Mutando con genes sintéticos UNA BUENA MANERA DE OBTENER PROTEINAS JORADAS Dr. Edson Cércamo Noriega, Dra, Claudia Martinez Anaya Dr, PaulGaytan Colin as células de todoslos organismos del planeta, grandes y icroscépicos, estén formadas, entre mu- chas otras moléeulas, de proteinas, Ademds de permi- ‘timos la vida, las pro- ‘einas participan en muestras actividades cotidianas mas de lo que creemos, no slo levande a cabo proce- sos bioligicosen nucs- ‘tro cuerpo, ocomo nu- ‘rientes en los alimentos que eonsumimos, sino «que se han aprovechado numerosas protefnas de diferente origen en procesos teenolégicos, por lo ‘que estn presentes en una gran variedad de pro sluctos de uso comtin come pinturas, pegamen- tos, detergentes, telas, papel, medicamentos, ete (Pero, qué son las proteinas? Las proteinas son biomoléculas formadas por cadenas lineales de aminodeidos cuyo arden es muy preciso y esti establecido por Ia informacin codificada en el, ADN de las células. La secuencia de las proted: nas se compone de 20 aminodcidos diferen- tes, por lo que eada posicion en la cadena podria estar prece da o seguida de agin otro se éstos 20,10 que ro inmenso de com: binaciones posibles. Por ejemplo, para una proteina pequefia for- mada por una cadena de 100 aminoscidos, existen més combina- que granos de arena enel mundo. Imagine- mos entonces la variabilidad que es posible en proteinas mas grandes, teniendo en cuenta que el promedio anda en poco mas de 300 aminoac- dos, pudiendo llegar hasta los miles. A pesar de esta casi infinita posibilidad de combinaciones, en la naturaleza existe séla una cantidad relali- vamente pequena de proteinas que eveluona- ron durante millones de afios y se han mante- nido hasta nuestros dias (por seleceisn natural) para realizar funciones especificas. Esto quiere decir que existen muchisimas posibilidades de fa en un mime. Para una pratelna pequelia formada por una cadena de 10Vaminodcidos, existen més combinaciones en secuencia que gran de arena en el mundoFigue |. Ensabaede genes mutadosaparirde ligonudesticsrmuadas, lseiadosysntetizadas en llahortoris Laurin dees ligonudesticsse eaiza medanteuna reac ‘cadena po encima ADN polunerasa — Oligoncedtidos — senes mutados combinaciones que nunca han ocurrido en lana= turaleza, pero que podrian existr si nosotros las ramos en el laboratorio, cambiando alguno O varios delos aminodcidos, en una cierta posi cidn de la secuencia para generar una variante que pudiera tener una funcidn ligeramente dife rente a la original. Esto eepresenta un gran po: tencial en aplicaciones de utilidad para el hom- bre. En otras palabras, sila naturaleza cred una protefna que nosotros hemos estado-usando {por ejemplo en los detergentes para disolver mejor la sgrasa al lavar la ropa), pero que no resist altas femperaturas (porque se desnaturaliza y deja de ser funcional), en el aboratorio nosotros podria ‘mos tomar el gen de esa protesna y cambiar algu nos pocos aminodcides y erear una wariante que haga lo mismo, pero que ahora resistaalealor. A este tipo de manipulaciones eles llama ingenie- ria de proteinas. El objetivo de la ingenieria de proteinases crear nuevas variantes de proteinas con aplica- ciones en la biologia o a industria. Esto se logra modificando la secuencia de los aminodcidos de las proteinas existentes para cambiar o mejorar su funci6n, no directamente en la proteina, sino cen su gen «como se explicé antes-. Al proceso de modificacién de la sectencia de tin gen se le co~ noce como mutagénesis, y puede sor expecifica {enalguna posicicn que hayamos decidido, basa~ dos en informacién previa) o aleatoria (que ocu- re al azar en distintas posiciones de la secuen cia). Debido a que no conocemos la funcién de cada aminodcido en las proteinas, la mutagéne- sis con esta estrategia ha sido mésexitosa debidoa que provoca cambios aleatorios alo largo de la cadena, resultando en una mayor probabilidad de éxito para crear proteinas con funciones de utilidad practica Existen distintos métodos con los que el gen de una proteina puede mutagenizarse aleatoria- mente, lama cambios en el ADN al momento de ser eopiade por una enzima (la amada ADN polimerasa), que ©5 propensa a equivocame. No obstante, estos métodos presentan una tendencia en los cambios realizados, es decir, ciertos cambios ‘curren mas frecuentemente que otros. Una ten- dencia en la mutagenesis se refieja en favorecer la presencia de algunas de las proteinas obteni- das, provocando la pérdida de variantes poten Gialmente exitosas. Recientemente, en nuestro laboratoria desarro- Hamosun método quimico de mutagenesis aleato~ ria sin tendencia, basado. en la sintesis de peque- fias cadenas de ADN llamadas oligonuclestidos, De manera convencional, estos compuestos son fabrieados en equipos especializados que unen idos A, C, Gy T (que en el equipo se encuentran separados y pu ros} en la secuencia deseada (por ejemplo: AT GCATCACCAT). Sin embargo, en el métado de mutagénesis que nosotras creams, cada uno de Jos nuclestides purosesreemplazado con.un nu Cle6tido "contaminado” con los otros tres, dando como resultado cierta probabitidad de cambio en cada posiciGn respecto a la secuencia origi nal. Debido a que la reactividad quimica de los cuatronuclestidos es similar, la probabilidad de que se ineorporen a la seeuencia depende direc tamente de la proporcién de "contamninacisn’, es decir que la probabilidad de incorporacién de cada uno de los cuatro nucledtidos es directa- mente proporcional a su porcentaje en la mezela de reaccidn. Por ejemplo, si para incorporar una T (lamina) ala secuencia se utiliza una mezcla de oria basadosen la introduecién de cada uno de los cuatro nucles T (97%), MAF)-C(1%) yG (16%), se generard una probabilidad de mutagénesis del 3% (ya que del {otal -100- hay 3% de los “contaminates” A, Cy G), Esto permite modular el grado de mutagé- nesis a criterio, simplemente cambiando la pro- porcién de losnuclestidos enel tubo de reaecién. Una ver generados los ol dos, éstos son ensamblados enzimsticamente paradarlugarauna variedad de genes mutados, © “salpicados” con mutaciones, y por ello elmé- todo se denomina “Spiked Genes” (Figura 1), Una vez que se implementa un técnica o mé- todo nuevo, hay que determinar qué tan efec- tivo resulta, por la que para validar el nuestro escogimos el gen de una proteina modelo. Asi, generamos cambios en la secuencia del gen dela proteina roja fluorescente llamada mKate, muy Uitilen Biologfa Molecular porgue -comosu nom- bre lo indica- es una proteina que fluoresce de color rojo euando su secuencia es la natural. Las proteinas codificadas por los genes mutados en a sintesis quimiea que nosolzos Hevamos a cabo, dieron como resultado variantes verdes, amari las y anaranjadas (debido a los cambios estruc- turales y sus interacciones producides en la pro- teina nueva), diferentesa la proteina roja original (Figura 2). Cuando analizamos las secuencias resultantes dela mutagénesis responsable de las diferentes colares, observamos homogeneidad en los cambios introducidos, asi como una tasa de mutagenesis similar a la predicha, lo que de- mostré la ausencia de una tendencia favorecida, en los cambios puntuales de nucledtidos Las resultados denuestratrabajoson-una apor- tacidn al campo de la ingenieria de proteinas que permitiré el mejoramiento de otras proteinas de tanto en los laboratorios de investigacién, como a nivel industrial onuclestides muta- Comacte: edsoncargibtunam mx Figura? Vanantes de dstitas lores delaprotenaemtate generaas pore métadade genessintétcosmatados. A) fapresiinde bsvarantesen bacteria eo 8) Dferencas enlascolores demostradasper métodesfotométnos Les resultados de nuestio ‘trabajo son una aportaciin al campo de la ingenieria 4e peoteinas que permitirs el mejoramiento de otras proteinas de interés, tanto en los laboratorios de investigacién como a nivel industria Ese tratajofuronginalmente publiade enelsiguiene articuh centr: (Greamae,,Rldin-Salgada A, Osuna J allo San Martin 1 Vater) A, Saab-Rncin Wadi, Gaytan. (2077) Spd Ganesh Method latrodue RandomPoiat NdeotideNutationsEveay thoughout an Entire Gene Using ample Set of Spiced lgonucleotdesfor the Assembly, ACS deg, 2 318317,