VALIDACIÓN DE TÉCNICAS ANALÍTICAS

INTRODUCCIÓN

DESARROLLO

Las variaciones en un método analítico dependen de varios factores; uno de ellos es el material que
va a ser analizado, también los materiales incluyendo los reactivos usados en el análisis, materiales de
calibración, factores ambientales, el personal (analista) y por último el instrumento (aparato) para
realizar la medición. Esto trae asociado un conjunto de errores (lee la diapositiva).
Errores de operación: son errores de naturaleza humana y están presentes en cada una de las etapas
que incluye la metodología a realizar.

Para tratar de minimizar estos errores se implementa un protocolo de validación del método que se
esté empleando para realizar la determinación.

LINEALIDAD

El proceso de validación de un método analítico cuenta de 6 parámetros fundamentales,

considerando el tipo de estudio que se esté realizando, lo que se quiera determinar en el laboratorio
e incluyendo también la metodología que vayamos a emplear. (Lee los 6 parámetros)

Estos parámetros se deben determinar en la mayoría de los casos uno por uno, hay casos muy
particulares en lo que no se exige que el método cumpla con los criterios estadísticos y valores de
aceptabilidad de cada parámetro. Todo va a depender de lo que se pretenda analizar y con el fin
que se pretenda desarrollar el protocolo de análisis dentro del laboratorio.

Ejemplo: Imagínense en un laboratorio, donde necesitan determinar una concentración de fármaco

en una muestra de un lote de producción de ácido acetilsalicílico. Nos piden validar una nueva
técnica, suponiendo que establecemos una técnica de HPLC y la vamos a implementar por primera
vez para ver si esta cromatografía es capaz de determinar las concentraciones establecidas dentro
de la formulación del ácido acetilsalicílico como medicamento. Teniendo en cuenta los posibles
errores, que tipo de muestra estamos analizando, los posibles factores que pudieran considerarse
como interferencia en el método. Para validar este método debemos demostrar en primer lugar la
linealidad.

Entonces se desarrolló el procedimiento, pero este al ser nuevo y querer introducirlo como nuevo
dentro de la farmacopea para la determinación de ácido acetilsalicílico en una tableta se debe
demostrar de primer momento la linealidad

Linealidad se entiende como la capacidad que tiene el método (en este caso la cromatografía de
alta resolución) para obtener resultados linealmente proporcionales a la concentración de analito en
la muestra dentro de un intervalo determinado (por ejemplo si se quiere analizar de 1 mg a 500 mg)

Fases para desarrollar el ensayo:

 a) Debemos cerciorarnos de que el intervalo lineal dinámico del sistema instrumental sea más
amplio que el intervalo de concentraciones a estudiar. (recordar primera clase cuando se vio
los intervalos de concentración de los métodos como el de la cromatografía gaseosa, HPLC,
etc.)
b) Preparar una serie de patrones de analito de concentraciones crecientes (lo más usual es
procesar tres curvas de calibración, se necesitarían 6 concentraciones y los márgenes de van
a depender del analista y de lo que se pretenda determinar)

DI APO

RECORDAR: que se está

analizando un producto
terminado y no una materia prima,
si se tratara de una materia prima
a la hora de llevar a cabo la
validación los requisitos son los
mismos pero el procedimiento es el
distinto)

Reglas para seleccionar el

intervalo de concentración:

o Materia prima: intervalo del 80-120% de la concentración teórica

o Principio activo en un producto acabado: intervalo de 50-150% de la teórica
o Impurezas y fluidos biológicos: 10-200% de la concentración promedio de analito en fluido
biológico
c) Efectuar el análisis siguiendo exactamente el procedimiento descrito (farmacopea, artículo
científico, sistema de referencias con confiabilidad). Cada análisis debe realizarse como
mínimo por duplicado.
d) Determinar la curva de calibración que relacione la respuesta con la concentración.

La recta de calibración es del tipo: Y= mx + b siendo X la concentración, Y la respuesta, M el valor de

la pendiente y B el termino independiente (Generalmente se halla la recta de regresión por el ajuste
de los mínimos cuadrados)

e) Tratamiento estadístico de los datos analíticos.

… FASES PARA DESARROLLAR EL ENSAYO

…Acá lo que
quiere decir es
que las variables
respuestas
(cromatografía)
pueden ser la
altura de pico o el
área bajo la curva
de esos peaks,
esto se relaciona
directamente con
la concentración
del analito a
determinar, entonces a partir de la construcción de la curva de calibración que correlaciona esta
variable respuesta con las concentraciones conocidas de las soluciones preparadas se establece la
curva y además se determina la pendiente de la recta empleando la ecuación comúnmente
conocida como Y=mx+b, siendo x la concentración, Y la respuesta (en este caso podría haber sido
altura de pico o área bajo la cueva), m el valor de la pendiente y b el termino independiente,
generalmente se halla la recta de regresión por el método de mínimos cuadrados parciales, cabe
mencionar que este es uno de los métodos más empleados para establecer o para determinar la
pendiente de la recta de los parámetros estadísticos de regresión como es el caso de R2 (se verá más
adelante), entonces se emplea comúnmente la regresión por mínimo cuadrados parciales. Por último,
a los valores obtenidos se les realiza un tratamiento estadístico para conocer si son estadísticamente
significativos.

CRITERIOS ESTADISTICOS PARA EV ALUAR LA LINEALI DAD

Para evaluar la
linealidad tenemos
como criterio
principal el
coeficiente de
correlación lineal, el
cual no debe ser
menos o igual a 0,99,
esta variable refleja
el grado de relación
entre la variable X e
Y, si este coeficiente es cercano a la unidad o sea a 1 significa que existe correlación con una
probabilidad elevada. También se le debe realizar un test de linealidad ya que existen varios puntos
o procedimientos para verificar la linealidad de un método, en esta clase se presentaran cuales son
los que se tienen en cuenta con mayor importancia a la hora de establecer los test de linealidad, un
ejemplo de estos es el coeficiente de variación de los factores respuesta, este coeficiente de
variación de manera general no debe superar el 5%, o sea este factor de respuesta es la relación
entre la lectura y la concentración, o sea la lectura no puede variar mas de un 5% del valor de la
concentración este es un criterio que hay que tener en cuenta, todo esto es a partir de la construcción
de la curva de calibración. Otro de los criterios estadístico lo constituye la desviación estándar relativa
a la pendiente etiquetada como Sb, este criterio es relativo al % de la determinación del equipo y
debe ser menor al 2%, la pendiente m en este caso también se llama coeficiente de regresión esto se
significa que a mayor pendiente mayor será la sensibilidad por lo que su varianza y desviación
estándar se pueden utilizar para expresar la linealidad se puede emplear como criterio estadístico
para validar el criterio de linealidad.

Los límites de confianza de los términos independientes se calculas a partir de la expresión de (b± tsb)
t es el valor de la distribución de student en una tabla de n-2 grados de libertad, entonces a partir de
esta relación se pueden establecer los limites de confianza y de *no se le entiende *, en el caso de
*tampoco se le entiende* que es otro de los parámetros que se deben desarrollar para validar los
parámetros seleccionados…

PRECISIÓN

Podemos definir
la precisión
como el grado
de
concordancia
entre los valores
de una seria
repetida de un ensayo analítico efectuado sobre una muestra homogénea o expresado de otra
forma: se define como la distribución de los valores analíticos alrededor de su media.

En temas estadísticos, se puede decir que mientras más varía un término en respecto a la media
quiere decir que el método es menos preciso.

El término de precisión se puede considerar finalmente como la estimación de la variabilidad de las

mediciones, que a su vez expresa la capacidad del método analítico para dar un resultado
semejante cuando se aplica repetidamente a una muestra.

Procedimiento: El procedimiento que emplea para determinar el parámetro de precisión físicos o

químicos dentro de un proceso de validación son los siguientes:

 Repetibilidad: Es la medida de la precisión de un método efectuado en las mismas condiciones

sobre la misma muestra por un mismo analista en el mismo laboratorio con los mismos aparatos
y reactivos y en el curso de una misma serie de análisis efectuados en un corto periodo de
tiempo. O sea generalmente debe ocurrir todo el mismo día.
Esto está relacionado con lo mencionado a la hora de disminuir los posibles errores. Por eso el
factor de precisión a la hora de validar un método analítico tiene en cuenta la repetibilidad
para disminuir el error asociado a lo mencionado, sea el analista, condiciones, equipamiento
etc.
 El procedimiento
a su vez cuenta de 3 etapas, en una primera etapa se utilizarán dos o más concentraciones de una
muestra homogénea las cuales serán analizadas 6 veces como mínimo en una misma corrida, lo que
le mencionaba anteriormente, preparan 6 diluciones o de dos concentraciones conocidas de la
muestra que se va a analizar y se le hace la medición como mínimo 6 veces.

En un segundo paso se preparan muestras de 3 concentraciones diferentes, una concentración

inferior, otra media y una superior del intervalo especificado (descrito en el protocolo) y además se
realizan 3 replicas de cada uno.

Finalmente, como tercera etapa pudiéramos realizar un mínimo de 6 determinaciones a la

concentración del 100%, o sea, tu tienes los 150mg que la tableta que les mencionaba y le hacemos
6 determinaciones a la muestra, considerando que debe existir el 100% de lo descrito.

Estos son los tres procedimientos que se deben llevar a cabo para demostrar el parámetro de
precisión.

También existen dentro de los procedimientos lo que se llama “precisión intermedia” donde podemos
decir que la precisión intermedia es la media de la precisión de los resultados de un método analítico
efectuado sobre la misma muestra pero en condiciones diferentes.

- …Con esto estamos validando que además de que lo desarrolle una misma persona si
cambiamos cualquier otro parámetro el método seguirá siendo preciso, los errores comunes
son mínimos.
- Para determinar la precisión intermedia del método se lleva a cabo implementando un diseño
donde se evalúan 3 concentraciones de una muestra, este proceso se analiza por duplicado
por lo menos por 2 analistas diferentes durante 3 días diferentes (las medidas de la precisión de
los resultados deben ser en condiciones diferentes).

REPRODUCIBILIDAD:

- Se debe implementar de forma intercalada o Inter laboratorio como se conoce comúnmente,

se emplea un protocolo y se le pide a entre 3 y 5 laboratorios que lo desarrollen, después se
evalúan de 3 a 5 muestras en un esquema de 2 a 4 concentraciones por muestras (por
duplicado), se involucraran diferentes analistas e instrumentos por lo que el criterio será más
amplio real y confiable si los analistas obtienen resultados similares. Las muestras se analizarán
en 6 ensayos independientes como mínimo.

CRITERIOS ESTADISTICOS PARA EV ALUAR LA PRESI CION

- El criterio estadístico clave para determinar la precisión del método es el coeficiente de

variación. Este valor se considerará aceptable dependiendo de la concentración del analito,
numero de replicas y hasta el objetivo del análisis, referido este último aspecto a la complejidad
de la muestra que se analiza.
 - Si empleamos un método cromatográfico, el coeficiente de variación (cv) debe ser ≤2% y si
empleamos un método espectrofotométrico debe ser ≤3%, estos son los valores que mas se
registran en publicaciones recientes para evaluar la repetibilidad y la reproducibilidad.
- En el proceso de repetibilidad el coeficiente de variación debe ser ≤1,5%.
- En el proceso de reproducibilidad el CV debe ser de ≤3%

EXACTITUD

Otro parámetro a considerar y que es de vital

importancia de evaluación lo constituye la
exactitud, la exactitud podemos definirla como
el parámetro que indica la capacidad del
método analítico para dar resultados lo más
próximos posibles al valor verdadero. Mientras
el método me pueda dar a mis valores
cercanos al verdadero, más que exacto.

El procedimiento, ubicándonos de nuevo en el

laboratorio, estamos analizando la tableta de ácido acetil salicílico, ya determinamos los parámetros
de linealidades, de precisión y queremos determinar la exactitud, para ello existen varios
procedimientos.

El primer procedimiento se lleva a cabo mediante un análisis repetitivo de una muestra de

concentración única conocida, de esa misma muestra de ácido acetilsalicílico, tomamos una y
desarrollamos las mediciones conociendo la concentración que estamos determinando.
Principalmente se utiliza un placebo, el placebo es lo mismo desde el punto de vista conceptual como
se escucha por ahí efecto placebo, o algo así, en el caso de análisis instrumental el placebo es los
componentes que forman la tableta sin la presencia del ingrediente farmacéutico activo. Esto nos
permite evaluar, es un proceso muy similar al que se sigue cuando el estudio o el objeto de estudio es
determinar la interferencia o posibles impurezas dentro del análisis de un producto terminado, en
estudios de estabilidad también se emplea este tipo de determinación usando siempre un placebo,
para ello se le añade una concentración conocida del analito patrón, siguiendo el procedimiento,
se analiza entre 6 a 10 veces lo mínimo, y se anotan los valores.

En una segunda opción es mediante el análisis repetitivo de varias muestras de concentraciones

diferentes conocidas, cuando digo concentraciones diferente es una de 10 mg, otra de 200mg, otra
de 300mg y así sucesivamente, pero siempre conocida, conozco lo que existe dentro de la muestra
que estoy analizando o la concentración del ingrediente farmacéutico activo en este caso el analito
que queremos determinar. Este diseño se puede considerar como un diseño habitual que se utiliza
comúnmente en el laboratorio y emplean 3 concentraciones como le mencione anteriormente, estas
concentraciones son una alta, media y baja, que debe ser conocida por el analista farmacéutico,
estas concentraciones deben estar dentro del rango de linealidad, el parámetro de exactitud esta
muy relacionado con la linealidad y una manera de sentido común si entendimos la parte de
linealidad, y recuerdan cuando le mencione que entre más correlación existe entre la variable
respuesta que da el equipo y la concentración que estamos determinando, por ende va a existir
mayor exactitud a la hora de que el método determinar la concentración que contiene la muestra a
analizar, para ello también utilizamos un tercer método que se llama comúnmente como el método
de adición de un patrón, un patrón es una sustancia que se conoce la concentración que tiene y
entonces se emplea en estos métodos cuando no se dispone de un placebo

1. Método de adición del patrón.

Este método se utiliza cuando no se dispone de un placebo o de una muestra de
concentración conocida. Para ello se procesan dos muestras en paralelo a una de las cuales
se le adiciona una cantidad conocida de analito, este constituirá el valor verdadero. La
diferencia de resultado de “muestra-patrón” menos” muestra” se compara con el valor
añadido.

“Un patrón es una sustancia que se conoce la concentración que tiene, este método se
emplea cuando no se dispone de un placebo o una muestra de concentración conocida. Esto
se emplea comúnmente cuando estamos analizando la calidad de materias primas, es decir
a los estudios empleados para analizar medicamentos o a las distintas opciones que tenemos
a la hora de proceder (?) en un laboratorio de análisis de medicamentos. Recuerden que
podemos analizar materias primas, productos terminados en laboratorios como de toxicología,
laboratorios de bioquímica clínica o laboratorios de química forense en caso de las
determinaciones de cualquier componente que puede provocar la pérdida de la vida de la
persona como por ejemplo veneno.”

“La adición de un patrón en el caso de una materia prima se procesan 2 muestras o deben
procesarse 2 muestras en paralelo, a una de las cuales se le adiciona una cantidad conocida
del analito, el cual constituirá el valor verdadero. Recuerden que tenemos el analito en una
muestra de materia prima y añadimos el patrón del cual se conoce su concentración, y la
diferencia de resultado después de realizar la determinación de la muestra y el patrón menos
la muestra del analito, estos valores permiten establecer la comparación del valor añadido, es
decir la diferencia va a ser la concentración conocida de lo que queremos determinar.”

2. Comparación con otro método validado:

Podrá implementarse a concentración única o en un intervalo de 2 a 4 concentraciones
diferentes. En cualquier caso, se analizarán las muestras 6 veces como mínimo y se
implementarán pruebas de significación apropiadas.
“También se emplea como patrón de comparación, como por ejemplo si la determinación por
cromatografía me da valores más exactos que la determinación por espectrofotometría,
finalmente me dice que tengo que emplear a futuro para este tipo de determinación la
cromatografía y no la espectrofotometría, pero en el proceso de determinación ya está el
parámetro de exactitud, el cual se puede utilizar como referencia teniendo en cuenta siempre
que no me puede dar peor que un método que ya está implementado, sino se está perdiendo
el tiempo. En cualquiera de los casos se analizarán las muestras 6 veces como mínimo y se
implementarán pruebas significativas apropiadas.”

- Criterios estadísticos para evaluar la exactitud:

Se expresa matemáticamente en forma de porcentaje de recuperación de la cantidad de analito
presente en la muestra o bien en forma de diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero.
Estadísticamente suele efectuarse un test de t student para determinar si el valor hallado y el valor
 considerado verdadero no difieren significativamente para un grado de probabilidad
determinado.
“Para ello empleamos comúnmente en la literatura la determinación del parámetro de X”
“Que es el porcentaje de recobrado. El criterio digamos que marca la exactitud del método o de
lo que estamos determinando, el cual oscila entre el 97% y 103% del valor de la muestra que
estamos determinando.”

ROBUSTEZ

Definición

Capacidad del procedimiento de producir resultados analíticos con exactitud y precisión aceptables
bajo variadas condiciones. Término permisible: Fortaleza.

“Está estrechamente relacionado con algunos de los parámetros a considerar y nos indica si el
método es robusto, es decir el método que estemos validando se mantiene estable frente a pequeñas
perturbaciones.”

“Si yo cambio las condiciones como por ejemplo el laboratorio, el porcentaje de pureza (?), el equipo
que vaya a emplear y cuanto factor pueda cambiar o modificar, pero que finalmente me permita
llevar a cabo el proceso (se escucha entrecortado).

Procedimiento: en este estudio se evaluarán variaciones razonables deliberadamente efectuadas

con el propósito de identificar factores que originen fluctuaciones menores y variaciones significativas
en el método de ensayo. Podrá realizarse durante o previo a la validación. Dentro de las variables a
considerar en un estudio de robustez, se evaluarán:

 Cambios de temperatura y o humedad del local o equipo de incubación.

 Tiempo de incubación, en el pH del reactivo o solución o en la composición de esta.
 Velocidad de flujo en la cromatografía.

El análisis busca siempre precisión en las mediciones que se realizan, gracias a esto podemos confiar
en el valor que nos arroja un ensayo y pensar que es muy cercano a un valor real.

Criterios para evaluar la robustez:

Para conocer la influencia de los factores seleccionados sobre el sistema de ensayo, se determinarán
la exactitud y la precisión de cada condición con el objetivo de estimar el grado de tolerancia de
ellos en las condiciones normales de ensayo.

LÍ MITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFI CACIÓN:

Estos parámetros se relacionan con la cantidad de analito requerida para dar un resultado
significativo, cualitativo (presencia o no del analito en muestra) o cuantitativo (métodos volumétricos
o métodos instrumentales (espectrofotometría, cromatografía liquida, espectrometría de masas,
etc)).

El límite de detección es la menor concentración de analito detectable con razonable certeza por un
procedimiento analítico dado, en pocas palabras es la menor cantidad de analito que se necesita
para poder detectarlo.
El límite de cuantificación es la menor concentración CL o cantidad QL de analito de una muestra
que puede ser determinada con aceptable precisión y exactitud bajo las condiciones experimentales
establecidas.

Procedimientos:

En todos los casos se calculan los límites de detección (LD) como la concentración de analito que
produce una señal igual a que produce una señal igual a tres veces las desviaciones estándar del
blanco. El criterio a considerar, es que, el valor a determinar no debe sobrepasar las más o menos 3
desviaciones estándar, siguiendo el protocolo establecido por la IUPAC y para el límite de
cuantificación (LC), este parámetro se toma como la concentración del analítico que produce una
señal igual a diez veces la desviación estándar del blanco bajo las condiciones experimentales
óptimas.

El límite de detección (LD) o el límite de cuantificación (LC) pueden ser expresado como:

Esta expresión que relación la constante para el límite de detección y la constante para el límite de
cuantificación, en el caso de la constante para el límite de detección el valor es K=3,3 y en el caso
para el límite de cuantificación el valor es K=10. Evaluándolo en la ecuación que se muestra, si
evaluamos 3,3 estaríamos determinando el límite de detección y si evaluamos 10 en este parámetro,
estaríamos determinando el límite de cuantificación.

Los demás parámetros por ejemplo el parámetro Sbl, se considera como la desviación estándar de la
respuesta de los N blancos, mientras que b, como la pendiente de la recta de calibración construida
previamente en el caso de la linealidad. Cl es el parámetro que queremos determinar puede ser el
límite de cuantificación o límite de detección.
CONTINUACIÓN CLASE…
DI APOSITIVA 20

El último parámetro de los 6 mencionados es el

de especificidad.
La especificidad se puede definir como la
selectividad a la capacidad de un método
analítico para medir de forma exacta y
específica el analito, sin interferencia de las
posibles impurezas, productos de
degradación, compuestos relacionados o
excipientes dentro de una formulación.
Cualquiera de los componentes que estén en
la matriz que puedan establecer interferencia,
van a afectar directamente el parámetro de especificidad durante la validación del método que se
quiera implementar.

El procedimiento general que se sigue a la hora de establecer la especificidad de un método analítico

se determina principalmente comparando los resultados del análisis de muestras que contienen las
impurezas.

La muestra con lo que posiblemente pudiera constituir una impureza, también pueden incluirse los
productos de degradación (altas temperaturas, condiciones extremas como la luz), sustancias
relacionadas o excipientes (en el caso de la tableta puede ser el talco, los preservantes si contara
con ellos) con los resultados del análisis de muestras que no contienen dichas sustancias. El diseño de
los estudios de especificidad dependerá de las características del método, del uso propuesto y del
tipo de muestra que se vaya a analizar. Ejemplos:

o Método de identificación: si se desea llevar a cabo un método para la identificación de un

ingrediente farmacéutico activo, se debe demostrar que el método funciona en presencia de
otras sustancias que pueden intervenir y de las de composición similar.

PROCEDIMIENTO

Cuantitativamente en un componente en estudios de control de calidad se debe asegurar que la

señal medida con el método analítico procede únicamente de la sustancia de interés sin
interferencias de los excipientes, producto de degradación y/o impurezas, en ensayos
biofarmacéuticos debe asegurar que la respuesta del método que se está validado corresponda
solamente al analito sin la interferencia del metabolito o sustancias endógenas, dentro de los
fármacos, estos son los criterios fundamentales a tener en cuenta en el parámetro de exactitud.

EJEMPLO

Aquí nos
encontramos con
una situación
problema en la
que queremos
determinar la
cantidad de
flavonoides
presentes en un
extracto de
plantas, para ellos
se cuenta con un patrón que es la Quercetina. El procedimiento general (en el ámbito del laboratorio)
incluye la preparación del patrón y la muestra problema, *LEE TEXTUAL EL PROBLEMA*.

Todo este procedimiento se realiza para dejar la solución patrón lista para poder ser determinada en
la instrumentación y además con las posibles concentraciones con las que se pretende construir la
curva de calibración, para ello procedemos a los intervalos de concentración incluidos entre 1,5 de
mg/L a 7,5mg/L

En el caso de la muestra problema, la cual es un concentrado de flavonoides obtenidos a través de

varias extracciones con acetato de etilo en la planta. Si se dan cuenta el acetato de etilo es el mismo
solvente que empleamos para la preparación de la solución patrón. Entonces todas estas son
asociaciones que se pueden hacer de manera preliminar y que ayudan a reconocer que estamos
siguiendo un protocolo que es estándar y nos estamos enfocando en la determinación del contenido
flavonoide partiendo de la concentración conocida de la sustancia patrón.

DETERMINACION DE LIN EALIDAD

Entonces ¿Cómo procedemos después de haber preparado la muestra patrón y la muestra

problema?

En un laboratorio se le da seguimiento a los pasos a realizar:

En un primer paso (tabla) refleja los datos incluidos en la determinación del parámetro de linealidad,
o sea ¿Cómo se lleva a cabo un procedimiento para demostrar que el método es lineal? Para ello
como les mencionaba anteriormente preparáramos 5 muestras que contienen las concentraciones
entre 1.5mg/L y 7.5mg/L y los rangos intermedios (3, 4.5 y 6) son establecidos a comodidad.
Realizamos una medición para cada una de las muestras por triplicado, o sea a la primera
concentración le hacemos 3 medidas, y con ellas construimos 3 curvas de calibración y además se
le determinan los parámetros estadísticos como:

 Coeficiente de correlación múltiple

 Coeficiente de correlación de la regresión ajustada (R2 )
 Coeficiente de variación de la formulación (C.V.F en %)
  Desviación estándar relativa (Sbrel en %)
 …Y la desviación estándar relativa, a partir de la curva de calibración podemos extraer la
ecuación de la recta y establecer criterios mas indicativos del procedimiento, que permiten
intuir si la metodología es lineal o no.
 Entre los parámetros tenemos:
 El R2 de 0,99 el cual esta cercano a 1 por lo que podemos decir que existe una correlación
lineal entre los valores medidos y la respuesta que nos da el equipo.
 Tenemos un coeficiente de variación menor al 5% (recordar que el valor máximo era 5%).
 En el caso de la desviación estándar de la pendiente el valor fue menor a 2%. Basado en estos
datos podemos decir que en el intento de demostrar la linealidad del método seleccionado
los parámetros de linealidad calculados para los datos cumplen con los criterios de aceptación
establecidos y por ende demuestran que la técnica es lineal en el rango de concentraciones
estudiados. Si se busca estudiar la linealidad de la técnica con nuevas concentraciones se
debe repetir todo el procedimiento.
 Otro factor determinante en los procesos de validación es la precisión.

PRECISIÓN

 A partir de los datos obtenidos y de las

concentraciones conocidas calculamos los
porcentajes y de igual forma los parametros
estadisticos como la media, la desviacion
estandar y el coeficiente de variacion, para
ellos utilizamos las metodologia de
repetibilidad y precision intermedia.

 La metodología para determinar la precisión, recuerden que existía la repetibilidad y la

precisión intermedia, entonces la repetibilidad se basa en realizar mediciones repetidas y
determinar la concentración en porciento y sobre esta base calcular los parámetros
estadísticos, la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación, y en el
procedimiento de precisión interna es cuando teníamos en cuenta las mediciones en días
distintos, (la repetibilidad es en un mismo día como requisito, por una misma persona, con las
mismas condiciones de laboratorio), en el caso de la precisión interna se debe intentar de
variar esos requisitos, en este caso se realizó en dos días distinto y se realizaron las mediciones,
en este caso 5 y en el segundo día 5 mediciones, para cada día se calculó la desviación
estándar, la media, el coeficiente de variación y el parámetro de Horwitz, que es uno de los
parámetros que esta descrito en la literatura y que les sugiero que después lo revisen, se los
oriento de tarea independiente, es un parámetro que ha quedado en desuso pero si alguien
tiene una duda sobre cómo se procede pudiera buscarlos en la biografía que deje.
 Entre los grupos debemos determinar la desviación estándar y esta a su vez debe ser igual o
menor a 0,004 % o fue en este caso igual a 0,004%, el coeficiente de variación de igual forma
fue 0,47%, y los parámetros de Cochrans calculado y critico fueron igual a 0,45 y 0,59, estos
 parámetros no se los mencione en la clase anterior porque tampoco son parámetros que se
exijan para todos los métodos, en este caso les estoy
mostrando un ejemplo donde era requerido, de
igual forma estos parámetros no deben superar el
1%, entonces si analizamos en profundidad los
parámetros obtenidos a partir del factor de precisión
a la hora de validar el método podemos decir que
también cumplen con los parámetros establecidos,
por lo que el método es preciso a la hora de
determinar la cantidad de flavonoides presentes en
la muestra extracto de planta.

“En cuanto al parámetro de

exactitud recuerden que se toman
por triplicado, es decir se toman tres
concentraciones o intervalos y se les
hacen mediciones a cada una de
esas concentraciones por triplicado
determinándose la respuesta del
patrón, ósea cuando se añade el
patrón se miden las respuestas de
este. La segunda columna indica la
respuesta del patrón añadido solo, ósea la determinación del Yp para el patrón, la Yp para este caso
constituye la medición del equipo. En la tercera columna se indica la respuesta del patrón añadido
en la muestra. Luego está la respuesta del patrón recuperado que recuerden que es la muestra menos
patrón eso entre paréntesis menos la muestra y además la recuperación, a todo esto, se le calcula la
media en este caso al parámetro de recuperación y obtenemos una media de 98.9%. Como ven este
parámetro es prácticamente el 99% con lo cual podemos decir que le método es exacto, es decir
mide de manera exacta o puede ser empleado para medir de manera exacta las concentraciones
de flavonoides presentes en la muestra problema.”

 Curva de recuperación para la técnica espectrofotométrica.

 “A partir de estos parámetros podemos construir utilizando una instrumentación analítica una
curva de recuperación. Esta curva mediante una técnica como la espectrofotometría nos
permite determinar una correlación entre la concentración recuperada del patrón Quercetina
y la concentración añadida, esto nos permite calcular a partir de esta recta, la pendiente de
esta recta y también el coeficiente de regresión que en este caso es 0.99 muy cercano a 1.
Hasta aquí podemos decir que nuestro método es válido, pero si vemos de los 6 parámetros la
más determinamos 3

EJEMPLO DE VALIDACIÓ N DE UNA TÉCNICA ANALÍTICA.

Pregunta:

¿Es necesario comprobar todos los parámetros cuando validamos una técnica analítica?

R: No ya que esta selección de parámetros depende de la finalidad del análisis. Según su propósito
de los métodos de ensayo se clasificarán en 3 grupos
  Ensayos de identidad
 determinación de impurezas
 Contenido y actividad biológica o potencia

PARÁMETROS TÍPICOS DE VALIDACIÓN SEGÚN EL TIPO DE ANÁLI SIS Q UE SE REALI CE:

Por ejemplo si estamos analizando la identidad de una sustancia y a la vez proponemos un ensayo
analítico o una metodología, los parámetros que exigen serían los que presentan el signo (+)
(demostración obligatoria) y el signo (-) nos indica que no existe una necesidad de demostración.

Entonces en el caso de ensayos de identificación, los parámetros dentro de un proceso de validación

de la metodología desarrollada o llevada a cabo son: la Robustez, la especificidad y los límites de
detección, esos son los parámetros más empleados, o que por obligación deben emplear. Los demás
pueden ser alternativos o simplemente no son obligados, entonces si estuviéramos intentado
determinar el contenido o potencia de una sustancia, en ese caso yo diría que todos son de carácter
obligatorio (Columna de la tabla de contenido o potencia) y en el caso de pruebas de impurezas
donde querremos cuantificar la cantidad de un componente en una muestra o queremos establecer
en límite de detección, ósea los límites con los que se cuenta, algunos ensayos son de carácter
obligatorio y otros que no.

Estas tablas son muy importantes tenerlas en cuenta por que en dependía del objetivo que persiguen
con su estudio y a la vez quieren validar la metodología que estén llevando a cabo, van a tenerla
como un material de consulta, es como una de las tablas de cabecera de una analista farmacéutica
o de un analista químico.