gravimétricos
Dispensadores de medios
Pipetas/micropipetas
Chapas en espiral
Contadores de colonias
Centrífugas
anaeróbico
frascos/incubadoras
Entorno de laboratorio
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Guía de Eurachem
Requisito Frecuencia sugerida
(a) Establecer características para (a) Inicialmente, y después de cualquier reparación/
cargas/ciclos. modificación/cambio de ubicación que pueda tener un
efecto en el desempeño
(b) Monitorear la temperatura/tiempo (b) Diario/cada uso o mediante monitoreo y registro
continuo durante el tiempo de uso
Verifique con un tacómetro calibrado e Anualmente
independiente si la velocidad es crítica
(a) Establecer el desempeño (a) Inicialmente, cada año y después de reparación/
modificación/cambio de ubicación que pueda influir
en el rendimiento.
b) Vigilancia microbiológica (b) Semanal
(c) Monitoreo del flujo de aire (d) Diario/cada uso
(a) Establecer el desempeño (a) Inicialmente, y después de la reparación//cambio de
ubicación que pueda afectar las actuaciones
(b) Verificar con placas de esterilidad (b) Semanal
Comprobar si es crítico Anualmente
Comprobar alineación Diariamente o en cada uso
Verifique la calibración con una solución Uso diario/cada uso
tampón no utilizada para la calibración.
Verificar lectura contra verificar peso Uso diario/cada uso
(a) Comprobar la conductividad (a) Semanal
(b) Comprobar si hay (b) Mensual
contaminación microbiana
(a) Verifique el peso del volumen (a) Diario/cada uso
dispensado
(b) Verifique la proporción de dilución (b) Diario/cada uso
Comprobar el volumen dispensado Después de cada ajuste o
reemplazo
Verifique el sesgo y la precisión del volumen Regularmente (que se definirá teniendo en cuenta la
dispensado mediante el método gravimétrico. frecuencia y la naturaleza del uso)
(a) Establecer el rendimiento frente al (a) Inicialmente y anualmente
método convencional.
(b) Verifique el estado del lápiz y los (b) Diario/cada uso
puntos inicial y final
(c) Verifique el volumen dispensado (c) Mensual
Verifique el número contado Anualmente
manualmente
Verifique la velocidad con un tacómetro Anualmente
calibrado e independiente.
Consultar con indicador anaeróbico. Uso diario/cada uso
Supervise la contaminación microbiana transmitida por Semanalmente para recuento total y moldes.
el aire y la superficie utilizando, por ejemplo, Semestralmente para patógenos o según lo decida
muestreadores de aire, placas de sedimentación, placas el laboratorio en función de las actividades y las
de contacto o hisopos. tendencias y resultados históricos.
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Anexo G–Orientación sobre el mantenimiento de equipos.

Esta información se proporciona a modo orientativo y la frecuencia se basará en la necesidad,
tipo y rendimiento previo del equipo.
Tipo de equipamiento Requisito Frecuencia sugerida

incubadoras Limpiar y desinfectar superficies internas. Mensual

Frigoríficos Limpiar y desinfectar superficies internas. Cuando sea necesario (por ejemplo, cada 3 meses)

Congeladores, hornos Limpiar y desinfectar superficies internas. Cuando sea necesario (por ejemplo, anualmente)

Baños de agua Vaciar, limpiar, desinfectar y rellenar Mensualmente, o cada 6 meses si se utiliza
biocida

Centrífugas (un servicio (a) Anualmente

(b) Limpiar y desinfectar (b) Cada uso

Autoclaves (a) Realice comprobaciones visuales de la junta y de (a) Regularmente, según lo recomendado
la cámara de limpieza/drenaje. por el fabricante.

(b) servicio FI (b) Anualmente o según lo recomendado por

el fabricante

(c) Comprobación de seguridad del recipiente a presión. (c) Anualmente

Armarios de seguridad Servicio completo y revisión mecánica. Anualmente o según lo recomendado

Cabinas de flujo laminar por el fabricante.

microscopios Servicio de mantenimiento completo Anualmente

medidores de pH Electrodo limpio Cada uso

Balanzas gravimétricas (a) Limpiar (a) Cada uso

diluyentes
(b) Servicio (b) Anualmente

Fotogramas Limpiar y descalcificar Según sea necesario (por ejemplo, cada 3 meses)

Desionizadores inversos Reemplace el cartucho/membrana Según lo recomendado por el fabricante

unidades de osmosis

Frascos anaeróbicos Limpiar/desinfectar Después de cada uso

Dispensadores de medios, Descontaminar, limpiar y esterilizar según Cada uso

equipo volumétrico, corresponda.
pipetas y en general
equipo de servicio

Chapas en espiral (un servicio (a) Anualmente

(b) Descontaminar, limpiar y esterilizar (b) Cada uso

Laboratorio (a) Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo. (a) Diariamente y durante el uso

(b) Limpiar pisos, desinfectar fregaderos y (b) Semanalmente o con mayor frecuencia si es
palanganas necesario

(c) Limpiar y desinfectar otras superficies (c) Cada 3 a 12 meses dependiendo del tipo
de trabajo de laboratorio

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Bibliografía
Para obtener actualizaciones de la guía a la que se hace referencia y lecturas adicionales, consulte la Lista de lectura de Eurachem en el
sitio web de Eurachem.www.eurachem.org .

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calibración. Organización Internacional de Normalización. 2017. Disponible en: https://
www.iso.org/standard/66912.html .

2. ISO 15189:2022 Laboratorios médicos－Requisitos de calidad y competencia. Organización

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3. Manual: buenas prácticas de laboratorio (BPL): prácticas de calidad para la investigación y el desarrollo no clínico
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4. Buenas prácticas de fabricación (BPF) de la OMS para productos farmacéuticos: principios fundamentales, Anexo 2,
Serie de informes técnicos de la OMS 986. 2014. Disponible gratuitamente en:https://cdn.who.int .

5. Directrices de la OMS para buenas prácticas clínicas (BPC) para ensayos de productos farmacéuticos. Serie de
Informes Técnicos de la OMS, N° 850, Anexo 3. 1995. Disponible gratuitamente en:https://apps.who.int .

6. REGLAMENTO (UE) 2017/625 DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 15 de marzo de 2017.
Unión Europea. 2017. Disponible gratuitamente en:https://eur-lex.europa.eu
7. DIRECTIVA (UE) 2020/2184 DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 16 de diciembre de 2020 sobre
la calidad del agua destinada al consumo humano (refundición) 2020. Disponible gratuitamente en:
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8. Introducción a la consideración de riesgos, libro de cocina nº 18. Eurolab. 2021. Disponible gratuitamente desde.
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9. Directrices de gestión de riesgos ISO 31000:2018. Organización Internacional de Normalización. 2018.

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10. ISO 7218:2007 y AMD 1:2013 Microbiología de alimentos y piensos Requisitos generales y
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Acreditación de Laboratorios Microbiológicos Guía de Eurachem

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