Biología Celular y Molecular

2022

COLOQUIO LOCALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

Chen, L.-Y., Zhang, Y., Zhang, Q., Li, H., Luo, Z., Fang, H., Kim, S.H., Qin, L., Yotnda, P.,
Xu, J., et al. (2012). Mitochondrial localization of telomeric protein TIN2 links telomere
regulation to metabolic control. Mol. Cell 47, 839–850.

Antecedentes

La proteína TIN2 tiene un rol en la unión a los telómeros y en la regulación de su función.

Varias proteínas teloméricas tienen roles adicionales en la célula. En este trabajo, los
autores están interesados en investigar el rol no-nuclear de TIN2.

Terminología
TIN2 –proteína de interés
TRF2 – proteína nuclear localizada en los telómeros
ATP5A1 – subunidad de la ATP sintasa mitocondrial
DAPI – molécula fluorescente que se une al DNA y marca el núcleo
flag – pequeño péptido que se fusiona a las proteínas y permite su detección
ORC2 – complejo de reconocimiento del origen (nuclear)
Tubulin – proteína del citoesqueleto (citoplasmática)
Triton-X 100 – detergente que rompe las membranas
TOM20 – proteína de la membrana externa de la mitocondria
Proteinase K – proteasa no especifica que degrada proteínas

Las siguientes preguntas corresponden a la Figura 1

Para determinar donde puede localizarse TIN2, los autores utilizaron microscopía de
fluorescencia y anticuerpos anti-TIN2 marcados. Además realizaron tres construcciones en
el cual TIN2 fue fusionada a GFP o a flag. Expresaron estas construcciones en células y
analizaron su localización.
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1. ¿Cuál de las siguientes construcciones (1, 2 y 3) se utiliza en cada uno de los paneles de
la Figura 1?

Panel A ________ Panel B ________ Panel C ________ Panel D ________

2. Cual de los siguientes reactivos fue utilizado en los paneles de la Figura 1. Explique por
qué se utilizaron?

Anticuerpos que reconocen TRF2

Anticuerpos que reconocen ATP5A1

Anticuerpos que reconocen flag

DAPI

3. ¿Qué se puede inferir acerca de la localización de TIN2 basados en la Figura 1A y Figura

1B?

4. Las proteínas TIN2-flag y TIN2-GFP se localizan en el mismo lugar que la proteína TIN2
endógena? ¿Qué paneles de la figura apoyan su conclusión?

Las siguientes preguntas se refieren a la Figura 2

Los científicos suelen usar distintos experimentos para investigar el mismo fenómeno
biológico. Para confirmar los datos de localización que fueron observados por
inmunofluorescencia (FIG1), los autores realizaron un experimento de fraccionamiento
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celular usando centrifugación diferencial, seguido de un Western-blott para continuar el
análisis de la localización de TIN2. En este experimento, las células son lisadas
mecánicamente y luego centrifugadas a una velocidad inicial baja para precipitar organelas
densas (núcleo). El sobrenadante luego es centrifugado nuevamente a mayor velocidad
para obtener mitocondrias.

5. Cual de estos componentes celulares (núcleo, mitocondria, proteínas citosólicas) serán

encontrados en las fracciones mencionadas a continuación

WCE
P1
S1
P2
S2

6. Luego de generar las fracciones mediante centrifugación diferencial, los autores

realizaron un Western-blot en cada una de ellas utilizando distintos anticuerpos. ¿Por qué
se utilizan cada uno de los anticuerpos mencionados a continuación?

anti-ORC2
anti-Tubulin
anti-ATP5A1
anti-flag

7. Basados en los datos mostrados en la Figura 2, ¿qué fracción(es) contiene cada uno de
los siguientes componentes?

Núcleo
Mitocondria
Proteínas citosólicas

8. Según los datos de la Figura 2, ¿dónde se localiza TIN2?

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Las siguientes preguntas se refieren a la Figura 3

Los datos mostrados en las figuras 1 y 2 sugieren que TIN2 podría localizarse en la
mitocondria. Esta localización depende de interacciones proteína-proteína con alguna
proteína de membrana externa mitocondrial o podría ser translocada a los compartimientos
interiores de la mitocondria. Para analizar la localización exacta de TIN2, los autores
realizaron los experimentos mostrados en la Figura 3. En estos ensayos, aislaron las
mitocondrias por fraccionamiento usando la fracción P2 (como se muestra en la figura 2) y
trataron las mitocondrias obtenidas con Proteinasa K (proteasa), Triton- X100 (detergente) o
ambos

7. ¿Cuáles componentes (P2, Proteinasa K, Tritón) fueron incluidos en cada una de las
reacciones realizadas en 3B?

9. En cuál de las reacciones se encuentran cada una de estas proteínas intactas (visibles
en el Western-Blot)?

TIN2-flag

ATP5A1

TOM20

10. ¿Por qué los resultados son diferentes para ATP5A1 y TOM20?
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11. Los datos de la figura, ¿confirman la idea que TIN2 está localizada en la mitocondria a
través de interacciones proteína-proteína con una proteína de membrana externa
mitocondrial? Explique

Las siguientes preguntas se refieren a la figura 4.

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Una vez que los autores determinaron que TIN2 se localiza en la mitocondria, se
interesaron en determinar qué porciones de TIN2 contienen la secuencia de localización
mitocondrial. Para esto generaron una serie de construcciones en las cuales ciertas
porciones de TIN2 fueron fusionadas con GFP. Estas construcciones se expresaron en
células y su localización fue analizada por fluorescencia

12. La región de 1-90 de TIN2 es necesaria para la localización en la mitocondria? ¿Qué

panel de la figura 4 se puede utilizar para responder esto?

13. La región de 1-90 de TIN2 es SUFICIENTE para la localización mitocondrial? ¿Qué

panel de la figura puede usarse para responder esto?

14. La región de 1-58 de TIN2 es necesaria para la localización? ¿Qué panel de la figura
puede usarse para responder esto?

15. La región de 1-58 de TIN2 es SUFICIENTE para la localización? ¿Qué panel de la

figura puede usarse para responder esto?

16. Basados en los datos de la Figura 4, los autores concluyen que hay dos señales de
localización distintas en TIN2. Explique cómo los datos avalan esta conclusión.