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TEMA 9. TCNICAS DE PCR Y RT-PCR Y SUS DISTINTOS USOS INTRODUCCIN PROCESO DE HIBRIDACIN Formacin y separacin de la doble hebra de ADN Medio de hibridacin DISEO DE LOS MTODOS DE HIBRIDACIN Preparacin de las sondas: produccin y marcaje Produccin de sondas Tipos de marcaje Inmovilizacin de la muestra Hibridacin y lavados Cuantificacin REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA: PCR Fundamento de la PCR Diseo de las tcnicas de PCR Medio de reaccin Etapas de la PCR Visualizaci6n los productos RT-PCR qPCR O PCR CUATITATIVA APLICACIONES DE LA PCR

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INTRODUCCIN Los cidos nucleicos difieren entre s, principalmente, en la secuencia de nucletidos, por lo que se han desarrollado tcnicas capaces de determinar dicha secuencia o parte de ella. El principio de estas tcnicas se fundamenta en el proceso de formacin de la doble hlice del ADN, ya que las dos hebras de ADN se unen por el establecimiento de puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas (ver captulo 20). La complementariedad de bases entre dos secuencias de ADN permite que se forme la doble hlice (Figura 21.1). Si se consigue sintetizar en el laboratorio un fragmento de ADN con una secuencia de bases complementaria a un segmento determinado de un cido nucleico, puede utilizarse este fragmento (conocido con el nombre de sonda) para realizar un reconocimiento especfico del ADN que quiere estudiarse. Este proceso de reconocimiento requiere un sistema que posteriormente permita la visualizacin o cuantificacin de la unin entre el cido nucleico a estudiar y la sonda. El proceso de reconocimiento y unin de un cido nucleico y un fragmento complementario se conoce con el nombre de hibridacin. Uno de los problemas ms importantes en el estudio de los cidos nucleicos suele ser el hecho de no disponer de cantidad suficiente de muestra de cidos nucleicos como para ser detectada. En este sentido, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que combina tcnicas enzimticas con tcnicas de hibridacin, permite amplificar la cantidad de ADN muestra y as facilita el estudio de los cidos nucleicos cuando se dispone de muy poca muestra de partida.

Figura 21.1. Estructura de la doble hebra de ADN. Se estabiliza por el establecimiento de puentes de hidrgeno entre las bases nitrogenadas del interior de la doble hebra. PROCESO DE HIBRIDACIN Como ya se ha comentado, el fundamento de las tcnicas de hibridacin se encuentra en la complementariedad de las bases nitrogenadas, al establecerse puentes de hidrgeno entre la adenina y la timina (dos puentes de hidrgeno) y la citosina y la guanina (tres puentes).

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Formacin y separacin de la doble hebra de ADN Tanto la formacin de la doble hlice de ADN, como la separacin de las dos hebras (su desnaturalizacin), se encuentran influenciadas por la temperatura. En la figura 21.2 se puede ver cmo se produce el proceso de desnaturalizacin del ADN en funcin de la temperatura, representando la absorcin de luz u.v. a 260 nm (mximo de absorcin de los cidos nucleicos). Esta absorbancia es un indicador del estado de desnaturalizacin del ADN, puesto que tiene mayor capacidad de absorbancia si est desnaturalizado (formando hebras simples) que si est en estado bicatenario. El proceso de formacin de la doble hebra de ADN por el establecimiento de los enlaces de hidrgeno es cooperativo. La forma sigmoidea de la curva indica que las interacciones entre los pares de bases unidas mediante puentes de hidrgeno y apiladas son interacciones cooperativas. Estas interacciones cooperativas se distorsionan progresivamente durante la desnaturalizacin (fusin) hasta que las dos hebras se separan completamente y, a partir de ese momento, no se observa ningn cambio posterior en la absorcin. La temperatura a la cual el ADN se encuentra semidesenrollado (es decir, la mitad del ADN total de la muestra se encuentra en forma de doble hlice y la otra mitad en forma de cadenas separadas) se conoce con el nombre de temperatura de fusin o Tm (T melting) del ADN.

La temperatura de fusin se encuentra determinada por la composicin de las bases del ADN, ya que los apareamientos AT requieren menor cantidad de energa para su separacin que los apareamientos GC (debido a que stos se establecen mediante tres puentes de hidrgeno), de manera que cuanto mayor sea el numero de bases G y C, mayor ser la temperatura de fusin (Figura 21.3). Una vez separadas, las dos hebras se pueden renaturalizar, es decir, volver a unirse en una doble cadena. Si una muestra de ADN fundido o desnaturalizado (con las hebras separadas) se enfra lentamente, la absorcin de luz ultravioleta por la disolucin en que se encuentra dicho ADN disminuye, indicando que las hebras complementarias de ADN se han apareado de nuevo. La renaturalizaci6n tiene lugar a cualquier temperatura por debajo de la temperatura de fusin, Tm, pero es caractersticamente ms rpida a 20 DC por debajo 3

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de dicha Tm (Figura 21.4). El proceso de renaturalizacin requiere que la muestra de ADN fundida sea enfriada lentamente; si se enfra rpidamente, las cadenas polinucleotdicas forman masas enmaraadas y la renaturalizacin es mucho ms lenta.

La renaturalizacin ser ms rpida cuanto mayor sea el nmero de pares de bases que persistan unidas entre las dos cadenas. An en el caso de una separacin total de las dos hebras, puede producirse la renaturalizacin, pero de forma mucho ms lenta, ya que las hebras debern alinearse previamente de forma adecuada; teniendo en cuenta que slo una de las alineaciones es la correcta, la velocidad inicial de renaturalizacin ser lenta.

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Medio de hibridacin El proceso de hibridacin se encuentra influenciado por la composicin del medio donde tiene lugar la reaccin. El medio de hibridacin es un punto clave, ya que determina el entorno en el que se da la reaccin fsica de interaccin entre los cidos nucleicos a estudiar y sus sondas. La composicin del medio y la temperatura de la hibridacin determinan el rigor (condiciones estrictas de apareamiento de las bases). Aunque la unin por complementariedad de cada par de bases est termodinmicamente favorecida, pueden darse uniones errneas entre las dos hebras durante el proceso de hibridacin. Los hbridos con errores de apareamiento en las bases son termodinmicamente menos estables que los hbridos con un perfecto acoplamiento; por lo tanto los primeros pueden desnaturalizarse (separarse) a ms bajas temperaturas que los segundos. Las condiciones de la reaccin de hibridacin definen el nmero de errores en el apareamiento de bases que pueden tolerarse en la estructura doble, es decir, el rigor de la reaccin de hibridacin. Un elevado rigor permite pocos errores de apareamiento, mientras que en condiciones de bajo rigor se permite un mayor nmero de errores en el apareamiento de las bases. Las condiciones de rigor tienen influencia en la sensibilidad del mtodo, de manera que un elevado rigor puede provocar una disminucin de la sensibilidad. Por el contrario, condiciones de bajo rigor aumentan la sensibilidad y disminuyen la especificidad. As pues, un punto clave en una tcnica de hibridacin es determinar las condiciones de rigor que permiten buena especificidad con el mximo de sensibilidad; estas condiciones se consiguen modificando la composicin del medio de hibridacin y los procesos de lavado para eliminar la sonda no unida. En el proceso de hibridacin hay una primera fase de nucleacin, en la que se da la formacin de un pequeo nmero de uniones entre las bases de las dos hebras, siendo sta la etapa limitante de la reaccin; esta fase va seguida de una rpida formacin de la doble hebra por complementariedad de las secuencias. Muchos factores influyen en la velocidad de la reaccin. Un incremento de la concentracin de sonda generalmente incrementa la velocidad de reaccin. Sin embargo, en sondas de doble hebra, las elevadas concentraciones de stas provocan una autohibridacin (uniones sonda-sonda complementaria), lo que eventualmente limitara la velocidad de hibridacin con la secuencia diana. La composicin en bases tiene un pequeo efecto en la velocidad de hibridacin: las molculas con un alto contenido de G y C tienden a una hibridacin ms rpida con sus secuencias complementarias. La temperatura tambin influye en la velocidad de reaccin: por encima de la Tm, la tendencia a que la hibridacin tenga lugar es baja; en cambio, a temperaturas por debajo de este punto, la velocidad de hibridacin se incrementa y alcanza el mximo a (20-25) C por debajo de la Tm. La presencia de polmeros de elevado peso molecular en el medio, como el sulfato de dextrano, provoca un incremento de la velocidad de hibridacin, posiblemente incrementando la concentracin efectiva de la sonda en la mezcla. La composicin del medio de hibridacin se determina de manera emprica. Los ingredientes de este medio se establecen de manera que modulen el rigor de la reaccin y favorezcan la interaccin especfica de los cidos nucleicos mediante puentes de hidrgeno ms que por interacciones entre cargas. Los componentes pueden ser muy variados, pero incluyen:

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- tampones - sales - agentes desnaturalizantes del ADN y del ARN, como la formamida - polmeros de elevado peso molecular - portadores de ADN o de ARN - ingredientes "mgicos" diseados para reducir el ruido de fondo (background), como albmina y ficoll La composicin exacta vara dependiendo de la aplicacin, y se encuentran disponibles muchas mezclas comerciales, en las que simplemente se debe aadir una sonda especfica. Las condiciones de elevado rigor (como una baja concentracin de sales, una alta concentracin de formamida y alta temperatura) requieren que se d una alta complementariedad entre las bases para que tenga lugar una hibridacin efectiva. Cuando el rigor del ensayo de hibridacin es bajo (incrementando la concentracin de sales, con bajos niveles de formamida y a temperaturas bajas) se incrementa el nmero de errores en el acoplamiento de bases que puede tolerarse en la estructura de doble hlice. Una vez establecidos los hbridos, las muestras se lavan para eliminar las interacciones no deseadas. Estos lavados se realizan con disoluciones de sales en las que se modula la concentracin; en este sentido, es muy frecuente modular la concentracin del tampn que se conoce como tampn de citrato sdico y cloruro sdico (SSC, compuesto por NaCl 0,15 M Y citrato trisdico 0,015 M a pH = 7). El control de estas condiciones se refiere a la fuerza del tampn de SSC (por ejemplo, 2 x SSC; 0,1 x SSC). Tambin se aade SSC, en la hibridacin y los lavados. En la prctica, los ensayos de hibridacin se disean de forma ms o menos emprica. El tiempo de hibridacin, la temperatura de hibridacin y la concentracin de la sonda son las variables ms frecuentemente ajustadas en el ensayo. Otro aspecto que tambin debe calcularse son las condiciones de lavado, una vez realizado el proceso de hibridacin. En general, las condiciones se ajustan para establecer el punto de mxima hibridacin especfica con el mnimo de hibridacin no especfica, y la sensibilidad suficiente para poder determinar el cido nucleico.

DISEO DE LOS MTODOS DE HIBRIDACIN La unin de la sonda con el cido nucleico aporta la especificidad del mtodo pero, al igual que ocurre con otros mtodos, es necesario acoplar un sistema para su deteccin, lo que se consigue marcando la sonda (con radiactividad, con fluorescencia, con un antgeno como la digoxigenina o la biotina, etc.). De la misma manera que ocurre con los mtodos inmunolgicos, se debe conseguir distinguir, adems, entre la sonda unida y la sonda libre, lo que se logra inmovilizando el cido nucleico a estudiar, de manera que la sonda no unida pueda eliminarse por lavados. Los puntos clave de cualquier mtodo de este tipo son la preparacin, procedencia y tipo de marcaje de la sonda, el sistema de inmovilizacin de la muestra, el proceso de hibridacin, los lavados que se realizan a continuacin y la cuantificacin de la cantidad de sonda hibridada.

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Preparacin de las sondas: produccin y marcaje Las sondas son fragmentos de ADN o de ARN de secuencia conocida (complementaria a parte del ADN o del ARN que quiere estudiarse), marcados en uno o ms de sus grupos. Estos fragmentos de ADN o de ARN pueden obtenerse digiriendo fragmentos de ADN (sonda genmica), por clonacin (recombinantes), o por sntesis (sntesis de oligonucletidos). El marcaje puede ser radiactivo o no radiactivo. Produccin de sondas Las sondas genmicas fueron las primeras en ser utilizadas en las tcnicas de hibridacin; consisten en fragmentos de cidos nucleicos extrados de organismos y purificados. La naturaleza qumica de la sonda (ADN o ARN, de hebra doble o simple) depende de la estructura del genoma del organismo a partir del cual se purifica dicha sonda. Las sondas recombinantes, en cambio, se obtienen por donacin: se insertan segmentos de ADN de secuencia conocida en un vector plasmdico, construido de forma que puede crecer y amplificarse en una bacteria. Los pequeos ADNs plasmdicos se pueden separar fcilmente del genoma bacteriano basndose en su tamao. Existen vectores que contienen una regin promotora de ARN adyacente a la secuencia de ADN insertada, lo que permite la generacin de transcritos de ARN a partir del ADN insertado. En este proceso de sntesis de ARN se copia una nica hebra. Controlando la orientacin de la regin insertada en relacin con la regin promotora, se permite la produccin de transcritos en sentido -sense- (es decir, como el ARNm) o antisentido -antisense- (es decir, secuencia complementaria al ARNm). Este tipo de sondas tiene varias ventajas. Entre ellas, se puede destacar que es imposible la autohibridacin, debido a que no se generan dos sondas complementarias sino una nica sonda, de manera que se favorece al mximo la interaccin con la secuencia diana. Otra ventaja es que la fraccin de sondas no unidas a su diana, en caso de las sondas de ARN, puede ser eliminada a travs de digestin con ARNasas, que degradan las hebras simples pero no las hbridas. No obstante, son sondas ms difciles de obtener y el ARN es mucho ms lbil que el ADN. La reaccin en cadena de la polimerasa permite tambin obtener sondas, diseando condiciones de amplificacin de una zona determinada del ADN del organismo de inters (que se puede conocer utilizando las bases de datos de los bancos genmicos). El proceso de amplificacin puede utilizarse tambin para marcar la sonda. En este caso, se obtienen sondas de ADN doble, con las limitaciones que ello supone, ya que puede producirse una autohibridacin. Las sondas cortas, segmentos cortos (14-45 bases) de desoxirribonucletidos de ADN -oligonucletidos- se pueden sintetizar qumicamente con una secuencia de bases determinada. La secuencia para la construccin de estas sondas puede conocerse a partir de bases de datos de uso pblico, y de programas informticos que permiten encontrar secuencias con un mximo de homologa con el cido nucleico a estudiar y un mnimo de homologa con otros cidos nucleicos. Estas sondas pueden ser sense o antisense. Un gran nmero de casas comerciales ofrece servicios para la sntesis de estos segmentos.

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Tipos de marcaje Las sondas pueden marcarse por diferentes procedimientos, dependiendo del tipo de sonda. En las figuras 21.7 y 21.8 se presentan diferentes tipos de procesos por los que se puede realizar el marcaje segn el tipo de sonda (ADN, ARN u oligonucletido).

Inmovilizacin de la muestra Un aspecto importante de las tcnicas de hibridacin es la posibilidad de poder distinguir entre la sonda unida y la no unida. Se consigue por diferentes procedimientos, y uno de los ms utilizados consiste en inmovilizar la muestra de cido nucleico sobre una membrana de nitrato de celulosa o de nylon. Estas membranas, cargadas positivamente, presentan una importante capacidad de unin de cidos nucleicos, al encontrarse stos cargados negativamente; adems, las uniones pueden darse covalentemente si las

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membranas se mantienen durante 30 minutos a 110 C o se exponen a radiacin ultravioleta. Al estar las molculas de ADN o de ARN diana inmovilizadas sobre una membrana, puede someterse dicha membrana a sucesivos lavados, de forma que la fraccin de sonda unida no podr eliminarse por los lavados (se encontrar unida por puentes de hidrgeno a las molculas de cidos nucleicos que, a su vez, se encontrarn unidas fuertemente a la membrana), mientras que la sonda no unida s se eliminar en estos lavados. Hibridacin y lavados La siguiente etapa consiste en proceder a la hibridacin de las membranas con la sonda diseada para tal efecto. Para tal fin, la membrana es incubada en las condiciones adecuadas de tiempo, temperatura y cantidad de sonda que permitan una buena sensibilidad en la determinacin del cido nucleico diana, con un mximo de especificidad. Antes de la incubacin de la membrana con la sonda, se suele incubar la membrana con el medio de hibridacin (que contiene, entre otros, compuestos como la albmina y el ficoll, as como algn tipo de ADN -por ejemplo, de esperma de salmn-, que se unen a los diferentes cidos nucleicos de manera inespecfica) y sin la sonda. De esta manera se bloquea la posibilidad de que puedan darse uniones inespecficas de la sonda (que se aadir en el siguiente paso) sobre la membrana, disminuyendo el "ruido de fondo" de la determinacin. Una vez realizada la incubacin con la sonda, la membrana se lava con tampones de distintas concentraciones; la finalidad de los primeros lavados es eliminar la sonda no unida, mientras que los lavados finales se ajustan para eliminar la sonda unida de manera inespecfica a la membrana. Tanto las condiciones de hibridacin como las de lavado se determinan empricamente para cada cido nucleico diana y tipo de sonda. Cuantificacin Una vez hibridada la membrana, se procede a la cuantificacin de la sonda unida. El procedimiento va a depender del tipo de marcaje de la sonda. sta puede haberse marcado con los sistemas de cuantificacin tradicionales: capacidad de formacin de color, radiactividad, fluorescencia o marcaje con antgenos para que, acoplando tcnicas inmunoqumicas, se pueda cuantificar la cantidad de sonda unida. El marcaje radiactivo de las sondas est ampliamente difundido al ser el sistema ms sensible. El istopo ms utilizado es el 32P, pero tambin pueden usarse el 125I, el 35S, el 14 C y el 3H. El marcaje radiactivo de la sonda se realiza a travs de la incorporacin enzimtica de nucletidos radiactivos a sta. Cuando se utiliza un marcaje radiactivo, una vez producida la hibridacin y lavada la membrana de nylon, es suficiente con exponer la membrana a un film de rayos X en la oscuridad, para impresionar la placa fotogrfica. Tambin pueden utilizarse sistemas de captacin de radiactividad. La cantidad de radiactividad emitida es proporcional a la cantidad de cido nucleico diana presente en la membrana (Figura 21.9). Hay diferentes sistemas de marcaje no radiactivos que permiten la determinacin de cidos nucleicos. Entre ellos, se puede destacar la utilizacin de marcaje con fluorescencia y el uso de antgenos, que han sustituido, en muchos casos, la utilizacin de sondas radiactivas. Uno de los mtodos ms usados es el de la digoxigenina. La digoxigenina es

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una molcula de origen vegetal que puede ser detectada por el uso de anticuerpos especficos anti-digoxigenina. Puede incorporarse a la sonda, por ejemplo, introduciendo durante la sntesis de sta nucletidos de uracilo (UTP) unidos a esta molcula (Figura 21.10).

Una vez hibridada la membrana con la sonda marcada con UTP-digoxigenina, se procede al revelado inmunolgico con un anticuerpo anti-digoxigenina marcado con fosfatasa alcalina, que se unir a la sonda (Figura 21.11). La seal se puede detectar mediante mtodos similares a los empleados en la tcnica de Western blot, utilizando sustratos de la fosfatasa alcalina capaces de producir color o luminiscencia a ser

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transformados por la enzima (ver captulo 15). En el caso de que el sustrato d color, ste se desarrolla directamente sobre la membrana; mientras que si el sustrato es quimioluminiscente, la seal puede ser detectada con pelculas de rayos X o detectores de quimioluminiscencia.

REACCIN EN CADENA DE LA POLlMERASA: PCR Fundamento de la PCR Uno de los problemas ms serios que presenta el estudio de los cidos nucleicos es la poca disponibilidad de muestra y la baja concentracin a la que a veces se encuentra, lo que complica en muchos casos su estudio. Este problema ha podido solventarse, como en otras ocasiones, a travs de la aplicacin en el laboratorio de conocimientos en bioqumica y del uso de enzimas. Para poder dividirse, la clula necesita duplicar todo su material gentico, de forma que cada una de las dos clulas hijas recibe una copia exacta del ADN de la clula progenitora. In vivo la incorporacin de nucletidos a cada una de las cadenas que forman el ADN genmico, se cataliza por la ADN polimerasa. El conocimiento de este proceso de replicacin sirvi de punto de partida para el desarrollo de tcnicas in vitro que han permitido sintetizar cadenas de ADN complementarias a un ADN molde. La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (polymerase Chain Reaction) es un mtodo que permite la amplificacin in vitro de fragmentos de ADN a partir de una cadena de ADN molde. La PCR utiliza la capacidad de un oligonucletido para hibridar con una zona especfica de ADN monocatenario, lo que permite la posterior extensin de la cadena de oligonucletido a partir de su extremo 3'-hidroxilo, en una reaccin catalizada por una ADN polimerasa. Cuando se seleccionan oligonucletidos complementarios a determinadas secuencias de las dos hebras del ADN a estudiar, de tal forma que delimiten una regin de inters, se puede obtener de manera exponencial una amplificacin del nmero de copias de esa regin (Figura 21.12). Se eligen dos primers o cebadores distintos, de forma que se siten en cada uno de los dos extremos 3' que delimitan la regin del ADN a amplificar. Uno de los primers hibrida con una de las dos cadenas de la doble hlice de la molcula de ADN, y el otro primer con la otra cadena. A partir de ah, tras la unin de los primers, una ADN polimerasa puede ya realizar la sntesis de ADN (en direccin 5' 3'), amplificndose el nmero de copias de la regin del ADN delimitada por los primers.

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Diseo de las tcnicas de PCR El medio de reaccin para proceder a la replicacin del ADN en un tubo de ensayo requiere que se aadan los co-sustratos de la ADN polimerasa, el molde de ADN, los desoxirribonucletidos (dATP, dTTP, dCTP Y dGTP), los cebadores o primers (que permiten que la ADN polimerasa pueda iniciar la sntesis de ADN enlazando los diferentes desoxirribonucletidos, y que adems delimitan la regin o las regiones de inters), y por ltimo la enzima ADN polimerasa. De esta manera, la enzima podr realizar la replicacin de la doble hebra de ADN. Una cuestin esencial para iniciar la replicacin es que la doble hebra se encuentre separada y los primers se hayan unido a los sitios donde son complementarios. La separacin de la doble hebra de ADN puede conseguirse aumentando la temperatura del medio hasta unos valores de 90-95 C, lo que conlleva la fusin o desnaturalizacin del ADN. Sin embargo, la unin de los primers a las secuencias complementarias de ADN molde requiere una bajada de la temperatura. Adems, se ha de considerar que las enzimas son muy sensibles a temperaturas elevadas, lo que provoca su desnaturalizacin y prdida de actividad. Considerando todo lo dicho anteriormente, el mtodo podra desarrollarse en varias etapas (Figura 21 .13): Introducir la muestra en el tubo de reaccin y proceder a la separacin de las dos hebras del ADN por aumento de la temperatura (95 C) (Desnaturalizacin). Enfriar la muestra y aadir al medio de incubacin el tampn adecuado para la enzima, los sustratos de la reaccin (desoxirribonucletidos, primers, etc.) y la enzima. Dejar que se produzca la hibridacin o annealing de los primers sobre

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las dos hebras molde (Annealing). Dejar que la ADN polimerasa proceda a ir aadiendo los desoxirribonucletidos siguiendo la secuencia especificada por el molde (Elongacin o extensin). Volver a aumentar la temperatura para separar las dos hebras de ADN (Desnaturalizacin). Enfriar y aadir la enzima de nuevo para poder realizar otro ciclo de duplicacin, debido a que dicha enzima se habr desnaturalizado por accin de la temperatura.

Si se repiten n veces los ciclos, se consigue amplificar la cantidad de ADN. Sin embargo, un problema importante lo constituye tener que ir aadiendo la enzima en cada ciclo de amplificacin, lo que, aparte de grandes problemas tcnicos, supone tambin un gasto importante. Los problemas tcnicos se solucionan con la utilizacin de ADN polimerasas que son estables a elevadas temperaturas y mediante el diseo de equipos que permiten el control automtico de la subida y bajada de la temperatura (termocicladores), pudindose realizar reacciones de PCR con una mxima precisin y en un tiempo mnimo. De esta manera se ha desarrollado un sistema que permite la amplificacin del ADN a travs de tres etapas (desnaturalizacin, annealing y elongacin), que se repiten n veces.

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Medio de reaccin En el tubo de reaccin deben encontrarse presentes todos los elementos que permitan la reaccin en cadena de la polimerasa: tampn adecuado, primers, la polimerasa, desoxirribonucletidos, etc. El medio debe tamponarse al pH ptimo de la enzima y normalmente contiene Mg2+, necesario para la actividad enzimtica. Primers. Son necesarios debido a que la ADN polimerasa no es capaz de incorporar de novo nucletidos a una cadena sencilla de ADN, sino que requiere de una regin de doble cadena precedente para poder iniciar la sntesis. Los primers son secuencias de ADN monocatenario de pequeo tamao, de entre 15 y 30 bases aproximadamente; y que presentan complementariedad de bases con regiones del ADN molde prximas a cada uno de los extremos del fragmento que interesa amplificar. Los primers se disean a partir del conocimiento de la secuencia que se quiere amplificar. Se eligen de manera que se evite la complementariedad de bases entre los propios primers, o entre stos y secuencias del ADN de regiones distintas a la que se quiere estudiar, ya que provocara la aparicin de productos distintos al deseado. Otro aspecto importante en el diseo de primers es el valor de su temperatura de fusin (Tm), ya que sirve de referencia a la hora de fijar una temperatura de hibridacin o annealing. Siempre que sea posible, debe escogerse una pareja de primers cuyas Tm sean similares entre s, con lo que se asegura la eficacia y especificidad del perfil de temperaturas empleado en el ciclo. Existen varios programas de ordenador en el mercado que facilitan el diseo de primers, comparando secuencias y calculando valores de Tm. La concentracin de los primers en el medio no debe ser limitante. Normalmente para un medio de reaccin que contenga 1 g de ADN genmico, la relacin entre primers y secuencia diana debe ser de 108 a 1. nicamente de esta forma puede asegurarse que cuando las dos cadenas de ADN de la muestra se separan, se unan antes a los primers que entre s. Sin embargo, si esta relacin es demasiado alta (un exceso de primers), existe una mayor probabilidad de amplificaciones inespecficas y de que se formen dmeros entre los primers. En caso de que la relacin sea demasiado baja, la cantidad final de producto obtenido puede disminuir considerablemente. ADN polimerasa. En el mercado hay diferentes ADN polimerasas que pueden actuar a elevadas temperaturas. Una de ellas es la Taq polimerasa, que se aisl del microorganismo termfilo Thermus aquaticus. Esta enzima es capaz de soportar las temperaturas de desnaturalizacin del ADN aplicadas en la PCR (95 C), aunque a esta temperatura su vida media es de 40 minutos. El uso de polimerasas termoestables en la PCR hace posible que se pueda llevar a cabo la reaccin completa en un nico tubo que contenga todos los reactivos necesarios. La fidelidad de la Taq polimerasa, es decir, la frecuencia de error en la incorporacin de nucletidos, depende de la concentracin de Mg2+ y de dNTPs, as como del equilibrio de concentraciones entre ellos. En la velocidad de sntesis de la Taq polimerasa intervienen una serie de factores entre los que destacan la temperatura, la concentracin de Mg2+ y de detergentes, la estructura secundaria del molde y la concentracin de dNTPs. Cuando la temperatura est entre 72 C y 80 C, la Taq es capaz de incorporar 150 nucletidos por segundo, encontrndose en el mximo de su actividad. La velocidad disminuye al descender la temperatura, de forma que a 55 C son incorporados 24 14

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nucletidos/segundo y nicamente 1,5 nucletidos/segundo a 37 C. La cantidad ptima de enzima oscila entre 0,5 y 2,5 unidades de enzima para un volumen de reaccin de 50 l. dNTPs. Los dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) deben aadirse en cantidad suficiente para que puedan darse todas las reacciones de extensin durante todos los ciclos de amplificacin, de manera que en ningn momento estos sustratos sean limitantes en el proceso de amplificacin. Etapas de la PCR La reaccin en cadena de la polimerasa presenta varias etapas, que cumplen funciones diferentes en el proceso; algunas etapas se dan una sola vez, mientras que otras se repiten n veces, dando lugar a los ciclos de amplificacin. 1) La primera etapa es la de desnaturalizacin de la muestra por aumento de la temperatura y se realiza una sola vez. La muestra de ADN se desnaturaliza para dar lugar a hebras simples. El calentamiento inicial a unos 95 C durante un perodo de 3 a 5 minutos es suficiente para desnaturalizar por completo el ADN genmico, el cual, en las condiciones en las que tiene lugar la reaccin, ya no vuelve a renaturalizarse por completo. 2) En la siguiente etapa, fase de hibridacin o annealing, se disminuye la temperatura del medio para que pueda darse la unin de los primers a sus dianas en el ADN. La temperatura de esta fase se determina empricamente, segn las caractersticas de los primers, y suele oscilar entre (50-60) C. La temperatura se selecciona de manera que el procedimiento tenga el mximo de especificidad y sensibilidad. Las temperaturas bajas aumentan la sensibilidad del proceso (se favorece la unin de los primers al ADN), al tiempo que la especificidad disminuye (pueden darse ms uniones errneas); las temperaturas elevadas disminuyen la sensibilidad (menor unin primers-ADN) y aumentan la especificidad. El xito de la unin de los primers va a depender del nmero de copias del ADN diana y de si hay tiempo suficiente para que stos se unan a su secuencia complementaria. El tiempo de hibridacin de los primers suele ser de entre 20 y 40 segundos, aunque depende del tipo de termociclador que se utilice. 3) Fase de extensin. La temperatura del medio se incrementa hasta alcanzar la temperatura optima de funcionamiento de la ADN polimerasa; en el caso de Taq polimerasa, esta temperatura se encuentra alrededor de los 72 C. Normalmente suele dar buen resultado la utilizacin de tiempos de elongacin que van desde 20 segundos, para fragmentos de 500 pares de bases, hasta 40 segundos, para fragmentos por encima de 1,2 kilobases. 4) Fase de desnaturalizacin. Las hlices de ADN formadas se separan por aumento de la temperatura a (90-95) C. Esta fase de desnaturalizacin suele ser ms corta que la primera y depende del diseo de cada PCR. Las etapas 2), 3) Y 4) se repiten n veces, hasta alcanzar la amplificacin deseada. A la hora de disear el programa de ciclos en el termociclador hay que tener en cuenta la vida media de la polimerasa a (90-95) C (que es, por ejemplo, de 40 minutos para la Taq polimerasa) y que una exposicin excesiva al calor puede provocarle daos que incrementen la incorporacin errnea de nucletidos. Adems, un nmero excesivo de 15

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ciclos puede ocasionar que en los ltimos ciclos falte alguno de los sustratos de la reaccin en el medio, como primers y dNTPs. En algunos casos, los productos de amplificacin pueden comenzar a actuar como primers en los ciclos sucesivos dando lugar a productos de mayor peso molecular. 5) Fase de extensin final. Normalmente tras el ltimo ciclo se aade un perodo de incubacin a 72 C de 5-12 minutos, para permitir que se complete la elongacin de los productos que hayan quedado parcialmente sintetizados. Visualizacin de los productos Los productos de la amplificacin por PCR pueden detectarse como una nica banda, si las condiciones han sido las apropiadas, en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio (Figura 21.15), aunque a veces se observan tambin otras bandas secundarias, correspondientes a amplificaciones inespecficas.

Figura 21.15. Visualizacin del resultado de una PCR en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio. RT-PCR La RT-PCR permite la amplificacin de ARN mediante una modificacin del mtodo que requiere la inclusin de una etapa previa de retrotranscripcin del ARN a su ADN complementario (ADNc) y que est catalizada por una transcriptasa inversa. Los diferentes ARNs presentes en la muestra son desnaturalizados a 90 C, destruyendo de esta manera las estructuras secundarias, tanto intracatenarias como intercatenarias y favoreciendo que todo el ARN pueda ser retrotranscrito a ADNc. La retrotranscripcin tiene lugar por la accin de una retrotranscriptasa viral en un medio de reaccin que contiene primers, una mezcla de dNTP (dATP, dGTP, dCTP Y dTTP) e inhibidores de ARNasas. Se pueden utilizar diferentes enzimas para la reaccin de transcripcin inversa. Los tres tipos de primers que se emplean para la retrotranscripcin son los oligo(dT)12-18, los hexanucletidos al azar (mezcla de hexmeros de nucletidos que se unen al azar a distintas zonas del ARN) y secuencias especficas de oligonucletidos. El ADNc sirve como molde de la posterior reaccin en cadena de la polimerasa (Figura 21.16).

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Figura 21.6. Ejemplo de un proceso tpico de RT-PCR La RT-PCR es una tcnica ms sensible que el Northern blot, que se puede convertir en una tcnica semicuantitativa e, incluso, cuantitativa. Uno de los problemas de utilizar la RT-PCR con fines cuantitativos es que resulta difcil controlar las condiciones de amplificacin, por lo que se recurre a utilizar patrones internos durante el proceso, pudindose tambin utilizar patrones internos y externos en otros casos. Hay diferentes mtodos que permiten la utilizacin de la RT-PCR con fines cuantitativos. Se comentarn brevemente dos mtodos que permiten la cuantificacin de los niveles de ARNm de la UCP1; uno es semicuantitativo, mientras que el otro es de tipo cuantitativo. En la determinacin semicuantitativa de los niveles de ARNm por RT-PCR se realiza, en primer lugar, una retrotranscripcin del ARN aislado de la muestra o muestras de inters por accin de una enzima con actividad retrotranscriptasa (RT). Se obtiene as el ADN complementario (ADNc), que puede utilizarse como molde en la posterior reaccin en cadena de la polimerasa. Para controlar las diferencias en el proceso de amplificacin 17

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dado entre los distintos tubos de anlisis (que, como se ha comentado en el captulo 21, vienen determinadas por un gran nmero de factores), se coamplifica en cada tubo otro ADNc correspondiente a un gen constitutivo (gen que se expresa constantemente debido a la eficiencia de su promotor) que se utiliza como patrn interno del proceso. Para este segundo gen se utilizan primers que provocan la amplificacin de un fragmento de este gen de una longitud diferente a la longitud del fragmento del gen que quiere estudiarse, de manera que los productos amplificados en el mismo tubo puedan separarse y diferenciarse posteriormente mediante electroforesis en geles.de agarosa. Los productos de amplificacin son separados por electroforesis en geles de agarosa y visual izados con bromuro de etidio, observndose dos bandas por tubo de amplificacin (Figura 22.19). Los geles son analizados por un sistema de captura de imagen, y la intensidad de cada banda se determina con ayuda de un programa informtico de cuantificacin.

ARNm-UCPl ARN-actina Figura 22.19. Imagen obtenida tras la separacin e/ectrofortica de productos de RT-PCR correspondientes a la coamplificacin de un fragmento del ADNc del mensajero de la protena UCP1 y un fragmento del ADNc del mensajero de la acUna en diferentes muestras. La determinacin cuantitativa de los niveles de ARNm por RT-PCR se fundamenta en la retrotranscripcin del ARNm salvaje y en la amplificacin de un fragmento de este gen, junto con la coamplificacin de un patrn interno que se aade a la muestra. Se utiliza como patrn interno un ARNm mutante para el mensajero a cuantificar, en el que se ha sustituido una sola base, de manera que presenta una diana de restriccin que no aparece en la secuencia salvaje. Esto permite diferenciar el producto del ARNm mutante del ARNm salvaje, tras incubar los productos de la RT-PCR con la enzima de restriccin. Al igual que en otras tcnicas cuantitativas, se utilizan tambin patrones externos, que proporcionan una curva patrn para poder determinar los niveles de mensajero presentes en la muestra. Los productos amplificados son separados por electroforesis y se realiza posteriormente un Southern blot y una hibridacin con una sonda especfica, seguida de un revelado inmunolgico.

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qPCR O PCR CUATITATIVA Permite cuantificar la cantidad de ADN fabricado en cada momento. Es el caso de la tcnica TaqMan, una qRT-PCR (PCR cuantitativa empleando RNA como molde). Permite la deteccin de la cantidad de DNA especfico empleando un tercer cebador, una sonda, unida a dos fluorocromos que, cuando la sonda est intacta, presentan una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicho FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, cosa que sucede cuando la polimerasa se sita a nivel de la sonda y la degrada mediante su actividad 3'-5' exonucleasa, lo que permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen.

APLICACIONES DE LA PCR Las aplicaciones de la PCR son mltiples, desde la arqueologa, la Medicina forense y la Medicina clnica. Permite el diagnstico de enfermedades infecciosas en unas horas frente a la espera de los cultivos. Adems, las cantidades necesarias son mnimas, por lo que ese inconveniente es obviado. Tambin tiene esta tcnica inters para la demostracin de genes indicadores de diversos rasgos que conduzcan a patologa. Del mximo inters parece ser la demostracin de oncogenes, genes supresores de tumor que en oncologa van teniendo valor en el estudio pronstico de ciertos tumores. 1. Secuenciacin Una de las razones mas comunes para el uso de la PCR es la formacin de suficiente cantidad de ADN molde para su secuenciacin. Es mucho mas sencillo y rpido que la clonacin en clulas. 2. Estudios evolutivos Mediante la PCR se pueden amplificar genes de organismos ya extinguidos, como del mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden comparar estos genes con los genes semejantes de organismos actuales y poder reconstruir rboles filogenticos. El PCR tambin se ha utilizado para conseguir el mapa del genoma humano. 3. Huellas dactilares del ADN. La determinacin de las huellas dactilares genticas constituye una de las aplicaciones mas interesantes de la PCR. Mediante esta tcnica es posible comparar

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muestras diferentes de ADN para comprobar si pertenecen al mismo individuo o no, o si existe parentesco entre ellas. Esta tcnica se aplica actualmente en Medicina forense e investigaciones policiales, con el fin de identificar individuos a partir de muestras biolgicas, como sangre, semen, piel o cabellos. Tambin se utiliza en las pruebas de paternidad.

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