.

ri
¿__*
t \
\ '=j,
._\.#
!s

5 ,:: ;¡:e s+-: rr=.+. ¡=' ;a

"l.
j: ¿ a -
i r: : ! s*! -**
E-,.E=+,#
L- a á =+ i: .i. E a ré
e+:, -!
- .
+

¡f
=s'í. -q-
-=€ +-: "-= .=F -Fé
t +§ E+l €* F.*-A_
É*=
*1. a'=
=;' E. F:=€=-
I E: lE =-*-= = É =+ =i A --:L --r
j'
g E .":r i =ÉA-I
E : E E
E:E '+; ¿ É*;='':5 E;_#É +===j I E É "oE +:
E
Lé€-'
+
{
-i i r-E
i *=:-,i-É F- fl-i É' "= F---E=: ' = i-
,+#-+",!-

i.i: =:; E
É :;F
E E +€i- i i E E: €É "-
L:€Fl a E-: +:,.---=
F{I E I i::rt"
Ls= ;i _E j E
=E
*E==€
.=, i

t]_DJji
.i :4.3Il i, jf1§j r i
t¡.!f_a. .

1.3 Pr*teínes y pl?tscriti

**=9"=:.:== cj= l**r =E

e=;=É-É=!= ; ***=r* 5=i {===: i,,.'.

Definir los términos "genoma", "tranícriptoma" y l'proteoma", y explicar cómo se vinculan con el proceso
de expresión del genoma.

Describir los dos experimentos que llevaron a los biólogos moleculares a concluir que los genes están
compuestos por DNA y explicar las limitaciones de estos experimentos.

Efectuar una descripción detallada de la estructur¿ de un polinucleótido, y resumir las diferencias quÍmicas
entre DNA y RNA.

Analizar la evidencia que utilizaron Watson y Crick para deducir Ia estructura de la doble hélice del DNA,
y describir Ias caracterÍsticas claves de esta estructura.

Distinguir entre RNA de codificación y funcional, y dar ejemplos de cada tipo.

Describir, en términos generales, cómo se sintetiza y se Procesa el RNA en Ia célula.

Brindar una descripción detallada de los diversos niveles de estructura proteica y expilcar por qué la
diversidad de aminoácidos es la base de la diversidad de las proteínas.

Mencionar las características claves del código genético.

Explicar por qué la función de una proteÍna depende de su secuencia de ¿minoácidos.

Enumerar las principales funciones de las proteínas en los organismos vivos y relacionar esta diversidad
con la función del genoma.

La vida como la conocemos está especificada por los genomas de los

innumerables organismos con los que compartimos el planeta. Todo
organismo tiene un genoma que contiene la informaciónbiológica nece-
saria para construir y mantener un ejemplo viüente de ese organismo.
La mayoría de los genomas, incluidos el genoma humano y los de todas
las demás formas de vida celular, están compuestos por DNA (ácido
desoxirribonucleico), pero unos pocos virus tienen genomas de RNA
(ácido ribonucleico). El DNA y eI RNA son moléculas poliméricas forrna-
das por cadenas de subunidades monoméricas denominadas nucleótidos.
El genoma humano, que es típico de los genomas de todos los animales
 CapÍtulo I Cenomas, transcriptomas y proteomas

multicelulares, está formado por dos partes distintas (figura 1.1):

u El genoma nuclear comprende alrededor de 3,200.000.000 de nucle-
ótidos de DNA, divididos en 24 moléculas lineales, la más corta de
50.000.000 de nucleótidos de longitud y la más larga de
260.000.000 de nucleótidos, cada una contenida en un cromosoma
diferente. Estos 24 cromosomas consisten en22 autosomas y los dos
cromosomas sexuales, X e Y. En conjunto, el genoma nuclear huma-
no contiene unos 35.000 genes.
= El genoma mitocondrial es una molécula de DNA circular de 16.569
nucleótidos, de la cual hay múltiples copias en los orgánulos genera-
dores de energía denominados mitocondrias. El genoma mitocon-
drial humano contiene sólo 57 genes.

Figura 1.1 Componentes nucleares y

mitocondriales del genoma humano.
Célula humana

a
§
¡A
1.1=l

&
E

ñ-i !:

Familia humana 3
i
.,.;f

Cenoma nuclea¡ Cenonia *:itecond¡i¿l

*(¿,8,
t\rP-;¡§*t,r
Bz{+

I ^Tr-&'"iI
*a)r r

Cada una de las aproximadamente 1013 células del cuerpo humano adul-
to tiene su propia copia o sus propias copias del genoma, excepto algu-
nos tipos celulares, como los eritrocitos, que carecen de núcleo en su
estado de diferenciación completa. La mayoría de las células son diploi-
des y, por lo tanto, tienen dos copias de cada autosoma, más dos cromo-
somaJsexuales, XX en las mujeres o XY en los varones: 46 cromosomas
en total. Se las denomina células somáticas, a diferencia de las células
.sexuales o gametos, que son haploides y sólo tienen 23 cromosomas,
uno de cada autosoma y un cromosoma sexual. Ambos tipos de célula
tienen alrededor de 8.000 copias del genoma mitocondrial, más o menos
10 en cada mitocondria.

El genoma es un depósito de información biológica, pero por sí mismo es

incapaz de liberar esa información a la célula. La utilización de la infor-
mación biológica contenida en el genoma requiere la actividad coordina-
da de enzimas y otras proteínas, que particip¿m en una compleja serie de
reaeciones bioquímicas conocida como expresión del genoma (figura
t.2).Elproducto inicial de la expresión del genoma es el transcriptoma,
un conjunto de moléculas de RNA derivadas de los genes que codifican
proteínas, cuya información biológica es'requerida por la célula en un
determinado momento. El transcriptoma es mantenido por el proceso
 DNA

denominado transcripción, que .opiu g"r,., individuales a moléculas de

GEI{OTA
RNA. El segundo producto de la expresión del genoma es el proteoma, el
repertorio de proteínas de la célula; que especifica el carácter de las reac-
ciones bioquÍmicas que la célula puede llevar a cabo. Las proteínas que fTranscrinción
forman el proteoma son sintetizadas por traducción de las moléculas indi-
viduales de RNA presentes en el transcriptoma.

Este libro trata acerca de los genomas y su expresión. Explica cómo se |Traducción
los estudia (Parte 1), cómo se organizan (Parte 2), cómo funcionan
(Parte 3) y cómo se replican y evolucionan (Parte 4). Hasta hace muy PROTEOMA
Reperlorio de proteínas de la célula
poco, era imposible escribir un texto como éste. Desde la década de
tg5O, los biólogos moleculares han estudiado genes individuales o
pequeños grupos de genes y, a partir de estos estudios, han acumulado
un gran conocimiento acerca del funcionamiento de los genes. Sin
embargo, sólo durante los últimos diez años se ha dispuesto de técnicas Figura 1.2 Genorna, transcriptoma y
que han posibilitado el examen de genomas enteros. Todavía se estudia proteoma.
de manera intensiva cada gen, pero la información acerca de genes indi-
viduales se interpreta, ahora, dentro del contexto del genoma en su con-
junto. Este nuevo y mayor interés se aplica no sólo a los genomas, sino
a toda la bioquímica y la biología celular. Ya no es suficiente conocer
vías bioquímicas o procesos subcelulares indiüduales. El desafío actual
es la biología de sistemas, que intenta articular estas vías y procesos en
redes que describan el funcionamiento global de las células y los orga-
nismos vivos.

Este libro presenta al lector nuestro conocimiento de los genomas y mues-

tra cómo esta interesante área de investigación está apuntalando nuestra
creciente comprensión de los sistemas biológicos. Sin embargo, primero
debemos prestar atención a los principios básicos de la biología molecular
repasando las características claves de los tres tipos de moléculas biológi-
cas que participan en los genomas y la expresión de los genomas: DNA,
RNA y proteínas.

I.I DNA
En 1869, Johann Friedrich Miescher, un bioquímico suizo que trabajaba
en Tübingen, Alemania, descubrió el DNA. Los primeros extractos que
obtuvo de leucocitos humanos eran mezclas no refinadas de DNA y pro-
teínas cromosómicas; al año siguiente, se mudó a Basilea, Suiza (donde
ahora se encuentra el instituto de investigación que lleva su nombre) y
entonces preparó una mezcla pura de ácido nucleico de espermatozoi-
des de salmón. Las pruebas químicas de Miescher mostraron que el
DNA es ácido y rico en fósforo; también sugirieron que cada molécula
es muy grande, aunque recién en la década de 1930, cuando se aplica-
ron técnicas biofísicas al DNA, se reconoció totalmente la enorme lon-
gitud de las cadenas poliméricas.

I.I.l Los genes están compuestos por DNA

En lá actualidad es tan conocido que los genes están compuestos por DNA
que, a veces, es difícil apreciar que, durante los primeros 75 años que
siguieron a su descubrimiento, no se sospechó el verdadero papel del
DNA. Ya en 1903, W. S. Sutton había advertido que los patrones de
herencia de los genes guardaban paralelo con el comportamiento de los
cromosomas durante la diüsión celulal observación que dio origen a la
teoúa cromosómica: la hipótesis de que los genes se localizan en los cro-
mosomas. El examen de las células por citoquímica, después de teñirlas
 ---

Capítulo I Cenomas, transcriptomas y proteomas

con colorantes que se unen específicamente a sólo un tipo de producto -

bioquímico, ¡nostró que los cromosomas están compuestos por DNA y
proteínas, en cantidades aproximadamente iguales. En esa época, los bió-
logos reconocieron que debían de existir miles de millones de genes dife-
rentes y que, por lo tanto, el materiál genético debía de ser capaz de
adoptar muchas formas distintas. Pero este requerimiento parecía no ser
satisfecho por el DNA, porque, en la primera mitad del siglo xx, se con-
sideraba que todas las moléculas de DNA eran iguales. Por otra parte, se
sabía con certeza que las proteínas eran moléculas poliméricas muy varia-
bles, formadas cada una por una combinación diferente de 20 monóme-
ros de aminoácidos químicamente distintos (sección 1.5.1). Por lo tanto,
los genes debían de estar compuestos por proteína, no por DNA.

Los errores en el conocimiento de la estructura del DNA persistieron, pero

hacia fines de la década de 1950 se había aceptado que el DNA, al igual
que las proteínas, presentaba inmensa variabilidad. El concepto de que las
proteínas eran el material genético se mantuvo firme al principio, pero con
el tiempo fue refutado por los resultados de dos experimentos importantes:
. Oswald Avery Colin Macleod y Maclyn McCarty mostraron que el
DNA es el componente activo del principio de transformación, un
extracto de células bacterianas que, al ser mezclado con una cepa
inocua de Streptococcus pneumoniae, conüerte a estas bacterias en
una forma virulenta capaz de provocar neumonía cuando son inyec-
tadas a ratones (figura 1.5A). En 1944, cuando se publicaron los
resultados de este experimento, sólo unos pocos microbiólogos reco-
nocieron que la transformación implica transferencia de genes del
extracto celular a las bacterias vivas. Sin embargo, una vez aceptado
esté punto, se clarificó el verdadero significado del "experimento de
Avery": los genes bacterianos deben estar compuestos por DNA.
. Alfred Hershey y Martha Chase utilizaron la radiomarcación para
mostrar que, cuando un cultivo bacteriano es infectado por bacterió-.
fagos (un tipo de ürus), el DNA es el principal componente de éstos
que ingresa en las células (figura 1.38). Esta fue una observación
vital porque se sabía que, durante el ciclo de infección, los genes de
los bacteriófagos infectantes se utilizan para la síntesis directa de
nuevos bacteriófagos y esta síntesis tiene lugar dentro de las bacte-
rias. Si el DNA de los bacteriófagos infectantes es lo único que ingre-
sa en las células, se deduce que los genes de estos bacteriófagos
deben estar compuestos por DNA.

Si bien desde nuestra perspectiva estos dos experimentos aportan los resul-
tados claves que demues.tran que los genes están compuestos por DNA, los
biólogos de la época no se convencieron con tanta facilidad. Ambos expe-
rimentos tenían limitaciones que permitían a los escépticos argumentar que
las proteínas podían ser, aun así, el material genético. Por ejemplo,había
preocupación acerca de la especificidad de la enzima desoxirribonucleasa
(ue utilizaron Avery y cols. para inactivar el principio de transformación.
Este resultado, una parte cántral de la evidencia de que el principio de
transformación era DNA, sería inválido si, como paredra posible, la etuima
contuviese vestigios de una proteasa contaminante y, por 1o tanto, también
pudiese degradar proteínas. Tampoco el experimento con bacteriófagos
es concluyente, como destacaron Hershey y Chase cuando publicaron
sus resultado§: "Nuestros experimentos muestran con claridad que es
posible una separación física del fago T2 en una parte genética y una
parte no genética... La identificación química de la parte genética debe
aguardar, sin embargo, a que se hayan respondido algunas preguntas...".
Retrospectivamente, estos dos experimentos son importantes no por lo que
 DNA

(§ Principio de transformación (B) Experimento de Hershey-Chase

4@%M Cáps¡de proteica

Bacterias inocuas El ratón sobrevive

: \/
. !=-{
l::') "\
I a la bacteria
bacteri¿

Aeitar en mezclador
Bacterias inocuas + El ratón muere B¿cterias virulentas
princrpic de tr¡¡sfcrinación
f

'É''

o-,D
\Y_ *-*-4 a(
..,-..:

''
j

o
i. r':----r
,i.
Fago ahora

r---l cJ - r\1i
O
desprendido

-O
i '*:

Bacterias inocuas + El ratón muere Bacterias i,irulentas

prncrfio de transfor nrlcion
lr¿tddo con proteasa o ribonucleasa Centrifusar
f

?i.

a\-#70"-P'
Bacterias inocuas + El ratón sobrevive r-./)
\\--.2
) 200¡,.S
orincioio de tr¿nsformación
iratadb con desoxirribonucleasa
Microglóbulo de ba(s¡i¿5 -=- u -/-\
c--2

Figura 1.3 Los dos experimentos que sugirieron que los Senes están
comPuestos Por DNA.
(A) Avery y cols. mostraron que el principio de transformación está comPuesto
por oNÁ. Los dos paneles süperiorbs ilustran lo que sucede cuando se inyecta.a..---....-
iatones con bacterias Streptococcus pneumonioe inocuas, con agregado o no del
principio de transformación: un extracto celular obtenido de ung cepa virulenta de
S. pnéumonioe. En presencia de principio de transformación, el ratÓn muere Por-
que los genes de este principio convierten a las bacterias inocuas en formas viru-
lentas; dÉspués, estas Éaaeiias virulentas se aíslan en los pulmones del ratón
muerto. Los dos paneles inferiores muestran que el tratamiento con-Proteasa o
con ribonucleasa no ejerce ningún efecto sobre el principio de transformación,
pero que éste es inactivado por la desoxirribonucleasa.

(B) El experimento de Hershey-Chase utilizó bacteriófagos T2, cad.a uno de los

cuales cónsiste en una molécula de DNA contenida en una cápside proteica
unida a un "cuerpo" y "piernas', que permiten que el bacteriófago. se fije.a.la
superficie de uná bacteiia y que inyecte sus genes en el interior de la célula. Se
marcó con ¡2P el DNA de los bacteriófagos y con 3sS, la proteína. Unos pocos
minutos después de la infección, se agitó el cultivo para desprender de la superfi-
cie celular lai partículas de fago vacías. Después, se centrifugó el cultivo, lo que.
reúne a las bacterias más los genes de los fagos en un microglóbulo en el fondo
del tubo, pero deja en suspensión las partículas más livianas del fago. Hershey y
Chase observarori que el microglóbulo bacteriano contenía la mayor parte del
componente marcado can 32P -le los fagos (el DNA), pero sólo el 200lo del
material marcado con 3sS (la proteína del fago). En un segundo experimento,
mostraron que los nuevos fagos producidos al final de cada ciclo de infección
contenían menos del lolo de la proteína de los fagos progenitores. Véanse más
detalles del ciclo de infección del bacteriófago en la figura 2.19.
 Capítulo I Cenomas, transcriptomas y proteomas

demuestran, sino porque alertaron a los biólogos sobre el hecho de que el

DNApodría ser el material genético y, por 1o tanto, valía la pena estudiar-
1o. Fue esto lo que influyó en Watson y Crick para que trabajaran sobre el
DNA y, como se verá más adelante, fue su descubrimiento de la estnrctura
de doble hÉüce, que resolvió el desconcertante interrogante sobre la mane-
ra de replicación de los genes, lo que rea,lmente convenció al mundo cien-
tífico de que los genes estaban compuestos por DNA.

1.1.2 Estructura del DNA

Los nombres de fames Watson y Francis Crick están tan estrechamente
ligados con el DNA que es fácil olvidar que, cuando comenzaron su
colaboración en.octubre de 1951, ya se conocía la estructura detallada
del polímero DNA. Su contribución no fue determinar la esfnrctura del
DNA per se, sino mostrar que, en las células vivas, se entrelazan dos cade-
nas de DNA para formar la doble héIice. Por consiguiente, primero es
necesario analizar qué sabían Watson y Crick antes de iniciar su trabajo.

N ucleótidos y polinucleótidos
El DNA es un polímero lineal, no ramificado, cuyas subunidades mono-
méricas son cuatro nucleótidos químicamente distintos que se pueden
unir en cualquier orden en cadenas de cientos, miles o, incluso, millones
de unidades de longitud. Cada nucleótido del polímero DNA está forma-
do por tres comporientes (figura 1.4):
. 2'-desoxirribosa, que es una pentosa, un tipo de azúcat compuesto
por cinco átomos de earbono. Estos cinco carbonos se numeran 1'
(que se dice "uno prima"), 2', etc. El nombre "2'-desoxirribosa" indi-
ca que este az(tcat particular es un derivado de la ribosa, en el que el
grupo oxhidrilo (-OH) unido al carbono 2' delaribosa ha sido reem-
plazado por un grupo hidrógeno (-H).
r Una base nitrogenada, de citosina, timina (pirimidinas de un solo ani-
llo), adenina o guanina (purinas de doble anillo). La base está unida al
carbono !' delazúcar mediante qn enlace SN-glucosídico, que se une al
nitrógeno número uno de la pirimidina o al número nueve de la purina.
. Un grupo fosfato que comprende una, dos-o tres unidades ligadas de
fosfato unidas al carbono 5' del azúcar. Los fosfatos se designan c, B
y y, y el fosfato o es el que se une directamente al az:úcat

(A) Nucleótido
0- 0- 0-
-C-P-e-P'-1-P-0-CH: f
rl rl ll l-o-
o 0 o c'ci
r
|

ñct'

OHH
@
(B) Las cuatro bases del DNA

NHz NHz o o
Fisura 1.4 Estructura de un
nüdeótido. t I II I
(A) Estructura general de un desoxi- ,,T-.í[\,,¡
HC'B' tt" 'l
*lÍ).,
t' 'lr
,*-c-ctNH'
HCIIi
HN-
lil
-C-*C-.CHs
rribonucleótido, el tipo de nucleótido t-N-, jcH jin 1e i . t
hallado en el DNA. (B) Las cuatro '.?-c
r.r o.-il, 'N- $-"-ñ7"-NH, o'-_c--N--cH
I l-
bases presentes en los desoxirribo-
r@ r@
f I

nucleótidos. @ @
:
-
i¡
:+

! DNA 9
n
1;

Una molécula compuesta sólo por azicary base se denomina nucleósi-

do; el agregado de los fosfatos la qonvierte en un nucleótido. Aunque las
células contienen nucleótidos con uno, dos o tres grupos fosfato, sólo los
nucleósido trifosfatos actúan como sustratos para la síntesis de DNA.
Los nombres químicos completos de los cuatro nucleótidos que se poli-
mettzan para formar DNA son:
r 2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato
. 2'-desoxicitidina 5'-tilfosfato

" 2'-desoxiguanosina 5'-trifosfato

r 2'-desoxitimidina 5'-trifosfato

Las abreviaturas de estos cuatro nucleótidos son dATP, dCTP, dGTP y

dTTP o cuando se hace referencia a la secuencia de DNA, A, C, G y T,
respectivamente.

En un polinucleótido, cada nucleótido está unido por enlaces fosfo-

diéster entre sus carbonos 5' y 3' (figura 1.5). A partir de la estructura
de esta unión, se puede observar que la reacción de polimerización
(figura 1.6) implica la eliminación de los dos fosfatos externos (los fos-
fatos B y y) de un nucleótido y el reemplazo por el grupo oxhidrilo
unido al carbono 3' del segundo nucleótido. Obsérvese que. los dos
extremos del polinucleótido son químicamente distintos: uno tiene
un grupo trifosfato, que no ha reaccionado, unido al carbono 5'
(extremo 5'o 5'-P) y el otro tiene un oxhidrilo, que tampoco ha reac-
cionado, unido al carbono 5' (extremo 5' o 5'-OH). Esto significa
que el polinucleótido tiene una dirección química, expresada como
5'-->3'(hacia abajo en la figura 1.5) o 3.'-+5' (hacia arriba en la figu-
ra 1.5). Una consecuencia importante de la polaridad del enlace fos-
fodiéster es que la reacción química necesaria para extender un
polímero de DNA en dirección 5'-+3' es diferente de la requerida
para hacer una extensión 3'-+5'. Todas las enzimas DNA polimera-
sas naturales sólo pueden llevar a cabo la síntesis 5'-->3' ,1o que suma
complicaciones significativas al proceso de replicación del DNA de
doble cadena (sección 15.2).

Bdremo 5'-P

o-
l1
o- o-
l5'
-0-P-0-P-0- F-O-CHz
rlrl i,ll
00 o(
:5,
irl¡i¿: ir,:.iliii:::i¡; il .,-, f t-l - CHZ
i

*-

0:P-0-CHz
lt
Figura I.5 Polinucleótído corto de -"
DNA que muestra la estructura del
enlace fosfodiéster. Obsérvese que
Ios dos extremos del polinucleótido
Extremo 5'-OH son químicamente distintos.
 Capítulo I Cenomas, transcriptomas y proteomas

Extremo 5'-P
:igura 1.6 Reacción de polimeriza-
:ión que determina la síntesis de tl
o- 0- 0-
ls'
rn polinucleótido de DNA. La sínte- -0-P-0-P-0- P-0-CHz
rl il rlt
;is ocurre en dirección 5'+3', y el
ruevo nucleótido se agrega al carbo-
oo o(
ro 3' al final del polinucleótido exis-
ente. Se efiraen los fosfatos F y y del ly
rucleótido como una molécula de 0:P-0-CHz
rirofosfato. I

0-
0- 0-
-o--P-o-P-0-P.,r /u Extremo 3'-OH
ll I i-0
0

'CHz

00
ilr
-0-P-o-P-O*
l

0- 0-
o-
tl
o- 0-
l¡'
-0-P-0-P-0- P-0-CHz
Pirofofato
ilil rlt
oo o7

ly
0:P-O-CHz
I

0-

0
i5'
P-0-CHz
tt
o-(

Evidencío que llevó a lo doble hélice

Antes de 1950, diversas líneas de evidencia habían mostrado que las molé-
culas de DNA celular estaban formadas por dos o más polinucleótidos
ensamblados de algUna manera. La posibilidad de que descifrar el carácter de
este ensamblaje pudiese aportar conocimientos sobre la manera como traba-
jan los genes instó a Watson y Crick, entre otros, a intentar resolver la estruc-
tura. Según afirma Watson en su libro The Double Helix (La doble hélice),
su trabajo fue una carreradesesperada contra el famoso bioquimico estadou-
nidense Linus Pauling que propuso, inicialmente, un modelo incorrecto de
triple hélice, 1o que les dio a Watson y Crick el tiempo que necesitaban parq
completar la estructura de doble hélice. Ahora, es difícil separar la realidad
de la ficción, sobre todo con respecto al papel desempeñado por Rosalind
Franklin, cuyos estudios de difracción de rayos X aportaron el grueso de los
datos experimentales que avalaban la doble hélice, y quien estuvo muy cerca
de resolveL ella misma, la estructura. Lo que queda claro es que la doble héli-
ce, descubierta por Watson y Crick el7 demarzo de 1955, fue el avance ais-
lado más importante de la biología durante el siglo >o<'

Watson y Crick emplearon cuatro tipos de información para deducir la

estructura de doble hélice:
 It

Datos biofísicos de diversas clases. El contenido de agua de las fibras Células humanas Bacterias
kcherichio coli
de DNA era de particular importancia, pues permitía estimar la den- :#
sidad de DNA de una fibra. La cantidad de cadenas de la hélice y el ffi- .::,-&==
:@.ffi
espacio entre los nucleótidos debían sel compatibles con la densidad @.# ffi EJ':-5::-i
.-¿'¡rla:-
ffi-=: Fl
de la fibra. El modelo de triple hélice de Pauling se basó en una deter-
-ffi-
- *
,--{D,**-.
ffi€
-+ih á-
minación incorrecta de la densidad, que sugería que la disposición de
la molécula de DNA era más compacta de 1o que en realidad es.
PurÍficación del DNA
Patrones de difracción de rayos X (Nota sobre técnicas 11.1), la
mayoría de los cuales fueron producidos por Rosalind Franklin, y I I
qué revelaron el carácter helicoidal de la estructura e indicaron algu- a0
p"^oco
nas de las dimensiones claves dentro de la hélice. 0
Las relaciones de bases, que habían sido descubiertas por Erwin
oooo
Chargaff de la Universidad de Columbia, Nueva York. Este investigador 0
realiióuna larga serie de estudios cromatográficos de muestras de DNA 0 H tratamiento ácido leve oO
de diversas fuentes y mostró que, aunque los valores son diferentes en rompe los enlaces fosfodiéster

distintos organismos, la cantidad de adenina es siempre igUal a la can-

tidad de timina y la cantidad de guanina equivale a la cantidad de cito-
ll
oo^
sina (figUra 1.7). Estas relaciones de bases dieron origen a las reglas de
apareamiento de bases, que son la clave para descubrir la estructura de
oO o^-
O*-
o?ooS
\) C"
doble hélice. Cromatografía Para

II
cuantifi car cáda nucleótido
La construcción del modelo, que fue la única técnica importante que
Watson y Crick practicaron por sí mismos. Los modelos en escala de
posibles estructuras de DNA permitieron controlar la posición rela- Relación de bases Relación de bases
iiva de los diversos átomos, asegurar que los pares que formaban A:T I,OO A:T ¡'09
enlaces no estuvieran demasiado separados y que otros átomos no G:C 1,00 G:C 0.99
estuvioran-demasiado cerca para interferir entre sí.

{*r*cterístíczs cloves de lo doble hélice

Figura 1.7 Experimentos sobre rela-
La doble hélice es dextrógira, lo que significa que si fuera una escalera en ciones de bases efectuados Por
espiral y usted la estuviera subiendo, la baranda del lado externo de la esca- Chargaff. Se extrajo DNA de diversos
leia estaría a su derecha. Las dos cadenas transcurren en direcciones orpanismos v se lo trató con ácido
opuestas (figura 1.8A). La hélice es estabilizada por dos tipos de interac- oa"ra hidrolizár los enlaces fosfodiéster
ciones químicas: y lib"rur los nucleótidos individuales.
Después, se cuantificó cada nucleóti-
r Apáreamiento de bases entre las dos cadenas, que implica la formación do por cromatografía. Los datos
de enlaces de hidrógeno entre una adenina de una cadena y una timina muestran algunos de los resultados
reales obten'ídos por Chargaff. Éstos
de la otra, o entre una citosina y una guanina (figura 1.8B). Los enlaces
indican que, dentro del error experi-
de hidrógeno son atracciones electrostáticas débiles entre un átomo mental, la cantidad de adenina es
electronegativo (como oígeno o nitrógeno) y un átomo de hidrógeno igual que la de timina y la cantidad de
unido a un segundo átomo electronegativo. Los enlaces de hidrógeno guanina es igual que la de citosina.
son más largos que los enlaces covalentes y mucho más débiles, con
energías de enlace típicas de 1-10 kcal mol-1 a 25"C, en comparación
con hasta 90 kcal mol-1 para un enlace covalente. Los enlaces de hidró-
geno estabilizan la estructura secundaria de las proteínas, así como la
doble hélice de DNA. Las dos combinaciones de bases -base A aparea-
da con T y base G apareada con c- explican las relaciones de bases des-
cubiertas por Chargaff. Éstos son los únicos pares de bases permisibles,
en parte, por las geometrías de las bases de nucleótidos y las posiciones
relativas de los átomos que pueden participar en los enlaces de hidróge-
no, y, en parte, porque el par debe estar entre una purina y una pirimi-
dina: un par purina-purina sería demasiado grande para caber denko de
la hélice y un par pirimidina-pirimidina sería demasiado pequeño.
. Apilamiento de baóes, denominado a veces interacciones 7E-78, que
implica interacciones hidrófobas entre pares de bases adyacentes y
suma estabilidad a la doble hélice luna vez que las cadenas se han
unido por apareamiento de bases. Estas interacciones hidrófobas sur-
 -1
F

l2 Capítulo I Genomas, transcriptomas y proteomas

(A) Par de bases Extremo 5' Extremo 5'

Figura 1.8 Estructura de doble héli-
ce del DNA. (A) Dos representacio- 0:
nes de la doble hélice. En la
estructura de la izquierda, se mues-
tran con los "esqueletos" de azúcar- f

fosfato de cada polinucleótido

4'
dibujados como una cinta gris, con los
pares de bases en verde. A la dere-
cha, se presenta la estructura química
de tres pares de bases. (B) La base A Surco \
meaof ,/
Esqueleto de
azúca r-fosfato
0,
se aparea con T y la base C, con C.
Se delinean las bases y las líneas de
puntos indican los enlaces de hidró-
geno. Obsérvese que un par de bases
C-C tiene tres enlaces de hidrógeno,
mientras que un par de bases A-T
Surco \
mayor ,/
tiene sólo dos.

Enlaces de
hidrógeno

(B)

Timina (T) ACenina (A) Citosina (C ) Cuanina (6)

,/

-n-ü {,-|.=l
¡r ( MÚCAR
, \^ -N
AzUCAR

gen porque la estructura acuosa con enlaces de hidrógeno fuerza a

los grupos hidrófobos hacia las partes internas de una molécula.

Tanto el apareamiento como el apilamiento de bases son importantes para

mantener juntos los dos polinucleótidos, pero el apareamiento tiene mayor
significación debido a sus implicaciones biológicas. La limitación de que
sólo se pueden aparear las bases A con T y G con C implica que la replica-
ción del DNA puede determinar copias perfectas de una molécula madre a
través del simple recurso de utilizai las secuencias de las cadenas preexis-
tentes para imponer las secuencias de las nuevas cadenas. Esto es la sínte-
sis de DNA dependiente del molde y es el sistema utilizado por todas las
DNA polimerasas celulares (sección 15.2.2). Por lo tanto, el apareamiento
de bases permite que las moléculas de DNA se repliquen por un sistema
tan simple y delicado que, en cuanto Watson y Crick publicaron la estruc-
tura de la doble hélice, todos los biólogos se convencieron de que los genes
están realmente compuestos por DNA.

La doble hélice tiene flexíbilidad estructuro{

La doble hélice descrita por Watson y Crick, presentada en la figura 1.84,
se denomina forma B de DNA. Sus características típicas residen en sus
dimensiones: un diámetro de la hélice de 2,37 nm, un aumento de O,34
nm por par de bases y un paso (pitch) (la distancia abarcada por un giro
 tt

Cuadro t.l Características de las diferentes conformaciones de la doble hélice de DNA

Tipo'de hélice Dextrógira Levógira

Diámetro de la hélice (nm) 2,37 1,84
Aumento por par de bases (nm) o,34 o,37
AE
Distancia por giro completo 5,+
(paso pftchl) (nm)
Número de pares de bases por giro 10 t,t_, 12
completo
Topología del surco mayor Ancho, profundo Angosto,'profundo Plano
Topólogía del surco menor Angosto, superficial Ancho, superficial Angosto, profundo

4,,

completo de la hélice) de 3,4 nm, que se corresponde con_diez pares de

bases por giro. Se considera que el DNA de las células vivas consiste pre-
dominantemente en esta forma B, pero ahora ha quedado claro que las
moléculas de DNA genómico no tienen una estructura por completo uni-
forme. Esto se debe, sobre todo, a que cada nucleótido de la hélice tiene
la flexibilidad de adoptar formas moleculares algo diferentes. Para adop-
tar estas conformaciones distintas, deben cambiar ligeramenteflas posicio-
nes relativas de los átomos del nucleótido. Hay una serie de posibilidades,
pero los cambios de conformación más importantes implican rotación
alrededor del enlace B-N-glucosídico, 1o que cambia la orientación de la
base respecto del adtcar,y rotación en torno del enlace entre los carbonos
3' y 4'.Ambas rotaciones ejercen un efecto significativo sobre la doble
hélice: la modificación de la orientación de las bases influye en la posición
relativa de los dos polinucleótidos y la rotación alrededor del enlace 3'-4'
incide en la conformación del esqueleto de azúcar-fosfato.

Por lo tanto, las rotaciones dentro de nucleótidos individuales inducen

cambios importantes en la estructura global de la hélice. Desde la déca-
da de 1950, se reconoció que ocurren cambios en las dimensiones de la
doble hélice cuando las fibras que contienen moléculas de DNA son
expuestas a diferentes humedades ielativas. Por ejemplo, la versión
modificada de la doble hélice denominada forma A (figura 1.9) tiene un
diámetro de 2,55 nm, un aumento de O,29 nm por par de bases y un
paso de 3,2 nm correspondiente a 1 1 pares de bases por giro (cuadro
1.1). Otras variaciones son B'-, C-, C'-, C"-, D-, E- y T-DNA. Todas
estas hélices son dextrógiras como la forma B. También es posible una
reorganización más drástica, que da origen al Z-DNA levógiro (figura
1.9), una versión más delgada de la doble hélice con un diámetro de sólo
1,84 nm.

Las dimensiones directas de las diversas formas de la doble hélice no

revelan 1o que, talvez, sean las diferencias más significativas entre ellas.
Estas se relacionan no sólo con el diámetro y el paso, sino con el grado
de acceso a las regiones internas de la hélice desde la superficie de la
estructura. Como se muestra en las figuras 1.8 y 1.9, la forma B del
DNA no tiene una superficie totalmente lisa, sino que dos surcos trans-
curren en espiral a lo largo de la hélice. Uno de estos surcos es bastan-
te ancho y profundo, y se lo denomina surco mayor; el otro es angosto
y menos profundo, es el surco menor. El A-DNA también tiene dos sur-
cos (figura 1.9) pero, en esta conformación, el surco mayor es aún más
 Capltulo I Cenomas, transcriptomas y proteomas

Figura I.9 Estructuras del B-DNA

(izquierda), el A-DNA (centro) y el
Z-DNA (derecha). Modelos espacia-
les (arriba) y modelos estructurales
(abajo) que representan diferentes
conformaciones de las moléculas de
DNA. Obsérvense las diferencias del
diámetro de la hélice, del número de
pares de bases por giro completo, y
de Ia topología de los surcos mayor y
menor, entre estas moléculas.
Reimpreso con autorización de
Kendrew, J. (Ed.) Encyclopoedio of
Moleculor Biology. O 1994 Blackwell
Publishing.

-ffr.
r --.-t -*ir-
l)+:_.

Wr-'-
aaE .--
'. d:
., --\
-:--t: :_

.
J'1
,, -.F.--._,a

profundo y el surco menor es más superficial y más ancho, en compara-

ción con el B-DNA. También el Z-DNA es diferente, con un surco casi
inexistente, pero el otro es muy angosto y profundo. En cada forma de
DNA, parte de la superficie interna de por lo menos uno de los surcos
está formada por grupos químicos unidos a las bases nucleotídicas. En
el capítulo 11 se verá que la expresión de la información biológica con-
tenida en el genoma está mediada por proteínas de unión al DNA, que
se unen a la doble hélice y regulan la actividad de los genes contenidos
en ésta. Para cumplir su función, cada proteína de unión al DNA debe
estar fijada en una posición específica, cerca del gen sobre cuya activi-
dad debe influir. Esto se puede lograr, al menos con cierto $ado de exac- ñ
titud, si la proteína alcanza el fondo del surco, dentro del cual se puede
"leef' la secuencia de DNA sin abrir la hélice'rompiendo los pares de {
bases. De esto se deduce que una proteína de unión al DNA, cuya
estructura le permite reconocer una secuencia nucleotídica específica a
#
dentro del B-DNA, por ejempTo, quizá no pueda reconocer esa secuen-
*
-
 RNA y transcriPtoma t5

cia si el DNA ha adoptado una conformación diferente. Como se anali- (A) Ribonudeóüdo
zará enel capítulo 11, las variaciones de conformación a lo largo de una 0- 0- 0-
áolécula de-DNA, junto con otros polimorfismos estructurales causados -o-É-o-p-o-i-o-tn, Ef
oor la secuencia nucleotídica, podrían ser importantes para determinar ll ll ll l-0-l
ia especificidad de las interacciones entre el genoma y sus proteínas de 00ocÍF.ct'
unión al DNA. úH,l
OH ÜH

(B) Uracilo
:.2 RNA y transcriPtoma 0
ti

El producto inicial de la del genoma es el transcriptoma

expre_sión _L.
(véáse figura 1.2), el conjunto de moléculas de RNA derivadas de los
HN- -cit
ll
g"r". qué codifican proteínas, cuya información biológica es requerida t
0-¿c -'N -clf
ior Ia en un momento particular. Las moléculas de RNA del
^transcriptoma,
"élulu así como muchos otros RNA derivados de genes que no I

codifican proteínas, son sintetizadas por el proceso denominado trans-

cripción. En esta sección se examina la estructura del RNA y, después,
se ánatzan más de cerca los diversos tipos de molécula de RNA presen- Figura l.t0 Diferencias químicas
enlre DNA y RNA. (A) El RNA contie-
tes en las células üvas.
ne ribonucleótidos, en los que el azú-
car es ribosa en lugar de
2'-desoxirribosa. La diferencia es que
1.2.1 Estructura del RNA se une un grupo oxhidrilo, en vez de
El RNA es un polinucleótido similar al DNA, pero con dos diferencias un átomo de hidrógeno, al carbono 2'.
químicas impoitantes (figura 1.10). Primero, el azúcar del nucleótido de (B) El RNA contiene la pirimidina
RNA es riboia y, segundo, el RNA contiene uracilo en lugar de timina. Por denominada uracilo, en lugar
de timina.
lo tanto, los cuatro sustratos nucleotídicos para la síntesis de RNA son:
" adenosina 5'-trifosfato
, citidina 5'-trifosfato
guanosina 5'-trifosfato
t uridina 5'-trifosfato

Estos nucleótidos se abrevian ATP, CTP, GTP y UTP, o A, C, G y U, res-

pectivamente.

Al igual que el DNA, los polinucleótidos RNA contienen enlaces fosfodiés-

ter 3'-5',-pero estos enlaces son menos estables que los de un polinucleó-
tido DNA, debido al efecto indirecto del grupo oxhidrilo eh la posición 2'
del azlcar. Rara v€2, las moléculas de RNA tienen más que unos pocos
miles de nucleótidos de longitud y, aunque muchas forman pares de bases
intramoleculares (p. ej., véase figura 13.2),la mayoría es de una sola cade- DNA 3'ryTACCCAACGCAATTC s 5'

na y no de doble cadena. Alr6!*

5' 3'
R ¡".1 /r:

I
Las enzimas responsables de la transcripción de DNA a RNA se denomi +
I
nan RNA polimerasas dependientes de DNA. El nombre indica que la
reacción ettzimáttca que catalizan determina la polimerización del RNA a 5' *T4999+l9GcAArrc # 5'
ÁUGGGUUG _*
partir de ribonucleótidos y que este proceso és dependie¡rte del DNA, lo 5' 3'
que significa que la secuencia de nucleótidos de un molde de DNA impo-
ne la secuencia de nucleótidos del RNA sintetizado (figura 1.11). Se per-
mite acortar el nombre de la enzima a RNA polimerasa, pues el contexto
en el que se emplea el nombre implica que rara vezhay confusión con las
Figura l.lI
Síntesís de RNA dePen-
diénte del molde. El transcrito de
RNA polimerasas dependientes de RNA, que participan en la replicación RNA es sintetizado en direcciÓn
y la expresión de los genomas de algunos ürus. La base química de la sín- 5'-->3',leyendo el DNA en l¿i dirección
iesis dé RNA dependiente del molde es equivalente a la ilustrada para la 3'-+5'; ei apareamiento de bases al
síntesis de DNA en la figura 1.6. Se aglega un ribonucleótido tras otro al molde de DNA determina la secuen-
extremo 3' creciente del transcrito de RNA y la identidad de cada nucleó- cia del transcrito.
 -
t6 Capltulo I Cenomas, transcriptomas y proteomas

tido está especificada por las reglas de apareamiento de bases: la base A se-
aparea con T o U, la base G se aparea con C. Durante la incorporación de
cada nucleótido, se eliminan los fosfatos B y y del nucleótido entrante, así
como el grupo oxhidrilo del carbono 3' del nucleótido del final de la cade-
na, precisamente igual que en la polimerización del DNA.

1.2.2 Contenido de RNA de la célula

Una bagteria típica contiene de 0,05 a 0,10 pg de RNA, que representan
alrededolllel60/o de su peso total. Una célula de mamífero, que es mucho
más grande, contiene más RNA, de 20 a 30 pg en total, pero esto repre-
senta sólo el lo/o de toda la célula. La mejor manera de conocer el conte-
nido de RNA de una célula es diüdirlo en categoúas y subcategorías según
su función. Si bien hay varias maneras de hacerlo, el esquema más infor-
mativo es el que se muestra en la figura l.12.La división primaria es entre
RNA codificante y RNA no codificante. El RNA codificante es el trans-
criptoma y está compuesto por sólo una clase de molécula: los RNA men-
sajeros (mRNA), que son transcritos de genes que codifican proteínas y,
por ende, son traducidos a proteínas en el segundo estadio de expresión
del genoma. Los mRNA raravez representan más del 4o/o del RNA total
y tienen vida breve, ya que son degradados poco después de su síntesis.
Los mRNA bacterianos presentan semividas de no más de algunos minu-
tos y la mayoría de los mRNA eucariontes son degradados unas pocas
horas después de la síntesis. Este recambio rápido significa que la composi-
ción del transcriptoma no está fija y que puede ser reestructurada con rapi-
dezpor modificación de la velocidad de sintesis de mRNA individuales.

El segundo tipo de RNA se denomina "no codificante", dado que estas molé-
culas no son traducidas a proteínas. Sin embargo, RNA frméional es un nom-
bre mejoq pues destaca que, aunque no forma parte del transcriptoma, el
RNA no codificante cumple, aun así, funciones esenciales dentro de.la célu-
la. Hay varios tipos de RNA funcional, de los cuales los más importantes son:
r RNA ribosómicos (rRNA). Están presentes en todos los organismos
y,por lo general, son los RNA más abundantes de la célula; represen-
tan hasta más del 8Oo/o del RNA total de las bacterias que se dividen
activamente. Estas moléculas son componentes de los ribosomas, las
estructuras en las que tiene lugar la síntesis proteica (sección 13.2).
. RNA de transferencia (IRNA). Son moléculas pequeñas que tam-
bién participan en la síntesis proteica y, al igual que el rRNA, se
encuentran en todos los organismos. La función de los IRNA es
transportar aminoácidos al ribosomay garantizar que éstos se unan

f,

WM
Todos los organismos

t solo eucariontes

w
:
, :
,,*....*.".!.,. .
* 4;,,"*s

lli ij
til
t.;i

Figura l.I2 Conten¡do de RNA de

. @@@ ?i
@E@@
una célula. Este esquema muestra
.

,,
=:
i:
i:
los tipos de RNA presentes en todos :,
los organismos y aquellas categorías
halladas sólo en células eucariontes. @ @tq
*if
+
€
RNA y transcriptoma t7
*s
=§

§;
€
en el orden especificado por la secuencia nucleotídica del mRNA que
É
:€ está siendo traducido (sección 13.1).
RNA nucleares pequeños (snRNA, denominados también U-RNA
=* porque estas moléculas son ricas en nucleótidos de uridina). Se
encuentran en el núcleo de los eucariontes. Estas moléculas partici-
pan en el corte y empalme, uno de los pasos claves de los eventos de
procesamiento que convierten los transcritos primarios de genes que
codifican proteínas en mRNA (sección 12.2.2).
RNA nucleolares pequeños (snoRNÁ). Se hallan en las regiones
nucleolares de los núcleos eucariontes. Tienen una participación cen-
tral en la modificación química de las moléculas de rRNA al dirigir a
las enzimas que realizan las modificaciones de los nucleótidos espe-
cíficos donde se deben efectuar alteraciones, como el agregado de un
grupo metilo (sección 12.2.5).
MicroRNA (miRNA) y RNA interferentes pequeños (siRNA). Son
RNA pequeños que regulan la expresión de genes individuales (sec-
ción 12.2.6).

Pr*cesat?:!e*:Éo d*i 3H,€ fr*{ur=+r

=,="5
Las células, además de los RNA maduros mencionados, también contie-
nen moléculas precursoras. Muchos RNA, sobre todo en los eucarion-
tes, se sintetizan al principio como RNA precursor o pre-RNA, que debe
ser procesado antes de que pueda cumplir su función. Los diversos fenó-
menos de procesamiento, todos los cuales se comentan en el capíttio 12,
son los siguientes (figura 1.13):
* Las modifieaciones terminales ocurren durante la síntesis de mRNA
eucariontes, la mayoría de los cuales tienen un solo nucleótido
inusual, denominado caperuza o casquete unido al extremo 5'y una
cola de poli(A) unida al extremo 5'.
* El corte y empalme es la eliminación de segmentos del interior de un
RNA precursor. Muchos genes, sobre todo de eucariontes, contienen
segmántos internos que nó contienen información biológica. Éstos se
denominan intrones y, cuando se transcribe el gen, se los copia junto
con los exones que contienen información. Los intrones son extraí-
dos del pre-mRNA mediante reacciones de corte y unión. El pre-
RNA no empalmado forma la fracción de RNA nuclear denominado
RNA nuclear heterogéneo (hnRNA).
* Los eventos de corte son de particular importancia en el procesa-
miento de los rRNA y los tRNA, muchos de los cuales son sintetiza-
dos, al principio, a partir de unidades de transcripción que
especifican más de una molécula. Por lo tanto, se deben cortar en

Prf_RiljA*-**-*<.@

terminal
Modificación Corte yempalme Corte Modificación química
Sección Secciones Secciones Secciones
12.2.1 t2.2.2y 12.1.3 y 12.1.3y
12.2.4 ::12.2.3
12.2.3 :12.2.5
I

.12.2.5 Figura 1.13 Esquema de los cuatro

tipos de fenómeno de procesa-
'l
I
miento del RNA. No todos los
Cola de poli(A) Posición del intrón Nuevo grupo químico fenómenos tienen lugar en todos
eliminado los organismos.
 Capítulo I Genomas, transcriptomas y proteomas
c 00-
+ figura 1.2), el repertorio de proteínas de la célula, que especifica el
H=N- c <H
R
Figura I.14 Estructura general de
un amínoácido. Todos los aminoáci-
dos tienen la misma estructura gene-
ral, que consiste en un carbono a
central unido a un átomo de hidróge-
no, un grupo carboxilo, un grupo
amino y un grupo R. El grupo R es
diferente para cada aminoácido
(véase figura 1 .18).
fragmentos los pre-rRNA y los pre-tRNA para producir los RNA
maduros. Este tipo de procesamiento ocurre tanto en procariontes
como en eucariontes.
. Los rRNA, los IRNA y los mRNA sufren modificaciones químicas.
Los rRI§A y los tRNA de todos los organismos son modificados por
agregado de nuevos grupos químicos a nucleótidos específicos den-
tro de cada RNA. La modificación química del mRNA, denominada
edición del RNA, ocume en muchos eucariontes.
!.3.4 ?ra::s*ript*se*
Si bien el transcriptoma representa menos del4o/o del RNA total de la
célula, es el componente más significativo, porque contiene el RNA
codificante que participa en el siguiente estadio de expresión del geno-
ma. Cabe destacar que el transcriptoma nunca es sintetizado de novo.
Toda célula recibe parte del transcriptoma de su progenitora cuando se
origina por primera vez, por división celular, y mantiene un transcrito-
ma durante toda su vida. Aun células latentes en esporas bacterianas o
en semillas de plantas tienen un transcriptoma, aunque su traducción a
proteínas puede estar desactivada por completo. Por lo tanto, la trans-
cripción de cada gen que codifica proteínas no determina la síntesis del
transcriptoma, sino que lo mantiene reemplazando mRNA que han sido
degradados y desencadena cambios en Ia composición del transcriptoma
a través de la activación y la desactivación de diferentes grupos de genes.
Aun en los organismos más simples, como bacterias y levaduras, hay
muchos genes activos alavez. Por ende, los transcriptomas son comple-
jos y contienen copias de cientos, si no miles, de mRNA diferentes. Por
lo general, cada mRNA representa sólo una pequeña fracción del con-
junto y el tipo más común raÍavez contribuye a más del lo/o del mRNA
total. Las células que tienen funciones bioquímicas muy especializadas,
reflejadas por transcriptomas en los que predominan uno o unos pocos
mRNA, constituyen excepciones. Por ejemplo, las semillas de trigo sin-
tetizan y acumulan grandes cantidades de proteína gliadina, que propor-
cionan una fuente de aminoácidos para el grano en germinación. Dentro
de las semillas en desarrollo, los mRNA de gliadina pueden representar
hasta el 3Oo/o de los transcriptomas de ciertas células.
El segundo producto de expresión del genoma es el proteoma (véase
carácter de las reacciones bioquímicas que ésta es capaz de realizar.
Estas proteínas son sintetizadas por traducción de las moléculas de
mRNA que forman el transcriptoma.
:.3.1 Estru¡eÉura prst€¡e*
Una proteína, al igual que una molécula de DNA, es un polímero lineal, no
ramificado. En las proteínas, las subunidades monoméricas se denominan
aminoácidos (figura 1.t4) y los polímeros resultantes, o polipéptidos, rara
vez tienen más de 2.OOO unidades de longitud. Como en el caso del DNA,
las características claves de la estructura proteica se determinaron en la
primera mitad del siglo xx; esta fase de la bioquímica proteica culminó en
la década de 1940 y principios de la de 1950 con el esclarecimiento, por
Pauling y Corey, de las principales conformaciones, o estructuras secunda-
rias, adoptadas por los polipéptidos. En los últimos años, se ha centrado
 Proteínas y proteoma 19

el interés en el modo de combinación de estas estructuras secundarias para R. R,

generar las formas tridimensionales, complejas, de las proteínas.

* l'
n.N-f-coo- + * l'
HrN-i-coo-
HH
Los cuotro niveles de la estrucfuro proteico
Tradicionalmente, se considera que las proteínas tienen cuatro niveles l*'.0
de estructura. Estos niveles son jerárquicos y la proteína se construye R. R,
estadio por estadio cadanivel de estructura depende del inferior: t'l'
* 'l., lExr€mo
La estructura primaria de la proteína está compuesta por la unión de Exiremc
H - H c¿rb,:xilo
amino
los aminoácidos en un polipéptido. Los aminoácidos están unidos
por enlaces peptídicos, formados por una reacción de condensación
entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de un
segundo aminoácido (figura 1.15). Obsérvese que, al igual que en un
polinucleótido, los dos extremos del polipéptido son químicamente Figura l.l5 En los polipéptidos,los
distintos: uno tiene un grupo amino libre y se denomina extremo aminoácidos están unidos por enla-
amino, NHz- o N; el otro tiene un grupo carboxilo libre y se deno- ces peptídicos. La ilustración mues-
mina extremo carboxiloTCOOH- o C. Por lo tanto, la dirección del tra la reacción química que tiene
lugar entre dos aminoácidos que se
polipéptido se puede efpresar como N->C (de izquierda a derecha en unen por un enlace peptídico. La
la figura 1.15) o C+N (de derecha a izquierda en la figura 1.15). reacción se denomina condensación
. La estruetura seeundaria hace referencia a las diferentes conforma- porque provoc¿ la eliminación de agua.
ciones que puede adoptar el polipéptido. Los dos tipos principales de
estructura secundaria son la hélice cr y la hoja B (figura 1.16). Estas
son estabilizadas sobre todo por enlaces de hidrógeno que se forman
entre distintos aminoácidos del polipéptido. La mayoría de los poli- (A) Hélice o (B) Hoia F
péptidos son suficientemente largos para plegarse. en una serie de
estructuras secundarias, uno después de otro a lo largo de la molécula. Enlace de H

. La estructura terciaria obedece al plegamiento de los componentes de la

estructura secundaria del polipéptido en una configuración tridimensio-
nal (figura l.l7).La estructura terciaria estabilizada por diversas fuerzas
químicas, como enlaces de hidrógeno entre aminoácidos indiüduales,
interacciones electrostáticas entre los grupos R de los aminoácidos con
carga (véase figura 1.18) y fuerzas hidrófobas, que imponen que los ami-
noácidos con grupos laterales no polares ("sin afinidad por el agua") que-
Enlace de H
den resguardados del agua dentro de las regiones intemas de la proteína.
Támbién puede haber enlaces covalentes denominados puentes disulfuro
entre residuos de aminoácidos cisteÍna en diversos lugares de polipéptido.

" La estruetura cuaternaria consiste en la asociación de dos o más poli-

péptidos, cada uno plegado en su estructura terciaria, erl una proteína
de múltiples subunidades. No todas las proteínas forman estructuras
cuatemarias, pero éstas son una característica de muchas proteínas
con funciones complejas, incluidas varias que participan en la expre-
sión del genoma. Algunas estructuras cuaternarias se mantienen uni-
das por puentes disulfuro entre los diferentes polipéptidos y forman
proteínas de múltiples subunidades estables que no pueden ser
degradadas con facilidad en sus partes componentes. Otras son aso-
Figura 1.16 Las dos unidades
ciaciones más laxas de subunidades estabilizadas por enlaces de hidró-
estructurales secundarias principa-
geno y efectos hidrófobos, 1o que significa que estas proteínas pueden les halladas en las proteínas: (A) Ia
revertir a sus polipéptidos componentes o cambiar la composición de hélice cr y (B) Ia hoja B. Bosquejo de
sus subunidades según los requerimientos funcionales de la célula. Ias cadenas polipeptídicas. Se han
omitido los grupos R para que resulte
más claro. Cada estructura está estabi-
La díversídod de los omínoácido.s es /a bose de la diversídad de lizada por enlaces de hidrógeno (H)
las proteínas entre grupos C:O y N-H de diferen-
tes enlaces peptídicos. La conforma-
Desde el punto de vista funcional, las proteínas difieren porque los amino-
ción en hoja B mostrada es
ácidos que las componen son, en sí mismos, químicamente diversos. Por lo antiparalela; las dos cadenas transcu-
tanto, diferentes secuencias de aminoácidos dan por resultado distintas rren en direcciones opuestas. También
combinaciones de reactiüdad química, que imponen no sólo la estructura hay hojas p paralelas.
 Capítulo I Ce¡omas, transcriptomas y proteomas

Exireno iv
global de la proteína resultante, sino también la posición sobre la superfi-
cie de la estructura de los grupos reactivos que determinan las propiedades
químicas de la proteína.

La diversidad de los aminoácidos deriva del grupo R, pues esta parte es

diferente en cada aminoácido y varía mucho de estructura. Las proteí-
nas se forman a partir de un conjunto de 20 aminoácidos (figura 1.18;
cuadro 1.2). Algunos de ellos tienen grupos R que son estructuras
pequeñas, relativamente simples, como un solo átomo de hidrógeno (en
el aminoácido llamado glicina) o un grupo metilo (alanina). Otros gru-
pos R son grandes cadenas laterales aromáticas, complejas (fenilalanina,
triptófano y tirosina). La mayoría de los aminoácidos no tienen carga,
pero dos presentan carga negativa (ácido aspártico y ácido glutámico) y
tres, carga positiva (arginina, histidina y lisina). Algunos aminoácidos
Figura l.I7 Estructura terciaria de son polares (p. ej., glicina, serina y treonina), otros son no polares (p.
una proteína. Esta estructura de una ej., alanina, leucina y valina).
proteína imaginaria consiste en tres
hélices o, ilustradas como espirales y
una hoja p de cuatro cadenas, indica- Los veinte aminoácidos mostrados en la figura 1.18 son los que se con-
da por las flechas. sidera, convencionalmente, que están especificados por el código gené-
tico (sección 1.3.2). Por lo tanto, son los aminoácidos que están unidos
cuando las moléculas de mRNA son traducidas a proteínas. Sin embar-
go, estos 20 aminoácidos no representan, por sí mismos, el límite de la
diversidad química de las proteínas. La diversidad es aún mayor debido
a dos factores:

//l-\
(A) Grupos R no polares
\\ CH¡
\/
2-"- I

'\./
HTC CH¡
H<C
CH
I
¡
CH¡
CH¡
I

CHz

I
HzC
-
HN..
t
CHz

,CHz t-)
Y
'*t
/t
HC
-C
I

I
s
I

CHz

CH: CH CHz HsC-CH H COo- cHz CHz CHz

I I I I I I I

I
OH
(B) Grupos R polares O NHz

,z\ \,,'c
HO CH: SH
til
\--'
O
\,/'c
NHz
I

CHz

I I I I I I

H CHz HO- CH CHz CHz CHz CHz

I I I I I I I
Cili:i¡r¿l 5e¡il ¡ I ritiJitiirai ilrleii¡: Tlir¡;iir¡¡ Iljillir:ti!li, Cilr¡r¡nir.;

(C) Grupos R con carga negativa (D) Grupos R con carga positiva

NHz

*l
H¡N C:N+Ha
II
CHz NH
00-
\,,
.C ll+
CHz CHz HN
00-
\,/'c I I
CHz
ICHz ,r('N-C-cH ll
Figura 1.I8 Crupos R de los amino-
ácidos. Se considera, convencional- I
CHz

I I I HI
mente, que estos 20 aminoácidos cHz CHz CHz CHz
ttl
CHz

están especificados por el código I I

genético. A;ico rsp;i-iil,: Áriir ¡lui.rril: Lt:tn.: Álit:r¡¡tr- Hr;:riir;:
---
Proteínas y proteoma 2I

Cuadro 1.2 Abreviaturas de los aminoácidos H

C-CH?
l' \'
N.tcH''. C- CH¡
H
Aminoácido :

Alanina Ala
^
Arg R NH
Arginina
Asparagina Asn N I

CHz
Ácido asPártico AsP E I

CHz
Ácido glutámico Clu D
I

Cisteína Cys C SeH CHz

,, Clutamina Cln a I I

CHz CHz
Llrcrna clv c
I I

Histidina His H Selenocisteína Pirrolisina

lsoleucina lle I

I Leucina Leu L

Lisina .Lys V
t\ Figura l.l9 Estructura de la seleno-
cisteína y la pirrolisina. Las partes
Metionina Met M mostradas en pardo indican las dife-
Fenilalanina Phe F rencias entre estos aminoácidos y la
cisteína y la lisina, respectivamente.
Prolina Pro P
: Serina Ser S

: Treonina Thr T
Triptófano TrP W
Tirosina Tyr
Valina Val

Durante la síntesis proteica, se pueden insertar, por lo menos, otros

dos aminoácidos: selenocisteína y pirrolisina (figura 1.19), en una
cadena polipeptídica; su inserción está dirigida por una modificación
de la lectura del código genético (sección 13.1.1).
Durante el procesamiento de las proteínas, algunos amin'oácidos son
modificados por el agregado de nuevos gn¡pos químicos; por ejem-
plo, por acetilación o fosforilación, o por unión de una gran cadena
lateral formada por unidades de azúcar (sección 13.3.3).

Por lo tanto, las proteínas muestran un inmenso grado de variabilidad

química, parte de la cual está directamente especificada por el genoma,
mientras que el resto surge del procesamiento de las proteínas.

; "5"3 Fr*:te+sr¡a
El proteoma comprende todas las proteínas presentes en una célula en
un momento determinado. Se considera que una célula "típica" de
mamífero; por ejemplo, un hepatocito, contiene de 10.000 a 20.000 pro-
teínas diferentes, alrededor de 8 Y 109 moléculas indiüduales en total,
lo que representa cerca de 0,5 ng de proteína o l8-2Oo/o del peso celu-
lar total. El número de copias de cada proteína varía enormemente, de
menos de 20.000 moléculas por célula, para los tipos más raros, hasta
100 millones de copias, para los más comunes. Se considera que cual-
quier proteína que está presente con un número de copias superior a
50.000 por célula es relativamente abundante y, en la célula promedio
CapÍtulo I Genomas, transcriptomas y proteomas

catego-
de mamífero, alrededor de 2.000 proteínas caen dentro de esta
tipos de células de-
úa. Cuando se examinan los proteómas de diferentes
Áamíferos, se observan .rr,ry po"ut diferencias entre estas proteína-s
abundantes, lo que sugiere qü"ju mayoría de ellas son
proteínas consti-
ilti";. que'realiza., uJtirridudes bioquímicas generales tienen lugar
la -qyg su función
en todas las células. Las proteínas q,r" aportan a célula.
á.p""iá¡ru¿a suelen ser bástante raras, aunque hay excepciones, como
i;Jil;a;cantidades de hemoglobina presente sólo en los eritrocitos.

Relación entre transcriptoma y proteomo

da lugar a
El flujo de información del DNA al RNA por transc{P:ión no
á*icultad conceptual.- I os polinucleótidos DNA y RNA tienen
"i"gJ"" muy similar". y fácil cómprender cómo se puede hacer una
".tá"t,rru. "r
áápáÑe de ün g"n m"diarrte síntesis áependiente del molde, utilizando
hemos,familiarizado'
^i, reglas de aparJamiento de bases con las que nos la cual las moléculas
ias
,"Sr;¿á fase de ia expresiOn del genoma, áurante
menos fácil
de mRNA del transcriptáma dirigen'ía síntesis de proteínas,-es
sóló las estructuras áe las moléculas involu-
de entender si se
"o.rrid".un
A principios de la década de 1950, noco {999ués del descubri-
miento de^ la estructura de doble hélice, vários biólogos moleculares
"ru¿ut.
a
intentaron diseñar posibles modos de unión ordenada de aminoácidos
por algunos enla-
;ÑÁ, pero todos estos esquemas contenían 1o
Tgno:
con
;; Ñ áebían ser más cortois o más largos qyá posible, de acuerdo
1o
iu. fÉv", iirlcoquímicas, y cada idea fue áesechada en silencio. Finalmente,
ii tésl, Franóis Crickéomenzó a aclarar la confusión al predecir la exis-
iencia de una molécula adaptadora que formaría un puente entre el mRNA
V sintátizado^. Poco déspués se advirtió que estas moléculas
eran los IRNA y, qna vez establecido este hecho, se adqtirió
"ip.fipCptido
á¿áp,"ááiár
de las
con rapidez un conácimiená detallado del mecanismo de síntesis
proteínas. Este proceso se examina en la sección 13'1'

El otro aspecto de la síntesis proteica que interesaba a los biólogos

t":1:-
Este
culares dé la d¿cada de 195b era el problema de 1a información.
importante del eslabón entre el
hace referencia al segundo
"o*pon"rite
iá"t"tlpt.ma y el pót"o*r' el cOdigo genétlco, que especificade amino- cómo se

traduce la secuencá nucleotídica de un mRNA a la secuencia

que se
ácidos de una proteína. En la década de 1950 se reconoció
que cada_palabra de
;;a;i;r" un código genético de tripletes -uno en el para los-2O
coáificación, o comprendeires nucleótidos- explicar
t "ódó-"r, en las proteínas. Un código de dos letras tendría
uttu¿o.
aminoácido.
;¿ú ¿, = 16 codones, que nó bastan para explicar los 20 aminoácidos,
mientras que un código de tres letras daría 4s = 64 codones.
El código
g."Cti"" füe descifruío la década de 1960, en parte por análisis de
",
io. pÁfipCptidos que surgían de la traducción de mRNA artificiales de
células, y en parte, por
.""ü"rr"iuionocida o preáecible, en sistemas sin de
determinación de qrre urri.roáciáos se asociaban con qué secuencias
ñR, en un análisis basado en ribosomas purificados. Cuando se finali-
zó este trabajo, se advirtió que los 64 codones pefienecían a
grupos
-uyo. (figura 1'20). Sólo el
miembios codificaban él rrir*o aminoácido
iriitáfá". y la metionina tienen un codón cada uno: todos los demás (
cuatro o codones. Esta
aminoácidos son codificados por dos, tres, seis_
I
(degeneracy)'
característica det-codlgo r" á"to-ina redundancia -El I
también tiene Juatro codones de puntuacigl, qI" indican los (
;.,,,1?, il;á" debe comenzar y finalizar
"ááigo lá traducción de 1a secuencia
Por lo general, el codón
I
nucleotídica dentro de un mRÑe (figura 1.2t). (
de iniciaciór, s;-ÁU G-3' , que también especifica la metionina (así, la t
",
mayoría de los polipéptidos rácién sintetizaáos comienzan con metioni-
r
?--

Proteínas y proteoma

§-=l::i:::=+:<
LJUU UCU -.i-==F,.'.3I UAU UGU
::::i:ii: , : Figura 1.20 Código genético. Los

E
::::=:= :l='.t. ::.:,.:= :i ,:
I tt:a
UUC UCC --+=::=::::ar:¡= UAC =;:i:
=.:a¡4,::-:=.i==,::.=:,: aminoácidos son designados con las
UUA
=::ii-=jr=:=-=¡:l
;- =:-==:::
t J CA
a:s:._-jir::
i:ri-=j+=+-:i.i=
=:-::=
:..;:j'=:lÉ.g.:E
UAA UGA ETE abreviaturas estándares, de tres letras
UUG
==i=
=:::i--:i.!'=.::::l;i::l
ucc =-i::

1-==,5=a€i UAG =.É== UGG (véase cuadro 1.2).

{UU L¡*:r.==::+¡.:.,: ccu F=--I:=.==E€§ CAU r-=:ffff1 CGU

5==::,--:i

il
(1)a .=-::r::1=:tr:j=:
rf . =t .=.i. .:= CAC *=====*€eE CGC q1:!==-.. t:=:
='i-..==É-:r';=.=
=:::-1:;-a=::...:::. 4::::-r= =1l r:--.- :1-.:i+:=iii,}=:f i=:
1-.1;,-=5¡;¡5 CCA CAA. CGA
LUU CCG =-j.:=-:i?,.====
i.5=,.ÉJ="=..=§ CAG *t::== CGG *='5=#¡|=.É

=.r*;i;':=..=.:-lr:.:::
ACU l=.Eg{.=€!.1 AAU :--==-j;:.:i::-':l
1:-::=-:i=-::= AGU j-jr.=. .i--'ii=-::=
::-_-:: i r ::-:=:14:ll Lf r .::==l_i:.1-l:=
.t:== AAC
-::=::-;si*l::=
AGC ,.:,i::=::_==::::=
1

AUA
a:r:!.it=--:::.:r.:=i:
t:ri==:r-::t:::=:: ACA =.
"

AAA =j=:=
==-:=-=-===.. AGA ffi
í::l::i= ii' r :li=.:j
r:.!::i::rjil::i::¡
ACG =r*:j.:=:== AAG AGG
:-=-=::= I :-!:r::a:::: : : :F,1=-=.,=.¡t *.-:=á===*i=
-==i'-::ir=:=":= :.:i;:-L:-ii:#-===
GUU GCU :.=::.'= j-':=l GAU E:::::.:::¡É=.:'.;=j GGU ==:-=-a---:::=::-
a ::=--:1:..-'-r:=-

rt 1f =r::==j=.:l-==r=
l
GCC t.==-=-. GAC
é¡-==
-- l::.+-:=:,::: GGC 11.14:sffi.:==
.i:ji,::::.. i I :i:,:::i; ;:':-':'::- -:: ='
;.:-a.===- l
::jrr::::a:-ilr-,:=:jE::::j

a+::+:t:+.1':==::;
:::::==a:i,:.:.::::t:
GCA i,:=;==_=..;;= GAA GGA
il
GCG ;::':ii:':':ti:i::=é GAG GGG =:-=:=!:-::4
:1ii:'.=.::a=:.a=-r: j
tlUU i:-=¿+t=.= i,:-:=-::l=.==:i

na), aunque con unos pocos mRNA se utilizan otros codones como
5'-GUG-3' y 5'-UUG-5'. Los tres codones de terminación son
5'-UAG-3', 5'-UAA-3' y 5'-UGA-5''

Ei códíEo genétíco n0 es universal

Al principio se pensaba que el código genético debía de ser el mismo en
todbs los organismos. El argUmento era que, una vez establecido, sería
imposible que el código cambiara, porque dar un nuevo significado a
cualquier codón aislado determinaría una alteración global de las secuen-
cias de aminoácidos de las proteínas. Este razonamiento parece sólido, de
manera que es sorprendente que, en realidad, el código genético no sea
universal. El código mostrado en la figura 1.20 es válido para la mayoría
de los genes de casi todos los organismos, pero las desviaciones son gene-
ralizadas. En particular, los genomas mitocondriales suelen utilizar un
código no estándar (cuadro 1.3). Esto fue descubierto en 1979 por el
$upo de Frederick Sanger de Cambridge, RU, que observó que varios
mRNA mitocondriales humanos contienen la secuencia 5'-UGA-5', que
en general codifica terminación, en posiciones internas donde no es espe-
rable que se detenga la síntesis proteica. Comparaciones con las secuen-
cias de aminoácidos de las proteínas codificadas por estos mRNA
mostraron que 5'-UGA-5'es un codón de triptófano en las mitocondrias
humanas y que esto es sólo una de cuatro desviaciones del código en este
sistema genético particular. Los genes mitocondriales de otros organis-
mos también presentan desviaciones del código, aunque es probable que
por lo menos una de éstas -el uso de 5'-CGG-3' como codón del triptó-
fano en las mitocondrias de las plantas- sea corregida por edición del üen

RNA (sección 12.2.5) antes de que se produzca la traducción.

También se conocen códigos no estándares para los genomas nucleares de

I
¡r:!i.!A 5';:::;E;1:.:=:;:::E 3'
eucariontes inferiores. A menudo, una modificación se limita sólo a un
pequeño grupo de organismos y suele consistir en reasignación de los codo-
tilr
Codón de iniciación Codón de terminación
nes de terninación (cuadro 1.3). Las modificaciones son menos frecuentes (habitualmente, AUG) (UM, UAG o UCA)
en los procariontes, pero se conoce un ejemplo en especies de Mycoplasma.
Un tipo más importante de variación del código es la reasignación del codón
dependiente del contexto, que ocurre cuando la proteína que debe ser sin-
tetizada contiene selenocisteína o pirrolisina. Las proteínas que contienen Figura l.2l Posiciones de los codo-
nes de puntuación en un mRNA.
pirrolisina son raras y es probable que sólo estén presentes en el grupo de
 I-

Capítulo I Cenomas, transcriptomas y proteomas

Cuadro L3 Ejemplos de desviaciones respecto del código genético estándar

Genomas mitocondriales
Mamíferos UCA Terminación TrP
ACA, ACC Arg Terminación
AUA lle Met
Drosophilo UCA Terminación TrP
ACA Arg Ser
AUA lle Met
Sacch a romyces ce revisioe UCA Terminación TrP
CUN Leu Thr
AUA lle Met
Hongos UCA Terminación TrP
Maíz CCC ArB
'fo
Cenomas nucleares y procaríontes
Varios protozoos UAA, UAC Terminación Cln
Condido cylindroceo CUC Leu Ser
Especies de Micrococcus ACA Arg Terminación
AUA lle Terminación
Especies de Euplotes sp. UCA lermlnacron Cys
Especies de Mycoplosmo sp. UCA Terminación TrP
CCC Arg Terminación
Reasignación del codón dependiente
del contexto
Diversos
UCA Terminación Selenocisteína
Archoeo
UAC lermlnacton Pirrolisina

Abreviatura: N, cualquier nucleótido.

procariontes denominados archaea (capírulo 8), pero las selenoproteínas

están difundidas en muchos organismos; por ejemplo, la enzima glutatión
peroxidasa que ayuda a proteger las células de los seres humanos y otros
mamíferos contra el daño oxidativo. La selenocisteina está codificada por
5'-UGA-3'y la pirrolisina, por 5'-UAG-3'. Por 1o tanto, estos codones tie-
nen un doble significado porque todavía se emplean como codones de ter-
minación en los organismos pertinentes (cuadro 1.3). Un codón 5'-UGA-3'
que especifica selenocisteína se distingue de los verdaderos codones de ter-
minación por la presencia de una estructura de bucle en horquilla en el
mRNA, localizada inmediatamente corriente abajo del codón de selenocis-
teína, en los procariontes, y en la región 3'no traducida (la parte del mRNA
después del codón de terminación) en los eucariontes. El reconocimiento del
codón de selenocisteína requiere interacción entre la estructura en horquilla
y una proteina especial que participa en la traducción de estos mRNA. Es
probable que actúe un sistema similar para especificar pirrolisina.

ff*;*rid"rr *r:fre ürr;te*m* ;,t bir:qu!*íts r*iul*r

La información biológica codificada por el genoma encuentra su expresión
final en una proteína, cuyas propiedades biológicas están determinadas por
 Proteínas y proteoma

su estructura plegada y por la disposición espacial de los grupos químicos

á. ,r, rrp"rfióie.-A especificar proteínas de diferentes tipos, el genoma
ouede construir y manténer un proteoma, cuyas propiedades biológicas for-
r=

i: man la base subyacente de la vida. El proteoma puede desempeñar este

+ oapel debido a la enorlne divemidad de estructuras proteicas que se pue-
t á"r, for.uf diversidad que les permite a las proteínas llevar a cabo una
variedad de funciones biológicas. Estas funciones son las siguientes:
e La catálisis bioquímica es la función del tipo especial de proteínas
denominadas enzimas. Las vías metabólicas centrales, que aportan
energía a la célula, son catalizadas por enzimas, como los procesos bio-
sintéiicos que determinan la construcción de ácidos nucleicos, prgteí-
nas, hidratbs de carbono y lípidos. La catálisis bioquímica también
impulsa la expresión del genoma a través de la actividad de enzimas
como la RNA polimerasa.
* Lafunción estructural que, en el nivel celular, depende de las prote-
ínas que forman el citoeiqueleto, también es una función primaria de
algunis proteínas extracelulares. Por ejemplo, el colágeno, que es un
componénte importante de huesos y tendones.
* Las proteínas contráctiles confieren moümiento; los ejernplos mejor
conócidos son la actina y la miosina de las fibras citoesqueléticas.
* El transporte de materiales alrededor del cuerpo es una actiüdad impor-
tante dá hs proteínas: por ejemplo, la hemoglobina transporta oígeno
por el torrente circulatorio y la albúmina sérica, ácidos glasos.
+ La regulación de los procesos celulares es mediada por proteínas de
señalámiento, como §fef (transductores de señales y activadores de
la transcripción, sección 14.1.2) y por proteínas como aetivadores
que se unen al genoma e influyen en los niveles de expresión de_genes
individualer y-grupos de genes (sección 11.3). Las actividades de
grupos de céÍulás ion reguladas y coordinadas por hormonas extra-
óe1ülares y citocinas, muóhas de las cuales son proteínas (p. ej., insu-
lina, la hormona que controla los niveles de glucemia, e interleucinas, un
grupo de citocinas que regulan la división y la diferenciación celular).
'u La protección del cuerpo y de células individuales es la función de un
espictro de proteínas, éntre ellas los anticuerpos y las proteínas invo-
luóradas en la respuesta de coagulación de la sangre'
* Las proteínas desempeñan funciones de depósitos, por ejemplo, la
ferriiina, que actúa cb*o ,r, depósito hepático de hierro, y las glia-
dinas, que depositan aminoácidos en semillas de trigo'
Esta multiplicidad de funciones de las proteínas brinda -al proteoma,su
capacidad del convertir el plan detallado contenido en el genoma en las
caiacterísticas esenciales del proceso de la vida.

Resu¡¡¡er=
El genoma es el depósito de la información biológica que tiene cada orga-
nisáo del planeta. La mayoúa de los genomas están compuestos por
DNA, con éscusas excepciónes, como los virus que tienen genomas de
RNA. La expresión del genoma es el proceso por el cual la información
contenida eri el genoma se libera en la célula. El primer p,roducto de la
expresión del geñoma es el transcriptoma, el conjunto de RNA derivados
de los g"n"s q,r" codifican proteínas que están activos en la célula en un
*o*"ñto partiicular. El segUndo producto es el proteoma, el repertorio de
proteínas áe la célula queispecifican el carácter de las reacciones bioquí-
*i"u, que la célula óapurá" [evar a cabo. Entre 1945 y 1952, se obtu-
". experimental de que los genes estaban compuestos
vo la pámera evidencia
Capítulo I Genomas, transcriptomas y proteomas

por DNA, pero fue el descubrimiento de la estructura de doble hélice por -

Watson y Crick, en 1953, lo que convenció a los biólogos de que eI DNA
era, por cierto, el material genético. Un polinucleótido de DNA es un polí-
mero no ramificado formado por múltiples copias de cuatro nucleótidos
químicamente diferentes. En la doble hélice, se entrelazan dos polinucleó-
tidos entre sí, con las bases de los nucleótidos del lado interno de 1a molé-
cula. Los polinucleótidos están unidos por enlaces de hidrógeno entre las
bases, con el apareamiento de la base A siempre con T y de G siempre con
C. El RNA también es un polinucleótido, pero cada nucleótido tiene
estructuras diferentes de las de los hallados en el DNA y, en general, el
RNA es de una sola cadena. Las Rlr[A polimerasas dependientes de DNA
son responsables de copiar los genes en RNA mediante el proceso denomi-
nado transcripción, que determina la sÍntesis no sólo del transcriptoma, sino
también de una serie de moléculas de RNA funcional, que no codifican pro-
teínas, pero cumplen, aun así, papeles vitales en la célula. Inicialmente,
muchos RNA son sintetizados como moléculas precursoras que, a través
de reacciones que provocan cortes y uniones, y por modificaciones quími-
cas, liberan las formas maduras. Las proteínas también son polímeros no
ramificados, pero sus unidades son aminoácidos unidos por enlaces peptí-
dicos. La secuencia de aminoácidos es la estructura primaria de la proteí-
na. Los niveles más altos de estructura -secundaria, terciaia y cuaternaria-
se forman por plegamiento de la estructura primaria en conformaciones tri-
dimensionales y asociación de polipéptidos indiüduales en estructuras mul-
tiproteicas. Las proteínas presentan diversidad funcional, porque cada
aminoácido tiene diferentes propiedades químicas que, al combinarse de
distintas maneras, dan origen a proteínas con un espectro de característi-
cas químicas. Las proteínas son sintetizadas por traducción de los mRNA y
las reglas del código genético especifican qué triplete de nucleótidos codifi-
ca cada aminoácido. El código genético no es universal, se observan varia-
ciones en las mitocondrias y los eucariontes inferiores, y algunos codones
pueden tener dos significados diferentes en un solo gen.
 r\ í\
1.É
:J ,' '\

-\# I

il=á=#§* #=E -f€é

\¡l
r^L¡
d.+ i
\
¿.,.
.-

;/\ -
i
;a

2.1 Énzi;:"ras p¿ra la rnaniplJlaeión d*! *l.lA

2.? {lc,*arión deí }ltj,+
2.1 Reaicicn en r¡der-ia dr ia pcllnr*rasa (P

** i=*r e§ =;+pái==* E
Describir los fenómenos involucrados en la clonación del DNA y la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), y mencionar las aplicaciones y las limitaciones de estas técnicas.

Enumerar las actividades y las principales aplicaciones de los diferentes tipos de enzimas empleados en la
inveligación del DNA recombinante.

ldentificar las caracterflicas importantes de las DNA polimerasas y distinguir entre las diversas DNA poli-
merasas utilizadas en la investigación de la genómica.

Describir, con ejemplos, de qué manera las endonucleasas de restricción cortan el DNA y explicar cómo
se examinan los resultados de un producto de la digesiión por enzimas de refiricción.

Distinguir entre ligamiento de extremos romos y de extremos cohesivos, y explicar cómo se puede
aumentar la eficiencia del ligamiento del extremo romo.

Detallar las caracterÍlicas claves de los vectores de clonación plasmfdicos y describir cómo se los utiliza en
los experimentos de clonación.

Describir cómo se emplean los vectores de bacteriófago I para clonar el DNA.

Dar ejemplos de vectores empleados para clonar fragmentos largos de DNA, y evaluar las ventajas y las
limitaciones de cada tipo.

Resumir cómo se clona el DNA en levaduras, animales y plantas.

Describir cómo se realiza una PCR, y prestar particular atención a la importancia de los cebadores y de las
temperaturas empleadas para el ciclo térmico.

La investigación científica ha descubierto casi todo lo que sabemos acer-

ca de los genomas y la expresión del genoma: los estudios teóricos han
tenido muy poca participación en esta o en cualquier otra área de la bio-
logía molecular y celular. Es posible aprender "hechos" sobre los genomas
sin conocer mucho acerca de cómo se llegó a ellos pero, para aleanzar un
conocimiento real del tema, debemos examinar en detalle las técnicas y los
enfoques científicos empleados para estudiarlos. Los cinco capítulos siguien-
tes analizan estos métodos de investigación. Primero, se examinan las técni-
cas, centradas en la clonación del DNA y la reacción en cadena de la
polimerasa, que se aplican para estudiar las moléculas de DNA. Estas téc-
nicas son muy eficaces con segmentos cortos de DNA, como los genes indi-
üduales, 1o que permite obtener una información muy rica en este nivel.
En el capítulo 3 se consideran los métodos desarrollados para construir
 Capítulo 2 Estudio del DNA

Genes

¡;=-É;-=;i

Corte Reordenamiento
CoPiado

I
¡Éf,rere=; ;;;;ÉE; ;IEJ;. .¡¡¡E-!i5F-='

Fieura 2.1 EiemPlos de las maniPu- ás#É¡ --€t:

iuZion"t qué se'Pueden llevar a

¡¡ECEre3¡
cabo con holéculas de DNA'

complementarios para el
mapas de genomas y se describe cómo métodos
a las técnicas de mapeo gené-
mapeo físico de los genomas se han sumado
siglo. En e1 capítulo 4 se vincu-
tico, creadas por pri;;;;'i"r¡u"" casi un
que' aunqye un mapa puede
la el mapeo con la secuenciación y sernuesffá
sácuencia-larga de DNA, el
ser una ayuda ,ufioJi-po:r;;;Jr"b1"r una
para Ia secuenciación del
mapeo no siempre ;á-p;;equisi.to esencial para
utilizados
il"i |upit"fJ's,". *ulu" en
;;;r. una bs diversoJenfoques
el capítu1o6 se examinan los méto-
conocer secuen"t, d;íg*ñy
il;;;;t,rdiu. r,,;il;til' ilá1^:,1""" eie capítulo cornetuaráa adver-
genoma especifica la capicidad bioquímica
de una
tir que conocer
célula viva es
"o*o,-
u". ¿á i.."p¡""ip"rÁ ¿esafíos dé investigación de la biolo-
gía modema'

Durantelasdécadasde1970y1980sereunióelconjunto-detécnicasuti-
estudiar lai moléculas de DNA'

ft
DNA del Plásmido

L§
'V
lizadas por los biólogos moleculares para
|l **r{ü "taricu
podían estudiar
ü" ápitulo ¡. r_o-s
I", ;;;.
ávances
como se
hábía sido hasta ese momento la única manera
tai'ia"'lts' con los procedimientos-q.ue:t:":il
de Ia investigación bioquímica que, a
pnncl-
enzimas que
pios"i de los años setenta apoi'uto" a los biólogospNe
moleculares
lnserción de DNA nuevo ensavo,
en el tubo de
se podían tÍitízarp;;;;itp"lr. moléculas
¿é
I estimularon tu upuri"ior, áe'métodos más directos
y
para estudiar el DNA'
participan en procesos
vivas
il¡l lüevo Estas enzimas son ná1*ut"t en 1as cé1ulas
F"\
CE como replicación, ü;;;;tó"liecombinación
del DNA,
p;i" ¡";rminar las funciones
que se analizan en
estas enzimas,
L§ roíi;.
los capítulo. rs,
de
.: S;r"riil;oo*u"ái, ;; ;ü. Ñ "rtudiuro, las reacciones
:*lÍ11 qu:
adoptaron las enzimas puras como 1ns-
Replicación dentro de las bacterias ;"$;¿;, b" tiotogo, moleculáres
ONA de maneras predeterminadas
trumentos pu.u *#i;ü;;;i¿;;1uJá
I de DNA, cortar molécu-
Colonia bacteriana v las utilizaron para iealizar copias de moléculas
y unirlos otravez en combinaciones
ir:?""tÑ;; ír;g-;ios más^cortos forman la
inexistentes iu rrátrát"^ (figr"u z-i)' Estas manipulaciones
"., que construye mo1éculas de
base de la tecnolog/a*;JóÑA;;ombinante,
..rá"o-binantes,, a partir de fragmentos de cromosomas
DNA nuevu. o
Numerosas coPias de DNA naturales Y de Plásmidos'
I
ffi LatécticadelDNArecombinantepermitiólaclonacióndelDNAolaclo.
nación de genes,
",,
i";; ;;il.".tá" fragmentos cortos
blemente contienen un solo gen, en un ilásmido
después, r" to, ."piiá-;;i;¿.pea Uacteriano
En la sección 2.z, iL examina cómo se realiza
razones por las q;;.,",¿;ca revolucionó
de DNA, que posi-
o un cromosoma viral y'
o eucari onte (ftg,ua 2'2)'
la clonación de genes y las
la biología molecular.
Fisura2.2 Clonación del DNA' En
esie eiemplo, se inserta el.fragmento.
de DNA que va ser clonado en un Plas- Haciafinesdeladécadade1970,laclonacióndegenesestababienesta-
tuvo lugar a mediados de
mido vector, que se rePlica desPués blecida. El siguie;J-u¿"ru"tote"ri"o i.nportante 1a polime-
,igoi"rrt"]*u"áo seinventó 1a reacción en cadena de
dentro de un huésPed bacteriano' la década
 Enzimas para la manipulación del DNA

rasa (PCR). La PCR no es una técnica complicada -todo 1o que consi-

gue es la copia reiterada de un segmento corto de una molécula de DNA
(figura 2.5)- pero se ha vuelto muy importante en muchas áreas de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
investigación biológica, como en el estudio de los genomas. La PCR se
considera en detalle en la sección2.3. I
re
#

*rc-
§*azimas pare la ¡eeenipulaclán de§ PNÉ re
E-5
="é
La tecnología del DNA recombinante fue uno de los principales factores
que contribuyeron al rápido progreso del conocimiento sobre la expre-
-
-l!fl

sión de genes, que tuvo lugar durante las décadas de 1970 y 1980. La Figura 2.3 La reacción en cadena
base de esta técnica es la capacidad de manipular moléculas de DNA en de la polimerasa (PCR) se utiliza
el tubo de ensayo. A su vez, esto depende de disponer de enzimas puri- para obtener copias de un determi-
ficadas, con actividades conocidas y que pueden ser controladas y que, nado segmento de una molécula
por lo tanto, pueden emplearse para efectuar cambios específicos en las de DNA. En este ejemplo, se copia
i un solo gen.
moléculas de DNA que se están manipulando. Las enzimas con las que
cuenta el biólogo molecular pertenecen a cuatro amplias categorías:
::i

fi
* DNA polimerasas (sección 2.t.I), que son enzimas que sintetizan
polinucleótidos nuevos complementarios de un molde de DNA o de
RNA existente (figura 2.4A).
* Nucleasas (sección 2.1.2), que degradan las moléculas de DNA rom-

(A) DNA polimerasas

Molde de DNA iviolrle ilt ili.l,A

:f \ \
Copias de DNA

(B) Nucleasas

',i

Endonudeasa Exonucleasa

z.
I I
I
-I:
---- 1t
,'+F
tt
II
Cortes internos Nucleótidos eliminados de los extremos

Figura 2.4 Actividades de (A) DNA

(Q polimerasas, (B) nucleasas y (C)
Ligasas
ligasas. En (A), se ilustra, a la izquierda,
la actividad de una DNA polimerasa
Una molécula de DNA Dos moléculas de DNA
dependiente de DNA y, a Ia derecha, la
de una DNA polimerasa dependiente

I I de RNA En (B), se muestran las activi-

dades de las endonucleasas y las exo-

o nucleasas. En (C), la molécula de DNA

gris se liga a sí misma (izquierda) y a
una segunda molécula (derecha).
 Capítulo 2 Estudio del DNA

piendo los enlaces fosfodiéstel que unen un nucleótido al sigUiente

(figura 2.48).
Ligasas (sección 2.1.3), que unen moléculas de DNA sintetizando
fosfodiéster entte nucleótidos ubicados en los extremos de
"rrl-u"".
dos moléculas diferentes o en los dos extremos de una misma molé-
cula (figura 2.4C).
Enzimas de modi{icación terminal (sección 2.1.4), que efectúan
cambios en los extremos de las moléculas de DNA, lo que suma una
dimensión importante al diseño de experimentos de ligamiento y pro-
porciona un medio para marcar moléculas de DNA con elementos
radiactivos y de otro tipo (Nota sobre técnicas 2.1).

?.I .l Sf*A paliarierasas

Muchas de las técnicas empleadas para estudiar el DNA dependen de la
síntesis de copias de DNA de todas las moléculas existentes de DNA o de
RNA, o de párte de ellas. Éste es un requisito esencial para la PCR (sec-
ci6n 2.3),1á secuenciación del DNA (sección 4.1), la marcación del DNA
(Nota sobre técnicas 2.1) y muchos otros procedimientos fundamentales
para la investigación en biología molecular. Una enzima que sintetiza

Nota sobre técnicas 2.1 Marcación del DNA

tJnión de morcodores rodiactivos, fluorescentes o de otro tipo o moléculas de DNA
La marcación del DNA es una parte básica de numerosos
procedimientos de biología molecular, entre ellos la hibri-
dación Southern (sección 2.1.2), la hibridación in situ
fluorescente (FISH; sección 3.3.2) y la secuenciación del
DNA (sección 4.1). Permite determinar la localización de
una molécula de DNA particular -sobre una membrana
de nitrocelulosa o de nailon, en un cromosoma o en un
gel- detectando la señal emitida por el marcador. En
álgunas aplicaciones, también se utilizan moléculas mar-
cadas de RNA (Nota sobre técnicas 5.1).
Se suelen emplear elementos radiactivos para marcar molé-
culas de DNA. Se pueden sintetizar nucleótidos en los que
se reemplaza uno de los átomos de fósforo por 32P o 33P,
uno de los átomos de oxígeno del grupo fosfato por 3sS o
uno o más de los átomos de hidrógeno por 3H (véase figu-
ra 1.4). Los nucleótidos radiactivos actúan, aun así, como
sustratos para las DNA polimerasas y, Por lo tanto, son incor-
porados a una molécula de DNA por cualquier reacción de
síntesis de cadenas catallzada Por una DNA polimerasa.
También se pueden unir nucleótidos o gruPos fosfato indi-
viduales marcados a uno o a ambos extremos de una mol#
cula de DNA mediante las reacciones catalizadas por la T4
polinucleotidoci nasa o la desoxi nucleotidiltra nsferasa termi-
nal (sección 2.1.4). La señal radiactiva se puede detectar
por cámara gamma pero, Para la mayoria de las aplicacio-
nes en biología molecu{a; se necesita información sobre la
posición, de manera que la detección se realiza por exposi-
ción a una película sensible a los rayos X (autonadiografia:
véase un ejemplo en la figura 2.1l) o a una pantalla radio-
sensible fosforescente (estudio por imágenes con pantalla
de fósforQ. La elección entre los diversos marcadores radiac-
tivos depende de los requerimientos del procedimiento. Es
posible alcanzar alta sensibilidad con 32P, porque este isóto-
po tiene una alta energía de emisión, pero la sensibilidad
se acompaña por baja resolución debido a la dispersión de
3H, tie-
la señal. Los isótopos de baja emisión, como 3sS o
nen menos sensibilidad Pero mayor resolución.
En los últimos años ha disminuido la popularidad de los
marcadores radiactivos por cuestiones sanitarias y del cui-
dado del medioambiente; además, para muchos procedi-
mientos, fueron superados ampliamente por alternativas
no radiactivas. Las más útiles de éstas son los marcado-
res fluorescentes, que son comPonentes centrales de téc-
nicas como la FISH (sección 3.3.2) y la secuenciación del
DNA (sección 4..I .I ). Se incorporan a los nucleótidos m¿r-
cadores fluorescentes con diversas longitudes de onda de
emisión (de diferentes colores) o se los une directamente
a las moléculas de DNA, y se los detecta con una pelícu-
la adecuada, por microscopia fluorescente o con un
detector de fluorescencia. Otros tipos de marcación no
radiactiva utilizan emisiones quimioluminiscentes, pero
éstas tienen la desventaja de que la señal no es Senera-
da directamente por el marcador, sino que debe ser
"revelada" por tratamiento de la molécula con sustancias
químicas. Un método popular consiste en marcar el DNA
con la enzima fosfatasa alcalina, que se detecta por apli-
cación de dioxetano, que es desfosforilado por la enzima
para producir la quimioluminiscencia.
 Enzimas para la manipulación del DNA

DI.{A se denomina DNA polimerasa y una que copia una molécula exis- 3, . : 5'
AfGG ,....-
-TACCCAACGCAATTC
tente de DNA o de RNA, DNA polimerasa dependiente del molde. 5' 1'
DltlA nuevo
II
d* ctti*r,= #'c #n# üi'Jr1 p+í,";';;ctrs#
!,€*te ¡=ism* +
d*pend!*i:t* del mairi* 3, *T+999+496cAATrc + §',

Una DNA polimerasa dependiente del molde crea un nuevo polinucleó- ATGGGT_rG 4
tido DNA cuya secuencia es impuesta, a través de las reglas de aparea-
miento de bases, por la secuencia de nucleótidos de la molécula de DNA
o de RNA que está siendo copiada (figura 2.5).El nuevo polinucleótido
siempre es sintetizado en dirección 5'E3': no se sabe que haya en la Figura 2.5 Actividad de una DNA
natt:r:aleza DNA polimerasas que sinteticen DNA en otra dirección. polimerasa dependiente de DNA.
Se agregan nuevos nucleótidos al
extremo 3'del polinucleótido en cre-
Una característica importante de la síntesis de DNA dependiente del cimiento; la secuencia de este nuevo
molde es que una DNA polimerasa no puede utllizar una molécula total- polinucléotido está determinada por la
mente monocatenaria como molde. Para iniciar la síntesis de DNA, debe secuencia del DNA molde.
Compárese con el proceso de trans-
haber una región corta de doble cadena, para que aporte un extremo 5' cripción (síntesis de RNA dependiente
sobre el que la enzima pueda agregar nuevos nucleótidos (figura 2.64). de DNA) ilustrado en la figura l.l 1.
En el capítulo 15 se describe cómo se cumple este requisito en las células
vivas cuando se replica el genoma. En el tubo de ensayo, una reacción de
copiado de DNA se inicia uniendo al molde un oligonucleótido sintético
corto, por lo general de alrededor de 20 nucleótidos de longitud, que actúa
como cebador para la síntesis del DI'{A. A primera üsta, la necesidad de
un cebador podría parecer una complicación no deseada del uso de DNA
polimerasas en la tecnología del DNA recombinante, pero nada podría
estar más lejos de la verdad. Como la hibridación del cebador al molde
depende del apareamiento de bases complementarias, se puede especificar
la posición dentro de la molécula molde en la que se inicia el copiado de
DNA sintetizando un cebador con la secuencia nucleotídica adecuada
(figura 2.68). Por lo tanto, es posible copiar un segmento corto, específi-
co, de una molécula molde mucho más larga, lo que resulta tanto más
valioso que la copia aleatoria que se produciría si no fuera necesario cebar
la síntesis de DNA. Es posible apreciar totalmente la importancia de Ia
cebadura en el análisis de la PCR que se realiza en la sección 2.3.

Una segunda característica general de las DNA polimerasas dependien-

tes del molde es que muchas de estas enzimas son multifuncionales y
pueden degradar, así como sintetizar, moléculas de DNA. Esto refleja la
manera cómo actúan las DNA polimerasas en la célula durante la repli
cación del genoma (sección 15.2). Además de su capacidad de síntesis
5'-)3' de DNA, las DNA polimerasas pueden tener una o ambas de las
siguientes actividades de exonucleasa (figura 2.7):

(A) La síntesis de DNA requiere un cebador Figura 2.6 Función del cebador en
i-.i:t.l,it: la síntesis de DNA dependiente del
5' lllltllllllllll-
.3' molde. (A) Una DNA polimerasa
,, llllrllllllll"rl- E, 2, E,
requiere un cebador para iniciar la sín-
tesis de un nuevo polinucleótido. (B)
DNA polimerasa
I La secuencia de este oligonucleótido
determina la posición en la que se
DNA nuevo
,]ffi
une al DNA molde y, por'ende, espe-
:L.1-:..:.1-:.i-1_|11]-1.! ¡¡rlilllllrrrrr cifica la región del molde que serÉ
llo ha'/ liri.rii c. Li\jA SintPsi. .i. Di'.iA copiada. Cuando se emplea una DNA
polimerasa para fabricar DNA nuevo
in vitro, el cebador suele ser un oligo-
(B) El cebador determina qué parte de la molécula de DNA se copia nucleótido corto creado por síntesis
i-::l;,:|i química. Véanse detalles de cómo se
5' + 3' ceba la síntesis de DNA in vivo en la
rr rI r 1 r t 11r r t r t t ¡ rlt r t t t r t r r ¡ ¡ r ¡ I t i r I I i I i l l ¡ t r l ll t r t.t ¡ !,r, sección 15.2.2.

i3
 Capítulo 2 Estudio del DNA

(A) Síntesis 5'+5'de DNA . La actiüdad de 5'-+5'exonucleasa permite que la enzima elimine nucle--
:=3 ótidos del extremo 3' de la cadena que recién ha sintetizado. Esto se
iri :,ir,¡ DNA nuevo .'' denomina actividad de corrección, porque permite que la polimerasa
5'
J
' I LtE¡ corr'lja erores eliminando un nucleótido insertado en forma incorrecta.
* La actividad de 5'->3' exonucleasa es menos frecuente, pero se observa
DM polimerasa
en algunas DNA polimerasas, cuya función natural en la replicación del
genoma exige que sean capaces de eliminar por lo menos parte de un poli-
(B) Actividad de 535'exonucleasa nucleótido ya unido a la cadena molde que la polimerasa está copiando.
Nucleótido incorrecto

I'pos d* Dl'.lA p*lím*r*s*s utiiizadas en lc i*'¡esiig*cíón

tttttlll¡ Varias de las DNA polimerasas dependientes del molde que se utilizan
para investigación en biología molecular (cuadro 2.1) son versiones de la
enzima DNA polimerasa I de Escherichia coli, que desempeña un papel
La DNA polimerasa
central en la replicación del genoma de esta bacteria (sección 15.2). Est¡a
invierte su dirección
enzima, denominada a veces polimerasa de Kornberg, por su descubridor
Arthur Kornberg, tiene las actividades de exonucleasa 3'-+5' y 5'->3', lo
(C) Actividad de 5'+3'exonucleasa que limita su utilidad en la manipulación del DNA. Su principal aplicación
Nucleóüdos desplazados
es la marcación del DNA (Nota sobre técnicas 2.1).
€
5'
J
Tffi \. -.
5' De las dos actividades de exonucleasa, la versión 5'->3' es la que causa más
problemas cuando se utiliza una DNA polimerasa para manipúlar moléculas
en el tubo de ensayo. Esto se debe a que una enitrna que tiene esta actividad
puede eliminar nucleótidos de los extremos 5' de los polinucleótidos que
. recién se han sintetizado (figura 2.8). Es improbable que los polinucleótidos
Figura 2.7 Síntesis de DNA y activi- sean degradados por completo, pues la función de polimerasa suele ser
dades de exonucleasa de las DNA mucho más activa que la función de exonucleasa, pero algunas técnicas no
polimerasas. Todas las DNA polime- actuarán si los extremos 5' de los nuevos polinucleótidos están acortados dg'
rasas pueden fabricar DNA y muchas alguna manera. En particula4 la secuenciación del DNA se basa en la sínte-
también tienen una o las dos activida-
sis de nuevos polinucleótidos, todos los cuales comparten exactamente el
des de las exonucleasas.
mismo extremo 5', marcado por el cebador empleado para iniciar las reaccio-
nes de secuenciación. Si ocurre cualquier "roedura" del extremo 5', es impo-
sible determinar la secuencia correcta del DNA. Cuando se introdujo por
primera vezla secuenciación del DNA a fines de la década de 1970, se utili-
zó unaversión modificada de la enzima de Komberg denominada polimera-
sa de Klenow. Ésta se preparaba, al principio, cortando la DNA polimerasa
I natural de Escherichia coli en dos segmentos mediante una proteasa. Uno
de estos segmentos retenía las actividades de polimerasa y de 3'->5' exonu-
cleasa, pero carecía de la función de 5'-+3' exonucleasa de la enzima no tra-
tada. La enÁrna todavía se suele llamar fragmento de Klenow en memoria

Cuadro 2.1 Características de las DNA polimerasas dependientes del molde empleadas
para la investigación en biología molecular

Polimerasa Descripción Aplicación principal f9r¡n ciá cruzada .:

. !.e,

DNA polimerasa I Enzima de E. colino modificada Marcación del DNA Nota sobre
técnicas 2.1
Polimerasa de Klenow Versión modificada de la DNA Marcación del DNA Nota sobre
polimerasa I de E. coli técnicas 2.1
Secuenasa Versión modificada de la DNA Secuenciación del DNA Sección 4.1 .1
polimerasa I del fago T7 ':..

Iag polimerasa DNA polimerasa I de Thermus PCR Sección 2.3

oquoticus
Transcriptasa inversa
DNA polimerasa dependiente de RNA, Síntesis de cDNA Sección 5.1.2
obtenida de diversos retrovirus
 Enzimas para la manipulación del DNA

de este antiguo método de preparación; sin embargo, en la actualidad, casi DNA nuevo
5'¡-+;l'
siempre se prepara de células de E. coli cuyo gen de polimerasa ha sido mani- -, r I r r r ¡ ¡ r r r ¡ I ¡ i lir ¡¡ i lir r ¡ r r r r r r ! r-L-¿
pulado de modo que la enzima resultante tenga las propiedades deseadas.
I 5'-3'
Pero, de hecho, la polimerasa de Klenow rata vez se utiliza ahora en la t
Actividad de
exonucleasa
secuenciación y tiene su principal aplicación en la marcación del DNA (véase
Nota sobre técnicas 2.1). Esto se debe a que, en la década de 1980, se de- ,, t¡ r r I llttt
-
r r tt I -ffi-
llr I I ll¡ tr I I I llll I l_.,
sarrolló una enzima denominada secuenasa (véase cuadro 2.1), que tiene
propiedades superiores en 1o que concieme a la secuenciación. En la sección Degradación del segmento
4. t. t se vuelven a tratar las características de la secuenasa y se explica por de DNA nuevo

qué la convierten en la enzima ideal para la secuenciación.

Figura 2.8 La actividad de exonuclea-

La enztrna DNA polimerasa I de E. coli presenta una temperatura de reac- sa 5'-+3'de una DNA polimerasa
ción óptima de 37"C, que es la temperatura habitual del medio natural de puede degradar el extremo 5'de un
labactgria dentro del intestino de los mamíferos, como los seres humanos. polinucleótido recién sintetizado.
Por lo tanto, las reacciones en tubo de ensayo con polimerasas de Komberg
o de Klenow y con secuenasa se incuban a 37"C, y se terminan aumentan-
do la temperatura a 7 5"C o más, que hace que la proteína se despliegue o
se desnaturalice, lo que destruye su actividad enzimática. Este esquema es
perfectamente apropiado para la mayoría de las técnicas de biología mole-
cular, pero por razones que se esclarecerán en la sección 2.3, la PCR
requiere una DNA polimerasa termoestable: una que pueda funcionar a
temperaturas mucho más altas que 37oC. Se pueden obtener enzimas ade-
cuadas de bacterias como Thermus aquaticus, que viven en primaveras
cálidas a temperaturas superiores a 95"C y cuya DNA polimerasa I tiene
una temperatura de acción óptima de 72"C. Si bien no se conoce por com-
pleto la base bioquímica de la termoestabilidad proteica, es probable que
dependa de caracterlsticas estructurales que reducen el grado de desplega-
miento de las proteínas observado a temperaturas elevadas.

Hay otro tipo de DNA polimerasa importante para la investigación en

biología molecular. Ésta es la transcriptasa inversa, una DNA polimera-
sa dependiente de RNA y que, por lo tanto, genera copias de DNA a
partir de moldes de RNA y no de DNA. Como las transcriptasas inver-
sas participan en los ciclos de replicación de los retroürus (sección
9.1.2); por ejemplo, los virus de la inmunodeficiencia humana que cau-
san el síndrome de inmunodeficiencia adquirida o sida, estos virus con
genomas de RNA son copiados a DNA tras la infección del huésped. En
el tubo de ensayo, se puede utilizar una transcriptasa inversa para hacer
copias DNA de moléculas de RNA. Estas copias se denominan DNA
complementarios (cDNA). Su síntesis es importante en algunos tipos de
clonación de genes y en técnicas empleadas para mapear regiones de un
genoma que especifican mRNA particulares (sección 5.1.2).

Cuadro 2.2 Características de nucleasas importantes utilizadas para la investigación en biología molecular

Nucleasa Descripción Aplicación principal

Endonucleasas de restricción DNA endonucleasas específicas Numerosas aplicaciones Sección 2.1.2

de secuencia, de numero-
sas fuentes
Nucleasa S l Endonucleasa específica para Mapeo de transcritos Sección 5.1 .2
DNA y RNA de una sola
cadena del hongo
Aspergillus oryzoe
Desoxirribonucleasa I Endonucleasa específica para Huella genética obteni- Sección 1 1. 1.2
DNA y RNA de doble cade- da con nucleasas
na de Escherichio coli
 Capítulo 2 Eludio del DNA

Cortes efeciuados en posiciones variables

?,:.? Nuet+*ses
:
llll Diversas nucleasas han hallado aplicaciones en la tecnología del DNA
*.-1 . recombinante (cuadro 2.2). Si bien algunas de ellas tienen un amplio
---..-,. -,-............- -+-.: espectro de actiüdades,la mayoúa son exonucleasas, que eliminan nucle-
ótidos de los extremos de moléculas de DNA o de RNA, o endonuclea§as,
secuencia de f Endonucleasa de que cortan enlaces fosfodiéster internos. Aigunas nucleasas son específi-
reconocimiento I relricción de tipo I o lll
Cas para DNA y otras, para RNA; algunas trabajan sólo sobre DNA de
doble cadena y otras, sólo sobre DNA de cadena simple, y algunas no son
I Endonucleasa de
exigentes respecto de su sustrato. Se verán varios ejemplos de nucleasas
I restricción de tipo ll en capítulos ulteriores cuando se traten las técnicas en las que se emple-
.l an. Aquí, sólo se considerará en detalle un tipo de nucleasa: las endonu'
cleasai de restricción, que desempeñan un papel central en todos los
.+ aspectos de la tecnología del DNA recombinante.
I
I

Tcdr:: h: {r-il¡+r elr la rri;m; pcsicrci:

Figura 2.9 Cortes efectuados por
endonucleasas de restricción. En
parte superior del diagrama, el DNA es
cortado por una endonucleasa de res-
tricción de tipo I o de tipo lll. Los cortes
tienen posiciones ligeramente diferen-
tes respecto de la secuencia de recono-
cimiento, de manera que los
fragmentos resultantes tienen distintas
longitudes. En la parte inferior del dia-
grama, se emplea una enzima de tipo
ll. Cada molécula se corta exactamente
en la misma posición para dar exacta-
mente el mismo par de fragmentos.
L*s *¡=ri*¡tui!**sss d* r*strir:clor: p*rmii*¡= t*ricr los molácuiss
de DliA en po:ici,:¡;*s c**¡:¡dcs
Una endonucleasa de restricción eS una enzrna que se une a una molécula
de DNA ell una secuencia específica y corta la doble cadena en esa secuen-
la
cia o cerca de ella. Dada la especificidad de la secuencia, es posible predecir
las posiciones de los cortes dentro de una molécula de DNA, asumiendo que
se c-onoce la secuencia de DNA,lo que permite escindir segmentos definidos
de una molécula más grande. Esta posibilidad constituye la base de la clona-
ción de genes y todos los demás aspectos de la tecnología del DNA recombi-
nante en la que se requieren fragmentos de DNA de secuencia conocida.
Hay tres tipos de endonucleasas de restricción. Los tipos I y III no permi-
tenejercerningún control estricto sobre la posición del'corte respecto de
la secuencia específica de la molécula de DlrlA reconocida por la erzima.

Cuadro 2.5 Algunos ejemplos de endonucleasas de restricción

Enzima Secuencia de reconocimíento Tipo de extremos Secuencias terminales

Alul 5,-ACC T_3, Romo 5'-ACCI-3',

3,_TCCA_5' 3,_TCCA-5,
Sou3Al 5,_CATC-3, Cohesivo, segmento protuberante 5' 5,_ CATC_3,
3,_CIAC_s, 3'-CIAC -5'
Hinfl 5,_CANTC_3' Cohesivo, segmento protuberante 5' 5,-C ANTC_3'
3,-CTNAG_5' 3,_CTNA C-5,
BomHl 5,_CCATCC_3' Cohesivo, segmento protuberante 5' 5,_C CATCC-3,
3,_CCIAC C-5'
.

5,_CCIAGC-s'
BsrBl 5,_ CCCC TC_3' Romo 5,_ NNNCCCCTC_3,
3,_ CCCCAC_s' 3,_ NNNCCCCAC-s,
FcoRl 5|-Cfl4fiC 3', '' .' Cohesivo, segmento protuberante 5' 5,_C MTTC_3,
3,_CTTAA C_5,
3,_CTTAAC_5'
Psfl 5,_C TCCAC-3' Cohesivo, segmento protuberante 3' 5,_CTCCA C-3'
3,-CACCTC-s, 3,_C ACGTC_5'
rVotl 5,_CCCCCCCC_3' Cohesivo, segmento protuberante 5' 5,-CC CCCCCC_3'
3,-CCCCGCCC_s' 3,_CGCCCC CC_5'
BgA s,-CCCNNNNNCCC_3' Cohesivo, segmento protuberante 3' s,-CCCNNNN NCCC_3'
5,_CCCNNNNNCCC-S' 3,_CCCN NNNNCCG_5'
Abreviatura: N, cualquier nucleótido.
Obsérvese que la mayoria de las secuencias de reconocimiento, aunque no todas, presentan simetría invertida: cuando se las lee en la dirección 5'-)3',la
secuencia es la misma en ambas cadenas.
 Enzimas para la manipulación del DNA 4t

Por lo tanto, estas enzimas son menos útiles, porque no se conocen con
precisión las secuencias de los fragmentos resultantes. Las enzimas de tipo
II no presentan esta desventaja, porque el corte siempre ocutre en el mismo
lugar, dentro de la secuencia de reconocimiento o muy cerca de ella (figu-
ra 2.9) . Por ejemplo ,la el.¿ima de tipo II denominada EcoRI (aislada en E
coli) cota el DNA sólo en el hexanucleótido 5'-GAATTC-3'. Por consi-
guiente, la digestión del DNA con una enzima de tipo II genera una serie
reproducible de fragmentos cuyas secuencias son predecibles si se conoce
la secuencia de la molécula DNA diana. Se han aislado más de 2.5OO erui-
mas de tipo II y hay más de 300 para uso de laboratorio. Muchas enzimas
tienen sitios diana hexanucleotídicos, pero otras reconocen secuencias más
cortas o más largas (cuadro 2.3). También hay ejemplos de enzimas con
secuencias de reconocimiento redundantes, lo que significa que cortan el
DNA en cualquiera de una familia de sitios relacionados. Por ejemplo,
Hinfl, (de Haemophilus influenzae) reconoce 5'-GANTC-5', donde "N" es
cualquier nucleótido y así, corta en 5'-GAATC-3', 5'-GATTC-5',
5'-GAGTC-3'y 5'-GACTC-3'. La mayoría de las enzimas cortan dentro
de la secuencia de reconocimiento, pero unas pocas, como BsrBI, 1o hacen
en una posición específica fuera de esta secuencia.

Las enzimas de restricción cortan el DNA de dos maneras. Muchas reahzan

un corte simple de la doble cadena, lo que geneta un extremo romo, pero
otras cortan las dos cadenas en posiciones diferentes, en general con una
separación de dos o cuatro nucleótido!, de modo que los fragmentos resul-
tantes de DNA tienen segmentos protuberantes (overhangs) cortos de una
sola cadena en cada extremo. Estos se denominan extremos cohesivos, por-
que el apareamiento de bases entre ellos puede volver a unir la molécula de
DNA (figura 2.1OA). Algunas enzimas que cortan extremos cohesivos dan

(A) Extremos romos y cohesivos

l,¡r¡it i;

E¡ TT nrnTi, ryffi;;
:,TTTITTTT
J- ;:nmr1* .i '"TXTnT::
[:li:¡t t;.. ii],lir¡-;:' Exi¡emcs rohesivos
-)
(B) Segmentos protuberantes (overhangs) 5'y 5'

:;ir":ifffiá:¡ffi;; l,rnrr
J
flq-$flrnr:,

tI BamHl

5'-
-§ALgtL-)

t'
l'* Figura 2.10 Resultados de Ia diges-
l,rrm!-^- ' GArcc. rffi;: tión del DNA con diferentes endo-
J Jl,¡rmfoto
.ju -.o..r.9nml,
3.ALU|
5,
nucleasas de restricción. (A)
-LLIAQ Extremos romos y extremos cohesi-
vos. (B) Diferentes tipos de extremo
(C) lgual extremo cohesivo producido por diferentes enzimas cohesivo: segmentos protuberantes 5'
producidos por Bom\l y segmentos
protuberantes 3' producidos por Psfl.
;;rñEbfiH-{; ;;Tm H:r ;; (C) Extremos cohesivos idénticos pro-
1 Bom\l sdu3Al ducidos por dos endonucleasas de
¿ I restricción diferentes: tanto BomHl
E, (que reconoce 5'-CCATCC-3') como
s'cnr-cc, " .GArc
5'
'nrrrf
l,rn-n!-tAb.,5, rrml, ],rrnrr-^- "-- 5'
J s J
SouSAl (que reconoce 5'-CATC-3')
producen un segmento protuberante
-LL 5r con la secuencia 5'-CATC-3'.
-L|AC5
 Capítulo 2 Estrdio del DNA

seglnentos protuberantes 5' (p. ei., Sau3Al, Hinfl), mientras otras dejan seg-
mEntos pr&uberantes 3' (p. é¡., Rsfl (figura 2.10B)' Una característica par-
ticularminte importante én la tecnología del DNA recombinante es que
algUnos pares de enzimas de resfficción tienen diferentes secuencias de reco-
nJcimieáto, pero dan los mismos extreriros cohesivos, entre ellas, Sau3AIy
namHI, que^dan, ambas, un extremo cohesivo 5'-GATC-3', aunque ta p4-
mera tiene una secuencia de reconocimiento de cuatro pares de bases y la
segunda reconoce una secuencia de seis pares de bases (figura 2.10c).

Nota sobre técnicas 2.2 Electrofores¡s en gel de agarosa

Seporoción de moléculas de DNA de diferentes longítudes

La electroforesis en gel es el método convencional para
separar moléculas ¿e ONn de drferentes longitudes. Tiene
müchas aplicaciones en el análisis del tamaño de los frag-
mentos de DNA y también se la puede utilizar para seParar
moléculas de RNA (véase Nota sobre técnicas 5.,l).
Electroforesis se define como el movimiento de moléculas
con carga en un camPo eléctrico: las moléculas con carga
negativJ migran hacia el electrodo positivo y las moléculas
coñ carga pósitiva, hacia el electrodo negativo. Al principio,
Ia técnica se llevaba a cabo en solución acuosa, en la que
los factores predominantes que influyen en la velocidad de
migración son la forma de la molécula y su carga eléctrica.
Esto no es de particular utilidad Para seParar DNA, porque
la mayoría de las moléculas de DNA tienen la misma forma
(lineai) y, aunque su carga depende de su longitud, Ias dife-
rencias de carga no son suficientes para determinar una
separación e{icá2. La situación es diferente cuando la elec-
troforesis se practica en un gel, porque.ahora la forma y la
carga son menos tmportantel, y la longitud molecular es el
detérminante crÍtico de la velocidad de migración. Esto se
debe a que el gel es una red de poros a través de los cuales
deben viajar laimoléculas de DNA para alcanzar el electrodo
positivo. Los poros obstaculizan menos a las moléculas más
cortas que a las moléculas más largas y, así, las primeras se
mueven con más rapidez a través del gel. Por lo tanto, molá
culas de diferentes longitudes forman bandas en el gel'
En biología molecular se utilizan dos tipos de gel: geles de
agurosa,io.o el que se describe aquí, y gele¡ de poliacrila-
Ñda, qu" se consideran en la Nota sobre técnicas 4'l' La
agarosa es un polisacárido que forma geles con Poros que
várían de IOO nm a 3OO nm de diámetro; eltamaño depen-
de de Ia concentración de agarosa del gel. Por ende, la con-
centración del gel determina-el rango de fragmentos de DNA
que se puedeñ seParar. El rango de separación también se '
vb afeaádo por el valor que la agarosa muestra en la electro-
endósmosis (EEO), que es un [arámetro de la cantidad de
aniones sulfaio y piruvato unidos. Cuanto mayor es el valor
en la EEO, más'lenta es la velocidad de migración de una
molécula con carga negativa, como el DNA.
Un gel de agarosa se prePara mezclando la cantidad apro-
piadá de polvo de agarosa con una solución de sustancia
amortiguadora (buffer), calentándola hasta disolver la agaro-
sa y, déspués, vertiendo el gel derretido sobre una placa
Perspex con cinta alrededoi de los lados para evitar los
derrames. Se coloca un peine formador de pocillos para

Figura T2.l Las figuraf2.2 El rango

o/o de agarosa 0,75
bandas de DNA de tamaños de los
Gel de agarosa sobre un gel de t _- ll[b fragmentos que se
pueden resolver
agarosa se visuali-
Soporte plástico zan mediante tin- depende de la con-
transparente a UV ción con bromuro --- 2kb centración de agaro-
de etidio. sa en el gel. Se ha
Sumergir en 0,5 !r ml-l
de solución de bromuro oracticado electrofore'
de etidio durante l5 minutos --- I kb sis con tres concentra-
ciones diferentes de
asarosa. Las marcas
--- 0.5 kb irü¡can los tamaños
de las bandas de las
- calles izquierda Y

fll
UV UV UV
0,5 kb -- derecha,
Fotografía cortesí.a de
BioWhittaker Molecular
Applications.
*
ffi-'
É
.E

5
É
§
€ Enzimas para la manipulación del DNA 47
E

-§
s
.€
a muestras en el gel. Se permite que el gel se asiente y, des- fragmentos de lO0 pares de bases (pb) a 50 kb de lon-
:];= pués, se practica la electroforesis con el gel sumergido bajo gitud (figura T2.2). Por ejemplo, se puede emplear un
la sustancia amorliguadora. Para seguir el progreso de la gel al 0,3olo para moléculas de 5 kb a 50 kb, y un gel al
.l00-500
electroforesis se añaden uno o dos colorantes con velocida- 5olo para moléculas de pb de longitud. Los frag-
,l50
l
'4 des de migración conocidas a las muestras de DNA antes mentos de menos de pb de largo se pueden sepa-
3é de la carga. Las bandas de DNA se visualizan embebiendo rar en un gel de agarosa al 4o/o o al 5ol0, lo que permite
el gel en solución de bromuro de etidio, compuesto que se distinguir bandas que representan moléculas que difie-
;!
:€ intercala entre los pares de bases del DNA y emite fluores- ren de tamaño sólo por un nucleótido. En cambio, con
=
cencia cuando es activado por radiación ultravioleta (figura fragmentos más grandes, no siempre es posible separar
É T2.1). Según Ia concentración de agarosa del gel, se pue- moléculas de tamaño similar, aun en geles con concen-
É den separar en bandas definidas tras Ia electroforesis tración más baja de agarosa.
-.J
.É

:F
e
E
:-l
{xsmen de los resultados de un producto de lo dígestión
g can enzímos de restricción
!7
Tras el tratamiento con una endonucleasa de restricción, se pueden
a
:i! examinar los fragmentos de DNA resultantes mediante electroforesis
:i en gel de agarosa (Nota sobre técnicas 2.2) para determinar su tama-
n
ño. Si el DNA inicial es una molécula relativamente corta y se produ-
't
,i cen veinte fragmentos o menos después de la restricción, suele ser
.:
posible seleccionar una concentración de agarosa que permita visua-
Lizar cada fragmento como una banda distinta en el gel. Si el DNA
inicial es largo y, por ende, da origen a numerosos fragmentos tras la
digestión con una slzima de restricción, entonces, con cualquier
concentración de agarosa que se utilice, el gel puede mostrar sólo un
frotis de DNA, pues hay.fragmentos de todas las longitudes posibles
que se fusionan juntos. Este es el resultado habitual cuando se corta
el DNA genómico con una enzima de restricción.

Si se conoce la secuencia del DNA inicial, es posible predecir las secuencias

y, por ende, los tamaños de los fragmentos resultantes del tratamiento con
Figura 2.1I Hibridación Souhern. (A)
una enzima de restricción particular. Después, se puede identificar la banda
Tranferencia de DNA delgel a la mem-
de un fragmento deseado (p. ej., uno que contiene un gen), cortarla del gel brana. (B) Colocación de una sonda en
y purificar el DNA. Aunque no se conozca su tamaño, se puede identificar Ia membrana que consiste en un molé-
un fragmento que contiene un gen u otro segmento de DNA de interés cula de DNA marcada radiactivamente.
mediante la técnica denominada hibridación Southern, siempre que se En la autorradiografía resultante, se
conozca o se pueda predecir parte de la secuencia dentro del fragmento. El observa una banda de hibridación en el
carrll2 y dos en el carril 3.

(A) Transferencia de DNA del gel a Ia membrana

Toallas de papel

Marcadores de DNA DNA sometído a digelión

enzimas de restricción
\ ,lpor
Membrana de nailon

Sulancia
amortiSuadora
(buffer)
----__-.
Gel de agarosa

Soporte

(B) Análisis por hibridación Bandas de hibrídación

Sonda de DítiA

Autorradiografía
 Capítulo 2 Efudio del DNA

(§ Función de la DNA ligasa in vivo primff paso consiste en transferir los fragmentos de restricción del gel de
Enlace fosfod¡éster faltante agarosa a una membrana de nitrocelulosa o de nailon. Esto se efectúa colo-
.,
) l r r ¡ ¡ r ¡ ¡ ¡ t ¡ t ¡'r_i l
J cando la membrana sobre el gel y permitiendo que la sustancia amortigua-
I ! 3 ¡ I I I I I ! I I I I I I
J-, -,
dora la empape, llevando el DI{A del gel a la membrana, a la que se une
I (figura 2:llA). Mediante este proceso las bandas de DNA se inmovilizan en
I
-#f

las mismas posiciones relativas sobre la superficie de la membrana.

Enlace faltante sintetizado por la DNA ligasa
-,I
5 __---*l-J
,¡ ¡ i ¡ r I I I ! I r ! r r r ' !
J
É¡ El siguiente paso es preparar una sonda de hibridación, que es una molécu-
la de DNA marcada cuya secuencia es complementaria de la del DNA diana
que se desea detectat. La sonda podría ser, por ejemplo, un oligonucleótido
sintético cuya secuencia se aparece con parte de un gen de interés. Como la
(B) Ligamiento in vitro sonda y los DNA diana son complementarios, pueden aparear sus bases o
5'- \' 5' hibridarse, y se identifica Ia posición de la sonda hibridada sobre la membra-
_¡|.'II IIir:¡|
-f --3'
II!.rI|I'Ifr-/
na detectando la señal emitida por el marcador unido a la sonda. Para llevar
a cabo la hibridación, se coloca la membrana en un frasco de üdrio con la
sonda marcada y algo de sustancia amortiguadora y se lo rota con suavidad
durante varias horas, de modo que la sonda tenga muchas posibilidades de
5'a;-;mr-i-r=r,-t,
¡ I i r ! I ¡ I
¡ r i !I r I I I I I I I I I I | . -¡
r-r":- 3' hibridar el DNA diana. Después, se lava la membrana para eliminar cual-
-,
t-- quier sonda que no se haya hibridado y se detecta la señal del marcador
(véase Nota sobre técnicas 2.1).En el ejemplo mostrado en la figura 2.lIB,
I

Dos enlaces sintetízados por DNA ligasa

la sonda está marcada radiactivamente y la señal se detecta por autorradio-

gafra. La banda que se observa en la autorradiografía es la que corresponde
(C) El ligamiento de extremos cohesivos al fragmento de restricción que se hibrida a la sonda y que, por lo tanto, con-
es más eficiente tiene el gen que se estaba buscando.
5'-.:"t.:-- 3', 5",,,,,,,,,-r-f3'
-/.t'rrt!¡t!r¡l-, ,, itt!rrrtltt-,

§¡UA Sigasas
=.1"5
Los fragmentos de DNA generados por tratamiento con una endonucle-
asa de restricción se pueden volver a unir, o unir a un nuevo compañe-
5' :.*'-**__.:
-¡r ; ( l{l' ¡t¡ l{ltr 1 ! lt ¡! lli!-,
3'. ro, mediante una DNA ligasa. La reacción requiere energía, que es
, provista por el agregado de ATP o nicotinamida adenina dinucleótido
Apareamiento de bases transitorio entre extremos cohesivos
(NAD) alamezcla de reacción, según el tipo de ligqsa que se use.

J
5'.mim¡;-rr¡;3'
-¡
J-
I I ¡ r I I r ¡ I I t !
Dos enlaces sintetizados por DNA ligasa
Figura 2.12 Ligamiento de molécu-
las de DNA con DNA ligasa. (A) En
las células vivas, la DNA ligasa sinteti-
za un enlace fosfodiéster faltante en
una cadena de una molécula de DNA
de doble cadena. (B) Para un¡r dos
moléculas de DNA in vitro, la DNA
ligasa debe crear dos enlaces fosfo-
diéster, uno en cada cadena. (C) El
ligamiento in vitro es más eficiente
cuando las moléculas tienen extremos
cohesivos compatibles, porque el apa-
reamiento de bases transitorio entre
estos extremos mantiene juntas las
moléculas y, así, aumenta la oportuni-
dad de que la DNA ligasa se una y
sintetice los nuevos enlaces fosfodiés-
ter. Véase la función de la DNA ligasa
durante la replicación del DNA in vivo
en la figura 15.18.
I I I | ¡ ! r I I I I I I r -,
La DNA ligasa más u¡lizada se obtiene de células de E. coli infectadas por el
bacteriófago T4. Esta erukna participa en la replicación del DNA del fago y
es codificada por el genoma T4. Su función natural es sintetizar enlaces fos-
fodiéster entre nucleótidos no unidos presentes en un polinucleótido de una
molécula de doble cadena (figura 2.12A). Para unir dos fragmentos de res-
tricción, la ligasa debe sintetizar dos enlaces fosfodiéste4 uno en cada cade-
na (figura 2.128). Esto no supera de ninguna manera las capacidades de la
enzkna, pero la reacción sólo puede tener lugar si los extremos por unir se
acercan lo suficiente entre sí por azari la ligasa no puede tomarlos y juntar-
los. Si las dos moléculas tienen extremos cohesivos complementarios y los
extremos se juntan por eventos de difusión aleatorios en la mezcla de liga-
miento, se podrían formar pares de bases fransitorios entre los dos segmen-
tos protuberantes. Estos pares de bases no son muy estables, pero pueden
persistir lo suficiente para que una enzima ligasa se fije a la unión y sintetice
enlaces fosfodiéster para fusionar los extremos (figura 2.12C). Si las molécu-
las tienen extremos romos no se pueden apareat entre sí ni siquiera de mane-
ra transitoria y el ligamiento es un proceso mucho menos eficiente, aun
cuando la concentración de DNA sea alta y los pares de extremos estén rela-
tivamente cerca.
La mayor eficiencia del ligamiento de los extremos cohesivos ha estimu-
lado la obtención de métodos para convertir extremos romos en extre-
mos cohesivos. Uno de los métodos une moléculas cortas de doble
cadena, denominadas conectores (linkers) o adaptadores, a los extre-
 Enzimas para la manipulación del DNA

Figura 2.I5 Se emplean conectores

(inkers) para colocar extremos cohe-
sivos en una molécula con extremos
romos. En este ejemplo, cada conector
contiene la secuencia de reconocimiento
para la endonucleasa de restricción
BamHl. La DNA ligasa une los conecto-
res a los extremos de la molécula de
secuencia de roeconocimiento
extremos romos en una reacción relai-
i: :_ - i, vamente eficiente, porque los conectores
están presentes en una alta concentra-
I

Conectores unidos a los extremos

de la molécula de DNA ción. Después, se añade la enzima de
restricción para escindir los conectores y

II BomHl generar los extremos cohesivos.

Obsérvese que, durante el ligamiento,
5' J los conectores se unen entre sí, de
5' 5' manera que hay una serie de ellos (un
concatámero) unidos a cada extremo de
E.\tremc aoires;vli
"qü,'ir
iil la molécula roma. Cuando se añade Ia
enzima de restricción, estos concatáme'
ros de conectores son cortados en seg-
mentos y la mitad del conector más
interno queda unido a la molécula de
DNA Los adaptadores son similares a
los conectores, pero cada uno tiene un
extremo romo y un extremo cohesivo.
mos romos. Los conectores y los adaptadores trabajan en forma ligera- Por lo tanto, el DNA de exffemos romos
mente diferente, pero ambos contienen una secuencia de reconocimien- adquiere extremos cohesivos simple
to para una endonucleasa de restricción y, por ende, producen un mente por ligamiento con los adaptado-
extremo cohesivo después del tratamiento con la enzima adecuada (figu- res: no hay ninguna necesidad de llevar
ru 2.13). Otro modo de crear un extremo cohesivo es agregar una cola a cabo el paso de restricción.
de homopolímeros, en la que los nucleótidos se añaden uno tras otro al
extremo 5' de un extremo romo (figura 2.14). La enzima involucrada,
denominada desoxinucleotidiltransferasa terminal, se detalla en la
siguiente sección. Si la mezcla de reacción contiene DNA, enzima y sólo
uno de los cuatro nucleótidos, Ia nueva extensión del DNA de una sola
cadena consiste únicamente en ese nucleótido. Podría, por ejemplo, ser
una cola de poli(G), que permitiría que la molécula aparease sus bases
con otras moléculas que tienen colas de poli(C), creadas de la misma
manera pero con dCTP en lugar de dGTP en la mezcla de reacción. Molécula de DNA
de extremo romo
(, ,1,
-ffi-
-, I I ¡ t I I I I ¡ I I I l,-,
J.-_-¡.-.é'

3"=",8 Elezi==*= #+ ¡:=*dááicaci*s: Éerr*i.el I Desoxinucleotidiltranlerasa

La desoxinucleotidiltransferasa terminal (véase figura 2.14), obtenida de I terminal + dCTP

tejido tímico de temera, es un ejemplo de una enzima de modificación ter- J

minal. De hecho, es una DNA polimerasa independiente del molde, por- 5'

que puede sintetizar un nuevo polinucleótido DNA sin apareamiento de

bases de los nucleótidos entrantes a una cadena de DNA o de RNA exis-
tente. Como ya se mencionó, su principal función en la tecnología del GGG iGG 6GGG
DNA recombinante consiste en añadir colas de homopolímeros.
{oia de ¡oli(C)
También se ernplean con frecuencia otras dos enzimas de modificación
terminal: la fosfatasa alcalina y la T4 polinucleotidocinasa, que actúan
de manera complementana. La fosfatasa alcalina, que se obtiene de
diversas fuentes, como E. coli y tejido intestinal de ternera, elimina gru- Figura 2.14 Cola de homopolímeros.
pos fosfato de los extremos 5'de las moléculas de DNA, 1o que les impi- En este ejemplo, se sintetiza una cola
de poli(A) en cada extremo de una
de a estas moléculas unirse entre sí. Dos extremos que tienen fosfatos 5'
molécula de DNA de extremos romos.
se pueden unir entre sí, y un extremo fosfatado se puede unir con un Se sintetizan colas que comprenden
extremo no fosfatado, pero no se pueden unir un par de extremos cuan- otros nucleótidos incorporando el dNTP
do ninguno de ellos tiene un fosfato 5'. Por lo tanto, el uso criterioso de apropiado a la mezcla de reacción.
 Capítulo 2 Estud¡o del DNA

Sitios BomHl-----.--.-------- la fosfatasa alcalina puede dirigir la acción de una DNA ligasa de una co
-_-_r/ y'a+ manera predeterminada, de modo de obtener sólo los productos de liga- qu
a 't
-BJ
íB miento deseados. LaT4 polinucleotidocinasa, obtenida de células E. coli se
\ \-,r' infectadas por el bacteriófago T4, realiza la reacción inversa a la de la mi
DNA animal Plásmido de á cc/¡
fosfatasa alcalina: agtega fosfatos a los extremos 5'. Al igual que la fos- ta!.
fatasa alcalina, esta enzima se utiliza durante experimentos de ligamien- ba
II BomHl BamHt
I to complicados, pero su principal aplicación es la marcación terminal de ht
tat
l¡E¡¡{ =j
,?§ é- moléculas de DNA (véase Nota sobre técnicas 2.1).
Cen animal IB
᧠ve

\ 1U-J p€
de
Lrgar
2.? Cl<¡*ariám del Dil{§
I La clonación del DI.{A es una extensión lógica de la capacidad de manipu-
1o
at
He+.
,JB Cen animal lar moléculas de DNA con endonucleasas de restricción y ligasas. Imagine :1
,:
ÉE insertado en el que se ha obtenido un gen animal como un solo fragmento de restricción -
B= plásmido
tras la digestión de una molécula más grande con la enzima de restricción .Lt
== r:i
cé
BamH\ que deja extremos cohesivos 5'-GATC-3' (figura 2.15).Imagine =
' ef
Transformación
asimismo que se ha purificado un plásmido -un pequeño DNA circular a:

capaz de replicarse dentro de una bacteria- a partir de E. coli y se lo ha ;t: br

@ Plásmido tratado con BamHL que corta el plásmido en una sola posición. Así, se ha
ri,

l-."
recombinante € e)
dentro de la convertido al plásmido circular en una molécula lineal, que también tiene
II
Bacteria bacteria extremos cohesivos 5'-GATC-3'. Mezcle las dos moléculas de DNA y it
,-:
,E
coli e1
E.
agregue DNA ligasa. Se obtendrán diversos productos de ligamiento
recombinantes, uno de los cuales comprende el plásmido circularizado
con el gen animal insertado en la posición tomada al principio por el sitio = 1/

de restricción de BamHI. Si ahora se reintroduce el plásmido recombinan- L

te en E. coli y el gen insertado no ha perdido su capacidad de replicación, ^:
se replicará el plásmido más el gen insertado y pasará copias a las bacte-
:1

¡ Replicación dentro :f i1
l, de las bacterias rias hijas después de la división celular. Más ciclos de replicación del plás- *
.z SI
mido y división celular darán origen a una colonia de bacterias E. coli .E
+ f.¿
recombinantes, en la que cada bacteria contendrá múltiples copias del gen a
Colonia i=
animal. Esta serie de eventos, ilustrados en la figura 2.15, constituye el
de E coli
proceso denominado clonación del DNA o de genes. t
u
.É
d
La invención de la clonación de DNA a principios de la década de 1970 revo- v
lucionó la biología molecular al posibilitar experimentos que antes eran t
inconcebibles. Esto se debe a que la clonación puede aportar una muestra r
pura de un gen indiüdual, separado de todos los demás genes de la célula. I
Considere el experimento básico llevado a cabo en forma algo diferente (figu-
Numerosas copias del plásmido recombinante
ra 2.16). En este ejemplo, el fragmento de DNA que se va a clonar es un
miembro de una rnezcla de muchos fragmentos diferentes, cada uno de los
cuales tiene un gen o una parte de gen distinto. De hecho, esta mezcla podría
Figura 2.15 Esquema de la clonación
ser un genoma completo. Cada uno de estos fragmentos se inserta en una
de genes.
molécula plasmídica diferente para generar una familia de plásmidos recom-
binantes, uno de los cuales contiene el gen de interés. Por 1o general, sólo una
molécula recombinante es transportada en cualquier célula huésped aislada,
de manera que, annque el conjunto final de clones puede contener muchas
moléculas recombinantes diferentes, cada clon indiüdual contiene múltiples
copias de sólo una. Ahora, el gen está separado de todos los demás genes de
lamezcla original. I a purificación de la molécula recombinante de la colonia
bacteriana o del cultivo líquido que creció de la colonia anoiarámicrogramos
de DNA, suficientes para el análisis por secuenciación del DNA o por algu-
na de las innumerables otras técnicas creadas para el estudio de genes clona-
dos, muchas de las cuales se tratarán en capítulos posteriores.

2-2-l Vectores de clonación y manera de uiilizarlos

En los experimentos mostrados en las figuras 2.15 y 2.1.6, el plásmido actúa
\
:

Clonación del DNA

como vector de clonación y aporta la capacidad de replicación que

permite -1.-.¡/ -..r _L:.
que el gen clonado se propague dentro de-la célula huésped. Los plásmidos fl ;""' i1 "';' ¡J
:i
ii 9=.- E

," r.plñun de manera éficiente en huéspedes bacterianos, porque cada plás- =t:1..
E,:_ _e/
"-é .r r-_J
mido tiene un origen de replicación que es reconocido por las DNA polime- * --f.*=.:--J
Fi¿:miio.l* Ftagmenios ds DNA
,uru. y otras proieínas que, normalmente, replican los_cromosomas de la
bacteáa (sección 15.2.1). Por ende, la maquinaria de replicación de la célula
\¿
Construir moléculas de DNA recombinante
huésped propaga el plásmido más cualquier gen nuevo que haya sido inser-
iado^en Cst". Aiimismo, se pueden u¡lizar genomas de bacteriófagos como -1* I
.!§¿
vectores de clonación, porque también tienen orígenes de replicación que les ;r:F'* u*-6t'**7.
..u
oermiten propagarse en el interior de las bacterias, ya sea mediante enzimas á1,*_=*,r-
ll É4., f;

áel huéspéd o.*¿iurrt" DNA polimerasas y otras proteínas especificadas por r+--*r Y*=*.t-
t* g"r"i del fago. En las dos iecciones siguientes se analiza cómo se emple-
an lós phsmidoi y los fagos vectores para clonar DNA en E' coli' Cada una lleva un fragmento diferente

Los plásmidos son infrecuentes en los eucariontes, aunqug Saccharomyces

Transformación

cerevisiae tiene uno que, a veces, se emplea con fines de clonación; por
ende, la mayoría de los vectores que se utilizan en células eucariontes están
Retirar de la placa
basados en genomas de virus. En forma alternativa, con un huésped e-uca-
rionte, se p-uede sortear el requerimiento de replicación practicando el
experimento de modo que el DÑA por clonar se inserte en uno de los cro-
móro*u. del huésped. Más adelante en este capítulo se comentan estos
enfoques parala clonación de células eucariontes.

l.'*#ores bassdas en pi*smiics C* E. r*ii ,#.=

g==E;qF"E ----=L
La manera más fácil de comprender cómo se utiliza un vector de clona- ÉáEEB.g
ción es comenzar con los plásmidos vectores de E. coli más simples, que =E#A=E=-#_
L-§
ilustran todos los principi-os básicos de la clonación del DNA. Después,
será posible dirigir la átención a las características especiales de los Cada colonia contiene múltiples copias de sólo

fagos vectores y los vectores empleados en los eucariontes'

-
una molécula de DNA recombinante

Uno de los plásmidos vectores más populares es pUCS, un miembro de Figura 2.16 La clonación puede apor-
una serie dó vectores introducidos por primera vez a principios de la tai una muestra pura de un gen.
década de 1980. La serie puc proviene de un vector de clonación pre-
vio, pBR322, creado originalmente por ligamiento de fragmentos de res-
tricción de tres plásmidos naturales de E. coli: R1, R6.5 y pMBl-'-El
pucS es un plásmido pequeño, que comprende sóLo 2,7 kilobases (kb).
Ásí como su origen de replicación, lleva dos genes (figura 2.17):
Gerr de
resistencia
a la ampicilina
Un gen de resistencia a la ampicilina. La presencia de este gen impli-
qre una bacteria que contiene el plásmido pUCS puede _s.intetizar
"u
una enzima, denominada B-lactamasa, que permite que la célula tole-
re el efecto inhibitorio dei crecimiento áel antibiótico. Esto significa
que es posible distinguir las células que contienen plásmidos puc8
á" uqráUur que no 1o tienen sembrando bacterias en agar con ampi-
ciliná. Las células de E. coli normales son sensibles a la ampicilina y
no pueden crecer en presencia del antibiótico. Por 1o tanto, la resis- Smal, )taol Soll, Accl, Hincll Hindlll

tenóia a la ampicilina es un mareador seleccionable de pUCS'

fcoRl BomH.l Psfl
El gen lacZ' codifica parte de la enzima B-galactosidasa- Ésta pertene-
Crupl de sitios de restricciÓn ilnieos
á unu serie de enzimas que participan en Ia degradación de la lacto-
""
sa a glucosa más galactosá. Normalmente, está codificada por el gen
lacZ,-qre reside eñ el cromosoma de E. coli. Aigunas cepas de E' coli
ptJC8. Se indican las ubi-
Figura 2.17 'sen
tienen un gen lacZ modificado, que carece del segmento denominado
cationes del de resistencia a la
lacZ' queiodifica la porción ü-péptido de la p-galactosidasa. Estos ampicilina, el\en locZ', el origen de
mutanies pueden sintelizar la enzima sólo cuando 4lbergan un plásmi- repiicación (ori) y el grupo de sitios
do, como pUCS, que contiene el segmento faltante IacZ' del gen' de restricción dentro del gen locZ'.
 -
Capítulo 2 Eludio del DNA

Para llevar a cabo un experimento de clonación con pUCS, las manipulacio-

nes mostradas en la figura 2.t5 qtrc determinan la construcción de un plás-
mido recombinante se practican en el tubo de ensayo con DNA purificado.
Se puede obtener DNA puro de pUCS óon bastante facilidad de extractos de
células bacterianas (Nota sobre técnicas 2.3) y, tras Ia manipulación, se pue-
den reintroducir los plásmidos en E. coli por transforrnación, el proceso por
el cual una célula bacteriana capta DNA "desnudo". Éste es el sistema eitu-
diado por Averyy cols. en los experimentos que mostraron que los genes bac-
terianos están compuestos por DNA (sección 1.1.1). La transformación no
es un proceso particularmente eficiente en muchas bacterias, incluida E. coli,
pero es posible aumentar de manera significativa la velocidad de captación
suspendiendo las células en cloruro de calcio antes de agregar el DNA y, des-
pués, incubando brevemente la mezcla a 42"C. Aun después de esta intensi-
ficación, sólo una pequeña proporción de las células capta el plásmido. Esto
explica por qué el marcador de resistencia a la ampicilina es tan importante:
permite seleccionar la pequeña cantidad de células ffansformadas del gran
fondo de células no transformadas.

El mapa de pUCS presentado en la figura 2.17 tndica que el genlacZ'con-

tiene un grupo de sitios de restricción únicos. El ligamiento de DNA nuevo
a cualquiera de estos sitios provoca la inactivación por inserción del gen y,
por lo tanto, la pérdida de la actividad de B-galactosidasa. Esta es la clave

Nota sobre técnicas 2.5 Purificación del DNA

Los técnicas para lo preporación de muestros puras de DNA de célulos vivos desempeñon
un papel fundomentol en lo investigoción en biologío molecular
El primer paso para la purificación del DNA es abrir las
células de las que se obtendrá el DNA. Este paso es
fácil con algunos tipos de material: las células anima-
les cultivadas, por ejemplo, se abren simplemente
agregando un detergente como dodecil sulfato de
sodio (SDS), que rompe las membranas celulares y
libera el contenido celular. Otros tipos de células tie-
nen paredes fuertes y, por lo tanto, exlgen un trata-
miento más duro. Por lo general, las células vegetales
se congelan y, después, se las muele utilizando un
mortero y una mano de mortero, pues es la única
manera eficaz de romper sus paredes de celulosa.
Bacterias como Escherichio coli pueden ser lisadas
mediante una combinación de tratamiento enzimático
y quÍmico. La enzima empleada es lisozima, obtenida
de la clara de huevo, que degrada los compuestos
poliméricos de la pared celular bacteriana, y la sustan-
cia química es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA),
que es un quelante de iones magnesio, lo que reduce
aún más la integridad de la pared celular. La rotura de
la membrana celular, por agregado de un detergente,
causa el estallido de la célula.
Una vez que se han roto las células, se pueden adoptar
dos métodos diferentes para purificar el DNA del extrac-
to resultante. El primero consiste en degradar o eliminar
todos los componentes celulares distintos del DNA, un
método que resulta óptimo si las células no contienen
I I
grandes cantidades de lípidos o hidratos de carbono.
Primero, se centrifuga el extracto a baja velocidad para
eliminar restos, como fragmentos de pared celular, que
forman un microglóbulo en el fondo del tubo (figura
T2.3). El sobrenadante se transfiere a otro tubo de
ensayo y se lo mezcla con fenol, que causa la precipita-
ción de la proteina en la zona de contacto entre las
capas orgánica y acuosa. Se recolecta la capa acuosa,
que contiene los ácldos nucleicos disueltos, y se agrega
una enzima ribonucleasa, que rompe el RNA en una
mezcla de nucleótidos y oligonucleótidos cortos. Ahora,
Ios polinucleótidos DNA, que permanecen indemnes,
pueden ser precipitados agregando etanol, centrifuga-
dos para que formen un microglóbulo y resuspendidos
en un volum'6n adecuado de sustancia amortiguadora.
En el segundo método de purificación del DNA, en
lugar de degradar todo lo que no sea DNA, se elimina
en forma selectiva el DNA del extracto. Una manera de
hacerlo es por cromatografía de intercambio iónico,
que separa las moléculas de acuerdo con su afinidad
de unión a partículas con carga eléctrica en una resina
de cromatografía. Tanto el DNA como el RNA tienen
carga negativa, al igual que algunas proteínas, y, por lo
tanto, se unen a una resina con carga positiva. La
manera más simple de efectuar la cromatografía de
intercambio iónico consiste en colocar la resina en una
columna y agregar el extracto celular a la parte supe-
i

_-t
 Clonación del DNA 49

Capa acuosa
Extracto celular DNA, RNA, proteína (DNA, RNA)
Fenoi {t¿nsi
ti
Transferir la capa acuosa
Transferir I ,:
I
el sobrenadante * a un nuevo tubo, incubar
Centrifugar
| ,,
;€
centrifusar I a un nuevo tubo Centrifugar con ribonucleasa :;.:
:.r+:
:

4
,§ Zona de contacto
(proteínas coaguladas)
,', "t'

I
l
I

Restos DNA
celulares precipitado

Figura T2.3 Purificación del DNA a partir de un extracto

celular por degradación o eliminación de todos los
demás componentes. '

rior (figura T2.4).El extracto pasa a través de la colum-

na y todas las moléculas con carga negativa se unen a Extracto
la resina. El agregado de una solución salina puede celular
romper la unión, que implica interacciones iónicas; las
moléculas unidas con menos firmeza se desprenden t:
de la resina con concentraciones de sal relativamente
bajas. Esto implica que, si se hace pasar a través de la
columna una solución salina cada vez más concentra- Sal Más sal
da, se observa elución de diferentes moléculas en la
secuencia proteína, RNA y DNA, lo que refleja su afini-
dad de unión relativa. De hecho, en general no se
necesita una separación tan cuidadosa, de modo que
Resina de
se emplean sólo dos soluciones salinas: una que con- intercambio
tiene NaCl 1 M a pH 7, suficiente para eluir la proteína iónico
y el RNA, dejando unido sólo el DNA, seguida de una
iegunda solución con NaCl 1,25 M a pH 8,5, que
eluye el DNA, ahora sin contaminantes de proteína o
RNA.

Estos dos métodos purifican todo el DNA de una célula. Proteína

Se requieren procedimientos especiales si el objetivo es y RNA .--l ,:¡ .;:.:r
'És
§
a
obtener sólo DNA de plásmidos de células bacterianas (p. S Desechar DFiA
ej., vectores de clonación recombinantes). Un método
popular aprovecha el hecho de que, si bien los plásmidos
y el cromosoma bacteriano están comPuestos por DNA
superenrollado, la lisis de la célula bacteriana determina,
inevitablemente, cierto grado de rotura del cromosoma
bacteriano, Io que induce lb pérdida del suPerenrolla
miento. Por lo tanto, un extracto celular contiene DNA del
plásmido superenrollado y DNA cromosómico no suPer-
enrollodo, y los plásmidos se pueden purificar Por un
método que distingue entre moléculas de DNA con estas
diferentes conformaciones. Una técnica consiste en aña-
dir hidróxido de sodio hasta que el pH del extracto celu-
lar llegue a 12-12,5, que rompe los pares de bases del
DNA no superenrollado. Las cadenas simples resultantes
se enredan en una red insoluble que puede extraerse Por
centrifugación, lo que deja los plásmidos superenrollados Figuraf2.4 Purificación del DNA por cromatografía de
en el sobrenadante. intercambio iónico.
 Capítulo 2 E(udio del DNA

para distinguir un plásmido recombinante -uno que contiene un fragmento

de DNA insertado-- de un plásmido no recombinante, que no tiene DNA
nuevo. Es importante reconocer los recombinantes, porque las manipulacio-
nes ilustradas en las figuras 2.15 y 2.16 dan origen a diversos productos de
ligamiento, incluidos plásmidos que se han recirculaizado sin inserción de
DNA nuevo. De hecho, investigar la presencia o la ausencia de B-galactosi-
dasa es bastante fácil. En lugar de analizar si la lactosa se degrada a glucosa
y galactosa, la presencia de moléculas de B-galactosidasa funcional en las
células se verifica mediante una prueba histoquÍmica con un compuesto
denominado X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-B-n-galactopiranósido), que la
erukna conüerte en un producto ansl. Si se añade X-gal (más un inductor de
la enzima como isopropiltiogalactósido, IPTG) al agar, junto con ampicilina,
las colonias no recombinantes, cuyas células sintetizan B-galactosidasa, se

Figura 2.18 Selección de Cen de

resistenci¿
recombinantes con pUC8. ampicilina

pUCs
g*ri lo;l in:e*o de DiiiA
recombinante
EI D

La p-galactosidasa produio Ausencia de p-galactosidasa, por

la división de X-gal a un lo que no hay división de X-gal
producto azul

Agar + ampicilina + X-gal

colorearán de azti, mientras que las recombinantes, con alteración del gen
lacZ', que no pueden fabricar B-galactosidasa, serán blancas (figura 2.18).
Este sistema se llama selección Lac.

Vectares de clonacíón bssados en gefiomss

de bscteriófogos de E. coli
Los bacteriófagos de E. coli se desarrollaron como vectores de clona-
ción allá por los primeros días de la revolución del DNA recombinan-
te. La principal raz6n para buscar un tipo de vector diferente fue que
los plásmidos como el pUCS no podían manejar los fragmentos de
DNA superiores a alrededor de 10 kb, insertos más grandes someti-
dos a reordenamientos o que interferían en el sistema de replicación
del plásmido de modo que las moléculas de DNA recombinantes se
'perdían de las células huésped. Los primeros intentos para obtener
vectores capaces de manejar fragmentos más grandes de DNA se cen-
traron en el bacteriófago fu.

Para replicarse, un bacteriófago debe ingresar en una célula bacteria-

na y hacer que las enzimas de la bacteria expresen la información
contenida en los genes del fago, de manera que la bacteria sintetice
nuevos fagos. Unavez que se ha completado la replicación, los nue-
vos fagos abandonan la bacteria y, por lo general, provocan su muer-
te al hacerlo, y pasan a infectar nuevas células (figura 2.19A). Esto
se denomina ciclo de infección lítica, porque determina la lisis de la
bacteria. El fago l, (a diferencia de muchos otros tipos de bacteriófa-
go) también puede cumplir, además del ciclo lítico, un ciclo de infec-
:

Clonación del DNA 5t

DNA cubt'u
Figura 2.19 Ciclos de infección lítica
irli**: ¡:*i.ri,:; Bacteriófago I y lisogénica del bacteriófago I. (A)
Cola En el ciclo lítico, se producen nuevos
fagos poco después de la infección.
r El bacteriófago 1.
(B) Durante el ciclo lisogénico, el
*I se une a una
bacleriaE. coli
eenoma del faso se ¡nserta en el DNA
Eromosómico ie la bacteria, donde
puede permanecer latente durante
muchas generaciones.

Se inyecta DNA 1.
al interior de
la célula

(A) Ciclo de infección lítica

4€§ ,, (B) Ciclo de infección lisogénica

lntegración del DM 1,
El DNA 1. dirige la síntesis ) ^
de nuevos fagos I \ al cromosoma bacteriano

=.<.'
*:{
=:a
*-,* _

Lisis celular Regreso al ciclo lítico DNA ), integrado al

I después de
muchas divisiones
cromosoma bacteriano

de la célula bacteriana
-a-^,a
i rJ.'\¡t+r:I ,..t
-+
i J" t
'. \-rli./J'..
:t
--*
"--- :- --
,--.-*
:t¡
-
Se liberan
nuevos fagos X,

Lisis celular
I
*'*
J
rñ^.ru.:-]
'. .§
t Se liberan
v\-/4/d -
-+ nuevos fagos 1,
.:i.

ción lisogénica, durante el cual el genoma i" se integra al cromoso-

ma bactáriano, donde puede permanecer latente durante muchas
generaciones y se replica junto con el cromosoma huésped cada Yez
que la célula se divide (figura 2.L9B).
El tamaño del genoma l, es de 48,5 kb, de las cuales más o menos 15 kb son
"opcionales", pues contienen genes que sólo se necesitan para la integración
del ONe del fago al cromosoma de E. coli (frgtra2.2OA). Por consiguiente,
estos segmentos se pueden suprimir sin alterar la capacidad del fago deinfec-
tar bacterias y dirigir la sÍntesis de nuevas partículas fu a través del ciclo líti-
co. Se han desarrollado dos tipos de vectores (figura 2.208):
Vectores de inserción, en los que se ha eliminado parte del DNA
opcional o su totalidad, y se ha introducido un único sitio de restric-
ción en alguna posición dentro del genoma recortado'
Vectores de reemplazo, en los que el DNA opcional está contenido
 Capítulo 2 Estudio del DNA

Figura 2.2O Vectores de clonación (A) EI genoma l" contiene DNA'bpcional"

basados en el bacteriófago 1,. (A) En
Cub¡erta proteica lntegración al DNA huesped
el genoma 1", los genes están dispues-
tos en grupos funcionales. Por ejem- Funciones d.l c." I I neplicación del DlrlA

plo, la región marcada como "cubierta I Lisiscerurar

proteica" comprende 21 genes que Genoma X,

l_LI
codifican proteínas que componen la
cápside del fago o son necesarias para TT
L¿s dele.icnes en este lL:gar
el ensamblaje de la cápside, y la de no ;íert¿n ei.;.io liiico
"lisis celula/' comprende cuatro genes
involucrados en la lisis de la bacteria al
(B) Vectores de inserción y de reemplazo
final de la fase lítica del ciclo de infec-
ción. Se indican en verde las regiones R
del genoma que se pueden suprimir #E=ffi
Vector de
:--^-jÁ-1 Vectorde . R R

,..rpriro ¡.
sin alterar la capacidad del fago para
cumplir el ciclo litico. (B) Diferencias I DNA nuevo insertado DNA nuevo reemplaza al
I
entre un vector de inserción 1" y un I en el sitio de restricción +
vector de reemplazo 1".
RR

R = sitio de relricción

dentro de un fragmento de la parte central (sruffer fragment), flan-

queado por un par de sitios de restricción, que es reemplazado cuan-
do se liga al vector el DNA que va a ser clonado.
El genoma ), es lineal, pero los dos extremos naturales de la molécula tienen
segmentos protuberantes monocatenarios de 12 nucleótidos, denominados
sitios cos, que presentan secuencias complementarias y, por ende, pueden
aparear sus bases entre sí. Por lo tanto, se puede obtener un vector de clona-
ción )" como una molécula circular que puede ser manipulada en el tubo de
ensayo de la misma manera que un plásmido y reintroducida en E coli por
transfección, término aplicado a la captación de DNA desnudo del fago.
Como alternativa, se puede recurrir a un sistema de captación más eficiente
denominado empaquetamiento in vitro. Este procedimiento comienza con la
versión lineal de un vector de clonación; la restricción inicial corta la molé-
cula en dos segmentos, los brazos izquierdo y derecho, cada uno con un sitio
cos en un extremo. El ligamiento se lleva a cabo con cantidades de cadabrazo
cuidadosamente medidas y el DNA que se va a clonar; el objetivo es produ-
cir concatárneros en los que los distintos fragmentos estén unidos en el orden
btazo aquierdo-DNA nuevo-brazo derecho, como se muestra en la figura
2.21. Después, se agregan los concatárneros a :.:r:ramezcla de empaqueta-
miento in vitro, que contiene todas las proteínas necesarias para fabricar una
partícula de fago )". Estas proteínas forman partículas de fago de manera
espontánea e incorporarán a las partículas cualquier fragmento de DNA que
tenga entre 37 kby 52kb de longitud y esté flanqueado por sitios cos. Por 1o
tanto, la mezcla de empaquetamiento corta las combinaciones brazo aquier-
do-DNA nuevo-brazo derecho de 37-52 kb liberándolas de los concatámeros
y construye fagos i, alrededor de ellas. Después, se mezclan los fagos con
células de E. coli y el proceso de infección natural transporta el vector más el
DNA nuevo al interior de las bacterias.

Tras la infección, se extienden las células sobre una placa de agar. El objeti-
vo no es obtener colonias individuales, sino producir una capa uniforme de
bacterias sobre toda la superficie del agar. Las bacterias infectadas por el vec-
tor de clonación empaquetado mueren en el término de 20 minutos porque
los genes l, contenidos en los brazos del vector dirigen la replicación del DNA
y la síntesis de nuevos fagos por el ciclo lítico, y cada uno de estos nuevos
fagos contiene su propia copia del vector más eI DNA clonado. La muerte y
 Clonación del DNA 53

Sitios cos
Figura 2.21 Clonación con un vec-
tor de inserción L. La parte superior
5' ¡' Vectorde inserción, del diagrama muestr'a la forma lineal
3' 5, versión lineal
del vector. El tratamiento con la endo-
I Restringir nucleasa de restricción adecuada pro-
J duce los brazos izqulerdo y derecho,
que tienen, ambos, un extremo romo
*.r* ffi
Braio izquierdo
y un extremo con los l2 nucleótidos
Brazo derecho que sobresalen del sitio cos. El DNA
que va a ser clonado es de extremo
I Ligar con
romo y, así, está insertado entre los
I";'.r!.'-::..'
dos brazos durante el paso de liga-
miento. Estos brazos también se ligan
=- i-Effi= ali.t,l int.iii,riii
entre sí a través de sus sitios cos y
forman un concatámero. Algunas par-
tes del concatámero comprenden
brazo izquierdo-DNA insertado-brazo
derecho y, si se asume que esta com-
Rcos L Rcos L RcosL Rcos L
binación tiene de 37 a 52 kb de lon-
zi
gitud, estará encerrada dentro de la
Puede ser empaquetado Demasiado corto cápside por la mezcla de empaqueta-
Para ser empaquelado miento in vitro. Partes del concatáme-
I; ro formadas por el brazo izquierdo
ligado directamente al brazo derecho,
,tÉ, sin DNA nuevo, son demasiado cortas
':{--" para ser empaquetadas.
:
-

Bacteriófago )" infeccioso

la lisis de la bacteria liberan estos fagos al medio circundante, donde infectan

nuevas células y comienzan otro ciclo de replicación del fago y lisis. El resul-
tado final es una zona de aclaramiento, denominada placa, que se visualiza
sobre el campo de bacterias que crece sobre la placa de agar (figura 2.22).
Con algunos vectores 1", todas las placas están compuestas por fagos recom-
binantes, pues el ligamiento de los dos brazos sin inserción de DNA nuevo
da origen a una molécula demasiado corta para ser empaquetada. Es necesa-
rio distinguir las placas recombinantes de las placas no recombinantes con
otros vectores. Se emplean diversos métodos, como el sistema de B-galacto-
sidasa descrito antes para el plásmido vector pUC8 (véase.figura 2.18) que
también es aplicable a los vectores 1" que contienen un fragmento del gen
lacZ en el que se inserta el DNA que va a ser.clonado.

Verlor*s pcro f{sgmentas mós largos de DNA

La partícula del fago l" puede albergar hasta 52 kb de DNA, de modo que si
el genoma tiene 15 kb eliminadas, se pueden clonar hasta 18 kb de DNA
nuevo. Este lÍmite es más alto que el correspondiente a los plásmidos vecto-
res pero es, aun así, muy pequeño respecto de los tamaños de los genomas
indemnes. La comparación es importante porque el punto de partida de un
proyecto destinado a determinar la secuencia de un genoma suele ser una C*
genoteca de clones: un conjunto de clones cuyos insertos cubren todo trn
genoma (capítulo 4). Si se útl.za un vector fu con DNA humano, se requiere
más de medio millón de clones para que haya una probabilidad del95o/o de
que cualquier parte particular del genoma esté presente en la genoteca (cua- lnfección visible como una placa o zona "despoblada
dro 2.4). Es posible preparar una genoteca con medio millón de clones, sobre entre una proliferación bacteriana en forma de "césped"
todo si se aplican técnicas automatizadas, pero un conjunto tan grande dista
de ser ideal. Sería mucho mejor reducir el número de clones utilizando un
vector que pueda manejar fragmentos de DNA de más de 18 kb. Gran parte Figura 2.22 La infección por bacte-
de los trabajos en técnicas de clonación de los últimos veinte años han esta- riófagos se visualiza como una
do orientados a alcanzar este objetivo placa sobre un campo de bacterias.
 Capítulo 2.Estudío del DNA

Una posibilidad es emplear un cósmido: un plásmido que lleva un sitio cos-X.

(figura 2.23). Los concatámeros de moléculas de cósmidos, ligadas por sus
sitios cos, actúan como sustratos para el empaquetamiento in vitro, porque
el sitio cos es la única secuencia que necesita una molécula de DNA para ser
reconocida como un "genoma X," por las proteinas que empaquetan DNA en
partículas de fago 1". Las partículas que contienen DNA del cósmido son tan
infectantes como los fagos l" reales pero, una vez dentro de la célula, el cós-
mido no puede dirigir la síntesis de nuevas partículas de fago y, en su luga4
se replica como un plásmido. Por lo tanto, se obtiene DNA recombinante de
colonias, más que de placas. AJ igual que otros tipos de vector 1", el limite
superior de longitud del DNA clonado depende del espacio disponible den-
tro de la partícula de fago ),. Un cósmido puede medir 8 kb o menos, de
manera que es posible insertar hasta 44 kb de DNA nuevo antes de alcanzar
el límite de empaquetamiento del fago 1". Esto reduce el tamaño de la geno-
teca genómica humana a alrededor de un cuarto de millón de clones, lo que
representa una ventaja respecto de una genoteca 1,, pero todavía es un núme-
ro masivo de clones para tener que trabajar con é1.

El primer avance importante en los intentos de clonar fragmentos de

DNA mucho más largos de 50 kb provino de la invención de cromo-
somas artificiales de levadura o YAC. Estos vectores se propagan en
S. cerevisiae y no en E. colí, y están basados en cromosomas, en lugar
de en plásmidos o virus. Los primeros YAC se construyeron después
de que estudios sobre cromosomas naturales habían mostrado que,
además de los genes que contiene, cada cromosoma tiene tres compo-
nentes importantes (figura 2.24):

El centrómero, que desempeña un papel crucial durante la diüsión

nuclear.
Los telómeros, secuencias especiales que marcan los extremos de las
moléculas de DNA cromosómico.

Cuadro 2.4 Tamaños de genotecas genómicas humanas preparadas en diferentes tipos de vectores de clonación

De reemplazo l" t8 532.500 820.O00

Cósmido, fósmido 40 240.000 370.000
',l8.OOO
PI 25 77.OOO I
BAC, PAC 300 32.OOO 50.000
YAC 600 r 6.000 24.500
Mega-YAC 1.400 6.850 o.500

+Calculado a partir de la ecuación:

A/ _
ln ll-P)
,v__
tn /t-q\
\ b)
donde N es el número de clones requerido, P es la probabilidad de que cualquier segmento d¿do del genoma esté presente en la genoteca, o es el tamaño
promedio de los fragmentos de DNA insertados en el vector y b es el tamaño del genoma.
f

Clonación del DNA

+ Uno o más orígenes de replicación, que inician la síntesis de DNA BamHl

nuevo cuando se divide el cromosoma.

En un YAC, las secuencias de DNA, que son la base de estos com-

ponentes cromosómicos, están ligadas con uno o más marcadores
ieleccionables y no menos de un sitio de restricción en el que se DJBB
DNA ''
puede insertar DNA nuevo (figura 2.25). Todos estos componentes s,+ r,¡
pueden estar contenidos en una molécula de DIIIA de 10-15 kb. Los
cromosomas de levadura naturales varían de 230 kb a más de 1.700
kb, de manera que los YAC tienen la posibilidad de clonar fragmen-
tos de DNA de megabases (Mb). Esta posibilidad se ha cumplido:
los YAC estándares pueden clonar fragmentos de'600 kb y tipos
especiales pueden manejar DNA de hasta 1.400 kb de longitud. Esta
es la máxima capacidad de cualquier tipo de vector de clonación y
varios de los primeros proyectos sobre genomas utilizaron mucho Figura 2.23 Cósmido típico. pJBS
los YAC. Lamentablemente, ha habido problemas de estabilidad del mide 5,4 kb y contiene el gen de
resistencia a Ia ampicilina (ompa), un
inserto con algunos tipos de YAC y el DNA clonado se reordenaba segmento de DNA l, que contiene el
en nuevas combinaciones de secuencias. Por esta taz6rt, también sitio cos y un origen de replicación
hay gran interés en otros tipos de vectores, que no pueden clonar (ori) de Escherichio coli.
fragmentos tan grandes de DNA, pero que presentan menos proble-
mas de inestabilidad. Estos vectores son los siguientes:

Cromosomas artificiales bacterianos o BAC. Están basados en el

plásmido natural F de E. coli. A diferencia de los plásmidos utili-
zados para construir los primeros vectores de clonación, el plásmi-
do F es relativamente grande y los vectores basados en él tienen
una capacidad más alta para aceptar insertos de DNA. Los BAC
están diseñados de manera que se puedan identificar los recombi-
nantes por selección Lac (véase figura 2.1.8) y, por ende, son fáci-
les de usar. Pueden clonar fragmentos de 500 kb y más largos, y
los insertos son muy estables. Los BAC se utilizaron mucho en el
Proyecto Genoma Humano (sección 4.3) y, en la actualidad, son
los vectores más populares para clonar grandes fragmentos de DNA.
Vectores derivados del bacteriófago Pl. Son muy similares a los
vectores 1, y están basados en una versión suprimida de un geno-
ma de fago natural; la capacidad del vector de clonación depende
del tamaño de la supresión y del espacio dentro de la partícula de
fago. El genoma Pl es más grande que el genoma i,, y la partícula
de fago es más grande, de modo que un vector derivado de P1
puede clonar fragmentos de DNA más grandes que un vector fu,
hasta de 125 kb aplicando las técnicas actuales.
Cromosomas artificiales derivados de Pl o PAC. Combinan las
características de los vectores derivados de P1 y de los BAC y tie- Telómero
nen una capacidad de hasta 300 kb. Posiciones de los
orígenes de
Fósmidos. Contienen el origen de replicación del plásmido F y un Centrómero la replicación
sitio cos 1,. Son similares a los cósmidos, pero tienen un número
más bajo de copias en E. coli,lo que significa que son menos pro- Telómero
clives a problemas de inestabilidad.

En el cuadro 2.4 se presentan los tamaños de las genotecas de genoma águra 2.24 Componentes estructura-
humano preparadas en estos diversos tipos de vectores. les claves de un cromosoma euca-
rionte. Véase más información sobre
estas estructuras en las secciones
Clonación
^l
en microorgonismos dístíntos de E. coli 7.1.2 (centrómeros y telómeros) y
La cloáación no sólo es una forma de producir DNA para secuenciación y 15.2.1 (orígenes de la replicación).
 Capítulo 2 Estudio del DNA

otros tipos de análisis. También brinda un medio para estudiar el modo de (

expresión de un gen y la regulación de la expresión, llevar a cabo experi- (
mentos de manipulación genética dirigidos a modificar las características
biológicas del organismo huésped y sintetizar proteínas animales importan- (

tes, como agentes farmacéuticos, en una nueva célula huésped de la que se

pueden obtener las proteÍnas en mayores cantidades de las que es posible l
lograr mediante purificación convencional de tejido animal. Estas diversas
l

(A) pYAC3

CEN4 Centrómero del cromosoma de levadura lV

TEL Telómero
o:': Origen de replicación
TRPI )
suP4 | Mur.udor., seleccionables
URB )

(B) Clonación con pYAC3

Brazo izquierdo
Restringir con BamH.ly SnoBl

I Ligar con inserto de DNA de extremo romo

I
I

I URA3 TEL

Inse¡-i.:i DNA

ágtm2.25 Trabajo con un YAC (A) Vector de clonación pYAC3. (B) Para clonar con
pYAC3, se digiere el vector circular con BomHl y SnoBl. La restricción con BomHl elimi-
na el fragmento de la parte central (stuffer frogment) mantenido entre los dos telóme-
ros en la molécula circular. SnoBl corta dentro del gen SUP4 y aporta el sitio en el que
será insertado el DNA nuevo. El ligamiento de los dos brazos del vector con DNA
nuevo genera la estructura ilustrada en la parte inferior. Esta estructura contiene copias
funcionales de los marcadores seleccionables IRPI y URA3. La cepa huésped tiene
copias desactivadas de estos genes, lo que implica que requiere triptófano y uracilo
como nutrientes. Después de Ia transformación, se siembran las células en un medio
mínimo que carece de triptófano y uracilo. Sólo pueden sobreüvir y formar colonias en
este medio las células que contienen el vector y, por lo tanto, pueden sintetizar fiptófa-
no y uracilo. Obsérvese que, si un vector consile en dos brazos derechos o dos brazos
izquierdos, no dará origen a colonias porque la célula transformada carecerá todavla de
uno de los nutrientes. Se verifica la presencia de DNA insertado en las moléculas del
vector clonado investigando la desachvación de SUP4. Esto se lleva a cabo mediante
una prueba de color: en el medio apropiado, las colonias que contienen vectores
recombinantes (con un inserto) son blancas; las no recombinantes
(vecto[ pero sin inserto) son rojas.
 Clonación del DNA

aplicaciones exigen que los genes deban ser clonados con frecuencia en
organismos distintos de E. coli.

Se han desarrollado vectores de clonación basados en plásmidos o fagos

para la mayoría de las especies de bacterias bien estudiadas, bomo
bacillus, Streptomyces y Pseudomonas, que se utilizán exactamente de
la misma manera que los análogos de E. coli. También se dispone de
plásmidos vectores para levaduras y hongos. Algunos de ellos contienen
é1 origen de replicación del círculo de 2 pm, un plásmido presente en
muchas cepas de S. cerevisiae, peto otros plásmidos vectores sólo tiene
un origen de E. coli. Un ejemplo es YIp5, un vector para S. cerevisiae
que es, simplemente, un plásmido de E. coli que contiene una copia del
gen de levadura denominado LIRA3 (figura 2.26A). La presencia del ori- Figura 2.26 Clonación con un Ylp.
(A) Ylp5, un plásmido integrado a leva-
+ [en de E. coli implica que YIp5 es un vector versátil o lanzadera (shut- dura típico. El plásmido contiene el gen
tle vec'tor), que se puede utiltzar con E. coli o S. cerevisiae como de resistencia a la ampicilina (omp\,
huésped. Ésta es una característica útil, porque la clonación en S. cere- el gen de resistencia a la tetraciclina
visiae es un proceso bastante ineficiente y es difícil generar un gran (fefl, el gen de levadura URA3 y un
número de clones. Si el experimento requiere que se identifique el origen de replicación (ori) de
recombinante deseado entre una mezcla de clones (como ilustra la figu- Escherichio coli. La presencia del ori de
E. coli implica que se pueden construir
ra 2.16), a veces no es posible obtener suficientes recombinantes para
moléculas Ylp5 recombinantes en E
hallar el correcto. Para evitar este problema, se efectúa la construcción coli antes de su transferencia a células
de las moléculas de DNA recombinante y la selección del recombinante de levadura. Por lo tanto, Ylp5 es un
correcto utilizando E. coli como huésped. Cuando se han identificado vector versátil o lanzadera (shuttle
los clones correctos, las moléculas YIp5 recombinantes son purificadas vector), porque puede ser traspasado
y transferidas a S. cerevisiae, en general mezclando el DNA con proto' entre dos especies. (B) Ylp5 no tiene
plastos (células de levadura cuyas paredes han sido eliminadas por tra- ningún origen de replicación que
pueda funcionar dentro de células de
tamiento enzimático). Sin un origen de replicación, el vector no puede
levadura, pero puede sobrevivir si se
propagarse de manera independiente dentro de las células de levadura, integra al DNA cromosómico de la
pero puede sobrevivir si se integra a uno de los cromosomas de la leva- levadura por recombinación homóloga
dura, lo cual puede tener lugar por recombinación homóloga (sección entre el plásmido y las copias cromo-
5.2.2) entre el gen URA3 del vector y la copia cromosómica de este gen sómicas del gen URA3.El gen cromo-
(figura 2.26r_). De hecho, "YIp" representa un "plásmido integrado a sómico presenta una pequeña
levadura". rJnavezintegrado, el YIp, más cualquier DNA que se le haya mutación que implica que no es fun-
cional r7 las células huésped son uro3-.
insertado, se replica junto con los cromosomas huésped. Uno del par de genes UMJ formados
después de la integración del DNA del
La integración al DNA cromosómico también es una característica de plásmido está mutado, pero el otro no.
Por lo tanto, las células recombinantes
muchoJde los sistemas de clonación utilizados con animales y plantas, y son uro3+ y pueden ser seleccionadas
forma la base de la creación de los ratones lcnockout (con desactivación por siembra en medio mínimo, que no
génica), que se emplean para determinar las funciones de genes, antes des- contiene uracilo.

(B) lnserción de Ylp5 en el DNA cromosómico de levadura

Ylo5
omff r.i Lu
Mutación \,," Recomb¡nación homóloga
\ \ _'\
DNA cromosómico de levadura ; i :. ét.5Má¡

I Ausencia de mutación

DNA de Ylp5 integrado


Capítulo 2 Estudio del DNA
Sitios de restricción
Límiie izquirrdo
úel i'ul\A
pBlN l9
t0 kb
Lin'tite derech{i
"i-DNA
Cei
Figura 2.27 Vector de clonación de
plantas pBlN19. pBIN19 contiene el
gen lacZ' (véase figura 2.18), el gen de
resistencia a la kanamicina (konR), un
origen de replicación de Escherichio
coli (ori) y las dos secuencias limÍtrofes
de ia región T-DNA del plásmido Ti.
Estas dos secuencias limítrofes se
recombinan con DNA cromosómico
veget¿l por inserción del segmento de
DNA entre ellas en el DNA de la plan-
ta. La orientación de las secuencias
Iimítrofes en pBlN19 significa que los
genes lacZ'y konR, así como cualquier
DNA nuevo ligado a los sitios de res-
tricción dentro de locZ', son transferi-
dos al DNA de la planta. Se
seleccionan las células vegetales
recombinantes por siembra en agar
kanamicina y, después, son regenera-
das en plantas completas. Obsérvese
que el pBlN19 es otro ejemplo de vec-
tor versátil o lanzadera (shuttle vecto),
las moléculas recombinantes se cons-
truyen en E. coli utilizando el sistema
de selección locZ', antes de la transfe-
rencia a Agrobocterium tumefociens y,
desde alh, a la planta.
I
conocidos, que se descubren en el genoma humano (sección 5.2.2). Los vec;
tores son equivalentes animales de YIps. Los adenovirus y los retroürus se
utilizan para clonar genes en animales cuando el objetivo es tratar una enfer-
medad genética o un cáncer mediante terapia génica. Se ha creado un espec-
tro simiiar de vectores para clonar genes vegetales. Se pueden introducir
plásmidos en embriones'de plantas por bombardeo con microproyectiles
revestidos de DNA, un proceso denominado biolística. La integración del
konR
DNA del plásmido a los cromosomas de la planta, seguida del crecimiento
de los embriones, da por resultado una planta que contiene el DNA clona-
do en la mayoúa de sus células o en todas ellas. También se ha logrado cier-
to éxito con vectores vegetales basados en los genomas de caulimovirus y
geminiürus, pero los tipos más interesantes de vector de clonación vegetal
son los derivados del plásmido Ti, un gran plásmido bacteriano hallado en
el microorganismo del suelo Agrobacterium tumefaciens.Parte del plásmi-
do Ti, la región denominada T-DNA, se integra al cromosoma de la planta
cuando la bacteria infecta su tallo y causa una enfermedad denominada-¿ga-
Ila de la corona. El T:DNA contiene diversos genes que se expresan dentro
de las células vegetales e inducen los cambios fisiológicos que caracteizan
a la enfermedad. Se han diseñado vectores como pBIN19 (figura 2.27) para
aprovechar este sistema natural de ingeniería genética. Se introduce el vec-
tor recombinante en células de A. tumefaciens y se permite que éstas infec-
ten una suspensión de células o un cultivo de callos de planta, a partir del
cual se pueden regenerar plantas maduras, transformadas.
3.3 ReaeeÉéae effi €Gd*sEál de Ia polimerasa {F{R}
La clonación del DNA es una técnica poderosa y su repercusión sobre
nuestro conocimiento de los genes y los genomas ha sido inconmensura-
ble. Sin embargo, tiene una desventaja importante: es un procedimiento
que insume tiempo y es, en patte, difícil. Demanda varios días realizar las
manipulaciones necesarias para insertar fragmentos de DNA en un vec-
tor de clonación y, después, introducir la molécula ligada en las células
huésped y seleccionar recombinantes. Si la estrategia experimental impli-
ca la generación de una gran genoteca de clones, seguida de la investiga-
ción de la genoteca para identificar un clon que contiene el gen de interés
(véase Nota sobre técnicas 2.4), se podrían requerir varias semanas más,
o aun meses, para completar el proyecto.
's
La PCR complementa la clonación del DNA porque permite alcanzar el s
mismo resultado -la purificación de un determinado fragmento de DNA- :*
pero en un tiempo mucho más breve, quizá sólo algunas horas. La PCR
complementa la clonación, no la reemplaza, porque tiene sus propias limi-
É
taciones, la más importante de las cuales es la necesidad de conocer la
secuencia de por 1o menos parte del fragmento que va a ser purificado. Pese
a esta limitación, la PCR ha adquirido una importancia fundamental en
muchas áreas de investigación en biología molecular. Examinaremos pri-
a
==
mero la técnica y, después, estudiaremos sus aplicaciones.
2.5,I Fráctica de una PCR
La PCR determina el copiado reiterado de una determinada región de una
molécula de DNA (véase figura 2.3). A diferencia de la clonación, la PCR es
una reacción de tubo de ensayo y no implicala uttlización de células vivas:
no son las enzimas celulares las que realizan la copia, sino la DNA polimera-
sa termoestable, purificada, de T. aquaticus (sección 2.1.1). La razón por la
que se necesita una enzima termoestable se comprenderá cuando se analicen
con más detalle los fenómenos que oculren durante la PCR
 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 59

Nota sobre técnicas 2.4Trabaio con una genoteca de clones

Se emplean conjuntos de clones como fuente de genes y olros segmentos de DNA
Desde la década de I 970, se han preparado genotecas de
clones de diferentes organismos como medio de obtener
genes individuales y otros segmentos de DNA para estu-
diarlos mejor por secuenciación y otras técnicas de DNA
recombinante. Se pueden preparar Senotecas de DNA
genómico o cDNA utilizando como vector un plásmido o
un bacteriófago. Por lo general, los clones se almacenan
como colonias o placas bacterianas en placas de agar de
23 x 23 cm, con 100.000-l 50.0OO clones por placa. Por
lo tanto, tan sólo l-8 placas pueden contener una Seno-
teca humana completa, según el tipo de vector de clona-
ción que se haya utilizado (véase cuadro 2.4). Tres
métodos permiten identificar el clon que contiene el gen
u otro fragmento de DNA que se está buscando:
de con la localización del clon de interés en la placa de agar.
La PCR (sección 2.3) se puede utilizar para investigar la
secuencia de interés en clones. Esto no se puede efectuar in
situ, de manera que se deben transferir clones individuales a
los pocillos de bandejas de microtitulación. Por lo tanto, la PCR
es relativamente engonosa para identrfcar clones, Porque
sólo se pueden colocar unos pocos cientos de ellos en una
sola bandeja. Las PCR que emplean cebadores especÍficos
para la secuencia de interés se practican con cada cion por vez
y se aplica, quizá, un enfoque combinatorio para reducir la
cantidad de PCR necesarias para identificar el que da un resul-
tado positivo (véase figura 4.14).

Se puede recurrir a técnicas inmunológicas si la secuencia

El análisis de hibridación se puede practicar con un oligonu-
buscada es un gen expresado por la célula en la que se ha
cleótido u otra molécula de DNA marcado, que se sePa que preparado la genoteca de clones. Si hay expresión del gen,
se hibrida con la secuencia de interés. Para hacerlo, se coloca
se fabricará el producto proteico, que se puede detectar
una membrana de nailon o de nitrocelulosa sobre la superfi-
investigando la genoteca con un anticuerpo marcado que
cie del plato de agar; después, se la retira con cuidado para
se une sólo a esa proteína. Como en el análisis de hibrida-
"levanta/' las colonias o las placas. El tratamiento con álcali o
ción, primero se transfieren los clones a una membrana y,
proteasa degrada el material celular, lo que deja detrás el DNA
después, se los trata para romper las células y unir la pro-
de cada clon que, luego, se une estrechamente a la superfi-
teína a la superficie de la membrana. Luego, la exposición
cie de la membrana por calentamiento o Por irradiación ultra-
de la membrana al anticuerpo marcado revela la posición
violeta. En este momento se aplica la sonda marcada a la
del clon que contiene el gen de interés.
membrana, del mismo modo que en la hibridación Southern
(figura 2.11) y se determina la posición a la que se une la
sonda mediante el método de detección adecuado. La posi-
ción de la señal de hibridación en la membrana se correspon-

Para efectuar un experimento de PCR, se mezcla el DNA diana con Taq DNA
polimerasa, un par de oligonucleótidos cebadores y una provisión de nucleó-
tidos. La cantidad de DNA diana puede ser muy pequeña, porque la PCR es
strmamente sensible y trabaiaú con sólo una molécula inicial aislada. Se
requieren cebadores para comenzar las reacciones de sÍntesis de DNA que Región que va a ser amplificada

llevará a cabo la Taq polimerasa (véase figura 2.6). Éstos se deben unir al
DNA diana a uno y otro lado del segmento que va a ser copiado: por lo tanto, l: 1, oNe aiun,

se deben conocer las secuencias de estos sitios de unión, de modo de poder I Desnaturalización a 94oC

sintetizar cebadores de las secuencias adecuadas. T

5". r'ñ"l r i'i'ili'ii ¡ r ¡' 3'

La reacción comienza calentando la mezcla a 94"C.A esta temperatura, -,tltl!t!lll!rllll-¡

J: )

se rompen los enlaces de hidrógeno que mantienen unidos los dos poli-
nucleótidos de la doble cadena, por lo que el DNA se desnaturaliza en
moléculas de una sola cadena (figura 2.28). Después, se reduce la tem-
tI Enfriar a 50-600C

5'r il i"i ¡ ii'i1''if I il i l'

peratura a 50"C-60oC, lo que determina cierta reunión de las cadenas itr¡¡lores::+
simples del DNA diana, pero también permite que los cebadores se unan -, I t I t I t r r ¡ ¡ r r r t r r- -,
a sus posiciones de hibridación. Ahora, puede comenzat la síntesis de
Síntesis de DNA a 720C.
DNA, de manera que se eleva la temperatura a 72"C, que es la óptima I
para \a Taq polimerasa. En este primer estadio de la PCR, se sintetiza 5' 1'
una serie di productos "largos" ipartir de cada cadena del DNA diana. 1'
1'
Estos polinucleótidos tienen extremos 5' idénticos, pero extremos 3' 3' 5'

Figura 2.28 Primera etapa de una PCR.

 T

CapÍtulo 2 Estudio del DNA

J ?rii-rriTTTt.iii-r J aleatorios, que representan posiciones donde la síntesis de DNA termi;

; :#-:::. ProductOS
'-- j na por azar. Cuando se repite el ciclo de desnaturalización-hibridación-
-:-- oel prlmer clclo
J-¡ lrttlr!tl!ltllLl
-, -, síntesis, los productos largos actúan como moldes para la nueva síntesis
de DNA, Io que da origen a productos "cortos", cuyos extremos 5' y 3'
II Desnaturalización
están establecidos, ambos, por las posiciones de hibridación de los ceba-
ifiñiffiiijrffi dores (figuru 2.29). En ciclos ulteriores, se acumula de manera exponen-
cial la cantidad de productos cortos (que se duplican durante cada ciclo)
hasta que se agota uno de los componentes de la reacción. Esto signifi-
.t.!!!.! r,!,!.!=!,.t, !-!-!..!!, ca que, después de 50 ciclos, habrá más de 250 millones de productos
cortos derivados de cada molécula inicial. En términos reales, esto equi-
I Síntesis de DNA vale a varios microgramos del producto de la PCR a partir de unos pocos
?
I
nanogramos o menos de DNA diana.
ir_ffi
Productos
:*r":.1-i-i"á!i:. r : . del segundo ciclo
Los resultados de una PCR se pueden determinar de varias maneras. Por
lo general, se analizan los productos mediante electroforesis en gel de
+i:j-i.iii-1.1' '
agarosa, que revelará una sola banda si la PCR ha trabajado del modo
t__-t-J]+:++-+
I r r I I I ¡ ¡ r r r l l r r r.L esperado y ha amplificado un solo segmento del DNA diana (figura
¡ 2.3O). En forma alternativa, se puede determinar la secuencia del pro-
¡
+ ducto mediante las técnicas descritas en la sección 4.1.1.
=i=§+ffiñ-++¡.
il- -!i:=:-=l-j,.ii-

2-3-z Aplicaciones de la PCR

II Desnaturalización

La PCR es un procedimiento tan simple que a veces es difícil compren-

i=,*ffi==
der cómo ha adquirido tanta importancia en la investigación moderna.
Primero, consideraremos sus limitaciones. Para sintetizar cebadores que
se hibriden en las posiciones correctas, se deben conocer las secuencias
II Síntesis de DNA
de las regiones limítrofes del DNA que va a ser amplificado. Esto signi-
fica que no se puede recurrir a la PCR para purificar fragmentos de
genes, ni otras partes de un genoma, que nunca antes se han estudiado.
=ry:=
.:ffi]
:===4¡:-
Productos
del tercer ciclo Una segunda limitación es la longitud del DNA que puede ser copiado.
Se pueden amplificar sin demasiada dificultad regiones de hasta 5 kb y
Producto torto'- se acumula son posibles amplificaciones más largas -hasta de 40 kb- si se aplican
de manera exponencial modificaciones de la técnica estándar. En cambio, los fragmentos de más
de 100 kb que se necesitan para proyectos de secuenciación de genomas
y que se pueden obtener por clonación en un BAC u otro vector de alta
Figura 2.29 Síntesis de productos capacidad son inalcanzables por PCR.
"cortos" en una PCR. A partir de los
productos del primer ciclo mostrados
en la parte superior del diagrama, el ¿Cuáles son los puntos fuertes de la PCR? El fundamental de ellos es la
siguiente ciclo de desnaturalización- facilidad con que se pueden obtener productos que representan un seg-
hibrldación-síntesis da origen a cuatro mento aislado del genoma de una serie de muestras de DNA diferentes.
productos, dos de los cuales son idénti- En el siguiente capítulo, hallaremos un ejemplo importante de esto cuan-
cos a los productos del primer ciclo y do consideremos cómo se tipifican marcadores de DNA en proyectos de
los otros dos están formados totalmen- mapeo genético (sección 3.2.2). La PCR se utiliza de una manera similar
te por DNA nuevo. Durante el tercer para investigar mutaciones asociadas con enfermedades genéticas, como
ciclo, estos últimos generan productos
"cortos" que, en ciclos ulteriores, se talasemia y fibrosis quística, en muestras de DNA humano. También
acumulan de manera exponencial. forma la base del perfil genético, en el que se tipifican las variaciones de
longitud de los microsatélites (véase figura 7.24).

Una segunda característica importante de la PCR es su capacidad de tra-

bajar con cantidades minúsculas de DNA inicial. Esto implica que se
puede utilizar la PCR para obtener secuencias de vestigios de DNA pre-
sentes en pelo, manchas de sangre y otros especímenes forenses, y de
huesos y otros restos preservados en sitios arqueológicos. En el diagnós-
tico clínico, la PCR permite detectar la presencia de DNA üral mucho
antes de que el virus haya alcanzado los niveles necesarios para desen-
cadenar una respuesta de enfermedad. Esto tiene particular importancia
en la identificación temprana de cánceres inducidos por virus porque
-
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 6t

implica que se pueden iniciar proglamas de tratamiento antes de la ins-

talación del cáncer. Electroforesis I 2 3
en gel de agarosa
#

Hasta aquí se han mencionado sólo algunas de las aplicaciones de la =.,'.,,.--...'"'

PCR. En la actualidad, la técnica es un componente importante de los =.
instrumentos del biólogo molecular; descubriremos muchos más ejem-
plos de su uso a medida que avancemos en los restantes capítulos de este
Figura 2.30 Análísis de los resulta-
libro. dos de una PCR mediante electro-
foresis en gel de agarosa. Se ha
practicado la PCR en un tubo de
F-*=¿arc:erE microcentrifugación. Se carga una
En los últimos treinta y cinco años, los biólogos moleculares han ideado muestra en el carril 2 de un gel de
un conjunto completo de técnicas que pueden emplearse para estudiar el agarosa. EI carril I contiene marcado-
DNA. Estas técnicas forman la base de la tecnología del DNA recombi- res de tamaño del DNA, y el carril 3,
una muestra de una PCR llevada a
nante, y permitieron desarrollar la clonación del DNA y la reacción en cabo por un colega. Tras la electrofo-
cadena de la polimerasa (PCR). Una característica fundamental de la tec- resis, se tiñe el gel con bromuro de
nología del DNA recombinante es la utilización de enzimas purificadas etidio (véase Nota sobre técnicas
para inducir determinados cambios en las moléculas de DNA en el tubo 2.2). El carril 2 contiene una sola
áe ensayo. Los cuatro tipos principales de enzimas empleados de esta banda del tamaño esperado, lo que
manera son DNA polimerasas, nucleasas, ligasas y enzimas de modifica- muestra que la PCR ha sido exitosa.
ción terminal. Las DNA polimerasas sintetizan nuevos polinucleótidos En el carril 3 no hay ninguna banda:
esta PCR no ha dado resultado.
DNA y se las emplea en procedimientos como la secuenciación del DNA,
la PCR y la marcación del DNA. Las nucleasas más importantes son las
endonucleasas de restricción, que cortan las moléculas de DNA de doble
cadena en secuencias nucleotídicas específicas y, por 1o tanto, dividen una
molécula en una serie predecible de fragmentos, cuyos tamaños se pueden
determinar mediante eleetroforesis en gel de agarosa. Las ligasas unen las
moléculas y las enzimas de modificación terminal llevan a cabo diversas
reacciones, entre ellas, varias utilizadas para marcar moléculas de DNA.
La clonación del DNA es un medio para obtener una muestra pura de un
gen individual u otro segmento de una molécula de DNA. Se han diseña-
do muchos tipos diferentes de vector de clonación para usar en E. coli
como organismo huésped; los más simples están basados en pequeños
plásmidos que transportan marcadores como el gen lacZ'.Este gen permi-
te identificar las colonias recombinantes, porque se ven blancas, en lugar
de azules, cuando hay X-gal en el medio de crecimiento. También se ha
empleado el bacteriófago l. como base para una serie de vectores de clo-
nación en E. coli, incluidos los híbridos plásmido-fago denominados cós-
midos, que se utilizan para clonar fragmentos de DNA de hasta 44 kb de
longitud. Es posible recurrir a otros tipos de vector; por ejemplo, cromo-
somas artificiales bacterianos , para clonar fragmentos aún más largos de
DNA, de hasta 500 kb de longitud. Estos vectores de alta capacidad se
usan para construir genotecas de clones, cuyos insertos abarcan un geno-
ma completo y que se emplean para aportar material para un proyecto de
secuenciación de genomas. También se pueden utllizar orgánismos distin-
tos de E. coli como huéspedes para la clonación de DNA. Se han diseña-
do varios tipos de vectoi para Saccharomyces cerevisiae y se dispone de
técnicas especializadas para clonar DNA en animales y plantas. La PCR
complementa la clonación del DNA pues permite purificar con rapidez
segmentos específicos de DNA, pero se debe conocer por lo menos parte
de la secuencia del DNA de este fragmento. En la PCR, una DNA polime-
rasa termoestable realiza copias reiteradas de una secuencia diana y de las
copias fabricadas en ciclos previos de la reacción. Comenzando con sólo
una molécula diana aislada, se pueden fabricar más de 250 millones de
copias durante 30 ciclos de una PCR.
 Mapeo de lcs
genorTla§

3.i i!1apas grnáticas y físiros

3.2 l,i,rper gentiiis

i.-,1 il'iiDüc lr!]ac

Explicar por qué un mapa es una ayuda importante para la secuenciación de un genoma.

Distinguir entre los términos "mapa genético" y "mapa físico".

Describir los difintos tipos de marcadores utilizados para construir mapas genéticos y afirmar cómo se
evalúa cada tipo de marcador.

Resumir los principios de la herencia descubiertos por Mendel y mostrar cómo la investigación genética
ulterior llevó a desarrollar el análisis de ligamiento.

Explicar cómo se emplea el análisis de ligamiento para construir mapas genéticos y dar detalles acerca de
cómo se lo practica en diversos tipos de organismos, como seres humanos y bacterias.

Mencionar las limítaciones del mapeo genético.

Evaluar los puntos fuertes y débiles de los diversos métodos aplicados para conlruir mapas fisicos de
8en0mas.

Describir cómo se Ileva a cabo el mapeo de restricción.

Describir cómo se utiliza la hÍbridación in situ fluonescente (FISH) para confruir un mapa físico, incluidas
las modificaciones empleadas para aumentar la sensibilidad de esta técnica,

Explicar la base del mapeo del sitio de secuencia identificada (STS) y enumerar las diversas secuencias de
DNA que se pueden emplear como SlS.

Describir cómo se utilizan los híbridos por radiación y las genotecas de clones en el mapeo de STS.

Los dos capítulos siguientes describen las técnicas y las estrategias emple-
adas para obtener las secuencias de un genoma. Es eüdente que la secuen-
ciación del DNA es primordial enke estas técnicas, pero tiene una limitación
importante: aun con la tecnologíamás avaruada, ratayez es posible obtener
una secuencia de más de alrededor de 750 pares de bases (pb) en un solo
experimento. Esto significa que la secuencia de una molécula de DNA larga
debe construirse a partir de una serie de secuencias más cortas. Esto se rea-
liza rompiendo la molécula en fragmentos, determinando la secuencia de
cada uno y utilizando un ordenador para investigar superposiciones y cons-
 '!s-

68 Capítulo 3 Mapeo de los genomas

truir la secuencia maestra (figura 3.1). Este método aleatorio (shotgun) es

500 pb
el procedimiento convencional para secuenciar genomas procariontes
pequeños (sección 4.2.1), pero es mucho más difícil con genomas más
grandes, pues el análisis de datos requerido se yuelve desproporcionada- 2
tragmentos
@té
mente más complejo a medida que aumbnta el número de fragmentos (para
n fragmentos, el número de superposiciones posibles es de 2n2-2n). Un
segundo problema del método aleatorio es que puede inducir a errores
Secuencias cuando se analizan regiones repetitivas de un genoma. Cuando se rompe +

CAATGC ATA en fragmentos una secuencia repetitiva, muchos de los fragmentos resul-
GCAGCCAATGC
Superposición tantes contienen motivos de secuencia iguales o muy similares. Seúa muy
fácil reensamblar estas secuencias de modo de dejar fuera una región repe-
-.; titiva o, incluso, conectar otros dos fragmentos bastante separados del
mismo cromosoma o de cromosomas diferentes (figura 3.2).
Figura 3.1 Método aleatorio (sáof-
gun) para el ensamblaje de Las dificultades de aplicar el método aleatorio a una molécula grande que :e

secuencias. Se rompe la molécula de
DNA en pequeños fragmentos, cada
uno de los cuales es secuenciado. Se
ensambla la secuencia maestra inves-
tigando las superposiciones entre las
secuencias de fragmentos individua-
les. En la práctica, se requeriría una
superposición de varias decenas de
pares de bases para establecer que
dos secuencias deberían estar ligadas.
contiene cantidades significativas de DNA repetitivo implican que este enfo-
que no se puede emplear por sí solo para secuenciar un genoma eucarionte.
En su lugar, se precisa primero generar un mapa (mapeo o cartografía) del
genoma. Este mapa proporciona una guía para los experimentos de secuen-
ciación al mostrar las posiciones de los genes y otras características distinti- 1€'
s
vas. Una vez que se dispone del mapa de un genoma, la fase de secuenciación
del proyecto puede avarrzar en una de dos maneras (figura 3.3):
c Método aleatorio del genoma completo (sección 4.2.3), que adopta
el mismo enfoque que el procedimiento aleatorio convencional, pero $
utiliza las características distintivas del mapa del genoma como repa-
ros para ayrrdar al ensamblaje de la secuencia maestra a partir de la
enoñne cantidad de secuencias cortas que se obtienen. La referencia
al mapa también garantiza que se ensamblen corectamente las regio-
nes que contienen DNA repetitivo. El método aleatorio del genoma
completo es una manera rápida de obtener un borrador de la secuen-
cia de un genoma eucarionte.

' Método de cóntigos de clones (clone contig approach) (sección 4.2.2).

En este método, se fragmenta el genoma en segmentos de unos pocos (
I
I
Figura 3.2 Problemas del método aleatorio. (A) La molécula de DNA contiene un elemento repetido en tándem formado por S
numerosas copias de la secuencia CAITA. Cuando se examinan las secuencias, se identifica una superposición entre dos fragmentos, C
pero éstos provienen de uno u otro extremo de la repetición en tándem. Si no se reconoce el error, se omitirá la región interna de Ia S
repetición en tándem de la secuencia maestra. (B) En el segundo ejemplo, la molécula de DNA contiene dos copias de un elemento
repetido. Cuando se examinan las secuencias, dos fragmentos parecen superponerse, pero un fragmento contiene la parte izquierda
de una repetición y el otro fragmento tiene la parte derecha de la segunda repetición. En este caso, no reconocer el error haría que
se dejase fuera de la secuencia maestra el segmento de DNA entre las dos repeticiones. Si las dos repeticiones estuvieran en cromG-
somas diferentes, las secuencias de estos cromosomas podrían ligarse enoneamente.
E
1'l

A. Problemas con el DNA repetido en tándem B. Problemas con las repeticiones

en todo el genoma Dos repeüciones en todo el genoma
DNA
,/\ DNA

I
+
Fragmentos Fragmentos

@E*a*l :g€eW @ #:e

GA IfAGATTA GCATACCT Secuencias

GAI IAGATTA CAI'AG Ci
Superposición
 Mapas genéticos y físicos 69

500 kb Marcadores
Método de cóntigos
de clones I ll Método aleatorio
del genoma completo
AB C DE
F GH
r .| _.,_.!..._-!_!:.. r ...-l-_]** Mapa del genoma
Segmento ds Pt![ + t@
mapeado Secuenciación aleatoria
de todo el genoma

A B

I Secuenciaciónaleatoria
J del segmento mapeado

lr'
:¡ H
:=:+=* Seiu¿nci¡s
ensamblao'¡s

Ya se rcnoce Ma¡t¿di:res usadoq

la posición para anclar las secuencias
de [a seruencia
\ ensambiacias en ei mapa

AB C DE GH

cieritos de kilobases o algunas megabases de longitud, que facilitan el pro- Figura 3.5 Métodos alternativos
cesamiento, que son suficientemente cortos para ser secuenciados con para la secuenciación del genoma.
exactitud mediante el método aleatorio. Unavez completada la secuencia Se generó el mapa de un genoma
de trn segmento, se la coloca en su lugar corecto en el mapa. Este méto- constituido por una molécula de
do "paso a paso" insume más tiempo que la secuenciación aleatoria del DNA lineal de 2,5 Mb y se conocen
genoma completo, pero genera una secuencia más exacta y sin errores. las posiciones de ocho marcadores
(A-H). A la izquierda, el método de
secuenciación de cóntigo de clones
Con ambos métodos, el mapa proporciona el marco para llevar a cabo comienza con un segmento de DNA,
la fase de secuenciación del proyecto. Si el mapa indica las posiciones de cuya posición en el mapa del geno-
los genes, también se lo puede emplear para dirigir la parte inicial de la ma se ha identificado porque contie-
secuenciación de clones solapados en las regiones de un genoma que son ne los marcadores A y B. El
segmento se secuencia mediante el
de interés, de manera que se obtengan con la mayor rapidez posible las método aleatorio y la secuencia
secuencias de los genes relevantes. maestra se coloca en su posición
conocida del mapa. A la der:echa, el
método de secuenciación aleatoria
de todo el genoma. Esto determina
§,8 ffiepás g*§!éɧces y fásñcas fragmentos de secuencias contiguas,
quizás de cientos de kilobases de
En forma convencional, los métodos de generación de mapas del geno-
longitud. Si una secuencia contigua
ma se dividen en dos categorías. contiene un marcador, se la puede
e Mapeo genético: se basa'en la aplicación de técnicas genéticas colocar en el mapa del genoma.
Obsérvese que con uno u otro
para construir mapas que muestran las posiciones de los genes y
método, cuanto más marcadores
otras características de las secuencias de un genoma. Las técni- haya en el genoma, mejor. Véanse
cas genéticas comprenden experimentos de cruzamiento o, en el más detalles de estas estrategias de
caso de los seres humanos, el examen de los antecedentes familia- secuenciación en la sección 4.2.
É res (árboles genealógicos). En la sección 3.2 se considera el mapeo
,É
§
,s
genético. ,
,g
# r Mapeo fisico: recutre a técnicas de biología molecular para examinar
:]&
4i en forma directa las moléculas de DNA con el fin de construir mapas
É
§ que muestren las posiciones de las secuencias características, inclui-
dos los genes. En la secciín 3.3 se trata el mapeo físico.
c

a:
*j

aa
r#.-i
á-+
 T'

Capítulo 5 Mapeo de los genomas

3.P HEepeG get?áÉi<s gen

A1 igUal que cualquier tipo de mapa, un mapa genético puede mostrar las qu(
posiciones de características distintivas. En un mapa geográfico, estos mar' yelr
cadores so11 componentes reconocibles del paisaje, como úos, caminos y bié
edificios. ¿Qué marcadores pueden utilizarse en un paisaje genético? col
ia,
mi
5"2.1 Los g€nes fuer*n lcs primerss mar{adores utillzadcs 29'
En los primeros mapas genéticos, construidos a principios del siglo xx SE

para organismos como la mosca de la fruta, se utilizaron genes como luE

marcadores. Para que un gen sea útil para el análisis genético debe exis- pr(
tir al menos en dos formas, o alelos, que especifiquen, cada una, un re1
fenotipo diferente; por ejemplo, tener tallos altos o cortos en las plantas pr,
de gUiiantes estudiadas originalmente por Gregor Mendel. En un comien- ac
,o,lor únicos genes que se pudieron estudiar fueron los que especifica- ta.
ban fenotipos distinguibles por examen visual. Así, los primeros mapas ES

de la mosóa de la fiuta, por ejemplo, mostraban las posiciones de los m

genes para el color del cuerpo, el color de los ojos, la forma del ala, etc., ni
fenotipos que eran üsibles al observar las moscas con un microscopio b¿
de baja resólución o a simple vista. Si bien este enfoque era adecuado en
los dias iniciales, los genetistas pronto adürtieron que sólo había una 5
cantidad limitada de fenotipos üsuales cuya herencia podía estudiarse y,
en muchos casos, su análisis se complicaba porque un solo fenotipo L
podía ser afectado por más de un gen. Por ejemplo, en t922 se habían U
mapeado más de 50 genes en los cuatro cromosomas de la mosca de la Vr

fruia, pero nueve de ellos eran para el color de ojos. En la investigación p

ulterior, los genetistas que estudiaron las moscas de la fruta debieron 1I

aprender a dlstinguir entre ojos de mosca que eran de color rojo, rojo tt
bermellón, granate, encarnado, cinabrio, rubí, sepia, escarlata, fi
"iu.o,
rosado, rojo vivo, clarete, violeta o pardo. Pata cteat mapas genéticos tr
más compietos, era necesario hallar características que fuesen más dis- fl
tintivas y menos complejas que las visuales. r
I
La respuesta consistió en recurrir a la bioquÍmica para distingUir fenotiPos. (
Esto ha sido de particular importancia en dos tipos de organismos: microbios (
y seres humanos. Los microbios, como las bacterias y las levaduras, tienen (
mrly po"a. características visuales, de modo que en estos organismos el I
mapeo genético debe basarse en fenotipos bioquímicos, como los enumera- (

doJ en el cuadro 3.7.Paru los seres humanos, es posible utllizat caracteús-

ticas üsuales pero, desde la década de l92O,los estudios de la variación

Cuadro j.l Marcadores bioquímicos típicos utilizados para el análisis genético de Soccharomyces cerevisioe

Marcador I' Fenotipo Método de identificación de las células que presentan el marcador

ADE2 Requlere adenina Sólo crecen cuando el medio contiene adenina

CANl Resistente a la canavanina Crecen en presencia de canavanina

CUPI Resistente al cobre Crecen en presencia de cobre

CYHI Resistente a la cicloheximida Crecen en presencia de cicloheximida

LEU2 Requiere leucina Sólo crecen cuando el medio contiene leucina

SUC2 puede fermentar Ia sacarosa Crecen si la sacarosa es el único hidrato de carbono del medio

URA3 Requiere uracilo Crecen sólo cuando el medio contiene uracilo

 Mapeo genético 7l

genética humana se han basado, en gran medida, en fenotipos bioquímicos

fenotipos inclu-
[,r" p".a." ser evaluados por tipificación sangUínea.laEstos
,.r, "o sólo los grupos sanguíneos estándares, como serie AB0, sino tam-
fiJn variabtes dáproteinasiéricas de la sangre y de proteínas inmunológigas,
lomo los antígenós de leucocitos humanos (sistema HLA). Una gran vexla-
iu á" mácadores es que muchos de los genes relevantes tienen alelos
".,o.
cómo
áóó A"fo. y et Ate-A, máJde 400. Esto es importante por la manera
(sección 3.2.4). En
r. tt."u u .ábo el mapeo de genes en los seres humanos
il*;á. implementar experimentos de cruzamientos planificados, que es el
pócedimiento con o.gris*os como moscas de la fruta o ratones, se deben
L""it los datos sobre-herencia de genes humanos examinando los fenotipos
piár""tudo. por miembros de famiüas en las que los matrimonios se han
'ácordado poi raro.r"s personales más que por la co¡vgniencg.de un genetis-
iu. Si to¿ó. los miem6ros de una familia tienen el mismo alelo para el
gen
no es posible obtener información útil. Por lo tanto, a los fines del
"r*¿iu¿o,
*up"o de'genes,is necesario hallar familias en las que haya habido matrimo-
Áár, po, úar, entreindividuos con diferentes alelos. Esto es mucho más pro-
babÉsi el gen estudiado tiene 290 alelos en lugar de 2'

3.2.2lVlarcadar€s de DNA Para r:?ap€o genát¡co

Los genes son marcadores muy útiles, pero de ningUrra manera ideales'
Ún p"roblema, sobre todo con los genomas más grandes, como los de los
vert'ebrados y las plantas que florecen, es que un mapa basado por.com-
pleto en g"rró. no es muy áetallado._Esto seúa válido aunque se pudiesen
mayoría de los genomas eucarion-
-up"*. ódos los genes, ya que, en la con grandes hiatos entre ellos (véase
tes, los genes están muy éspáciados
figura 7-.t2). El problema sé agrarra porque sólo una fracción del número
to"tal de g.rr", en formás aléftcas que pueden ser distinguidas de
"*irte
manera cbnveniente. Por lo tanto, los mapas de genes no Son muy com-
pletos. Se necesita otro tipo de marcador.

Las caracteústicas mapeadas que no son genes Se denominan marcadores

de DNA. Al igual qri 1o. márcadores genéticos, un marcador de DNA
debe tener poilo ménos dos alelos para que sea útil. Tres-tipos de secuen-
cias de DNA satisfacen este requisiio: polimor{ismos de longitud de frag- Sitio de restricción polimorfo

mentos de restricción (RFLP), polimorfismos de longitud de secuencias I ---..t---::.' l ::

simples (SSLP) y polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)' DNA
DNA
(alelo t) (alelo 2)

Palirnarfismos de longítud de los frogmentas de restricción

IT
Añadir endonucleasa de restricción
Los RFLP fueron el primer tipo de marcador de DNA estudiado. Cabe
recordar que las enzimas de restricción cortan las moléculas de DNA en
secuenciai de reconocimiento específicas (sección 2.t.2). Esta especifici- --:-JL---JL::JL:j - -.lt iJL;
dad de secuencia implica que el tratamiento de una molécula de DNA con 4 fragmentos 3 fragmentos

una enzima de restricciOn debe producir siempre el mismo conjunto de

fragmentos. Esto no siempre es así con moléculas de DNA genómico, pues
algunos sitios de restricción son polimorfos: existen como dos alelos y uno Fisura 3.4 Polimorfismo de longitud
dJetlos presenta la secuencia correcta para el sitio de restricción y, por tro dá frasmentos de restricción
tanto, es cortado cuando se trata eI DNA con la enzima; el segundo alelo lRFLPi. La molécula de DNA de la
muestra una alteración de la secuencia, de modo que el sitio de restricción üauierda tiene un sitio de restricción
ya no es reconocido. El resultado de la alteración de la secuencia es que polimorfo (marcado con el asterisco)
los dos fragmentos de restricción adyacentes se mantienen unidosdesppé.s oue no está presente en la molécula de
la derecha. Después del tratamiento con
del tratamiento con la enzima,lo que determina polimorfismos de longi-
la enzima de restricción, se revela el
tud (figura i.4). Esto es un RFLP y es posible descifrar su posición en un RFLP porque una de las moléculas se
mapa áel genoma sigUiendo la herencia de sus alelos, tal como se hace corta en cuatro fragmentos, mientras
cuando se"utilizan gJrr". co*o marcadores. Se considera que hay alrede- que la otra se corta en tres fragmentos.
dor de 10s RFLP en el genoma de un mamífero.
 -
Capítufo 3 Mapeo de los genomas

(A) HibridaciónSouthern Sitio polimorfo

Figura 3.5 Dos métodos de evalua- l

ción de un RFLP. (A) Los RFLP se R, R, Rl

oueden evaluar por hibridación . : t- . -:-_l_-=:t; r ¡ Mapa de sitios de restricción
Bandas de hibridación
§outhern. Se di§iere el DNA con la Sonda de DNA rAz3
enzima de restricción apropiada y se lo
separa en un gel de agarosa. Se trans- i\
fiere elfrotis de fragmentos de restric-
ción a una membrana de nailon y se Membrana de nailon
Autorradiografía
Io trata con una sonda que es un frag-
mento de DNA que abarca el sitio de
restricción polimorfo. Si el sitio está
ausente, se detecta un solo fragmento
(B) PCR S¡tio pol¡morfo
de restricción (calle 2); si el sitio está
presente, se detectan dos fragmentos
(calle 5). (B) Los RFLP también se .8*
B,l,l, r Mapa de sitios de restricción

pueden tipificar por PCR, con cebado- (ebadores de i¿ FCR

res que se hibriden a cada lado del .'. .-:
sitio de restricción polimorfo. Después
pcR sesuida Electroforesis en gel de agarosa l" ..:.?-
de la PCR, se tratan los productos con -a---
,:,,,.;;1.,1 .,,:.,
de restflccton
la enzima de restricción adecuada y se -
los analiza mediante electroforesis en
gel de agarosa. Si el sitio está ausente,
se observa sólo una banda en el gel .

de agarosa (ca1le 2); si el sitio está pre- Para evaluar un RFLP, es necesario determinar el tamaño de sólo uno o ',

sente, aparecen dos bandas (calle 3). dos fragmentos de restricción individuales contra un fondo de numero-
sos fragmentos irrelevantes. Éste no es un problema trivial: una enzima :

como EcoRI, con una secuencia de reconocimiento de seis nucleótidos, ,.,

debería cortar aproximadamente ufia vez cada 46 = 4.096 pb y, por ende,

generaría casi 800.000 fragmentos cuando se la emplea con DNA huma-
no. Después de la separación por electroforesis en gel de agarosa, estos
300.000 fragrnentos producen un frotis de DNA y no es posible distin-
guir los RFLP. La hibridación Southem, que utiliza una sonda que abar-
ca el sitio de restricción polimorfo, es una manera de visualizar los RFLP
(§ (figura 3.5A), pero en la actualidad se recurre con mayor frecuencia a la
Dos variantes de un SSLP
PCR. Los cebadores para la PCR se diseñan de manera que se hibriden
Alelo I a cada lado del sitio polimorfo, y se tipifican los RFLP tratando el frag-
mento amplificado con la enzima de restricción y haciendo correr, des-
pués, una muestra en un gel de agarosa (figura 3.58).

Alelo 2 Palím*r{isrnos d8 longitud de secuencias sirnp/es

Los SSLP son matrices de secuencias repetidas que presentan variacio-
nes de longitud, diferentes alelos que contienen distintos números de
unidades repetidas (figura 3.6A). A diferencia de los RFLP, los SSLP
(B) Tipificación de un SSLP por PCR pueden ser multialélicos, pues cada SSLP puede tener una cantidad de
variantes de longitud diferente. Hay dos tipos de SSLP:

lPcR
* Minisatélites, conocidos también como número variable de repeti-
ciones en tándem (VNTR), en los que la unidad repetida es de hasta
25 pb de longitud.
,.",.:$:ij;f - Electroforesis
\ en gel de agarosa
Figura 5.6 STR y manera de tipificarlas. (A) Dos alelos de una repetición en tándem
A
corta, denominada también microsatélite. En el alelo l, el motivo "CA' se repite tres
B

veces, y en el alelo 2, cinco veces. (B) f-ipificación de una STR por PCR. Se amplifica la
STR y iarte de la secuencia circundante, y se determina el tamaño del producto
mediante electroforesis en gel de agarosa o electroforesis capilar. En el gel de agarosa,
la calle A contiene el producto de la PCR, r¡ la calle Q marcadores de DNA que mues-
tran los tamaños de las bandas obtenidas después de la PCR de los dos alelos. La
banda de la calle A tiene igual tamaño que los dos m¿rcadores de DNA más grandes,
lo que muestra que el DNÁ inve*igado contenía el alelo 2. Se presentan los resultados
de ia electroforesls capilar como un electroforetograma, donde la posición del pico indi-
ca el tamaño del producto de Ia PCR El electroforetograma es automáticamente calibra-
150 t80 do respecto del tamaño de los marcadores, de manera que es posible calcular la
Pares de bases longitud precisa del producto de la PCR lmagen cortesía de Susan Thaw.
 Mapeo genético

s Microsatélites o repeticiones en tándem simples (STR), cuyas repe- Alelo I

ticiones son más cortas, en general de 15 pb o menos.

Los microsatélites son más populares que los minisatélites como marcadores .. .AGTCA :AAATC. ..
de DNA por dos razones. Primero, los minisatélites no están diskibuidos en jsl-91.441rc-:
.:-: :,
forma uniforme alrededor del genoma, sino que tienden a.localizarse con
mayor frecuencia en las regiones teloméricas, en los extremos de los cromo-
Alelo 2
somas. En términos geográficos, esto equivale a intentar usar un mapa de
faros para orientarse en el medio de una isla. Los microsatélites se distribu-
ven dé manera más conveniente por todo el genoma. Segundo, la forma más
,apiAu de tipificar un polimorfismo de longitud es por PCR, pero la tipifica- Figura 3.7 Polimorfismo de un solo
cién por PCR es mucho más rápida y más exacta con secuencias inferiores a nucleótido (SNP).
300 pb de longitud. La mayoúa de los alelos minisatéiites son más largos que
esto, porque las unidades repetidas son bastante grandes y üende a haber
muchas de ellas en una sola matriz, de modo que se requieren productos de
pCR de varias kilobases de longitud para tipificarlas. Los microsatélites utili-
zados como marcadores de DNA suelen consistir en 10-50 copias de una
repetición que no mide más de 6 pb de longitud y, por lo tanto, son mucho
más pasibles de análisis por PCR. En el genoma humano hay 5 x 105 micro-
satélites con unidades de repetición de 6 pb o menos.

Cuando se 1o examina por PCR, el alelo presente en una STR es revelado por
la longitud precisa del producto de la PCR (figura 3.68). Las variaciones de
longitud se pueden üsual2ar mediante electroforesis en gel de agarosa, pero
la electroforesis en gel estándar es un procedimiento engorroso difícil de
automatizar y, por consiguiente, inadecuado para los análisis de alto rendi-
miento demandados por la investigación moderna de genomas. En cambio,
las STR se suelen tipificar por electroforesis capilar en un gel de poliacrila-
mida (véase Nota sobre técnicas 4.1,).Lamayoría de los sistemas de electro-
foresis capilar tf,lwart detección de fluorescencia, de manera que se fija un
marcador fluorescente a uno o los dos cebadores antes de llevar a cabo la
PCR (véase Nota sobre técnicas 2.1). Después de la PCR, el producto se
carga en el sistema capilar y se lo hace correr a través de un detector de fluo-
rescencia. Un ordenador unido al detector correlaciona el tiempo de pasaje
del producto de la PCR con datos equivalentes para una serie de marcadores
de tamaño e identifica así la longitud precisa del producto.

F*!i¡:-z*r{ismús de ufi sülü nuclr;étidü

Hay posiciones de un genoma en las que algunos individuos tienen un
nucleótido (p. ej., una G) y otros tienen un nucleótido diferente (p. ej.,
:: una C) (figura 3.7), En todo genoma hay grandes cantidades de SNP
§
.3 (más de cuatro millones en el genoma humano), algunos de los cuales
: también dan origen a RFLP, pero muchos no porque la secuencia en la
:a
que residen no es reconocida por ninguna enzima de restricción.
rá

:; Como cualquiera de los cuatro nucleótidos podría estar presente en cualquier

posición del genoma, cabñaimaginar que cada SNP debería tener cuatro ale-
.:: los. Si bien esto es posible enteorla, en la práctica la mayoúa de los SNP exis-
4
g
,.!
ten sólo como dos variantes. Esto se debe a que cada SNP se origina cuando
= ocurre una mutación puntiforme (sección 16.1) en un genoma, que conüer-
:::
15 te un nucleótido en otro. Si la mutación afecta las células reproductoras de
.i un individuo, uno o más de sus descendientes podrían heredar la mutación y,
después de muchas generaciones, el SNP puede quedar establecido en la
:;
población. Pero hay sólo dos alelos: la secuencia original y la versión muta-
a
da. Para que surja un tercer alelo debe tener lugar una nueva mutación en la
ti misma posición del genoma en otro indiüduo, y éste y su descendencia se
+
deben reproducir de manera tal que el nuevo alelo quede establecido. Este

rg
-5
 -

Capítulo 5.Mapeo de los genomas

cuadro no es imposible, pero es improbable: en consecuencia, la vasta mayo-

ría de los SNP son bialélicos. Esta desventaja es más que superada por Ia
enorne cantidad de SNP presentes en cada genoma: en la mayoría de los
eucariontes, por 10 menos uno por cada 10 kb de DNA. Por lo tanto, los SNP
permiten construfu mapas muy detallÍidos del genoma.

La importancia que han cobrado los Slt{P en la investigación de genomas

ha estimulado el desarrollo de métodos rápidos para su tipificación, varios
de los cuales se basan en análisis de hibridación de oligonucleótidos. Un
oligonucleótido es una molécula de DNA de una sola cadena, corta, en
general de menos de 50 nucleótidos de longitud, que es sintetizada en el
tubo de ensayo. Si las condiciones son correctas, entonces un oligonucleó-
tido se hibridará con otra molécula de DNA sólo si el oligonucleótido
forma una estructura totalmente apareada por bases con la segunda moié-
cula. Si hay un solo error de apareamiento -una sola posición dentro del
oligonucleótido que no forme un par de bases- no tiene lugar la hibrida-
ción (figura 3.8A). Por lo tanto, la hibridación de oligonucleótidos discri-
mina entre dos alelos de un SNP. Se han elaborado varias estrategias de
investigación basadas en la hibridación de oligonucleótidos, entre ellas:
Técnicas de chips de DNA (Nota sobre técnicas 3.1): utiliza una oblea
de vidrio o de silicona, de 2 cm2 o menos de superficie, que contiene
muchos oligonucleótidos diferentes en una matriz de alta densidad. Se
(A) La hibridación de oligonucleótidos marca el DNA que va a ser investigado con una sustancia fluorescen-
es muy específica
te y se lo pipetea iobre la superficie del chip. La hibridación se detec-
El híbrido completamente ta examinando el chip con un microscopio de fluorescencia y las
apareado por sus bases es estable
posiciones que emiten la señal fluorescente indican qué oligonucleóti-
Oiigoni:ileótidc
dos se han hibridado con el DNA investigado. Por lo tanto, es posible
CGT'AG- CTT i ACI'I
CT GGT
¡ ¡ ¡ ¡ ¡ i i i ¡ ¡ ¡ i 1i r ¡ tii i estudiar muchos SNP en un solo experimento.
"r-GACCAGCAGT CAGAAAT CAA
1I --"
o¡,lR dianu Técnicas de hibridación en solución: se practican en los pocillos de
SI\ P una bandeja de microtitulación, cada uno con un oligonucleótido
diferente; utilizan un sistema de detección que permite discriminar
entre el DNA de una sola cadena, no hibridado, y el producto de
Error de apareamiento Error de apareamiento -
simple - el híbrido es
no se puede formar el doble cadena que se origina cuando un oligonucleótido se hibrida
inestable par de bases con el DNA investigado. Se han creado varios sistemas, uno de 1os
C'i GGT C GT C A C] á I-']- A' IT cuales utiliza un par de marcadores que consisten en un colorante
.- . -GACCAGCAGTCACAAATCAA
a fluorescente y un compuesto que extingue la señal fluorescente cuan-
do se aproxima mucho al colorante. El colorante se une a un extre-
-]. mo de un oligonucleótido y el compuesto extintol al otro. Por lo
general, no hay fluorescencia, porque el oligonucleótido está diseña-
do de modo que los dos extremos aparean sus bases entre sí, lo que
(B) Detección de hibridación mediante
colorante-extinción
DNA diana
oligonucleotrdo
de .i'
Figura 3.8 fpificación de SNP por análisis de hibridación de oligonucleótidos. (A)
compuesto Marcador Eñ conditionés de hibridación muy efirictas, se produce un híbrido estable sólo si el
/
de extinción
\8.-' fluorescente f /a oligonucleótido puede formar una estructura completamente apareada por sus bases
É\ ¿¿J coñ el DNA diaáa. Si hay un solo error de apareamiento, no se forma el hhrido. Para
-l
ri ,+ SNP alcanzar este nivel de rigurosidad, la temperatura de incubación debe estar justo por
Ll /.
;r' ,tr ,{ debajo de la temperatura de fusión o T,n del oligonucleótido. A temPeraturas suPe
¡:lt^ riorei a la T* aun el híbrido con apareamiento de bases completo es inestable. A
ru#F .,^ más de 5oC por debajo de la T*, híbridos con errores de apareamiento podrían ser
\,1 estables. La Í. para el oligonucleótido mostrado en la figura seria de alrededor de
58oC. La T* eii'o6 se calc"ula con la fórmula Tm: I
(+ x ñúmero de nucleótidos y C)
I + (2 x número de nucleótidos A y T). Esta fórmula da una indicación aproximada de
+
la T. de oligonucleótidos de 15-30 nucleótidos de longitud. (B) La hibridación en
§l'lp
.---_----_------=
dr¡rrLrt!lir;,trt,-. -- DNA solúéión es una manera de tipificar un SNP. La sonda oligonucleotídica tiene dos mar-
y__l-i cadores terminales. Uno de éstos es un colorante fluorescente y el otro, un comPues-
€ S¡nd¿ to extintor. Los dos extremos del oligonucleótido aparean sus bases entresí, de modo
que la señal fluorescente se anula. Cuando la sonda se hibrida con su DNA diana, los
5enal extremos de la molécula se separan, lo que permite que el colorante fluorescente
fluorescente emita su señal. Los dos marcadores se denominan "balizas moleculares".
 Mapeo genético 75

aproxima el extintor al colorante (figura 3.88). La hibridación entre

ei ollgonrcleótido y el DNA investigado rompe este apareamiento de
bases, 1o que aleja al extintor del colorante y permite que se genele
la señal fluorescente.

Otros métodos de tipificación utilizan un oligonucleótido cuyo error

Jrupu."u-iento conel SNP se produce en su extremo 5'o 3'. En las
Jorrdi"io.r.s apropiadas, un oligonucleótido de este tipo se hibridará al
bÑe mot¿e con érror de apareamiento mediante una "cola" corta, sin
Úrr"r upu.eadas (figura 3.9A). Esta característica se utilíza de dos
maneras:
. Análisis de ligamiento de oligonucleótidos (OLA): :utlliza dos oligo-
nucleótidos qrl" se hibridan, adyacentes entre sí, con el extremo 3' de
uno de estos oligonucleótidos ubicado exactamente en el SNP. Este
oligonucleótido formará una estructura completamerrte apareada por
bales si hay una versión del SNP en el DNA molde y, cuando esto
ocurre, el oligonucleótido se puede ligar a su compañero (figUra
i.9B). Si el DÑA examinado contiene el otro alelo del SNP, el nucle-
ótido 3' del oligonucleótido de prueba nb se hibridatá al molde y no

Nota sobre técnicas 5.I Micromatrices y chips de DNA

Matríces de alta densidad de moléculos de DNA pora onólisis de hibridacíón en Porolelo
Las micromatrices y los chips de DNA están diseñados un oligonucleótido en crecimiento. Se agregan los nucleó-
para permitir que se practiquen numerosos experimentos tidos úno tras otro a la superficie del chip, y se emplea
de hibridación en paralelo. Sus principales aplicaciones fotolitografía para dirigir los pulsos de luz a posiciones
han correspondido a la investigación de polimorfismos individuales de la matiiz y determinar así cuál de los oli-
como SNP (sección 3.2.2) y la comparación de poblacio- gonucleótidos en crecimiento se extenderá por adición
nes de RNA de diferentes células (sección 6.1.2). áel nucleótido particular añadido en cada paso (figura
T3.1). Es posible alcanzar una densidad de hasta
Aunque la terminología es inexacta, las mlcromatrices y 3O0.OO0 oligonucleótidos por cm2, de modo que si se
los chips son, estrictamente hablando, dos tipos diferen- los utillza para investigar SNP, se pueden tipificar l5O.O00
tes de matriz. En ambas arquitecturas, se inmoviliza sobre polimorfismos en un solo experimento, presumiendo que
una superficie sólida un Sran número de sondas de DNA, haya oligonucleótidos para ambos alelos de cada SNP.
cada una con una secueicia distinta. Las sondas pueden
ser oligonucleótidos sintéticos u otras moléculas cortas de No es complicado utilizar chips ni micromatrices. Se
DNA, éomo cDNA o productos de la PCR. Éstas se pue- incuba el chip o la matriz con DNA diana marcado para
den colocar sobre un portaobjetos de vidirio o un frag- permitir que se produzca la hibridación. Las posiciones
mento de membrana de nailon para formar una de hibridación a[ DNA diana se determinan barriendo la
micromatriz. Con este enfoque, sÓlo es posible alcanzar superficie y registrando los puntos de detección de la
una densidad relativamente baja, por lo general 6.400
puntos en una matriz de 80 x 80, en una superficie de
l8 x l8 mm, que es suficiente para examinar poblacio- Síntesis activada por luz
nes de RNA, pero menos aplicable a los análisis de alto
rendimiento requeridos para tipificar SNP. i
¿
Para preparar matrices realmente de alta densidad, se sin- A
TG T G
tetizan in situ oligonucleótidos sobre la superficie de una cc
AT+
c L
T
oblea de vidrio o silicona, lo que origina un chip de DNA. CG
A
L §i
El método normal para la síntesis de oligonucleótidos tl I I ..i
implica agregar nucleótidos uno a uno al extremo en cre-
cimiento Ze un oligonucleótido, cuya secuencia depende Adición sólo a
del orden en que ie añaden los sustratos nucleotídicos a oligonucleótidos activados
la mezcla de reacción. Si se utilizara para la síntesis de un
chip, este método determinaría que todos los oligonucle-
ótidos tuvieran la misma secuencia. En cambio, se emple-
an sustratos nucleotÍdicos modificados, es decir, que deben Figura T3.l Síntesis de oligonucleótidos en la superficie de
ser activados por luz antes de que se unan al extremo de un chip de DNA.
 Capítulo 3 Mapeo de los genomas

señal emitida por el marcador. Se pueden emplear marca- chips de alta densidad. Se puede alcanzar una resolución
dores radiactivos, cuyas señales se detectan electrónica- más alta con marcadores fluorescentes y detección por
mente mediante estudio por la imagen con fósforo, pero barrido láser o microscopia de fluorescencia confocal
esto aporta sólo baja resolución y no es adecuado para (figura T3.2)

Figura T5.2 Visualización de la hibridación de una sonda

marcada con fluorescencia en una micromatriz. Se ha detec-
tado el marcador mediante barrido con láser confocal y se ha
convertido la intensidad de la señal en un seudoespectro de colo-
res, en el que rojo indica hibridación máxima, seguido de anaran-
jado, amarillo, verde, azul, índigo y violeta; este último representa
el nivel basal de hibridación. Cada punto de la micromatriz es
un clon diferente de cDNA preparado de mRNA de células
sanguíneas humanas y la sonda fue un cDNA de mRNA de
médula ósea humana. Véase más información sobre el uso de
chips y micromatrices de DNA para estudiar poblaciones de
mRNA en Ia sección 6.1.2. lmagen cortesía de Tom Strachan,
reimpreso con autorización de ly'afure.

habrá ligamiento. Por lo tanto, el alelo se tipifica determinando si se

sintetiza el producto de ligamiento, en general por corrida de la mez-
cla posreacción en un sistema de electroforesis capilar, como ya se
describió para la tipificación de STR.
* Sistema de mutación refractario a la amplificación o prueba ARMS:
basado en el mismo principio que el OLA, pero emplea como oligo-
nucleótido de prueba uno de un par de cebadores de la PCR. Si el
cebador de prueba se hibrida al SNP, puede ser extendido por la Taq
polimerasa y puede tener lugar la PCR, pero si no se hibrida, porque
está presente la versión alternativa del SNP, no se genera ningún pro-
ducto de la PCR (figura 3.9C).

5.?.5 §! amálisis de EÉger*Éento es Ea base del

EffiGPeo §eE?áÉÉes
Ahora que hemos reunido una serie de marcadores con los que construir
un mapa genético, podemos pasar a considerar las técnicas de mapeo
propiamente dichas. Todas estas técnicas se basan en el ligamiento
genético que, a su vez, deriva de los descubrimientos esenciales de gené-
tica efectuados a mediados del siglo xtx por Gregor Mendel.

Los príncípí*s de l* her*nd* y el descubrin;-tientadel lig*rnient*

El mapeo genético se basa en los principios de la herencia descritos por
primera vez por Gregor Mendel en 1865. A partir de los resultados de
estos experimentos de quzamientos de guisantes, este investigador con-
cluyó que cada planta de guisante tiene dos alelos para cada gen, pero
manifiesta sólo un fenotipo. Esto es fácil de comprender si la planta es
de cepa pura, u homocigótica, para una determinada característica, por-
que entonces tiene dos alelos idénticos y presenta el fenotipo apropiado
(figura 3.10A). Sin embargo, Mendel demostró que, si se cruzan dos
plantas de cepas puras y fenotipos diferentes, toda la progenie (la gene-
ración F1) presenta el mismo fenotipo. Estas plantas F1 debgn ser hete-
rocigóticas, lo que significa que tienen dos alelos diferentes, uno para
cada fenotipo: un alelo heredado de la madre y uno del padre. Mendel
 Mapeo genético

(A) Hibridación con un oligonucleótido (B) Análisis de ligamiento de oligonucleótidos (C) Prueba ARMS
con un error de apareamiento terminal
Ausencia de errores de aoareamiento
Híbrido completamente I

apareado por sus bases r ,. .,..:., : ¡¡-1f-i.!-.!.1,!J-lL!'r I't-L¡.!t!' I e¡ DNA r

-:iTii'ii-#TTTÍii-r? ¡ '
§NP
5', i. :r- 3'
I a. Ír,- i,rI f
ti,.¡r
i: tI i aij : i
f
HaV liSamiento
.-, It gl:.]-::-l:-ttl-:+,,
.!§AG C CAG CGAC CAG CAGf f,[ fi-rr
DNA diana
Se sintetiza el
I
producto de la PCR

Híbrido con cola sin Error de apareamiento

bases apareadas O i r
;c ;¡ t.: ik:i i r,.ii:
I

t
5'
u..l .,i4.-- ,t: .::- 5'
.-,ri,i;l'Il i,,,,ill-. ¡¡¡
t
tlitl.;

.-,..lAGCCAGCGACCAGCAGTCAC*r¡
DNA diana Ausencia de ligamiento No se sintetiza ningrln producto de la PCR

propuso que, en esta condición heterocigótica, un alelo contrarresta los Figura 3.9 Métodos para tipificar SNP.
efectos del otro alelo: por lo tanto, caractefizó el fenotipo expresado en (A) En condiciones apropiadas, un oli-
las plantas F1 como dominante respecto del segundo, fenotipo recesivo gonucleótido cuyo error de aparea-
(figura 3.10B). miento con el SNP se produce en su
extremo 5'o 3'se hibridará al DNA
molde con errores de apareamiento
La interpretación de Mendel de la condición heterocigótica es perfecta- mediante una "cola" corta, sin bases
apareadas. (B) Tipificación del SNP por
mente corecta para los pares de alelos que él estudió, pero ahora apre-
análisis de lígamiento de oligonucleóti-
ciamos que esta regla simple dominante-recesiva puede complicarse por dos. (C) Prueba ARMS.
situaciones que nunca encontró. Por ejemplo:
+ Dominancia incompleta, donde la forma heterocigótica presenta un
fenotipo intermedio entre las dos formas homocigóticas. Un ejemplo
es el color de las flores de las plantas, como las clavelinas (pero no (A) Autofertilización de plantas de guisantes
de cepas puras
los guisantes): cuando se cruzan clavelinas rojas con blancas, las
heterocigotas Ft no son rojas ni blancas, sino rosadas (figura 5.11A).
,.=é {, Ernap¡ i¡n¡¿i
* Codominancia, donde la forma heterocigótica presenta los dos feno- 1,-'
a
tipos homocigóticos. Los grupos sanguíneos humanos brindan varios
ejemplos de codominancia. Por ejemplo, las dos formas homocigotas
de la serie MN son M y N, y estos individuos sintetizan sólo las glu-
t
II
I
coproteínas sanguíneas M o N, respectivamente. En cambio, los hete- .j=
"1-/l---:
rocigotos sintetizan ambas glucoproteínas y, por 1o tanto, se los *
designa MN (figura 3.118).
I I
Además de descubrir el carácter dominante y el recesivo, Mendel llevó a :j:=.=

cabo otros experimentos que le permitieron establecer sus dos leyes de la rr

Eae
- denere¿ionF.
l¡
genética. La primera ley establece que los alelos se segregan en forma ale-
atoria. En otras palabras, si los alelos del padre son A y a, ln miembro de Flores violeta Flores blancas
la generación F1 tiene la misma probabilidad de heredar A qrue de heredar la,i ,W
a. La segunda ley establece que los pares de alelos se segregan en forma
independiente, por lo que la herencia de los alelos del gen A es indepen- (B) Fecundación por cruzamiento de dos tipos
de cepas puras
diente de la herencia de los alelos del gen B. Debido a estas leyes, los resul-
tados de los cruzamientos genéticos son predecibles (figura 3.12). .=E:É . Prr:ge*iiores
' :t_ ¡
1
Flores violeta X Flores blancas
Figura 3.10 Homocigosis y heterocigosis. Mendel estudió siete pares de caracterís- t¡ít,u,/

ticas contrastantes de las plantas de guisantes, una de las cuales era el color violeta o
blanco de las flores, como se muestrá aquí. (A) Las plantas de cepas puras siempre
I
dan flores con el color parental. Estas plantas son homocigotas, cada una tiene un E§-i.E
par de alelos idénticos denotados aquí por W, para las flores violetas, y.Wlt1 , para las
!::
Ce::*r¿ria¡: i,
flores blancas. (B) Cuando se cruzan dos plantas de cepas puras, sólo se observa
uno de losfenotipos en la generación F¡. Mendeldedujo que elgenotipo de las Flores violeta
Plantas F, era VW, de manera que [/ es el alelo dominante y W, el recesivo. vlv
 Capítulo 5. Mapeo de los genomas

(A) Dominancia incompleta

Cuando se redescubrió el trabajo de Mendel en 1900, su segunda ley
': ,, / preocupó a los primeros genetistas, porque pronto se determinó que los
€ l. ¡'
:.::ri ''
Prcgenitares
genes residen en los cromosomas y se advirtió que todos los organismos
É"* F tienen muchos más genes que cromosomas. Los cromosomas se heredan
Flores rojas X Flores blancas
illl.
como unidades indemnes, de modo que los alelos de algunos pares se
,(l¡
heredarán juntos porque están en el mismo cromosoma (figura 3.13).
I Éste es el principio del ligamiento genético y, con rapidez, se mostró que
*F; Cereracién F,
era correcto, aunque los resultados no fueron exactamente los espera-
dos. No se materializ1 el ligamiento completo entre muchos pares de
F4 genes que había sido previsto. Los pares de genes se heredaron de mane-
Flores rosadas ra independiente, como era esperable para genes de cromosomas dife-
Ri1,'
rentes o, si mostraban ligamiento, éste era sólo ligamiento parcial: en
ocasiones, se heredaban juntos y, a veces, no (figura 3.14) . La resolución
de esta contradicción entre la teoría y la observación fue el paso crítico
(B) Codominancia para la aparición de las técnicas de mapeo genético.
ñ*
Gb+ G:*+ , . :: ,. El comportsrníe¡¡to de las crotnosomüs durúnt€ la meiosís
d3 G 8-# explica el ligorníento parcio{
,1,1,r,1 X r'.r1" El avance crucial provino de Thomas Hunt Morgan, quien estableció el
nexo conceptual entre ligamiento parcial y comportamiento cromosómico
I durante la diüsión nuclear de una célula. Los citólogos de fines del siglo
,* xtx habían distinguido dos tipos de división nuclear: mitosis y meiosis. La
^€
fJg*r'*' . ,: mitosis es más frecuente y corresponde al proceso de diüsión del núcleo
g
,I =1 diploide de una célula somática para producir dos núcleos hijos, ambos
l;!i! diploides (figura 3.I5). Se necesitan alrededor de 1017 mitosis para produ-
cir todas las células requeridas durante una üda humana. Antes de que
comience la mitosis, se replica cada cromosoma del núcleo, pero los cro-
Figura 3.1I Dos tipos de interacción mosomas hijos resultantes no se separan de inmediato. Al principio, que-
de alelos no hallados por Mendel. dan unidos por sus centrómeros y no se separan hasta etapas más tardías
(A) Dominancia incompleta y (B) de la mitosis cuando los cromosomas se distribuyen entre los dos nuevos
codominancia. núcleos. Sin duda, es importante que cada uno de los nuevos núcleos reci-
ba una serie completa de cromosomas y la mayoría de las complejidades de
la mitosis parecen estar dedicadas a alcanzar este fin.

Figura 3.12 Las leyes de Mendel per- La mitosis ilustra los episodios básicos que ocurren durante la divi-
miten predecir el resultado de los sión nuclear, pero lo que nos interesa son las características distin-
cruzamientos genéticos. Se presentan
dos cruzamientos con sus resultados
tivas de la meiosis. La meiosis sólo tiene lugar en las células
previstos. En un cruzamiento monohíbri- reproductoras y determina que una célula diploide dé origen a cua-
do, se siguen los alelos de un solo gen, tro gametos haploides, cada uno de los cuales se fusiona después
I
en este caso, el alelo para plantas de con un gameto del sexo opuesto durante la reproducción sexual. El
guisantes altas, y el alelo d para plantas hecho de que la meiosis origine cuatro células haploides, mientras que
de guisantes bajas. f es dominante y t la mitosis origina dos células diploides es fácil de explicar: la meiosis
es recesivo. La grilla muestra los genoti-
pos y los fenotipos previstos de la gene-
implica dos divisiones nucleares, una después de la otra, en tanto que
ración F, basados en Ia primera ley de la mitosis consiste sólo en una división nuclear. Ésta es una distinción
Mendel, que afirma que la segregación importante, pero la diferencia crucial entre mitosis y meiosis es más
de alelos es aleatoria. Cuando Mendel
efectuó este cruzamiento, obtuvo 787
plantas de guisantes alfasy 277 plantas
CRUZAMIENTO MONOHíBilDO CRUZAMIENTO DIHIBilDO
bajas, una relación de 2,84'.1. En el cru-
zamiento dihíbrido, se siguen dos Progenitores Alto1il x it Alto Progenitores AIto redondo IIfir x lffrAÍto redondo
genes. El segundo gen determina Ia a" ./\
forma de los guisantes: Ios alelos son R Genotipos F1 ,t' TT i t Genotipos F, T¡i
(redondo, el alelo dominante) y r (rugo- /L- r li Í;t T l:;t:
so, el alelo recesivo). Los genotipos y \_t It tt T TTi.
los fenotipos mostrados son los previs- r,-l Tti::.:

tos por la primera y la segunda ley de

Fenotipos F1 5 altós: I bajo
Mendel, la última de las cuales afirma Fenotipos Fr 9 altos redondos :5 altos rugosos
que la segregación de pares de alelos 3 bajos redondos : I bajo rugoso
es independiente.
 Mapeo genético

sutil. Cabe recordar que una célula diploide contiene dos copias sepa- B,§
iadas de cada cromosoma (capítulo 1). Nos referimos a ellas como \§
A. ÁV
,ares de cromosomas homólogos. Durante la mitosis, los cromosomas -v
ilomólogos se mantienen separados entre sí, cada miembro del par se
,§§É
replica y pasa al núcleo hijo independientemente de su homólogo. Por E8 Gf

Ll'contiaiio, en la meiosis, los pares de cromosomas homólogos no ár

c.
son, de ninguna manera, independientes. Durante |a profase I, cada §)g
.ro*o.ornu se alinea con su homólogo para formar un bivalente (figu- g,§
ra i.16). Esto tiene lugar después de la replicación de cada cromoso-
ma, pefo antes de que se dividan las estructuras replicadas, de manera
ou. .1 bivalente contiene, de hecho, cuatro copias del cromosoma, Figura 5.13 Los genes del mismo
,rnu de las cuales está destinada a hallar su camino hacia uno de crómosoma deben Presentar liSa-
"ud,cuatro gametos que serán producidos al final de la meiosis. Dentro miento. Los genes A y B se encuen-
los
tran en el mismo cromosoma Y, Por
del bivalente, los brazos del cromosoma (las cromátides) pueden lo tanto, se deben heredar juntos. Así,
sufrir degradación física e intercambio de segmentos de DNA. El pro- la segunda ley de Mendel no se aPli-
ceso se dénomina entrecruzamiento o recombinación, y fue descubier- cará a la herencia de A y B. El gen C
to por el citólogo belga |anssens en 1909. Esto sucedió sólo dos años está en un cromosoma diferente, Por
antes de que Morgan comenzara a pensar en el ligamiento parcial. lo que la segunda ley será válida para
la lrerencia de A y C o de B y C.
Mendel no descubrió el ligamiento
¿Cómo ayudó el descubrimiento del entrecruzamiento a
que Morgan
porque los siete genes que estudió
éxplicara el ligamiento parcial? Para comprenderlo, es necesario pensar estaban cada uno en un cromosoma
qué efecto puede ejercer el entrecruzamiento sobre la herencia de los de guisante diferente.
g.rr"r. ConJideremos dos genes, cada uno de los cuales tiene dos alelos.
Llu-ur"*os A al primer gen, Y Ay a a sus alelos, y B al segundo gen,
con alelos B y b. Imaginemos que los dos genes están localizados en el
cromosoma 2 de Drosophila melanogaster,la especie de mosca de la
fruta estudiada por Morgan. Analizaremos la meiosis de un núcleo
diploide en el qué una copia del cromosoma 2 tiene 2 alelos A y B, y la

Genes Alelos CRUZAMIENTO PARENTAL

@tF
€+
i=: €
Color de las flores
r.ffi r:.ffi
Y7
11 Y¡
Violeta Rojo
Violela,,.:,.;r' X Rojq:- 1'':
Forma del polen :-:r ..,
i:

I
r:a
Conclusion
Las flores vioietas son dominantes respecto r=H
Y/
:-
de las rojas
Los granos de polen son dominantes Todas vioiel¿¡, ,. ' . '.
respecto de los ,=,
Figura 3.'14 Ligamiento parcial. El
E
ligámiento parcial fue descubierto a prin-
ciplos del siglo x. En 1905, Bateson,
CRUZAMIENTO DE Fr
Si los genes no están ligados S¿unders y Punnett llevaron a cabo el
EI cruzamiento de Fr dará una relación de cruzamiento aquí mofrado con guisan-
-é ;]+ tes dulces. El cruzamiento parental da el
9 rioletas, :3 violetas,
3:oj.:s,:., :Iroja,,'1:,:,.
:
.. EH ..'Fs
al/ típico resultado dihíbrido (véase figura
\.7
11 3.12),y todas las plantas F1 presentan el
Si los genes están ligados
Viciet¡r, ::,. ,: X Vialetas, i:¡.,:, mismo fenotipo, lo que indica que los
El cruzamiento de Fr dará una relación de
alelos dominantes son flores de color
3 üoletas, i;rg*: I roja, re¿ir::'id<;
I violeta y granos de polen largos. El cruza-
miento de F1 arroja resultados inespera-
dos, pues la progenie no muestra una
Resultados teales relacón 9:5:3:l (prevista para genes de
483,I Vro¡eies, '
diferentes cromosomas) ni una relación
Conclusión
390 r,ioletas, . 3:1 (previfa para genes completamente
Los genes presenta lilamiento parcial
591 roja; : .' ligadós). Una relación inusual es típica
1358 roja, . ,
del ligamiento parcial.
 Capítulo 3 Ji4apeo de los genomas

INTERFASE
Figura 5.15 Mitosis. Durante la interfase
(el período entre las divisiones nuclea- -des§&!
res), los cromosomas se encuentran en
forma extendida (sección 7 I .1). Al ? ':'- Marbruna nuclear
comienzo de la mitosis, Ios cromosomas
.a
:
"{;¡P1
---./ a

\JL'4¡-_ .
se condensan y, hacia fines de la profa-
se, han formado estructuras que son visi-
. {-__.- \
ttt'*,,,-,....-.,,t-t'
bles con el microscopio óptico. Gda
cromosoma ya ha replicado el DNA'
pero los dos cromosomas hijos están' TELOFASE
\
unidos por el centrómero. Durante la
metafase, se rompe la membrana nucle
ar (en la mayoría de los eucariontes) y PROFASE TARDíA
los cromosomas se alinean en el centro
de la célula. Ahora, los microtúbulos
arrastran los cromosomas hijos hacia Centrómero
uno u otro extremo de la célula. En la
telofase, se vuelven a formar las mem-
branas nucleares alrededor de cada con-
junto de cromosomas hijos. El resultado
es que el núcleo progenitor ha dado ori-
gen a dos núcleos hijos idénticos. A los
fines de la simplicidad, sólo se muestra
un par de cromosomas homólogos; un
ANAFASE
miembro del par es rojo y el otro, azul.

segunda tiene a y b. En la figxa 3.17 se ilustra esta situación.

Consideremos las dos situaciones alternativas:
e No se produce un entrecruzamiento entre los genes A y B. Si esto
es lo que sucede, entonces dos de los gametos resultantes conten-
drán copias del cromosoma con alelos Ay B, y los otros dos con-
tendrán a y b.En otras palabras, dos de los gametos tienen el
genotipo AB y dos, el genotipo ab.
s Sí se produce un entrecruzamiento entre los genes A y B. Esto
determina intercambio entre cromosornas homólogos de segmen-
tos de DNA que contienen el gen B. El resultado eventual es que
cada gameto tiene un genotipo diferente: uno AB, lno dB, uno Ab
y uno ab.

Ahora, piense qué sucedería si investigáramos los resultados de la meio-

sis en un centenar de células idénticas. Si no hay ningún entrecruza-
miento, los gametos tendrán los siguientes genotipos:
2OO AB
2OO ab

'Esto es ligamiento completo: los genes A y B

se comportan como una
sola unidad durante la meiosis. Pero si (como es más probable) se pro-
ducen entrecruzamientos entre A y B en algunos de los núcleos, enton-
ces los pares de alelos no se heredarán como unidades aisladas.
Presupongamos que se producen entrecruzamientos durante 40 de las
100 meiosis. Se originarán los siguientes gametos:
160 AB
t6O ab
40 Ab
40 aB
 Mapeo genético

INTERFASE

Los cromosomas
homólogos forman
un bivalente

\
Gametos !;

i
ffi' METAFASEI

á
\sB g=:*+l
d'B*-,&
/
€ É-'--: i -í B- SehaProducido
: d=e; É"
:
*-*F
a-r entrecruzamiento

I
f *..
'-"'=w :
i
ANAFASE I
i
-' -e 1- § I
E-8, =>*=
%-§

4w i
I
METAFASE II
=*"=*
PROFASE II

ANAFASE II

TELOFASE II

El ligamiento no es completo, sólo parcial. Además de los dos geno- Figura 3.16 Meiosis. Se presentan los
tipoJparentales (AB, ab), observamos gametos con genotipos 1ecom- evéntos que involucran a un par de
binantes (Ab, aB). cromosomas homólogos; un miembro
del par es rojo, el otro es azul. Al
comienzo de la meiosis, Ios cromoso-
Del lig*míento parcicl *! mapea g€r,ético mas se condensan y cada par homó-
lJnavez que Morgan entendió cómo se podía explicar el,ligamiento logo se alinea para formar un
biüalente. Dentro del bivalente, podría
parcial pór entrecruzamiento durante la meiosis, pudo diseñar una haber entrecruzamiento, que implica
manera de mapear las posiciones relevantes de los genes en un cro- la rotura de los brazos del cromoso-
mosoma. De hecho, el irabajo más importante no lo efectuó é1, sino ma y el intercambio de DNA.
un estudiante de su laboratorio, Arthur Sturtevant, quien presumió Después, la meiosis continÚa median-
que el entrecruzamiento era un episodio aleatorio y que la probabi- te uh par de divisiones mitóticas del
tidad ¿e que se produjera en cualquier posición a lo largo de un par núcleo que da origen, inicialmente, a
dos núcleos, cada uno con dos coPias
de cromátides alineadas era la misma. Si esta presunción es correc- de cada cromosoma, todavía unidos
ta, entonces dos genes que Se encuentran próximos serán separados por sus centrómeros, y Por Último, a
por entrecruzamientos con menor frecuencia que dos genes que cuatro núcleos, cada uno con una
éstán alejados entre sí. Más a:(Uln,la frecuencia con que los genes son sola copia de cada cromosoma. Por lo
desligadós por entrecruzamientos será directamente proporcional a tanto, estos productos finales de la
la diitanciá qr" los separa en el cromosoma. Por lo tanto, la fre' meiosis, los gametos, son haploides.
cuencia de recombinación es un parámetro de la distancia entre los
dos genes. Si se descifran las frecuencias de recombinación para
diferéntes pares _de genes, es posible construir un mapa de sus posi-
ciones relativas en el cromosoma (figura 3.18).

Resulta que la presunción de Sturtevant sobre la aleatoriedad de los

entrecrutamieftos no estaba totalmente justificada. Comparaciones
entre mapas genéticos y las posiciones reales de los genes en las
moléculai de bNA, reváladas por mapeo físico y secuenciación del
DNA, han mostrado que algunas regiones de los cromosomas, deno-
 -
Capítulo 3 Mapeo de los genomas

PROFASE I
minadas puntos calientes de recombinación, tienen mayor probabi-
Ausencia 4*'.- Entrecruza-
lidad que otras de participar en entrecruzamientos. Esto significa
de entrecru- ll s miento que una distancia en el mapa genético no indica necesariamente la
zamiento ., - entre A y B distancia física entre dos marcadores (véase figura 3.25). Asimismo,
1\ §
ahora advertimos que una sola bromátide puede participar en más
de un enttecruzamiento al mismo tiempo, pero que hay algunas
to/e
limitaciones acerca de qué tan cerca pueden estar estos er..ttectllza-
€4-D --E
Ere¡ 5
',*S€C ? mientos, lo que determina más inexactitudes en el procedimiento de
1.4 I 3 '--o § ;, mapeo. Pese a estas limitaciones, el análisis de ligamiento suele efec-
*-*=s %,#-
PRoFASE Ir
#e
tuar deducciones correctas acetea del orden de los genes y las estima-
íAb a ciones de distancia son suficientemente exactas para generar mapas
áffis
Bd,
-E=: genéticos, que son valiosos como marcos de referencia para proyectos
'\*# -É
L:-: de secuenciación de genomas. Por lo tanto, procederemos a conside-
rar cómo se lleva a cabo el análisis de ligamiento en diferentes tipos
I I de organismos.
§AB ?- §¡n3
í _e_ ! ,eB
á AD
{*É/
¡
3.?.4 Análisis de ligamiente en diferentes tipos
gé a5"
ad
de organismos
AAB 'É q'oB *a Para ver cómo se efectúa, en realidad, el análisis de ligamiento, debemos
: e.e ;,48 é#Sd considerar tres situaciones bastante diferentes:
qi ap
H: TELoFASE l . Análisis de ligamiento en especies como moscas de la fruta y ratones,
con las que se pueden llevar a cabo experimentos de cruzamientos
?
rb
{ @# i E Ab
+@B/4 E
planificados.
=OD a6
e.g
==*:t' e Análisis de ligamiento en seres humanos, en quienes no se pueden
practicar experimentos planificados, pero se pueden estudial en
? ob
zr*e*§obe
cambio, los árboles genealógicos.
=-é*5d
aÉ
É-§
AB
Análisis de ligamiento en bacterias, que no se dividen por meiosis.
Genotipos
"
Genotipos
)AB:2ab lABiloBilAb:lab
Anólisis de ligamienta cuando son posibles experimenfos
de cruza mienfos pla n ifícados
Figura 3.17 Efecto de un entrecru-
El primer tipo de análisis de ligamiento es la contrapartida modema del
zamiento sobre genes ligados. El
dibujo muestra un par de cromoso- método creado por Morgan y cols. El método se basa en el análisis de la
mas homólogos, uno rojo y el otro progenie de cruzamientos experimentales entre progenitores de genoti-
azul. A y B son los genes ligados con pos conocidos y es aplicable, por lo menos en teoría, a todos los euca-
alelos,4, o, B y b. A la izquierda, hay riontes. Consideraciones éticas impiden aplicar este enfoque a seres
meiosis, sin entrecruzamiento entre A humanos, y problemas prácticos, como la duración del período de ges-
y B: dos de los gametos resultantes tación y el tiempo que demora el recién nacido en alcanzar la madurez
tienen el genotipo AB y los otros dos (y, por ende, participar en cruzamientos ulteriores) limitan la eficacia del
son ob. A la derecha, se produce un
entrecruzamiento entre A y B: los cua- método en algunos animales y plantas.
tro gametos presentan todos los
genotipos posibles: AB, oB, Ab y ob.
Si volvemos a la figura 3.17, observamos que la clave del mapeo genéti-
co es poder determinar los genotipos de los gametos que resultan de la
meiosis. En algunas pocas situaciones, esto es posible por examen direc-
to de los gametos. Por ejemplo, los gametos producidos por algunos
eucariontes microbianos, entre ellos la levadura Saccharomyces cerevi-
siae, pueden crecer en colonias de células haploides, cuyos genotipos se
pueden determinar mediante pruebas bioquímicas. En los eucariontes
superiores, también es posible Ia genotipificación directa de los gametos
si se utilizan marcadores de DNA, ya que se puede practicar PCR con el
DNA de espermatozoides indiüduales, lo que permite tipificar RFLP,
SSLP y SNP. Lamentablemente, tipificar espermatozoides es trabajo-
so. Por lo tanto, el análisis de ligamiento de rutina en los eucariontes
superiores no se efectúa mediante el examen directo de los gametos,
sino determinando los genotipos de la progenie diploide originada por
 Mapeo genético 83

la fusión de los dos gametos, uno de cada uno de un par de progenito-

res, En otras palabras, se efectúa un cruzamiento genético.

La complicación de un cruzamiento genético es que la progenie diploi-

Alas miniatura
/e\
de resultante es el producto de dos meiosis (una en cada progenitor), no
\-'"/-
Olos bermellón
de una, y, en la mayoúa de los organismos, los eventos de entrecruza- ,t0t
miento son igual de probables durante la producción de los gametos
masculino y femenino. De alguna manera debemos ser capaces de des- Olos blancos .Jrru
enmatalat los procesos de entrecruzamiento que ocurren en cada una
de estas dos meiosis a partir de los genotipos de la progenie diploide.
{$
\y'
Esto implica que el cruzamiento debe prepararse con cuidado. El proce- Cuerpo amarillo

dimiento convencional consiste en efectuar un cruzamiento de prueba. loF

Esto se ilustra en la figura 3.19, en la que se ha preparado un cruzamien-
to de prueba para mapear los dos genes hallados antes: gen A (alelos A Frecuencias de recombinacién
y a) V gen B (alelos B y b), ambos del cromosoma 2 de la mosca de la
fruta. Los genotipos de los dos progenitores son la característica crucial Entre m yv=30/o
de un cruzamiento de prueba: Entre m e Y = 33¡7o/o
Entre v y w = 29,4o/o
Un progenitor es un doble heterocigoto. Esto significa que contiene Entre w e y = 1,3010
los cuatro alelos: su genotipo es AB/ab. Esta notación indica que un
par de los cromosomas homólogos tiene alelos Ay B, y el otro, ale'
los a y b. Se pueden obtener heterocigotos dobles cruzando dos
cepas puras, por ejemplo, AB/AB x ab/ab. Posiciones del mapa deducidas

El segundo progenitor es un doble homocigoto de cepa pura. En este ywvm

progenitor, ambas copias homólogas del cromosoma 2 son las mis-
0 I,3 30,7 33,7
mas: en el ejemplo de la figura 3.19, ambas tienen alelos ay b,y el
genotipo del progenitor es ab/ab.

El doble heterocigoto tiene el mismo genotipo que la célula cuya meiosis Figura 3.18 Dilucidación de un
seguimos en la figura 3.l7.Por lo tanto, nuestro objetivo es inferir los geno- mapa genético a partir de las fre-
tipos de los gametos producidos por este progenitor y calcular la fracción de cuencias de recombinación. El
ejemplo está tomado de los experi-
recombinantes. Obsérvese que todos los gametos producidos por el segundo
mentos originales practicados con
progenitor (el doble homocigoto) tendrán el genotipo ab,independientemen- moscas de la fruta por Arthur
te de que sean gametos parentales o recombinantes. Los alelos a y b son Sturtevant. Los cuatro genes se
ambos recesivos, de manera que la meiosis en este progenitor es, en efecto, encuentran en el cromosoma X de la
inüsible cuando se examinan los fenotipos de la progenie. Esto significa que, mosca de la fruta. Se muestran las
como muestra la figura 3.19, es posible convertiL inequívocamente, los feno- frecuencias de recombinación entre
tipos de la progenie diploide en los genotipos de los gametos del progenitor los genes, junto con la deducción de
sus posiciones en el mapa.
doble homocigoto. Por lo tanto, el cruzamiento de prueba permite efectuar
un examen directo de una sola meiosis y calcular así una frecuencia de recom-
binación y una distancia en el mapa para los dos genes estudiados.

La potencia de este tipo de análisis de ligamiento aumenta si se siguen más

de dos marcadores en un solo cruzamiento. Esto no sólo genera frecuencias
de recombinación con más rapidez, sino que también permite determinar el
orden relativo de los marcadores en un cromosoma por inspección simple de
los datos. Esto se debe a que se requieren dos eventos de recombinación para
desligar el marcador central de los otros dos marcadores externos de una
serie de tres, mientras que alguno de los dos marcadores extemos se puede
desligar mediante una sola recombinación (figura 3.20). Una doble recombi-
nación es menos probable que una recombinación simple, de modo que será
relativamente infrecuente que se desligue el marcador central. En el cuadro
3.2 se presentan una serie de datos típicos de un cruzamiento de ftes puntos.
Se ha preparado un cruzamiento de prueba entre un triple heterocigoto
(ABC/abc) y un triple homocigoto (abc/abc). La progenie más frecuente es
aquella con alguno de los dos genotipos parentales, que resulta de la ausen-
cia de eventos de recombinación en la región que conüene los marcadores A,
B y C. Las otras dos clases de progenie son relativamente frecuentes (proge-
 t

Capítulo 3 Mapeo de los genomas

Á y B son dominantes sobre o y á nie 51 y 63 en el ejemplo mostrado). Se presume que estas dos surgen de una
recombinación simple. La inspección de sus genotipos indica que, en la pri-
PROGENITORES mera de estas dos clases, el marcador A se ha desligado de B y C, y en la
1x2 Cruzamiento segunda clase, el marcador B se ha desligado de A y C. La implicación es que
AB/ab ab/ab de prueba
A y B son los marcadores extémos. Esto se confirma por el número de des-
tl
AB cb
cendientes en el que el marcador C se ha desligado de A y B. Hay sólo dos
de éstos, lo que muestra que se requiere una doble recombinación para pro-
ducir este genotipo. Por lo tanto, el marcador C se encuentra entre A y B.
Ab ' . Gametos
t1
Se debe considerar sólo un punto más. Si, como muestran la figura 3.19 y el
11

ob tb
cuadro 3.2, se examinan en un cruzamiento de prueba los genes cuyos alelos
I presentan caráctet dominante y recesivo, el progenitor doble o triple homo-
cigoto debe tener alelos para los genes recesivos. Si, por el contrario, se uti-
GEN0TIPoS Fr FENOTIPOS
lizan marcadores codominantes, entonces el progenitor doble homocigoto
t\É,t lJ AB puede presentar cualquier combinación de alelos homocigóticos (p. ej.,
Ab¡i Ab
oBttb aB
AB/AB, Ab/Ab, aB/aB o ab/ab). La figura 3.21, que presenta un ejemplo de
obeb ab este tipo de cruzamiento de prueba, muestra laruzónde esto. Obsérvese que
los marcadores de DNA tipificados por PCR presentan lo que es, en efecto,
Cada fenotipo es igual al genotipo
del gameto del progenitor I
codominancia: por lo tanto, la figura 3.21 ilustra una situación típica hallada
cuando se lleva a cabo análisis de ligamiento con marcadores de DNA.

Figura 5.19 Cruzamiento de prueba

entre alelos que presentan carácter
dominante y recesivo. A y B son mar-
cadores con alelos A, o, B y b. La pro-
genie resultante es evaluada por
examen de sus fenotipos. Como el pro-
genitor doble homocigoto (progenitor
2) tiene dos alelos recesivos -o y b-
no contribuye efectivamente a los feno-
tipos de los descendientes. Por lo tanto,
elfenotipo de cada individuo de la
generac¡ón F1 es el mismo que el
genotipo del gameto del progenitor
1
Mopeo genético por onólisis de lo geneologío humona
Por supuesto, en los seres humanos es imposible preseleccionar los geno-
tipos de los progenitores o preparar cntzamientos diseñados específica-
mente con fines de mapeo. En cambio, los datos para el. cálculo de las
frecuencias de recombinación se deben obtener por examen de los geno-
tipos de los miembros de generaciones sucesivas de familias existentes.
Esto significa que sólo se dispone de datos limitados y su interpretación
suele ser difícil, porque un matrimonio humano rara vez resulta un cru-
zamiento de prueba conveniente y, a menudo, no es posible obtener los
genotipos de un miembro de la familia o más, porque esos individuos
están muertos o no desean cooperar.

que d¡o origen a ese individuo.

En la figura 3.22 se ilustran estos problemas. En este ejemplo, se estudia
una enfermedad genética presente en una familia formada por los dos
progenitores y seis hijos. Las enfermedades genéticas se emplean como
marcadores genéticos en los seres humanos: el estado patológico es un
alelo y el estado de salud es el segundo alelo. El árbo1 genealógico de la
figura 3.22A muestra que la madre está afectada por la enfermedad, al
igual que cuatro de sus hijos. Sabemos por relatos familiares que la abue-
la materna también sufría esta enfermedad, pero tanto ella como su espo-
so -el abuelo materno- ya han muerto. Podemos incluirlos en el árbol
genealógico con cortes para indicar que están muertos, pero no podemos
obtener ninguna otra información sobre sus genotipos. Sabemos que el

Cuadro 3.2 Serie de datos típicos de un cruzamiento de prueba de tres puntos

Cenotipos de la descendencia

ABC/obc obc,/obc 98-7 Ninguno (genotipos parentales)

oBC,/obc Abc,/obc 5l Uno, entre Ay B/C
AbC/obc oBc/obc 63 Uno, entre By e/C
ABc/obc obC/obc 2 Dos, uno entre C y A, y uno entre C y B
 Mapeo genético

Entreruzamiento simple
sen de la enfermedad está presente en el mismo cromosoma que un
íricrosatélite, que denominamos M, cuyos cuatro alelos -M¡ M2, M3! @
DEF #
dEF
M¿- están presentes en los familiares üvos. Nuestro objetivo es cons- :€ X-+
trúir mapas para identificar la posición del gen de la enfermedad res- def Def
pecto del microsatélite.
@
DEF : DEf
para establecer una frecuencia de recombinación entre el gen de la
enfermedad y el microsatélite M, debemos determinar cuántos de los
_. X =*
rl tf deF
hiios son recombinantes. Si investigamos los genotipos de los seis hijos,
obr.*u*o. que los números 1, 3 y 4 presentan el alelo de la enferme-
dad y el alelo del microsatéLite Mr Los números 2 y 5 tienen el alelo Entrecruzamieilto doble

sano y M2.Por lo tanto, podemos elaborar dos hipótesis alternativas. La éDEFDEF

XX -)
..........:.....:...........................§
primera es que las dos copias de los cromosomas homólogos relevantes -
áe la madre tienen los genotipos Enfermedad-M1y Salud-M2; por lo deÍ dEf
tanto, los hijos 1,2,3,4 y 5 tienen genotipos parentales, y el hijo 6 es
el único recombinante (figura 3.228). Esto sugeriría que el gen de la
Figura 3.20 Efectos de los entrecru-
enfermedad y el microsatélite están ligados de manera relativamente cer- zamientos durante un cruzamiento
caflay que los entrecruzamientos entre ellos son infrecuentes. La hipó- dihíbrido. Cualquiera de los dos mar-
tesis alternativa es que los cromosomas de la madre tienen los genotipos -cadores externos puede-ser desligado
Salud-M1 y Enfermedad-M2,lo que implicaúa que los hijos 1'-5 son por sólo un evento de recombinación,
recombinantes y que el hijo 6 tiene el genotipo parental. Esto significa- pero se requieren dos recombinacio-
ría que el gen y el microsatélite están relativamente separados en el cro- nes para desligar el marcador central
de los dos marcadores externos.
mosoma. No podemos determinar cuál de estas hipótesis es correcta; los
datos son ambiguos, lo que resulta frustrante.
Ay Bson codominantes conoy b
La solución más satisfactoria al problema planteado por el árbol genealógico
de la figura 3.22 seúaconocer el genotipo de la abuela. Pretendamos que ésta PROGENITORES
es una familia de telenovela y que la abuela, en realidad, no está muerta. Para lX2 Cruzamiento
sorpresa de todos reaparece justo a tiempo para salvar las mediciones de AB,'ab Áb';:,b de prueba

audiencia declinantes. Se determina que su genotipo para el microsatélite M

es M1M5 (figura 3.22C). Esto nos dice que el cromosoma heredado por la
madre tiene el genotipo Enfermedad-M7. Por lo tanto, podemos concluir con
ll
ri
.Lt A.
certeza que la hipótesis 1 es cortecta y que sólo el hijo 6 es recombinante. Ab
uamelos
o8
¡sb
Por lo general, la resurrección de individuos claves no es una opción
I
para los genetistas de la vida real, aunque es posible obtener DNA de +
especímenes patológicos antiguos, como portaobjetos y tarjetas de CENOT|POS Fr ALELOS DETECTADOS
Guthrie. Los árboles genealógicos imperfectos se analizan estadística- AEAII A+B+b
mente aplicando ,r, puiá-etró denominado puntuación lod. Éste repre- AbAb A+b
senta el logaritmo del cociente de verosimilitudes (logarithm of the aBAb A+o+B+b
rsb.,lb A+o+b
odds) de que los genes estén ligados y se utiliza fundamentalmente para
determinar si los dos marcadores estudiados residen en el mismo cromo- Se identifican los genotipos del gameto del
soma: en otras palabras, si los genes están ligados o no. Si la puntuación progenitor'l de los alelos detectados.
5i sólo se detecta,4, el gameto del progenitor
lod establece ligamiento, también puede aportar un parámetro de la fre- I era l.
cuencia de recombinación más probable. En condiciones ideales, los Si se detectan A + a, el gameto del progenitor
datos provendrán de más de un árbol genealógico, lo que aumenta la fia- I era d, etc.

bilidad del resultado. El análisis es menos ambiguo en familias con

mayor cantidad de hijos y, como se ve en la figura 3.22, es importante Figura 3.2I Cruzamiento de prueba
que se pueda genotipificar a los miembros de por lo menos tres gene- entre alelos que presentan codomi-
raciones. Por esta raz6n, se han establecido conjuntos de familias, nancia. Ay B son marcadores cuyos
como el mantenido por el Centro de Estudios de Polimorfismos pares de alelos son codominantes. En
Humanos (Centre d'Études du Polymorphisme Humaine, CEPH) de este ejemplo particular, el progenitor
París. El conjunto del CEPH contiene líneas de células cultivadas de doble homocigoto tiene el genotipo
Ab/Ab. Los alelos presentes en cada
familias en las que se pudieron obtener muestras de los cuatro abue-
individuo de F1 se detectan directamen-
Ios, así como de no menos de ocho hijos de la segunda generación. te, por ejemplo, mediante PCR. Estas
Cualquier investigador puede disponer de este conjunto para mapeo de combinaciones de alelos permiten dedu-
marcadores de DNA, siempre que acceda a remitir los datos resultantes cir el genotipo del gameto del progenitor
a la base de datos del CEPH central. I que dio origen a cada individuo.
 '--

Capítulo 3 Mapeo de los genomas

Figura 3.22 Ejemplo de análisis de

un árbol genealógico humano. (A)
El árbol genealógico muestra la heren-
cia de una enfermedad genética en
C Mujer no afectada

una familia de dos progenitores vivos

y seis hijos, con información acerca de
o Muier afectada

los abuelos maternos obtenida de his-

torias clínicas de la familia. El alelo de
u Hombre no afectado

enfermedad (símbolos cerrados) es

dominante respecto del alelo sano &111:1., I'Nr*¡, ly|.tu!, M,#u lyJzi'vli fll*l ,
T Hombre afectado

(símbolos huecos). El objetivo es Muerto

determinar el grado de ligamiento (B) Posibles interpretaciones del árbol genealógico
entre el gen de enfermedad y el
microsatélite M por tipificación de los CROMOSOMAS DE LA MADRE
alelos para este microsatélite (A1,, M,
Hipótesis I Hipótesis 2
etc.) en los miembros vivos de la
ll1, eníermedad
familia. (B) El árbol genealógico se \!::'!.n'
puede interpretar de dos maneras: la
ivl, sano L|, enfermedod
hipótesis I da una frecuencia de
recombinación baja e indica que el I
Hijo
:h!, eníermedod Parental Recombinante
gen de enfermedad está estrechamen- Hiio 2 fvl, scna Parental Recombinante
te ligado al microsatélite M. La hipóte-
Hiio 5
sis 2 sugiere que el gen de :
ll1, enfermedad Parental Recornbi¡r¿ nte

enfermedad y el microsatélite están Hifo 4 ll1, enfermedad Parental Recornbin¡ nte

mucho menos ligados. En (C), el pro- Hijo 5 !11, sona Parental Recombinanie
..,.#
blema se resuelve por la reaparición
Hiio 6 fi.EnÍermedod Reco¡l-n in¿nie Parental
de la abuela materna, cuyo genotipo
del microsatélite es compatible sólo lr-.rirenri.;
con la hipótesis l. :l: reco¡ibrn¿ción 1'5- )6,7.r: 5,"6 = B3.3rr,i,

(C) Resunección de la abuela materna

El alelo de enfermedad debe estar ligado a M I

LA HIPÓTESIS I ES CORRECTA

i"tl ,/t1.

iti*pe* §rílétlt* €¡? r"cs b*#eri*s

El último tipo de mapeo genético que debemos considerar es la estrate-
gia empleada en las bacterias. La principal dificultad que enfrentaron los
genetistas al intentar crear técnicas de mapeo genético para las bacterias
es que estos microorganismos suelen ser haploides, por lo que no pre-
sentan meiosis. Por lo tanto, se debía encontrar alguna otra manera de
inducir entrecruzamientos entre segmentos homólogos de DNA bacte-
riano. La respuesta fue recurrir a tres métodos naturales existentes para
transferir fragmentos de DNA de una bacteria a otra (figura 3.23)t
a En la conjugación, dos bacterias entran en contacto físico y una (la
dadora) transfiere DNA a la segunda (la receptora). El DNA transfe-
rido puede ser una copia de algunos de los cromosomas de la célula
dadora o es quizás de todos ellos, o podría ser un segmento de DNA
cromosómico -de hasta 1 Mb de longitud- integrado a un plásmido.
Esto último se denomina transferencia de episomas.
. La transdueción implica transferencia de un pequeño segmento de
DNA -hasta de alrededor de 50 kb- del dador al receptor a través de
un bacteriófago.
e En la transformación, Ia célula receptora capta de su medio un frag-
mento de DNA, rara yez de más de 50 kb de longitud, liberado de
una célula dadora.
 Mapeo físico

Siempre se utilizan marcadores bioquímicos; el fenotipo dominante o de

tipo silvestre consiste en tener una característica bioquímica (p. ej., (A) Coniugación
cápacidad de sintetizar triptófano) y el fenotipo recesivo es la caracterís-
tica complementaria (p. ej., incapacidad de sintetizar triptófano). La
transferencia de genes suele presentarse entre una cepa dadora que tiene
el alelo de tipo silvestre y un receptor con el alelo recesivo; la transfe-
rcncia a la cepa receptora se controla investigando la adquisición de la
función bioquímica especificada por el gen estudiado. Esto se ilustra en
la figura 3.24A, donde se observa un gen funcional para biosíntesis de
triptófano transferido de una bacteria de tipo silvestre (genotipo descri-
to como trp+) a un receptor que carece de una copia funcional de este
Plásmidos

gen (trp-). El receptor se denomina auxótrofo para triptófano (palabra (B) Transducción
ámpleada para describir una bacteria mutante que puede sobrevivir sólo
si s! le suministra un nutriente -en este caso, triptófano- no requerido
por el tipo silvestre; véase sección 16.1.2). Después de la transferencia,
ie necesitan dos entrecruzamientos para integrar el gen transferido al
cromosoma de la célula receptora, lo que la convierte de trp- en trp+. Baderiófago

Los detalles precisos del procedimiento de mapeo dependen del tipo de

transferencia de genes utilizado. Durante la conjugación, el DNA es
transferido del dador al receptor de la misma manera en que se arrastra
una cuerda a través de un tubo. Por 1o tanto, se pueden mapear las posi-
ciones relativas de los marcadores en la molécula de DNA determinan-
(Q Transformación
do los momentos en que aparecen en la célula receptora. En el ejemplo
ilustrado en la figura 3.248,1os marcadores A, B y C son transferidos 8,
20 y 30 minutos después del comienzo de la conjugación, respectiva-
mente. La transferencia de todo el cromosoma de Escherichia coli
demanda alrededor de 100 minutos. En cambio, el mapeo por transduc-
ción y transformación permite mapear genes que están relativamente
próximos, ya que el segmento de DNA transferido es corto (< 50 kb), de
modo que la probabilidad de que dos genes sean transferidos juntos
depende de su cercanía en el cromosoma bacteriano (figura 3.24C)

É!

ilHE=Se# É=st{ffi Fisuta 3.23 Tres maneras de losrar

==E
Un mapa generado por técnicas genéticas ratavezes suficiente para diri-
gir la fase de secuenciación de un proyecto de genomas. Esto obedece a
dos razones:
* La resolución de un mapa.genético depende del número de entrecru-
zamientos que se han evaluado. Esto no es un problema importante en
los microorganismos, porque éstos se pueden obtener en grandes can-
tidades, lo que permite estudiar muchos entrecratzamientos y obtener
un mapa genético muy detallado en el que los marcadores estén sepa-
rados por sólo algunas kilobases. Por ejemplo, cuando comenzó el pro-
yecto de secuenciación del genoma de Escherichia coli en 1990, el
último mapa genético de este microorganismo comprendía más de
1.400 marcadores, un promedio de 1 cada 3,3 kb. Este mapa era sufi-
cientemente detallado para dirigir el programa de secuenciación sin
necesidad de un mapeo físico extenso. De modo similar, el proyecto de
Saccharomyces cerevisiae eta avalado por un mapa genético en escala
fina (de alrededor de 1.150 marcadores genéticos, un promedio de 1
cada 10 kb). El verdadero problema con los seres humanos y la mayo-
ría de los otros eucariontes reside en que no es posible obtener gran
número de descendientes, por lo que pueden estudiarse pocas meiosis
y el poder de resolución del análisis de ligamiento es limitado. Esto sig-
nifica que genes que se encuentran separados por varias decenas de
kilobases pueden aparecer en la misma posición en el mapa genético.
la"transferencia de DNA entre b"ac-
terias. (A) La conjugación puede determinar
la transferencia de DNA cromosómico o plas-
mídico de la bacteria dadora a la receptora. La
conjugación implica contacto físico entre las
dos bacterias y se considera que la transferen-
cia ocurre a través de un tubo angolo deno-
minado pilus. (B) La tmnsducción es la
transferencia de un pequeño segmento del
DNA de la célula dadora a través de un bacte-
riófago. (C) La transformación es similar a la
transducción, pero se transfiere DNA "desnu-
do". Los eventos ilufrados en (B) y (C) se
suelen acompañar por la muerte de la célula
dadora. En (B), la muerte se produce cuando
los bacteriófagos emergen de la célula dado'
ra. En (C), la liberación de DNA de la célula
dadora suele ser una consecuencia de la
muerte celular por causas naturales.
 T
Capítulo 3 Mapeo de los genomas

(A) Transferencia de DM enhe bacterias dadoras (B) Transferencia secuencial de marcadores (C) Cotransferencia de marcadores estrechamente
y receptoras durante la conjugación ligados durante Ia transducción o la transformación

DADORA RECEPTORA DADORA RECEPTORA DADORA RECEPTORA

<É
!* <o.y
< ¡#a¡.

$*ffi
ttp +trp ABi ;8a
: ,.¡1 A + A'
,xx Tiempo de
transferencia nu ,r')
(
*s
L¿ freruencia con qur,4-8 +,4'8*
ttp (minutos)
\y's
C-+ C'
Cepende de l¿ cerc¡ni¿ enire,4 y
e¡l el clonrcscrr:¡
I
+
apr
Mapa 4
082030

Figura 3.24 Base del mapeo genético

e La exactitud de los mapas genéticos es limitada. Este punto se trata
en las bacterias. (A) Transferencia de
un gen funcional para biosíntesis de
triptófano de una bacteria de tipo silves-
tre (genotipo descrito como trp+) a un
receptor que carece de una copia fun-
cional de este gen (trpJ. (B) Mapeo
por conjugación. (C) Mapeo por trans-
ducción y transformación.
en la sección 3.2.3 cuando se evalúa la presunción de Sturtevant de
que los entrecruzamientos son aleatorios a lo largo de los cromoso-
mas. Esta presunción es correcta sólo en parte, pues la presencia de
puntos calientes de recombinación implica que hay mayor probabili-
dad de entrecruzamientos en algunos puntos que en otros. En 1992,
se ilustró el efecto que esto puede tener sobre la exactitud de un
mapa genético cuando se publicó la secuencia completa del cromo-
soma III de Saccharomyces cerevisiae, lo que permitó la primera
comparación directa entre un mapa genético y las posiciones reales
de los marcadores revelada por la secuenciación del DNA (véase
figura 3.25). Habia considerables discrepancias, incluso hasta el
grado en que un par de genes había sido ordenado incorrectamente
por análisis genético. Cabe recordar que S. cerevisiae es uno de los
dos eucariontes (el otro es la moscá de la fruta) cuyos genomas han
sido sometidos a mapeo genético intensivo. Si el mapa genético de
una levadura es inexacto, ¿cuán precisos son los mapas genéticos de
organismos sometidos a análisis menos detallados?

Estas dos limitaciones del mapeo genético implican que, en la mayoría de

los eucariontes, se debe controlar y complementar el mapa genético con
tl
procedimientos de mapeo alternativos antes de iniciar la secuenciación del 5
DNA en gran escala. Se han ideado innumerables técnicas de mapeo físico
para encarar este problema, las más importantes de las cuales son:

= Mapeo de restricción: localiza las posiciones relativas en una molé-

cula de DNA de las secuencias de reconocimiento para las endonu- :i.
cleasas de restricción.
* Hibridación in situ fluorescente (FISH): se mapean las localizacio-
nes de los marcadores por hibridación de una sonda, que contiene el
marcador, con cromosomas intactos.
e Mapeo de los sitios de secuencia identificada (STS): se mapean las
posiciones de secuencias cortas examinando conjuntos de fragmen-
tos de DNA genómico por PCR o análisis de hibridación.
3
 Mapeo fisico 89

lrlapa MaPa
3.3,? MaPec de restricció* lísico g€rléüco

El mapeo genético utilizando RFLP como marcadores de DNA permite chal glkl
tá""lii* lai posiciones de los sitios de restricción polimorfos dentro de un chal

n.rro.u (sectión 3.2.2), pero como muy pocos sitios de restricción de un

sitios (figura3.26).
E."o*u son polimorfos, ésta técnica no mapea muchos un mapa genómico
ípodríarrros aumentar la densidad de marcadores de glkl

Ípú.u"¿o un método altemativo paralocalizar las posiciones de algunos de his¿

iás sitios de restricción no polimorfos? Esto es 1o que logra el llapeo
de res-
ñción, aunque la técnicJtiene limitaciones prácticas que la hacen aplica-
SUP53
Lle sOlo a moléculas de DNA relativamente pequeñas. Analizaremos Ieu2

pri*".o la técnica y, después, consideraremos su importancia para el Centrómero Centrómero

mapeo del genoma. pgkl

Pckl

Mírr:*dología básieo púíú el rriapea de restricciÓn petls

pet18
La manera más simple de construir un mapa de restricción es comparar los CryI

turrruRo, de los fragmentos cuando se digiere una molécula de DNA con dos cry1 MAT

.-i-u, de restricóión diferentes que reconoben distintas secuencias diana.

En la figura 5.27 semuest¡a un ejemplo que utiliza las enzimas de restricción MAT

¿rrru i BamHl.primero, se digiere la molécula de DNA con sólo una de las

;*irnÁ y se miden los tamañoJ de los fragmentos resultantes mediante elec- th14

t ofo..rii en gel de agarosa. A continuación, se digiele la molécula con la SUP6I

segunda y se ritelven a medir los fragmentos obtenidos. en un gel de

"rrririu
ugáro.u. Hasta airora, los resultados permiten descifrar la cantidad de sitios
d"e restricción para cada enzifna, pefo no es posible determinar
sus posicio-
nes relativas. Por 1o tanto, se obtiJne información adicional cortando la molé-
cula de DNA con ambas enzimas alavez. En el ejemplo de la figxa 3.27,
esta doble restricción permite mapear tres de los sitios. Sin embargo, sufge
rin problema con el fragmento más grande obtenido con EcoRI, por_que éste
dos.sitios namAny hay dos posibilidades altemativas para la locali- Figura 3.25 ComParación entre los
"orti"r"
zaciónen el mapa del más externo de ellos. El problema se resuelve volvien- mápas genético y físico del cromo-
soma lll de Sacchoromyces cerev¡-
do a la moléculá original de DNA y tratándola otraYez cooBamHI sola, pero
sioe. La comparación muestra las
impidiendo esta vetque la digestión se complete, lo gu9 se puede logra4 por discrepancias entre los maPas genético
e¡emplo, incubando ü r"r""iót sólo durante un período _breve o utilizando y físicó, este último determinado por
ut u t"*p".utura de incubación subóptima. Esto se denomina restricción par' secuenciación del DNA. Obsérvese que
cial y origina una serie compleja de productos; ahora, los productos de la res- el orden de los dos marcadores supe-
tricción Completa son co*p1"*entados por fragmentos de restricción parci?l riores (glk 1 y cha 1) es incorrecto en
que todavía óontienen uno o más sitios BamHI no cortados. En el ejemplo de el mapá genético Y que también haY
dlferencias en la posición relativa de
ta figUra 3.27, eltamaño de uno de los fragmentos de restricción parcial es
otros pares de marcadores.
diagnóstico y se puede identificar el mapa correcto.

Por lo general, una restricción parcial aporta la información necesaria pata

compleiar un mapa, pero si hay numerosos sitios de restricción, este tipo de
análisis se torna áifi& A" manejaq sólo por la gran cantidad de fragmentos
diferentes por considerar. Hay una estrategia altemativa más simple, porque
permite igñorar la mayoría de los fragmentos. Esto se logra uniendo un mar-
cador rad"iactivo o de ótro tipo a cadáextremo de la molécula de DNA inicial
ll Sitio de restlicción
polimorfo
antes de llevar a cabo la digestión parcial. El resultado es que muchos de los Molécula de
productos de restricción párcial se lrrelven "invisibles" porque no contienen DNA t Siiio de rtsliccién
no polimcrfo
un fragmento terminal y, por lo tanto, no aparecen cuando se investigan pro-
ductos-marcados en et get ae agarosa (figura 3.28). Los tamaños de los pro-
ductos de restricción parcial que son visibles posibilitan localizar los sitios no
mapeados respecto dé los extremos de la molécula inicial.

L* *scolo del mopea de restrícción se ve \¡mitadú Por lüs

t*m*ños de los fragmentos de restricción
Los mapas de restricción son fáciles de generar si los sitios- de corte para Fieura 3.26 No todos los sitios de
las enziimas utilizadas son relativamente escasos. En cambio, a medida reitricción son polimorfos.
90 Capítulo 3 Mapeo de los genomas
-
4.9 kb

,¿/ *oat Bomt¡tl

+ \rcom + BomHl
rll 0! 0,5

3,4 0,7 1,0 1,2 2,0 1,0

1,2

tNTERpRFrAclóN DE LA DoBLE nEsrRrcclóu

Fragmentos Conclusiones
0,2 kb,0,5 kb Estos deben derivar del fragmento EamHI de 0,7 kb que, por lo tanto, tiene un sitio interno EcoRl:

s Fs
# o:
o5

r,o kb Éste debe ser un fragmento Bor¡rHl sin sitio interno EcoRl. Podemos compensar el fragmento EcoRI de 1.5 kb
si colocamos asi el fragmento de I kb:
e Fe
IJ

1,2kb,2,0kb Éstos también deben ser fragmentos EarnHl sin sitíos internos EcoRl. Deben residir dentro del fragmento EcoRl
de 3,4 kb. Hay dos posibilidades:

MAPA I
fa
MAPA II
p fc
0,7 1,2

RESULTADOS PREVISTOS DE UNA RESTR¡CCIÓN PARCIAL CON EAMHI

Si el mapa I es correcto, los productos de restricción parcial incluirán un fragmento de I.2 + 0,7 = I,9 kb
5i el mapa Il es correcto, Ios productos de restricción parcial incluirán un fragmento de 2 + 0,7 = 2,i kb

4,9 kb

I BomHl.
I condiciones subóptimas

1,0 1,7 3,7

.9:! ., ,.-..-... ... J-:!...-.-....,.,,,- . 3,9

4,9

2,0 3,2

1,2 CONCLUS¡ÓN
El mapa ll es correcto

Figura 3.27 Mapeo de restricción. El objetivo es construir mapas de los sitios

EcoRl (E) y BamHl (B) en una molécula de DNA lineal de 4,9 kb. En la parte
superior, se muestran los resultados de las restricciones simples y dobles. Los
tamaños de los fragmentos obtenidos después de la doble restricción permi-
ten.construir dos mapas alternativos, como se explica en el panel central, y el
problema no resuelto es la posición de uno de los tres sitios Bom\l. Se inves-
tlgan los dos mapas mediante una restricción parcial con BomHl (abajo), que
muestra que Map ll es el correcto.
 Mapeo físico

lo hace el número .r r r ,-, =r $ u. M_Olécula de

oue aumenta la cantidad de sitios de corte, también =
- DNA marcada
áe productos de restricción simple, doble y parcial, cuyos tamaños se en el extremo
debin determinar y comparar para construir el mapa. Se puede incorpo- .=--:l
rar análisis computarizado, pero aun así pueden surgir problemas. Se $;*etet Fragmentos
llesará a un estadio en el que un producto de digestión contenga tantos qE-*r**=i.-.r
de restricción
parciales
fra*s-mentos que las bandas indiüduales se fusionen en el gel de agarosa, visibles
lo [ue aumenta las probabilidades de medir uno o más fragmentos de
muñeru incorrecta o de que pasen inadvertidos por completo. Si varios
fragmentos tienen tamaños similares, aunque se los pueda identificar a
tod=os, a veces no es posible reunirlos en un mapa que no sea ambiguo. Figura 3.28 Simplificación del aná-
Iisis de una restricción parcial
fijando marcadores a los extremos
Por 1o tanto, el mapeo de restricción es más aplicable a moléculas pequeñas de la molécula de DNA antes de la
que a grandes, y el lÍmite superior para la técnica depende de la frecuencia de digestión. Se ilustra un extremo de
lós sitios de restricción en la molécula mapeada. En la práctica, si una molé- una molécula de DNA marcada en el
cula de DNA tiene menos de 50 kb de longitud, suele ser posible construir extremo. Después de la restricción
un mapa de restricción que no sea ambiguo para una selección de enzimas parcial, sólo se detectan los produc-
con secuencias de reconocimiento de seis nucleótidos. Cincuenta kilobases es tos que incluyen un fragmento termi-
inferior al tamaño mínimo de cromosomas bacterianos o eucariontes, aunque nal. Esto simplifica mucho los
análisis, lo que permite determinar
sí cubre unos pocos genomas virales y de orgánulos; de hecho, mapas de res-
directamente las posiciones de los
tricción del genoma completo han sido importantes para dirigir proyectos de sitios de restricción de las longitudes
secuenciación con estas moléculas pequeñas. Los mapas de restricción son de los productos marcados.
igualmente útiles después de la clonación de DNA genómico bacteriano o
eucarionte si los fragmentos clonados tienen menos de 50 kb de longitud,
porque es posible construir un mapa de restricción detallado como paso pre-
ii-irrur a lá secuenciación de la región clonada. Ésta es una aplicación impor-
tante del mapeo de restricción en proyectos de secuenciación de grandes
genomas, pero ¿hay alguna posibilidad de emplear el análisis de restricción
para el mapeo más general de genomas completos superiores a 50 kb?

La respuesta es un'osí" formal, porque las limitaciones del mapeo de restric-

ción se pueden superar ligeramente eligiendo enzimas que se prevé que ten-
drán sitios de cofte infrecuentes en la molécula de DNA diana. Estas enzimas
que causan cortes infrecuentes (rare cutters) pertenecen a dos categorías:
Algunas enzimas de restricción cortan en secuencias de reconocimien-
to de siete u ocho nucleótidos; por ejemplo, SapI (5'-GCTCTIC-3') y
Sgfl (5'-GCGATCGC-3'). Sería esperable que las enzimas con secuen-
cias de reconocimiento de siete nucleótidos cortasen, en promedio, una
molécula de DNA con un contenido de GC del5Oo/o vrlavez cada 47 =
16.384 pb. Las enzimas con secuencias de reconocimiento de ocho
nucleótidos debeúan cortar :urravez cada 48 = 65.536 pb. Estas cifras
se comparan con 46 = 4.O96 pb para enzimas con secuencias de reco-
nocimiento de seis nucleótidos, como BamHI y EcoRI. A menudo, se
emplean enzimas de corte con secuencias de reconocimiento de siete u
ocho nucleótidos para elaborar mapas de restricción de moléculas gran-
des, pero el método no es tan útil como podría ser sólo porque no se
conocen muchas erzimas de este tipo.
Se pueden utilizar enzimas cuyas secuencias de reconocimiento conten-
gan motivos que son raros en el DNA diana. Las moléculas de DNA
genómico no presentan secuencias aleatorias y algunas moléculas tienen
deficiencias significativas de algunos motivos. Por ejemplo, la secuencia
5'-CG-3' es rara en los genomas de los vertebrados, porque sus células
tienen una enzima que añade un grupo metilo aI carbono 5 del nucleó-
tido C de esta secuencia. La desaminación de la 5-metilcitosina resul-
tante genera timina (figura 3.29). La consecuencia es que, durante la
evolución de los vertebrados, muchas de las secuencias 5'-CG-3'origi-
nales de estos genomas se han convertido en 5'-TG-3'. Por lo tanto, las
enzimas de restricción que reconocen un sitio que contiene 5'-CG-3'
 Capítulo 3 Mapeo de los genomas
añ Citosin¡ llli.;
.,..¡-L,,
l Los ejemplos son Smal (5'-CCQGGG-3'), que corta el DNA humano
.-.c
¡i'- 'cH
.
tLi
0-- -
l\c.ii.
a, 1
iiN - '' c.
iil
-,C.'N' .CH
TG llnntna i DNA más pequeñas de los procariontes y los eucariontes inferiores,
Figura 5.29 La secuencia 5'-CC-3'es
raia en el DNA de los vertebrados
debido a la metilación del C seguida
de desaminación, que genera T. La
c'rtosinano metilada también puede ser
desaminada, pero el producto -uracilo-
es detectado por el sistema de repara-
ción del DNA de las células de los verte'
brados (sección 16.2.2), que lo vuelve a
convertir en citosina. En cambio, el siste'
ma de reparación no reconoce bien la
timina, de modo que estos nucleótidos
persisten en el genoma.
(A) Electroforesis en gel de agarosa convencional
€.*--
(B) Electroforesis en gel con alternancia de campos
ortogonales (OFAGD
o-er'
t- ::-.. -.-+ .-
:-':ii=l:i-r:=
*::++'-#,
R ar los sitios de restricción en moléculas de DNA. Con la técnica denominada
Bg\
Figura 3.3O Electroforesis en gel de
agarosa convencional y no convencio-
nal. (A) En la electroforesis en gel de
agarosa estándar, los electrodos se colo-
can en ambos extremos del gel y las
moléculas de DNA migran directamente
hacia el electrodo positivo. Las moléculas
de más de alrededor de 50 kb de longi-
tud no pueden ser separadas entre sí de
esta manera. (B) En la OFACE, los elec-
trodos se colocan en los ángulos del gel,
y el campo pulsa entre el par A y el par
B. La OFACE permite separar moléculas
de hasta 2 Mb de longitud.
cortan el DNA de los vertebrados de manera relativamente infrecuente.- e
C
una vez cada 78 kb en promedio, y BssHII (5'-GeGeGC-3'), que corta
t
unayez cada 590 kb. Obsérvese que No/I, una enzima de restricción C
tiH: con una secuencia de reconocimiento de ocho nucleótidos, también c
tiene como diana las secuencias 5'-CG-3' (secuencia de reconocimien- I
fl '' ' cii to 5'-GeGGCCGC-3') y muy raravez corta DNA humano: alrededor C
t-n
de una vez cada 10 Mb.
ü' ilr (
Por consiguiente, las posibilidades de la elaboración de mapas de
I
5'¡::ei;icitosina 1
restricción son mayores cuando se utilizan enzimas que determinan
cortes infrecuentes. Todavía no es posible construir mapas de restric- I
ción de los genomas de animales y plantas, pero es factible aplicar la I
técnica con grandes fragmentos clonados, y con las moléculas de I
f
como levaduras y hongos. (
Si se emplea una enzima que determina cortes infrecuentes, quizá sea nece- (
sario recurrir a un tipo especial de electroforesis en gel de agarosa para
estudiar los fragmentos de restricción resultantes. Esto se debe a que la
relación entre la longitud de una molécula de DNA y su velocidad de
migración en un gel de electroforesis no es lineal, y la resolución disminu-
ye a medida que las moléculas se alargan (figura 3.30A). Esto significa que I
no es posible separar moléculas de más de alrededor de 50 kb de longitud,
porqué todas estas moléculas más largas corren como una sola banda de
migración lenta en un gel de agarosa estándar. Para separarlas, es preciso
reemplazar el campo eléctrico lineal utilizado para la electroforesis en gel
convencional por un campo más complejo. Por ejemplo, la electroforesis
en gel con alternancia de campos ortogonales (OFAGE) emplea un campo
eléctrico que altema entre dos pares de electrodos, ubicados cada uno en
un ángulo de 45" respecto de la longitud del gel (figura 3.308). Las molé-
culas de DNA se mueven, aun así, hacia abajo a través del gel, pero cada
cambio del campo las obliga a realinearse. Las moléculas más cortas se rea-
linean con más rapidez que las más largas y, así, migran más rápidamente
a través del gel. El resultado global es que se pueden resolver moléculas
Fscasa separación
mucho más largas que las separadas mediante electroforesis en gel conven-
de moléculas
de DNA > s0 kb cional. Las técnicas relacionadas son la aplicación de campos eléctricos
homogéneos en contorno cerrado (CHEF) y la electroforesis en gel con
inversión del campo (FIGE).
\§:=
-
lxcmen direclo de m*léculas Ce DtlA para investig*r
sifios ri* restriccion
Thmbién es posible aplicar métodos distintos de la electroforesis para mape-
-rNg
mapeo óptico, los sitios de restricción se localizan directamente observando
las moléculas de DNA cortadas con un microscopio. Primero, se debe fijar el
DNA a un portaobjetos de vidrio, de manera que las moléculas individuales
se estiren en lugar de agruparse en una masa. Hay diversas maneras de
.
lograrlo, como el estiramiento en gel y el peinado molecular (molecular
combing). Para preparar fibras de DNA estiradas en gel, se suspende DNA
cromosómico en agarosa derretida y se lo coloca sobre un portaobjetos. A
medida que el gel se enfría y se solidifica, las moléculas de DNA se extienden
(figura 5.31A). En el peinado molecular, se preparan las fibras de DNA
sumergiendo un cubreobjetos revestido de silicona en una solución de DNA,
se lo deja 5 minutos (período durante el cual las moléculas de DNA se fijan
al cubreobjetos por sus extremos) y, después, se retira el cubreobjetos a una
velocidad constante de 0,3 mm s-1 (figura 3.318). Lafuerza requerida para
arrastrar las moléculas de DNA a través del menisco hace que éstas se aline-
 Mapeo físico 95

en. Una
yez al aire,la superficie del_cubreobjetos se seca y.retiene las molé-
del estiramien-
.ui* a. DNA como una matriz de fibras paralelas. Despuéscon
,"i .t peinado, se tratan las moléculas de DNA inmovilizado una enzima
u1 colorante fluorescente,
áe r.stricciOt y, luego, se las üsualiza agregando
que tiñe el DNA, de
como DAPI (diclorhidrato de 4,6-diamino-2-fenilindol),
portaobjetos
modo que se pueden üsualizar las fibras cuando se examina el
.án ,rtmi"toscopio de fluorescencia de alta resolución. En las moléculas
los sitios de restricción se vuelven gradualmente hiatos, a medi-
""t".rdidut,
áá q"" se disminuye el grado de extensión de las fibras
por la elasticidad natu-
ialáel DNA, lo que permite registrar las posiciones relativas de los cortes.

El mapeo óptico se aplicó por primera vez a grandes fragmentos de

DNA clonados en vectores YAC o BAC (sección 2.2.1). Más reciente-
mente, se ha probado que es factible emplear esta técnica con DNA
senómico en estudios de un cfomosoma de 1 Mb del parásito del palu-
áirrno Plasmodium falciparum, y los dos cromosomas y el megaplásmi-
do único de la bacteia Deinococcus radiodurans (véase cuadro 8.2).

3.3,= É{É*r!da<i*r: i=': sátu¡ fiuor€sttr¡t€

El método de mapeo óptico descrito antes está vinculado con el segun-
do tipo de procedimiento de mapeo físico que consideraremos: la FISH.

(§ Estiramiento en gel (B) Peinado molecular

(molecular combing)

il

, lr
rl
Portaobietos revestído
=_- Solución de DNA
con enzima de restricción
--- #- Cubreobjetos

DNA cromosómico Agarosa

- l

derretida .--..
,'--*
;Pr\
, ñ - \l
i¡dJ i
Figura 5.31 Estiramiento en gel y pei-
'-..\**,,'
t L¿J molecui.rs <ie DNA se fijan
nádo molecular (moleculor combing).
(A) Para efectuar el estiramiento en gel,
La agarosa se solidifica,
ai cubreobjetos por un extrenlo se pipetea sobre un portaobjetos revesti-
el DNA se estira do con un¿ enzima de restricción agaro-
I sa derretida que contiene moléculas de
+
DNA cromosómico. A medida que elgel
se solidific¿, las moléculas de DNA se
Agregar Mgz* para activar 'n.ti,u,
la enzima de restricción estiran. No se sabe por qué sucede esto,
:::)
fl pero se considera que podría ser res-
il ponsable el movimiento del líquido
.¡.
,.-lt
\ sobre la superficie del vidrio durante la
..;' u solidificación. El agregado de cloruro de
# magnesio activa Ia enzima de restricción,
que corta las moléculas de DNA. A
medida que las moléculas se enrollan
gradualmente, se visualizan los hiatos
Microscopia que representan los sitios cortados. (B)
de fluorescencia En el peinado moleculaq se sumerge un
;-;-' cubreóbjetos en una solución de DNA.
Las moléculas de DNA se fijan al cubre-

iúL objetos por sus extremos y se retira el

cubreobjetos de la solución a una veloci-
i,4olécul¡s de DiJÁ con :itrr¡s
de reslrÍriiln visibl¡;
Moleculas de DNA
"peinadas"
dad de 0,3 mm rl, los que produce un
"peine" de moléculas paralelas.
 ::

genomas
CaPítulo 5 MaPeo de los

Comoenelcasodelmapeoóptico,laFlsHpermitelaobservacióndirec-
o una molécula de
ta de la posicién de un'marcador en un cromosoma un sitio de restric-
DNA extendida. En ;il;;;¿pti"o, el marcador DNA extendida' En
es
fibra de
ción y se 1o visualir";;;;;; hiuto una
"". de DNA' que se visualiza por
i; in§H, á áu."udor es una secuencia
hibridación con una sonda fluorescente'

i4ibri.C'=titn in situ;¡¡ -scr:dc s raCiactiu's5

3 filr-;3're5re''lir:
análisis de hibridación (sección
La hibridación in situ es una versión del
2.1.2)queexaminu-r.,"'otttosomaintactomedianteunasonda'quees
en el cromosma en la que
una molécuta de oÑÁ marcada. La posición
acerca de la localización
se produce la hibriüci;;"p*t" inftrmación
enelmapadetasecuenciadeDNAempleadacomosonda(figura3.32).
cromosoma se debe descom-
Para que -eto¿áJ""tio"e, el DNA del
poner en "funa .ott (;'desnatutilizar") rompiendo los pares de
"uá"t'a
bases que mantieneiiiniáá ü ¿out"
hélice. sólo entonces, el DNA cro-
mosómico podrá rrit¡árrr" con la sonda.
El método convencional para
destruir la morfología del cro-
desnaturali zar e]DNA;;;*osómico sin
Células en división mosoma consiste ,""u, la preparación sobre un portaobjetos de
con cromosomas "r.
;iá;i" y, después, tratarLa con formamida'
en metafase

Enlasprimerasversionesdelahibridacióninsitu,lasondasemarcabacon
radiactividad,peroesteprocedimientoefainsatisfactorioporque,conun
sensibilidad y resolución' dos
marcador radiactivo, eJ dificil alcanzat
I

requerimien,o. ni¡ti¿uciO" in situ exitola' La sensibilidad

una alta energía de emisión (p'
I
i
I
I
"*"Iát"l"n;ü];
requiere que el *u."uáo, radiactivo tensa
,'i:)
* t"nul se?is.petse y;.por lo.tanto' la resolu-
ej.,32P),p..o un radiomar-
"rro'ñiJJq""
ción es escasa. e. poliUf.Irc i.,,u, ulturesolucióniile
utiliza
cador de baja como 3H, pero en este caso la sensibilidad
".r"rgdá" "*isión prolongadas' lo que determina
es tan baja que se-necesitan exposiciones
genuina'
Formamida
I ái . i."áÜv iificuitades para diicemir la señal

Estosproblemasseresolvieronafinesdeladécadade1980conelde-
fluorescentes. Estos mar-
sarrollo de marcaáores de DNA no radiactivos,
alta resolución y son ideales para
Desnaturalización
del cromosoma
## cadores .o*Ui.,uriáiü.""ti¡ifi¿ad con con diferentes
la hibridaciOn lr, .ii".*§"^frá ái."ñado fluoromarcadores de sondas distintas
una serie
colores de emisió'n;il"-;;ii* tiUti¿ur individua-
y a1r"r"rr"lar sus señales de hibridación
ou:q,.ill: a un solo
I les, 1o que".orroroáá
posibil"it;rp;;; rá. po.i"io".s relativas de las secuencias
sensibilidad' se
de
deben
la sonda (figura i".sif'b"'u alcánzat la máxima lo qu?, en el pasado'
posible,
marcar las sondas ááí to¿u la intensiáád largas, en gene-
-'- ,rg"ifi;"b; q"" ¿áuiá" ser moléculas de DNAdebastante 40 kb. Este requisito es
ral fragmento. ¿" Ña clonado de no menos
ái'
1

técnicas para lograr marca-

menos importuriJun;;; q"" se han creado
I

Señal de Ia sonda
Figura 3.32 Hibridación in situ fluo-
reicente. Se seca una muestra de
.¿t"f.i en división sobre un portaob-
la trata con formamtda, de
ie::s v se
:-t=na'tu que los cromosomas son
iesnaturálizados pero no pierden sus
n'cn'ologías características de la meta-
'.r= iueZse sección 7.1.2)' Se visuali-
za la posición en la que la sonda se
hibrida al DNA cromosÓmico Por
detección de la señal fluorescente
ernitida Por el DNA marcado'
1o qu9-gongierne a la cons-
ción intensa con moléculas más cortas' En se puede
de bNA
trucción de un *"p" irti"t, t"' ftugmento "lot'udo
en la.práctica uso de
el
considerar sólo otro tipo de -u."u¿ái-*rrque
dimensióñ, porque el DNA
clones como marcadores suma unu sáérttda secuencia de
ctonado *u'áiái;;;i.áa .iáf se determina-[a
DNA. por".lo"t,r";;;;t;é;; á" las posiciones y su secuencia de DNA'
de los clones representa
un eslabón directo entre el mapa de un genoma
DNA' surge un posible problema' por
Si la sonda es un fragmento largo
de
que esla probabilidad de que con-
1o menos en los eucariontes superiores,
tenga ejemplo, ¿á-rá"*.iu. ¿f DNA
repetitivo (óapítulo 9) y' por Io tanto'
del cromosoma' no sólo en el
se puede hibrid;;;;Á""nu' posicionés Para reducir esta
punto específico con el que sé aparea perfectamente'
 Mapeo físico 95

hibridación inespecífica, se mezcla la sonda con DNA no marcado del orga-

nir*o estudiado antes de utilizatla. Este DNA puede ser simplemente
bNA nuclear total (que representa el genoma entero), aunque es mejor uti-
liru, unu fracción enriquecida en secuencias repetidas. La idea es que el =
bNe ro marcado se hibride con las secuencias de DNA repetitivo de la
sonda y las bloquee, de manera que la hibridación in situ ulterior sea con-
ducidaen su totalidad por las secuencias únicas. Así, la hibridación inespe-
cífica se reduce o se elimina por completo (figura 3.34).

{i5i4 =¡ ü{iic't
Al principio, la FISH se utilizaba con cromosomas en metafase (sección
Z.t). Estos cromosomas, preparados a partir de núcleos en división, están
muy condensados, y cada cromosoma de un par adopta un aspecto recono-
cibie, caractenzado por la posición del centrómero y el patrón de bandeo
que emerge tras la tinción de la preparación cromosómica (véase fig. 7'5).
Óon los cromosomas en metafase, la señal fluorescente obtenida por FISH
se mapea midiendo su posición respecto del extremo delbrazo corto del cro-
mosoma (valor Flpter). Una desventaja de este método es que el carácter
altamente condensado de los cromosomas en metafase implica que sólo es
posible el mapeo de baja resolución: dos marcadores tiene¡ que estar sepa-
iados por no menos de 1 Mb para ser resueltos como señales de hibridación
distintas. Este grado de resolución es insuficiente para construir mapas üo-
mosómicos útiles, y la principal aplicación de la FISH en metafase ha sido
determinar en qué cromosoma se localiza un nuevo marcador y tener una
idea aproximada de su posición en el mapa, como dato preliminar al mapeo
en escala más fina por otros métodos.

Durante varios años, estos "otros métodos" no implicaron ninguna

forma de FISH, pero desde 1995 se han creado diversas técnicas de Figura 3.53 Utilización de FISH para
FISH de mayor resolución. Con estas técnicas, se alcanza resolución más mapeo físico. Se ha marcado una
alta por modificación del carácter de la preparación cromosómica estu- serie de l8 clones de cósmidos dife-
diada. Si los cromosomas en metafase están demasiado condensados rentes con distintos marcadores fluo-
para el mapeo en escala fina, se deben úilizar cromosomas que estén rescentes y se los hibridó con un solo
más extendidos. Hay dos maneras de hacerlo: par de cromosomas hom,ólogos..Los
cromosomas provienen de un núcleo
= Se pueden obtener cromosomas extendidos mecánicamente modifi- en metafase y, por lo tanto, están uni-
cando el método de preparación aplicado para aislar cromosomas de dos por sus centrómeros. Las posicio-
los núcleos en metafase. La incorporación de un paso de centrifuga- nes relativas de las señales
ción genera fuerzas de deslizamiento que pueden estirar los cromoso- fluorescentes permiten determinar las
localizaciones en el mapa de los frag-
mas hasta 20 veces su longitud normal. Aun así, se pueden reconocer mentos de DNA transportados Por
cromosomas individuales y es posible mapear las señales de FISH de cada cósmido. lmagen, cortesía de
la misma manera que con los cromosomas en metafase normales. La Octavian Henegariu.
resolución mejora en forma significativa, y se pueden distinguir mar-
cadores separados por 200-500 kb.
= Se pueden utilizar cromosomas fuera de la metafase, porque sólo
durante ésta se observa alta condensación cromosómica: en otros esta-
dios del ciclo celular, los cromosomas están naturalmente desenrolla-
dos. Se ha intentado emplear núcleos en profase (véase figura 3.15),
cuando los cromosomas todavía están suficientemente condensados
para identificarlos. Pero en la práctica estas preparaciones no ofrecen
ventajas respecto de los cromosomas estirados en forma mecánica. Los
cromosomas en interfase son más útiles, porque en este estadio del
ciclo celular (entre las divisiones nucleares) presentan su máximo de-
senrollamiento. Es posible una resolución hasta de 25 kb, pero se pier-
de la morfología del cromosoma, de manera que no hay puntos de
referencia externos para mapear la posición de la sonda. Por lo tanto,
esta técnica se emplea después de obtener la información del mapa pre-

Capítulo 5 f/apeo de los genomas
Sonda de hibridación
!i !.Lr
=-::á _ \¡|
'_=:_-*Es
Añadir DNA enriouecidJ
para DNA repetitivo
Las secuencias repetÍdas
de la sonda ahor¿ están bloqueadas
llllllllllllrl,',lr
T'?'i*i-í-t-r
La hibridación de la sonda
es conducida por las secuencias únicas
Figura 3.34 Método para bloquear
las secuencias de DNA repetitivo en
una sonda de hibridación. En este
ejemplo, la molécula de la sonda con-
tiene dos secuencias repetidas (ilus-
tradas en rojo). Si no se bloquean
estas secuencias, la sonda se hibrida-
rá de manera inespecífica con cual-
quier copia de estas repeticiones del
DNA diana. Para bloquear las secuen-
cias repetidas, la sonda se prehibrida
con una fracción de DNA enriquecida
para DNA repetitivo.
-:
DNA repetitivo liminar, en general para detenninar el orden de una serie de marcado-
res en una pequeña región del cromosoma.
Los cromosomas en interfase contienen las moléculas más desenrolladas de
todo el DNA celular. Así, para mejorar la resolución de la FISH a menos de
I 25 kb, es preciso abandonar los cromosomas intactos y utilizar, en cambio,
DNA purificado. Este enfoque denominado FISH sobre fibras utiliza DNA
preparado mediante estiramiento en gel o peinado molecular (véase figura
I 3.31) y permite distinguir marcadores separados por menos de 10 kb.
I
3.3.3 Mapeo de sitics de secuencia identificada
llll,r
fT:'rr!illllllll Para generar un mapa físico detallado de un genoma grande se requie-
re, idealmente, un procedimiento de mapeo de alta resolución que sea
rápido y sin exigencias técnicas. Ninguna de las dos técnicas que hemos
considerado hasta ahora -mapeo de restricción y FISH- cumple estos
requisitos. El mapeo de restricción es rápido, fácil y aporta información
detallada, pero no se lo puede aplicar a genomas grandes. La FISH se
puede aplicar a genomas grandes y las versiones modificadas como la
FISH sobre fibras pueden proporcionar datos de alta resolución, pero la
FISH es difícil de practicar y la acumulación de datos es lenta; un solo
experimento permite obtener las posiciones en el mapa de no más de
tres o cuatro marcadores. Para que los mapas físicos detallados se con-
viertan en una realidad, se necesita una técnica más potente.
Por ahora, la técnica de mapeo físico de mayor rendimiento y que ha dado
lugar a la generación de la mayoria de los mapas detallados de grandes geno-
mas es el mapeo de STS. Un siüo de secuencia identificada, o STS, es sólo
una secuencia corta de DNA, en general de 100 pb a 500 pb de longitud, que
es fácilmente reconocible y aparece una única vez en el cromosoma o el geno-
ma estudiado. Para mapear una serie de STS, se requiere un conjunto de frag-
mentos de DNA superpuestos de un solo cromosoma o de todo el genoma.
En el ejemplo de la figura 5.55, se ha preparado un conjunto de fragmentos
a partir de un solo cromosoma, con cada punto a lo largo del cromosoma
representado, en promedio, cinco veces en el conjunto. Los datos de los que
se derivará el mapa se obtienen determinando qué fragmentos contienen cuá-
les STS. Esto se puede efectuar por análisis de hibridación, pero se suele
emplear PCR porque es más ñpida y ha probado ser más pasible de automa-
t'tzación. Por supuesto, las probabilidades de que dos STS estén presentes en
el mismo fragmento dependerán de cuán juntos estén en el genoma. Si están
muy próximos, hay una buena probabilidad de que siempre estén en el
mismo fragmento; si están más separados, a veces estarán en el mismo frag-
mento y a veces no (figura 3.35). Por lo tanto, se pueden utikzar los datos
para calcular la distancia entre dos marcadores, de un modo análogo al que
se determinan las distancias en el mapa por análisis de ligamiento (sección
3.2.3). Cabe recordar que en el análisis de ligamiento una distancia en el mapa
se calcula de la frecuencia de entrecruzamientos entre dos marcadores. El
mapeo de STS es básicamente igual, excepto que la distancia en el mapa se
basa en la frecuencia con la que se producen roturas entre dos marcadores.
La descripción previa del mapeo de STS deja algunos interrogantes crí-
ticos: ¿Qué es exactamente un STS? ¿Cómo se obtiene el conjunto de
fragmentos de DNA?
Cualquier secuencis único de DNA puede utílizorse como.un 5I5
Para calificar como STS, una secuencia de DNA debe cumplir dos criterios.
El primero es que se debe conocer su secuencia, de manera que se pueda pre-
 Mapeo flsico 97

Figura 3.55 Conjunto de fragmentos

adecuados para el mapeo de STS. Los
fragmentos abarcan toda la longitud de
Mapa cromosómico un cromosoma y cada punto del cromo-
soma está presente en un promedio de
cinco fragmentos. Los dos marcadores
azules están cerca en el mapa cromoso'
mico y hay una alta probabilidad de que
se los encuentre en el mismo fragmen-
Recolección to. Los dos marcadores verdes están
de fragmentos más distantes entre sí y, por lo tanto, hay
menos probabilidad de hallarlos en el
mismo fragmento.

5 fragnlentos 2 segmentos
Cola de poli(A)
compe rtLi,:s compartidos
J
a¡1+¡¡

v rlrrrr
AsreSar un cebador oligo(d[)
parar un análisis por PCR para investigar su presencia 9 auselcia en diferen- I
tes fragmentos de DNA. El segundo requisito es que el STS debe tener una
TTTTTT -,
localización única en el cromosoma estudiado o en el genoma completo si la -,
J)

serie de fragmentos de DNA cubre todo el genoma. Si la secuencia del STS I Síntesis de la primera cadena

aparece en más de una posición, los datos del mapeo serán ambiguos. Por lo ij I por la transcriPtasa inversa
5' .. 3'
tanto, hay que tener cuidado de asegurarse de que los STS no incluyan -- --..-. - . -.:,\.1\
r r r ¡ i ir r r I ¡ ¡ l I ¡ ¡ ¡ r ¡ i i I (J++++++
secuencias halladas en DNA repetitivo. l'-,,.,'.5,
DNA
I La ribonucleasa H degrada la

Éstos son criterios fáciles de cumplir y se pueden obtener STS de muchas

I mayor parte del RNA
: :?-1
maneras, de las cuales las más comunes son etiquetas de secuencia expre' r r r r l r r i ¡ ¡ t t t rr r t r r r I rLJ"++++++
l.-.',,,,5,
sada (EST), SSLP y secuencias genómicas aleatorias.
¡ Síntesis de la segunda cadena
* Etiquetas de secuencia expresada. Éstas son secuencias cortas obte- ! por la DNA polimerasa I

nidas por análisis de clones de cDNA. Se prepara DNA complemen- 5'

tario convirtiendo una preparación de mRNA en DNA de doble TTTTTT 5-,
3'
cadena (figura 3.36). Como el mRNA de una célula deriva de genes
que codifican proteínas, los cDNA y las EST obtenidas de ellos repre-
! Finalización de la síntesis de
! la segunda cadena
sentan los genes expresados por la célula de la que se preparó el
5' "3'
mRNA. Las EST se consideran un medio rápido de acceder a las ffi
secuencias de genes importantes y son valiosas aun cuando sus 3'- 5'

secuencias estén incompletas. Asimismo, se puede '¡tllizat una EST

como un STS, si se presume que proviene de un único gen y no de Figura 5.56 Un método de prepara-
un miembro de una familia de genes en la que todos los genes tienen ción de cDNA. La mayoía de los
la misma secuencia o secuencias muy similares. mRNA eucariontes tienen una cola de
poli(A) en su odremo 5' (sección
" SSLP. En la sección 3.2.2 examinamos el uso de microsatélites y 12.2.1). Esta serie de nucleótidos A se
otros SSLP para el mapeo genético. Los SSLP también se pueden uti- utiliza como sitio cebador para el primer
lizar como STS para el mapeo físico. Los SSLP que son polimorfos y estadio de la síntesis de cDNA llevada a
ya han sido mapeados por análisis de ligamiento tienen particular cabo por la transcriptasa inversa: una
DNA polimerasa que copia un molde de
valor, pues representan una conexión directa entre los mapas genéti- RNA (sección 2. I .1 ). El cebador es un
co y físico. oligonucleótido DNA sintético, corto, en
* Secuencias genómicas aleatorias. Éstas se obtienen por secuenciación de
geñeral de 20 nucleótidos de longitud,
formado enteramente pór T (un cebador
fragmentos aleatorios de DNA genómico clonado o, simplemente, descar- "oligo(dl)'). Una vez finalizada la síntesis
gando secuencias que han sido depositadas en bases de datos. de la primera cadena, se trata la prepara-
ción con ribonucleasa H, que degrada
específicamente el componente RNA de
Fr*grnentos de DNA parc mopeo de 5IS un hhrido RNA-DNA En las condiciones
empleadas, la enzima no degrada todo
El segundo componente de un procedimiento de mapeo de STS es el el RNA, sino que deja segmentos cortos
conjunto de fragmentos de DNA que abarcan el cromosoma o el geno- que ceban la reacción de síntesis de la
ma estudiado. En ocasiones, este conjunto se denomina reactivo de segunda cadena de DNA, catalizada por
mapeo y, por ahora, hay dos maneras de reunirlo: como genoteca de clo- la DNA polimerasa l.
 T
Capitulo 3 l\4apeo de los genomas

(A) lnadiación de cromosomas nes y como panel de híbridos por radiación. Consideraremos en primer
término los híbridos por radiación.

Un híbrido por radiación es una célula de roedor que contiene frag-

.,ñ$
Alta dosis i,,Baia dosis
mentos de cromosomas de un segundo organismo. Inicialmente, la téc-
nica se desarrolló con cromosomas humanos, a partir de la década de
€@€=§*me= e@*
1970 cuando se descubrió que la exposición de células humanas a
Ciomosomas fragmentad*s dosis de rayos X de 3.000-8.000 rad fragmenta los cromosomas al azar
y que dosis más altas de rayos X generan fragmentos más pequeños
(figura 3.37A). Por supuesto, este tratamiento es letal para las células
(B) Fusión de las células para producir un híbrido humanas, pero los fragEentos de cromosomas se pueden propagar si
- por radiación
las células irradiadas se fusionan después con células no irradiadas de
un hámster u otro roedor. Se estimula la fusión químicamente, con
polietilenglicol o por exposición a virus Sendai (figura 3.378). No
:: J,-+t+-
*+-,9n+ ¿
§ todas las células del hámster captan fragmentos de cromosomas, por
''i-
-:_ É- 1o que es preciso contar con un medio para identificar los híbridos. El
proceso de selección habitual consiste en utilizar una línea de células
hámler
de hámster incapaces de fabricar timidincinasa (TI() o hipoxantina
Núcleo humano Núcleo de
irradiado
fosforribosiltransferasa (HPRT); las deficiencias de cualquiera de estas
dos enzimas son letales cuando las células crecen en un medio que
contiene una mezcla de hipoxantina, aminopterina y timidina (medio
Fusión celular
HAT). Después de la fusión, se colocan las células en un medio HAT.
I Aquellas que crecen son células de hámster híbridas que han adquiri-
E *_a do fragmentos de DNA humano que incluye genes para las enzimas
.t ;fl ^=r Fragrnenios rie TK y HPRT humanas, que son sintetizadas dentro de los híbridos, 1o
í § F :e ot¡Á hum¡no en que les permite crecer en el medio selectivo. El tratamiento determina
É ,+s d ='
(roroso,nos
agg!
a - .*r i de hámsler células híbridas que contienen una selección aleatoria de fragmentos
.+_
de DNA humano insertados en los cromosomas de hámster. Por lo
Núcleo híbrido general, los fragmentos miden de 5 a 10 Mb y cada célula contiene
fragmentos que equivalen al 1.5-35oh del genoma humano. El conjun-
to de células se denomina panel de híbridos por radiación y se puede
emplear como reactivo para e1 mapeo de STS, siempre que el análisis
Figura 3.37 Híbridos por radiación.
(A) Resultado de la irradiación de de PCR utilizado para identificar e1 STS no amplifique la región equi-
células humanas: los cromosomas se valente de DNA del genoma del hámster.
rompen en fragmentos, los fragmen-
tos más pequeños son generados Se puede construir un segundo tipo de panel de híbridos por radia-
por dos¡s de rayos X más altas. En ción que contiene DNA de sólo un cromosoma humano si la línea
(B), se produce un híbrido por radia- celular irradiada no es humana, sino un segundo tipo de híbrido de
ción mediante la fusión de una célu-
Ia humana irradiada con una célula
roedor. Los citogenetistas han desarrollado una serie de líneas celula-
de hámster no tratada. Con el fin de res de roedores en las que un sólo cromosoma humano es propagado
que resulte más claro, sólo se mues- de manera estable en el núcleo de la célula del roedor. Si se irradia
tran los núcleos. una línea celular de este tipo (p. ej., una línea celular de ratón) y se
la fusiona con células de hámster, las células de hámster híbridas
obtenidas tras la selección contendrán fragmentos de cromosomas
humanos o de ratón, o una mezcla de ambos. Es posible identificar
los que contienen DNA humano por sondaje con una secuencia repe-
tida específica de ser humano, como el elemento nuclear corto disper-
so (SINE) denominado Alu (sección 9.2.1), que tiene una cantidad de
copias de más de un millón (véase cuadro 9.3) y, por lo tanto, apare-
ce en promedio ufla vez cada 3 kb en el genoma humano. Só1o las
células que contienen DNA humano se hibridarán con las sondas Alu,
lo que permite descartar los híbridos de ratón, que no interesan, y
dirigir el mapeo de STS a las células que contienen fragmentos de cro-
mosomas humanos.

A1 principio, el mapeo de híbridos por radiación del genoma humano

se llevaba a cabo con paneles específicos de cromosoma y no de todo
el genoma, porque se consideraba que se requerirían menos híbridos
 Mapeo físico

Dara mapear un solo cromosoma que los que se necesitarían para

irup.u, fodo el genoma. Se observó que un mapq de alta resolución
á" r" solo cromosoma humano requiere un panel de 100-200 híbri-
dos, que se acerca al máximo de 1o que se puede manejar cómoda- Mezcla de
fnente en un programa de investigación por PCR. Pero los paneles cromosomas
oata el genoma completo y para un solo cromosoma se construyen de
irur,.ru diferente: el primero implica irradiación sólo de DNA huma-
no y el segundo, irradiación de una célula de ratón que contiene ;l'
*tróho DIIIA de ratón y relativamente poco DNA humano. Esto impli- Detector de
ca que el contenido de DNA humano por híbrido es mucho más bajo fluorescencia

.n ún panel para un solo cromosoma que en un pangl Pgra- el genoma ,:

compléto. sé deduce que es posible un mapeo detallado del genoma
tririiitirrrH

completo con menos de 100 híbridos por radiación del genoma com-
ÉÉ
--.-,!i
-
=+ r

pletó, de manera que el mapeo del genoma completo no es más difí-

.il qr" el mapeo de un solo cromosoma. ÍJna vez advertido esto, los
híbridos por radiación del genoma completo se convirtieron en un com- Cargador

ponente central de la fase de mapeo del Proyecto Genoma Humano \l)

isección 4.3). También se han utilizado genotecas de todo el genoma
para elmapeo de STS de otros genomas de mamíferos y para los del pez \)

Placas
de deflexión
Ton¡bién se puede empleor una genoteta de clones coma Deflexión de
reúttivú de mopeo poro el onólisís de SI5 gotitas con carga

El paso preliminar de la fase de secuenciación de un proyecto de geno-

-ui ". romper en fragmentos el genoma o los cromosomas aislados y
clonar cada uno en un vector de alta capacidad que pueda manejar
grandes fragmentos de DNA (sección 2.2.1). Esto da origen a una
genoteca de clones, un conjunto de fragmentos de DNA que, en el caso
áe u, proyecto de genomas, tienen un tamaño promedio de varios
cientos de kilobases. Además de apoyar el trabajo de secuenciación,
Muestra que contiene Todos los
este tipo de genoteca de clones también se puede utilizar como reacti- sólo un tipode demás
vo de mapeo en el análisis de STS. cromosoma cromosomas

A1 igual que los paneles de híbridos por radiación, una genoteca de

clones se puede preparar de DNA genómico y, así, representar a todo Figura 3.38 Separación de cromo-
el genoma, o si el DNA proviene de sólo un tipo de cromosoma, se somas por citometría de flujo. Se
puede preparar una genoteca específica del cromosoma. Esto último hace pasar una mezcla de cromoso-
es posible porque los cromosomas se pueden separar por citometría mas marcados fluorescentemente Por
una pequeña apertura, de manera
de flujo. Para llevar a cabo esta técnica, se rompen con cuidado las que cada gota que emerge contiene
células en división (aquellas con cromosomas condensados) para sólo un crómosoma. El detector de
obtener una mezcla de cromosomas intactos. Después, se tiñen los fluorescencia identifica la señal de las
cromosomas con un colorante fluorescente. La cantidad de colorante gotas que contienen el cromosoma
que fija un cromosoma depende de su tamaño, de manera que los cro- éorrecto y les aplica una carga eléctri-
mosomas más grandes fijan más colorante y emiten fluorescencia más ca. Cuando las gotas alcanzan las pla-
brillante que los más pequeños. Se diluye el preparado cromosómico cas eléctricas, las que están cargadas
presentan deflexión e ingresan en un
y se lo hace pasar a través de una fina apertura, 10 que produce una
vaso distinto. Todas las demás gotas
corriente de gotitas, cada una de las cuales contiene un solo cromo- caen verticalmente a través de las pla-
soma. Las gotitas atraviesan un detector que mide el grado de fluo- cas de deflexión y son recogidas en el
rescencia e identifica así cuáles contienen el cromosoma particular vaso de residuos.
buscado. Se aplica una carga eléctrica a estas gotitas y no a otras
(figura 3.58), 1o que posibilita la deflexión de las gotitas que contie-
nen el cromosoma deseado y su separación del resto. ¿Qué sucede si
dos cromosomas diferentes tienen tamaños similares, como en el caso
de los cromosomas humanos 2l y 22? Por lo general, éstos se pueden
separar si el colorante empleado no es uno que se una inespecífica-
mente al DNA, sino que tenga preferencia por las regiones ricas en
AT o GC; por ejemplo, Hoechst 33258 y cromomicina A3, respectiva-
 Capítulo 3_Mapeo de los genomas

Figura 5.39 Valor de las genotecas

A,E i D EF t'.

,/ -\
- l=- -

de clones en los proyectos de /'- \ z)

l{ -'§ \\
genomas. La pequeña genoteca de () () t\\\ /,
cENoTEcA DE cLoNEs

clones mostrada en este ejemplo con-

tiene suficiente información para
\y'" c\y' r, t- i-r \/: ./J

construir un mapa de STS y también \//\\

se puede utilizar como fuente del . V
DNA que será secuenciado.

I Uülizar la genoteca de clones I Secuencia de clones

I como reactivo de mapeo .f, superpuelos

AB C DE F G H I
¡¡ETAGGCAf §f,[f §f,Qf,{ ear
,il.4apa de 5TS Secuencia de DNA

mente. Rara vez dos cromosomas del mismo tamaño tienen idéntico
contenido de GC y, por lo tanto, se los puede distinguir por las canti-
dades de colorante específico de AT o GC fijado.

En comparación con los paneles de híbridos por radiación, las genote-

cas de clones tienen una ventaja importante para el mapeo de STS: los
clones individuales pueden aportar, después, el DNA que es realmente
secuenciado. Los datos que resultan del análisis de STS, a partir del cual
se genera el mapa físico, pueden tener la misma utilidad para determi-
nar qué clones contienen fragmentos de DNA solapado, lo que permite
construir un cóntigo de clones (clone contig) (figura 3.39; véanse otros
métodos para ensamblar cóntigos de clones en la sección 4.2.2). Este
ensamblaje de clones solapados se puede utilizar como material de base
para una secuencia de DNA continua, prolongada, y los datos de los STS
se pueden utilizar después para anclar con precisión esta secuencia en el
mapa físico. Si los STS también incluyen SSLP que han sido mapeados
por análisis de ligamiento genético, entonces es posible integrar la secuen-
cia de DNA, el mapa físico y el mapa genético.

É.esu*:+y:
Los mapas de genomas proporcionan el marco para los proyectos de
secuenciación porque indican las posiciones de los genes y otras
características reconocibles y permiten, así, verifi car la exactitud de
una secuencia de DNA ensamblada. Los mapas genéticos se constru-
yen por experimentos de cruzamiento y análisis de árboles genealógi-
cos, y los mapas físicos, por examen directo de moléculas de DNA. En
los primeros mapas genéticos, los marcadores eran genes cuyos alelos
se podían distinguir porque daban origen a fenotipos fáciles de reco-
nocer, como distintos colores de ojos, o se podían diferenciar por
pruebas bioquímicas. En la actualidad, también se utilizan mucho los
marcadores de DNA, que comprenden polimorfismos de longitud de
los fragmentos de restricción (RFLP), polimorfismos de longitud de
secuencias simples (SSLP) y polimorfismos de un solo nucleótido
(SNP), todos los cuales se pueden tipificar en forma rápida y fácil
mediante PCR. Las posiciones relativas de los genes y los marcadores
de DNA en Ios cromosomas se determinan por análisis de ligamiento.
Esta técnica se basa en los descubrimientos genéticos originales de
Mendel y fue desarrollada por primera yez en la primera mitad del
siglo xx para aplicarla a las moscas de la fruta. El análisis de liga-
 Mapeo físico IOI

miento permite determinar la frecuencia de recombinación entre un

par de marcadores y aporta los datos necesarios para deducir las posi-
iiones relativas de los marcadores en el mapa genético. Para muchos
organismos, el análisis de ligamiento se lleva a cabo siguiendo la
herencia de marcadores en experimentos de cruzamientos planifica-
dos, pero esto no es posible en los seres humanos. En cambio, el
mapeo genético del genoma humano depende del examen de la heren-
cia de marcadores en familias grandes, procedimiento denominado
análisis del árbol genealógico. Los mapas genéticos tienen resolución
relativamente escasa, tienden a ser inexactos y se los debe refinar por
mapeo físico si el mapa se va a utilizar para un proyecto de secuen-
ciación de genomas. Las posiciones de restricción en una molécula de
DNA pequeña se pueden determinar mediante la generación de mapas
de restricción, pero éstos sólo tienen valor limitado en los cromoso-
mas eucariontes. Resulta más útil la hibridación in situ fluorescente
(FISH), en la que una preparación de cromosomas intactos, posiblemen-
te los que han sido elongados por estiramiento mecánico, son hibrida-
dos por una sonda con un marcador fluorescente. Se determina la
posición en la que se produce la hibridación por examen del preparado
mediante microscopia confocal. Los mapas físicos más detallados se
obtienen por mapeo del contenido de sitios de secuencia identificada
(STS), que utiliza un reactivo de mapeo, un conjunto de fragmentos de
DNA superpuestos que abarcan todo un cromosoma o un genoma. La
posición de un marcador en un mapa se determina identificando los
fragmentos del conjunto que contienen copias del marcador. El reac-
tivo de mapeo puede ser una genoteca de clones o un panel de híbri'
dos por radiación.
T-

%cil#*ffi*Eees**
=
d*
Ér= ffi*ffi*ÉE#-

€
:.É

l¡;ii:: j¡ :',.ri:ti:,:l l:i: ; ¡l:i :

]::E
.4
,} l.l i'r1¡ l:,,:
=
ss, 4.? f;nsambiap d* una se#i**{ia
* {ont¡§$= de *i§A
4.1 Lss Fr*yeri*s fi*l:+¡r:+ Hum*;:+
á
.*
.*
Describir en detalle los métodos enzimático (de terminación de cadena) y de ciclo térmico para la secuen-
ciación del DNA.
É ::::

Describir en general los métodos de degradación quÍmica y pirosecuenciación, y mencionar sus aplicacio-
# nes.
:tr
E Mencionar los puntos fuertes y las limitaciones del método aleatorio, el método aleatorio del genoma
completo y el método de cóntigos de clones para la secuenciación del genoma.
é
-? Describir cómo se puede secuenciar un pequeño genoma bacteriano por el método aleatorio, utilizando
como ejemplo el proyecto de Hoenophilus influenzoe.
*
,-§
-s Reseñar las diversas maneras en que se puede conlruir un cóntigo de clones.

Explicar la base del método aleatono del genoma completo para la secuenciación del genoma y destacar
los pasos adoptados para garantizar que la secuencia resultante sea correcta.

tri
=
.rj
Relatar el desarrollo de los proyectos de genoma humano hasta la publicación de las secuencias cromosó-
micas terminadas en 2004-2005.
é
=É Debatir los problemas éticos, legales y sociales planteados por los proyectos de genoma humano.

s
Er:
€
*
g':
Eñ
El objetivo final de un proyecto de genoma es obtener la secuencia com-
s: pleta del DNA del organismo estudiado, integrada en lo ideal por mapas
genéticos o físicos del genoma, de manera de poder localizar los genes y
.É
*§É otras características interesantes dentro de la secuencia de DNA. En este
*': capítulo se describen las técnicas y las estrategias de investigación emple-
* adas durante la fase de secuenciación de un proyecto de genoma, cuando
se está considerando directamente este objetivo final. Dado que las téc-
:§
:s :-
nicas de secuenciación del DNA son de primordial importancia en este
* !1
contexto, comenzaremos el capítulo con un examen detallado de los
ffi
:H :: métodos de secuenciación. Sin embargo, estos procedimientos son de
gil escaso valor, a menos que se puedan ligar en el orden correcto las secuen-
cias cortas, que resultan de los experimentos de secuenciación indivi-
* duales, para obtener las secuencias maestras de los cromosomas que
§ .=i
componen e1 genoma. Por lo tanto, en la segunda parte de este capítulo
1á 'l
's i'! se consideran las estrategias empleadas para garantizar el ensamblaje
ff i:
correcto de las secuencias maestras.

# .a;
#-,.rt:ur .'
:ñt: l
t08 Capítulo 4 Secuenciación de los genomas

§.? ffiátsdcs de secuenciaciáa del EBru&

Si bien hay varios procedimientos para secuenciar el DNA, el más popu-
lar es el método enzimático (de terminación de cadena) creado por pri-
merayez por Fred Sanger y cols. a.mediados de la década de 1970. La
secuenciación enzimática ha ganado preeminencia por varias razones,
entre las cuales la facilidad con que se puede automatizar esta técnica
no es la menor. Como se verá más adelante en este capítulo, un proyec-
to de genoma implica una enorne cantidad de experimentos de secuen-
ciación individuales y practicarlos todos en forma manual insumiría
muchos años. Por lo tanto, las técnicas de secuenciación automatizadas
son esenciales para completar un proyecto en un lapso razonable.

Nota sobre técnicas 4.t

Electroforesis en gel de poliacrilamida
Separacíón de moléculos de DNA con una diferencia de longitud de sólo un nucleótido
La electroforesis en gel de poliacrilamida se emplea para exa-
minar las familias de moléculas de DNA con cadenas termi-
nadas que resultan de un experimento de secuenciación. La
electroforesis en gel de agarosa (véase Nota sobre técnicas
2.2) no puede utilizarse con este fin porque no tiene el poder
de resolución necesario para separar moléculas de DNA
monocatenarias cuya diferencia de longitud es de sólo un
nucleótido. Los geles de poliacrilamida tienen poros de tama-
ño más pequeño que los geles de agarosa y permiten sepa-
raciones precisas de moléculas de l0 a 1 .500 pb de longitud.
Se los utiliza no sólo para la secuenciación del DNA, sino tam-
bién para otras aplicaciones en las que se requiere la separa-
ción del DNA en un nivel de gran precisión, por ejemplo, en
el examen de los productos de amplificación de PCR dirigidas
a loci de microsatélites, en que los productos de diferentes
alelos podrí.an diferir de tamaño en sólo dos o tres pares de
bases (véase figura 3.6). Se pueden preparar geles de polia-
crilamida como planchas entre placas de vidrio, que se man-
tienen distanciadas por separadores, o en columnas largas y
delgadas adecuadas para electroforesis capilar (figura T4.i).
Un gel de poliacrilamida está formado por cadenas de monó-
meros de acrilamida (CH2:CH-CO-NHr) que tienen enla-
ces transversales con unidades de lr/, l/'-metilenbisacrllamida
(CH2:CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH:CH2), estas últimas
denominadas con frecuencia "bis'i El tamaño de los poros del
gel depende de la concentración total de monómeros (acnla-
mida + bis), y de la relación entre acrilamida y bis. En una
plancha de gel de 1 mm de espesor utilizada para la secuen-
ciación del DNA, suele emplearse un gel al 6olo con una rela-
ción acrilamida:bis de 19:1, porque permite la resolución de
.l00
moléculas de DNA monocatenario de a 750 nucleótidos
de longitud. Por lo tanto, se pueden leer alrededor de 650
nucleótidos de secuencia a partir de un solo gel. Se puede
aumentar la concentración del gel al 80/0, para leer la secuen-
cia más cercana al cebador (lo que resuelve moléculas de 50-
4OO nucleótidos de longitud) o disminui{a al 4o/o, para leer
una secuencia más distante (500-1.500 nucleótidos respec-
to del cebador). La polimerización de la solución
acrilamida:bis se inicia con persulfato de amonio y el cataliza-
dor es TEMED (/V, ti, /Vi A/atetrametiletilendiamina). Los
geles de secuenciación también contienen urea, que es un
agente de desnaturalización que impide la formación de
pares de bases intracatenarios en las moléculas secuenciadas
enzimáticamente. Esto es importante porque el cambio de
conformación secundario al apareamiento de bases modifica
la velocidad de migración de una molécula de una sola cade'
na, de manera que se pierde la equivalencia estricta entre la
longitud de una molécula y la posición de la banda, crucial
para leer la secuencla de DNA.

PLANCHA DE GEL CAPILAR CON GEL

Pocillos
para
muestras

Placa posterior. Placa anterior Capilar,50-80

cm de longitud

Gel < I mm de espesor Cel, o,r mm

de diámetro

Figura T4.l Dos configuraciones

para la electroforesis en gel de
poliacrilamida.
 Métodos de secuenciación del DNA

il.É.7 §eeuerciacién enzimática (- 50 nucleót¡dos

{par ternrlnaciér¡ de cadema} del t}ñ{A

Lu.""r"n"iación enzimática del DNA se basa en el principlo de que 9s
I"sible separar moléculas de DNA monocatenario con diferencias de
i.,nsitud de sólo un nucleótido mediante electroforesis en gel de polia-
lriia-i¿a (Nota sobre técnicas 4.1). Esto significa que se puede resolver (-
uná famitia de moléculas, que fepresentan todas las longitudes de 10 a
10 nucleótidos

i.SOO nucleótidos, en una serie de bandas, en un gel en plancha o capi-

lar (figura 4.1).
Figura 4.1 La electroforesis en gel de
frener*lidaCes sabre lo secuenci*cíán enzímútic* póliacrilamida permite resolver
El material inicial para un experimento de secuenciación enzimática es inoléculas de DNA monocatenario
un preparado de rnoléculas idénticas de DNA monocatenario. El primgr que difieren de longitud en sólo un
nucleótido. La ilustración muestra el
,aó cónsiste en hibridar un oligonucleótido corto a Ia misma posición patrón de bandeo obtenido después
á. molécula; después, este oligonucleótido actuará como cebador de la separación de moléculas de DNA
paralasíntesis de una nueva cadena de DNA complementaria del molde
"u¿u
de una sola cadena por electroforesis
'(figuru 4.2A). La reacciÓn de síntesis de la cadena, que es catalizada por
en una plancha de gel de poliacrilami-
uná DNA polimerasa (véase más adelante) y qu.e requiere los da con un agente de desnaturalización.
cuatro "nrima
desoxirriboñucleótidos trifosfato (dNTP: dATP, dCTP, dGTP y Las moléculas fueron marcadas con
dTIP) como sustratos, continuaría normalmente hasta que se hubieran una sustancia radiactiva y las bandas se
varios miles de nucleótidos. En un experimento de secuen- han visualizado por autorradiografía. En
polimerizado
porque, además de los cuatro desoxi- un gel de poliacrilamida, Ia separación
fiación enzimática esto no sucede
entré moléculas individuales de DNA
nucleótidos, se agrega ala rcacción una pequeña cantidad de cada uno aumenta con su migración hacia el
de los cuatro diáesóxinucleótidos trifosfato (ddNTP: ddATP, ddCTP, electrodo positivo. Por lo tanto, las ban'
ddGTP y ddTTP). Cada uno de estos didesoxinucleótidos está marcado das obseruadas en la autorradiografía
con una sustancia fluorescente diferente. están más separadas en la parte infe-
rior de la escala. En la práctica, con la
plancha de gel o el sistema capilar, se
pueden separar moléculas de hasta
álrededor de 1.500 nucleótidos si la
(A) lniciación de la síntesis de la cadena (B) Didesoxinucleótido electroforesis continúa durante un
período suficiente.
goo
' ,. I DNA molde
-o-fl-o-i-o-l-o
tll
r ( I i r r r I I Lt Ll.! r.r t t t Ll -cHz
3'TTT5'
ooo¿
r ,' l ,¡ ,..,.L!l,gr_=1f.,!-ll_L!lJ HH
TTT5,

: -.,,,'i J * Posición donde el

r r !. i t r ¡ ¡ r., t l r I r t t r l lJ- -OH de un dNTP
es reemplazado
5,TTT5,
por -H Ágara 4.2 Seo.¡enciación enzimáica de
DÑA (A) La secuenciación enzimática
imolica la síntesis de nuevas cadenas de
oÑn que son complementarias a las del
molde de una sola cadena. (B) La sínte-
sis de cadenas no prosigue de manera
(C) La síntesis de la cadena termina indefinida porque la mezcla de reacción
cuando se agrega un ddNTP
contiene pequeñas cantidades de cada
uno de los cuatro didesoxinucleótidos,
¡-,::---ddA @-@.t-_----.-=-+ddA que bloquean la elongación adicional
lt I i ¡ ¡ lilr i ¡ tl ¡¡ ¡ tr l_l¡
porque tienen un átomo de hidrógeno
án lugar de un grupo oxhidrilo unido al
#""*"=+ddA carboño si (C) La incorporación de
ddATP da origen a cadenas que son ter-
minadas frente a la T del molde. Esto
genera la familia 'i{' de moléculas termi-
#:"-'-.+ddA ñadas. La incorporación de los otros
didesoxinucleótidos genera las familias
- FAMILIA "A" "C', "C" Y 'T'"
I t0 Capítulo 4 Secuenciación de los genomas

La enzima polimerasa no discrimina entre desoxinucleótidos y didesoxinucle-

ótidos, pero una vez incorporado, un didesoxinucleótido bloquea la elonga-
ción ulterior de la cadena porque carece del grupo 5'-oxhidrilo necesario
para la conexión normal con el siguiente nucleótido (figura 4.28). Como
también hay desoxinucleótidos normales, en mayor cantidad que los dideso-
xinucleótidos, la síntesis de la cadena no siempre termina cerca del cebador:
de hecho, se pueden polimerizar varios cientos de nucleótidos antes de la
eventual incorporación de un didesoxinucleótido. El resultado es una serie de
nuevas moléculas, todas de diferentes longitudes, y terminadas, cada una, en
un didesoxinucleótido cuya identidad indica el nucleótido -A, C, G o T- pre-
sente en la posición equivalente del DNA molde (figura 4.2C).

Para determinar la secuencia de DNA, todo 1o que se debe hacer es identifi-

car el didesoxinucleótido al final de cada molécula secuenciada enzimática-
mente. Aquí es cuando interviene el gel de poliacrilamida. Se carga la mezcla
de DNA en un pocillo de una plancha de gel de poliacrilamida, o en un tubo
de un sistema de gel capila4 y se lleva a cabo la electroforesis para separar las
moléculas según su longitud. Tras la separación, se hacen correr las molécu-
las a través de un detector de fluorescencia capaz de discriminar los marca-
dores unidos a los didesoxinucleótidos (figura 4.3A). Por lo tanto, el detector
determina si cada molécula termina en A, C, G o T. La secuencia se puede
imprimir para que la examine el operador (figura 4.38) o puede ingresar
directamente en un dispositivo de almacenamiento para un análisis futuro.
Los secuenciadores automatizados con múltiples capilares que trabajan en
paralelo pueden leer hasta 96 secuencias diferentes en un peúodo de dos
horas, lo que significa que, conunpromedio de 750 pb por experimento indi-
üdual, es posible generar 864 kb de información diaria por aparato. Por
supuesto, esto exige soporte técnico las 24 horas e, idealmente, se usan dis-

(A) ddA# ddc =

. ddc
dNTp - cada uno con un
marcador fluorescente diferente
ddT

I Reacciones de secuenciación
t íraccionamiento de productos

ddT r-:¡
,¡^
uun:
ddA
r-
= ¡=
#
- uuu : á==+ sistema de estudio
" '**.. ddc ¡ El por la imagen
. * ddc r::.:- Detector
Figura 4.3 Lectura de la secuencia
* ddc
generada por un experimento de Bandas fluorescentes
secuenciación enzimática. (A) Se atraviesan el detector
marca cada didesoxinucleótido con un
fluoroforo diferente. Durante la electro-
foresis, las moléculas marcadas pasan (B)
a través de un detector de fluorescen-
t.ii-a ,.1 ,- Á;lra. A.fl t_{-AAA ,ii ,-
cia, que identifica qué didesoxinucleóti-
do está presente en cada banda. La
información es transferida al sistema
de estudio por la imagen. (B)
lmpresión de una secuenciación de
DNA. La secuencia está representada
por una serie de picos, uno por cada
posición de los nucleótidos. En este
ejemplo, un pico verde es 'A', azul es
"C", pardo es "C" y rolo es 'T'i
 Métodos de secuenciación del DNA It t

Dositivos robóticos para preparar las reacciones de secuenciación y cargar los

iroductos de la reacción en los secuenciadores. Si se puede establecer y man-
generar los datos para
i.rr.. .m enfoque industrial de este tipo, es posible
secuenciar un genoma completo en un período de semanas.

L* s-*ru*¡=ri*cíó* enzimotica requi=re un *lJA m*íde rno**cctenarí*

El molde para un experimento de secuenciación enzimática es una ver-
sión monocatenaria de Ia molécula de DNA que va a ser secuenciada.
Hay varias maneras de obtenerla:
Se puede clonar el DNA en un plásmido vector (sección 2.2.1). El
' DNA resultante será bicatenario, de modo que no se 1o puede utili-
Vector M13 recombinante
(DNA bicatenario)
zar directamente para la secuenciación. En cambio, se lo debe con-
vertir en DNA monocatenario por desnaturalizaciín con álcali o por
5 Transfección de E. coli
ebullición. Éste es un método común para obtener DNA molde para 5
I
secuenciación del DNA, en gran medida porque la clonación en un I
vector plasmídico es una técnica habitual. Una desventaja es que 6¡-+--41 ^
puede ser difícil preparar DNA del plásmido que no esté contamina- o \"¡<;¡Jd'
áo con pequeñas cantidades de DNA y RNA bacteriano, que pueden :
actuar como moldes o cebadores espurios durante el experimento de i Liberación

secuenciación del DNA.

I de fagos

. Se puede clonar el DNA en un bacteriófago M15 vector. Los vecto- Fago MI3
recombinante
res basados en el bacteriófago M15 están diseñados específicamente DNA central
para producir moldes monocatenarios para la secuenciación de
j

::
DNA. El bacteriófago M13 tiene un genoma de DNA monocatenario +
que, tras la infección por bacterias Escherichia coli, se conüerte en /,zl¿ \ \\
una forma replicativa bicatenaria, la cual es copiada hasta que hay fl// \\
l1 DNA
más de 100 moléculas en la célula, y cuando la célula se divide, nue- \\ f/ monocatenario
vas replicaciones mantienen el número de copias en las nuevas célu-
las. Al mismo tiempo, las células infectadas secretan continuamente
nuevas partículas de fago M13 -alrededor de 1.000 por generación-
que contienen la versión monocatenaria del genoma (figura 4.4) Los Figura 4.4 Obtención de DNA de
vectores de clonación basados en vectores M13 son moléculas de una sola cadena por clonación en
DNA bicatenario equivalentes a la forma replicativa del genoma un bacteriófago vector Ml3. Los
M13. Se las puede manipular igual que un vector de clonación plas- vectores Ml3 se pueden obtener de
mídico. La diferencia es que las células que han sido transfectadas dos formas: la molécula replicativa
de doble cadena y la versión de una
con un vector M13 recombinante secretan partículas de fago que sola cadena hallada en las partículas
contienen DNA monocatenario, que comprende la molécula vectora de bacteriófago. La forma replicativa
más cualquier DNA adicional ligado a ella. Por lo tanto, los fagos puede ser manipulada de la misma
proporcionan el DNA molde para la secuenciación enzimática. La manera que un vector de clonación
única desventaja es que los fragmentos de DNA de más de alrededor plasmídico (sección 2.2.1), con
de 3 kb de longitud sufren deleciones y reordenamientos cuando se inserción de DNA nuevo por restric-
los clona en un vector M15, por lo que el sistema sólo puede utilizar- ción después del ligamiento. El vec-
tor recombinante es introducido en
se con fragmentos cortos.
las células de Escherichio coli por
I Se puede clonar DNA en un fagémido. Éste es un vector de clona- transfección. Una vez dentro de una
ción plasmídico que contiene, además del origen de replicación del célula de E. coli, el vector de doble
cadena se replica y dirige la síntesis
plásmido, el origen de M15 u otro bacteriófago con un genoma
de copias de una sola cadena, que
DNA monocatenario. Si una célula de E. coli contiene tanto un son empaquetadas en partículas de
fagémido como la forma replicativa de un fago auxiliar, este último fago y secretadas por la célula. Se
con genes para las enzimas de replicación del fago y las proteínas pu'eden recolectar las partículas de
de la cubierta, entonces se activa el origen del fago del fagémido, fago del medio de cultivo después
lo que determina la síntesis de partículas de fago que contienen la de centrifugar hasta que se forma un
versión monocatenaria del fagémido. Por lo tanto, el DNA bicate- microglóbulo de bacterias. Se elimi-
nan las cubiertas proteicas de los
nario del plásmido se convierte en DNA molde monocatenario para fagos tratándolos con fenol, y se
la secuenciación de DNA. Este sistema evita las inestabilidades de purifica la versión de una sola cade-
la clonación con M15 y se puede utilizar con fragmentos de hasta na del vector recombinante para utili-
10 kb o más de longitud. zarlo en la secuenciación del DNA.
il2 CapÍtulo + Secuenciación de los genomas

p*limsrüs*S pcr* l* serijsfiricdói e¡¡zimútira

ü;.;:",tr
Toda DNA polimerasa dependiente del molde puede extender un ceba-
dor que se ha hibridado a una molécula de DNA monocatenario, pero
no todas las polimerasas pueden hacerlo de manera que resulte útil para
la secuenciación del DNA. Una enzima de secuenciación debe cumplir
tres criterios en particular:
* Alta procesividad. Esto hace referencia a la longitud del polinucleó-
tido sintetizado antes de que la polimerasa termine de actuar por
causas naturales. Una polimerasa de secuenciación debe tener alta
procesividad para que no se disocie del molde antes de incorporar un
didesoxinucleótido.
e Actividad de exonucleasa 5'-->3'insignificante o nula. La mayoría de
las DNA polimerasas tienen también actividades de exonucleasa, lo
que significa que pueden degradar los polinucleótidos DNA a medi-
a^u q.rá los sintetiian (seccién 2.1.1; Gase figura 2.T. Ésta es una
desventaja para la secuenciación de DNA, porque la eliminación de
nucleótidos de los extremos 5' de las cadenas recién sintetizadas
modifica sus longitudes, lo que hace imposible determinar la secuen-
cia correcta.

" Actiüdad de exonucleasa 3'-+5'insignificante o nula. Esto también

es conveniente, pues la polimerasa no elimina el didesoxinucleótido
al final de una cadena terminada. Si esto sucediera, la cadena podría
extenderse más. El resultado neto sería que habría pocas cadenas
cortas en la mezcla de reacción y no sería posible leer la secuencia
cercana al cebador.

Éstos son requisitos estrictos que no son cumplidos por cualquier DNA
polimerasa natural. Por lo general, se utilizan, en cambio, enzimas modi-
ficadas artificialmente. La primera de ellas en ser desarrollada fue la
polimerasa de Klenow, que es una versión de la DNA polimerasa I de
Escherichia coli de la que se ha eliminado la actividad de exonucleasa
5'--+3'de la enzima estándar, ya sea por escisión de la parte pertinente
de la proteína o por ingeniería genética (sección 2.1.1). La polimerasa
de Klenow tiene procesividad relativamente baja, lo que limita la longi-
tud de la secuencia que se puede obtener con un solo experimento a alre-
dedor de 25O pb y genera productos inespecíficos -cadenas que han
terminado naturalmente más que por incorporación de un didesoxinucle-
ótido- durante la reacción de secuenciación. Por lo tanto, ha sido reem-
plazada por una versión modificada de la DNA polimerasa codificada por
el bacterófago 77, errzima cuyo nombre comercial es "Sequenase". La
secuenasa tiene alta procesividad y carece de actividad de exonucleasa,
además de tener otras características convenientes, como una velocidad
de reacción rápida.

l!cebadcr determina la reg!ón del Df,lA malde que será secuenciada

Para comenzar tn experimento de secuenciación enzimática, se hibrida
un oligonucleótido al DNA molde. Se requiere el cebador, porque las
DNA polimerasas dependientes del molde no pueden iniciar la síntesis
de DNA sobre una molécula totalmente monocatenaria: debe haber una
región corta, bicatenaria, que aporte un extremo 3' al que la enzima
pueda agregar nuevos nucleótidos (sección 2.1.1).

El cebador también desempeña el papel crucial de determinar la región

de la molécula molde que será secuenciada. Para la mayoría de los expe-
rimentos de secuenciación, se utiliza un cebador "universal", que es
complementario de la parte del DNA vector inmediatamente adyacente
 Métodos de secuenciación del DNA tt¡

(A) Cebador universal Figura 4.5 Diferentes tipos de ceba-

Ceb¿d*¡ dor para secuenciación enzimática.
(A) Se hibrida un cebador universal al
DNA vector adyacente a la posición
Di,,iÁ ve,l¡r lneeÉo de Df\lA DNA ve«or
en la que se inserta el nuevo DNA.
Por lo tanto, se puede utilizar un solo
cebador universal para secuenciar
(B) Cebadores internos
cualquier inserto de DNA, pero sólo
:.d @@:* aporta la secuencia de un extremo
#e@t :ee*{ wEe @#**
del inserto. (B) Una manera de obte-
J s', ner una secuencia más larga es llevar
a cabo una serie de experimentos de
# Cebador universal secuenciación enzimática, cada uno
:=,,== Cebador interno con un cebador interno diferente que
se hibrida dentro del inserto de DNA.

al punto en el que se liga DNA nuevo (figura 4.5A). Por lo tanto, el

miimo cebador universal puede dar la secuencia de cualquier fragmen-
to de DNA que haya sido ligado al vector. Por supuesto, si este DNA
insertado tiene más de alrededor de750 pb de longitud, sólo se obten-
drá parte de su secuencia, pero éste no suele ser un problema, porque el
proyecto en su conjunto sólo requiere que se genere un gran número de
secuencias cortas y se las ensamble, después, en la secuencia maestra con-
tigua. Es irrelevante si las secuencias cortas son, o no, secuencias comple-
tas o sólo parciales de los fragmentos de DNA empleados como molde. Si
se:utiliza DNA de doble cadena del plásmido como molde, se puede obte-
ner, si se desea, más secuencia del otro extremo del inserto. Como altema-
tiva, es posible extender la secuencia en una dirección sintetizando un
cebador interno no universal, diseñado para que se hibride en una posición
dentro del DNA insertado (figura 4.5B). Un experimento con este cebador
dará ma segunda secuencia corta que se superpone con la anterior.

Lc s**¡e ncicción por círlsda térmi* represerltú utl* §lt€#';*tív* u

I os rn áiad as trq d í cí o n o I *s

El descubrimiento de DNA polimerasas termoestables, que permitió el DNA molde

desarrollo de la PCR (secciones 2.1.1y 2.3), también ha dado origen a

nuevos métodos de secuenciación enzimática. En particular, la innova-
PCR con sólo
ción denominada secuenciación por ciclado térmico tiene dos ventajas dri ATP un cebador
respecto de la secuenciación enzimática tradicional. Primero, úiliza
DNA bicatenario en lugar de DNA monocatenario como material inicial.
Segundo, se requiere muy poco DNA molde, por lo que no es necesario
clonar eI DNA antes de la secuenciación. --=
. a,] :r

- i:4i
La secuenciación por ciclado térmico se practica de manera similar a la =-.,.*.===".=- (lÁ
PCR, pero se emplea sólo un cebador ylamezcla de reacción incluye los
cuatro didesoxinucleótidos (figura 4.6). Como hay sólo un cebador, se
Cadenas terminadas; la cantidad aumenta
copia únicamente una de las cadenas de la molécula inicial, y el produc- a medida que se completan más cicios
to se acumula de modo lineal y no exponencial, como en el caso de una
PCR real. La presencia de los didesoxinucleótidos en la mezcla de reac-
ción provoca la terminación de la cadena, igual que en los métodos con- Figura 4.6 Secuenciación por ciclo tér-
vencionales, y-es posible analizar y leer de la forma habitual la secuencia mico. Se lleva a cabo Ia PCR con sólo
de la familia de cadenas resultantes. un cebador y con los cuatro didesoxinu-
cleótidos presentes en la mezcla de
4.?"3 lUlátadt:s altcmativcs para le secuen<ia<íá* d*l DltÁ reacción. El resultado es una serie de
cadenas terminadas: la familia 'A' en la
Si bien la mayor parte de la secuenciación se lleva a cabo por el método enzi-
parte de la reacción aquí mostrada. Estas
mático, otras técnicas siguen siendo importantes para aplicaciones específi-
cadenas, junto con los productos de las
cas. Examinaremos dos de estas técnicas alternativas: el método de reacciones C C yIson sometidas a
degradación química que, como la secuenciaciónenzknática, se desarrolló en electroforesis mediante el método están-
la década de I97O, y la pirosecuenciación, es una invención más reciente. dar (véase figura 4.5).
tI4 Capítulo 4 Secuenciación de los genomas
Bloqueo de la síntesis de la cadena
DNA molde
Estructura tallo-bucle
A-_ T
T-- A por degradación química, por lo que este método puede representar una
A-- T alternativa cuando surge este tipo de problema.
C--G
A-- T
G--C
c--G
Figura 4.7 El apareamiento intraca-
tenario de bases puede interferir en
la secuenciación enzimática. En este
ejemplo, el DNA molde puede formar
una estructura tallo-bucle, porque su
secuencia permite que se forme una
serie de pares de bases intracatena-
rios. Este tallo-bucle bloquea el pro-
greso de la DNA polimerasa, lo que
áetermina una terminación inespecífi-
ca de la cadena.
Seruenci*r!*n p*r degr*dsrió* q*í*ir*
Una limitación de la secuenciación enzimática es que quizá no se pueda
obtener una secuencia exacta si el DNA molde puede formar pares de
bases intracatenarios (figura 4.7). Éstos pueden bloquear el progreso de
la DNA polimerasa, lo que reduce el grado de síntesis de la cadena y
también puede modificar la movilidad de las moléculas con cadena ter-
minada durante la electroforesis; esto último implica que el orden con
que las moléculas atraviesan el detector ya no depende sólo de su longi-
tud. Los pares de hases intracatenarios no obstaculizanLa secuenciación
El método de degradación química es similar a la secuenciación enzimática
en cuanto a que la secuencia se determina examinando las longitudes de las
moléculas cuyo nucleótido terminal es conocido. Sin embargo, estas molé-
culas son generadas de modo totalmente diferente: por tratamiento con sus-
tancias químicas que provocan cortes específicos en un determinado
nucleótido. Esto significa que se deben llevar a cabo por lo menos cuatro
reacciones de secuenciación distintas, una para cada nucleótido.
El material inicial es DNA bicatenario, que primero es marcado uniendo un
grupo de fósforo radiactivo al extremo 5' de cada cadena (figura 4.8A).
Después, se agrega dimetilsuHóxido (DMSO) y se calienta el DNA hasta
90"C. Esto rompe los pares de bases entre las cadenas y permite separarlas
entre sí por electroforesis en gel, sobre la base de que una de las cadenas
probablemente contiene más nucleótidos de purina que la otra y, por lo
tanto, es algo más pesada y colTe con más lentitud durante la elecffofore-
sis. Se purifica una cadena apaftfu del gel y se la diüde en cuatro muestras,
cada una de las cuales es tratada con uno de los reactivos de escisión. Para
ilustrar el procedimiento, seguiremos la reacción "G" (figura 4.88).
Primero, las moléculas son tratadas con dimetilsulfato, que fija un grupo
metilo al anillo de purina de los nucleótidos G. Se añade una cantidad limi-
tada de dimetilsulfato, cuyo objetivo es modifical en promedio, sólo un
residuo G por polinucleótido. En esta etapa, las cadenas de DNA todavía
están intactas y la escisión no ocutre hasta que se añade una segunda sus-
tancia química: piperidina. La piperidina elimina el anillo de purina
modificado y corta la molécula de DNA en el enlace fosfodiéster inme-
diatamente corriente arriba del sitio sin bases que se ha creado. El resul-
tado es una serie de moléculas degradadas de DNA, algunas de las cuales
están marcadas y otras no. Todas las moléculas marcadas tienen un extre-
mo en común y uno determinado por los sitios de corte; estos últimos indi-
can las posiciones de los nucleótidos G en las moléculas de DNA que
fueron degradadas. Se aplican enfoques similares para generar otras fami-
lias de moléculas degradadas, aunque éstas no suelen ser sólo familias ",{",
"T" y "C", pues han surgido problemas para desarrollar tratamientos qui
micos que corten específicamente en A o T. Por lo general, las cuatro reac-
ciones que se practican son "G", "A + G", "C" y "C + T". Esto complica el ti
proceso, pero no afecta la exactitud de la secuencia determinada. t
;:§
:i
Se carga lafamilia de moléculas generada por cada reacción en una calle t
de una plancha de gel de poliacrilamida y, después de la electroforesis,
se visualizan las posiciones de las bandas del gel por autorradiografía
(véase Nota sobre técnicas 2.1).La banda que se ha alejado más repre-
senta el fragmento más pequeño de DNA. En el ejemplo mostrado en la
figura 4.8C, esta banda reside en el carril "A + G". No hay ninguna
banda de tamaño equivalente en el carril "G", por lo que el primer
nucleótido de la secuencia es " A" . La siguiente posición de tamaño es
ocupada por dos bandas: una en el carril "C" y otra en el carril "C +T"i
 Métodos de secuenciación del DNA II5

DNAy disociación de las cadenas (B) Reacción G (C) Lectura de la secuencia a -

(A) Marcación de partir de la autorradiografía
Molécula que será
secuenciada (muchas coPias)
Pesada
.,--.t-t-l---r--9 t-t-9 --t 9 ---t G Ai€ C C+T

I E IE
E
g
t €
É
Dimetilsulfato
=
: :::
1

Extremo 5'marcado
¿
¡ DMSO 90'C
l¡, : :
I -t I-n--,
tt 9 :
-r-.-=-.-§ :
ffi
l"l
:
n-r..rr,- +9r¡=9¡-¡§+r*
,:
c
I Electroforesis
--,---t-F -r.,9,-t, I -t--t G
T
I en gel de agarosa
I PiPeridina
T

¿ c
G

-,-t-----tt9 G

: -..,++ Purificaruna
de cadenas
las ---.*-r9*9
c
c
c

--n----,---9-.t9-t §

Dor ende, el segundo nucleótido eS "C" y la secuencia, hasta ahofa, es Figura 4.8 Secuenciación por degra-
IAC". Se puedá proseguir la lectura de la secuencia hasta la región del dación quím¡ca.
gel donde no se separaron bandas individuales.

Se uiiliz* pirosecuenciocíÓn paro lc determinscíón rápida

de setuencios muY cartos
I a pirosecuenciación no requiere electroforesis ni ningún otro procedi-
miento de separación de fragmentos y, por lo tanto, es más rápida que
la secuenciaCión enzimática o por degradación química. Sólo puede
genefar unas pocas decenas de pares de bases por expelimento, pero se
éstá volviendo una técnica importante en situaciones en las que se deben
generar muchas secuencias cortas lo más rápidamente posible; por ejem-
plo, en la tipificación de SNP (secci6n 3.2.2).

En la pirosecuenciación, se copia el molde en forma directa sin agregar dide-

soxinucleótidos. A medida que se sintetiza la nueva cadena, se detecta el
orden de incorporación de los desoxinucleótidos, de modo que es posible
"leer" lasecueniia mientras se lleva a cabo la reacción. Es posible detectar el
agregado de un desoxinucleótido al extremo de la cadena en crecimiento por-
que se acompana por la liberación de una molécula de pirofosfato, que puede
ser convertida por la enzlfna suHurilasa en un destello de quimioluminiscen-
cia. Por supuesto, si se añadieran los cuatro desoxinucleótidos al mismo tiem-
po, se veían destellos luminosos todo el tiempo y no se obtendría ninguna
información útil. Por lo tanto, se agrega cada desoxinucleótido por separado,
uno tras otro, y lamezcla de reacción también contiene una enzima nucleo-
tidasa para que de$ade con rapidez el desoxinucleótido que no es incopo-
rado al polinucleótido, antes de añadir el siguiente (figura 4'9). Este
procedimiento permite seguir el orden de incorporación de los desoxinucle-
ótidos a la cadena en crecimiento. La técnica parece complicada, pero sólo
requiere efectuar una serie repetitiva de adiciones a la mezcla de reacción,
precisamente el tipo de procedimiento que es fácil de automatizar. Como la
detección de la quimioluminiscencia es muy sensible, cada reacción se puede
practicar con un volumen muy pequeña, qtuizá de sólo un picolitro. Esto sig-
nifica que se pueden efectuar hasta 1,6 millones de reacciones en paralelo
sobre un portaobjetos de 6,2 cm2, 1o que permite obtener 25 millones de
nucleótidos de secuencia en cuatro horas, una velocidad de generación de
secuencia 100 veces más rápida que la del método eúrná¡co.
 ---

tI6 Capítulo 4 Secuenciación de los genomas

Figura 4.9 Pirosecuenciación. La

reacción de síntesis de cadenas se
lleva a cabo en ausenc¡a de didesoxi-
nucleótidos. Cada desoxinucleótido
se añade individualmente, junto con +
una enzima nucleotidasa que degra- dATP ...+ Degrada
da el desoxinucleótido si no es inco-
porado a la cadena que se está +
sintetizando. La incorporación se
dTTP Degrada
detecta por un destello de quimiolu- -+
miniscencia inducido por el pirofosfa-
to liberado del desoxinucleótido. Por
+
lo tanto, se puede seguir el orden en dCTP § Qr,ir-nrciurniniscencia =
que se añaden los desoxinucleótidos
a la cadena en crecimiento.
+
dCTP -..+ Degrada

+
dATP §QLrimiclurniniscancia=

§n=amblaic de una §€€uer:{ía

¿tr,?
eontigua de DH#
La siguiente cuestión por considerar es cómo se puede ensamblar la
secuencia maestra de un cromosoma, posiblemente de decenas de mega-
bases de longitud, a partir de una multitud de secuencias cortas genera-
das por secuenciacilnenzimática. Cuando tratamos este tema al comienzo
del capítulo 3, establecimos que los genomas relativamente cortos de los
procariontes se pueden ensamblar por el método aleatorio (shotgun),
que implica fragmentar la molécula de DNA, determinar la secuencia de
cada fragmento y recurrir a un ordenador para investigar superposicio-
ir¡
nes a partir de las cuales se construye la secuencia maestra (véanse figu- é

ra 3.t y sección 4.2.1). En la actualidad, este método se ha empleado a

con más de 200 genomas procariontes, pero podría inducir a errores si :i
se aplicara para genomas eucariontes más grandes, sobre todo porque t;
éstos contienen secuencias repetitivas que complican la búsqueda de
superposiciones de secuencias y podrían llevar al ensamblaje incorrecto iÉ
;:
de segmentos del genoma (véase figura 3.2).Para evitar estos errores, el
procedimiento denominado método aleatorio del genoma completo
emplea un mapa para ayudar a ensamblar la secuencia maestra (véanse {
figura 5.5 y sección 4.2.3). Se ha aplicado con éxito la secuenciación ale-
atoria del genoma completo en varios genomas eucariontes, entre ellos, los -€

genomas de la mosca de la fruta y del ser humano, pero se suele aceptar

que con elmétodo de cóntigos de clones se logra el máximo grado de exac- r=á

titud. En este método, antes de llevar a cabo la secuenciación, se rompe el

5
genoma en segmentos, cada uno con una posición conocida en el mapa del :*

genoma (véanse figura 5.5 y sección 4.2.2). Comenzaremos por examinar ig

r-5
cómo se ha aplicado el método aleatorio en genomas procariontes. ,g
:s

§
4.2.1 Ensamblaje de la s€cuen{ia por el método aleatoria
Un procedimiento sencillo para ensamblar la secuencia consiste en construir
la secuencia maestra directamente de las secuencias cortas obtenidas de expe-
rimentos de secuenciación indiüduales, sólo por investigación de superposi- g:

ciones en las secuencias (véase figura 5.1). Esto se denomina método

aleatorio. No requiere ningún conocimiento preüo del genoma y, por lo
tanto, se puede reahzar en ausencia de un mapa genético o físico.
**
'#
 Ensamblaje de una secuencia contigua de DNA lt7

Él p*t*¡:ri*l del mét*d* *ie*íor!ü sr triü&d m*di*nt* la noenophilus

s€ciJ e¡ .-tí* de rla=¡'n*phiius inÍiuenzee influenzoe

A orincipios de Ia década de 1990, se debatió mucho si el método aleato-

.io ¿uriit"rultado en la práctica y numerosos biólogos moleculares opina-
bu, qr" la cantidad de datos que era necesario manipular para comparar
toár. tu. minisecuencias e identificar superposiciones, aun en los genomas
más pequeños, superaría la capacidad de los sistemas computarizados exis-
i.rto. Éstas dudas se resolvieron en 1995 cuando se publicó la secuencia
del genoma de 1.850 kb de la bacteria Haemophilus influenzae'

F.l senoma de H. influenzae se secuenció por completo por el método alea-

tró V sin recurrir a información de ningún mapa genético o físico. En la figu- # € #

ra +.iO se muestra la estrategia aplicada para obtener la secuencia. El primer é= @= E ffi Éragr,':eniosdeDliA
oaso fue fragrnentar el DNA genómico por sonicación, una técnica que uti-
iá ondas dé alta frecuencia para efectuar cortes aleatorios en las moléculas Há3 @

de DNA. Después, se practicó elecffoforesis de los fragmentos y se purifica-

I Electroforesis
ron los que médían de 1,6 a2kb a partir del gel de agarosa para ligarlos luego I en gel de agarosa
en un plásmido vector. De la genoteca resultante, se tomaron 19.687 clones
CALLE I : DNA de H. influenzae sonicado
al azai y se llevaron a cabo 28.643 experimentos de secuenciación, una can- CALLE 2: marcadores de DNA
tidad mayor que el número de plásmidos, porque se secuenciaron ambos
extremos de algunos insertos. Se consideró que el 160/o de estos experimen-
tos de secuenciación fueron un fracaso, porque originaron menos de 400 pb
de secuencia . Las 24.304 secuencias restantes dieron un total de 1 1.631.485
pb, que corresponden al séxtuplo de la longitud del genoma de H. influen- * I Purificar DNA
,ae;ieestima que este grado de redundancia es necesario para garantizar una I a partir del gel
cobertura completa. El ensamblaje de la secuencia requirió 30 horas en un
ordenador con-5l2megabytes de memoria de acceso directo (RAM) y deter-
]:::: :: *::i
t.agm¡nto5
:
de DNn - l,É-: kb
minó 140 secuencias contigUas largas; cada uno de estos cóntigos de secuen-
cias representaba una porción diferente, no superpuesta del genoma. ¡ Preoarar una
I g.nbt..u de clones

El sigUiente paso fue unir pares de cóntigos obteniendo secuencias de

los hiatos (gaps) entre ellos (figura 4.ll). Primero, se investigó la geno-
teca para observar si había algún clon cuyas dos secuencias terminales
estuviesen localizadas en cóntigos diferentes. Si se pudiese identificar un r Obtener las secuencias

clon de este tipo, la secuenciación adicional de su inserto ceratía el I terminales de los

insertos de DNA
"hiato de secuéncia" entre los dos cóntigos (figura 4.11A). De hecho,
hubo 99 clones en esta categoria, de modo que se pudieron cerrat 99 de + + ++ I

los hiatos sin demasiada dificultad. Seruenrias terminales

t Construir cóntigos
Esto dejó 42 hiatos, que probablemente consistían en secuencias de I de secuencias
DNA inestables en el vector de clonación que, por lo tanto, no estaban
presentes en la genoteca. Para cerrat estos "hiatos físicos", se preparó
una segunda genoteca de clones con un tipo diferente de vector' En lugar
de utilizar otro plásmido, en el que era probable que las secuencias no
clonadas fuesen inestables, la segunda genoteca se preparó con un vec-
tor derivado del bacteriófago l" (sección 2.2.1). Esta nueva genoteca se
sondó con 84 oligonucleótidos, uno por vez, que tenían secuencias idén-
ticas a las de los extremos de los cóntigos no ligados (figura 4.11B). El

Fígura 4.lO Manera de aplicar el método aleatorio para obtener la secuencia

de DNA del genoma de Haemophilus influenzoe. Se sonicó el DNA de H.
.l,6
influenzoe, se"purificaron fragmentos de a2kb de longitud a partir de un.gel
de agarosa y se los ligó a un plásmido vector para generar una Senoteca de clo-
nes. Se obtúvieron laé secuencias terminales de los clones tomados de esta
genoteca y se empleó un ordenador para identificar superposiciones entre las
secuencias. Esto cieterminó cóntigos de 140 secuencias, que fueron ensambla-
dos en la secuencia del genoma completo, como muestra la figura 4. 11.
 -
il8 Capítulo 4.Secuenciación de los genomas

(A) Ciene de un "hiato de secuencia"

Figura 4.1I Ensamblaje del genoma
completo de Hoemophilus influenzoe I
r@ Cóntigos
que abarca los hiatos entre cóntigos
Fr.:gn:ento Ce DliiA de secuencia
de secuencias individuales. (A) Los cion¿dc íab¿rca el ili¿lci
"hiatos de secuencia" son los que se
pueden cerrar mediante secuenciación I Completar la secuencia

adicional de los clones ya presentes en

J con cebadores internos

la genoteca. En este ejemplo, las

'l
secuencias terminales de los cóntigos
y 2 residen dentro del mismo clon plas-
mrdico, de manera que la secuenciación
adicional de este inserto de DNA con
cebadores internos (véase figura 4.5B) (B) Ciene de un "hiato físico"
aportará Ia secuencia para cerrar el hiato. I 2
(B) Los "hiatos físicos" son extensiones
de secuencia que no están presentes en '4i -5
la genoteca de clones, quizá porque ,71
:é 89 ::
estas regiones son inestables en el vec-
tor de clonación empleado. Se muestran
dos estrategias para cerrar estos hiatos. A
la izquierda, una segunda genoteca de Sondaje de una segunda genoteca de clones con ,:r: ::: :,r :: ' :. PCR con pares de .

clones, preparada con un vector deriva-

do del bacteriófago l" en lugar de con un
vector plasmídico, es sondada con oligo-
nucleótidos conespondientes a los extre-
mos de los cóntigos. Los
oligonucleótidos 1y7 se hibridan,
ambos, al mismo clon, cuyo inserto
debe contener, por lo tanto, DNA que
abarque el hiato entre los cóntigos I y 4.
A la derecha, se llevan a cabo PCR con
pares de oligonucleótrdos. Sólo los
números 1 y 7 dan un producto de la
PC& lo que confirma que los extremos , :- .:::'.: - :'
de los cóntigos representados por estos
dos oligonucleótidos están cerca en el
genoma. Se podría secuenciar el produc-
to de la PCR o el inserto del clon )" para
cenar el hiato entre los cóntigos 1 y 4.
#
I

CONCLUSIÓN:
los cóntigos I y 4 son adyacentes

fundamento era que si dos oligonucleótidos se hibridaban al mismo clon

1., entonces los extremos de los cóntigos a partir de los cuales fueron
derivados debían residir dentro de ese clon, y por lo tanto, la secuencia-
eión del DNA en el clon ?u ceraúa el hiato. Veintitrés de los 42 hiatos
físicos se manejaron de esta manera.

Una segunda estrategia para el cierre de los hiatos consistió en utilizar

pares de oligonucleótidos, de la serie de 84 mencionados antes, como
cebadores para PCR de DNA genómico de H. influenzae. Algunos pares
de oligonucleótidos se seleccionaron al azar y se identificaron aquellos
que abarcaban un hiato simplemente sobre la base de si daban o no un
producto de la PCR (véase figura 4.1 1B). La secuenciación de estos pro-
ductos de la PCR cerró los hiatos pertinentes. Se eligieron otros pares
de cebadores sobre una base más racional. Por ejemplo, se emplearon
oligonucleótidos como sondas de hibridación Southem (véase figura
2.ll) y se cortó el DNA de H. influenzae con diversas endonucleasas de
restricción, lo que permitió identificar los pares que se hibridaron a
pares similares de fragmentos de restricción. Los dos miembros de un
 Ensamblaje de una secuencia contigua de DM It9

dentro
oar de oligonucleótidos así identificados deben estar contenidos
restricción y, por 19 tantg es.probable que
áálo. mismos fragmentos de
i""nu" una loca[záción cercana en el genoma. Esto significa que el par
á-.^Zá"tigo. del que derivan los oligonucleótidos son adyacentes y el
puede ser abarcado por una PCR de genó-
f,iato errtie los cóñtigos PNA pro-
mico utilizando los dos oligonucleótidos como cebadores, lo
que
porcionará el DNA molde para el cierre de los hiatos'

con
La demostración de que un genoma pequeño puede ser secuenciado
1..tutiuu rapidezpor el método aleatorio determinó que, súbitamente, se
genomas microbianos. Estos proyectos demos-
.ámpt"tu.á" nume.otos
;r"#; a;; se puede im[lementar la secuenciación aleatoria sobre la
iur" ¿"^r"a línea de próducción, en la que cada miembro del equipo
ii"* r"u tarea individual en la preparación del DNA, la práctica de las
,Lá."ior"t de secuenciación o el análisis de los datos. Esta estrategia
,LáitiO que cinco personas secuenciaran el genoma de 580 kb
'Mycoplasma genitalium en sólo ocho semanas y, ahora, se- acepta que
de

unos pocos meses serían un período amplio nary o!1e-1er la secuencia

de cualquier genoma que mida menos de 5 Mb, aunque no §e
"ornpi.tu
Lonór"u acerca dá Cste antes de que comience el proyecto. Por lo tanto,
tou pr.rtot fuertes del método aleátorio son su velocidad y la posibilidad
de trabajar en ausencia de un mapa genético o físico.

4.",?. Ensamblaie de la secuencia por ei mátodo

de cóntigos de-clones
Se considera que el método de cóntigos de clones es el método convencio-
nal para obtener la secuencia de un genoma eucarionte; también se 1o ha
empleado con los genomas microbianos mapeados antes por medios gené-
ticés o físicos. Coñ el método de cóntigos de clones, se rompe el genoma
en fragmentos de hasta 1,5 Mb de longitud, en general por restricción par-
cial (sécción 3.3.1),y se clonan estos fragmentos en un vector de alta capa-
cidaá como un BAC (sección 2.2.1). Se construye un cóntigo de clones
identificando los que contienen fragmentos superpuestos, 99e luego son
secuenciados de manera individual mediante el método aleatorio'
Idealmente, los fragmentos clonados se anclan en un mapa genético o físi-
co del genoma para poder controlar e interpretar los datos,de la secuencia
del cóntigo invástigando las características (p. ej., STS, SSLP, genes) que
se sabe que están presentes en una determinada región.

Se pueden creer cúntigos Ce clan*s pat pcseo €raffiúsóffi¡cú,

perc el métada es lCIbori*so
La manera más simple de construir una serie superpuesta de fragmentos
de DNA clonados es comenzar con un clon de una genoteca, identificar
un segundo clon cuyo inserto Se superponga con el del primer clon,
identilicar después ,.r., te.""t clon cuyo inserto se superponga con el del
segundo clon, y así sucesivamente. Ésta es la base del "paseo" cromosó-
mico (desplazámiento sobre el cromosoma), el primer método diseña-
do para ensamblar cóntigos de clones.

Al principio, el paseo cromosómico se utilizaba pata avanzar distancias

relátivamente córtas a lo largo de moléculas de DNA y se recurría a
genotecas de clones preparadás con vectores l, o cósmidos. El pfocedi
miento más simple consiste en emplear el DNA insertado del clon ini-
cial como sondá de hibridación para investigar todos los demás clones
de la genoteca. Los clones cuyoi insertos se superponen con la sonda
dan señales de hibridaeión positivas y sus insertos pueden usarse como
nuevas sondas para continuar el paseo (figura 4.12).

t20 Capítulo 4 Secuenciación de los genomas
Paso I
12345678910il12
Figura 4.12 Paseo cromosómico. La
genoteca comprende 96 clones, cada
uno de los cuales contiene un inserto
diferente. Para iniciar el paseo, se utili-
za el inserto de uno de los clones
como sonda de hibridación contra
todos los demás clones de la genote-
ca. En el ejemplo presentado, el clon
A1 es la sonda; se hibrida a símismo
y a los clones E7 y F6. Por lo tanto,
los insertos de los dos últimos clones
se deben superponer con el inserto
del clon Al. Para continuar el paseo,
se repite el sondaje, pero esta vez
con el inserto del clon F6. Los clones
que se hibridan son Al , FG y B12,lo
que muestr¿ que el inserto de BI2 se
superpone con el inserto de F6.
Figura 4.13 Paseo cromosómico por
PCR Los dos oligonucleótidos se hibri-
dan dentro de la región terminal del
inserto número l. Se los emplea en la
PCR con todos los clones restantes de la
genoteca. Sólo el clon 15 da un produc-
to de la PCR, lo que indica superposición
,l5.
de los insertos de los clones I y EI
paseo continuaría por secuenciación del
fragmento del otro extremo del clon 15,
con diseño de un segundo par de oligo.
nucleótidos y su utilización en una nueva
serie de PCR con los otros clones.
789
::-
Sonda: inserto del clon Al AI
m
Señales positivas: clones Al, E7, F6
lJ
= i-b
Sonda: inserto del clon F6 L A1
Señales positivas: clones Al, S,r, fU ry i: i'l
El problema principal es que si la sonda contiene una secuencia repeti-
da, se hibridará no sólo con los clones solapados, sino también con los
clones no solapados cuyos insertos contengan copias de la repetición. Es
posible reducir el grado de esta hibridación inespecífica bloqueando las
secuencias repetidas mediante prehibridación con DNA genómico no
marcado (véase figura 3.34), pero esto no resuelve por completo el pro-
blema, en especial si el paseo se está llevando a cabo con insertos largos
de un vector de alta capacidad como un BAC. Por esta razófl, tara yez
se utilizan insertos intactos para paseos cromosómicos con DNA huma-
no y DNA similares, que presentan alta frecuencia de secuencias repeti-
das. En cambio, se emplea como sonda un fragmento del extremo del
inserto, pues hay menos probabilidad de hallar una repetición en un seg-
mento terminal corto que en todo el inserto. Si se requiere una certeza
completa, se puede secuenciar el segmento terminal antes de utilizarlo
para asegurarse de que no contiene DNA repetitivo.
Si se ha secuenciado el fragmento terminal, se puede acelerar el paseo
utilizando PCR en lugar de hibridación para identificar los clones con
insertos solapados. Se crean cebadores a pafiir de la secuencia del frag-
mento terminal y se los uliliza en todos los intentos de PCR con todos
los demás clones de la genoteca. Un clon que genera un producto de Ia
PCR del tamaño correcto debe contener un inserto solapado (figura
4.I3). Para acelerar aún más el proceso, en lugar de practicar una PCR
con cada clon individual, se mezclan gxupos de clones de manera tal que
se puede efectuar, aun así, una identificación inequívoca de insertos
solapados. El método se ilustra en la figura 4.14, en la que se ha prepa-
rado una genoteca de 960 clones en diez bandejas de microtitulación,
cada una de las cuales consta de 96 pocillos en una maftiz de 8 x 12,
con un clon por pocillo. Las PCR se practican de la siguiente manera:
¡nserio N". Ciiqon u:leóiid*s
7
1
L -__
| 't0 ]'l
l-
12 13 14 ]5 15 11 l8 l9 20 2',I 72 73 71 25
CONCLUSIÓN: los insertos Iy 15 se superponen
 Ensamblaje de una secuencia contigua de DNA I2t

liid :*4-o*$, IJezclar, PCR Figura 4.14 Cribado combinatorio de

Repetir para todas las filas de
las l0bandejas=80PCR
Repetir para todas las column¡
de las l0 bande¡as = 120 PCR
Repetir para todos los
pocillos = ss PCR
clones en bandejas de microtitula-
ción. En este ejemplo, se debe investi-
gar por PCR una Benoteca de 96o
clones. En lugar de practicar 960 PCR
individuales, se agrupan los clones
como se muestra y sólo se realizan
296 PCR. En la mayoría de los casos,
los resultados permiten identificar sin
ambigüedad clones positivos. De
hecho, si hay pocos clones positivos, a
veces se pueden identificar sólo por
PCR de "fila" y "columna". Por ejemPlo,
si se obtienen PCR positivas con ban-
deja 2 fila A, bandeja 6 fila D, bandeja
2 columna 7 y bandeja 6 columna 9,
se puede concluir que hay dos clones
positivos, uno en el pocillo A7 de la
bandeja 2 y uno en el pocillo D9 de la
bandeja 6. Se requieren PCR de "poci-
llos" si hay dos o más clones positivos
en la misma bandeja.

PCR TOTALES = 296

Se mezclan muestras de cada clon de Ia fila A de la primera bandeja

de microtitulación y se lleva a cabo una sola PCR. Esto se repite para
cada fila de cada bandeja: 80 PCR en total'
Se mezclan muestras de cada clon de la columna 1 de la primera ban-
deja de microtitulación y se lleva a cabo una sola PCR. Esto se repi-
te para cada columna de cada bandeja: 120 PCR en total.
Se mezclan los clones del pocillo A1 de cada una de las diez bande-
jas de microtitulación y se lleva a cabo una sola PCR. Esto se repite
para cada pocillo: 96 PCR en total.

Como se explica en el epígrafe de la figura 4.14, estas 296 PCR aportan

suficiente información para identificar cuál de los 960 clones genera
productos y cuál no. Sólo surgen ambigüedades si una cantidad sustan-
cial de clones resulta positiva.

MétoCos mós rúpídos parú el ensamblaie de cóntiEos de clones

Aun cuando la etapa de investigación se realice mediante el enfoque
combinatorio de PCR mostrádo en la figura 4.14, el paseo cromosómi-
co es un proceso lento que raravez permite ensamblar cóntigos de más
de 15p20 clones. El procedimiento ha resultado muy valioso en la clo-
nación posicional, en la cual el objetivo es caminar desde un sitio mape-
ado hasta un gen de interés, que se sabe que no está a más de algunas
megabases de distancia. Ha sido menos valioso para ensamblar cóntigos
de clones en genomas completos, sobre todo en los genomas complejos
de los eucariontes superiores. Entonces, ¿qué métodos alternativos hay?

La principal alternativa es recurrir a una técnica de deterrninación de la

huélla genética de clones. Ésta aporta información sobre la estructura
física de un fragmento de DNA clonado, y esta información física o
 --:
Capítulo 4_Secuenciación de los genomas

(A) Huella genética por restricción (B) Huella genética de DNA repetitivo
Figura 4.15 Cuatro técnicas de
determinación de la huella genética
de clones. R R RRR R RR R R RRR R RR
. - L--:-:-J:;---i--I*I-laq¡¡.El : ¡

jre todc el genorr::

.t.::.r::,
I Restricción ! Restricción, hibridaciónSouthern
¿ I con sonda para la repetición
l2

Fragmentos de Fragmentosde
restricción compartidos restricción compañidos
- -

(C) PCR de DNA repetitivo (D) Mapeo del contenido de STS

ST5
- | Ja-Ii;l:id AIL

PCR con cebadores Alu II PCR específica de STS

I
12 12
::,1

STS compartidos
Productos de la
PCR compartidos tÉ

"huella genética" se compara con datos equivalentes de otros clones, lo

que permite identificar aquellos con similitudes que, posiblemente, indi- !a

can superposiciones. Se emplea una o alguna combinación de las

siguientes técnicas (figura 4.15):
* Es posible generar patrones de restricción por digestión de clones
con diversas enzimas de restricción y separación de los productos en
un gel de agarosa. Si dos clones contienen insertos superpuestos, sus
huellas genéticas de restricción mostrarán bandas en común, ya que
ambas contendrán fragmentos derivados de la región superpuesta.
+ Se pueden preparar huellas genéticas de DNA repetitivo analizando ':
una serie de fragmentos de restricción por hibridación Southern (sec-
ción 2.1.2) con sondas específicas para uno o más tipos de secuencia
repetida. Al igual que las huellas genéticas de restricción, se identifi-
can las superposiciones investigando dos clones que tienen algunas
bandas de hibridación en común.
+ La PCR de DNA repetitivo, o PCR de elementos repetidos disper-
sos (IRE-PCR), utiliza cebadores que se hibridan dentro de secuen-
cias repetidas y, así, amplifican el DNA de copia única entre dos
repeticiones vecinas. Como las secuencias repetidas no están espacia-
das de manera uniforme en un genoma, se puede emplear el tamaño
de los productos obtenidos tras la PCR de DNA repetitivo como una
huella genética para las comparaciones con otros clones con el fin de
identificar posibles superposiciones. En el DNA humano, se suelen
emplear las repeticiones denominadas elementos Alu (sección9.2.1)
porque aparecen, en promedio, una vezcada 5 kb. Por lo tanto, sería
esperable que una Alu-PCR de un inserto humano de 150 kb de un
BAC diera alrededor de 50 productos de la PCR de diversos tama-
ños, 1o que determina una huella genética detallada.
= El mapeo del contenido de STS es muy útil porque puede dar por
 Ensamblale de una secuencia contigua de DNA t23

resultado un cóntigo de clones que es anclado a un mapa físico de (A) Ensamblaie correcto de la secuencia _

localizaciones de STS. Se practican PCR dirigidas a STS individuales kep¿tllion::,

(sección 3.3.3) con cada miembro de una genoteca de clones. l0 kb er :lou ?; j:j ,,t-.

Presumiendo que el STS sea una copia única en el genoma, todos los o¡ Secuenci
de DNA
clones que dan productos de la PCR deben contener insertos super-
puestos.
Como en el caso del paseo cromosómico, la aplicación eficiente de estas Se pueden ubicar en la secuencia
maestra ambas secuencias terminales
técnicas de determinación de huellas genéticas exige la investigación de un inserto de l0 kb
combinatoria de clones en grillas, idealmente con métodos computariza-
dos para analizat los datos resultantes.

q"7.3 Sec¿¡entiación aleatoria del genoma {GmPleto (B) Ensamblaje incorrecto de la secuencia

Craig Venter y cols. fueron los primeros en proponer el método alea- Se ha riejado íuera ia secuenri¿

torio del genoma completo como medio de acelerar la adquisición de enlre ias repeticioael

datos de secuenci4s contiguas para grandes genomas, como el huma- Secuenci

no y los de otros eucariontes. La experiencia con secuenciación alea- i'- ) de DNA

toria convencional (sección 4.2.1) había mostrado qtle si la longitud I

total de la secuencia generada es de 6,5 a 8 veces mayor que la longi- Sólo aparece una secuencia
tud del genoma estudiado, los cóntigos de secuencia resultantes abar- terminal en la secuencia
maeslra
carán más del99,8o/o del genoma, con unos pocos hiatos que pueden
ser cerrados con métodos como los desarrollados durante el proyecto
de Haemophilus influenzae (véase figura 4.ll), Esto implica que serí- Figura 4.16 Evitación de errores
an suficientes 70 millones de secuencias individuales, cada una de alre- cuando se aplica el método aleato-
dedor de 500 pb de longitud, correspondientes a un total de 35.000 Mb, rio del genoma completo. En la figura
si se adoptara el enfoque aleatorio para un genoma de mamífero de 3.28 se vio cuán fácil sería "salta/'
3.000 a 5.500 Mb de longitud. Setenta millones de secuencias no es una entre secuenclas repetidas al ensam-
blar la secuencia maestra mediante el
imposibilidad: de hecho, con 60 secuenciadores automáticos, que
método aleatorio convencional. El
determinan 96 secuencias cada uno, cada dos horas todos los días, la resultado de un error de este tipo sería
tarea se podría cumplir en tres años. perder toda la secuencia entre las dos
repeticiones que se ligaron juntas por
¿Se podrían ensamblar correctamente 70 millones de secuencias? Si se error. En el método aleatorio del geno-
emplea el método aleatorio convencional con una cantidad tan grande ma completo, se evita este tipo de
de fragmentos, sin ninguna referencia a un mapa del genoma, sin duda error asegurándose de que las dos
la respuesta es no. La tarea resultaría imposible por la enorme cantidad secuencias terminales de un fragmento
de DNA clonado (de alrededor de l0
de tiempo de ordenador necesaria para identificar superposiciones entre
kb de longitud) aparezcan en la
las secuencias, y los errores o, en el mejor de los casos incertidumbres, secuencia maestra en sus posiciones
causados por el extenso contenido de DNA repetitivo de la mayoría de previstas. Si falta una de las secuencias
los genomas eucariontes (véase figura 3.2). Pero si se contara con un terminales, se ha cometido un error al
mapa como referencia, podría ser posible el ensamblaje correcto de las ensamblar la secuencia maestra.
minisecuencias.

Carscterísticas claves de lo secuencíacíón qteatori*

del genono completo
La parte que más tiempo insume de un proyecto de secuenciación alea-
toria es la fase de unión de cada cóntigo de secuencias por cierre de los
hiatos de secuencia y los hiatos físicos (véase figura 4.1.1). Para reducir
el grado de cierre de hiatos requerido, el método aleatorio del genoma
completo utiliza por lo menos dos genotecas de clones, preparadas con
diferentes tipos de vector. Se emplean no menos de dos genotecas por-
que, con cualquier vector de clonación, se prevé que algunos fragmen-
tos no serán clonados debido a problemas de incompatibilidad que
impiden la propagación de los vectores que contienen estos fragmentos.
Diferentes tipos de vector plantean distintos problemas, de modo que
fragmentos que no pueden ser clonados en un vector a menudo pueden
ser clonados si se emplea un segundo vector. Por lo tanto, generar la
secuencia a partk.de fragmentos cl<¡nados en dos vectores diferentes
mejorará la cobertura global del genoma.
 =-

124 Capítulo 4 Secuenciación de los genomas

(A) Supercóntigos
(B) Cierre de un hiato de secuencia h
S(

I SUPERCÓNTIGO 2 el

*f *
SUPERCÓNNGO

T
* ]* r-=."."e *l
<-Lectura
q

físico-]*l*
Lectura de ¡ de C
extremos \'j extremos
1
Cóntigos de secuencias Hiato Hiatos de secuencia
apareados apareados
T
r5 kb 1

L
Plásmido o clon 1' C

Figura 4.17 Resultado inicial del
eñsamblaje de secuencias mediante
el método aleatorio del genoma
f
por los elementos repetidos
¿Qué ocurre con los problemas planteados I
iara el ensamblaje dé la secuencia? En el capítulo-5 destacamos este
en contra de la secuenciación
i.á6t"m, como é1 prinicipal argumento
la posibilidad. de que saltos
(

áleatoria de genomás euc;riont"s, debido a I

completo. (A) Los supercóntigos son
entre unidadés repetidas dejasen fuera partes de una^región repetitiva o I
intermediarios en el ensamblaje de
secuencias mediante el enfoque aleato- que se efectuase ina conexión incorrecta entre dos fragmentos separa- (

no del genoma completo. Se muestran áos del mismo cromosoma o de distintos cromosomas (véase figura (

dos supercóntigos, Cada uno compren- 3.2). Se han propuesto varias soluciones posibles a.este problema, pero i

de una serie dé cóntigos de secuencias
seoarados oor hiatos de secuencia, con
sebaración'de los supercóntigos propia-
mente dichos por hiatos físicos. (B) Los
hiatos de secuencia se localizan entre
lecturas de extremos apareados -un par
de minisecuencias de los dos extremos
de un solo fragmento clonado- y, por lo
tanto, pueden ser cerrados Por secuen-
ciación adicional del DNA clonado.
ü i"al exitosa es garantizar que una de las genotecas de clo-
"rt.ut"giu prolongaáos que las secuencias repetidas
nes contelnga fragmentos máIs
Áár turgu.?el gánoma estudiádo. Poi ejemp-lo, una de las genotecas de
piár*i¿ár usadá cuando se aplicó este método al genoma de Drosophila
fontenía insertos que medían, en promedio, 10 kb, pues la mayoría de- las
r""""""iu, repetidás de Drosophiia son de 8 kb o menos. Se evitan saltos
que las
de secuencia, de una secuencia repetida a otra, asegurándose de
dos secuencias terminales de cadáinserto de 10 kb estén en las posicio-
nes apropiadas de la secuencia maestra (figura 4'16)'

El resultado inicial del ensamblaje de la secuencia es una serie de super-

(figura 4.17A), cada uno de los cuales comprende una serie de
"arrtigo.
cóntilos de-secuencias-separados por hiatos de secuencia localizados
entre"lecturas de extremol apareados -las minisecuencias de los dos
extremos de un solo fragmentó clonado- y, por 1o tanto, son hiatos que
(figura
se pueden cerrar po. ."ir"rciación adicional de ese fragmento
4.i78). Los super^cóntigos propiamente dichos están separados por hia-
tos físicos, que son más difíciles de cerrar porque representan secuen-
cias que no se encuentran en las genotecas de clones. El contenido de
*u."ádor". de cada supercóntigo ée utiliza para determinar su posiciórr
ál -rpu del genoma. Por ejeáplo, si se cónocen las localizaciones de
"n
StS ,rrupid"l genoma, ie puede posicionar un_ supercóntigo deter-
*inu.r¿o que SfS co*ntiene. Si un supeicóntigo contiene STS de dos par-
"r, "i
tes no cortigrru. del genoma, ha ha6ido un error durante el ensamblaje
de la secuencia. Se p"uede controlar aún más la exactitud del ensambla-
de fragmentos de
i" ¿" fu secuencia ob,teniendo las secuencias terminales alta capacidad. Si
iOO tU o más que han sido clonados en un vector de
un par de secuáncias terminales no cae dentro de un solo supercóntigo
i..r. posiciones previstas relativas entre sí, también en este caso se ha
"n
cometido un error de ensamblaje.

Se ha demostrado la factibilidad del método aleatorio del genoma com-

pf"i. pár su aplicación a los genomas de la mosca de la fruta y el ser
Figura 4.18 El carácter aleatorio de
la generación de secuencias
me--diante el método aleatorio del
genoma completo imPlica que
algunas partes del genoma son
cu-biertai por más minisecuencias
que otras partes.
 Los Proyectos Genoma Humano

hurnano. Pero todavía persisten dudas acerca de la veracidad de las

secuen"iat genómicas generadas por este método. Las comparaciones
fr. doi versiones áel genomá humano (sección 4.3) han mostrado
"rtt"
q,"lusecuenciaq:l"rtr]:l,i"l'iTl"::::t:^*:'-f::'T.1'.o:o,,y:
Jon,i"". .rtu "uttidud susiancial de segmentos faltantes, que totalizan
iOO ltU y se han perdido de la secuencia por problemas causados
por
ñÑe r"pétitivo. Eitos errores han determinado la deleción completa de
iO g"r", y la deleción parcial de otros 67. También se ha sugerido que
unu"."".r".rcia obtenida por el método aleatorio del genoma completo
ouizáno tenga el grado de exactitud deseado, aun en regiones correcta-
iiente enru*bludai. Un lado del problema es que el carácter aleatorio de
ia generación de la secuencia implica que algunas paftes del genoma
están cubiertas por varias de las minisecuencias obtenidas, mientras
que
otras están représentadas sólo una o dos veces (figura 4.18). Por lo gene-

menos cuatro véces para garantizar un nivel de exactitud aceptable y qu.e

esta cobertura debe aumentar a 8-10 veces antes d9 Que se pueda consi-
derar que la secuencia está completa. Es probable que una secuencia
obtenida por el método aleatorio del genoma completo supere esterequi-
sito en muchas regiones, pero puede no cumplirlo en otras áreas. Si esas
áreas incluyen génes, la falta de exactitud podría causar problemas

(váase capítulo 5). Estos problemas fueron destacados por el análisis del
borrador de |a secuencia de Drosophila obtenido por el método aleatorio
del genoma completo, que sugirió que hasta 6.500 de los 13.000 genes
podiían contener errores de secuencia significativos.

4.8 §-os Froyectes G€E?oma Hu$?amo

Para concluir el examen del mapeo y la secuenciación, consideraremos
cómo se aplicaron estas técnicas al genoma humano. si bien cada pro-
yecto de génoma es diferente, con §us propios problemas y soluciones,
ior p.oyeótos humanos ilustran los problemas generales que debieron
encararse para secuenciar un genoma eucarionte gfande y, de muchas
maneras, muestran los procedimientos considerados ahora lo más nove-
doso en esta área de la biología molecular.

4.5-l Fase de mapee del ProyecÉo tenoma Hu¡*ano

Hasta comienzos de la década de 1980, se creía que el mapa detallado
de un genoma humano era un objetivo inalcanzable. Si bien se habían
construido mapas genéticos completos para la mosca de la fruta y algu-
nos otros organismos, debido a los problemas inherentes al análisis de
árboles g".reálógicos humanos (sección 3.2.4) y la relativa escasez de
marcadoies genéticos polimorfos la mayoría de los genetistas dudaban
de que alguáa vez se pudiese obtener un mapa genético humano. El
impulso inicial para lograrlo provino del descubrimiento de los RFLP,
qué fueron los primeros marcadores de DNA altamente polimorfos en
ser reconocidos, en genomas de animales. En 1987 se publicó el primer
mapa de RFLP humanos, que comprendia 393 RFLP y otros 10 marca-
dores polimorfos. Este mapa, elaborado del análisis de 21 familias, tenía
una dénsidad promedio de marcadores de uno cada 10 Mb.

A fines de la década de 1980, el Proyecto Genoma Humano surgió como una

tarea conjunta apacible pero organizada, entre genetistas de todas partes del
mundo. Uno de los objetivos que se fijó el Proyecto fue construir un mapa
genético con una densidad de un marcador cada 1 Mb, aunque se considera-
126 Capítulo 4. Secuenciación de los genomas

ba que una densidad de uno cada 2-5 Mb podría ser un límite realista. De
hecho, en 1994, urr consorcio intemacional había cumplido y, por cierto,
\ ,1 superado el objetivo, gracias ala:utTlización de SSLP y el gran conjunto de
familias de referencia del CEPH (sección 3.2.4). El mapa de 1994 contenía
{l*;: rk Tái 5.800 marcadores, de los cuales 4.000 eran SSLP, y tenía una densidad de un
marcador cada 0,7 Mb. Una versión ulterior mejoró un poco el mapa de
1994 al incluir otros 1.250 SSLP.
Figura 4.19 Algunos clones de YAC
contienen segmentos de DNA de El mapeo físico no se hizo esperar demasiado. A principios de la década
diferentes partes del genoma de 1990, se inürtió considerable esfuerzo en generar mapas de cóntigos
humano. de clones mediante la investigación de STS (sección3.3.3), así como otros
métodos de determinación de la huella genética de los clones (sección
4.2.2). El principai logro de esta fase del proyecto de mapeo físico fue
publicar un mapa de cóntigos de clones de todo el genoma, que consistía
en 33.000 YAC que contenían fragmentos de 0,9 Mb, en promedio. Sin
embargo, surgieron dudas acerca del valor de los mapas de cóntigos de r
YAC cuando se advirtió que los clones de YAC pueden contener dos o más C
fragmentos de DNA no contiguo (figura 4.19).Lautilización de estos clo- S
nes quiméricos para construir mapas de cóntigos podría determinar que C
segmentos de DNA ampliamente separados en el genoma sean mapeados l,
por effor en posiciones adyacentes. Estos problemas llevaron a adoptar el I
mapeo de marcadores STS mediante híbridos por radiación (sección c
3.3.3), sobre todo por el \\rltitehead Institute/MlT Genome Center de 1

Massachusetts,lo que culminó en 1995 con la publicación de un mapa de 1:

STS humanos que contenía 15.086 marcadores, con una densidad prome- ci
dio de uno cada 199 kb. Más adelante, este mapa se complementó con (
otros 20.104 STS, la mayoría de los cuales eran EST y, por ende, localiza- c
ban genes que codificaban proteínas en el mapa físico. La densidad del e
mapa resultante se acercaba al objetivo de un marcador cada 100 kb fija- p
do para el mapeo físico al comienzo del Proyecto Genoma Humano. f
t
Los mapas de STS combinados incluían posiciones de casi 7.000 SSLP \
polimorfos, que también habían sido mapeados en el genoma por lt
medios genéticos. En consecuencia, se podían comparar directamente t;
los mapas físico y genético, y se podían anclar mapas de cóntigos de clo- o
ó
nes que contenían datos sobre STS en ambos mapas. El resultado neto S

fue un mapa completo, integrado, que se podía emplear como marco t'
para la fase de secuenciación de DNA del Proyecto Genoma Humano.

+
€"=.? Se<u*eciación d=l ger:*ryr€ huffia.= C
El plan original era que la fase de secuenciación del Proyecto Genoma S,

Humano estuviese basada en genotecas de YAC, pues este tipo de vector se b

o
puede utilizar con fragmentos de DNA más largos que los que pueden ser o'
c:

manipulados por cualquier otro tipo de sistema de clonación. Se debió aban- St

donar esta estrategia cuando se descubrió que algunos clones de YAC conte- tt
nían fragmentos de DNA no contiguos. Por lo tanto, el Proyecto dirigió su o'
b
atención a los BAC (sección 2.2.1). Se generó una genoteca de 500.000 clo-
nes de BAC y se mapearon estos clones en el genoma,lo que dio origen a un g
mapa de "secuencias listas", que se podía utilizar como base primariaparula q
fase de secuenciación del Proyecto, durante la cual se secuenciaría por com- cl
pleto el inserto de cada BAC por el método aleatorio. e
2
2
Aproximadamente en la época en que el Proyecto Genoma Humano se 1-r

estaba preparando para pasar a la fase de adquisición de la secuencia, se lc

propuso por primera vez el método aleatorio del genoma completo como 1'(

alternativa al método más laborioso de cóntigos de clones adoptado hasta C-

 Los Proyectos Genoma Humano 127

entonces. La posibilidad de que, de hecho, el Proyecto Genoma Humano

no aportara la primera secuencia del genoma estimuló a los organizadores
del Proyecto a posponer las fechas planificadas para completar un borra-
dor de trabajo. En diciembre de 1999, se publicó el primer borrador de una
s.cu"r"iu dó un cromosoma humano completo (número 22) y algunos
fneses más tarde apareció el borrador de la secuencia del cromosoma 21.
Por último, el26 de junio de 2000, acompañados por el presidente de los
Estados Unidos, Francis Collins y Craig Venter, los directores de los dos
proyectos anunciaron que habían completado los borradores de trabajo,
que aparecieron impresos ocho meses después.

Es importante saber que las dos secuencias del genoma publicadas en

2OOl eran borradores, no secuencias finales completas. Por ejemplo, la
versión obtenida por el método de cóntigos de clones cubría sólo el 90oZ
del genoma, y las 520 Mb faltantes residían sobre todo en la heterocro-
matina eonstitutiva (sección 10.1.2): regiones de los cromosomas
donde el DNA se dispone en un ordenamiento muy estrecho que, según
se cree, contienen pocos genes o ninguno. Dentro del9Oo/o del genoma
cubierto, cada parte había sido secuenciada por 1o menos cuatro veces,
lo que aportaba un nivel de exactitud "aceptable", pero sólo el 25o/o se
había secuenciado las 8-10 veces necesarias para considerar "termina-
do" el trabajo. Más aún, este bomador de la secuencia tenía alrededor de
150.000 hiatos y se reconoció que era probable que algunos segmentos
no hubiesen sido correctamente ordenados. El Consorcio Internacional
de Secuenciación del Genoma Humano (International Human Genome
Sequencing Consortium), que manejó la fase final del proyecto, fijó
como objetivo una secuencia terminada de por lo menos el 95o/o de la
eucromatina -la parte del genoma en la que se localiza la mayoría de los
genes- con una tasa de error de menos de uno en 104 nucleótidos y cie-
rre de todos los hiatos, excepto los más refractarios. Alcanzar este obje-
tivo exigió la secuenciación adicional de 46.000 clones de BAC, PAC,
YAC, fósmidos y cósmidos (sección 2.2.1,). Las primeras secuencias cro-
mosómicas terminadas comenzaron a aparecer en 2004 y, un año más
tarde, se consideró que se había completado la secuencia de todo el
genoma. Esta secuencia tiene una longitud total de 2.850 Mb y carece
sólo de 28 Mb de eucromatina presentes en 308 hiatos que, hasta ahora,
resistieron todos los intentos de cierre.

4.3-3 Futuro de los proyectos sobre el gcnorna humano

Completar una secuencia terminada no es el único objetivo de los con-
sorcios que trabajan en el genoma humano. Conocer la secuencia del
genoma es una tarea masiva que implica la participación de numerosos
grupos de todo el mundo y el empleo de diversas técnicas y enfoques que
se considerarán en los dos capítulos siguientes. Entre ellos, es importan-
te la genómica comparativa, que compara dos secuencias completas de
genomas para identificar características comunes que, por estar conser-
vadas, es probable que sean importantes (véase sección 5.1.1). Con el
genoma humano, la genómica comparativa tiene el valor agregado de
que puede permitir localizat las versiones animales de genes de enferme-
dades humanas, lo que abre el camino para estudiar la base genética de
estas enfermedades utilizando los genes animales como modelos. En
2002, se publicaron borradores de los genomas de ratón y de rata, y en
2005, se completó el borrador del genoma del chimpancé. También
habrá otros proyectos de genoma humano orientados a elaborar tn catá-
logo de variabilidad de secuencias en diferentes poblaciones, cuyos
resultados quizá permitan inferir los orígenes antiguos de estas pobla-
ciones (sección 19.3.2).
¡28 Capítulo 4 Secuenciación de los genomas

Estos proyectos de diversidad humana nos llevan a aspectos controver-

tidos de la secuenciación del genoma. La mayoúa de los científicos pre-
vén que los datos de la secuencia de diferentes poblaciones destacarán
la unidad delaruza humana, al mostrar que los patrones de variabilidad
genética no reflejan las agrupaciones geográficas ni políticas adoptadas
por los seres humanos durante los últimos siglos. Pero, aun así, los resul-
tados de estos proyectos sin duda estimularán el debate en círculos no
científicos. Otras controversias giran alrededor de la cuestión de quién
poseerá, si alguien lo hace, las secuencias de DNA humano. Para muchos,
la idea de propiedad de una secuencia de DNA es un concepto peculiar,
porque se pueden ganar grandes sumas de dinero con la información
contenida en el genoma humano, por ejemplo, utilizando las secuencias
de genes para dirigir el desarrollo de nuevos fármacos y tratamientos con-
tra el cáncer y otras enfermedades. Es natural que las compañías farma-
céuticas involucradas en la secuenciación del genoma deseen proteger sus
inversiones, como sería el caso para cualquier otra empresa de investi-
gación, y, en la actualidad, la única manera de hacerlo es patentar las
secuencias de DNA que descubran. Lamentablemente, en el pasado, se
han cometido errores al manejar los aspectos económicos relacionados
con la investigación con material biológico humano y el sujeto del que
se obtuvo el material no siempre ha compartido los beneficios. Resta
todavía resolver estos problemas.

Las cuestiones relacionadas con el uso público de las secuencias del

genoma humano son aún más polémicas. Una preocupación importante
es que, una vez conocida la secuencia, se podría discriminar a los indi-
viduos cuyas secuencias sean consideradas "subestándates", por la
razón que fuere. Los peligros varían de primas de seguro más altas para
las personas cuyas secuencias contengan mutaciones que las predispo-
nen a una enfermedad genética, ala posibilidad de que los racistas inten-
ten definir características "buenas" y "malas" de las secuencias, con
implicaciones desalentadoramente predecibles para quienes tengan el
infortunio de caer dentro de la categofia "mala".

Los dos proyectos de genoma humano, sobre todo en los Estados Unidos,
siguen apoyando la investigación y el debate de los problemas éticos, lega-
les y sociales planteados por la secuenciación del genoma. En particula4 se
tiene gran cuidado de garurftzar que no sea posible identificar las secuen-
cias generadas por los proyectos con ningún individuo en particular. El
DNA que es clonado y secuenciado proviene sólo de personas que han con-
sentido en que su material se utilice para este propósito y a quienes se les
puede garantizar el anonimato. Esta política, cuando fue adoptada por pri-
meravez, exigió cierto grado de realineación de los proyectos de investiga-
ción, porque hubo que destruir las genotecas de clones más antiguas y
controlar los mapas físicos existentes con el nuevo material. De todos
modos, se aceptó que era necesario trabajar más para mantener y aumen-
tar la confianza del público en los proyectos.

ñesumen
Durante la década de 1970 fueron inventados los procedimientos para
la secuenciación rápida del DNA. En la actualidad, la versión utilizada
con mayor frecuencia es el método enzimático, que se ha popularizado
porque es fácil de automatízar,lo que permite llevar a cabo una gran
cantidad de experimentos individuales en un período breve. Esto es
importante porque un solo experimento proporcionaT1O pb o menos de
secuencia, por lo que se deben efectuar miles, si no millones, de experi-
mentos individ_uales para obtener la secuencia de un genoma completo.
 Los Proyectos Genoma Humano 129

Otros métodos de secuenciación de DNA, como la técnica de degrada-

ción química y la pirosecuenciación, tienen aplicaciones más especiali-
zadas. Cuando se está secuenciando un genoma, el principal problema
es ensamblar en el ofden cofrecto todas las minisecuencias obtenidas de
los múltiples experimentos de secuenciación. En un genoma bacteriano
Dequeño, es posíble ensamblar la secuencia mediante el método aleato-
iio, qu" consiste simplemente en examinar las minisecuencias para
d,eteciar superposiciones. Este enfoque, que no requiere ningún conoci-
miento previo del genoma, fue utilizado por primera Yez en 1995 para
el genoma de 1.830 kb de Haemophilus influenzae y sp conviritó, des-
oués, en el método estándar para secuenciar genomas bacterianos. Los
intentos de aplicar este enfoque a genomas eucariontes más grandes se
complican por la presencia de secuencias de DNA repetitivo, que pue-
den llevar a ensamblar de manera incorrecta segmentos del genoma. El
enfoque de cóntigos de clones eüta estos problemas al identificar una
serie de clones, en. un vector de alta capacidad como un BAC, que con-
tienen fragmentos superpuestos que han sido anclados a un mapa físico
o genético del genoma en estudio. Se pueden constluir cóntigos de clo-
nes cortos por paseo cromosómico, pero los cóntigos más largos emple-
ados en los proyectos de secuenciación se suelen ensamblar mediante
diversas técnicas de determinación de la huella genética de clones.
Después, se secuencian los fragmentos presentes en cada clon por el
método aleatorio. Éste es el enfoque adoptado por el Proyecto Genoma
Humano oficial, pero cuando ese proyecto se acercaba al final de la fase
de secuenciación, Craig Venter y cols. mostraron que el genoma huma-
no y otros genomas más grandes se podían secuenciar con mucha mayor
rapidez por el método aleatorio del genoma completo, que adopta el
mismo enfoque que el método aleatorio convencional, pero con ciertas
salvaguardas, como estricta atención a un mapa físico para asegurarse
de que las secuencias adyacentes a regiones de DNA repetitivo estén
correctamente ensambladas. La comparación de los dos borradores de
secuencias humanas ha sugerido que el método de cóntigos de clones
genera una secuencia más exacta, pero que el método aleatorio del
genoma completo, al ser rápido, es la mejor manera de obtener un
borrador inicial de un genoma. En la actualidad, los proyectos de
genoma humano han progresado hasta el estadio en que se han publi-
cado secuencias cromosómicas terminadas, que cubren hasta el 95o/o
de la eucromatina de cada cromosoma, con una tasa de error de
menos de uno en 10a nucleótidos. Los problemas éticos, legales les y
sociales planteados por la finalización de la secuencia humana com-
prenden cuestiones respecto de los derechos de propiedad y patente,
y la posibilidad de discriminación genética.
 .t -=.r

.L*
r'1 i i
:f
='\ l--i
-
\_r--
ilrffi#cám=ie*E* ## Em if
1
==
#t
r'l '

LE*
=#{#**eÉ# g*r=#rE=G

5.tr {-*r¡ii¿ecié¡: eie los gen€3 en i* §*rutnc

de un gen*n=
5.2 Determinarión de l¿s funcianes cie
cade gen
5.3 Estx¿lic de i*sa: an*iarián de !a
=ccucnr
d*i genoma de S*rr**roml-¿*: ¿*¡*vis<

Describir la base del banido de marcos de leciura abiertos (ORF) y explicar por qué este enfoque no
siempre es exitoso para localizar genes en genomas eucariontes.

Explicar cómo se localizan los genes de RNA funcional en la secuencia de un genoma.

Definir el término "homología", y explicar cómo se utiliza la homología y la genómica comparativa para
localizar genes en la secuencia de un genoma.

Reseñar los diversos métodos experimentales empleados para identificar partes de la secuencia de un
genoma que especifican moléculas de RNA.

Evaluar los puntos fuertes y las limitaciones del análisis de homología como medio de asignar fun-
ciones a genes.

Describir los métodos utilizados para desactivar o sobreexpresar genes individuales en levaduras y mamf-
feros, y explicar cómo pueden llevar a identificar la función de un gen.

Efectuar una descripción general de las técnicas que se pueden utilizar para obtener información más
detallada de la actividad de una proteína codificada por un 8en desconocido.

Resumir los métodos aplicados y el progreso logrado en la anotación de la secuencia del genoma de
Sacchoromyces cerevisioe.

La secuencia de un genoma no es un fin en sí misma. Aún se debe resolver

un problema importante para conocer qué contiene y cómo se expresa el
genoma. Los intentos por conocer el contenido utilizan una combinación de
análisis computarizado y experimentación, con el objetivo fundamental de
localizar los genes y determinar sus funciones. Este capíhlo está dedicado a
los métodos aplicados para encarar estas cuestiones. El segundo problema
-saber cómo se expresa un genoma- es, en cierta medida, una manera dife-
rente de expresar los objetivos de la biología molecular de los últimos trein-
ta años. La diferencia reside en que, en el pasado, se ha dirigido la atención
 t¡8 Capítulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma
.=-==*l::---::l--l::- ::---'--=-
I- -- a,ia il.-- i:_¡+_- -_:_: ;i
--Marco de lectura abierto
Fígura 5.1 Un gen que codifica una
proteína es un marco de lectura
abierto de codones. Se muestran
los primeros cuatro y los últimos dos
codones del gen. Los primeros
cuatro codones especifican metioni-
naliniciación-glicina-serina-alanina,
y los dos últimos especifican fenilala-
nina-terminación.
s''ATGACGAGAGAG CAG C CA TTTTAG *3'
jTACTG C TCTC TCG TCGG TAAAATC _ 5,
5,
+ila
Figura 5.2 Una molécula de DNA
bicatenario tiene seís marcos de
lectura. Ambas cadenas se leen en Ia
dirección 5'-+3'. Cada cadena tiene
tres marcos de lectura, que dependen
de qué nucleótido es elegido como
posición inicial.
a las vÍas de expresión de genes indiüduales y sólo se han considerado gru: pfc
pos de genes cuando la expresión de uno estaba evidentemente ligada con la
say
de otro. Ahora, la cuestión se ha vuelto más general y se relaciona con la nof
expresión del genoma completo. En el capífrlo 6 se considerarán las técnicas clol
empleadas para abordar este tema. EV€
¿C
5-? LscalizaeEóes de les genes e¡? !a se{$er?€Ée nol
de
de urc senosme mt
Una vez que se ha obtenido una secuencia de DNA, ya sea la secuencia mi
de un solo fragmento clonado o de todo un cromosoma, se pueden se(
emplear diversos métodos para localizar los genes presentes. Estos ia
métodos se pueden dividir en los que implican sólo inspeccionar la po
secuencia, en forma üsual o más a menudo por ordenador, para buscar 11
características especiales de las secuencias asociadas con genes, y los les
que localizan genes por análisis experimental de la secuencia de DNA. no
Los métodos computarizados forman parte de la metodología denomi- en
nada bioinformática y comenzaremos por ellos. ge.
tal
5,I "? Lccalizaeién eie los genes p*r inspeccién
i¡
rEe seeuenc¡as :
,i
Es posible recurrir a la inspección de secuencias para localizar genes,
porque éstos no son una serie aleatoria de nucleótidos, sino que presen- Si
tan características distintivas. Por ahora, no conocemos por completo el mr
catácter de todas estas características específicas, y la inspección de la ric
secuencia no es, por lo tanto, una manera infalible de localizar genes, let
pero aun así es un instrumento poderoso y suele ser el primer método OP
que se aplica para analizar una secuencia de un nuevo genoma.
l*cs regíones de cadificaciún ril !*s g*rir.s son tnsrcos
Ce leciura sbiertos
Los genes que codifican proteínas comprenden marcos de lectura abier-
tos (open reading frames, ORF) que consisten en una serie de codones
que especifican la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada
por el gen (figura 5.1). Los ORF comienzan corr un codón de iniciación
-en general (aunque no siempre), ATG- y terminan con un codón de ter-
minación: TAA, TAG o TGA (sección 1.3.2), Por lo tanto, investigar
ORF que comienzan con ATG y finalizan con un triplete de terminación
en una secuencia de DNA es una manera de buscar genes. El análisis se
complica porque cada secuencia de DNA tiene seis marcos de lectura,
tres en una dirección y tres en la dirección inversa, en la cadena comple-
mentaria (figura 5.2), pero los ordenadores son bastante capaces de
barcer los seis marcos de lectura para detectar ORF. ¿Qué tan eficaz es
esto como medio de localizar genes?
La clave para el éxito del barrido de ORF scanning es la frecuenaa de apa-
rición de codones de terminación en la secuencia de DNA. Si el DNA tiene
una secuencia aleatona y un contenido de GC del50o/o, cada uno de los tres
codones de terminación -TAA, TAG y TGA- aparecerá, en promedio, una rrir i(
vez cada 43 = 64 pb. Sí el contenido de GC supera el SUo/o,los codones de
terminación, ricos en AL apatecetán con menor frecuencia, pero aun así será rmii6
esperable hallar uno cada 100-200 pb. Esto significa que el DNA aleatorio
no mostrará muchos ORF de más de 50 codones de longitud, sobre todo si
se utiliza un triplete ATG inicial como parte de la definición de un ORE Por
otra parte, la mayoría de los genes tienen más de 50 codones: las longitudes
 Localización de los genes en la secuencia de un genoma t¡9

Dfomedio son de 517 codones para Eschencltio coli, 483 codones para
cerevisíoey alrededor de 450 codones para los seres huma-
nos. El barrido de OR-E en su forma más simple, toma una cifra de alrede-
dor de 100 codones como longitud mínima de un presunto gen y registra
eventos positivos para todos los ORF que superan esta longitud'

;Qué eficacia tiene esta estrategia en la prácAca? En los genomas bacteria-

ios, los barridos de ORF simples son un modo eficaz delocahzar la mayoría
de los genes de una secuencia de DNA. Esto se ilustra en la figura 5.3, que
rnuestra un segmento del genoma de E coli y destaca todos los ORF que
miden más de 50 codones. No es posible confundir los genes reales de la
secuencia, porque su longitud es mucho mayor de 50 codones. En las bacte-
rias, el análisis se simplifica aún más porque los genes son muy cercanos y,
por 1o tanto, hay.relativament" p::o_ DNA intergénico en el genoma (sólo
ilo/o para E. coli; véase sección s.2.1,). Si presuponemgs -que los genes rea-
les no se superponen,lo cual es cierto parulamayoría de los genes bacteria-
nos, sólo hay posibilidad de confundir un ORF corto, espurio, con un gen real
Figura 5.3 El barrido de ORF es una
en 1as regiones intergénicas. Por ende, si el componente intergénico de un mánera eficaz de localizar genes de
genoma es pequeño, hay menor probabilidad de cometer effores al interpre- un genoma bacteriano. El diagrama
tar los resultados de un barido de ORF simple. muestra 4.522 pb del operón de lac-
tosa de Escherichio coli con todos los
ORF de más de 50 codones marca-
Lcs r,-*r¡"ic*s de *8F slmplss süfi {i..*n*s €f,'.:cres efi si ¿i¡iÉ dos. La secuencia contiene dos genes
cie ¡,rs -'u'fú.'rú.,lif s suDeriares reales -locZ y locY- indicados por las
líneas rojas. No es posible confundir
Si bien los barridos de ORF funcionan bien en los genomas bacterianos, son
estos genes reales porque son mucho
menos eficaces para localizar genes en las secuencias de DNA de los euca- más largos que los ORF espurios,
riontes superiores. Esto se debe, en parte, a que el espacio entre los genes rea- mostrados en amarillo. Véase la
les de un genoma eucarionte es mucho mayor (p. ej., alrededor del620/o del estructura detallada del operón de lac-
genoma humano es intergenico), 1o que aumenta la probabilidad de hallar tosa en la figura 8.8A.

aT6CtG(cTGIÍTT6ACaGCT6e6AtCT6CCAfi6laAGACAl6l¡fACCCa6T¡CcTCTfCCCSAGa6^AAACGG rrc¡6c¡acT6aT6G¡aaccaGcc¡Tc6acATcrGcrGcAcGc66aa6¡¡G6c¡crrc6crGAATATC6ACC6lfTcaA
 Capítulo 5Ionocimiento de la secuencia de un genoma

Figura 5.4 Los intrones complican los
barridos de ORF. Se muestra la
secuencia nucleotídica de un gen corto
que contiene un solo intrón.
lnmediatamente por debajo de la
secuencia nucleotrdica, se presenta Ia
secuencia correcta de aminoácidos de
la proteína traducida del gen: en esta
secuencia, el intrón ha quedado fuera
porque es eliminado del transcrito
antes de que el mRNA sea traducido a
proteína. En la línea inferior, se ha tra-
ducido la secuencia sin advertir que hay
un intrón presente. Como consecuencia
de este error, la secuencia de aminoáci-
dos parece terminar dentro del intrón.
Para las secuencias de aminoácidos se
utilizaron abreviaturas de una letra
(véase cuadro 1.2). Los asteriscos indi-
can las posiciones de los codones de
terminación. En la sección 12.2.2 se
considera en detalle los intrones.
lntrón E.rón
/l
/\
/\
I
Í tr '_-
AT6C6CAATC CAAC CTAC6CTCATCACGTAAGTGATTAAT6cATTTCTCGcAGTC 6CTACACCATCIAT;C
fi{ G $;l A R Y C ,E .Q , ..." W I D D A *
MGS¡ARYüfQVSDX
ORF espurios. Pero el principal problema con el genoma humano y los geno-
mas de los eucariontes superiores en general es que sus genes suelen estar
divididos por intrones (sección 1.2.3) y, así, no aparecen como ORF conti-
nuos en trna secuencia de DNA. Muchos exones miden menos de 100 codo-
nes, algunos tienen menos de 50 codones, y continuar el marco de lectura
hasta trn intrón suele llevar a rria secuencia de terminación que parece cerrar
el ORF (figura 5.4). En otras palabras, los genes de un eucarionte superior
no aparecen en la secuencia del genoma pues no es posiblelocalizarlos por
barridos de ORF largos ni simples.
f
Resolver el problema planteado por los intrones es el principal desafío I
de los especialistas en bioinformática que crean nuevos programas de c
software para la localización de ORF. Se han incorporado tres modifica- c
ciones al procedimiento básico de barrido de ORF: j
. Se tiene en cüenta el sesgo de codones. "Sesgo de codones" hace referen-
i
l,
cia al hecho de que no todos los codones se utilizan con igual frecuencia
en los genes de un determinado organismo. Por ejemplo, la leucina es
especificada por seis codones del código genético (TTA, TIG, CTT CTC,
CIA y CTG; véase figura 1.20), pero lo más frecuente es que, en los genes
humanos, sea codificada por CTG y sólo rara vezlo sea por TTA o CTA. E
Asimismo, de los cuatro codones para valina, los genes humanos usan
¿
GTG cuatro veces más a menudo que GTA. No se conocelaruzónbioló- (-
gica de este sesgo de codones, pero todos los organismos tienen un sesgo, c
que es diferente en distintas especies. Es esperable que los exones reales o
b
presenten este sesgo de codones, mientras que series fortuitas de triple- t:
tes, no. Por lo tanto, el sesgo de codones del organismo estudiado está S,
escrito en el software de barrido de ORE
Se pueden investigar los límites exón-intrón, ya que tienen caracte- b
' rísticas distintivas de la secuencia, aunque lamentablemente éstas no
son tan notorias como para que su localización sea una tarea trivial. p
Por lo general, la secuencia del límite exón-intrón corriente arriba se r(
describe como:
5'_AGJGTAAGT_3'
donde la flecha indica el punto lÍmite preciso. Sin embargo, sólo el "GT"
c.
inmediatamente después de la flecha es invariable: en otras partes de la
secuencia, se encuentran bastante a menudo nucleótidos distintos de los
d
o-
mosffados. En otras palabras, la secuencia es un consenso, con lo que sig- b

nificamos que muestra el nucleótido más frecuente en cada posición de d

p
todos los límites exón-intrón corriente arriba que conocemos, pero que
cualquier secuencia lÍmite particular podúa tener trn nucleótido diferente
en una o más de estas posiciones (figura 5.5). El límite exón-intrón
corriente abajo está aun menos definido: 11

ST
5'-PyPy§PyPyPyNCAGJ-3' d,
donde "$r" significa'uno de los nucleótidos de pirimidina (T o C) y "N" cl,

es cualquier nucleótido. Si sólo se buscan estas secuencias consenso, no

se localizarán más que lmos pocos limites exón-intrón, porque lamayoría
 Localización de los genes en la secuencia de un genoma t4l

+-GTMGT :-;i. i'

tiene secuencias distintas de las mostradas. Ha resultado difícil üear soft- 5, ,,..* AG Secuencia

ware que tengan en cuenta las variables.conocidas y, por ahora,locahzat

consenso

los limites exón-intrón es una cuestión de azar.

utilizar secuencias reguladoras corriente arriba patalocahzar ler-nor
--¡, 3,
Se pueden "--
' iur ."gion"s donde comienzan los genes. Esto se debe a que las secuen-
s, Re

lerRR.T
,

,ágduAolas, como los limites exón-intrón, tienen características dis- 5' .=* ¡e --;-, ,' , s..r.n.iu,
ti"tiuuí de la secuencia que les permiten desempeñar su papel como
"iu. 5' ."_ T:+GTAAGT;-'" ]' ] L
reales

."ñu1", de reconocimiento para las proteinas de unión a DNA involucra- *,,

ár, la expresión de los genes (capítulo 11). Lamentablemente, al igual
5' ..* o -luro,u, ,' l
que ""los límiies exón-intrón, las secuencias reguladoraf son variables, más
en los eucariontes que en los procariontes, y en los primeros, no todos
los
genes tienen el mismo conjunto_de secuencias reguladoras. Por lo tanto, Figura 5.5 Relación entre una
és problemático utilizarlas para localizar genes' seiuencia consenso para un límite
exón-intrón corriente arriba y las
secuencias reales halladas en los
Estas tres extensiones de los baridos de ORF simples, pese a sus limi- verdaderos genes. Se muestran en
aplicables a los genomas de todos los eucariontes rojo las diferéncias respecto de la
,*iorr"r, suelen ser
secuencia consenso. En los límites
,rp".ior".. También són posibles otras estrategias con organismos indi-
exón-intrón corriente arriba, sólo es
uiáuut.r, según las características especiales de sus genomas. Por ejem- invariable el "CT" inmediatamente
pfá, fo. g"t ó-u. de los vertebrados contienen islas CpG corriente arriba después del sitio de corte y empalme
que el
áL -r"ño. genes, que son secuencias de alrededor de 1 kb en las (indicado por la flecha).
contenido ¿é CC ei mayo, que el promedio para el genoma en su con-
junto. Alrededor del 40-5Oo/o de los genes humanos se asocian con una
irt, CpO corriente arriba. Estas secuencias son distintivas y, cuando se
iá.uliiu una en el DNA de un vertebrado, se puede presumir con firme-
iu qu" comienza un gen en la región inmediatamente corriente abajo.

L*:*íiz*riéa #* geces d* FlvÁ ír'nrt*¡:cies

El barrido de ORF es apropiado para genes que codifican proteínas, pero
¿qué sucede con los gerres á" RNA funcionales,
como rRNA y IRNA (sec-
óión t.2.2)? Estos génes no comprenden marcos de lectura abiertos, por
consiguiente rro ..tátt localizados por los métodos comentados' Sin embar-
go, lai moléculas de RNA funcional tienen, de hecho, sus propias caracte-
áril"u. distintivas, que pueden emplearse para ayudar a descubrirlas en la
secuencia de un g"tto*á. La más importante de estas características es la
capacidad de plegarse en una estructura secundaria, como la hoja de tré-
bol adoptada por las moléculas de tRNA (figura 5.qA). Estas estructuras
secundarias se mantienen unidas por apareamiento de bases, no entre dos
polinucleótidos distintos, como en h dóbte hélice de DNA, sino entre dife-
ientes partes del mismo polinucleótido, lo que denominamos apareamien'
to int-ramoleeular de bases. Para que se formen pares de bases
intramoleculares, las secuencias de nucleótidos de las dos partes de
la molécula deben ser complementarias, y para generar una estructura
compleja como la hoja de tré6o1, los componentes de estos pares de secuen-
ciaslomplementariás deben estár dispuestos en un orden característico
dentro dála secuencia del RNA (figura 5.68). Estas características aportan
gran cantidad de información que puede aprovecharse para localizar genes
áe IRNA en la secuencia de un genoma y los programas diseñados para este
propósito específico suelen ser muy eficaces'

Al igual que los tRNA, los rRNA y algunos de los pequeños RNA funcio-
nalei (seóci 6n 1.2.2) también adoptan estructuras secundarias que tienen
suficiente complejidad para permitir que se identifiquen sus genes sin
demasiada difióuliad. Oiros genes de RNA funcionales son menos fáciles
de localizar, porque los RNA adoptan estructuras que implican aparea-
miento de baies rilativamente escaso o que no sigue un patrón regUlar. Se
están utilizando tres enfoques paralocalizar los genes de estos RNA:
 Capítulo.5 Conocimiento de la secuencia de un genoma
-

(A) Estructura en hoja defébol del IRNA

Figura 5.6 Las características distin-
tivas de los tRNA ayudan a localizar 3'

los genes de estos RNA funciona- e

les. (A) Todos los IRNA se pliegan en e
una estructura en hoja de trébol, que
y€
e
se mantiene unida por apareamiento
intramolecular de bases en las cuatro
€:-
é é
regiones destacadas. (B) Secuencia E €
de DNA del gen para uno de los IRNA re Brazoaceptor

de Escherichia coli específico para el

aminoácido leucina. Los segmentos
XE
:
destacados corresponden a las regio-
nes de apareamiento intramolecular
€e a€
E-é Y*a.geBrazoTYc
c@
"oe6_ T,_f*gs =YsEi 1@
de bases mostrado en la parte A. Las I

limitaciones de la secuencia impues- o .._g-._j,..-J1_; :a=áé:+

o.,.-
tas por la necesidad de que estos
e :-,'.ai--if: @'. =@ @€
segmentos puedan aparearse por sus
bases con otro determinan caracterís-
@..6)"-::*e^ a '. 1

Gr----1FElá _
ticas que pueden buscarse mediante
programas computarizados diseñados Brazoanticodón@
ff-€€, l

para localizar genes de IRNA. Véase

más información sobre estructura del
#
#
l
I
IRNA en la sección
.l3.1.1.
@e
ee
@e@
I

I
(
(B) Secuencia de uno de los genes de tRN Aleu de Escherichia coli
1

5,GCCGAAGTGI{GAMTCG TAGICCCAGTTGATTCMAATCAACCGTAGAAATACGTCCCGGTTCGA TCCGGCCTTCCGCACCA 3' (

(
(

(
* Aunque algunos RNA funcionales no adoptan estructuras secundarias t
complejas, la mayoría contiene una o más estructuras tallo-bucle (u e

horquillas), que derivan del tipo más simple de apareamiento intramo- t

lecular de bases (figura 5.7). Por lo tanto, los programas que investi- (
gan estas estructuras en secuencias de DNA identifican regiones donde I
podría haber genes de RNA funcionales. Estos programas incorporan I

reglas termodinámicas que permiten estimar la estabilidad de una C

estructura tallo-bucle, teniendo en cuenta características como el tama- C

ño del bucle, la cantidad de pares de bases del tallo y la proporción de t

pares de bases G-C (que son más estables que los pares A-T pues se
mantienen unidas por tres enlaces de hidrógeno, en lugar de dos; véase (
figura 1.8). Se considera que una presunta estructura tallo-bucle con
una estabilidad estimada superior a un límite elegido es un posible
indicador de la presencia de un gen de RNA funcional.
AU
Al igual que en los genes que codifican proteínas, se puede efectuar
AG una búsqueda de las secuencias reguladoras asociadas con genes de
UU
LU RNA funcionales. Estas secuencias reguladoras son diferentes de las ¡.
G--C de los genes que codifican proteínas y pueden estar presentes denlro
A__U
U*.A de un gen de RNA funcional, así como corriente arriba de éste.
G--C.
G*-C En genomas compactos, se dirige la atención a las regiones que que- (r
a--c dan después de una búsqueda completa de genes que codifican
¡t=AUA G6Cn¡i
proteínas. A menudo, estos "espacios vacíos" no están vacíos en
absoluto y un examen cuidadoso revelará la presencia de uno o
más genes de RNA funcionales.
Figura 5.7 Estructura típica tallo-
bucle de RNA.
 . Localización de los genes en la secuencia de un genoma

La búsqued* de izarnología y la genúmica comparaiivo aporton

una dimensión extrc a la inspecdón de secuencias

Lamayorlade los diversos programas de sofware existentes para la localtza-

ción de genes por barrido de ORF permiten identificar hasta el 95o/o de[as
regiones codificantes de un genoma eucarionte, pefo aun los mejores tienden
u óom.t"t effores frecuentes en la ubicación de los lÍmites exón-intrón, y la
identificación de ORF espurios como genes reales todavía es un problema
importante. Estas limitaciones pueden ser compensadas, e1 cieta medida,
ooi la búsqueda de homología para investigar si una serie de tripletes es un
áxón real o una secuencia fortuita. En este análisis, se investigan bases de
datos de DNA para determinar si la secuencia de prueba es idéntica o simi-
lar a algún gen que ya ha sido secuenciado. Sin duda, si la secuencia de prue-
ba forma parte de un gen que ya ha sido secuenciado por alguien más, habrá
una coincidencia exacta, pero éste no es el objetivo de la búsqueda de homo-
logía. Por el contrario, su intención es determinar si una secuencia completa-
mente nueva es similar a algún gen conocido porque, si es así, hay una
probabilidad de que las secuencias de prueba y la comparable sean homólo'
gas, 1o que significa que representan genes relacionados desde el prlnto de
üsta evolutivo. La principal aplicación de la búsqueda de homología es asig-
nar funciones a genes recién descubiertos, y se volverá a tratar, por 1o tanto,
al considerar este aspecto del análisis del genoma más adelante en este capí-
tulo (sección 5.2.1). La técnica también es fundamental para la localizaaón
de genes, porque permite investigar la funcionalidad de secuencias tentativas
de exones localizadas por barrido de ORE Si la secuencia exónica tentativa
muestra una o más coincidencias positivas tras una búsqueda de homología,
es probable que sea un exón, pero si no tiene ninguna coincidencia, se debe
dudar de su autenticidad hasta que sea evaluada por una u otra de las técni-
cas experimentales de localización de genes.

Cuando se dispone de secuencias genómicas de dos o más especies relacio-

nadas, es posible una versión más precisa de la búsqueda de homología. [,as
especies relacionadas tienen genomas que comparten similitudes heredadas
de su ancestro común, superpuestas con diferencias específicas de especie
que han surgido desde que las especies comenzaron a evolucionar de mane-
ra independiente (figura 5.8). Debido a la selección natural (sección 19.3.2),
las similitudes de secuencia entre genomas relacionados son máximas dentro
de los genes y mÍnimas en las regiones intergénicas. Por 1o tanto, cuando se
comparan genomas relacionados, es fácil identificar genes homólogos porque
tienen alta similitud de secuencias, y se puede considerar casi con certeza que

(A) Organización del gen

Figura 5.8 Las especies relaciona-
Ai.Di das tienen genomas similares. (A)
¡E É¡ Ancestro Se ilustra cómo podría cambiar la orga-
nización de un gen a medida que dos
1\ común
especies divergen de su ancestro
común. El ancestro común tiene cinco
:;:aÉ.'SaD genes designados de A a E. En una de
las especies derivadas, el gen C ya no
relacionadas está presente y en la otra especie, el
gen A ha sido truncado. (B) Las espe-
cies relacionadas presentan similitudes
(B) Secuencias de DNA en la secuencia de DNA. El diagrama
muestra una sección corta de una
- GACAGTTAGCAATCGGAT- Ancestro secuencia de un gen de un organismo
común ancestral, junto con las secuencias
homólogas para este segmento del gen
/\ en las especies derivadas. Véase una
descripción más completa de la evolu-
- - GATAGTTATCA ATc C GAT- . . GACAG CTATCAATC CG A A- Especies
ción de los genomas en el capÍtulo 18.
relacionadas
 Capítulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma
-

Genoma anotado Genomas relacionados

Figura 5.9 Comparación con geno-
mas sintéticos para investigar la
autenticidad de un ORF corto. En
este ejemplo, el ORF está presente en
tres de los cuatro genomas relaciona-
ORF corto
dos y, por Io tanto, es probable que a¡

sea un gen genuino.

cualquier ORF que no tenga un claro homólogo en el segundo genoma es una

secuencia fortuita y no un gen genuino. Este tipo de análisis -denominado
genómica eomparativa- está resultando muy valioso paralocalizar genes en
Figura 5.IO Presentación de un siste-
ma de anotacíón de genoma típico. el genoma de Soccltaromyces cereyisiae (sección 5.3), pues ahora hay
El ejemplo mostrado es la anotación secuencias completas o parciales no sólo para esta levadura, sino también
del navegador Cenotator de un seg- para offos 16 miembros del Hemiascomycetes, entre ellos, Saccharomyces
mento de l5 kb del genoma humano, paradoxus, Saccharomyces míkatae y Sacchoromyces bayanus, las especies
que contiene un gen de factor tisular. más estrechamente relacionadas con § cereyísioe. La comparación entre
Desde la parte superior, los análisis estos genomas ha confirmado la autenticidad de una serie de ORF de S. cere-
son: localizaciones de posibles promo-
visíae y también permitió eliminar casi 500 presuntos ORF del catálogo de
tores (elementos reguladores corriente
aniba); secuencias correspondientes a S. cerevísiae sobre la base de que no tienen equivalentes en los genomas rela-
proteínas de la base de datos cionados. El análisis se toma aún más poderoso por la sintenía --conserva-
CenPept; secuencias correspondientes ción del orden de los genes- presentada por los genomas de estas levaduras
a EST conocidas (véase sección 3.3.3); relacionadas. Si bien cada genoma ha sufrido sus propios reordenamientos
localización de secuencias repet¡das específicos de especie, todavía hay regiones sustanciales donde el orden de
humanas, conocidas; predicciones los genes del genoma de S. cerevísiaees el mismo que el observado en uno o
sobre exones mediante los programas
más de los genomas relacionados. Esto facilita mucho la identificación de
Censcan, Cenefinder, CRAIL y Cenie;
secuencias correspondientes a genes genes homólogos, pero lo más importante es que permite descartar con gran
conocidos de la base de datos confianza un ORF espurio, sobre todo uno corto, porque se puede buscar en
CenBank; y ORF de cada uno de los detalle su localización esperada en un genoma relacionado para asegurarse
tres marcos de lectura. Por debajo de de que no hay ningun equivalente (figura 5.9).
Ia línea negra, se repiten los análisis
para el complemento inverso de la
sequencia de DNA. La anotación revela A¡=at*úón üulamúti{G de los setueñci#s rie geno,nas
las posiciones de cinco posibles exo- Una gran ventaja de los enfoques computarizados para local:zat genes es la
nes, indicadas por las flechas negras
posibilidad de combinar una serie de programas analíticos en un solo siste-
en la parte superior de la figura.
lmagen cortesía de Nomi Harris. ma integrado. Así, se pueden llevar a cabo en paralelo diferentes enfoques

-=
::

+ + + + + =
Promotores ill ¡t lt tt tt I I I tt lil =
Eventos CenPept II t r rt IT t+

IvenÍcs [5I i t: ::= ::

:É

¡rtrE :: ::
:¡§

Gunraun I re=* g e
Cenefi¡¡de¡ '§
CF.q¡L = =
Cenie I I I *T E a
CD5 I =
Cen.3ank * § Ég a :1

ORF
s
§
ORF €
CenS;:nk iü5 '.i+
l:.E
,11
Cenie
E
=;
ci{¡,1!_ !

i,¡r:=ii¡ r:ir:l
c
ie¡:r.:ir f--
=
:: :!.,.it,r i :,:, i ! ,tt
Eventos CenPept II ':,E

Promotores tlt t¡ tt ,t ,á
r*

é-
 Localización de los genes en la secuencia de un genoma

n^ralalocalización de genes y comparar automáticamente los resultados, de

y completa. La ano-
iná¿o qu" el genoma en estudio se anota en forma rápida
con el análisis de la secuen-
ticiónáel genoma con estos sistemas comienza
límites exón-intrón y secuencias
áia mediante programas que estudian ORR
,"*tu¿o.ut corriente arnba; investigan homología de los ORF con genes de
tu"r.r a. datos; y buscan secuencias repetidas y otras características distinti-
,as de los genes de RNA funcionales. También se podúan estudiar las bases
de datos dé secuencias de cDNA
(véase más adelante) para detectar algún
sesmento que coincida con la secuencia del genoma; cualquiera de estas coin-
indica una región que es transcrita a mRNA. Después, se integra la
información a una üsualizaciÓn computarizada que muestra las localizacio-
"iá'"ncias
nes de las diversas caracteústicas de la secuencia determinadas
por los dife-
rentes programas (figura 5.10). A menudo, se puede acceder a la k" @ LelUlaS

informaiión resultante por Internet y, por lo tanto, puede ser utilizada por ée
ffi
otros investigadores para planificar sus propios estudios computarizados más
detallados o experimentales de regiones específicas de un genoma. I Extraer RNA
*I
5.L3 ?ácnlcas exP€r;?¡?entales para la /-^ts ? --
loccE=zaei$n de g€{:€= f \Jr {'-
¡ \-
o\ t / -
La mayoría de los métodos experimentales para localizar genes no están
basados en el examen directo de moléculas de DNA, sino en la detección I Electroforesis en gel de agarosa
de moléculas de RNA transcritas a partir de genes. Todos los genes son I con agente de desnaturalización
transcritos a RNA y, si el gen es discontinuo, se procesa después el trans-
crito primario para eliminar los intrones y unir los exones (secciones 1.2.5 '- :.=''

y tZ.2.D. Por consiguiente, es posible utilizar las técnicas que mapean las
posiciones de las secuencias transcritas de un fragmento de DNA para
Tocalizar exones y genes completos. El único problema que se debe tener
en cuenta es que el transcrito suele ser más largo que la parte codificante I Transferencia. hibridación

del gen, pues comienzavartas decenas de nucleótidos corriente arriba del I northern, autonadiografía

codón de iniciación y continúa varias decenas o cientos de nucleótidos

corriente abajo del codón de terminación. Así, si bien el análisis de trans-
critos no aporta una definición precisa del comienzo y el final de la región La sonda de DNA se hibrida
a un solo transcrito de RNA
de codificación de un gen, indica que hay un gen en una determinada
región y permite localizar los límites exón-intrón. A menudo, esta infor-
mación es suficiente para delinear la región de codificación.

Las pru*bos ri* hlbridacíon pueden determinar si un ftagment* Figura 5.ll Hibridación northern. Se
oáaica electroforesis de un extracto de
coniisr?e secueñcrú s trl nscrita s hruR condiciones de desnaturaliza-
Los procedimientos más simples para estudiar las secuencias transcritas se ción, "n
en un gel de agarosa (véase Nota
basan en el análisis de hibridación. Las moléculas de RNA pueden ser sepa- sobre técnicas 5.1). Tras la tinción con
radas mediante formas especializadas de eleckoforesis en gel de agarosa, bromuro de etidio, se observan dos
transferidas a una membrana de nitrocelulosa o de nailon y examinadas por bandas. Éstas son las dos moléculas de
rRNA más grandes (sección 1.2.2), que
el proceso denominado hibridación northern (véase Nota sobre técnicas
son abundantes en la mayoría de las
5.1). Ésta difiere de la hibridación Southem (sección 2.1.2) sólo por las con- células. Los rRNA más pequeños, que
diciones precisas en las que se lleva a cabo la transferencia, y porque no fue también son abundantes, no se visuali-
inventada por un doctor Northem y, por lo tanto, la "r't" no se escribe con zan porque son tan cortos que corren
mayúscula. Si se realiza un sondaje de una transferencia northem de RNA fuera de la parte inferior del gel y, en la
celular con un fragmento marcado del genoma, se detectarán los RNA trans- mayoría de las células, ninguno de los
critos a paftir de genes dentro de ese fragmento (figura 5.11). Por consiguien- mRNA es suficientemente abundante
para formar una banda visible después
te, en teoría, la hibridación northem es un medio de determinar la cantidad
de la tinclón con bromuro de etidio. Se
de genes presentes en un fragmento de DNA y el tamaño de cada región de transfiere el gel a una membrana de
codificación. Este enfoque tiene dos puntos débiles: nailon y, en este ejemplo, se emplea
r como sonda un fragmento de DNA
Ciertos genes individuales dan origen a dos o más transcritos de dife- marcado radiactivamente. En la autorra-
rentes longitudes, porque algunos de sus exones son opcionales y diografía, sólo se visualiza una banda, lo
pueden estar conservados en el RNA maduro o no (sección 12.2.2). que indica que elfragmento de DNA
En este caso, pn fragmento que contiene sólo un gen podría detectar utilizado como sonda contiene parte de
dos o más bandas de hibridación en la transferencia northern. Puede una secuencia transcrita o su totalidad.
t46 Capítulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma

surgir un problema similar si el gen es un miembro de una familia

multigénica (sección 7.2.3).

" En muchas especies, no es práctico hacer una preparación de mRNA de

todo un organismo, de modo que el extracto se obtiene de un solo órga-
no o tejido. En consecuencia, cualquier gen no expresado por ese órga-
no o tejido no estará representado en la población de RNA y, así, no será
detectado cuando se efectúe el sondaje del RNA con el fragmento de
DNA en estudio. Aunque se utilizara todo el organismo, no todos los
genes daúan señales de hibridación, porque muchos son expresados sólo
en un estadio particular del desarrollo y otros tienen expresión débil, lo
que significa que sus productos RNA están presentes en concentraciones
demasiado bajas para ser detectadas por análisis de hibridación.

Un segundo tipo de análisis de hibridación evita los problemas de los

genes escasamente expresados y específicos de tejido al investigar, no los
RNA, sino las secuencias relacionadas de los DNA de otros organismos.
Este enfoque, al igual que la búsqueda de homología, se basa en que los
genes homólogos de organismos relacionados tienen secuencias simila-

Nota sobre técnicas 5.1 Técnicas para el estudio de RNA

Muchas de los técnicos diseñados poro estudior moléculos de DNA pueden odoptarse poro
utilizarlos con RNA

La electroforesis en gel de agarosa del RNA se lleva a
cabo después de su desnaturalización, de manera que la
velocidad de migración de cada molécula depende por
completo de su longitud y no es afectada por los pares
de bases intramoleculares que se pueden formar en
muchos RNA (p. ej., figura 13.2). Se añade a la muestra
el agente de desnaturalización, en general formaldehído
o glioxal, antes de cargarla en el gel.
Hibridación northern hace referencia al procedimiento por
el cual se transfiere un gel con RNA a una membrana de
nailon y se lo hibrida a una sonda marcada (véase figura
5.11). Es un equivalente de la hibridación Southern (véase
figura 2. 11) y se practica de manera similar.
Por lo general, las moléculas de RNA marcadas se prepa-
ran copiando un molde de DNA en RNA, en presencia de
un ribonucleótido marcado. Se utilizan enzimas RNA poli-
merasas de bacteriófagos SP6, T3 o T7, porque pueden
producir hasta 30 pg de RNA marcado a partir de 1 pg de
DNA en 3O minutos. El RNA también puede ser marcado
en su extremo por tratamiento con poli(A) polimerasa
purificada (sección 12.2.1).
La PCR de moléculas de RNA exige modificar el primer
paso de la reacción normal. La Taq polimerasa no puede
copiar una molécula de RNA, de modo que el primer
paso es catalizado por una transcriptasa inversa, que fabri-
ca una copia de DNA del molde de RNA. Después, la Iog
polimerasa amplifica esta copia de DNA. La técnica se
denomina PCR con transcriptasa inversa, o RT-PCR. El
descubrimiento de enzimas termoestables que generan
copias de moldes tanto de RNA como de DNA (p. ej., la
f¿h DNA polimerasa de la bacteria Thermus thermophi-
/us) plantea la posibilidad de efectuar una RT-PCR en una
sola reacción con sólo una enzima.
Existen métodos de secuenciación de RNA, pero son difíci-
les de practicar y sólo son aplicables ¿ moléculas pequeñas.
Los métodos son similares a la secuenciación por degrada-
ción química del DNA (sección 4.1.2), pero emplean endo-
nucleasas especificas de secuencia, en lugar de sustancias
químicas, para escindir las moléculas. En la práctica, la
secuencia de una molécula de RNA se suele obtener por
conversión en su cDNA (véase figura 3.36) y secuenciación
por el método enzimático (sección 4.'l.l).
Se han ideado métodos especializados para mapear las
posiciones de moléculas de RNA sobre secuencias de
DNA; por ejemplo, para determinar los puntos inicial y
final de la transcripción, y localizar las posiciones de los
intrones en una secuencia de DNA. En la sección 5.1.2 se
describen estos métodos.
La única deficiencia importante en la serie de instrumentos
para RNA es la ausencia de enzimas con el grado de espe-
cificidad de secuencia molrado por las endonucleasas de
restricción, que son tan importantes en las manipulaciones
de DNA. Aparte de esto, la única desventaja de trabajar con
RNA es la facilidad con que los RNA son degradados por las
ribonucleasas liberadas cuando se rompen las células (como
sucede durante la extracción de RNA), y que también están
presentes en las manos de los empleados de laboratorio y
tienden a contaminar los objetos de vidrio y las soluciones.
Esto implica que se deben adoptar procedimientos de labo-
ratorio rigurosos (p. ej., limpieza de los objetos de vidrio con
sustancias químicas que destruyan las ribonucleasas) para
mantener intactas las moléculas de RNA.
 Localización de los genes en la secuencia de un genoma 147

res, mientras que el DNA intergénico suele ser bastante diferente. Si se

emplea un fragmento de DNA de una especie como sonda para una
transferencia Southem de DNA de especies relacionadas y se obtienen
una o más señales de hibridación, es probable que la sonda contenga
uno o más genes (figura 5.12). Esto se denomina zootransferencia.
Ser humano Chimpancé Coneio

secü-oi,'ci*ción riel r}iiA p*rrlift€ nlcFect g€n€s centro

I
lo ¡
de íragmentas de DNA I
I
I
¡
Lahibidación northem y la zootransferencia peimiten determinar la pre- § E

sencia o la ausencia de genes en un fragmento de DNA, pero no aportan

Marcadores
información posicional sobre la localización de esos genes en la secuencia de DNA
de DNA. La manera más fácil de obtener esta información es secuenciar
los cDNA pertinentes. Un cDNA es una eopia de un mRNA (véase figura
3.36) y, por lo tanto, corresponde a la región de codificación de un gen,
más cualquier secuencia líder o tráiler que también sea transcrita. Así, la
Hibridación Southern con
comparación de una secuencia de oDNA con una secuencia de DNA genó- sonda de DNA humano
mico delinea la posición del gen pertinente y revela los límites exón-intrón.

Para obtener un cDNA indMdual, se debe preparar primero una genoteca

de cDNA a partfu de todos los mRNA del tejido en estudio. Una vez pre-
parada la genoteca, el éxito de la secuenciación del oDNA como medio de
localización de genes depende de dos factores. El primero está relacionado
con la frecuencia de los cDNA deseados en la genoteca. Al igual que en la La sonda se hibrida
a todas las muestras de DNA
hibridación northern, el problema se üncula con los diferentes niveles de
expresión de distintos genes. Si el fragmento de DNA en estudio contiene
uno o más genes escasamente expresados, los cDNA pertinentes serán Figura 5.12 Zootransferencia. El obje-
raros en la genoteca y podría ser necesario investigar muchos clones antes tivo es determinar si un fragmento de
de identificar el deseado. Para superar este problema, se han diseñado DNA humano se hibrida a DNA de
diversos métodos de captura de cDNA o selección de cDNA, en los que el especies relacionadas. Por lo tanto, se
fragmento de DNA en estudio se hibrida en forma reiterada con la mezcla preparan muestras de DNA humano,
de chimpancé, de vaca y de conejo, se
de cDNA para enriquecer la mezcla con los clones deseados. Como lamez-
las somete a restricción y a electrofore-
cla de cDNA contiene tantas secuencias diferentes, estas hibridaciones rei-
sis en gel de agarosa. Después, se
teradas por lo general no permiten descartar todos los genes irrelevantes, lleva a cabo hibridación Southern con
pero es posible aumentar de manera significativa la frecuencia de los clo- un fragmento de DNA humano como
nes que se hibridan específicamente al fragmento de DNA. Esto disminuye sonda. Se observa una señal de hibri-
el tamaño de la genoteca que debe ser investigada, después, en condiciones dación positiva con todos los DNA ani-
estrictas para identificar los clones deseados. males, lo que sugiere que el fragmento
de DNA humano contiene un gen
expresado. Obsérvese que los frag-
Un segundo factor que determina el éxito o el fracaso es qué tan com- mentos de restricción hibridados de los
pleta está cada molécula de cDNA. Por 1o general, los cDNA se obtie- DNA de vaca y de conejo son más
nen copiando moléculas de RNA a DNA de una sola cadena mediante pequeños que los fragmentos hibrida-
transcriptasa inversa y convirtiendo después el DNA monocatenario en dos en las muestras de ser humano y
DNA bicatenario con una DNA polimerasa (véase figura 3.36). Siempre chimpancé. Esto indica que el mapa
hay una probabilidad de que una u otra de las reacciones de síntesis de de restricción alrededor de Ia secuen-
cia transcrita es diferente en vacas y
cadena no avance hasta ser completada, lo que determina un cDNA
conejos, pero no afecta la conclusión
truncado. La presencia de pares de bases intramoleculares en el RNA de que hay un gen homólogo en las
también puede causar un copiado incompleto. Los cDNA truncados cuatro especies.
pueden carecer de parte de la información neces aria para localizar los
puntos inicial y final de un gen, y todos sus límites exón-intrón.

Hay mélodos psra el mopea precíso de {os extremos

de los tronscritos
Los problemas causados por los cDNA incompletos indican que se requie-
ren métodos más sólidos para localizar los puntos precisos de comienzo y
terminación de los transcritos de genes. Una posibilidad es un tipo especial
de PCR que utiliza RNA en lugar de DNA como material inicial. El primer
r48 CapÍtulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma

-i' RiiÁ paso de este tipo de PCR consiste en convertir eI RNA en cDNA con trans-
¡ Hibridar un criptasa inversa, tras 1o cual se amplifica el cDNA con Taq polimerasa de
I cebador DNA la misma manera que en una PCR normal. Estos métodos reciben la deno-
J minación colectiva de PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), pero la
tt! versión particular que nos interesa ahora es la amplificación rápida de
- Síntesis de cDNA extremos de cDNA (rapid amplification of cDNA ends, RACE). En la
I con transcriptasa forma más simple de este método, uno de los cebadores es específico para
una región interna cercana al comienzo del gen en estudio. Este cebador se
une al mRNA del gen y dirige la primera etapa del proceso catalizada por
transcriptasa inversa, durante la cual se fabrica un cDNA correspondiente
al comienzo del mRNA (figura 5.I3). Como sólo se está copiando un
pequeño segmento del mRNA, la expectativa es que no se produzca vna
terminación prematura de la síntesis de cDNA, de modo que un extremo
::L_ *_ del cDNA se corresponderá exactamente con el comienzo del mRNA. Una
vez f.abncado el cDNA, se une una cola de poli(A) corta a su extremo 3'.
EI segundo cebador se hibrida a esta secuencia de poli(A) y, durante el pri-
,i\)ii.|'j]=1, mer ciclo de la PCR normal, convierte el cDNA de una sola cadena en una
J molécula de doble cadena que, después, se amplifica a medida que prosi-
¡ AgregarA al extremo 5' gue la PCR. La secuencia de esta molécula amplificada revelará la posición
J con transferasa terminal precisa del comienzo del transcrito.

3' Otros métodos para el mapeo preciso de transcritos comprenden el análi-

I Hibridar el cebador sis de heterodúplex. Si la región de DNA estudiada es clonada como un
I de anclaie
fragmento de restricción en un vector M15 (sección 4.1.1,), se la puede
.l'/ \.

i
,,.. ' -,;..i \ obtener como DNA monocatenario. Cuando se mezcla con una prepara-
'i AAAAA\\NN=E; ción apropiada de RNA, la secuencia transcrita del DNA clonado se hibri-
\1'I
t\-l
.\_--l
dará con el mRNA equivalente y formará un heterodúplex de doble cadena.
En el ejemplo ilustrado en la figura 5.14, el comienzo de este mRNA resi-
de dentro del fragmento de restricción clonado, de manera que parte de
éste participa en el heterodúplex, pero el resto no. Se pueden digerir las
:.:i-
regiones monocatenarias por tratamiento con una nucleasa específica de
I Síntesis de la segunda una sola cadena, como 51. El tamaño del heterodúplex se determina degra-
I cadena con loq polimerasa
dando el componente de RNA con álcaliy practicando electroforesis en gel
i j.:.: il-:.-i-¡=1 l-:.¡ ¡ I de agarosa del DNA de una sola cadena resultante. Después, se emplea esta
determinación del tamaño para ubicar el comienzo del transcrito respecto
I
+ del sitio de restricción al final del fragmento clonado.
Continuar como para una PCR estándar

::,.-L.'.-
,'J.'ll-l=-l':5? ,-;-.,,
1,,1.'=,j=;J
:-.-^!, ;-;.',^ j j,-jr
LJ L.-rj, i:^-^ =!.,riii/'i i.., jr¿:-, - F -" : - :..- .'
!.,-,,;.,
,'iij
..
-.ruj;j =.íí-.!ij-,'¡jj-ri,i.:
Figura 5.15 RACE: amplificación rápi- El análisis de heterodúplex también ," p.r"d" ttilizar paru localizar los
da de extremos de cDNA. Se convier- límites exón-intrón. El método es casi igual al ilustrado en la figura 5. 14,
te el RNA estudiado en cDNA parcial excepto que el fragmento de restricción clonado abarca el límite exón-
por extensión de un cebador DNA que
intrón que se está mapeando, en lugar del comienzo del transcrito.
se hibrida en una posición interna no
demasiado alejada del extremo 5' de
la molécula. Se extiende aún más el Un segundo método para hallar exones en la secuencia de un genoma
extremo 3' del cDNA por tratamiento se denomina atrapamiento de exones. Éste requiere un tipo especial de
con desoxinucleotidiltransferasa termi- vector que contiene un minigén formado por dos exones que flanquean
nal (sección 2.1.4) en presencia de
una secuencia intrónica, y el primer exón está precedido por las seña-
dATP, lo que determina el agregado de
una serie de A al cDNA. Esta serie de A les de secuencia necesarias para iniciar la transcripción en una cé1ula
actúa como sitio de hibridación para el eucarionte (figura 5.15). Para emplear este vector, se inserta el fuag'
cebador de anclaje. La extensión del mento de DNA que va a ser estudiado en un sitio de restricción locali-
cebador de anclaje genera una molé- zado dentro de la región del intrón del vector. Después, se introduce el
cula de DNA bicatenario, que ahora vector en una línea de células eucariontes adecuada, donde es transcri-
puede ser amplificada por una PCR to y donde el RNA producido a parti de éste se corta y empaima. El
estándar. Esto es una S'-RACE, así lla-
resultado es que cualquier exón contenido en el fragmento genómico se
mada porque amplifica el extremo 5'
del RNA inicial. Se puede emplear un une entre los exones corriente arriba y corriente abajo del minigén.
método similar -3'-RACE- si se desea Ahora, se practica RT-PCR con cebadores que se hibridan dentro de los
la secuencia 3'. exones del minigén para amplificar un fragmento de DNA, que se .e
 Determinación de las funciones de cada gen

minar las posiciones nucleotídicas en las que comienza y termina el exón RI R2

insertado, lo que delinea con precisión este exón. Irasrnento de restricción

de +00 pb

¡ ¡= E-i, :+-=r=1-"=gi*:=
.-i:_--+;i iÉ==:+HG;'#¡= flÉ
-=-i:r- EeS
;-= á*=ti.*f:eS
ji;B'*'ii+J =+-* {#*=
*.= +e I Clonar el fragmento
3..i ==
=**li J de restricción en Ml3
tJnavez que se halocalizado un nuevo gen en la secuencia de un geno-
-*)
ma, se debe encarar el tema de su función. Esto se está convirtiendo
en un área importante de la investigación en genómica, pues los pro-
ff DNA monocatenario

vectos de secuenciación completados han revelado que sabemos bas-

\/
lante menos de lo que pensábamos sobre el contenido de los genomas Hibridar RNA
individuales. Por ejemplo, antes del advenimiento de los proyectos de I
secuenciación, se estudiaron de manera intensiva Esckerichio co/i y
Saccharomyces cerevisiae mediante análisis genético convencional y
los genetistas estaban entonces bastante confiados en que se había
identificado la mayoría de los genes. Las secuencias de los genomas
revelaron que, de hecho, hay grandes deficiencias en nuestro conoci-
miento. De los 4.288 genes que codifican proteínas en la secuencia del I Nucleasa Sl, degrada todas las

genoma de E. coli, sólo se habían identificado | .853 (43o/o del total). En ! regiones de una sola cadena

el caso de S. cerevisiae,la cifra era de s6lo el3Ook. R2

--,..--;.:-.,1
.!
l-r-&él
--
Como en el caso de la localización de genes, los intentos de determinar
las funciones de genes desconocidos se efectúan mediante análisis com- I Álcali, degrada RNA
putarizado y estudios experimentales. +
R2

=*-t
! Medir el DNA por
Ya hemos observado que el análisis computarizado desempeña un papel ! electroforesis, p. ej.,2oo pb

importante paralocalizar genes en secuencias de DNA, y que uno de los ins-

trumentos más poderosos para este propósito es la búsqueda de homología,
que localüa genes comparando la secuencia de DNA en estudio con todas las
demás secuencias de DNA de bases de datos. El fundamento de la búsqueda
de homología es que genes relacionados tienen secuencias similares y, así, es de la transcripción
posible descubrir un nuevo gen en virtud de su similitud con un gen ya
secuenciado, equivalente, de un organismo diferente. Ahora consideraremos Fígura 5.14 Mapeo con nucleasa Sl.
en forma más exhaustiva el análisis de homología y veremos cómo se puede Este método de mapeo de transcritos
u¡lizar para asignar una función a un nuevo gen. utiliza la nucleasa S1, una enzima que
degrada polinucleótidos DNA o RNA de
una sola cadena, incluidas las regiones
L<;lzam*lagío reff*j* relsciancs evalutivcs monocatenarias de moléculas predomi-
nantemente de doble cadena, pero no
Los genes homólogos son los que comparten un ancestro evolutivo
ejerce ningún efecto sobre DNA bicate-
común, revelado por las similitudes de secuencia entre los genes. Estas nario nisobre híbridos DNA-RNA. En el
similitudes representan los datos sobre los que se basa la filogenia mole- ejemplo ilustrado, se liga un fragmento
cular, como se verá en el capítulo 19. Los genes homólogos pertenecen de restricción que abarca el comienzo
a dos categorías (figura 5.16): de una unidad de transcripción a un
vector M l3, y se hibrida el DNA de una
Los genes ortólogos son aquellos homólogos que están presentes en sola cadena resultante con una prepa-
diferentes organismos y cuyo ancestro común antecede a la división ración de RNA. Tras el tratamiento con
entre las especies. Por lo general, los genes ortólogos cumplen fun- nucleasa Sl, el heterodúplex generado
ciones iguales o muy similares. Por ejemplo, los genes de la mioglo- tiene un extremo marcado por el
bina de los seres humanos y de los chimpancés son ortólogos. comienzo del transcrito y el otro, por el
sitio de restricción (R2) corriente abajo.
Los genes parálogos están presentes en el mismo organismo, a menu- Por lo tanto, se mide el tamaño del
do como miembros de una familia multigénica reconocida (sección fragmento de DNA no digerido median-
7,2.3), y su ancestro común puede anteceder, o no, a las especies en te electroforesis en gel para determinar
la posición del comienzo de la unidad
Ias que ahora se encuentran los genes. Por ejemplo, los genes de la
de transcripción respecto del sitio de
mioglobina y la B-globina de los seres humanos son parálogos: se ori- restricción corriente abajo.
 150 Capítulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma

Vector trampa de exones p ginaron por duplicación de un gen ancestral hace alrededor de 55O 5
millones de años (sección 18.2.1).
!
.=-,E-::::- s

I lnsertar Dl,.i nL¡crr.

Por lo general, un par de genes homólogos no tiene secuencias nucleotí- lr

I dicas idénticas, porque los dos genes presentan diferentes cambios alea-
RR torios por mutación, pero tienen secuencias similares porque estos
cambios aleatorios han actuado sobre la misma secuencia inicial: el gen
5r
t lntroducir en huésoed ancestral común. La búsqueda de homología aprovecha estas similitudes
I eucarionte, ru proáu.. de secuencia. La base del análisis es que si un gen recién secuenciado 5,
la transcripción
resulta ser similar a un gen secuenciado antes, es posible inferir una rela-
-_ ción evolutiva, y es probable que la función del nuevo gen sea igual, o
,!;!,1L,:r.i l,: ñ ra por lo menos similar, a la función del gen conocido.
I Corte y empalme
¿ Es importante no confundir las palabras homologíay similitud. Es inco-
rrecto afirmar que un par de genes relacionados tienen "homogía del
BOa/o" si sus secuencias presentan una identidad de nucléotidos del 80%
Cebacjores p¿ra RI-PCR
(figura 5.17). Un par de genes está relacionado evolutivamente o no; no
hay situaciones intermedias y, por lo tanto, no tiene sentido asignar un
valor porcentual a la homología.

Ef aná!ísis de homo{agío puede Gportzr información sabrc lc

á!:5 Secuenciaspromotoras
{unción de t*do un gen o de segrnenfrs de éste
-É
--" txon Se puede efectuar una búsqueda de homología con una secuencia de
R
....,.i ... _
DNA, pero en general se convierte una secuencia tentativa de un gen en
Sitio de restricción
una secuencia de aminoácidos antes de llevar a cabo la búsqueda. Una
de las razones de esta conversión es que hay 20 aminoácidos diferentes
en las proteínas, pero sólo cuatro nucleótidos en el DNA, de manera que
los genes no relacionados no parecen más diferentes entre sí cuando se
Figura 5.15 Atrapamiento de exones. comparan sus secuencias de aminoácidos (figura 5.18). Por lo tanto, es
El vector trampa de exones consiste en menos probable que una búsqueda de homología dé resultados falsos si
dos secuencias de exones precedidas se emplea la secuencia de aminoácidos.
por secuenc¡as promotoras: las señales
requeridas para la expresión de genes Un programa de búsqueda de homología comienza por efectuar alinea-
en un huésped eucarionte (sección
ciones entre la secuencia investigada y las secuencias de las bases de
11.2.2). Se liga DNA nuevo que contie-
ne un exón no mapeado al vector y se datos. Para cada alineación, se calcula una puntuación, a partir de la
introduce la molécula recombinante en cual el operador puede evaluar la probabilidad de que las secuencias
la célula huésped. Después, se examina investigada y de prueba sean homólogas. Hay dos maneras de generar la
por RT-PCR eltranscrito de RNA resul- puntuación:
tante para identificar los límites del
exón no mapeado. " Los programas más simples cuentan el número de posiciones en las
que se encuentra el mismo aminoácido en ambas secuencias. Este
número, cuando se lo convierte en un porcentaje, aporta el grado de
idenfídad entre las dos secuencias.
* Los programas más sofisticados emplean la relación química entre ami
noácidos no idénticos para asignar una puntuación a cada posición de
la alineación: una puntuación más alta para aminoácidos idénticos o
estrechamente relacionados (p. ej., leucina e isoleucina, o ácido aspár-

Gen ancestral

1t \ Duplicación del gen

--------.-----_ +
I

Especie 2 PARALOGOS

Figura 5.16 Genes ortólogos y

parálogos. ORTÓLOGOS
 Determinación de las funciones de cada gen l5l

J: S
-iG
A13: G Ti:C Á 1 C ] ¿ iI: TG C;'iA; Á. . T C 1 T G G; A ¡ A i G G '1'iT i i:] I Fisura 5.17 Dos secuencias de DNA
.^. f.i r- .r..Á' Ta A CAa -iACA: a -: TA -ia' c cG ia Tae,: A!i a §: r
r§a ¡ iluv
Secuencia 2
it LL!.srr5l/ ^
**'<**a*** *** *** *Ít*i***t co"n identidad de secuencias del 8oo/o.
x*x *-* +x* ** **i**
ldentidades

G A i' G H !: L R L :1 A'' S F E i A G

TAG'A:CG€GA'iCA;rTC'1 Gt¡l!C¡'G'-' Fisura 5.18 La falta de homología

Secuencia1a,G;GCAia-.GGTA-iGiGA'jTG'GA-i
rsLv- -
: q **?t*x *:** *t** ++ ***
*i +++ +ii*
*ti* ****x
****x **:
**i n*
n* ****
**** *i
*i * enlre dos secuencias suele ser más
evidente cuando las comparaciones
SCCUCNCiA,I'ATAC¡iCiC6;iTTTCi:AGCA;TTT'3CACGúíJGÁTGAT'iG'ÁCiiTGGA'C'':
F : G ]i l¡J L H :-: G A se efectúan en el nivel de los ami-
D T :' R I !t E E
noácidos. Se muestran dos secuen-
cias nucleotídicas, con nucleótidos
oue son idénticos en las dos secuen-
tico y asparagina) y una más bajl par.a aminoácidos menos relacionados cias ilustradas en verde y no idénticas
ip. cisteíña y tirosina, o fenilalanina y serina). Este análisis determi- en las dos ilustradas en rojo. Las dos
"j., secuencias nucleotídicas son idénticas
nu grado de similitud entre un par de secuencias'
"i en un 760lo, como indican los asteris-
cos. Esto se podría tomar como evi-
Para alcanzar la máxima puntuación posible, el algoritmo
introduce hia- dencia de que las secuencias son
;;r;;il;s posicionei d".mu o ambas secuencias, hasta límites fija- homólogas. Sin embargo, cuando las.
'' do, po, el opeiadof 1o que guarda paralelo con los procesos ql" :: secuencias son traducidas a aminoáct-
.o"ri¿"ru qué tienen lugai duiante la evolución de los genes, cuando se dos, la identidad disminuye al28o/o.
b9r1a¡ d.e un gen bloques de nucleótidos que codifi- Los aminoácidos idénticos se Presen-
;;;d;" inórtar oindividuales o adyacentes' tan en amarillo, y los no idénticos, en
' can aminoácidos pardo. La comparación entre secuen-
tias de aminoácidos sugiere que los
La practicidad de la búsqueda de homología no es en absoluto desalentado- qenes no son homólogos Y que la
,u.Auy varios p.ogra*uide software para este tipo deanálisis, de los cuales éim¡l¡tud en el nivel nucleotídico era
-et
.i Áa. pop"tai es BLAST (Basic Locol Alígnment Seorch Tool) . Es posi- fortuita. Para las secuencias de amino-
el análisis consultando simplemente una página web de alguna ácidos se usaron abreviaturas de una
Ut.
"t"ótuát letra (véase cuadro 1 .2).
áe hs bases de datos de DNA e ingresando la secuencia en el instrumento
de
f,irqreaa en línea. El programa nLeSf estándar es eficaz para identificar
g".r"s ho-Ologos con más del 3O-4Oo/o de similitud de secuencia, pero lo es
menos para reconocer relaciones evolutivas cuando la similitud es inferior a
(position-
este poicentaje. La versión modificada denominada PSI'BLAST
speitfic iterorád BLAST) identifica secuencias con relaciónmás distante com-
Éi.,u"¿o las secuencias homólogas de una búsqueda con eI BLAST estándar
en un per{il, cuyas característicai se emplean para identificar otras secuencias
homól,cgas que no fueron detectadas en la búsqueda inicial'

Drosophila fudor
Si bien la búsqueda de homología con el BLAST y programas similares ha
adquirido inménsa importancia para la investigación en genómica, es necesa-
rio reconocer sus limiáciones. Ún problema cadavezmayor es que las bases
de datos contienen genes cuyas funciones asignadas son incorrectas' Si se Drosophila homeless

identifica uno de estos genes como homólogo de la secuencia investigada,

entonces la función incorrecta pasará a esta nueva secuencia y se sumará al
problema. También hay varios óasos en los que genes homólogos tienen fun- AKAPl4g humana
óirn"s biológicas bastánte diferentes; por ejemplo, las proteínas cristalinas :==!s+.!i=:+:i::5=J

del cristaünJdel ojo, algunas de los cuales son homólogas con algunas enzi-
mas metabólicas. Por ldtanto, la homología entre una secuencia investigada
y una proteína cristalina no significa que la primera sea una proteína cristali-
Figura 5.19 Dominio tudor. El dibuio
na y, áe modo similar, una homología aparentemente eüdente entre una su-perior muestra la estructura de la pro-
secüencia investigada y una enzima metabólica qu:záno signifique que la teína tudor de Drosophilo, que contiene
secuencia investigada sea una erzhna metabólica. diez copias del dominio tudor. También
se hallá este dominio en una segunda
proteína homeless de Drosophilo y en
También hay ejemplos de genes que tienen secuencias similares, pero sin rela-
ia proteína de anclaje A-cinasa (AKAP
ción evolutivaévidente. En ocasiones, la explicación es que, aunque los genes
149) humana que participa en el meta-
no están relacionados, sus proteínas tienen funciones similares yla secuencia boliimo del RNA. Las proteínas tienen
compartida codifica un dominio dentro de cada proteína quees-fundamental estructuras disímiles fuera de la presen-
parlesa función compartida. Si bien los genes propiamente dichos no tienen cia del dominio tudor. La actividad de
ninún ancestro común, 1os dominios sí, pero Su ancestro común se remon- cada proteína involucra, de una manera
ta a una época muy antigUa, y los dominios homólogos han evolucionado des- u otra, el RNA.
t52 Capítulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma

pués no sólo por cambios de un solo nucleótido, sino también por reordená-
mientos más complejos que han creado nuevos genes dentro de los cuales se
encuentran los dominios (sección 18.2.1). Este tipo de homología, cuando se
la reconoce, puede aportar mucha información. Un ejemplo típico es el domi-
nio tudoq trn motivo de alrededor de'120 arninoácidos identificado por pri-
merayez en la secuencia del gen de Drosophila melanogasterdenominado
fudor. La proteÍna codificada por el gel,:t tudor, cuya firnción se desconoce,
está formada por diez copias del dominio tudor, una después de la otra (figu-
ra 5.19). Una búsqueda de homología con el dominio tudor como prueba
reveló que varias proteinas conocidas contienen este dominio. Las secuencias
de estas proteÍnas no son muy similares entre sí y no hay ninguna indicación
de que seanverdaderos homólogos, pero todas tienen el dominio tudor. Estas
proteÍnas comprenden una involucrada en el transporte de RNA durante la
ovogénesis de Drosopltila, una proteÍna humana que participa en el metabo-
lismo del RNA y otras cuyas actiüdades parecen involucrar el RNA de algu-
na manera. Por 1o tanto, el análisis de homología sugiere que la secuencia
tudor tiene alguna participación en la interacción entre la proteÍna y su sus-
trato RNA. La información del análisis computarizado es incompleta por sí
misma, pero señala los tipos de experimentos que se deben realizar para obte-
ner datos más definidos sobre la función del dominio tudor.

UtiÍízación de la búsqueda de homaÍogía pora asígnar funcian*s

a gerles de enfer¡nedsdes l¡umonas
Para ilustrar la importancia de la búsqueda de homología en la genómi-
ca, examinaremos cómo ha ayudado esta técnica a investigar enfermeda-
des genéticas humanas. Una de las principales razones para secuenciar
el genoma humano ha sido acceder a genes involucrados en patología
humana. La esperanza es que la secuencia del gen de una enfermedad
aporte información sobre su base bioquímica y, por lo tanto, indique la
manera de prevenirla o de tratarla. La búsqueda de homología desempe-
ña un papel importante en el estudio de los genes de enfermedad, por-
que el descubrimiento de un homólogo de un gen de enfermedad
humana en un segundo organismo suele ser la clave para conocer la fun-
ción bioquímica del gen humano. Si el homólogo ha sido caracterizado,
quizáya exista la información necesariapara conocer la función bioqui
' mica del gen humano; si no ha sido caractertzado, entonces se puede
dirigir la investigación requerida al homólogo.

No es preciso que el homólogo esté presente en una especie estrecha-

Cuadro 5.1 Ejemplos de genes de enfermedades humanas que tienen homólogos en Sacchoromyces cerevísiae

Gen de enfermedad humana Homólogo de levadura Función del gen de levadura

Esclerosis lateral amiotrófica SODI Protección contra superóxido

(oz-)
Ataxia telangiectasia TELI Codifica una proteincinasa
Cáncer de colon MSH2, MLHI Reparación de DNA
Fibrosis quística YCFI Resistencia a metales
Distrofia miotónica YPKI Codifica una proteincinasa
Neurofibromatosis tipo l IRA2 Codifica una proteína
reguladora
Síndrome de Bloom, sCS/ DNA helicasa l
síndrome de Werner 1

Enfermedad de Wilson (
CCC2 iTransporte de cobre?
 Determinación de las funciones de cada gen t55

útil en el estudio de las enfermedades

fnente relacionada para que sea
humanas. En este aspecto, Drosophí/a representa una gran promesa,
'ectos
ñues se conocen bien los efectos fenotípicos de muchos de sus genes, de
pues
Áun"ruque ya hay datos para inferir el modo de acción de genes de enfer-
medadeJhumanas que tienen homólogos en el genoma de Drosophila.
Sin embargo, el mayor éxito ha correspondido a la levadura. Varios genes
de enfermedades humanas tienen homólogos en el genoma de § cerevi-
siae (cuadro 5.1); por ejemplo, algunos involucrados en cáncer, fibrosis
quística y síndromes neurológicos y, en varios casos, el homólogo de
lévadura cumple una función conocida, que aporta una clara indicación
de la actividad bioquímica del gen humano. En algunos casos, incluso ha
sido posible demostrar una similitud fisiológica entre la actividad del
gen en seres humanos y levaduras. Por ejemplo, el gen de levadura SGSI
és un homólogo de un gen humano involucrado en las enfermedades
denominadas síndromes de Bloom y de WerneL caractetizados por tras-
tomos del crecimiento. Las levaduras con un gen SGS/ mutante üven
menos que las levaduras normales y presentan indicadores de comienzo
de envejecimiento acelerado, como esterilidad. El gen de levadura ha
mostrado codificar una de un par de DNA helicasas que son necesarias
para la transcripción de genes de rRNA y para la replicación del DNA.
Por lo tanto, el vínculo entre SGSI y los genes de los síndromes de
Bloom y de Werner, descubierto por la búsqueda de homología, ha indi-
cado la posible base bioquímica de las enfermedades humanas.

5.3"? AsÉgmaciór¡ de la función de g€ilss F*r

a;:*EE=is experifi?€*taE
Es evidente que el análisis de homología no es una panacea que permi-
te identificar las funciones de todos los genes. Por consiguiente, se
requieren métodos experimentales para complementar y ampliar los
resultados de los estudios de homología. Esto está probando ser uno de
los mayores desafíos de la investigación en genómica,y la mayoría de los
biólogos moleculares coinciden en que los métodos y las estrategias
actuales no son del todo adecuados para asignar funciones a la gran can-
tidad de genes desconocidos descubiertos por los proyectos de secuen-
ciación. El problema es que el objetivo -graficar un trayecto del gen a la
función- es lo inverso a la vía que normalmente sigue el análisis genéti-
co, cuyo punto inicial es un fenotipo y el objetivo es identificar el gen o
los genes subyacentes. El problema que encaramos en la actualidad nos
DNA cromosómico
lleva en la dirección opuesta: comenzar con un nuevo gen y esperar que
nos permita identificar el fenotipo asociado.

;lacliís¡s funcí*nai por des*rtív'adón ce ge.nes

En el análisis genético convencional, la base genética de un fenotipo se suele
I Recombinación
estudiar buscando organismos mutantes que presenten alteración del feno- J homóloga
tipo. Los mutantes se podrían obtener en forma experimental; por ejemplo,
tratando a una población de organismos (como un cultivo de bacterias) con DNA cromosómico

radiación ultravioleta o un mutágeno químico (véase sección 16.1.1), o

podría haber mutantes en una población natural. Después, se estudian el Alteración del gen
gen o los genes que han sido alterados en el organismo mutante mediante
cruzamientos genéticos (sección 3.2.4),lo que permite localizar la posición
de un gen en un genoma y también determinar si es el mismo que alguno ya Figura 5.20 Desactivación de genes
caracterizado. Luego, se puede profundizar su estudio mediante técnicas de por recombinación homóloga. La
copia cromosómica del gen diana se
biología molecular, como clonación y secuenciación.
recombina con una versión alterada
El principio general de este análisis convencional es que es posible iden- del gen transportado por un vector de
tificar los genes responsables de un fenotipo determinando qué genes clonáción. En consecuencia, se desac-
están desactivados en organismos que presentan una versión mutante tiva el gen diana.
 Capítulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma
Casete de deleción
k u¡
RI
Rl RI
I lntroducir en las
J células de levadura
Copia cromosómica del gen diana
t=
XX
RI Rl
¡ [a recombinación homóloga
t ahera el gen diana al insertar
la secuencia
t ru 5.21 se muestra una técnica de uso actual. El componente central es el
Se erpresa kon.
ksn' 6en de resilencia a la geneticina
§* Secuencias promotoras de levadura
RI. R2 Sitios de restricción
Figura 5.21 Uso de un casete de dele-
ción de levadura. El casete de deleción
consiste en un gen de resistencia a los
antibióticos precedido por las secuencias
promotoras necesarias para la expresión
en la levadura y flanqueado por dos
sitios de restricción. Se inseftan los seg-
mentos inicial y final del gen diana en
los siios de restncción y se introduce el
vector en células de levadura. La recom-
binación entre los segmentos del gen en
el vector y la copia cromosómica del gen
diana determina la alteración de e*a últi-
ma. Las células que han sufrido la altera-
ción se pueden identificar porqug ahora,
expresan el gen de resistencia a los anti-
bióticos y, así, crecerán en agar con
geneticina. La designación del gen "konr"
es una abreviatura de "resistencia a Ia
kanamicina"; kanamicina es el nombre
de la familia del grupo de antibióticos
que incluye la geneticina.
del fenotipo. Si el punto inicial es el gen, en lugar del fenotipo, la estra-
DNA vector
tegia equivalente sería mutar el gen y detectar el cambio fenotípico pro-
R2
vocado. Esta es la base de la mayoría de las técnicas empleadas para
asignar funciones a genes desconocidos.
ic reraifi 5 i ¡= r: d ó ¡: h * rn ó I * g a F€íj"líÍ+ d*ssrfív.o r gsnes i ¡-td i v i ti u * i es
La manera más fácil de desactivar un gen específico es alterarlo con un seg-
R2 R2
mento de DNA no relacionado (figura 5.2O). Esto se puede lograr por
recombinación homóloga entre la copia cromosómica del gen y un segun-
do fragmento de DNA que comparte alguna identidad de secuencia con el
gen diana. Las recombinaciones homóloga y de otros tipos son eventos
complejos, que se detallan, en el capítulo 17.Paru el propósito actual, basta
e;
saber que si dos moléculas de DNA tienen secuencias similares, puede
haber recombinación en segmentos de las moléculas que se intercambian.
R2 R2
¿Cómo se desactivan genes en la práctica? Consideraremos dos ejemplos,
el primero con § cereyisiae. Desde que se completó la secuencia del geno-
*anr ma en 1996, los biólogos moleculares que trabajan con levaduras se han
embarcado en un proyecto intemacional, coordinado, para determinar las
funciones de la mayor cantidad de genes posible (sección 5.3). En la figu-
"casete de deleción", eu€ contiene un gen de resistencia a los antibióticos.
Este gen no es un componente normal del genoma de levadura, pero fun-
cionará si se lo transfiere a un cromosoma de levadura y dará origen a una
célula de levadura transforrnada resistente al antibiótico geneticina. Antes
de utilizar el casete de deleción, se unen nuevos segmentos de DNA como
colas a uno u otro extremo. Estos segmentos tienen secuencias idénticas a
partes del gen de levadura que va a ser desactivado. Tlas introducir el case-
te modificado en una célula de levadura, se produce la recombinación
homóloga entre las colas de DNA y la copia cromosómica del gen de leva-
dura, que es reemplazado por el gen de resistencia a los antibióticos. Por 1o
tanto, las células que han presentado el reemplazo son seleccionadas sem-
brando el cultivo en agar que contiene geneticina. Las colonias resultantes
carecen de la actiüdad del gen diana y sus fenotipos pueden examinarse
para obtener cierta información sobre la función del gen.
El segundo ejemplo de desactivación de genes recurre a un proceso análo-
go, pero que utiliza ratones en lugar de levaduras. El ratón suele ser utili-
zado como organismo modelo para los seres humanos, porque su genoma
es similar al humano y contiene muchos de los mismos genes. Por 1o tanto, l
el anáiisis funcional de genes humanos desconocidos ie lleva a cabo, en (
gran medida, desactivando genes equivalentes del ratón, experimentos que (
serían éticamente impensables en seres humanos. La parte de recombina-
ción homóloga del procedimiento es idéntica a la descrita parula levadura,
y también en este caso, da origen a una célula en la que el gen diana ha sido
desactivado. El problema es que no queremos sólo una célula mutada, sino
todo un ratón mutante, pues sólo con el organismo completo podemos
hacer una evaluación total del efecto que ejerce la desactivación del gen
(
sobre el fenotipo. Para lograrlo, es necesario utilizar un tipo especial de
célula de ratón: una célula madre embrionaria o célula ES. A diferencia de (
la mayoría de las células de ratón, las células ES son totipotentes, lo que C
significa que no están dedicadas a una sola vía de desarrollo y, por ende, {:
pueden dar origen a todos los tipos de células diferenciadas. Así, se inyec- t
ta la célula ES genomanipulada en un embrión de ratón, que se sigue de- r
sarrollando, y con el tiempo, da origen a una quimera, un ratón cuyas C
células son una mezcla de células mutantes, derivadas de las células ES ir
genomanipuladas, y células no mutantes, derivadas de todas las demás t
células del embrión. Sin embargo, esto no es lo que queremos, de manera I
 Determinación de las funciones de cada gen t55

oue se permite que los ratones quiméricos se aparecen entre sí. Algunos de Promotor que responde

lbs descendientes resultan de la fusión de dos gametos mutantes y, por lo

a galactosa

tanto, no serán quiméricos, pues todas sus células tendrán el gen desacti-
vado. Estos son ratones htockout, y, con suerte, sus fenotipos aportarán la
información deseada sobre la función del gen en estudio. Este método es
efrcazparumuchas desactivaciones de genes, pero algunas son letales y, por
1o tanto, no pueden estudiarse en un ratón konockouf homocigoto. En
carnbio, se obtiene un ratón heterocigoto, producto de la fusión entre un
sameto normal y uno mutante, con la esperanza de que el efecto fenotípi-
ío de la desactivación del gen sea eüdente aunque el ratón todavía tenga mRNA de ly;
una copia correcta del gen en estudio.

De-r*::íj:. #c i ó n ri * g€fi rs s,¡: ¡*r*;-n& i r¡ * ti o ¡; h * m Ó ! * E s

I
Transposición
La recombinación homóloga no es la única manera de alterar un gen
para estudiar su función. Una alternativa es recurrir al etiquetado con
transposones, que induce la desactivación por inserción de un elemento Figura 5.22 lnducción artificíal de
transponible, o transposón, en el gen. La mayoria de los genomas con- transposición. Se han empleado téc-
tienen elementos transponibles (sección 9.2) y, aunque casi todos ellos nicas de DNA recombinante para
son inactivos, algunos suelen conservar su capacidad de desplazarse a colocar una secuencia promotora que
responde a Ia galactosa corriente arri-
nuevas posiciones en el genoma. En circunstancias nor:rnales, la transpo-
ba de un elemento Tyl del genoma
sición es un hecho relativamente rato, pero a veces es posible aplicar téc- de levadura. Cuando hay ausencia de
i-ricas de DNA recombinante para crear transposones modificados que galactosa, no se transcribe el elemen-
cambian su posición en respuesta a un estímulo externo. En la figura to Tyl y, por lo tanto, permanece
5.22 se muestra cómo hacerlo con el transposón Tyl de levadura. El eti- latente. Cuando se transfieren las
quetado con transposones también es importante en el análisis del geno- células a un medio de cultivo que
ma de la mosca de la fruta, que utiliza el transposón endógeno de contiene galactosa, se activa el pro-
motor y se transcribe el elemento Iyl,
Drosophi/a denominado elemento P. La debilidad del etiquetado con
lo que inicia el proceso de transposi-
transposones reside en que es difícil apuntar a genes individuales, por- ción. Véase más información sobre la
que la transposición es un fenómeno más o menos aleatorio y es impo- activación de promotores eucariontes
sible predecir dónde terminará un transposón una vez que ha saltado. Si en la sección 1 1.3 y detalles del pro-
el propósito es desactivar un gen particular, es preciso provocar una can- ceso de transposición de Iyl en la
tidad sustancial de transposiciones y, después, investigar todos los orga- sección 173.2.
nismos resultantes para hallar uno con la inserción correcta. Por lo
tanto, el etiquetado óon transposones es más aplicable a estudios globa- l' ;Ti= i'i : rit.++,:5'RNÁ ticaien¿rio
les de la función del genoma, en los que se desactivan al azar los genes -, II.r
5-::=---::J
:ItI:!lItL'I -¡I

y se identifican grupos de genes con funciones similares por examen de

cambios fenotípicos interesantes en la progenie.
I La nucleasa Dicer corta
I el RNn biacatenario

# r-..-r jñ fr
La interferencia por RNA (o ribointerferencia, RNAi) representa un enfo- jJ lff
l#- ñ-'-
t-:.- :.4t_ r :l r!-_
RNA inte.ferentes
pequenos rsiR\iA.
que totalmente diferente para la desactivación de genes y consiste en uno de
una serie de procesos naturales por los que moléculas de RNA cortas influ- I siRNA monocatenario
yen en la expresión del gen, en células vivas (sección 12.2.6). Cuando se apli- I t. rn.n al mRNA
ca ala investigación en genómica, la RNAi aporta un medio de desactivar un
gen diana, no por alteración del gen en sí mismo, sino por destrucción de su ffi
: ..:-*-.'.i
=.+
ffi= 5*f ffi ffi
S' .-.,,,..-.:.--j,:,,,., 3' rl:rjr-,
mRNA. Esto se logra introduciendo en la célula moléculas cofias de RNA
bicatenario, cuyas secuencias coinciden con las del mRNA diana. Los RNA
bicatenarios son fragmentados en moléculas más cortas, que inducen la
:
Degrariado Fcr RDf-1
degradación del mRÑA (figura 5.23).Inicialmente, el proceso-mosré ser efi-
caz en el helminto Caenorhabditís elegans, cuyo genoma ha sido secuencia-
do por completo y que se considera un organismo modelo importante para Figura 5.23 lnterferencia por RNA. La
eucariontes superiores (sección 14.3.3). La interferencia por RNA ha desac- molécula de RNA bicatenario es
tivado casi todos los i9.000 genes preüstos del genoma de C. elegans. El degradada por Ia ribonucleasa Dicer
paso clave de cualquier experimento de RNAi es introducir en el organismo en "RNA interferentes pequeños"
(siRNA) de 21-25 pb de longitud.
de prueba la molécula de RNA de doble cadena que dará origen a los RNA
Una cadena de cada siRNA se aparea
interferentes de una sola cadena.En C. e/egans, esto se puede lograr alimen- por sus bases con el mRNA diana,
tando con RNA a los helmintos. C elegans come bacterias, incluida que es degradado, después, por la
Eschenchío co/i, y cÍece, a menudo, sobre un campo de bacterias en una nucleasa RDE- l.
 ?-l

156 Capítulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma

Fisura 5.24 Análisis funcional por Promotor especÍfico

de hígado, altamente activo
so--breexpresión de genes' El objetivo
es determinar si Ia sobreexpresión del
gen estudiado ejerce algún efecto
iobre el fenotipo de un ratón transgé-
nico. Por lo tanto, se inserta un cDNA Clon en un ratón
del gen en un vector de clonación, I
que-contiene una secuencia promoto-
rá altamente activa que dirige la
expresión del gen clonado en células §
hepáticas de ratón. Se utiliza cDNA en
F" -&*-
lugar de la copia genómica del gen,
E ....+ @ lnveligacióndelfenotipo
='+' a::@'
porque el primero no contiene intro- **F
hes y, así, és más corto Y más fácil de F¡ote¡na ieriei¿tla
manipular en el tubo de ensaYo. ¿l torenle rircul¿ttri¡
Células hepáticas

placa de agar. Si las bacterias contienen un gen clonado que dirige la expre-
ilOn d" ,rr-nNa bicatenario con la misma iecuencia que un gen de C. e/e'
gans, ttas la ingestión, comienza a operar la vía de RI'{Ai' En forma
álternativa, et nNe bicatenario puede sei microinyectado de mfilera directa
en el helminto, pero esto insume más tiempo.
Se sabe que lainterferencia por RNA es un proceso natutal en una serie de
eucarionies, pero se preveía que su aplicación a células de mamíferos sería
difícil, porq,r" estos brganismos presentan una respuesta paralela al RNA
bicatenario, en la que ie suele inhibir la síntesis proteica, io que causa la
muerte celular. Se ha evitado este problema utilizando RNA bicatenario
que sólo tienen 2l-22pb de longitud, suficientemente largospara ser espe-
iifi"o. para un determinado gen diana y activar el proceso de.RNAi, pero
demasiádo cortos para desencadenar la respuesta inhibitoria de la síntesis
proteica. Este enfóque, que emplea vectoies retrovirales para introducir
'genes
clonados que exprásan los RNA en células cultivadas, ha permitido
áesactivar indMáuaknente más de 8.000 de los 55.000 genes humanos' El
desafío actual de la RNAi en los mamíferos es pasar de los sistemas celula-
res, en los que sólo es posible evaluar ciertos fenotipos, a los ratones knoc'
koul, en los que se puede examinar todo el espectro de fenotipos._Esto
exige desarroúar sisiemas de clonación para la síntesis estable, a largo
plíro, de los RNA interferentes, que deben estar presentes en un nivel alto
uniforme para mantener desactivado el gen diana.

Tambié¡z se puede recurrir a ia sabreexpresiÓtl i* genes

pür1 evúluar io funciÓn
Hasta ahora, hemos considerado técnicas que desactivan el gen en estu-
dio (..pérdida de la función"). El enfoque cbmplementario. es genomani-
pular un organismo para que el gen investigado sea mucho más activo
q"" .t norm"al (,'ganáncia de func-"ión") y determinar qué cambios, si los
hay, ejerce esta modificación sobre el fenotipo. Los resultados de estos
deben interpretarse con cautelá, pues es preciso distingUir
"*p".i*."tos
.rri." .rn cambio fenotípiio secundario a la función específica de un gen
sobreexpresado y un cambio fenotípico menos específico que refleja la
situación u.ro.-ál donde un solo producto génico está siendo sintetiza'
do en cantidades excesivas, quizáéntejidosán los que el gen es normal-
mente inactivo. Pese a esia^limitación, la sobreexpresión ha aportado
cierta información importante sobre la función de los genes'
Para sobreexp.".u. rr, !"r, ." ¿.U. emplear un vector de ólonación especial,
diseñado paragarunúzar que el gen clonado dirija la sintesis de la mayor can-
tidad de proteíia posible. Por lJ tanto, el vectoi es multicopia, lo quesigrrr-
fica que ie multiplica dentro del organismo huésped hasta alcanzar 4o-2ou

:]
 Determinación de las funciones de cada gen 157

copias por célula, de modo que hay numerosas copias del gen de prueba. El
u.óto, también debe contener un promotor altamente activo (sección Lt.2.2)
para que cada copia del gen de prueba sea convertida en grandes cantidades
áe mRNA, lo que vuelve a asegurar que se sintetice toda la proteína posible.
En eI ejemplo ilustrado en la figura 5.24, el vector de clonación contiene un
promotor altamente activo expresado sólo en el hígado, de modo que cada
iatón transgénico sobreexpresa el gen de prueba en ese órgano. Se ha utili-
zado este enfoque para genes cuyas secuencias sugerían que codificaban pro-
teínas que son secretadas al torrente circulatorio. Después de la sÍntesis
hepánca en el ratón transgénico, Ia proteína de prueba es secretada, y se exa-
mina el fenotipo del ratón transgénico para buscar indicios respecto de la fun-
ción del gen clonado. Se efectuó un descubrimiento interesante cuando se
advirtió que en un ratón transgénico los huesos son mucho más densos que
en los ratones normales. Esto era importante por dos r¿vones: primero, per-
mitía identi{icar el gen pertinente como uno involucrado en la sÍntesis ósea;
segundo, el descubrimiento de una proteÍna que aumenta la densidad ósea
tiene implicaciones para el desarrollo de tratamientos contra la osteoporosis
humana, una enfermedad asociada con la fragilidad ósea.

El*{etía f*nctípico d* ia dtssciív*ción o i* sabreexpres,;in de

geíi*s puede ser dífícilde disre,-;;í¡"
El aspecto crucial de un experimento de desactivación o sobreexpresión de
un gen es la necesidad de detectar un cambio fenotípico cuyo carácter dé un
indicio sobre la ftmción del gen manipulado. Esto puede ser mucho más difí-
cil de lo que parece. En cualquier organismo, el espectro de fenotipos que se
debe examinar es inmenso. Aun en un organismo tmicelular como la levadu-
ra, la lista es bastante larga (cuadro 5.2A) y lo es mucho más en los eucarion-
tes multicelulares (cuadro 5.28). En los organismos superiores, algunos
fenotipos (p. ej., los conductuales) son dificiles o imposibles de evaluar en
forma completa. Más aún, el efecto de la desactivación del gen puede ser muy
sutil y, a veces, no se lo reconoce al examinar el fenotipo. Un buen ejemplo
de los problemas que surgen corresponde al gen más largo del cromosoma
III de levadura que, con 2.167 codones y con un sesgo de codones típico de
la levadura, simplemente teria que ser un gen funcional y no un ORF espu-
rio. La de-sactivación de este gen no ejercía ningun efecto evidente las célu-
las de levadura mutantes parecían tener un fenotipo idéntico al de la levadura
normal. Durante algún tiempo, se pensó qtte, quizá, este gen era prescindi-
ble. y que su producto proteico participaba en alguna función no esencial o
cumplía una función que era duplicada por un segundo gen. Por último, se
observó que los mutantes mueren cuando crecen con pH bajo en presencia
de glucosa y ácido acético, que las levaduras normales pueden toleraq y se
concluyó que el gen codifica una proteína que bombea ácido acético fuera de
la célula. Ésta es definidamente una función esencial, pues el gen desempeña
un papel vital en proteger a la levadura del dano induiido poi á"ido acdtico,
pero era difícil detectarla a partir de los estudios fenotípicos.

Aun cuando se lleven a cabo las investigaciones más cuidadosas, muchas

desactivaciones de genes no inducen ningún cambio fenotípico discernible.
Casi 5.000 de los 6.000 genes de levadura pueden ser desactivados en
forma individual sin provocar la muerte de la célula, y la desactivación de
muchos de estos 5.000 genes no ejerce ningún efecto detectable sobre las
propiedades metabólicas de la célula en condiciones de crecimiento norma-
les. En C. elegans, los proyectos de desactivación de genes en gran escala
hasta ahora han asignado fenotipos a menos del lOo/o de los 19.000 genes
anticipados. La implicación es que, en ambos organismos, la mayoría de
los genes desempeñan funciones especializadas, e identificar qué fun-
ción corresponde a cada gen va a ser un proceso prolongado y difícil.
 I

158 Capítulo 5. Conocimiento de la secuencia de un genoma

Cuadro 5.2 Fenotipos típicos evaluados en investigaciones de genes de

Saccharomyces cerevisiae o Caenorhobditis elegons

A) Todos los genes de Socchoromyces cerevisiae

Síntesis de DNA y ciclo celular
Síntesis y procesamiento de RNA
Síntesis de proteinas
Respuestas al estrés
Síntesis de la pared celular y morfogénesis
Transporte intracelular de sustancias bioquímicas
Energía y metabolismo de los hidratos de carbono
Metabolismo lipídico
Reparación y recombinación de DNA
:*
Desarrollo 'r'§
,G

Meiosis ;
§
Estructura cromosómica
Arquitectura celular E
:g
.§
Secreción y tráfico de proteínas ;:
.+
aé

B) Genes que participan en la embriogénesis temprana de s

Cn e no rh o bd iti s eleg a n s
,q
E
Esterilidad/alteración de la fertilidad en el progenitor
.é
lntegridad osmótica
Extrusión de cuerpos polares .i.j
'.É
+
Pasaje a través de la meiosis :*
Ingreso en la interfase
-:§
Dinámica cortical
Aspecto pronuclear,/nuclea r =
:::
j.':

Unión al centrosoma
Migración pronuclear ai-

i5
Ensamblaje del huso
Elongación/integridad del huso I

j
Separación de cromátides hermanas
l
Aspecto nuclear (
t
Segregación de cromosomas
Citocinesis
Asimetría de división
I
 Determinación de las funciones de cada gen 159

q 3 -= t=*rudics ¡s:és deteSÉad*s d* §a acti';idac d* u*e Gendiana DNAcrómosómico

pr*ieín= ccdificedc p*r ur: g€s: dEscancei#o

¿1e'-
!

X X DNAvector

La desactivación y la sobreexpresión de genes son las técnicas funda- -/-

/ -\ \
rnentales utilizadas por los investigadores de §enomas para determinar
Promotor Cen de resistencia
a los antibióticos
la función de un nuevo gen, pero éstos no son los únicos procedimien-
tos que pueden aportar información sobre la actividad de los genes. I Primer Paso del
Otros métodos pueden ampliar y elaborar los resultados de la desactiva-
I reemplázo del gen
ci6n y la sobreexpresión. Se pueden emplear para obtener información ' ' +--'*cromosómico
adicional que ayude a identificar la función de un gen o podrían repre-
---
sentar la base de un examen más completo de la actividad de una prote-
ína, cuyo gen ya ha sido caracterizado. I
+- -.:-+
E__E-:E-tF__.

Se pe*Ce utilizar lo mutagénesís dirigido para investlgar en X DNAvector

dei*!!e í* {unción del gen iE
{len nuia¡i+
La desactivación y la sobreexpresión pueden determinar la función gene-
ra1 de un gen, pero no pueden aportar información detallada sobre la I Segundo paso

actividad de una proteína codificada por un gen. Por ejemplo, se podría + del reemplazo del gen

sospechar que parte de un gen codifica una secuencia de aminoácidos DNA cromosómico
que dirige su producto proteico a un compartimento particular de la
célula, o que es responsable de la capacidad de la proteína para respon-
der a una señal química o física. Para investigar estas hipótesis, sería
necesario eliminar o alterar la parte relevante de la secuencia del gen, Figura 5.25 Reemplazo de un gen
pero dejar el grueso sin modificación, de modo que, aun así, la proteína en dos pasos.
sea sintetizada y conserve la mayor parte de su actividad. Se pueden
emplear los diversos procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio o
in vitro (Nota sobre técnicas 5.2) para inducir estos cambios sutiles.
Éstas son técnicas importantes cuyas aplicaciones son no sólo el estudio
de la actividad del gen, sino también el área de la ingeniería proteica,
cuyo el objetivo es crear nuevas proteínas con propiedades más adecua-
das para utilizarlas en contextos industriales o clínicos.

Después de la mutagénesis, se debe introducir la secuencia del gen en la célu-

la huésped, de manera que la recombinación homóloga pueda reemplazarla
copia del gen por la versión modificada. Esto plantea un problema, porque
es necesario contar con una forma de conocer qué celulas han presentado
recombinación homóloga. Aun en la levadura, éstas corresponderán sólo a
una fracción del total, y en los ratones, la fracción será muy pequeña.
Normalmente, este problema se soluciona colocando un gen marcador (p. ej.,
un gen que codifique resistencia a los anübióticos) cerca del gen mutado e
investigando las células que adoptan el fenotipo conferido por este marcador.
En la mayoría de los casos, las células que insertan el gen marcador en su
genoma también insertan el gen mutado estrechamente unido y, por lo tanto,
son las que nos interesan. El problema es que, en un experimento de muta-

Cuadro 5.3 Ejemplos de genes indicadores

rcct B-galactosidasa Prueba histoquímica

uidA B-glucuronidasa Prueba histoquímica
lux Luciferasa Bioluminiscencia
CFP Proteína fluorescente Fluorescencia
verde
r60 Capítulo 5, Conocimiento de la secuencia de un genoma

Nota sobre técnicas 5.2 Mutagénesis dirigida al sitio

Métodos para inducir una olteroción precisa en uno secuencio de un gen con el fin de com-
biar lo estructuro y, posiblemente, la actividad de uno proteína .

Es posible inducir cambios en la estructura protéica mediante
técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, que provocan altera-
ciones definidas de la secuencia nucleotídica del gen que
codifica una proteína de interés. Estas técnicas permiten exa-
minar las funciones de diferentes partes de una proteína y
también tienen importancia generalizada en el desarrollo de
nuevas enzimas con fines biotecnológicos.
La mutagénesis convencional es un proceso aleatorio que
introduce cambios en posiciones no especificadas de una
molécula de DNA Es preciso investigar gran número de orga-
nismos mutados para detectar una mutación de interés. Aun
en microbios, que pueden ser investigados en enormes can-
tidades, lo mejor que se puede esperar es un espectro de
mutaciones en el gen correcto, una de las cuales podría afec-
tar Ia parte de la proteína en estudio. La mutagénesis dirigida
al siüo representa un medio de causar mutaciones mucho
más especificas. Los más importantes de estos métodos son:
. Mutagénesis diti$da por oligonudeótidos, en la que se
hibrida un oligonucleótido que contiene la mutación deseada
a una versión monocatenana del gen pertinente, que se
obtiene por clonación en un vector M13 (sección 4.1..1). El
oligonucleótido ceba una reacción de síntesis de cadena que
se deja proseguir hasta que rodea por completo la molécula
molde circular (figura T5.lA). Después de la introducción en
Escherichio coú, la replicación del DNA produce numerosas
copias de esta molécula de DNA recombinante, de las cuales
la mitad corresponde a copias de la cadena originalde DNA,
y la mitad, a copias de la cadena que contiene la secuencia
mutada. Todas estas moléculas de doble cadena dirigen la
síntesis de partkulas de fago, de manera que alrededor de la
mitad de los fagos liberados de las bacterias infectadas trans-
portan una versión monocatenaria de la molécula mutada. Se
siembran los fagos en agar sólido para que se produzcan pla-

Figura T5.I Mutagénesis dirigida

(A)
por oligonucleótidos.
Síntesis de la cadena de DNA

DNAmonocatenario Híbridareloligonucleótido Síntesis de la cadena DNA bicatenario

n error de apareamiento

(B) ldentificación de fagos mutantes

Transferencia,
a
sonda I

ffi
I

Partículas de fago Señal de hibridación - placa

sembradas para dar placas de fagos mutantes

E. coli infeclada

-------i

génesis dirigida al sitio, se debe estar seguro de que cualquier cambio de la

actividad del gen en estudio sea el resultado de la mutación específica intro-
ducida en el gen y no el resultado indirecto de modificar su medio en el geno-
ma al insertar un gen marcador próximo a é1. La respuesta es recurrir a un
reemplazo del gen en dos pasos, más complejo (figura 5..25). En este proce-
dimiento, el gen diana es reemplazado primero por el gen marcador solo y se
identifican las células en las que tiene lugar esta recombinación por selección
del fenotipo del gen marcador. Después, se emplean estas células en la segun-
da etapa de reemplazo del gen, cuando el gen marcador es reemplazado por
el gen mutado; ahora el éxito se controla investigando qué células han perdi-
do el fenotipo del gen marcador. Estas células contienen el gen mutado y se
pueden examinar sus fenotipos para determinar el efecto de la mutación diri-
gida sobre la actiüdad del producto proteico.
 Determinación de las funciones de cada gen t6l

cas y se identifican las mutantes por hibridación con una
sonda del oligonucleótido original (figura T5.1 B). Después, se
puede volver a colocar el gen mutado en su huésped original
bor recombinación homóloga, como se describe en la sec-
'c\ón
5.2.3, o se lo puede transferir a un vector E coli diseña-
do para síntesis de proteínas a partir del DNA clonado, de
manera de poder obtener la proteína mutada.
mezclan los dos productos de la PCR y se lleva a cabo un
ciclo final de PCR para construir la molécula de DNA
mutada de longitud completa.
Figura T5.2 Un método de mutagénesis dirigida al
sitio por PCR.

o La síntesis de genes artificiales consile en construir el gen

::nffi;; i;rm l;
I Desnaturalizar. hibridar I
en el tubo de ensayo y ubicar las mutaciones en todas las I cebadores I
posiciones deseadas. El gen se construye sintetizando una iiffiffiri'
ffi Loscebadores
serie de oligonucleótrdos que presentan superposiciones par- contienen _
ciales, cada uno de hasta l50 nucleótidos de longrtud. Elgen L! la mutación ir Lr.

se ensambla llenando los hiatos entre las superposiciones

con DNA polimerasa y se lo liga a un vector de clonaciÓn
II PCR PcR

antes de introducirlo en el organismo huésped o en E. coli. I

o PCR, que también se puede utilizar para crear muta-
J Í'fff-
-, tl-tú-l,i
J-
Y J
)
:,,,ffi:,
J3- f

ciones en genes clonados, aunque al igual que la muta-

Hibridar las cadenas mutadas
génesis dirigida por oligonucleóticos, sólo permite I
I
generar una mutación por experimento. El método mos-
trado en la figura T5.2 comprende dos PCR, cada una con Jr-ffi:J

un cebador normal (que forma un híbrido totalmente 3'-! :!!i¿=l= 5'

apareado por sus bases con el DNA molde) y un cebador

mutágeno (que contiene un solo error de apareamiento
de pares de bases, que corresponde a la mutación)' Por
II Ciclo final de PCR

lo tanto, esta mutación está presente, al principio, en los

. Effiffi
. dos productos de la PCR, que corresPonden, cada uno, a
, la una mitad de la molécula de DNA inicial. Después, se
Mutación

5SpL.'.;. ..r 1 .- : -- .
'.. jr''.'.
--- -l '-,'l '- -.'r::i .'-: ." r- -

lo¿.c,',r--.: . -:r' .: ,' -1..., .. -r..l l.;:l .'. t .l-. -'-.

A menudo, es posible obtener indicios de la función de un gen determinan-

do dónde y cuándo el gen es activo. Si la expresión del gen se limita a un
órgano o tejido particular de un organismo multicelular, o a una sola serie
de células dentro de un'órgano o tejido, esta información posicional se
puede utilizar para inferir la función general del producto génico. Lo
mismo es válido para la información relacionada con el estadio de desarro-
llo en el que se expresa un gen. Este tipo de análisis ha probado ser de par-
ticular utilidad para conocer las actividades de genes involucrados en los
primeros estadios del desarrollo de Drosophila (sección 14.3.4) y se está
utilizando cadavezmás para revelar la genética del desarrollo de los mamí-
feros. También es aplicable a los organismos unicelulares, como la levadu-
ra, que tienen estadios madurativos distintivos en su ciclo vital.

Un gen indicador permite determinar el patrón de expresión de genes den-

tt'o de un organismo. Es un gen cuya expresión se puede controlar de mane-
ra cómoda, idealmente por examen visual (cuadro 5.3), pues las células que
contienen el gen indicador se toman azules, fluorescentes o dan alguna otra
señal visible. Para que el gen indicador dé una indicación fiable de dónde
y cuándo se expresa un gen de prueba, el indicador debe estar sujeto a las
mrsmas señales reguladoras que el gen de prueba. Esto se logra reempla-
zando el ORF del gen de prueba por el ORF del gen indicador (figura
)..¿6). La mayoría de las señales reguladoras que controlan la expresión
genrca están contenidas
en la región de DNA corriente arriba del ORE de
162 Capítulo 5 Conocimiento de la secuencia de un genoma
Promotor
A
I cen diana
I La recombinación homóloga
+ reemplaza el gen diana
por el gen indicador
Cen indicador
Figura 5.26 Cen indicador. El marco de
Iectura abierlo del gen indicador reem-
plaza el marco de lectura abierto del gen
en estudio. El resultado es que el gen
indicador queda bajo el control de las
secuencias reguladoras que suelen
imponer el patrón de expresión del gen
de prueba. Véase más información
sobre estas secuencias reguladoras en
las secciones 11.2y 1.I.3. Obsérvese
que la estrategia del gen indicador pre-
supone que las secuencias reguladoras
importantes residen corriente arriba del
gen. Esto no siempre es así en el caso
de los genes eucariontes.
I Sonda con
J, a,,1|Cr.rpo rr,. .. -.ac
L¿ nr¿r'c¡ció¡r ¿!¿i'¿ce
cie;riro ,4e i¿s rrilcro;rdi:¿.q
Figura 5.27 lnmunocitoquímica. Se
trata la célula con un anticuerpo marca-
do con una sustancia roja fluórescente.
El examen de la célula muestra que la
señal fluorescente se asocia con la
membrana mitocondrial interna. Por lo
tanto, una hipótesis de trabajo sería que
la proteína diana participa en el transpor-
te de electrones y Ia fosforilación oxidatl-
va¡ pues éstas son las principales
funciones bioquímicas de la membrana
mitocondrial interna.
manera que el gen indicador debe presentaq ahora, el mismo patrón de
expresión que el gen de prueba. Por lo tanto, es posible determinar el
patrón de expresión investigando la señal del indicador en el organismo.
Además de saber en qué células se expresa un gen, a menudo es útil locali-
zar la posición intracelular de la proteína codificada por éste. Por ejemplo,
se pueden obtenq datos claves sobre la función del gen mostrando que el
producto proteico está localizado en las mitocondrias, en el núcleo o en la
superficie celular. En este caso no son útiles los genes indicadores, porque
la secuencia de DNA corriente arriba del gen -la secuencia a la que está
unida el gen indicador-no participa en dirigir el producto proteico a su loca-
luación intracelular corecta. En realidad, lo importante es la secuencia de
aminoácidos de la propia proteína. Por 1o tanto, la única manera de deter-
minar la localización de la proteina es buscarla directamente. Esto se puede
realizar por inmunocitoquímica, que emplea un anticuerpo especÍfico con-
tra la proteina de interés y, por lo tanto, se une a esta proteína y no a otra.
El anticuerpo está marcado para que se pueda üsualizar su posición en la
célula y, por ende, la de la proteína diana (figura 5.27). Se utiliza marcación
fluorescente y microscopia confocal para estudios de baja resolución; en
forma alternativa, se puede efectuar inmunocitoquimica de alta resolución
mediante microscopia electrónica utilizando un marcador electrodenso,
como oro coloidal.
5.5 Sstudi* d* cGsG: anota(ión de la seruen<*a
de! genorma de Sscchoromyces c€r€vísíse
En este capítulo hemos comentado diversas técnicas, tanto computari-
zadas como experimentales, para localizar los genes en la secuencia de
un genoma y determinar sus funciones. No todas las técnicas se han apli
cado a todos los organismos; la elección ha dependido, a menudo, de (
consideraciones técnicas: por ejemplo, la RNAi se ha empleado mucho É
en C. e/egans, debido en parte a la facilidad con que se pueden introdu- C
cir Rl{A de doble cadena en helmintos mediante experimentos de alimen- I
tación (sección 5.2.2). Para ilustrar cómo se combinan estas diversas (
técnicas, finalizaremos este capítulo estudiando el progreso efectuado en (
la anotación del genoma de la levadura S. cerevisiae. En términos euca- C
riontes, el genoma de levadura es bastante simple, pues contiene relati- I,
vamente poco DNA intergénico y muy pocos intrones. Esto simplifica la
identificación de ORI pero no ofrece ninguna ventaja en el momento de (
determinar la función de cada gen. e
*
5.3.I Anotacién de la se{u€ndia del genama de levadur*
El proyecto de secuenciación de S. cerevisíae se completó en 1996. El
análisis inicial, que fijó 100 codones como límite mínimo de un posible
gen, detectó 6.274 ORE de los cuales se sabía que alrededor del30a/o
correspondía a genes genuinos, porque ya se los había identificado por
análisis genético convencional, antes de que comerlzara el proyecto de
secuenciación. Cuando se completó la secuencia del genoma, se estudió
el70o/o restante por análisis de homología, con los siguientes resultados
(figura 5.28):
. Fue posible asignar funciones a casi el3Oo/o de los genes del genoma
después de la búsqueda de homología en las bases de datos de
,secuencias. Casi la mitad de ellos eran claros homólogos de genes
cuyas funciones ya se habían establecido y casi la mitad tenía simili-
tudes menos llamativas, incluidos muchos casos en los que las simi-
litudes se limitaban a dominios definidos. En todos estos genes, el
análisis de homología se pudo calificar de exitoso, pero con distintos
grados de utilidad. En algunos genes, la identificación de un homó-
 Estudio de caso: anotación de la secuencia del genoma de Socchoromyces cereviose I65

logo permitió determinar por completo la función del gen de levadu- Cen¿',
ri. por ejemplo, identificar genes de levadura pata subunidades de tr¡viai¡eni,¡
:u*§i¡nilai-.Je
Huérfanos
DNA polimerasa. En otros genes, la asignación funcional sólo pudo irie::ifitados
únicos
ser una categoría amplia, como "gen de una proteincinasa": es decir,
se pudieron inferir lai propiedades bioquímicas del producto génico,
peio no la función exacta de la proteína en la célula. Al principio,
álgunus identificaciones resultaron desconcertantes; el mejor ejem-
pló fue el descubrimiento de un homólogo de levadura de_ un gen
Lacteriano involucrado en la fijación de nitrógeno. Las levaduras no
fijan nitrógeno, de modo que ésta no podía ser la función del gen de
fuliembros
¡d€ntiir.ad*j
no identificados
por aná{isis
levadura. En este caso, el descubrimiento del homólogo de levadura de homciagia
de familias

volvió a dirigir la atención al gen bacteriano ya caracterizado y, des-

huérf¿n¿s

pués, se adviritió que, si bien participaba en la fijación de nitrógeno,

é1 papel fundamental del producto génico bacteriano era la síntesis
de metaloproteínas, que cumplen amplias funciones en todos los Figura 5.28 Resumen del resultado
.
organismos, no sólo en los que fijan nitrógeno. de la anotación inicial del genoma
.
de levadura.
i Alrededor del tOo/o de los genes de levadura tenía homólogos en las bases
de datos, pero se desconocían sus funciones. Por lo tanto, el análisis de
:

homología no pudo ayudar a asignar sus funciones. Estos genes de leva-

dura y sus homólogos fueron denominados famiüas huérfanas.
Los genes de levadura restantes, alrededor del30o/o del total, no pre-
sentaban homólogos en las bases de datos. Una proporción de ellos
(un 7o/o del total) correspondían a ORF cuestionables que qtizá no
fuesen genes reales, porque eran bastante cortos o tenían un sesgo de
codones inusual. El resto parecían genes, pero eran únicos y se los
denominó huérfanos únicos.
Tras la anotación inicial de la secuencia del genoma de levadura hubo que
considerar dos preguntas: primero, ¿cuántos de los huérfanos únicos son
genes genuinos? Segundo, ¿hay algunos genes genuinos que tienen menos
de 100 codones de longitud y, por ende, no fueron detectados por este aná- Gen locZ
(sín codón de iniciación)
lisis inicial? Este último es un punto importante: aunque hay sólo 6.274
ORF de 100 codones y más en el genoma de levadura,hay más de 100.000 # TransPosón

ORF de 15 codones o más, la mayoría de los cuales presentan un patrón

de uso de codones indistinguible del de los genes genuinos. Por lo tanto, la ¡¡¡=-¡fftF:ii Transposición hacia
un gen de levadura
posibilidad de hallar nuevos genes cortos era enorrne.
Fusión
Seaplicaron tres enfoques para refinar la serie de genes de levadura, que intramarco

emplearon técnicas ya comentadas en este capítulo:

' Se utilizó genómica comparativa, que aprovecha la serie de secuen-

cias de genomas de especies de levaduras relacionadas, para evaluar
I
El gen /acZ es activo
la autenticidad de muchos ORF cortos.
Se buscó evidencia de transcripción por secuenciación de cDNA,
incluidas genotecas de etiquetas de secuencias expresadas, que son Figura 5.29 Utilización de etiquetado
cDNA cortos y, en general, incompletos derivados de los extremos de con transposones para identificar
secuencias transcritas (sección 3.3.3) y por análisis seriado de la genes de levaduras. Si el transposón se
expresión de genes (SAGE; sección 6.1.t) y estudios de micromatri- desplaza hacia un gen de levadura fun-
ces (sección 6.1.2). cional, de manera que se crea un marco
de lectura abierto entre el comienzo del
Se utilizó el etiquetado con transposones para identificar ORF que son gen de levadura y el gen /ocZ presente
genes genuinos, además de emplearlo para inactivar genes como parte én el transposón, se puede expresar el
del análisis funcional. Este trabajo usó un transposón que contiene una gen loú. Un segmento de la proteína B-
galactosidasa resultante está codificado
copia del gen lacZ, que carecía de su codón de iniciación (figura 5,29).
por el gen de levadura unido a su extre-
Por lo tanto, en las células normales, el gen lacZ es inactivo, así que al
mo N, pero a menudo esto no afectará
realizar la prueba de X-gal (sección 2.2.1) las colonias son blancas. Este la actividad de la enzima. Por ende, la
gen se activa si la transposición 1o desplaza a una posición dentro de un transposición hacia un gen de levadura
gen de levadura genuino y la inserción determina que los codones de1 funcional se puede detéctar mediante la
gen de levadura se fusionen, en marco, con el gen /acZ. Ahora, las colo- prueba de X-gal.
164 Capítulo 5, Conocimiento de la secuencia de un genoma
Segmento del
gen de levadura
¡E
Códigos de barras moleculares
§ Sitios para los cebadores de la PCR
Figura 5.30 Casete de deleción
empleado en la estrategia del códi-
go de barras. Compárese con el
casete mostrado en la figura 5.2.1.
Los dos códigos de barra moleculares
son secuencias de 20 nucleótidos de
longitud, diferentes para cada casete,
que pueden ser amplificadas por
Durante la recombinación homóloga,
se insertan los códigos de barra en el
genoma de Ia levadura junto con el
gen de resistencia a la kanamicina.
Por lo tanto, los códigos de barras
aportan etiquetas específicas para la
deleción de cada gen individual.
Segmento del
nias son azules. En consecuencia, se pueden evaluar los ORF cuestiona-
gen de levadura bles a partir del color de las colonias después que se ha etiquetado el
Éi ORF con el transpclsón.
Estos experimentos continúan, pero su resultado, hasta ahora, ha sido
reducir el catálogo de genes de levadura a alrededor de 6.12O ORE unos
150 menos que la estimación inicial. Esta reducción proviene no sólo de
descartar muchos de los huérfanos únicos originales, que ya no se con-
sideran posibles genes, sino también de añadir a Ia lista unos pocos ORF
que miden menos de 100 codones, pero que resultaron ser gel1es genui-
nos.
5"3.2 Asignacién de funciones a los genes de levadura
S. cerevisioe presenta dos características que son útiles para los intentos
de asignar funciones a los genes desconocidos de su genoma. La prime-
PCR.
ra de ellas es una alta propensión natural a la recombinación homóloga,
que torna relativamente fácil aplicar este enfoque para desactivar genes
individuales (véase figura 5.2O). La segunda es que el genoma contiene
la familia Ty de transposones, lo que permite recurrir al etiquetado con
transposones como medio alternativo de alteración de genes. Los inves-
tigadores de las levaduras han empleado mucho ambos enfoques. El de-
safío actual no reside en desarrollar métodos de desactivación de genes
de levadura individuales, sino en inventar maneras de investigar el vasto
número de mutantes resultantes para detectar nuevas características
fenotípicas que podrían indicar la función de un gen desactivado. Llevar
a cabo numerosos experimentos en paralelo, cada uno con un mutante
diferente, insume un tiempo prolongado, sobre todo cuanto hay una
cantidad tan grande de fenotipos por evaluar. Por lo tanto, se requieren
estrategias de investigación en gran escala.
El más eficazde estos métodos de investigación es la estrategia de deleción
con introducción del código de barras. Esta es una modificación del siste-
ma de casete de deleción básico presentado en la figura 5.21., pero la dife-
rencia es que el casete también incluye dos secuencias de 20 nucleótidos
"código de barras", diferentes para cada deleción, que actúan como etique-
tas para ese mutante particular (figura 5.30). Cada código de barras está
flanqueado por el mismo par de secuencias y, por 1o tanto, puede ser ampli- I
ficado por una sola PCR. Esto significa que es posible mezclar gnrpos de (
cepas de levaduras mutadas, cada una con un gen desactivado diferente, e I
investigar sus fenotipos en un solo experimento. Por ejemplo, para identi- (
ficar los genes requeridos para el crecimiento en un medio rico en glucosa, I
se mezclaría un conjunto de mutantes y se lo cultivaría en estas condicio- (
nes. Tras la incubación, se prepara DNA del cultivo y se lleva a cabo la PCR t
(
del código de barras. El resultado es una mezcla de productos de la PCR,
(
cada uno de los cuales representa un código de barras distinto, cuya abun-
(
dancia relativa indica la de cada mutante después del crecimiento en un
(
medio rico en glucosa. Los códigos de barras ausentes, o presentes sólo en
(
escasa cantidad, señalan los mutantes cuyos genes desactivados eran nece-
(
sarios para crecer en estas condiciones.
(
Al igual que la identificación de genes, la caracterización funcional de
los genes de levadura está en progreso y transcurrirán varios años
antes de que este proyecto comience a completarse. Pero gradualmen-
te se está avanzando. Alrededor del 55ok de los genes de levadura tie-
nen ahora una función bien caracterizada, asignada por una o más
técnicas experimentales. Esto representa 1.500 genes más de que los
que había cuando se secuenció el genoma por primera vez. Otros
2.000 genes -33o/o del total- tienen funciones que han sido asignadas
 Resumen 165

por análisis de homología. Esto deja sólo 500 ORF, que se piensa
que
son genes genulnos, pero no tienen ninguna función asignada, y otros
-Onf cuestionables, que talvez no sean genes reales'
iOO

Resu**==
Se han creado diversos métodos para identificar los genes de un geno-
ma y determinar sus funciones. Algunos son computarizados y otros
i-oíi"ut experimentación. Cuando se obtiene por primeravezla secuen-
.iá4. u.r géro*a, el objetivo inicial es localizar las posiciones de todos
los genes. Para los genes que codifican proteínas, esto se puede intentar
tu.óundo los marcos de lectura abiertos (ORF), lo cual es complicado
los eucariontes debido a la presencia de intrones, cuyas secuencias
"n
1ímite son variables y no pueden identificarse con exactitud. También se
oueden localizar los genes de RNA funcionales investigando sus carac-
ierísticas típicas, sobre todo su capacidad de plegarse en estructuras
secundarial mediante la formación de estructuras tallo-bucle apareadas
por sus bases. Asimismo, se pueden localizar genes por análisis de
[romología, que uriliza Ia preseñcia de un gen equivalente en un segun-
do genoma cómo evidencia de que un presunto gen del genoma de
prue-
ba és genuino. El análisis de homología aumenta su potencia cuando se
dispone de la secuencia completa de un genoma relacionado-. Los méto-
doÁ experimentales para la localización de genes se basan en la detección
de moiéculas de RNA transcritas a partir del genoma. Estos métodos
comprenden la secuenciación de cDNA y el mapeo de transcritos por
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) o análisis de heterodúplex. se
pueden asignar en forma tentativa las funciones de los genes por análi-
iis d" ho*ología, pues los homólogos presentan una relación evolutiva
y suelen cumplir, aunque no siempre, funciones similares. La mayoría de
ias técnicas experimentales para determinar las funciones de los genes
consisten en examinar el efecto que provoca la desactivación del gen en
el fenotipo del organismo. La desactivación se puede lograr_de diversas
maneras: por recombinación homóloga con una copia defectuosa del
gen, por inserción de un transposón en el gen o por ribointerferencia
(este último enfoque ha sido muy eficaz en Caenorhabditís elegans).
Asimismo, se puede recurrir a Ia sobreexpresión del gen para evaluar su
función, pero tanto con desactivación como con sobreexpresión, a veces
es difícil detectar un cambio fenotípico y la función precisa del gen
puede seguir siendo esquiva. Es posible efectuar estudios más detallados
de la función de un gen por mutagénesis dirigida al sitio, y determinar
la localización celular de una proteína por expresión de un gen indica-
dor o por inmunocitoquímica. Cuando se completó la secuencia del
genoma de Saccharomyces cerevisiae en 1996, se identificaron 6.274
ORF que podían ser genes, pero ahora se ha modificado esta cifra a
6.120, después de análisis experimental y comparaciones con genomas
de otras levaduras. Al principio, sólo 3O%o de estos genes tenían fun-
ciones bien caractetizadas, pero esta cifra ha aumentado de manera gra-
dual por análisis de homología y por aplicación de estudios funcionales
de alto rendimiento, como la estrategia de deleción con introducción
del código de barras.
 ,i;

= =:.1€

=Ifl
r= # Tr= - {É * # ffi € *l=eEeG
= ;:
.:i _;
: ,:
.
=
- :. - -1 -:+- :.-
, =,.;.;
:

.".. .
. i.: i 1¿
: :!j

ira¡ ¡script**.:a
litrtsg,$ei
@
e .3 irlá: eiia ri*lFr*t**mñ

j:,,, --r-'-: :::: :l+i': + i.:;,*"..:, li": '",:l:';"

.'.§:l;;
'i

Describir cÓmo se puede estudiar un transcriptoma por análisis de la secuencia de cDNA.

Evaluar Ios puntos fuertes y déblles de la técnica de micromaÍices y chips para el estudio de transcripto-
mas, y explicar cómo se comparan los patrones de expresión de genes revelados
por estos estudios.

Dar ejemplos de las contribuciones que han aportado los estudios de transcriptomas a nuestro conocl-
miento de la biología de la levadura y el cáncer humano.

Ditinguir entre los diferentes tipos de información obtenid¿ por el estudio de los transcriptomas y los
proteomas.

Describir cómo se lleva a cabo el perfil proteico.

Comparar y contrastar los métodos empleados para identificar pares y grupos de proteinas que interactú-
an entre sí'en células vivas y, sobre todo, distinguir los métodos que identifican interacciones fisicas de
aquellos que identifican interacciones funcionales.

Dar ejemplos de mapas de interacción proteica y analizar sus caracterÍlicas imporiantes.

' Explicar la base y la importancia del perfil bioquímico.

Reseñar los principios y los objetivos de la biología de sistemas.

En el capítulo anterior aprendimos la forma deuttlizat diversas técnicas com-

putarirádas y experimentales para asignar funciones a genes descubiertos
dentro de la- secuencia de un genoma y cómo su aplicación al genoma de
Saccharomyces cerevisiae casi ha duplicado el número de genes de los que se
conocen funciones definidas. Este tipo de anotación de genomas es un
emprendimiento masivo, pero aunque sea posible identificar y asignar una
funiión a todos los genes de un genoma, todavía persiste un desafío: saber
cómo opera el genoma en su conjunto dentro de Ia célula especificando y
coordinándo las diversas actiüdades bioquímicas que tienen lugar. Estos
estudios globales de actividad del genoma deben considerar no sólo el geno-
ma en sí mismo, sino también el transcriptoma y el proteoma que son sinte-
tizados y mantenidos por el genoma. Asimismo, deben analizx la manera en
que el transcriptoma y el proteoma establecen y cqordinan el criterio de valo-
ración final de la expresión del genoma: la red de vías y procesos bioquími-
cos relacionados qué constituye una célula viva. En este capítulo, analizamos
los métodos empléados en estos estudios globales de la actividad del genoma.
 EFI
iF.-

172 Capítulo 6 Conocimiento del funcionamiento de un genoma =

§

Clóbulo
de celulosa
€.? Esáeedis del ÉrascssripÉ+ma
El transcriptoma comprende los mRNA presentes en una célula en un
Cadena de otigola1lrrr momento particular. Los transcriptomas pueden tener composiciones
muy complejas, con cientos o miles de diferentes mRNA representados,
II Añadir RNA que forman, cada uno, una fracción diferente de la población global
(sección t.2.4). Por lo tanto, para caracterizar un transcriptoma es nece-
. TTTT
sario identificar los mRNA que contiene e, idealmente, determinar sus
concentraciones relativas.
I Convertir en
t cDNAbicatenario

3' §.! -E §sÉudia de ¡,:r: tre*srrlpt*r¡:e F*r ar:élgsig

cDNA TTTTTiTfT-l-l-ITIT[llil de s*{=,:€rE€iñ§
5¡
hhhh -.
I Digerir con A/ul El modo más directo de carac tenzar un transcriptoma es convertir su
¿ mRNA en cDNA (véase figura 3.36) y, después, secuenciar cada clon de
rm-i-:-
lr¡¡¡l n llll -r
la genoteca de cDNA resultante. Las comparaciones entre las secuencias
de cDNA y la secuencia del genoma revelarán las identidades de los
genes cuyos mRNA están presentes en el transcriptoma. Este enfoque es
,/ -
...::.. I

factible, pero laborioso, y se necesitan muchas secuencias diferentes de

Desechar el ¡ Ligar el oligonucleótido
cDNA antes de que comience a aparecer un cuadro casi completo de la
fragmento terminal t que contiene la secuencia
Bsmtl
'rrrrr-rrrrt composición del transcriptoma. Si se están comparando dos o más
TTTT
rrtt¡rtttt..r. transcriptomas, aumenta el tiempo requerido para completar el proyec-
to. ¿Se puede utilizar algún atajo para obtener con más rupidez informa-
i Digerir con EsrnFl ción vital sobre la seeuencia?
J
TTJ-
rl
TTTT
L ¡¡¡¡ El análisis seriado de la expresión de genes (serial analysis of gen
expression, SAGE) aporta una solución. En lugar de estudiar cOÑA
\ completos, el SAGE arroja secuencias cortas, de tan sólo 12 pb de lon-
Recolectar, ligar a otros gitud, cada una de las cuales representa un mRNA contenido en el trans-
f ragmentos, secuenciar
criptoma. El fundamento de esta técnica es que estas secuencias de 12
pb, pese a que son cortas, bastan para permitir que el gen codifique el
mRNA que va a ser identificado. El argumento se basa en que cualquier
Figura 6.I SAGE. En este ejemplo, la secuencia de 12 pb particular debe aparecer en el genoma una vez cada
primera enzima de restricción que se 4r2 = 16.777.216 pb. El tamaño promedio de un mRNA eucarionte es
utiliza es Alul, que reconoce el sitio
de alrededor de 1.500 pb, de modo que 412 equivale a la longitud com-
diana de a pb 5'-ACCI-5'. El oligonu-
cleótido que es ligado al cDNA contie- binada de más de 1 1.000 transcritos. Esta cifra es más alta que la canti-
ne la secuencia de reconocimiento para dad de transcritos previstos en todos los transcriptomas, éxcepto los
BsmFl, que corta de l0 a 14 nucleóti- más complejos, de manera que etiquetas de secueniias de 12pb deben
dos, y así escinde un fragmento del permitir la identificación de los genes que codifican todos los mRNA
cDNA. Se ligan fragmentos de diferen- presentes.
tes cDNA para producir el concatámero
que es secuenciado. Con este método,
el concatámero que se forma está
En la figura 6.1 se ilustra el procedimiento utilizado para generar etique-
compuesto, en parte, por secuencias tas de 12 pb. Primero, se inmoviliza el mRNA en una columna de cro-
derivadas de los oligonucleótidos matografía por hibridación de colas de poli(A), presentes en los extremos
BsmF1. Para evitar eso y obtener así un 3' de estas moléculas, a cadenas de oligo(dT) que han sido fijadas a gló-
concatámero compuesto completa- bulos de celulosa. Se conüerte el mRNA en cDNA bicaténario y, des-
mente por fragmentos de cDN§ se pués, se lo trata con una enzima de restricción que reconoce un sitio
puede diseñar el oligonucleótido de
diana de 4 pb y, por lo tanto, practica cortes frecuentes en cada oDNA.
manera que el extremo que se liga al
cDNA contenga Ia secuencia de reco-
El fragmento de restricción terminal de cada cDNA peÍnanece unido a
nocimiento para una tercera enzima de los glóbulos de celulosa, lo que permite eludir y desechar todos los
restricción. EI tratamiento con esta enzi- demás fragmentos. Ahora, se une al extremo libre de cada cDNA un oli-
ma escinde el oligonucleótido del frag- gonucleójido corto, que contiene una secuencia de reconocimiento para
mento de cDNA BsmFl. Esta es una enzima de restricción atípica pues, en lugar de pro-
ducir el corte dentro de su secuencia de reconocimiento,lo hace de 10
a 14 nucleótidos corriente abajo. Por lo tanto, el tratamiento con BsmFI
elimina un fragmento con una longitud promedio de 12 pb del extrerno
de cada cDNA. Se reúnen los fragmentos, se los liga cabezacon cola para
producir un concatámero y se los secuencia. Se identifica cada secuencia
H Estudio del transcriptoma l7t

Micromatriz
edqueta dentro del concatámero y se la compara con las secuencias de
los genes en el genoma.

6.I.? Estudác de u¡: tra*script+rna Pcr a§?élási§

de mEcrcmatri{es e ehips
También se pueden utilizar chips y micromatrices de DNA (véase Nota
I
sobre técnicas 3.1) para estudiar transcriptomas. Cabe recordar que la
Hibridar a
.[ cDNA marcado
diferencia entre ellos es que un chip transporta una matriz de oligonu-
cleótidos inmovilizados sintetizados in situ sobre la superficie de una
oblea de üdrio o silicona, mientras que las micromatrices comprenden
moléculas de DNA -en general, productos de PCR o cDNA- que han
sido colocadas sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio o una
membrana de nailon. Tanto las micromatrices como los chips se emple-
an de la misma manera (figura 6.2). Se convierte la población de mRNA
que forma un transcriptoma en una mezcla de cDNA marcados (casi
s)eqpre con una sustancia fluorescente), se los aplica a la micromatriz
o elc-hip-fse detectan las posiciones en las que sá produce hibridacién.
En comparación con la SAGE, este enfoque tiene la ventaja de que per-
mite evaluar con rapidezlas diferencias entre dos o más transcriptomas
hibridando diferentes preparaciones de oDNA a matrices idénticas y
comparando los patrones de hibridación. Se puede lograr mayor refina-
miento utilizando como sonda para la matiz el cDNA preparado de la
fracción de mRNA que está unido a los ribosomas de las células en estu-
dio y no del mRNA total. El mRNA unido corresponde a la parte del
transcriptoma que está dirigiendo activamente la síntesis proteica, 1o Figura 6.2 Análisis en micromatri-
que aporta un cuadro algo diferente de la actividad del genoma ces. Se marca una preparación de
cDNA con una sustancia fluorescente
Consideraremos, primero, los problemas técnicos de los estudios con y se la hibrida a la micromatriz. El
marcador se detecta por barrido con
micromatrices y chips, y después, algunas de las aplicaciones de este tipo
láser confocal y la intensidad de la
de análisis. señal se convierte en un espectro de
seudocolores, donde rojo indica Ia
máxima hibridación, seguido de ana-
üiílizccíon de una micromatriz o un clzip para estudí*r
ranjado, amarillo, verde, azul, índigo y
¿Jno 0 mós trsnscriptomas violeta (este último representa el nivel
Cuando se arraltza un transcriptoma, los dos objetivos claves son identifi- de hibridación basal). Véase mayor
car los genes cuyos mRNA están presentes y determinar las concentracio- información sobre la preparación y el
uso de una micromatriz en la Nota
nes relativas de estos diversos mRNA. El primero de estos requisitos exige
sobre técnicas 3.1. lmagen, cortesía
que cada gen relevante esté representado por no menos de una sonda en la de Tom Strachan, reimpreso con auto-
matnz. Con una micromatriz, eso se logra utilizando productos de PCR o rización de Noture.
cDNA derivados de los genes de interés, y con un chip de DNA, sintetizan-
do en cada posición una mezcla de oligonucleótidos, quizá hasta 2O dtf.e-
rentes en total, cuyas secuencias se aparean en diferentes posiciones, en el
gen relevante (fig. 6.5). El segundo requisito -la posibilidad de determinar
las concentraciones relativas de cada mRNA del transcriptoma- se satisfa-

Gen
EEE- F ¡¡

,/ Oligonucleótidos que se aparean

cDNA o producto de la PCR
en diferentes posiciones dentro del gen
Figura 6.5 Micromatrices y chips de
DNA. Cada posición de una microma-
triz contiene un cDNA o un producto
de la PCR de un gen de interés,
- mientras que cada posición de un
. ,l't ,,'t,,.' chip de DNA contiene una mezcla de
Chip de DNA
oligonucleótidos, cuyas secuencias
coinciden con diferentes segmentos
Micromatriz del gen relevante.
 I

-
174 Capítulo 6 Conocimiento del funcionamiento de un genoma

Más Diana saturada;

intens¿
*.ft++?*
IIIIIIIIIi
no hay aumento de la
hibridaciónsiseañade
más sonda

Señal de g¿¿
hibridación f.f TT ñ
tlllrrllr*! Diana no saturada;
señal de hibridación proporcional
a la concentración de la sonda

Figura 6.4 Relación entre intensidad

de la hibridación y concentracíón
de la sonda. Concentración de la sonda

ce porque cada posición de la micromatnz o el chip contiene hasta 10e

copias de las moléculas sonda. Este número de copias es más alto que el
previsto para cualquier mRNA de la pequeña cantidad del transcriptoma
que se aplica alamatnz,lo que significa que nunca se satura ninguna posi
ción (hay tanta hibridación que cada molécula sonda está apareada por sus
bases a una molécula diana). Por 1o tanto, el grado de hibridación es varia-
ble y la intensidad de la señal en cada posición depende de la concentra-
ción de cada mRNA del transcriptoma (figura 6.4).

De la lectura previa se podría desprender que los análisis de micromatrices

y chips son procedimientos simples. Sin embargo, en la práctica surgen
diversas complicaciones. La primera es que en todos los transcriptomas,
excepto los más simples, el análisis de hibridación tendrá insuficiente espe-
cificidad para distinguir entre cada mRNA presente. Esto se debe a que dos
mRNA diferentes podrían tener secuencias similares y presentar hibrida-
ci6n cnuada con la sonda específica del otro en la matriz, lo que suele
observarse cuando hay dos o más genes parálogos (sección 5.2.1) activos
en el mismo tejido. El transcriptoma contiene entonces un grupo de mRNA
relacionados, cada uno de los cuales se puede hibridar en cierta medida con
distintos miembros de la familia de genes. Así, puede ser difícil distinguir
las concentraciones relativas de cada mRNA o, incluso, estar seguro de qué
mRNA particulares están presentes. Un problema similar surge cuando dos

123
Pre-mRNA ..
=.-=ffi.-.=.-,

.#..
I 2' l5

I I
*rJ
l

Figura 6.5 Corte y empalme alter- : ::..!

.:É
á
nativo. El corte y empalme alternativo
hace que se liguen diferentes combi-
naciones de exones, lo que determina NJ
R\:
la síntesis de distintas proteínas a par-
tir del mismo pre-mRNA. B.,
-./
.--
 Estudio del transcriptoma 175

o más mRNA diferentes derivan del mismo gen. Esto es bastante frecuen-
te en los vertebrados debido al corte y empalme alternativo, el
proceso por
el cual exones de un pre-mRNA se ensamblan en distintas combinaciones
Dara generar una serie de mRNA relacionados, pero diferentes
(figura 6.5).
'Se
debe diseñar con mucho cuidado la matnz para detectar y cuantificar
con exactitud estas variantes.

Aparecen otras complicaciones si el objetivo es comparar dos o más trans-

cáptomas, lo que es un caso frecuente, como se verá más adelante. Para que
las comparaciones sean válidas, las diferencias entre las intensidades de hibri-
dación para el mismo gen con dos micromatrices o chips distintos deben
representar diferencias genuinas en la concentración de mRNA y no debol
obedecer a factores experimentales, como la concentración de DNA diana de
Tamatnz,la eficiencia con que se ha marcado la sonda o la eficacia del pro-
ceso de hibridación. Aun en un solo laboratorio, rara vez se pueden conffo-
lar estos factores con absoluta precisión, y es más o menos imposible que
sean exactamente reproducibles entre distintos laboratorios. Esto implica que
el análisis de los datos debe incluir procedimientos de normalización que
posibiliten comparar con exactitud los resultados de experimentos en diferen-
tes matrices. Por lo tanto, las maffices deben contener controles negativos,
para poder determinar el nivel de fondo en cada experimento, así como con-
troles positivos, que deben dar siempre señales idénticas. En los kanscripto-
mas de los vertebrados, se suele emplear el gen de actina como control
positivo, ya que su nivel de expresión tiende a ser bastante constante en un
iejido en particula4 cualquiera que sea el estadio de desarrollo o el estado de
enfermedad. Una altemativa más satisfactoria es diseñar el experimento de
modo que se puedan comparar directamente los dos transcriptomas en un
solo análisis con una sola matriz. Esto se efectúa marcando las preparaciones
de cDNA con distintas sondas fluorescentes y barriendolarnatnz en las lon-
gitudes de onda adecuadas para determinar las intensidades relativas de las
dos señales fluorescentes en cada posición, lo cual permite observar las dife-
rencias entre el contenido de mRNA de los dos transcriptomas (figura 6.6).

Si se presupone que es posible efectuar comparaciones exactas entre dos o

más transcriptomas, pueden distinguirse diferencias bastante complejas de

Micromatriz hibridada a ...:'-'..- -:- ,; .-. , ... .....: .'; '

.

dos preparaciones de cDNA ;:=!;.:..::-::;-:-:-'-1'.*íi'-.i1,-a.:;';;:-t"¡'

-
.;',. ':.;;"";.;;;',;:..it:';..-' ,' .'-'. :r
-...-.-_, .'::- :..l'--.:..-.:.:. -::j.::
. .. .
;;;,;.;;llt1.::i.;;;;;:
Barrer en diferentes
tongitudesdeonda
I \

Figura 6.6 Comparación de dos

transcriptomas en un solo experi-
mento. lmagen, cortesía de Tom
Stracham; reimpreso con autorización
Transcriptoma I Transcriptoma 2 de Nature.
176 Capítulo 6 Conocimiento del funcionamiento de un genoma
Figura 6.7 Comparación de los per-
files de expresión de cinco genes
de siete transcriptomas. Se han pre-
parado siete transcriptomas a partir de
células en diferentes períodos, tras el
agregado de un nutriente rico en
energía al medio de crecimiento.
Después del análisis de los datos por
agrupación jerárquica, se construye un
dendrograma que muestra el grado
de relación entre los perfiles de
expresión de los cinco genes.
..§ro§lo§oo"{o"S"'o'o§
Gen A
Gen B
Gen c
Gen D
Gen E
los patrones de expresión de genes. Es probable que los genes con perfiles de
expresión similares tengan funciones relacionadas y se requiere un método
riguroso para identificar estos grupos. El método convencional, denomina
agrupación jerárquica, consiste en comparar los niveles de expresión de cada
par de genes de cada transcriptoma anal:r;ado y asignar un valor que indica
el grado de relación entre esos niveles de expresión. Estos datos se pueden
expresar como un dendrograma, que agrupa a genes con perfiles de expre-
sión relacionados (figura 6.7). El dendrograma aporta una clara indicación
üsual de las relaciones funcionales entre los genes.
,5sf¿-¡dios Cel transcriptúrriú de lc levaduro
Con apenas más de 6.000 genes, la levadura Saccharomyces cerevisiae se
adecua de manera ideal a los estudios de transcriptomas y muchos de los
proyectos pioneros se han llevado a cabo con este microorganismo. Uno de
los primeros descubrimientos fue que, aunque los mRNA se degradan y
resintetizan todo el tiempo, la composición del transcriptoma de la levadu-
ra se modifica muy poco si las características bioquímicas del medio per-
manecen constantes. Cuando la levadura crece en un medio rico en
glucosa, que permite a las células dividirse a su velocidad máxima, el trans-
criptoma es casi totalmente estable y sólo 19 mRNA aumentan más del
doble su concentración en un período de dos horas. Se observan alteracio-
nes significativas del transcriptoma sólo cuando hay depleción de glucosa
en el medio de crecimiento, lo que obliga a las células a pasar de la respi- :ü
ración aerobia a la anaerobia. Durante este cambio, los niveles de más de
ai
700 mRNA se duplican o más, y otros 1.000 mRNA declinan a menos de
la mitad de su concentración original. Es eüdente que los cambios del
medio determinan una reestructuración del transcriptoma para satisfacer
Ias nuevas demandas bioquímicas de la célula.
El transcriptoma de la levadura también se reestructura durante la diferen-
ciación celular. Esto se ha establecido al estudiar la esporulación (formación
de esporas), que es inducida por inanición y otras condiciones estresantes
del medio. Lawa de esporulación se puede dividir en cuatro estadios -tem-
prano, intermedio, intermedio-tardío y tardío- sobre la base de los fenóme'
nos morfológicos y bioquímicos que se producen (figura 6.8). Esrudios
preüos han mostrado que cada estadio se caractenza por la expresión de
una serie diferente de genes, lo que no fue inesperado. Los estudios de trans-
criptomas han aumentado de varias maneras nuestros conocimientos sobre
el proceso de esporulación. Lo más importante es que los cambios de la
composición del transcriptoma indican que el estadio temprano de la espo-
rulación se puede subdividir en tres fases distintas denominadas temprana
(I), temprana (II) y temprana intermedia. Los niveles de más de 25O mRNA
aumentan de modo significativo durante la esporulación temprana y offos
158 mRNA aumentan específicamente durante el estadio medio. Otros 61
mRNA aumentan su coicentración durante el período medio-tardío y 5
más, durante lá tase tardía. También hay 600 mRNA que disminuyen de
concentración durante la esporulación; se presume que éstos son los que
codifican proteínas requeridas durante el crecimiento vegetativo, pero cuya
síntesis se debe suspender cuando se están formando esporas.
5--
 Estudio del transcriptoma

Figura 6.8 Vía de esporulació-n de

Célula diploide de levadura
Sacchoromyces cerevisíoe. Los tres
dibujos del medio muestran las divi-
siones nucleares que se producen
durante la esporulación. Véanse
ESTADIO TEMPMNO detalles de los fenómenos
Replicación, recombinación involucrados en la meiosis I y la
del DNA meiosis ll en Ia figura 5.16.
F-=o€=+
BgFo€uc
aé

I
+eeq §-\
gre§
*-B-aé,

AB.ۤ
ESTADIO INTERMEDIO

Finalización de la meiosis I

\*g 1=_*---
I
ESTADIO INTERMEDIO-TARDíO
la-= e€€.
Meiosis ll

ESTADIO TARDIO
Asco más
ascosporos Síntesis de Ia pared
de la espora, otros
cambios bioqulmicos
I
Germinación, fusión de esporas

Este trabajo sobre la esporulación de la levadura es importante por dos

razones. Primero, al describir los cambios de expresión del genoma que tie-
nen lugar durante la esporulación, los análisis del transcriptoma abren el
camino a estudios de las interacciones entre el genoma y las señales
ambientales que la desencadenan. Estudios de este tipo, en un microorga-
nismo relativamente simple como la levadura, actúan como un modelo
importante de procesos madurativos más complejos que operan en los
eucariontes superiores, incluidos los seres humanos. Segundo, varios de los
mRNA cuyos niveles se modifican en forma significativa durante la espo-
rulación son transcritos de genes con funciones antes desconocidos. Por lo
tanto, los estudios de transcriptomas son útiles para anotar la secuencia de
un genoma y alrrdan a identificar genes cuyos papeles en el genoma no han
sido determinados por otros métodos.

Ei tr*;:s*ri ptom* h u¡;'¡* n*

El transcriptoma humano es muchísimo más complejo que el de la levadu-
ra, pues tiene el quíntuple de genes y los estudios de su composición toda-
vía se encuentran en las primeras etapas. No obstante, se han obtenido
algunos resultados interesantes. Por ejemplo, se han mapeado los transcrip-
tomas de diferentes tipos celulares en la secuencia del genoma humano, lo
que dio por resultado perspectivas globales del patrón de expresión de
genes a lo largo de cromosomas enteros. Esto posibilitó el descubrimiento
importante de que los transcritos están compuestos por regiones del geno-
ma en las que no se sabía que existían genes. Por ejemplo, se han prepara-
do chips de DNA en los que cada sonda oligonucleoldica tiene como diana
posiciones que aparecen, en promedio, cada 35 nucleótidos a lo largo de
los cromosomas 21 y 22. Estos "mosaicos" o tiling arrays comprenden má§
de un millón de sondas, pero sólo 26.000 de ellas residen dentro de los exo-
nes de estos cromosomas. Sin embargo, más de 350.000 de las sondas
detectaron un mRl'lA en por lo menos uno de los 11 transcriptomas huma-
r78 Capítulo5 Conocimiento del funcionamiento de un genoma

#
Figura 6.9 Análisis del transcripto-
ma de los cromosomas humanos g 2lp¡ll 2rqI.2 2l q2l l 2lq2l.2 2rq¿J
o
21 y 22. Se muestra una parte de I o.ro -
cada cromosoma con su patrón de : o.r5 -.1

bandeo C (sección 7.1.2) y se indican .'9 0.10 I t.*

9l
las posiciones en el mapa (21 p11.2, b
o- 0.05 I
j
o.oo
etc.). Para cada cromosoma, el gráfico .s 0.20 "1

superior muestra dónde se localizan €E o.u-.1

.:
:;
los exones conocidos; esta informa- E* 0.rc -.1 ,:i

ción se expresa como densidad de EE 0.0s -l

Á H o.ool
exones para cada "ventana" de DNA 25 30 40 :t:
45
de 5,7 Mb. El gráfico inferior indica las Posición, Mb
posiciones donde se detectan mRNA
en los I I transcriptomas estudiados, ,# ai
expresadas también en este caso
como densidad por ventanas de 5,7 »qtiz DqlW 22qr2.l 22q122
ffi :a
g 22q123 22qt3.32 22qBll
o É
Mb. Reimpreso con autorización de
Kapranov et ol., Science,296,
Í
É¡ o.ro - Cromosoma 22
0.I5 I ]t
9r6-9r9. O 2002 AMS. § o.,o-l
.,.r,.: i i
¡ I
.,,.i¡
i
,;.,|i'i¿,.si , § l,
.1¿
É,t'r,., i
iil
o o05l
o¡o 0-00 J _;1,$¡r,*§='-;f+,É#É-,*;i-i-¡.1JÉ.f +* j.*iÉ.y*5T";¡1,?;L;i;r-i,si-!i*--1"1 j
:,:
-..E
E
o.zo1
:
I 015-1
. i, ,i i: , il,. .ii, : ,
ts
EE
* o.ro..l
o05-.1 '
=
; "r ' ri Ei'E
il #=il 'i T= '
ilr- - ''r! i :É '
! l
**_,1-É,-¿+Li+*=.-. r¡..,u'l,H¿-rtlih:==¡¿,;:***-.",i
l
::
o; o.ooJ ii= '
15 20 25 30 l5 40 45
i:
Posición, Mb .::]

-
j:.1: (

nos de diferentes líneas celulares que fueron estudiados (figura 6.9). En I

todo el genoma, se han identificado alrededor de 10.500 secuencias trans- = l

critas de regiones que se consideraba que no contenían ningún gen. Este É I

trabajo ilustra el importante papel que puede desempeñar el análisis del (

transcriptoma en la anotación del genoma. '::

.:i
l
,l

El análisis del transcriptoma también está teniendo una repercusión impor- tllr

-'rj
tante en los estudios sobre enfermedades humanas, sobre todo el cáncer. La
reestructuración del transcriptoma como consecuencia del cáncer se descu- ;
brió en 1997, cuando se mostró que las concentraciones de 289 mRNA eran j
significativamente diferentes en los transcriptomas de células epiteliales nor- ::¡

males del colon que en células colónicas cancerosas y que alrededor de la .t:

mitad de estos mRNA también presentan una concentración alterada en ,=

células de cáncer de páncreas. Estas observaciones son importantes, pues

conocer las diferencias entre los transcriptomas de células norrnales y can-
:a
cerosas señala diferencias en su bioquimica, y por ende, nuevas maneras de ,

tratar el cáncer. Asimismo, los estudios de transcriptomas tienen aplicacio- ' ':i
I
nes en el diagnóstico del cáncer. En este aspecto, el primer avance se pro-
ra

dujo en 1999, cuando se mostró que el transcriptoma de las células de 13 I

leucemia linfoblástica aguda es diferente del de las células de leucemia ..:

::_
mieloide aguda. Se estudiaron 27 cánceres linfoblásticos y 11 mieloides y,
C

-a I
aunque todos los transcriptomas eran ligeramente diferentes, las distincio- ;:
::
nes entre los dos tipos fueron suficientes para una identificación inequívo- j

ca. La significación de este trabajo reside en las mejores tasas de remisión t

que se pueden alcanzar si el cáncer se detecta en un estadio temprano, antes
de que se observen indicadores morfológicos claros. Esto no es importante :
en estos dos tipos de leucemia, porque se las puede distinguir por medios no
I

f'
genéticos, pero sí lo es en otros cánceres, como el linfoma no Hodgkin. La :i
versión más común de la enfermedad se denomina linfoma difuso de célu- I
c
las B grandes y, durante muchos años, se pensó que todos los tumores de :-i

este tipo eran iguales. Los estudios de transcriptomas modificaron este con-
¿1

::::
E
cepto y mostraron que el linfoma de células B se puede dividir en dos sub- ,::!
li
tipos. Las diferencias entre los transcriptomas de los dos subtipos permiten
:i
i=

:c
&.
 Estudio del proteoma

que
relacionar l cadl uno con una clase diferente de células B, lo estimula
la investigación de tratamientos específicos para cada linfoma.
fJirig.
'li'

G.É deÉ Fr*áe*seee

=sáud3*
Los estudios del proteoma son importantes
porque éste desempeña un
Ir"et fundamental como vínculo entre el genoma y la Óapacidad bioquími-
célula (sección 1.3.2). Por lo tanto, es clave caracteizar los prote-
iu'¿. fu
ámas de diferentes células para comprender cómo
opera el genomay cómo
Iu-áctivida¿ funcional puede provocar enfermedades. Los estudios del
tánscriptoma sólo pueden encarar en pafte estos problemas.
El examen
á.t truric.iptoma aporta una indicación exacta de qué genes están activos
detérminada célula, pero la información sobre las proteínas es
,ru
", exacta. Esto se debe a que los factores que in{luyen en el contenido
á""o.
áe proteínas comprenden no sólo la concentración de mRNA,
sino también
la velocidad de tiaducción de mRNA a proteínas la y velocidad de degra-
áación de éstas. Además, la proteína, que es el producto inicial de la tra-
áucciOn, quizá no sea activa, ya que algunas proteínas deben sufrir
funcionales (sección
modificación física o química antes de volverse
li.S¡. Así, es crucial déterminar la concentración de |a forma activa de
una proteínapara conocer la bioquímica de una célula o un tejido.

La metodología aplicada para estudiar proteomas se denomina proteómi'

ca. En térmiños eitrictos, la proteómica es un conjunto de técnicas diver-
sas relacionadas sólo por su capacidad de aportar información sobre un
proteoma, lo que abarca, además de las identidades de las proteínas cons-
iituyentes, faciores como la función de cada proteína y su ubicación intra-
celülar. La técnica que se emplea para estudiar la composición de un
proteoma se denomina perfil proteico o proteómica de expresión.

ñ.?.E #eÉcra?a:r?G{i*m dcl p€rl:É Fr+á€E{+; ffiétc#+§ Fer*

id*reÉÉiÉ*er §*s pr*t*áa=c= deÉ prct**Eca&
El perfil proteico se.basa en dos técnicas -electroforesis de proteínas y
espectrometría de masas de proteínas- ambas con largos antecedentes,
pero que rarayez se aplicaban juntas en la era pregenómica. En la actua-
iidad,-s" las ha combinado en una de las principales áreas de crecimien-
to de la investigación moderna.

Seper*rión C* lss proteín*s d* L¡r; Prctearfi*

Para caract etizar un proteoma, primero eS neceSario preparar muestraS
puras de las proteínai que 1o componen. Esto dista de ser una tarea tri-
vial, consideiando la complejidad del proteoma promedio: cabe recor-
dar que una célula de mamífero puede contenel de 10.000 a 20.000
proteínas diferentes (sección 1.3.2).

La electroforesis en gel de poliacrilamida (véase Nota sobre técnicas

4.1) es el método esiárrdar para separar las proteínas de unamezela.
según la composición del gefy las condiciones en las que se lleva a cabo
la électroforeiis, se pueden utilizar diferentes propiedades químicas y
físicas de las proteínas como base para su separación. L,9 técnica más
frecuente el detergente denominado dodecil sulfato de sodio,
"*pl"u
que desnaturáliza las proteínas y les confiere una carga negativa que es
aproximadamente equivalente a la longitud del polipéptido desplegado.
En estas condiciones, las proteínas se Separan según sus masas molecu-
lares: las más pequeñas migran con mayor tapidez hacia el electrodo
 Capítulo.s Conocimiento del funcionamiento de un genoma

Cargar la muestra proteica

L
lirliilIi lllt iltlilt
---.r--.---.+ ---.---r..+ -.--r..r....-+
Primera Rotar Segunda
eledoforesis electroforesís

positivo. Las proteínas se pueden separar también por focalización iso-

Figura 6.1 0 Electroforesis bidímen-
sional en gel. eléctrica en un gel que contiene sustancias químicas que generan un gra-
diente de pH cuando se aplica la carga eléctrica. En este tipo de gel, una
proteína migra hasta su punto isoeléctrico, la posición en el gradiente
donde su carga neta es cero. En el perfil proteico, estos métodos se com-
binan en la electroforesis bidimensional en gel. En la primera dimen-
sión, las proteínas son separadas por focalización isoeléctrica. Después,
'se embebe el gel en dodecil sulfato de sodio, se lo rota 90" y se lleva a
cabo una segunda electroforesis en ángulos rectos con la primera, que
separa las proteínas de acuerdo con su tamaño (figura 6.10). Este enfo-
que permite separar varios miles de proteínas en un solo gel.

Después de la electroforesis, la tinción del gel revela tm patrón complejo de

manchas, cada uno de los cuales contiene una proteína diferente (figura
6.11). Cuando se comparan dos geles, las diferencias de patrón e intensidad
de las manchas indican diferencias en las identidades y las concentraciones
relativas de cada proteÍna de los dos proteomas en estudio. Por lo tanto, se
pueden tomar como diana las manchas interesantes para el segundo estadio
del perfil, en el que se determinan las identidades de las proteÍnas reales,
como se describe más adelante. Sin embargo, antes de pasar a este estadio,
es necesario reconocer que la electroforesis bidimensional en gel tiene limita-
ciones que pueden ejercer una repercusión significativa sobre la utilidad
general del perfil proteico como medio de estudiar un proteoma. El proble-
ma más significativo es que no todas las proteÍnas del proteoma se visualiza-
rán en el gel; en particula4 estarán ausentes las que son insolubles en una
sustancia amortiguadora (buffer) acuosa, como muchas de las proteÍnas de
las membranas celulares. Para estudiar estos componentes del proteoma, se I

tPG5-5 (

I
i
f
(
í
c

a
t
Figura 6.l l Resultado de Ia electro-
foresis bidimensional en gel. Se han q
separado proteínas hepáticas de ratón
por focalización isoeléctrica en el i«

rango de pH 5-6, en la primera direc- c

ción, y según su masa molecular, en d
la segunda dimensión. Se han visuali- r(
zado manchas proteicas por tinción d
con solución argéntica. Reimpreso con
d
autorización de Córg et ol.,
Electrophoresis,2l , 1037-1053. @ d
20OO Wiley-VCH Verlag.
 Estudio del proteoma

deben uttl.zar composiciones especiales de sustancias amortiguadoras y

ieles, lo que implica que se deben efectuar varios experimentos en paralelo
íi el objetivo es estudiar un proteoma en su totalidad. También hay proble-
rflas para reproducir la elecffoforesis bidimensional en gel y para crear pro-
.r¿l-i"ntot de control que permitan normalizar los datos de estos geles
cuando Se comparan dos proteomas. Por estas razones, se están buscando
métodos de separación altemativos; en la actualidad, se está dirigiendo la
atención a la cromatografia líquida de alto rendimiento (high-performance
liquid chromatography, HPLC) y la focalización isoeléctrica de flujo libre.

{de¡:tifítar¡** de lrss proi*ín*s Ce ttn proieorrta

La electroforesis bidimensional en gel determina un patrón complejo de
manchas, en el que cada uno representa una proteína diferente. ¿Cómo
identificamos qué proteína está presente en una mancha? Esto solía ser
una proposición difícil, pero los progresos en espectrometría de masas
han aportado el procedimiento de identificación rápida y exacta exigido
por los requerimientos de los estudios de genomas. Al principio, la
ispectrometría de masas se ideó como un medio de identificar un com-
puesto a partir de las relaciones masa-carga de las formas ionizadas que
ie producen cuando se exponen las moléculas del compuesto a un
campo de alta energía. La técnica estándar no se podía utilizar con pro-
teínas porque éstas son demasiado grandes para ionizarlas de manera
eficaz, pero un nuevo procedimiento, la espectrometría de masas por
láser de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-TOF), evita
este problema, por lo menos con péptidos de hasta 50 aminoácidos de
longitud. Como la mayoría de las proteír¡as miden mucho más que 50
aminoácidos, es preciso fragmentarlas antes de examinarlas por
MALDI-TOF. El enfoque convencional consiste en purificar la proteína
a partir de una mancha y digerirla con una proteasa específica de
secuencia, como la tripsina, que escinde la proteína inmediatamente des-
pués de residuos arginina o lisina. En la mayoría de las proteínas, esto
determina una serie de péptidos de 5-75 aminoácidos de longitud.

Una vez ionizado, la relación masa-carga de un péptido se establece a partir

de su "tiempo de vuelo" dentro del espectrómetro de masas, mientras pasa
de la fuente de ionización hasta el detector (figura 6.12). La relación masa-
carga posibilita conocer la masa molecula4 lo que, a su vez, posibilita dedu-
cir la composición de aminoácidos. Si se analiza una serie de péptidos de
una sola mancha proteica del gel bidimensional, es posible relacionar la
información sobre la composición con la secuencia del genoma para identi-
ficar el gen que especifica esa proteína. Asimismo, se pueden emplear las
composiciones de aminoácidos de los péptidos derivados de una sola prote-
ína para verificar que la secuencia de genes sea la correcta y, en particular,
asegurarse de la correctalocalización de los límites exón-intrón. Esto no sólo
ayuda a delinear la posición exac.ta de un gen en un genoma (sección 5.1.1);
también permite identificar vías altemativas de corte y empalme en los casos
en que dos o más proteínas derivan del mismo gen.

Si se están comparando dos proteomas, un requisito clave es que se puedan

ldentificar proteínas presentes en distintas concentraciones. Si las diferen-
cias son relativamenté grandes, serán eüdentes sólo al mirar los genes teñi-
dos después de la eléctroforesis bidimensional. Sin embargo, cambios
relativamente menores de las concentraciones de proteínas indMduales pue-
den provocar modificaciones importantes de hl propiedades bioquímicas
de un proteoma, y por lo tanto, resulta esencial iontat con métoáos que
oetecten cambios en pequeña escala. Una posibilidad consiste en marcar los
componentes de dos proteomas con diferentes sustancias fluorescentes y,
t82 Capítulo 6 Conocimiento del funcionamiento de un genoma -tr
a
§=

Figura 6..l2 MALDI-TOF para deter-

(A) Espectrometría de masas MALDI-TOF -á *-
4 =
minar el perfil proteico. Después de
Mahiz de {j
la electroforesis bidimensional en gel,
se escinde una proteína de interés del l¿
gel y se la digiere con una proteasa, gÉ.
como tripsina. Esto degrada la proteí- E:
na en una serie de péptidos que pue- i:iÉii¡!; i,l!:
¡ri¡,:ii:i as
den ser analizados por MALDI-TOF h¿i;,
(A). En el espectrómetro de masas, I-ai ¿,( ri - r: .: a i i: 5.
los péptidos son ionizados por un Péptido con DI
pulso de energía de un láser y, des- alta relarión ej
masa-carga
pués, acelerados por la columna hasta la
el reflector y sobre el detector. El tC
tiempo de vuelo de cada péptido c(
depende de su relación masa-carga.
Los datos se visualizan como un
ü
espectro (B). El ordenador contiene
una base de datos de las masas
moleculares previstas de cada frag-
mento obtenido con tripsina de todas (B) Espectro de MALDI-TOF
las proteínas codificadas por el geno- H
ma del organismo en estudio, compa- úr
ra las masas de los péptidos s¿
detectados con la base de datos e § ta
identifica la proteína fuente más
probable. G
ni
o fi
G g(
E
a n;
te
d,
p
1500
tL
Relación masa-carga

después, hacerlos correr juntos en un solo gel bidimensional. Ésta es la

misma estrategia que se ulrliza para comparar pares de transcriptomas
(véase figura 6.6).La visualización del gel bidimensional en diferentes longi-
tudes de onda permite valorar las intensidades de manchas equivalentes con
mayor exactihrd que cuando se obtienen dos geles distintos. Una altemativa
más exacta es practicar una marcación isotópica diferencial (isotope coded
a{finiü tag, ICAI) de cada proteoma. Los marcadores para este método se
pueden obtener en dos formas: una que contiene átomos de hidrógeno nor-
males y otra que contiene deuterio, el isótopo pesado del hidrógeno. Las ver-
siones normal y pesada se pueden distinguir por espectrometría de masas, lo
que permite determinar las concentraciones relativas de una proteína en dos
proteomas que se han mezclado durante el estadio MALDI-TOF del proce-
dimiento de obtención del perfil (figura 6.1,3).

s
Figura 6.13 Análisis de dos proteo- G
.¿
mas por ICAT. En el espectro MALDI- G
o
TOF, los picos que corresponden a
ñ
péptidos que contienen átomos de :9
hidrógeno normales están ilustrados o
en azul y los de péptidos que contie-
nen deuterio, en rojo. La proteína en
estudio es alrededor de I,5 veces
más abundante en el proteoma
marcado con deuterio.
 Estudio del proteoma 185

,*"2-2- ldemtiái*acién de Proteírla§

,que ¡nteractúa¡r enÉre sí
También se pueden conocel datos importantes lespecto de la actiüdad del
o"rro*u identificando pares y grupos de proteínas que interactúan entre sí.
Én * nivel detallado, esta información suele ser valiosa cuando se intenta
',lriglru, una función a un gen o a una proteína recién descubiertos (sección
,,i,2"), porqre una interacción con una seggnda proteína bien caractenzada
.iuedá indicar, a menudo, la función de una proteína desconocida. Por
áiemplo, una interacción con una proteínalocÑzada en la superficie celu-
iá, póa¡uindicar que una proteína desconocida participa en el señalamien-
iá int".celutar (seición 14.1). En un nivel global, se considera que la
iéonstrucción de mapas de interacción proteica es un paso importante para
.irincular el proteoma con la bioquímica celular.

','tdentific*ción
de pares de proteínss ífite{zctívzs por p{*sentscíÓn
',ten {sgos ¡u esfuCios de Cas híbridos
Hay varios métodos para estudiar las interacciones proteicaS; los dos más
,útiles son la presentación en fasos lN. de 7., despliegue de proteínas en la
'supelficie difagos, phage display) y el sistema de dos híbridos de levadu-
.ra. En la presentación en fagos se emplea un tipo especial_de vector de clo-
,nación, uno basado en el bacteriófago fu o alguno de los bacteriófagos
,filamentosos, como M13. El vector está diseñado de modo que un nuevo
.gen clonado en é1se expresa de manela que s9 producto proteico se fusio-
.ñu una de las protéínas de la cubierta del fago (figura 6.14A). Por 1o
"otla proteína del fago transporta la proteina foránea en su cubierta,
.tanto,
donde eS "presentada" de una forma que le permite interactuar con otras
proteínas que encuentre el fago. Hay varias marleras de utilizar la presen-
iación en fágos para estudiar las interacciones proteicas. En un método, se Figura 6.14 Presentación en fagos. (A)
El vector de clonación empleado para la
. presentación en fagos es un genoma de
bacteriófago con un sitio de restricción
(A) Producción de un fago de presentación
único localizado dentro de un gen de
una proteína de la cubierta.
Sitio de

rl
restricción

RI
Gen de proteína de la cubGrta del fago
Originalmente, la técnica se llevó a cabo
con el gen lll de Ia cubierta proteica del
¡¡:q.EÉ%':E¡¡ DNAvector fago filamentoso denominado f l, pero
ahora se ha extendido a otros fagos,
I lnsertar el DNA que codifica la proteína incluido ),. Para crear un fago de Presen-
t que se va a presentar tación, se liga la secuencia de DNA que
RR codifica la proteína de prueba en elsitio
l#l=+:i..:$:.::=:?:
de restricción, de manera que se Senera
un marco de lectura fusionado en que Ia
fxpresión \ serie de codones continúa sin romperse
del gen de prueba al gen de la proteína
Fago de
.TTA ATC,GGA GCC. presentación de la cubierta. Después de la transfor-
mación de Escherichio coli esta molécu-
I

Marco de lectura fusionado de fL¡sión PICteína present¿d,r la recombinante dirige la síntesis de una
en la cubierta del faqr¡ proteína híbrida formada por la proteÍna
de prueba fusionada con la proteina de
la cubierta. Por lo tanto, las partículas de
(B) Utilización de una genoteca de presentación en fagos fago producidas por estas bacterias trans-
foimadas presentan la proteína de prue-
ba en sus cubiertas. (B) Utilización de
una genoteca de presentación en fagos.
Se inmoüliza la proteína dentro de un
en fagos
pocillo de una bandeja de microtitula-
ción y se añade la genoteca de prese¡-
l

tación en fagos. Después del lavado, los

-+ si _;*- I:¿:,,
/'l\
I
/''-- >
o,o,.,nuo.-(])
prueba ,:_j
+ !=l
¡' -l
Lavados t-*
fagos retenidos en el pocillo son aque-
llos que presentan una proteína que
interactúa con la proteína de prueba.
t84 Capítulo 5 Conocimiento del funcionamiento de un genoma

presenta la proteína de prueba y se buscan interacciones con diversas pro-

teínas o fragmentos proteicos purificados de función conocida. Este enfo- I

que se ve limitado por el tiempo que insume efectuar cada prueba, por lo
que sólo es factible si se cuenta con alguna información preüa acerca de I

las interacciones probables. Una estrategia más útil es preparar una geno. 1

teca de presentación en fagos, un conjunto de clones que despliegan una

serie de proteínas e identificar qué miembros de la genoteca interactúan
con la proteína de prueba (figura 6.14B).

El sistema de dos híbridos de levadura detecta interacciones proteicas de

Figura 6.15 Sistema de dos híbrídos
de levadura. (A) A la izquierda, se ha
ligado un gen de una proteína humana
al gen del dominio de unión al DNA de
un activador de levadura. Después de
Ia transformación de Ia levadura, esta
estructura especifica una proteína de
fusión, parte proteína humana y parte
activador de levadura. A la derecha, se
han ligado diversos fragmentos de DNA
humano al gen del dominio de activa-
ción del activador: estas estructuras
especifican diversas proteínas de fusión.
(B) Se mezclan las dos series de
estructuras y se las cotransforma en
levadura. Una colonia, en la que hay
expresión del gen indicador, contiene
proteínas de fusión cuyos segmentos
humanos interactúan, lo que aproxima
los dominios de unión al DNA y de
activación, y estimula la RNA polimera-
sa. Véase más información sobre activa-
dores en la sección 11.3.2.
un modo más complejo. En la sección 17.3.2, veremos que las proteínas
denominadas activadores son responsables de controlar la expresión de
genes en los eucariontes. Para cumplir esta función, un activador se
debe unir a una secuencia de DNA corriente arriba de un gen y estimu-
lar a la enzima RNA polimerasa que copia el gen en RNA. Estas dos
capacidades -unión a DNA y activación de polimerasas- son especifica-
das por distintas partes del activador, y algunos activadores actuarán
aun después de la escisión en dos segmentos, uno que contiene el domi-
nio de unión a DNA y otro que contiene el dominio de activación. En la
célula, los dos segmentos interactúan para formar el activador funcional.
El sistema de dos híbridos utiliza una cepa de Saccharomyces cerevisiae
que carece de un activador para un gen indicador. Por lo tanto, este gen
está desactivado. Se liga un gen artificial, que codifica el dominio de unión
al DNA del activado4 al gen de la proteína cuyas interacciones se desea
estudiar. Esta proteína puede provenir de cualquier organismo, no sólo de
levadura: en el ejemplo ilustrado en la figura 6.15A, es una proteína
humana. Tras la introducción en la levadura, esta estructura especiflca la
síntesis de una proteína de fusión formada por el dominio de unión al
DNA del activador ligado a la proteína humana. La cepa de levadura
recombinante todavía puede expresar el gen indicador, porque el activa-

(A) Sistema de dos híbridos (B) Inveligación de las interacciones proteicas utilizando el silema de dos hlbridos

I
HIBRDo I HíBRIDo 2
Dominio de Dominio de i
unión al DNA activación T

-"--..#,-.
r
¡-g¡ffii_lt ¡Éry¡#¡¡ C

I \ .?
L
q

É'-=
E -*re'-. l
rllrc-É¿
¡^

\ j
'l''.+P n
-ffi- - t
-i---rt¡
Expresión l-
\ é del gen t
E:=
Actívación de la RNA
r
RNA polimerasa polimerasa t
,ij
r
t
C

Gen de levadura
^
É € Dominios Dominios
t
-,ft. Cenhumano % É delevadura e = :, humanos
?",,:,
F

re
!:
 Estudio del proteoma

dor modificado sólo se une a DNA; no puede influir en la RNA

polimera-
ii.l-u activación sólo tiene lugar después que la cepa de levadura se ha
cotransformado con una segunda estructura, que comprende la secuencia
áe codificación del dominio de activación fusionada a un fragmento de
ONa q,r" especifica una proteína capaz de interactuar con la proteína
hurnana en estudio (figura 6.158). Al igual que en la presentación en
iagos, si hay cierto conocimiento previo acetca de posibles interacciones,
ir"pr"d"r, investigar uno por uno losfragmentos de DNA en el sistema de
doi hibridos. Pero, por lo general, el gen del dominio de activación está
ligado con una mezcla de fragmentos de DNA, de modo que se forman
mluchas estructuras diferentes. Después de la transformación, se retiran
las células de la placa y se detectan las que expresan el gen indicador iden-
tificado. Éstas son células que han captado una copia del gen del dominio
de activación fusionado con un fragmento de DNA que codifica una pro-
rcina capaz de interactuar con la proteína de prueba.

lde ;:ii?i,:s;!Ó:: *e J*-= i:¿;¡¡"¡::*i'lcilaf:{ d* *np!ejr..; *:t-:ií!prciriiccs

La presentación en fagos y el sistema de dos híbridos de levadura son
mélodos eficaces para identificar pares de proteínas que interactúan
entre sí, pero la identificación de estos vínculos revela sólo el nivel bási-
co de intéracciones proteicas. Muchas actividades celulares son llevadas
a cabo por complejos multiproteicos, como el mediador que desempeña
un papel fundamental en la regulación de la transcripción de genes (sec-
ción 1 1.3.2) o el empalmosoma, que es responsable de eliminar intrones
de pre-mRNA (sección 12.2.2). Por lo general, complejos como éstos
comprenden una serie de proteínas centrales, siempre presentes, junto
con diversas proteínas auxiliares, que se asocian con el complejo en cir-
cunstancias particulares. La identificación de las proteínas centrales y
auxiliares es un paso crucial para comprender cómo cumplen sus fun-
ciones estos complejos. Estas proteínas se podrían identificar par por
par mediante una larga serie de experimentos de dos híbridos, pero es Complejo
évidente que se requiere una vía más directa para determinar la compo- multiproteico

sición de los complejos multiproteicos.

En principio, se puede emplear una genoteca de presentación en fagos para

identificar los miembros de un complejo multiproteico, pues este procedi-
miento permite detectar todas las proteínas que interactúan con la proteí
na de prueba en un solo experimento (véase figura 6.14). El problema es
que la presentación de las proteínas grandes es ineficiente, porque éstas péptido presentado
Proteinas El
rompen el ciclo de replicación del fago; para superar este inconveniente, no detectadas no interactúa con todos
suele ser necesario présentar un péptido corto, que representa parte de una los miembros del compleio

proteína celulaq en lugar de toda la proteína. Por 1o tanto, el péptido pre-

sentado a veces no puede interactuar con todos los miembros del comple-
jo dentro del que está localizada la proteína intacta, porque carece de
algunos de los sitios de unión proteína-proteína presentes en la forma intac- Figura 6.16 La presentación en
ta (figura 6.16). Un método que evita este problema, porque trabaja con fagos puede no detectar a todos
los miembros de un complejo
proteínas intactas, es la cromatografía de afinidad. En ésta, se fija la pro-
multiproteico. El complejo está for-
teína de prueba a una resina de cromato grafia y se la coloca en una colum- mado por una proteína central que
na (véase Nota sobre técnicas 2.5). Se hace pasar el extracto celular a interactúa con cinco proteínas más
través de la columna en una sustancia amortiguadora hiposalina, que per- pequeñas. En el dibujo inferior, se
mite la formación de enlaces de hidrógeno que mantienen unidas a las pro- utiliza un péptido de la proteína cen-
teínas de un complejo (figura 6.t7A). Así, las proteínas que interactúan tral en un experimento de Presenta-
con la proteína de prueba unida quedan retenidas en la columna, mientras ción en fagos. Este péptido detecta a
dos de las proteínas interactivas,
que todas las demás son eliminadas por lavado. Después, se eluyen las pro- pero las otras tres proteínas pasan
teínas interactivas con una sustancia amortiguadora hipersalina. Una des- inadvertidas porque sus sitlos de
ventaja de este procedimiento es la necesidad de purificar la proteína de unión están localizados en una Parte
prueba, lo que insume tiempo y dificulta su utilización como base de un diferente de la proteína central.
186 Capítulo-6 Conocimiento del funcionamiento de un genoma

(A) Cromatografía de afinidad estándar

Figura 6.17 Métodos de cromatografía de afinidad para la purificación de
Extracto celular complejos multiproteicos. (A) En la cromatografía de afinidad elándar, la proteína
-. de prueba está unida a la resina. Se aplica el extracto celular en una sustancia amorti-
Alta guadora hiposalina, de manera que los otros miembros del complejo multiproteico
concen- se unan a la proteína de prueba. Después, se eluyen las proteínas en una sustancia
tración amortiguadora hipersalina. (B) En la TAP, el extracto celular se aplica en una sustancia
Baja concen-
de sal
tración de sal amortiguadora que contiene 2 mM de CaCl2, condiciones que promueven la unión
-.-+ de la proteína de prueba modificada, más las proteínas con las que interactúa, a las
moléculas de calmodulina unidas a la resina cromatográfica. Después, se eluyen las
proteínas en una sustancia amortiguadora que no contiene CaClr.
Resina más
proteínas de
prueba unidas
gran programa de detección. En el método más avanzado denominado
il
purificación por afinidad en tándem (tandem affinity purification, TAP),
creado como medio de estudiar complejos proteicos de S. cerevisiae, se
modifica el gen de la proteína de prueba, de manera que la proteína, al ser
sintetizada, tenga una extensión del C terminal que se une a una segunda
proteína llamada calmodulina. Se prepara el extracto celular en condicio-
nes delicadas para no degradar el complejo multiproteico y, después, se lo
",.
Desechar .
hace pasar a través de una columna de cromatografia de afinidad empaque-
tada con una resina a Ia que se han unido moléculas de calmodulina. Esto
determina la inmovilización tanto de la proteína de prueba como de otras
l,:
con las que ésta se asocie (figura 6.178). En ambas técnicas, se establece
(B) Purificación por afinidad en tándem la identidad de las proteínas purificadas por espectrometúa de masas.
Extracto celular
Cuando se empleó en una detección en gran escala de los 1.739 genes de
la levadura, la TAP identificó 232 complejos multiproteicos, lo que aportó
j nuevos conocimientos sobre las funciones de 344 genes, muchos de los
'n
cuales no habían sido caracterizados antes por medios experimentales.
2mM , 5tn r,É

CaCl, -, € CaCl,
-+ .:
.¡l::l
,* +., l
Una desventaja de los métodos cromatográficos de afinidad es que se usa un
solo miembro de un complejo multiproteico como "señuelo" para el aisla-
?i
...e in
miento de otras proteínas de ese complejo. En la práctica, si un miembro del
Resina con :
l
complejo no interactúa directamente con el señuelo, puede no ser aislado
proteínas (figura 6.18). Por 1o tanto, el método identifica grupos de proteínas presen-
calmodulina tes en un complejo, pero no siempre aporta el complemento de proteínas
unidas
totales del complejo. Así, un objetivo importante de la investigación actual
es obtener medios para purificar complejos intactos. En la coinmunopreci-
pitación, se prepara un extracto celular en condiciones delicadas, de
manera que los complejos perrnanezcan intactos. Después, se añade un
anticuerpo específico contra la proteína de prueba, que provoca la pre-
:1= cipitación de esta proteína y todos los demás miembros del complejo al
i.= que pertenece. La técnica multidimensional de identificación de proteínas
.:. Desechar Proteinas
de prueba (MudPIT) es más complicada y combina diversas técnicas cromatográficas
más (p. ej., cromatografía líquida de intercambio catiónico en fase inversa
proteinas
inie¡'activas o cromatografía de exclusión por tamaño) para aislar complejos intac-
tos. Después, se pueden identificar los componentes de un complejo
por espectrometría de masas. Este método se utilizó por primera vezpara
estudiar la subunidad grande del ribosoma de levadura y permitió identifi-
car lt proteínas que no se sabía que estaban asociadas con este complejo.

nt¡ ! ¡ i ::,-i ¡ a c
i3
= = F ía li : i: as :,: n ! n i +tc :;i s n =l ft: t c : o n n i =.:
Las proteínas no necesitan formar asociaciones físicas entre sí para pre-
sentar una interacción funcional. Por ejemplo, en las bacterias como
Escherichia coli,las enzimas lactosa permeasa y B-galactosidasa tienen
una interacción funcional, pues ambas participan en la utilización de
lactosa como fuente de carbono. Pero estas proteínas no tienen interac-
ción física: la permeasa está ubicada en la membrana celular y transpor-
ta lactosa hacia la célula, y la B-galactosidasa, que degrada la lactosa en
glucosa y galactosa, está presente en el citoplasma celular (véase figura
 Estudio del proteoma t87

g.8A). Muchas enzimas que actúan juntas en la misma vía metabólica Cómplejo
nunca establecen interacciones físicas entre sí y si los estudios se basa- multiproteico

ran sólo en la detección de asociaciones físicas entre proteínas pasarían

inadvertidas muchas interacciones funcionales.

Se puede recurrir a varios métodos para identificar proteínas que presen-

tan interacciones funcionales. La mayoría de ellos no implican el estudio
directo de las proteínas propiamente dichas y en términos estrictos, no per-
tenecen al encabezamiento general de "proteómica". No obstante, es con-
veniente considerarlos aquí porque la información que aportan se suele Señuelo más Proteinas

incluir, junto con los resultados de los estudios de proteómica, en los mapas proteínas no obtenidas
unidas
de interacción proteica. Estos métodos son los siguientes:
La genómica comparativa se puede aplicar de diversas maneras para
identificar grupos de proteínas que tienen relaciones funcionales. Un Figura 6.18 Una desventaja de la
enfoque se basa en la observación de que pares de proteínas, que son cromatografía de afinidad. Si Ia pro-
moléculas distintas en algunos organismos, están fusionados en una teína señuelo (marcada con una "B")
sola cadena polipeptídica en otros; por ejemplo, el gen de levadura no interactúa directamente con una o
HIS2, que codifica una enzima que participa en la biosíntesis de his- más proteinas del complejo, entonces
esas proteínas podrian no ser aisladas.
tidina. En E. coli, hay dos genes homólogos de HIS2. Uno de ellos,
llamado his2, muestra una similitud de secuencia con la región 5' del
gen de levadura, y el segundo, hisl0, es similar a la región 3' (figura
6.19). La implicación es que las proteínas codificadas por his2 e
hisl) interactúan dentro del proteoma de E. coli para proporcionar
parte de la actividad de biosíntesis de histidina. El análisis de las
bases de datos de secuencias revela muchos ejemplos de este tipo, en
que dos proteínas de un organismo se han fusionado en una sola pro- H/S2 de levadura

teína en otro organismo. Un enfoque similar se basa en el examen de his2 de E coli

operones bacterianos. Un operón está forrnado por dos o más genes
que se transcriben juntos y que suelen tener una relación funcional histo de E col¡

(sección 8.2). Por ejemplo, los genes de lactosa permeasa y B-galac-

tosidasa de E. coli están presentes en el mismo operón, junto con el
gen de una tercera proteína que participa en la utilización de lacto- Figura 6.,l9 Análisis de homología
sa. En consecuencia, se pueden utilizar las identidades de los genes para deducir interacciones proteína-
de operones bacterianos para inferir interacciones funcionales entre proteína. La región 5' del gen de
las proteínas codificadas por genes homólogos en un genoma euca- levadura Hl52 es homóloga a his2 de
Escherichio coli, y la región 5' es
rionte. homóloga a hisl0 de Escherichia coli.
Los estudios del transcriptoma permiten identificar interacciones
funcionales entre proteínas, pues los mRNA de proteínas funcional-
mente relacionadas suelen presentar perfiles de expresión similares
en diferentes condiciones.
Los estudios de desactivación de genes pueden ser informativos. Si
se observa un cambio fenotípico sólo cuando se desactivan juntos
dos o más genes, es posible inferir quq esos genes funcionan juntos
para generar el fenotipo.

M*p::s d* ;'*ie¡*rd*r: pror*!*c

Los mapas de interacción proteica, denominados también redes de inter-
actomas, presentan todas las interacciones que se producen entre los com-
ponentes de un proteoma. En 2001., se construyeron los primeros de estos
mapas para proteomas relativamente simples, casi por completo a partir
de experimentos de dos híbridos. Estos mapas iniciales fueron el de la bac-
:
tena Helicobacter pylori, que comprendía más de 1.200 interacciones que
:

mvolucraban casi la mitad de las proteínas del proteoma, y otro de 2.240

: interacciones entre 1.870 proteínás del proteoma de S. cerevisiae (figra
: 6.20A). La aplicación de nuevas técnicas ha permitido obtener versiones
más detalladas del mapa de S. cerevisiae., como algunos en los que se ilus-

:
r88 Capítulo 6 Conocimiento del funcionamiento de un Senoma
Figura 6.2o Versiones del mapa de
interacción proteica de
Socchoromyces cerevisio e. (A) Mapa
inicial, publicado por primera vez en
200.l. Cada punto representa una pro-
teína y las líneas que los conectan indi-
can interacciones entre pares de
proteínas. Los puntos rojos son proteí-
nas esenciales: una mutación desactiva-
dora del gen de alguna de estas
proteínas es letal. Las mutaciones de
genes de proteínas señaladas con pun-
tos verdes no son letales y las mutacio-
nes de genes de proteínas
representadas en anaranjado inducen
crecimiento lento. No se conocían los
efectos de las mutaciones de genes de
proteínas mostradas como puntos ama-
rillos cuando se construyó el mapa. (B)'
Mapa más completo, públicado ón
2OO2. En este mapa, cada óvalo es un
complejo proteico y se ilustran las
conexiones entre complejos que com-
parten por lo menos una proteína. Los
complejos están codificados por color
según su función: rojo, ciclo celular;
verde oscuro, señalamiento; azul oscu-
ro, transcripción, mantenimiento de
DNA o estructura de la cromatina; rosa,
transporte de proteínas o RNA; anaran-
jado, metabolismo del RNA;verde
claro, síntesis o recambio de proteínas;
pardo, polaridad o estructura celular;
violeta, metabolismo intermedio o ener-
gético; celeste, biogénesis o tráfico de
membrana. lmagen (A) gentileza de
Hawoong Jeong. Reimpreso con autori-
zación de Jeong et ol. (2OO1), Noture,
411 , 41-42. lmagen (B) gentileza de
Anne Claude Cavin. Reimpreso con
autorización de Cavin et ol. (2OO2),
Noture, 415, 141-147.
¡@o-o
(a
€D
(Bo,
-t 3
EgotD a
ir
tran interacciones entre grupos multiproteicos (no dentro de ellos) (figura
6.208). También se han generado por primera vez mapas para especies
más complejas, como Caenorhabditis elegans.
¿Qué características interesantes han surgido de estos mapas de interac-
ción proteica? El descubrimiento más inquietante es que cada red está
construida alrededor de una pequeña cantidad de proteinas que presentan
numerosas interacciones y que forman nodos (hubs) en la red, junto con
una cantidad mucho mayor de proteínas con escasas conexiones indiüdua-
les (figura 6.21A). Se considera que esta arquitectura reduce las conse-
cuencias sobre el proteoma de los efectos disruptivos de mutaciones que
podrían desactivar proteínas indiüduales. Sólo si una mutación afecta algu-
na de las proteínas de un nodo altamente interconectado, resultará dañada
la red en su conjunto. Esta hipótesis es compatible con el descubrimiento,
a partir de estudios de desactivación de genes (secci6n5.2.2), de que una
cantidad sustancial de proteínas de levadura son, en apariencia, redundan-
tes, lo que significa que si se destruye la actividad de una proteína, el pro-
teoma en su conjunto continúa funcionando de manera normal, sin
repercusión discernible sobre el fenotipo de la célula. El examen de los
perfiles de expresión de las proteínas del nodo y sus compañeras directas
permite dividir estos nodos en dos grupos. El primero corresponde a las
proteínas del nodo que interactúan en forma simultánea con todas sus
compañeras. Éstos se denominan party hubs (nodos "sociables") y su eli-
minación ejerce escaso efecto sobre la estructura global de la red (figura
6.218). En cambio,la eliminación del segundo grupo,7os date /¡ubs (nodos
"de cita"), que interactúan con diferentes nodos en distintos momentos,
rompe la red en pequeñas subredes (figura 6.21C). La implicación es que
el pafi hub trabaja dentro de procesos biológicos indiüduales y no contri-
buye en gran medida a la organizaciín general del proteoma. Por el contra-
rio, los date hubs son los jugadores claves que aportan organización al
proteoma al vincular los procesos biológicos entre sí.
€" 3 Más Eliá del BroteCIme
Tradicionalmente, se considera que el proteoma es el producto final de
la expresión del genoma, pero este concepto oscurece el verdadero papel
del proteoma como parte del eslabón final que conecta el genoma con la =
;i!
rjj
bioquímica de la célula (figura 6.22). La exploración del carácter de esta .g
relación es uno de los aspectos más interesantes y productivos de la bio- ..r
logía moderna. -i;
=
§
i-=
;s
 Más allá del Proteoma I89

(A) Red comPleta (B) Eliminación delos pofi hubs

.€

(C) Eliminación delosdote hubs

Figura 6.2I Nodos del mapa de ínteracción proteica de
:', Soccharomyces cerevisioe. Este mapa fue publicado en
-'):': 2OO4. Los nodos (hubs) son claramente visibles en el mapa
::
" completo (A). Tras la eliminación de los porty hubs,la red apa-
# l?,,
rece casi intacta (B), pero después de eliminar los dote hubs,
la red se divide en subredes desprendidas (C). lmagen, genti-
leza de Nicolas Bertin. Reproducido con autorización de Han et
ol. QOOQ Noture, 430, 88-93.

- Fa E

b.5. É
- -
SíÉ€EEDüESí??E
=E
A menudo, los progresos más importantes en biología no provienen de algún
experimento espectacular, sino que surgen porque los biólogos conciben una
nueva manera de pensar acerca de un problema. La introducción del concep-
to de metaboloma es un ejemplo. El metaboloma se define como el conjun-
to completo de metabolitos presentes en una célula o un tejido, en una serie
de condiciones particulares. En otras palabras, un metaboloma es un plan
bioquÍmico detallado, y su estudio, denominado metabolómica o perfil bio-
químico, representa una descripción precisa de la bioquímica de base de dife-
rentes estados fisiológicos, incluidos estados patológicos, que puede adoptar
una célula o un tejido. Al convertir la bioquímica de una célula en una serie
de tópicos metabólicos, la metabolómica aporta diversos datos que se pue-
den vincular directamente con la información de tópicos equivalentes que
surgen de la proteómica y otros estudios de expresión del genoma.

Un metaboloma se puede caractertzat por técnicas químicas como espec-

troscopia infrarroja, espectroscopia de masas y espectroscopia por reso-
nancia magnética que, solas o combinadas, permiten identificar y ITranscripción
cuantificar las diversas moléculas pequeñas que forman los metabolitos
de una célula. Cuando se combinan estos datos con el conocimiento
acerca de la velocidad de reacción en los diversos pasos de vías bioquí-
fTraducción
micas bien caracterizadas, como glucólisis y ciclo del ácido tricarboxíli-
co, es posible crear el modelo de flujo metabólico, la velocidad de flujo
de metabolitos a través de la red de vías que forman la bioquímica celu-
lar. Entonces, se pueden definir los cambios."del metaboloma en térmi-
nos de alteraciones del flujo de metabolitos a través de una o más partes
de la red, lo que aporta una descripción muy compleja de la base bioqui
mica de los cambios del estado fisiológico. Esto abre la posibilidad de la
ingeniería metabólica, que provoca cambios en el genoma por mutación
o técnicas de DNA recombinante para influir de una manera predeter-
Figura 6.22 El proteoma forma parte
minada en la bioquímica celular; por ejemplo, para aumentar 1a síntesis del eslabón final que conecta el geno-
de un antibiótico por un microorganismo. ma con la bioquímíca de la célula.
Capítulo 6,Conocimiento del funcionamiento de un genoma

Por ahora, el máximo avance de la metabolómica se ha logrado en

microorganismos como bacterias y levaduras, cuya bioquímica es relati-
vamente simple. En la actualidad, se está investigando de manera consi-
derable el metaboloma humano, con el objetivo de describir los perfiles
metabólicos de tejidos sanos, de estados patológicos y de tejidos de
pacientes sometidos a tratamientos farmacológicos. Cabe esperar que
cuando estos estudios estén más refinados, sea posible utilizar la infor-
mación metabólica para desarrollar fármacos que inüertan o mitiguen
las anormalidades de flujo particulares que ocurren en los estados pato-
lógicos. El perfil bioquímico también podría indicar algunos efectos
colaterales no deseados del tratamiento farmacológico, lo que permitiría
modificar la estructura química del fármaco o su modo de uso, para
reducir esos efectos.

#"=.? {*;:*<ia::i=aeá* #= 3'=s s!sÉ=s.c=*c fuicl*gÉ<*=

El interés actual en los mapas de interacción proteica y Ia metabolómica
nos lleva al último aspecto de la función del genoma que debemos consi-
derar: la necesidad de describir y conocer la expresión de un genoma no
en función de las moléculas -RNA, proteínas y metabolitos- cuya síntesis
dirige el genoma, sino de los sistemas biológicos que resultan de la activi-
dad cooráinada de esas moléculas. Ésta es la esencia del salto que se ha
dado en los últimos años de genes a genomas. Uno de los principios bási-
cos de la era pregenómica de la biología molecular era la hipótesis "un
gen, una enzima", postulada por primera vezpor George Beadle y Edward
Tatum en la década de 1940. Con "un gen, una enzima", esos autores des-
tacaban que un solo gen codifica una sola proteína que, si es una enzima,
dirige una sola reacción bioquímica. Por ejemplo, el gen TrpC de
Escherichia coli codificala enzima indol-3-glicerolfosfatosintasa, que con-
vierte 1-(o-carboxifenilamino)-1'-desoxirribulosa-5'-fosfato en indol-3-gli-
cerolfosfato. Sin embargo, esta enzima no actúa de manera aislada: su
actividad forma parte de la vía bioquímica que da por resultado la sínte-
sis de triptófano; las otras enzimas de esta vía están especificadas por los
genes trpA, B, D y E que, junto con trpC forman el operón de triptófano
de E. coli (véase figura B.8B). Así, la vía de biosíntesis del triptófano es un
sistema biológico simple y el operón del triptófano es la serie de genes que
especifican esa vía. Pero la mera transcripción y traducción de los genes
del operón no inducirán la síntesis de triptófano. La operación exitosa del
sistema requiere que haya enzimas biosintéticas en el lugar apropiado de
la célula, en las concentraciones relativas adecuadas, en el momento opor-
tuno. Por ende, el sistema depende de factores, como la velocidad de sín-
tesis de las proteínas codificadas por genes, el plegamiento correcto de
estas proteínas en enzimas funcionales, la velocidad de degradación de las
moléeulas de enzimas, su ubicación celular y la presencia de las concen-
traciones necesarias de metabolitos que actúan como sustratos y cofacto-
res para Ia síntesis de triptófano. Este sistema biológico simple está
comenzando a adquirir una complejidad bastante importante. Sin embar-
go, con este sistema se están considerando sólo 5 de los 4.405 genes del
genoma de E. colí.

Hasta ahora, se ha avanzado en diversas áreas de la biología de siste'

mas, como el conocimiento del sistema biológico responsable de la sín-
tesis del flagelo de E. coli. Los estudios pregenoma habían mostrado que
la síntesis del flagelo requiere 51 genes organizados en 12 operones, que
son activados en tres grupos (figura 6.23). El primer grupo en ser acti-
vado comprende un solo operón, que contiene dos genes que codifican
una proteína que actúa como reguladora maestra y activa la expresión
del segundo grupo de siete operones, cuyos genes especifican compo-
 Más allá del Proteoma

fthDC
¡¿*n¡

+I
@ erot.inu reguladora maestra

II Activación

fliFGHilK fliE II|LMNOPQR fliAZY flhBAE flgAMN flgBCDEF0Hll

_=#:i- r-_#=1 -"-=- --E-" .:-ffi.--. ,-r:#*=., 1:=@==-. [:iruiiiii¡ bÉii:i
iÁrÉ-ti.i i.Effi¡¡¡ .--¡¡ ¡a-.¡ i.¡¡-¡-.¡ ¡-.=-E.r arE--.¡

I
l,: Filar¡ento
=
'+;"i

fActivación

flgKl
:ii
fliDST
=P--
¡r.i-E-L¡-¡
-:
¡-ñ---h1.

€@€ Sistema de ouimiotaxis

nentes de la estructura basal del flagelo. Uno de estos genes codifica una Figura 6.25 Sistema responsable de
segunda proteína reguladora que activa los cuatro operones restantes, la biosíntesis del flagelo de
que dirigen la síntesis del filamento del flagelo y el sistema bioquímico Escherichio coli.
que permite a la bacteria responder a estímulos químicos rotando su fla-
gelo para nadar hacia un factor quimiotáctico. La utilización cuidadosa
de genes indicadores unidos a operones individuales ha revelado el orden
preciso de activación de los operones de cada grupo y ha permitido asig-
nar coeficientes de activación -parámetros de las tasas relativas de
expresión- a cada operón. La información resultante basta para crear un
modelo computarizado del sistema, 1o que posibilita determinar las fun-
ciones detalladas de las dos proteínas reguladoras. A partir de modelos
computarizados, es posible predecir los efectos de cambios sutiles del
sistema (p. ej., cambio de las propiedades de uno de los reguladores) e
investigarlos mediante nuevos experimentos con el sistema biológico.
Este es justamente el tipo de investigación que se espera poder realizar
algún día con células humanas, a fin de conocer la base exacta de las
anormalidades y con la esperanza de crear métodos que ayuden a resta-
blecer el estado normal del tejido patológico. Abordar estos sistemas
biológicos mucho más grandes, con el magnífico objetivo de saber cómo
trabaja una célula bacteriana o eucarionte, pondrá a prueba la inventiva
y los recursos de los biólogos de las décadas venideras. De todos modos,
se ha dado el primer paso al trasladar el interés en el funcionamiento de
genes individuales al de genomas completos y al establecer técnicas para
estudiar transcriptomas, proteomas y metabolomas, que forman los com-
ponentes de estos sistemas biológicos.

Resume*r
El principal desafío de la posgenómica es conocer la forma en que especi-
fica y coordina el genoma las diversas actividades bioquímicas que tienen
lugar dentro de una célula üva. Para este trabajo, son fundamentales los
estudios del transcriptoma y el proteoma sintetizados y mantenidos por el
genoma. Si bien los transcriptomas se pueden estudiar por secuenciación
de cDNA, con técnicas como el SAGE, que aportan minisecuencias de
numerosos cDNA en un solo experimento, los adelantos más importantes
 -
192 Capítulo 6 Conocimiento del funcionamiento de un genoma

se están logrando con las técnicas de micromatrices y chips. La hibridacién

de cDNA con marcación diferencial preparados a partir de dos o más trans-
criptomas a una micromatnz o un chip proporciona información acerca de
los patrones de expresión de los genes, que pueden analizarse por agrupa-
ción jerárquica para revelar las relaciones funcionales entre genes. El estu-
dio de los transcriptomas está ayudando a conocer la base genética de los
procesos de desarrollo y las enfermedades humanas, entre ellas, varios
tipos de cáncer. Los estudios de los proteomas son igual de importantes,
porque el examen de un transcriptoma sólo revela qué genes expresa una
determinada célula, pero no aporta ningún cuadro exacto de las proteínas
presentes. La determinación del perfil proteico utiliza electroforesis bidi
mensional en gel seguida de MALDI-TOF de los fragmentos peptídicos ais-
lados para caractertzar las proteínas de un proteoma. A fin de comprender
cómo opera un proteoma dentro de una célula, es útil conocer qué proteí-
nas interactúan entre sí. La presentación en fagos y el sistema de dos híbri-
dos de levadura son los métodos aplicados con mayor frecuencia para
detectar pares de proteínas que forman asociaciones físicas y se pueden
emplear métodos como coinmunoprecipitación para aislar complejos mul-
tiproteicos intactos. Se pueden deducir las interacciones funcionales, que
no siempre requieren que un par de proteínas tengan contacto físico, por
genómica comparativa, análisis de los perfiles de expresión de genes y estu-
dios de desactivación de genes. La información resultante permite cons-
truir mapas de interacción proteica, que muestran todas las interacciones
que ocuren en un solo proteoma. Por lo general, estos mapas están estruc-
turados alrededor de una cantidad relativamente pequeña de proteínas que
presentan numerosas interacciones y forman nodos en la red, algunos de
los cuales representan procesos biológicos indiüduales y otros vinculan
procesos biológicos entre sí. El proteoma mantiene el metaboloma -+l con-
junto completo de metabolitos presentes en una célula o un tejido- y se
prevé que los estudios del metaboloma revelaránla base bioquímica preci-
sa de los estados patológicos y de los efectos colaterales no deseados del
tratamiento farmacológico. El trabajo con transcriptomas, proteomas y
metabolomas está orientando a los biólogos a la biología de sistemas, que
intenta conocer la expresión del genoma no en función de las moléculas
cuya síntesis dirige el genoma, sino de los sistemas biológicos que resultan
de la actividad coordinada de esas moléculas.
 ..::.,..,-. :.:1 ¡,. ;.,

'j .
' . _.,: :::i:,:.;
..i::::.:

ffiffi#É#ref,* s§* E*s ffiffiffi#trffi#s

Parte 2 - Anatomía de los genomas estudia Ia infor-

mación sobre la orgarización de los genomas que ha
sido revelada, en su mayoría durante los últimos diez
años, mediante las técnicas descritas en la Parte 1. En
el capítulo 7 se examinan los genomas nucleares euca-
riontes, con particular hincapié en el genoma humano
que, además de pertenecernos, es el más complejo
secuenciado hasta ahora. En el capítulo B se investi-
gan los genomas procariontes y de orgánulos euca-
nontes; estos últimos se incluyen aquí debido a sus
orígenes procariontes. El capítulo 9 se ocupa de los #ep§*ax§e S
genomas virales y los elementos genéticos móviles,
que se agrupan porque algunos elementos móviles il*r:*mas viraies y eleru:*iit*s
están relacionados con genomas de virus. o+néiigg5
5!r rLL rncviies
 1"11

_-== §
F= -=+" EF= :=-:: ffi€ ft c+ ffi : E,+ e +-E -.*
uerÉ EL= =ÉE É#b áE#á*Éff#g tr=b == =--É

,+- € : é € .:
= = =e
#E=5
E E =E = €E EEEgEÉ-#L
=== -:-
-*Ef EÉ =E -E
-'a,--:#E E+.g-= ==É
=-Ee=+=

?-É Lss {r*¡*§scmas s*s¡tie*** g§**rne=

nrrrl*=r+<

?=? ta¡eqÉeríst!<cs g*-étieas d* !+s

geÉÉrrtas c!s{isares ea.:*arÉrym€es

Describir las interacciones DNA-proteínas que dan origen a nucleosomas, cromatosomas y la fibra de cro-
matina de 30 nm.

Mencionar las funciones de los centrómeros y los telómeros, y describir las interacciones DNA-proteÍnas
especificas que tienen lugar dentro de estas estructuras.

Explicar por qué los patrones de bandeo del cromosoma y el modelo de isócoros sugieren que los genes
no tienen una distribución uniforme en los cromosomas eucariontes.

Comparar la organización de genes de diversos genomas núeleares eucariontes y analizar la relación entre
la organización de los genes y el tamaño del genoma.

Resumir el contenido global del genoma humano.

Describir las di*intas maneras de categorizar las funciones de los genes eucariontes y reseñar las caracte-
rísticas importantes reveladas por comparaciones de catálogos de genes de diferentes eucariontes.

Explical con ejemplos, qué significa "familia multigénica".

Diferenciar seudogenes convencionales y procesados, y otros tipos de vestigios evolutivos.

Distinguir DNA repetido en tándem de DNA repetitivo disperso y describir las caracteríticas importantes
del DNA satélite, minisatélite y microsatélite.

En los tres capítulos siguientes se estudia la anatomía de los diversos tipos de

genomas hallados en nuestro planeta. Hay tres capítulos porque se deben
considerar tres tipos de genomas
. Los genomas nueleares eucariontes (este capítulo), de los cuales el
genoma humano es el de mayor interés para nosotros.
: Los genomas procariontes y de orgánulos eucariontes (capítuio 8),
que consideraremos juntos porque los orgánulos eucariontes des-
cienden de procariontes antiguos.
r Los genomas virales y los elementos genétieos móüIes (capítulo 9),
que se agrupan porque algunos elementos móüles están relacionados
con genomas de virus.
 Capítulo 7 Cenomas nucleares eucariontes

?.8 il*e {s&EEEssGffiE€§ aeeá§eseem

g§sB#ffie§ §Ee§cñe&re§
El genoma nuclear está dividido en una serie de moléculas de DNA linea-
les, cada una de las cuales está contenida en un cromosoma. No se cono-
cen excepciones a este patrón: todos los eucariontes estudiados tienen por
lo menoi dos cromosomas y las moléculas de DNA son siempre lineales.
La única variabilidad en este nivel de estructura del genoma eucarionte
reside en el número de ctomosomas, que parece no estar relacionado con
las características biológicas del organismo. Por ejemplo, la levadura tiene
16 cromosomas, cuatro veces más que la mosca de la fruta. El número de
cromosomas tampoco está relacionado con el tamaño del genoma: algunas
salamandras tienen genomas 30 veces más grandes que la versión humana,
pero distribuidos en la mitad de la cantidad de cromosomas. Estas compa-
iaciones son interesantes, pero por ahora no aportan ninguna información
útil sobre los genomas en sí mismos; son más una reflexión sobre la falta
de uniformidad de los eventos evolutivos que han eonformado la arquitec-
tura del genoma en diferentes organismos.

?.§,I §mpsqsetery?§*ná* deÉ GNé e§E sse§?*§*§??&§

Los cromo§omás son mucho más cortos que las moléculas de DNA que
contienen: el cromosoma humano promedio tiene algo menos de 5 cm de
DNA. Por 1o tanto, se requiere un sistema de ernpaquetamiento muy orga-
nizado para adecuar una molécula de DNA a su cromosoma. Es necesario
conocei este sistema antes de-comenzat a pensar cómo funcionan los geno-
mas, pues el carácter del empa{qetamiento influye sobre los procesos invo-
lucraáos en la expresión de los génes individuales (capítulo 10).

A principios de la década de 1970, hubo avances importantes en el cono-

cimiento del empaquetamiento del DNA mediante una combinación de
análisis bioquímico y microscopia electrónica. Ya se sabía que el DNA
nuclear se asociaba con proteínas de unión aI DNA denominadas histonas,
pero no se había delineado el carácter exacto de la asociación. Entre 1973
y tOl+, varios grupos de investigadores llevaron a cabo experimentos de

Fígura 7.I Análisis de protección de

nucleasa de la cromatina de núcleos Cromatina purificada
humanos. Se purifica con cuidado la
cromatina de los núcleos y se la trata
con una enzima nucleasa. A la izquierda,
el tratamiento con nucleasa se lleva a DNA

cabo en condiciones limitantes, de

modo que el DNA se corta, en Prome'
dio, sólo una vez en cada una de las Tratamiento con nucleasa ,/ Tratam¡enio con nucleasa -
regiones ligadoras entre las proteínas co n d ici on es linitantes condiciones no limitantes
unidas. Después de eliminar la proteina, ¿/
se analizan los fragmentos de DNA por
_:)
electroforesis en gel de agarosa y se '--:-:i.--" -.:. ,#
observa que son de 200 pb de longitud, .) ^'H
o múltiplos de esta medida. A Ia dere- -,{a::
-.-,)
cha, el tratamiento con nucleasa prosi- -:-':.-'
gue hasta que se completa, de manera
que se digiere todo el DNA de las regio-
nes ligadoras. Los fragmentos de DNA
restantes son todos de 146 pb de longi-
tud. Los resultados muestran que, en
esta forma de cromatina, los complejos
proteicos a lo largo del DNA están sepa-
rados a intervalos regulares: uno cada
§:#nxLY 400 pb... CARRIL 1: marcadores de DNA
CARRIL 2: bandas de 200 Pb, +oo Pb,
etc' I
'146 pb de DNA estrecha- 200 pb...
-
2OO pb, con r46 pb... CARRIL 3: banda única de 146 Pb r
mente unidas a cada complejo proteico.

.,L,-
 Los cromosomas contienen genomas nucleares 203

protección de nucleasas en la cromatina (complejos DNA-histona), que (A)

-había
sido extraída con delicadeza de los núcleos por métodos ideados para
conservar todo lo posible la estructura cromatínica. En un experimento de
protección de nucleasa, se trata el complejo con una enzima que corta el
-DN,q,
en posiciones que no están "protegidas" por unión a una proteína. El
fimaflo de los fragmentos de DNA resultantes indica la posición de los (B)

complejos proteicos en la molécula de DNA original (figura 7.1). Después

del tratamiento limitado con nucleasa de la cromatina purificada, la mayor
parte de los fragmentos de DNA tienen longitudes de alrededor de 200 pb
v múltiplos de esta cifra, lo que sugiere un espaciamiento regular de las pro-
ieínas histonas a lo largo del DNA. Nucleosomas

En 1.974, estos resultados bioquÍmicos fueron complementados por microfo-

tografías electrónicas de cromatina purificada, que permitieron visualizar (c) Histona ligadora

como cuentas de proteínas en un collar de DNA el espaciamiento regular

inferido por los experimentos de protección (figura 7.2A). El análisis bioqui
mico adicional indicó que cada cuenta, o nucleosoma, contiene ocho molé-
culas de histonas: dos de H2A, dos de H2B, dos de H3 y dos de H4. Estudios
estructurales han mostrado que estas ocho proteínas configuran un octáme-
ro central en forma de barril, rodeado dos veces en su parte extema por DNA
(figura 7.28). La partícula de nucleosoma está asociada con 140-150 pb de
DNA (segun la especie) y cada nucleosoma está separado por 50-70 pb de
DNA ligador lo que da la longitud de repetición de l9O-22O pb ya mostrada
por los experimentos de protección de nucleasas. figura 7.2 Nucleosomas. (A)
Microfotografía electrónica de una
Además de las proteínas del octámero central, hay otro grupo de histo- banda de cromatina purificada que
nas, todas estrechamente relacionadas entre sí y denominadas en con- muestra las estructura "cuentas de
junto histonas ligadoras. En los vertebrados, éstas comprenden las collar". (B) Modelo de la estructura
histonas H1a-e, H10, H1t y H5. Se une una sola histona ligadora a cada cuentas de collar, en el que cada
cuenta es un nucleosoma en forma
nucleosoma para formar el cromatosoma, pero no se conoce la posición de barril rodeado dos veces, por
precisa de esta histona ligadora. Estudios estructurales avalan el mode- fuera, por DNA. Cada nucleosoma
lo tradicional, en.el que la histona ligadora actúa como pinza e impide está formado por ocho proteínas: un
que el DNA enrollado se desprenda del nucleosoma (figura 7.2C). Sin tetrámero central de dos subunidades
embargo, otros resultados sugieren que, por lo menos en algunos orga- H3 de histona y dos subunidades H4
nismos, la histona ligadora no se ubica en la superficie extrema del de histona, más un par de dímeros
H2A-H2B., uno encima y uno debajo
ensamblaje nucleosoma-DNA, como sería esperable si en realidad fuese
del tetrámero central (véase figura
una pinza, sino que se inserta entre el octámero central y el DNA. i0.13). (C) No se conoce la posición
precisa de la histona ligadora respecto
Se considera que la estructura "cuentas de collar" ilustrada en la figura 7.2A del nucleosoma, pero ésta puede
representa una forma no empaquetada de cromatina que aparece pocas actuar, como se muestra aquí, como
veces en los núcleos vivos. Técnicas de ruptura celular muy suave elabora- una pinza, que impide que el DNA se
das a mediados de la década de 1970 permitieron descubrir una versión más desprenda de la parte exterior del
nucleosoma. lmagen (A) cortesía de
condensada del complejo, denominada fibra de 50 nm (tiene alrededor de
la Dra. Barbara Hamkalo.
30 nm de ancho). No se conoce la manera exacta en que se asocian los
nucleosomas para formar la fibra de 30 nm, pero se han propuesto varios
modelos, dos de los cuales se ilustran en la figura 7.3. Cada nucleosoma
dentro de la fibra de 30 nm puede pernanecer unido por interacciones entre
las histonas ligadoras o las uniones pueden involucrar las histonas centrales,
cuyas "colas" proteicas se extienden fuera del nucleosoma (véase fig'ura
10.13). Esta última hipótesis es interesante porque la modificación química
de estas colas determina la apertura de la fibra de 30 nm, lo que permite la
activación de los genes que contiene (sección 10.2.1,).

7.1.? {arecterístásas €sp*{¡ales de !*=

crG*?sscffias ۖ mStalase
Es probable que la fibra de 30 nm sea el tipo principal de cromatina del
núcleo durante la interfase, el período entre las divisiones nucleares.
204 Capítulo z Genomas nucleares eucariontes

Figura 7.3 Dos modelos de la fibra (A) Modelo (B) Modelo de cinta
E
de cromatina de 3O nm. Durante de solenoide helicoidal
varios años, se ha privilegiado el mode-
lo del solenoide (A), pero evidencia la
experimental reciente avala la cinta heli-
coidal (B). Reimpreso con autorización
de Dorigo et al., Science, 306, 1571-
1573. Copyright 2004 MAS.

Centrómero Cuando se divide el núcleo, el DNA adopta una forma de empaqueta-

l
.. :.r+Telómero
1 '
""'''
. ,.,.j-a-'
Cromátide
Figura7.4 Aspecto típico de un cro-
mosoma en metafase. Los cromoso-
mas en metafase se forman después
que ha tenido lugar la replicación del
DNA, de manera que cada uno consis-
te, de hecho, en dos cromosomas uni-
dos por el centrómero. Los brazos se
denominan cromátides. Un telómero
es el extremo fínal de una cromátide.
Cuadro 7.1 Técnicas de tinción utilizadas para generar patrones de bandeo cromosómicos
miento más compacto, que da por resultado los cromosomas en metafa-
se altamente condensados, que se pueden observar con el microscopio
óptico y que tienen el aspecto que se suele asociar con la palabra "cro-
mosoma" (figura 7.4). Los cromosomas en metafase se forman en un
estadio del ciclo celular posterior a la replicación del DNA; así, cada
uno contiene dos copias de su molécula de DNA cromosómico. Las dos
copias están unidas por el centrómero, que tiene una posición específi-
ca dentro de cada cromosoma. Los brazos del cromosoma, que se deno-
minan cromátides y presentan estructuras terminales llamadas telómeros,
tienen distintas longitudes en diferentes cromosomas. Por lo tanto, es
posible reconocer cada cromosoma por la longitud de sus cromátides y
la ubicación del centrómero respecto de 1os telómeros. La tinción de los
cromosomas revela otras características distintivas. Hay diversas técni-
cas de tinción (cuadro 7 .I) cada una de las cuales determina un patrón
de bandeo característico de un cromosoma particular. Esto implica que
se puede representar la serie de cromosomas de un organismo como un
cariograma, en el que se ilustra el aspecto bandeado de cada uno. En la
figura 7.5 se muestra el cariograma humano.

Técnica Procedimiento Patrón de bandeo

Bandeo C Proteólisis leve seguida de tinción con Ciemsa

Las bandas oscuras son ricas en AT
Las bandas claras son ricas en CC
Bandeo R Desnaturalización por calor seguida de tinción con Ciemsa Las bandas oscuras son ricas en CC
Las bandas claras son ricas en AT
Bandeo Q Tinción con quinacrina Las bandas oscuras son ricas en AT
Las bandas claras son ricas en CC

Bandeo C Desnaturalización con hidróxido de bario y, después, tinción Las bandas oscuras contienen heterocro-
con Ciemsa matina constitutiva (véase sección 10.1 .2)
 Los cromosomas contienen genomas nucleares
ffi
ffi.
¡r@

ffi+t
,
cariograma humano es el típico de la gran mayoría de los eucarion-
algunos organismos presentan características no observadas en
-1.r, pero
ffitu vársión humana. Por ejemPlo:

ffi" Los minicromosomas son relativamente cortos de longitud, pero

ricos en genes. El genoma del pollo, por ejemplo, está distribuido en
59 cromosomas: seis macrocromosomas, que contienen el 660/o del

i:i F
,6.1

Bi
i:,
i¡.i
E ii'I-
!:r -
iit-- ,,f
,.8,.T :,: ,IíiiI.tI,,-

it= il;
;;;-'izE:r1rt''=;rzz.7

;==r.==rr- ii'; ii,I il= ,i,! i':

,: ji :::! ii f I
= = =
,i;
=;,,1'
iii ii¡,
=

¡ i
;;= =-==-=:r
i;,;i ;.- isj= li= ;;,f
;.- l-

==
llie
i.= i;,I - - ii¡!= ii'=
=!=-=-=E ,' f = r= ;i
,; ;; ;.
=
;, E

11J

il,'iE I¡
:r i- iii,i,I rii=
ii,
= ,i
= 4EF

"";"8
E i. =
,,, i ,ji =..iiiii, :
i.ié,iiE
llr= ljl . ii,E
i,,
=
,, § rr! 11,=,; = r,= :ii r'

i;i E= i:i.- i;i ;,

=
r =,;
;i ; íii =
;Ii iir
=
I=
== = = =
=: =
l2 1l t5
= ll

Figura 7.5 Cariograma humano. Se

ll.,
tr.z ! ,,, á muestran los cromomas con el
(l obtenido
ri@
¡i
lli I'':' '
narrnn de
patrón nc bandeo
n:nrlen C nhtcni/n, des-
oués de la tinción con Ciemsa. Los
pués I os
il ñ
B.l llll !! h¿r"r& á" lor cromosá*ur i.pr"
u, !
ll.3
, ñ sentan debajo de cada estructurá y
B.l ! E el¡úmero de band¿, a la izquierda.
"rDNA' es una región que contiene
un grupo de unidades repetidas para
pa
los genes de RNA ribosómico (sec-
ción 1 .2.2). "Heterocromatina consti-
tutiva" es cromatina muy compacta
rDM § ro*"*,:m".";*im que contiene pocos genes o ningu-
-
no (sección 10.1.2).
206 Capítulo.7 Cenomas nucleares eucariontes
CDEI
.-@
CDEII
Figura 7.6 Centrómero de
Soccha ro myces cerevlsroe. CDEI
tiene 9 pb de longitud; CDE|l, 80-90
pb;y CDElll, I1 pb. Se considera que
otras secuencias que flanquean la
región aquí mostrad¿ forman parte
del DNA centromérico, cuya longitud
total es de alrededor de 125 pb.
Cbfs unida a CDElll
Cbfl unida
Figura 7.7 lnteracciones DNA-pro-
teínas en el centrómero de levadu-
ra. El diagrama es puramente
esquemático, pues se desconoce la
posición precisa de los componentes
proteicos y del DNA.
Microtúbulos
I Estadio de anafase
I de la div¡sión nuclear
e-B -)
§ÉÉ B -.2?
É w4-
#E
,;&.áÉ E
¿"- '%s-I
Figura 7.8 Papel de los cinetocoros
durante la división nuclear. Durante
el período de anafase de la división
nuclear, cada cromosoma es separado
por la contracción de m¡crotúbulos
unidos a los cinetocoros.
DNA, pero sólo el25o/o de los genes; y 33 minicromosomas, que con-
CDEIII
tienen el tercio restante del genoma y el75o/o de los genes. Por lo s
tanto, Ia densidad de genes de los minicromosomas sextuplica la de r
L
los macrocromosomas.
c
Los cromosomas B son cromosomas adicionales que se observan en I
algunos integrantes de una población, pero no en todos. Son comu- I
nes en las plantas y también se los conoce en hongos, insectos y ani- f
males. Los cromosomas B parecen ser versiones frágmentarias de C
cromosomas normales, que resultan de fenómenos insuficientes duran- i
te la diüsión nuclear. Algunos contienen genes, a menudo de rRNA, 1
pero no se ha esclarecido si son activos. La presencia de cromosomas €
B puede afectar las características biológicas del organismo, sobre §
todo en las plantas, donde se asocian con menor viabilidad. Se presu- C
me que hay pérdida gradual de los cromosomas B de linajes celulares 2.
como consecuencia de las irregularidades de su patrón de herencia. (
t
Los cromosomas holocéntricos no tienen un solo centrómero, sino (
múltiples estructuras dispersas en toda su longitud. El nematodo (
Caenorhab ditis ele gans tiene cromosomas holocéntricos.
I
a CDEI I
/nrerar<.í*¡r*s üff4-pr*teín*s er? /os centrr{i,:rercs y lcs felame;-*s (
El DNA contenido dentro de centrómeros y telómeros, y las proteínas 1
unidas a este DNA tienen características especiales relacionadas con las 1
funciones particulares de estas estructuras. l
I
f
La secuencia nucleotídica del DNA centromérico de los eucariontes supe- (
riores mejor conocida corresponde a la planta Arabidopsis thaliana, cuya
accesibilidad al análisis genético ha permitido localizar con cierta precisión
las posiciones de los centrómeros en la secuencia de DNA. Asimismo, se
puso un empeño especial para secuenciar estas regiones centroméricas, que
a veces son excluidas de las secuencias de los genomas por los problemas
en la obtención de una lectura exacta a través de las estructuras altamente
repetitivas que caracterizan estas regiones. Los centrómeros de
Arabidopsls abarcan 0,9-1,2 Mb de DNA, y cada uno está formado, en
gran medida, por secuencias repeüdas de 180 pb. En los seres humanos,
las secuencias equivalentes son de 17 L pb de longitud y se las denomina
DNA alfoide, con 1.500-50.000 copias por centrómero. Antes de que se
obtuvieran las secuencias de Arabidopsis, se consideraba que estas secuen-
cias repetidas eran, por mucho, el componente principal del DNA centro-
mérico. Sin embargo, los centrómeros de Arabidopsis también contienen
múltiples copias de repeticiones en todo el genoma, junto con algunos
genes, estos últimos con una densidad de 7-9 por 100 kb en comparación
con 25 genes por 100 kb de las regiones no centroméricas de los cromoso-
mas de Arabidopsis. El descubrimiento de que el DNA centromérico con-
tiene genes causó gran sorpresa, porque se pensaba que estas regiones eran
genéticamente inactivas.
Arabidopsis y los seres humanos presentan el patrón básico de DNA
centromérico observado en casi todos los eucariontes, pero se detecta
una variación interesante en la levadura Saccharomyces cerevisiae,
cuyo centrómero está definido por una sola secuencia de alrededor de
125 pb de longitud. Esta secuencia está formada por dos elementos
cortos, denominados CDEI y CDEIII, que flanquean un elemento más I
largo llamado CDEII (figura 7.6).La secuencia de CDEII es variable,
aunque siempre es muy rica en nucleótidos A y T, mientras que tanto
CDEI como CDEIII están muy conservados, lo que significa que sus
 Características genéticas de los genomas nucleares eucariontes 207

secuencias son muy similares en los 16 cromosomas de levadura. Las

rnutaciones de CDEII raravez afectan la función del centrómero, pero Centrómero
una mutación de CDEI o de CDEIII suele impedir su formación. El -:
carácter corto, no repetitivo, del DNA centromérico de levadura ha
permitido avanzar en el conocimiento de la interacción entre DNA y
proteínas para formar un centrómero funcional. Desempeña un papel
iundamental una proteína cromosómica especial denominada Cse4,
que es similar en estructura a la histona H3 y que, con una segunda
proteína llamada Mif2, forma un núcleo alrededor del cual se envuel-
ve la secuencia CDEII (figura 7 .7). El DNA parece ser mantenido en
el lugar por otras dos proteínas: Cbf1, que reconoce y se une a la
secuencia CDEI, y Cbf5 (de hecho, urt tetrámero de cuatro proteínas),
que se une a CDEIII. Cbfl y CbfS también se unen a por 1o menos Cubierta extema

algunas de las cerca de 20 proteínas adicionales que forman el cineto' de los nucleosomas
CENP.A
coro, la estructura que actúa como punto de fijación para los microtú-
bulos que arrastran los cromosomas divididos hacia los núcleos hijos
(figura 7.8). Todavía no se ha esclarecido en qué medida este modelo Figura 7.9 Centrómeros mamíferos
del centrómero de levadura es aplicable también a otros eucariontes. que contienen nucleosomas CENP-
Los centrómeros de los eucariontes superiores son bastante diferentes A y H3. Una posibilidad es que los
nucleosomas H3 estén ubicados
porque contienen nucleosomas, similares a los de otras regiones del
sobre todo en el núcleo central del
cromosoma, pero algunos de ellos contienen la proteína CENP-A en centrómero y que las versiones CENP-
lugar de histona H3. Los nucleosomas que contienen CENP-A tienen A formen una cubierta externa con la
una estructura más compacta y rígida que los que contienen H5, y se que se construye el cinetocoro.
ha sugerido que la disposición de los nucleosomas CENP-A y H3 a 1o
largo del DNA es tal que las versiones CENP-A están ubicadas en la
superficie del centrómero, donde forman una cubierta externa sobre la
que se construye el cinetocoro (figura 7.9).

La segunda parte importante del cromosoma es la región terminal o i:r::5]-+=_=:*;=-

telómero. Los telómeros son importantes porque marcan los extre-
mos de los cromosomas y, por lo tanto, permiten que la célula distin-
ga un extremo real de un extremo no natural causado por la rotura de
5'1;3CrI¡:-l'i":f, rTi::3cri¡ü:::, ii
3'
un cromosoma (un requisito esencial, pues la célula debe reparar este - " ;a
último, pero no el primero). El DNA telomérico está formado por := T -Ci1:i -¡¿4:i;¡6¡5ri: :¡.ii:
3' 5'
cientos de copias de un motivo repetido, 5'-TTAGGG-3' en los seres
humanos, con una extensión corta del extremo 5' de la molécula de
DNA bicatenario (figura 7 .lO). En los telómeros humanos, dos pro-
teínas especiales se unen a las secuencias repetidas: TRF1, que ayuda Figura 7.lo Telómeros. Secuencia del
a regular la longitud del telómero, y TRF2, que mantiene la extensión extremo de un telómero humano. La
de una sola cadena. Si se desactiva TRF2, se pierde esta extensión y longitud de la extensión 3' es diferen-
te en cada telómero. Véanse más
los dos polinucleótidos se fusionan en un enlace covalente. Se consi- detalles sobre DNA telomérico en la
dera que otras proteínas teloméricas forman un enlace entre el telóme- sección 15.2.4.
ro y la periferia del núcleo, la zona en la que se ubican los extremos del
cromosoma. Otras proteínas median la actividad enzimática que man-
tiene la longitud de cada telómero durante la replicación del DNA.
Volveremos-a tratar esta última actividad en la sección 15.2.4, pues
es crucial parala supervivencia del cromosoma y puede ser una clave
para comprender la senescencia y la muerte celular.

=-==E {arecterístl€as geñéticas de les g€lloffia§

:E s{leares eu{e rieg?*ss

En el capítulo 5 examinamos el espectro de métodos bioinformáticos y

experimentales que se pueden emplear para localizar los genes en la
secuencia de un genoma y para determinar sus funciones. Ahora, dirigire-
mos nuestra atención a la información que nos han aportado esos métodos
sobre las características genéticas de los genomas nucleares eucariontes.
 Capítulo 7 Cenomas nucleares eucariontes
l,trrrrrirl,rrrrrrrr],rr
i ,l ,il,ffi i I!i= :g
Espectros de
=lltl#:
seudocolor Alta densidad
Figura 7.11 Densidad de genes a lo
largo del cromosoma más grande
de los cinco de Arabidopsis tholio-
no. Se ¡lustra el cromosoma 1, que
tiene 29,.l Mb de longitud, con las
porciones secuenciadas presentadas
en verde claro, y el centrómero y los
telómeros, en verde oscuro. El mapa
genético bajo el cromosoma indica la
densidad de genes en el seudocolor,
de azul oscuro (baja densidad) a rojo
(alta densidad). La densidad varía de
I a 38 genes por 100 kb. Reimpreso
con autorización de ACI (The
Arabidopsis Cenoma lnitiative),
Noture, 4O8,797-815. O 2000
Macmillan Magazines Limited.
T
á
.*
100 kb
rig 1¿
ttttt
-.4
t+ l¿
t(
.;¡.¡,1==.ii
=E,l=€
F=,EH€ tli= A
'llii:=l',lE: l,iÉá:€ *+:i l EÉ3:,'8,
=
. Baia densidad
7.=.E ¿*ür¡de =sies: !*= E*ffies #* u¡: E€náirE?= nu{á*ftr-r-
En la sección anterio4 aprendimos que los centrómeros de Arabidops¡,s con-
tienen genes, pero en menor densidad que en el resto de los cromosomas.
Esto nos alerta sobre el hecho de que los genes no tienen una disposición trri-
forme a 1o largo de un cromosoma. En la mayoría de los organismos, los
genes parecen estar distribuidos de manera más o menos aleatoria, con varia-
ciones sustanciales de la densidad de genes en diferentes posiciones de un
cromosoma. La densidad promedio de genes en Arabidopsls. es de 25 genes
por 100 kb, pero aun fuera de los centrómeros y los telómeros, la densidad
varia de 1 a 38 genes por 100 kb, como ilustra la figura 7.ll para el más
grande de los cinco cromosomas de la planta. Lo mismo es válido para cro-
mosomas humanos, en los que la densidad varía de 0 a64 genes por 100 kb.
Desde varios años antes de que se completara la secuencia, se sospechaba
que la distribución de los genes no era uniforme dentro de los cromosomas
humanos. Había dos líneas de eüdencia, una de las cuales se relacionaba con
los patrones de bandeo generados cuando se tiñen los cromosomas. Los colo-
rantes empleados en estos procedimientos (véase cuadro 7.1) se unen a las
moléculas de DNA, pero la mayoría de las veces muestran preferencias por
ciertos pares de bases. Por ejemplo, Giemsa presenta mayor afinidad por
regiones de DNA ricas en nucleótidos A y T. Por lo tanto, se considera que
las bandas G oscuras del cariograma humano (véase figura 7.5) son regiones
de1 genoma ricas en AT. La composición de bases del genoma en su conjun-
to es de 59,7o/o A + T, de modo que las bandas G oscuras deben tener un
contenido de AT mucho mayor del600/o. En consecuencia, los citogenetistas
anticiparon que habríamenos genes en las bandas G oscuras, pues los genes
suelen tener un contenido de AT de\45-5Oo/o. Esta predicción se confirmó al
comparar la secuencia del genoma con el cariograma humano.
La segunda línea de evidencia que apuntaba a la distribución no uniforme de
los genes provenía del modelo de isócoros de organización del genoma.
Según este modelo, los genomas de los vertebrados y de las plantas (y, qsizá,
de otros eucariontes) son mosaicos de segmentos de DNA, cada uno de no
menos de 300 kb de longitud, y cada segmento presenta una composición de L
bases uniforme que difiere de la de los segmentos adyacentes. El modelo de e
isócoros es avalado por experimentos en los que se rompió el DNA genómi o
co en fragmentos de alrededor de 100 kb se los trató con colorantes que se S]
unen específicamente a regiones ricas en AT o GC, y se separaron los seg- o
mentos por centrifugación en gradiente de densidad (Nota sobre técnicas LD
7.1). Cuando se efectua este experimento con DNA humano, se observan ir
cinco fracciones, cada una de las cuales representa un tipo diferente de isó- It
coro con una composición de bases característica: dos isócoros ricos en AX c'
denominados L1 y L2;y tres clases ricas en GC, denominadas H1, H2 y H3. c,
La última de éstas, H3, es la menos abundante er el genoma humano y,repre- o
5
senta sólo el3o/o del total, pero contiene más del25o/o de los genes. Esta es cl
una clara indicación de que los genes no se distribuyen de manera uniforme
en el genoma humano. De hecho, el examen de la secuencia del genoma LI
sugiere que la teoría de los isócoros sobresimplifica lo que es, en realidad, un a
patrón mucho más complejo de variaciones de la composición de bases a lo tr
 Características genéticas de los genomas nucleares eucariontes

brgo de cada cromosoma humano. Aunque resultase un concepto erróneo,

iaíeo¡a de los isócoros fue de utilidad pues desempeñó un papel importan-
iá.n uyu¿ut a los biólogos moleculares de la era presecuencia a conocer la
,estnrctura de los genomas.

f*---=J---
¡

'l
..
+;:
Nota sobre técnicas 7.1 Técnicas de ultracentrifugación
t. :

i
i

L, Métodos poro
l.:r: - seporor comPonentes celulares y moléculos grondes l

i
i
lji
i La aparición de las centrífugas de alta velocidad en la gradiente depende de su. coeficiente de sedimentacón,
que depende, a su vez, de su masa yforma molecular.
i

tt,' ;¿.;¡; de l92o permitió e[desarrollo de técnicas para

t*I i.
:

. f
I orgánulos y
separar ur6arruru)
sePdrdt v vrrqJ
otras fracciones ¿" .árri*
rrqlLrvtrsJ uL 1,"^t^:lTP9'r',:::?::.,"^::t^iT:'':J:::-tl?:":"Yi":::f'
lté desedimentación de 8os (s significa unidades
reco- :1"9i"".:
:

Svedberg; ::i[:l]jl':T
primera técnica fue la centrifugación diferencial, que
el apellido del ::,,:#.:"t'.;:ti: :'Í""iii:'
cientifico sueco que fue pione-
, : gía glóbulos de componentes celularer-';;ri".;;;"
*:-":;:-":-''-
más lirianos por centrifugación de extractos celulares .
ro en aplicaciones biológicas de la ultracentrifugación),
,i"",r.! qr" f", ,fU"r;;..;b#i;;".;;;;;"üueños,
diferentes velocidades. Por ejemplo, los nÚcleos intactos
'
tienen un coeficiente de sedimentación de 7OS.
son bastante grandes y se pueden recoger de un eñrac-
,l.000 ),'.¡¡+¡ 1ñ minu-
' -- -^1..1-- -^-
to celular ^^^+-iÍ,,-^-iA^
por centrifugación ^ 1 ^^^ g
a ^ durante 10 min¡ .-l^ t:-^ -l^ ^^-+-;f,,-^-iA^
En un segundo tipo de centrifugación en gradiente de
^^ ^--r¡^^+^ ,^

; tos; las mitocondrias, que son más livianas, requieren densidad, se utrliza una soluclón como cloruro de
; )rl^nn g
centrifugación a 2O.OO0 a durante lñ minutos.
Attrsnta 20 §e pue-
minrrtnc Se nre- resio 8
cesio nrte es mtlcho
[\/l que
R M, mucho más densa que oUe la soluctÓn
SOIUCión
: ii -
-- obÉner
den diferentes cámponentes celulares en forma de sacarosa empleada para medir valores S. La solu-
-''l
l*r.i.,, ,l:rián cuidadosa
rrri¿a¿ode los pará- clor inicial es uniforme y el gradiente se establece
i
i ;il;dJll"íii,s..¡¿"
bastante pura por manipulación

ffil::"J:::ll[:'j:i".:;,r:'",?HfJ!!": i:ii,,?i,?,
i rn
'r ,e51, )c utilizó
r:7Jr, se ulrrr¿u por
PU¡ primera vs¿ la
Prrrrrs¡a vez "'"""":'j;l;;.:'en
'' centrifugación
gradiente de densidad. En este procedimiento,
el fondo; cada una ::,T:-?)i
?::?]1i.T:|":Yl:: Ifl"]::lt-
queda en una qn *,Tf"""
posición 1"- qyg lg
la matriz equivale a su propia densidad
ción celular no se centrifuga en una solución fi;; 1-9:9 de(véase
sumergida figuraT'23)' Esta técnica tiene
normal. En cambio, r" ru.i,br" eltubo.on unitátu.¡on
de sacarosa de manera qr" r" forme un gtuaÉnt" J; n!:"':-tas aplicaciones en biología m.olecular' y per-
densidad, Ia solución es más concentrada y, po; ¿;¿, []te 1e9ar3r fragmentos d.e DNA de distintas composi-
ciones de bases y moléculas de DNA de diferente
más densa hacia elfondo deltubo. Se.olo.uiu iiu.o!" (p' ej'' DNA superenrollado' circular y
celular en la parte superior del gradiente v r" i""it¡f-u","u
:9ll?JTtción
sr tuuu c
elrubo a muy vsrvLruqu por
alta velocidad:
rrruv o¡to lo Imenos
Pvr rv " ".sotióóo-t- li::»:l::?1":J^"::il:^91'^t:8^']::Ii:"i,T:li:
DNA marcado con un isótopo pesado de nitrógeno
durante varias horas. En estas condiciones, l.
;; ;i;;;;-i" ,; ""iáiá,,"¿
componente celular a'travéidel (sección l5' l ' l )'

?.8.3 éfr*me estáñ €rg€mlzad*s i*s §*ñ€s

*r¡ ffñ g€n{}f?t;i E¡*¡tleEl¿
Las variaciones de la densidad de genes a lo largo de un cromosoma
eucarionte implican que es difícil identificar regiones en las que la
organización de los genes pueda considerarse "tipica" del genoma en
su conjunto. Pese a esta dificultad, es evidente que el patrón global de
organización de los genes varía mucho en los diferentes eucariontes.
Es necesario conocer estas diferencias porque reflejan distinciones
importantes entre las características genéticas y los antecedentes evo-
lutivos de estos genomas. Para ilustrar las diferencias, en esta sección
' consideraremos en detalle una pequeña parte del genoma humano y
compararemos este segmento con partes igual de pequeñas de los
genomas de otros organismos. A medida que analice este material,
debe concentrarse en las características distintivas que se están obser-
vando, pero recuerde que las variaciones que se producen a 1o largo de
un solo cromosoma implican que es imposible hacer afirmaciones
absolutas acerca de los patrones de organización de los genes presen-
tes, o ausentes, en un genoma particular.
 -_
2I0 Capítulo 7 Cenomas nucleares eucariontes

lcs genes representefi sélCI unú peEueña parte

d*l genarns humon*
¿Cómo están organizados los genes en el genoma nuclear humano? Para
responder esta pregunta, examinaremos un segmento de 50 kb del cro-
mosoma 12 (ftg:Ía 7 .12). Este segmento contiene las siguientes carac-
terísticas genéticas:
* Cuatro genes. Éstos son:
o PKP2, que codifica placofilina 2, una proteína que participa en la
síntesis de desmosomas, estructuras que actúan como puntos de
conexión entre células adyacentes de mamífero.
o SYB1, que especifica una proteína de membrana asociada con
vesículas, cuyo papel es garantizar que estas vesículas se fusionen
con.sus membranas diana correctas dentro de la célula.
o Un gen denominado FL]10143, cuya función no se ha identificado.
o CD27, que codifica un miembro de la superfamilia del receptor
del factor de necrosis tumoral, un grupo de proteínas que regulan
las vías de transducción de señales involucradas en la apoptosis
(muerte celular programada) y la diferenciación celular.
Obsérvese que cada uno de estos cuatro genes es discontinuo y la canti-
Figura 7.12 Segmento del genoma dad de intrones varía de dos, en SYBI, a ocho, en PKP2. I

humano. Este mapa muestra Ia ubica-

ción de Benes, segmentos de genes,
r Ochenta y ocho secuencias repetidas en todo el genoma. Éstas son
I

repeticiones en todo el genoma y secuencias recurrentes en rnuchos lugares del genoma. Hay cuatro
I
microsatélites en un segmento de 50 tipos principales de pepetición en todo el genoma: LINE (elementos I
.l2.
kb del cromosoma humano nucleares largos dispersos), SINE (elementos nucleares cortos dis- I

I
(
C

f
s'rB r
#
-tEaÉ--

::::::=i--..j:l.:r::.:::=:!::::8ffi=l-:_::li:-*r:=- g_r-= _: -r"_-

*" ::]=::-r:-=_:-::r:::rr:-=€
==
50K

Otra
Elemento Transposón reoetición
LTR de DNA en todb el genoma Microsatélite
 Características genéticas de los genomas nucleares eucariontes 2tt

nersos), elementos IJTR (repetición terminal larga) y transposones

áe DNA. En este corto segmento del genorira, se observan ejemplos
áe cada tipo. La mayoría de las repeticiones en todo el genoma están
ubicados én las regiones intergénicas, pero varias residen dentro de
intrones'
Siete microsatélites, como los deseritos en la sección 3.2.2, que son
secuencias en las que hay repetición en tándem de un motivo corto.
Uno de los microsatélites aquí observados tiene el motivo CA repeti-
do 12 veces, que da la secuencia:
5'-CACACACACACACACACACACACA-3'
3'_GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-5'
Los otros seis microsatélites comprenden repeticiones de CAAA,
CCTG, CTGGGG, CAAAA, TG y TTTG, respectivamente. Cuatro
de los siete microsatélites están ubicados dentro de intrones.
Por último, alrededor del 3Oo/o del segmento de 5O kb del genoma
humano está formado por extensiones de DNA de copia única, no
génico, no repetitivo, sin ninguna función o significación conocida.

La caracteústica más llamativa de este segmento de 50 kb del genoma

humano es la cantidad relativamente pequeña de espacio ocupado por
los genes. Cuando se la suma, la longitud total de los exones -las partes
de lós cuatro genes que contienen la información biológl,ca , es de 4.745
pb, lo que equivale al9,5o/o del segmento de 50 kb. De hecho, este seg-
mento és bastante rico en genes: todos los exones del genoma humano
representan sólo 48 Mb, únicamente el l,5ok del total. En cambio, el
+4olo del genoma es ocupado por repeticiones en todo el genoma (figu-
ra 7 .13).

'El
geit*n:a de is levadíjrc es filüy {*mpüetü
¿Son muy grandes las diferencias de organizaciÓn de los genes en los
eucariontes? Sin duda, hay diferencias muy sustanciales en el tamaño de
los genomas: los genomas eucariontes más pequeños tienen menos de 10
Mb de longitud y los más grandes, más de 100.000 Mb. Como se puede
óbservar en la figura 7,74 y el cuadro 7.2, este rango de tamaño coinci- Figura 7.13 Composición del genoma
de, en cierta medida, con la complejidad del organismo: los eucariontes humano. RNJ regiones no traducidas.
más simples, como los hongos, tienen los genomas más pequeños; los

ry
ffiffi -r=

nffiñtm?H
Er==
ffire 'fflfÍiliI¡
=fr:: EfirilE . , .t :

ffi
EÜ..+-=
212 Capltulo_ 7 Genomas nucleares eucariontes

Figura 7.14 Rango de tamaño de Hongos

los genomas de diferentes grupos AIgas

de eucariontes. Protozoos

lnsectos

Moluscos

Peces

Anfibios

Reptiles

Aves

Mamfferos

Plantas fanerógamas
tlt I

1000 t0.000 100.000

eucariontes superiores, como los vertebrados y las plantas fanerógamas, tie-

nen los más grandes. Esto parecería tener sentido porque cabúa esperar que
la complejidad de un organismo esté relacionada con la cantidad de genes de
su genoma: los eucariontes superiores necesitan genomas más grandes para

Cuadro 7.2 Tamaño de los genomas eucariontes

Socchoromyces cerevisioe 12,1

Aspergillus nidulons 25,4

Protozoos
(,
Tetro hyme n o pyrifo rmis 190

lnvertebrados
Coenorhobditis elego ns 97
r80
Bombyx mori (gusano de seda) 490
Strongylocentrotus purpurotus (erizo de mar) 845
I

Locu sto mig rato ri o (langosta) 5.OOO t

400
3.200 (

3.300
(D

125 I
0
466
H
e
2.500
4.800
16.000
120.000
 ,: Características Benéticas de los genomas nucleares eucariontes 21,

'acomodar genes adicionales. Sin embargo, la correlación dista de ser precisa:

'si lo fuera, seúa esperable que el genoma nuclear de la levadura
,,saccharomyces cerevisiae, que con 12 Mb tiene 0,004 veces el tamaño del
senoma nuclear humano, contuviese 0,004 x 35.000 genes, que son sólo
14O.Dehecho, el genoma de S. cerevisiae conttene alrededor de 6.000 genes.

Durante muchos años, la falta de correlación precisa entre la compleji-

dad de un organismo y el tamaño de su genoma se consideró desconcer-
tante,la llamada paradoja del valor C. La respuesta es bastante simple:
en los genomas de los organismos menos complejos se ahorra espacio
porque los genes están más estrechamente empaquetados. El genoma de
S. cerevisiae ilustra este punto, como puede observarse en las dos par-
tes superiores de la figura 7.15, donde se compara el segmento de 50 kb
del genoma humano que recién hemos examinado con un segmento de
50 kb del genoma de levadura. El segmento del genoma de levadura, que
proviene del cromosoma III (el primer cromosoma eucarionte secuen-
ciado), tiene las siguientes características distintivas:
r Contiene más genes que el segmento humano, Esta región del cromo-
soma III de levadura contiene 26 genes, que se considera que codifi-
can proteínas y dos que codifican RNA de transferencia.
Relativamente pocos de los genes de levadura son discontinuos. En Figura 7.15 Comparación de los
este segmento del cromosoma III, ninguno de los genes es disconti- genomas de seres humanos, Ieva-
nuo. En todo el genoma de levadura, hay sólo 239 intrones, en som- duras, moscas de la fruta y maí2.
paración con más de 500.000 en el genoma humano. (A) Segmento de 50 kb del cromoso-
ma humano 12 presentado antes.
Hay menos repeticiones en todo el genoma. Esta parte del cromosoma Este se compara con segmentos de
III contiene un solo elemento LTR, denominado Ty2, y cuatro elemen- 50 kb de los genomas de
tos LIR truncados: las secuencias delta. Estas cinco repeticiones en (B) Socchoromyces cerevisioe, (C)
Drosophilo melonogoster y (D) maí2.
todo el genoma representan el 13,5o/o del segmento de 50 kb, pero esta

(A) Ser humano

PKP2 SYBI FLJl OI45

010
(Bl S a cch a ro nyces ce revisi a e
ALKI SROq HlS4 FUSI AGP| t Ty2 t BUDí

oto so kb

(C) Drosophilo melanogoster

Ppl
E_E,5_=_- : ::-::___ :_: 1- ::
.
o l0 20 50 -- 40 50kb
,
- (D) Maíz Adhl-F

Otra repetición
Elemento Transposón en todo
exón intrón L'NE srNE de DNA el genoma Microsatél¡te Cen de tRl\üA
 -
214 Capítulo 7 Cenomas nucleares eucariontes

cifra no es típica del genoma de levadura en su conjunto. Cuando se

consideran los 16 cromosomas de levadura, la cantidad de secuencia
ocupada por repeticiones en el genoma es sólo del3,4o/o del total.
El cuadro que surge es que la organización genética del genoma de leva-
dura es mucho más económica que la de la versión humana. Los propios
genes son más compactos y tienen menos intrones, y los espacios entre
los genes son bastante cortos, con mucho menos espacio ocupado por
repeticiones en todo el genoma y otras secuencias no codificantes.

CIrg*nizoción de los genes en oúrcs eucaricnt*s

La hipótesis de que los eucariontes más complejos tienen genomas menos
compactos se sostiene cuando se examinan otras especies. La tercera parte
de la figura 7.15 muestra un segmento de 50 kb del genoma de la mosca
de la fruta. Si coincidimos en que una mosca de la fruta es más compleja
que una célula de levadura, pero menos compleja que un ser humano, sería
esperable que la organización del genoma de la mosca de la fruta sea inter-
media entre la de la levadura y la del ser humano. Esto se observa en la
figura 7 .l5C: este segmento de 50 kb del genoma de la mosca de la fruta
tiene 11 genes, más que el segmento humano, pero menos que la secuen-
cia de levadura. Todos estos genes son discontinuos, pero siete tienen sólo
un intrón cada uno. El cuadro es similar cuando se comparan las secuen-
cias de todo el genoma de los tres organismos (cuadr o 7 .3) . La densidad de
genes del genoma de la mosca de la fruta es intermedia entre la de la leva-
dura y la del ser humano, y el gen promedio de la mosca de la fruta tiene
muchos más intrones que el gen promedio de levadura, pero aun así, tres
veces menos que el gen humano promedio.

La comparación entre genomas de levadura, mosca de la fruta y seres huma-

nos también es válida cuando se consideran las repeticiones en todo el geno-
ma (véase cuadro 7.5). Éstas representan el3,4o/o del genoma de la levadura,
alrededor del l2ok del genoma de la mosca de la fruta y el44o/o del genoma
humano. Se está comenzando a esclarecer que las repeticiones en todo el
genoma desempeñan un curioso papel en imponer la densidad o no del geno-
ma. Esto está muy bien ilustrado por el genoma delmatlz., que con 2.500 Mb
es relativamente pequeño para una planta fanerógama. Sólo se han secuen-
ciado unas pocas regiones del genoma delmat:z, pero se han obtenido algu-
nos resultados notables que revelan un genoma dominado por elementos
repetitivos. En la figura 7.15D se muestra un segmento de 50 kb de este
genoma, a uno y otro lado de un miembro de una familia de genes que codi-
fican erzimas aicohol deshidrogenasas. Éste es el único gen de esta región de
50 kb, aunque hay un segundo gen de función desconocida alrededor de 100
kb más allá del final derecho de la secuencia aquí presentada. En lugar de los
genes, la característica dominante de este segmento del genoma son las repe-
ticiones en todo el genoma, que se han descrito como un mar en el que se
localaanislas de genes. Las repeticiones en todo el geno:na son del tipo ele-
mentos LTR, que comprenden casi toda la parte no codificante del segmen-

Cuadro 7.3 Densidad de los genomas de levadura, mosca de la fruta y ser humano

Característica Levadura Mosca de la fruta Ser humano

Densidad de genes (cantidad promedio por Mb) 496 76 II

lntrones por gen (promedio) o,o4 3 9

Cantidad del genoma ocupada por repeticiones 3,40/o 12o/o 44o/o

en todo el genoma
 Características genéticas de los, genomas nucleares eucariontes 215

to, y se estima que foÍnan por sí mismos alrededor del5Oo/o del genoma del
maa. Cada vez es más eüdente que una o más tamilias de repeticiones en
todo el genoma han presentado proliferación masiva en los genomas de cier-
¡¿s especies. Esto puede explicar el aspecto más desconcertante de la parado-
ia del valor C, que no es el aumento general del tamaño del genoma
'observado en los organismos de complejidad creciente, sino que pueda haber
grandes diferencias del tamaño del genoma en organismos similares. Un
Éuen ejemplo es Amoeba dubia: se podría pensar que, por ser un protozoo,
tiene un genoma de 100-500 kb, similar al de otros protozoos como
Tetrahymma pyriformis (véase cuadro 7.2). De hecho, el genoma de
Amoeba es de más de 200.000 Mb. Asimismo, se podía suponer que el
genoma de los grillos tiene un tamaño similar al de otros insectos; sin embar-
!o, es de alrededor de 2.000 Mb, 11 veces superior al de la mosca de la fruta'

7"?"3 iCuántos genes hay y cuáles §o§t §É!s fumeEones?

Las anotaciones más detalladas de las secuencias terminadas de cromoso-
mas humanos sugieren que el genoma humano contiene 30.000-40.000
genes; la incertidumbre se debe a la dificultad, comentada en la sección
Ú.1.1,paru reconocer qué secuencias son genes y cuáles no. La cifra es
mucho menor que la prevista al principio, pues se estimaban de 80.000 a
100.000 genes hasta unos pocos meses antes de que se completaran los
borradores de secuencia en el año 2000. Estas estimaciones iniciales eran
altas porque se basaban en la suposición de que, en Ia mayoría de los casos,
un solo gen especifica un solo mRNA y una sola proteína. Según este mode-
1o, la cantidad de genes del genoma humano debía ser similar al número de
proteinas de las células humanas, lo que llevaba a la presunción de 80.000-
1OO.OOO. El descubrimiento de que el número de genes es mucho menor
indica que el corte y empalme alternativo, el proceso por el cual los exones
de un pre-mRNA son ensamblados en diferentes combinaciones para que
un solo gen pueda codificar más de una proteína (véase figura 6.5), es más
prevalente de lo que se creía en principio. En el cuadro 7.4 se presenta la
cantidad de genes de diversos genomas nucleares eucarjontes, pero cabe
recordar que, dado el corte y empalme altemativo, la pregunta, "¿cuántos
genes hay?" no tiene significación biológica real, pues la cantidad de genes
no indica la cantidad de proteínas que pueden ser sintetizadas y, por 1o
tanto, no es un parárnetro de la complejidad biológica de un genoma.

Aunque el corte y empalme altemativo posibilita que un gen especifique

varias proteínas, éstas tendrán por lo menos algunas partes de sus secuencias
de aminoácidos en común y así, cumplirán en general funciones similares o
relacionadas. Por lo tanto, categonzx los genes de acuerdo con sus funcio-

Cuadro 7.4 Tamaño del genoma y cantidad de genes de diversos eucariontes

Especie Tamaño delgenoma (Mb)

Socchoromyces cerevisioe (levadura de gemación) 12,1 6.,I 00

'r1tr 4.900
Schizosocchoromyces pombe (levadura de fisión)
Co e no rho bd iti s el ego n s (nematodo) 97 19.000

Arobidopsis tholiono (planta) 125 25.500

.l3.600
Drosophilo melonogoster (mosca de la fruta) 180

Oryzo sotivo (arroz) 466 40.000

Collus gollus (pollos) 1.200 20.000-23.000
Homo sopiens (ser humano) 3.200 30.000-40.000

2t6 Capítulo 7 Cenomas nucleares eucariontes
É:rlrtrión, ¡'eolii¿iión
nanieniraienin
1v Tr¿ nsd
¿ie
Otras diversas
aciividades
Figura 7.16 Categorización del catá-
logo de genes humanos. El gráfico
de torta muestra una categorización
de los genes humanos que codifican
proteínas humanas identificadas.
Omite alrededor de 13.000 genes
cuyas funciones todavía no se cono-
cen. El segmento marcado "otras
diversas actividades" incluye, entre
otras, proteínas que participan en pro-
cesos de transporte bioquímico y ple-
gamiento de proteínas, proteínas
inmunitarias y proteínas estructurales.
-
nes puede apofiar información significativa sobre el espectro de activida-
des bioquímicas especificadas por un genoma, aun cuando no se hayan
identificado o asignado funciones individuales a las variantes de corte y
empalme de muchos genes. El problema de los catálogos de genes es que
están incompletos debido a las dificultades para identificar las funciones,
incluso en un organismo relativamente simple como Saccharomyces cere-
visiae. Es bastante probable que ciertas categorías de gen estén subrepre-
sentadas en los catálogos, dado que estos genes tienen funciones muy
difíciles de identificar. Recordando estas consideraciones, trataremos pri-
mero el catálogo de genes humanos.
Cslúlogo de genes hum*nos
Se conocen o se pueden inferir con un grado razonable de cefieza las fun-
ciones de más de la mitad de los 30.000-40.000 genes humanos. La vasta
mayoría codifica proteínas; menos de 2.500 especifican los diversos tipos de
RNA funcional. Casi un cuarto de los genes que codifican proteínas partici-
pan en la expresión, la replicación y el mantenimiento del genoma (figura
7.16), y otro 2'1.o/o especifica los componentes de las vías de transducción
de señales, que regulan la expresión del genoma y otras actiüdades celula-
res en respuesta a señales recibidas desde fuera de la célula (sección 14.1.2).
Se puede considerar que todos estos genes tienen una función que participa
de una manera u otra en la actividad del genoma. Las enzimas responsables
de las funciones bioquimicas generales de la célula representan otro 17,5o/o
de los genes conocidos; el resto interviene en actividades como transporte
de compuestos hacia el interior y el exterior de la célula, plegamiento de las
proteínas en sus estructuras tridimensionales correctas, respuesta inmunita-
ria y síntesis de proteínas estructurales, como las observadas en el citoesque-
leto y los músculos. Es posible que a medida que eI catálogo de genes
humanos se complete, disminuyan las proporciones relativas de los genes de
las tres categorías principales de la figura 7.16. Esto se debe a que estas tres
categorías principales representan las áreas más estudiadas de la biología l
celular, lo que significa que es posible reconocer muchos de los genes perti- I
u cción
nentes porque se conocen sus productos proteicos. Es más probable que los l
se¡l¿ies
genes cuyos productos aún no han sido identificados participen en áreas I
menos estudiadas de la actiüdad celular.
AIgo que el catálogo de genes no puede informamos, ni siquiera cuando se
lo complete, es cuál es la esencia de un ser humano. La secuencia del geno-
ma humano ha asestado un duro golpe al enfoque minimalista de la biología
molecula4 que espera que el estudio de los genes indiüduales o de grupos de
c
los genes lleve finalmente a una descripción biomolecular completa de cómo
está construido y cómo funciona un ser humano. No hay revelaciones asom- !
o
brosas acerca de qué diferencia al hombre de los simios. Si bien se ha com-
E
.=
pletado la secuenciación del genoma del chimpancé, todavía no es posible z
determinaq simplemente por comparaciones de los genomas, qué nos hace
humanos (sección 18.4). Sobre la base del número de genes, somos sólo eI
triple de complejos que una mosca de la fruta y el doble de complejos que el
helminto microscópico Caenorhabditís elegans. Estudios más detallados del
funcionamiento del genoma humano quizá revelen características claves que
son la base de algunos atributos especiales de los seres humanos, pero la
genómica nunca explicará la humanidad.
Lcs catátogos ri* g/enes r*velsn l*s carocterístícas distintívas
de difersntes arganísmos
Hay distintas maneras de categorizar los genes de un genoma eucarion-
te. Una posibilidad consiste en clasificarlos según su función, como se
-i-.
 i;. Características genéticas de los genomas nucleares eucariontes 217

muestra en Ia figura 7.16 paru el genoma humano. Este sistema tiene la

ventaja de que las categorías funcionales bastante amplias aplicadas en
iafigura 7.16 se pueden subdividir más para generar una jerarquía de
áescripciones cada vezmás específicas para genes y grupos de genes más
Éequeños. La debilidad de este enfoque reside en que todavía no se han
ásignado funciones a muchos genes eucariontes, por lo que este tipo de
claiificación deja fuera una proporción del conjunto total de genes. Un
fu¿todo más poderoso es basar la clasificación no sólo en las funciones
.lde los genes, sino también en las estructuras de las proteínas que espe-

iifi"urr. Una molécula de proteína se construye a partir de una serie de

;,ilgminios, cada uno de los cuales cumple una función bioquímica parti-
icular. Por ejemplo, el dedo de cinc es uno de varios dominios que per-
i¡iten la unión de una proteína a una molécula de DNA (sección I 1.1 .1),
v el "dominio de muerte", presente en muchas proteínas, interviene en la
ápoptosis. Cada dominio tiene una secuencia característica de aminoáci-
":dos, quizá no exactamente la misma en todos los ejemplos de ese domi-
:nio, pero bastante similar para poder reconocer la presencia de un
heterminado dominio examinando la secuencia de aminoácidos de la
rproteína. Esta es especificada por la secuencia de nucleótidos de su gen,
de modo que es posible determinar los dominios presentes en la proteí-
na de la secuencia de nueleótidos del gen que la codifica. Por lo tanto,
:los genes de un genoma se pueden categorizar en función de los domi-
nios proteicos que especifican. Este método tiene la ventaja de que se
puede aplicar a genes cuyas funciones no se conocen y, por ende, abar-
can una proporción mayor del conjunto de genes de un genoma.

Los esquemas de clasificación que recuren a dominios para inferir la ftrnción

de los genes sugieren que todos los eucariontes presentan el mismo conjun-
to básico de genes, pero que las especies más complejas tienen un mayor
número de genes en cada categoría. Por ejemplo, los seres humanos tienen la
máxima cantidad de genes en todas las categorías ilustradas enlafrgna7.77,
excepto trna; el "metabolismo", en que Arabidopsís ocupa el primer lugar
como consecuencia de su capacidad fotosintética, que requiere un gran con-
junto de genes que no están presentes en los otros cuatro genomas incluidos
en la comparación. Esta clasificación funcional revela offas características

5.000
-,?a.3t!:.-a=*--:a=.-=.:=::::=:.::+:
4.500 Figura 7.17 Comparación de los
::=:1i:::::_-:::::==r=:=::.:::'i:,-.:t== catálogos de genes de
So cch o ro myces cerevisia e,
I S. cerevisioe
Arobidopsis thaliano,
ú 3.s00 : A. tholiono
o Caenorhabditis elegans, mosca de
!
f i.ooo = L. eteoons
la fruta y seres humanos. Los genes
ffi
fi z.soo
E
Mosca de la fruta
)er numano
se categorizan según su función,
E deducida a partir de los dominios pro-
2 2.ooo
teicos especificados por cada gen.
1.500

1.000

500

0
 Capítulo 7 Cenomas nucleares eucariontes
-

Cuadro 7.5 Ejemplos de dominios proteicos

Dominio Función

Dedo de cinc, tipo

a_A-,2 Unión al DNA 564 234 68 21 34
-)'
Dedo de cing tipo
CATA Unión ¿l DNA i I 26
Homeosecuencia Regulación de genes
durante el desanollo ]60 100 o1 66 6

Muerte Muerte celular programada l6 ,5 7 0 o

Conexina Acoplamiento eléctrico
entre células 14
Efrina Crecimiento de células
nerviosas 7 0

Véase más información sobre dedos de cinc y dominio de homeosecuencia en la sección 1 1 . I .

interesantes, como la cantidad bastante alta de genes de C. elegans involucra-

dos en el señalamiento intercelula4 algo sorprendente ya que este organismo
tiene sólo 959 células. Los seres humanos, con 1013 células, tienen sólo 250
genes más para el señalamiento intercelular. Por lo general, este tipo de aná-
lisis hace hincapié en las similitudes entre genomas, pero no revela la base
genética de los tipos ampliamente diferentes de información biológica conte-
nida en los genomas de, por ejemplo, moscas de la fruta y seres humanos. De
todos modos, el enfoque de dominios es promisorio en este aspecto porque
muestra que el genoma humano especifica una serie de dominios proteicos
ausentes en los genomas de otros organismos: por ejemplo, los involucrados
en adhesión celular, acoplamiento eléctrico entre células y crecimiento de
células nerviosas (cuadro 7.5). Estas funciones son interesantes porque con-
sideramos que les confieren características distintivas a los vertebrados, en
comparación con otros tipos de eucariontes.

¿Es posible identificar una serie de genes presentes en los vertebrados, pero
no en okos eucariontes? Por ahora, este análisis se puede efectuar de mane-
ra aproximada, pues sólo se dispone de secuencias de algunos genomas. En
la actualidad, parece que alrededor de un quinto a un cuarto de los genes del
genoma humano son privativos de los vertebrados y otro cuarto se encuen-
tra sólo en los vertebrados y en otros animales (figura 7.18).

verltbrad¡s

Figura 7.I8 Relación entre el catálo-

go de genes humanos y los catálo-
gos de otros grupos de organismos.
El gráfico de torta categoriza el catálo-
Eucario ntes
go de genes humanos según la distri- y procarionies
bución de genes individuales en otros
organismos. El gráfico muestra que,
por ejemplo, el22o/o del catálogo de
genes humanos está formado por
genes que son específicos de los ver-
tebrados y que otro 240lo comprende Animales
genes específicos de vertebrados y y otros
otros animales. eucariontes
 Características genéticas de los genomas nucleares eucariontes 2t9

F*¡i:iíi*s d# g*r-?es
Desde los primeros días de la secuenciación del DNA, se ha sabido que las
farnilias multigénicas -grupos de genes de secuencia idéntica o similar-
son características comunes de muchos genomas. Por ejemplo, todos los
eucariontes estudiados (así como todas las bacterias, excepto las más sim-
ples) tienen múltiples copias de los genes de RNA ribosómicos. Esto es ilus-
irado por el genoma humano, que contiene alrededor de 2.000 genes para
el rRNA 55 (llamado así porque su coeficiente de sedimentación es de 55;
véase Nota sobre técnicas 7.1), localizados todos en un solo complejo
(chtster) del cromosoma 1. También hay alrededor de 280 copias de una
unidad de repetición que contiene los genes de rRNA 2BS, 5,8S y 18S,
agrupados en cinco complejos de 50-70 repeticiones, uno en el cromosoma
15, uno en el 14, uno en el 15, uno en el 2l y uno en el 22 (véase figura
7.5). Los RNA ribosómicos son componentes de las partículas que sinteti-
zan proteinas denominadas ribosomas, y se presume que sus genes están
presentes en múltiples copias, porque hay una gran demanda de síntesis de
inNe durante la diüsión celulal cuando se deben ensamblar varias dece-
nas de miles de nuevos ribosomas.

Los genes de rRNA son ejemplos de familias multigénicas "simples" o"clá-

sicas", en las que todos los miembros tienen secuencias idénticas o casi
idénticas. Se piensa que estas familias han surgido por duplicación de
genes, con mantenimiento de secuencias idénticas de cada miembro por un
proceso evolutivo hasta ahora no analizado por completo (sección 18.2.1).
Otras familias multigénicas, más comunes en los eucariontes superiores
que en los inferiores, se denominan "complejas" porque cada miembro,
aunque tiene secuencias similares, es suficientemente diferente para que
sus productos génicos presenten propiedades distintivas. Uno de los mejo-
res ejemplos de este tipo de familia multigénica son los genes de globina de
los mamíferos. Las globinas son las proteínas hemáticas que se combinan
para formar la hemoglobina: cada molécula de hemoglobina está formada
por dos globinas de tipo u y dos de tipo B. En los seres humanos, las glo- Figura 7..l9 Crupos de genes de
binas de tipo cr son codificadas por una pequeña familia multigénica del a- y B-globina humanos. El grupo
cromosoma 16 y las globinas de tipo B, por una segunda familia del cromo- de u-globina está ubicado en el cro-
soma li (figura 7.19). Estos genes fueron de los primeros en ser secuen- mosoma 16 y el grupo B, en el cro-
ciados, hacia finales de la década de 1970. Los datos de la secuencia mosoma 1 l. Ambos grupos
contienen genes que son expresados
mostraron que los genes de cada familia son similares entre sí, pero de nin-
en diferentes estadios de desarrollo y
guna manera idénticos. De hecho, las secuencias nucleotídicas de los dos cada uno incluye por lo menos un
genes más distintos del complejo tipo B, que codifica las B y e-globinas, pre- seudogén. Obsérvese que Ia expre-
sentan sólo un 79,1o/o de identidad. Si bien esto es bastante similar para sión del Ben €z de tipo cr comienza
que ambas proteínas sean globinas de tipo B, es suficientemente diferente en el embrión y continúa durante el
para que tengan propiedades bioquímicas distintivas. Se observan variacio- estadio fetal; no hay ninguna globina
nes similares en el complejo o. de tipo cx, especÍfica del feto. Hay
expresión del seudogén 0, pero su
producto proteico es inactivo. No se
¿Por qué son tan diferentes entre sí los miembros de las familias de genes de expresa ninguno de los otros seudo-
globina? La respuesta fue revelada cuando se estudiaron los patrones de genes. Véase más información sobre
expresión de cada gen. Se descubrió que los genes se expresan en diferentes la regulación madurativa de los genes
estadios del desarrollo humano; por ejemplo, en el complejo tipo B, e se de B-globina en la sección 10.1.2.

5kb

ü- ú", 0l l€
6en de embrión Gen de adulto
._ _ _ -_ ¡_ utltE)utq-xluulto
Gen de feto
--:
-&
¡=Ei ffi Seudogén

c1 A, ús
22O Capítulo 7 Cenomas nucleares eucariontes

expresa en el embrión temprano; GV V Ay (cuyos productos proteicos difie-

ren sólo en un aminoácido), en el feto; y 6 y F, en el adulto (figura 7.19). Se
estima que las diferentes propiedades bioquímicas de las proteínas globinas
resultantes reflejan ligeros cambios de la función fisiológica que cumple la
hemoglobina durante el desarrollo humano.

En algunas familias multigénicas, cada miembro está agrupado, como en el

caso de los genes de globina, pero en otras, los genes están dispersos por el
genoma. Un ejemplo de familia dispersa 1o constituyen los cinco genes huma-
nos de la aldolasa, una enzima involucrada en la generación de energía, ubi-
cados en los cromosomas 3, 9, 10, 16 y 17.El concepto importante es que,
aunque dispersos, los miernbros de una familia multigénica tienen similitu-
des de secuencia que apuntan a un origen evolutivo común. Cuando se com-
paran secuencias, a veces es posible observar relaciones no sólo dentro de
una familia de genes, sino también entre distintas familias. Por ejemplo, todos
los genes de las familias de globina cr y B tienen una similitud de secuencia y
Cen funclcn¿1 se considera que han evolucionado de un solo gen de globina ancestral. Por
;¡=:=:;;¡=.;==;; lo tanto, nos referimos a estas dos familias multigénicas como representantes
de una única superfamilia de genes de globina y, a partir de las similitudes
Transcripción
t entre cada gen, es posible graficar los episodios de duplicación que han dado
origen a la serie de genes que se observan hoy (sección 18.2.1).
I
,il

Ssudogenes y otros vestigios evalutívos

{,/ Transcripción inversa Los complejos de genes de globina humana contienen cinco genes que ya no
son activos. Estos son seudogenes, copias de genes no funcionales. Los seu-
;:;¡'=,-=úE DNA dogenes son un tipo de vestigio evolutivo, una indicación de que los geno-
mas se modifican continuamente. Hay dos tipos principales de seudogén:
I Reintegración
¿ = Un seudogén convencional es un gen que ha sido desactivado porque su
secuencia nucleotídica ha cambiado por mutación (capítulo 16). Muchas
# #
B.E ¡iryE-*i¡¡-*ffi¡r mutaciones ejercen sólo efectos menores sobre la actiüdad de un gen,
Seudogén rlet: iun'i¡n¡i pero algunas son más importantes y es bastante posible que el cambio de
un solo nucleótido determine que un gen pierda por completo su función,
Una vez que un seudogén se ha tomado no funcional, se degradará por
acumulación de más mutaciones y, con el tiempo, ya no será reconocible
Figura 7.2O Origen de un seudogén
procesado. Se considera que un seu- como vestigio génico. Los seudogenes de globina son ejemplos de seudo-
dogén procesado surge por integra- genes convencionales.
ción al genoma de una cop¡a del
mRNA transcrito de un gen funcional. = Un seudogén procesado surge no por degradación evolutiva, sino por un (

El mRNA es transcrito inversamente a complemento anormal de la expresión del gen. Deriva de la copia mRNA I
una copia de cDNA, que se podría de un gen por síntesis de una copia de cDNA que, después, se reinserta (

integrar al mismo cromosoma que su en el genoma (figura 7.2O). Como un seudogén procesado es una copia (

progenitor funcional o, quizá, a un de una molécula de mRNA, no contiene ninguno de los intrones presen- I
cromosoma diferente. tes en el gen progenitor. Thmbién carece de las secuencias nucleotídicas I
inmediatamente corriente arriba del gen progenito4 que es la región en la (

que se localizan las señales empleadas para actlar su expresión. La

ausencia de estas señales implica que un seudogén procesado es inactivo.

Cen ft.¡rici¡rn¿1 Además de seudogenes, el genoma contiene otros vestigios evolutivos en

forma de genes truncados, que carecen de una extensión mayor o menor
t),/\
de un extremo del gen completo, y fragmentos de genes, que son regiones
cortas, aisladas, del interior de un gen (figura 7 .21).
,-
r.4+.i
.€
Fragmento de gen Gen truncado ¿?.4 {e*t=í:!do. re.petitivú d+ trNá de E*s geae+¡=-:as
nuei=a r€s *Guca r!ont€S
La secuencia del genoma humano reveló que alrededor del 620/o de éste
comprenderegionesintergénicas,laspartesde1genomaqueresidenentre
frágmento de u"n gen. genes y no tienen función conocida. Estas secuencias se solían llamar DNA
 Características genéticas de los genomas nucleares eucariontes 22t

É¡ cromosoma t Figura 7.22 Los dos tipos de DNA

repetitivo: repeticiones dispersas y
DNA repetido en tándem.
Repeticiones dispersas

Cromosoma 2

,. ONA repetido
en tándem
.

redundante (iunk), pero este término se está abandonando, porque las

numerosas sorpresas resultantes de la investigación del genoma en los últi-
rnos años han determinado que los biólogos moleculares tengan menos
ionfi,anza en afirmar que cualquier parte del genoma carece de importan-
cia, sólo porque por ahora no sabemos cuál podría ser su función. Como
hemos viito, en la mayoría de los organismos, el grueso del DNA intergé-
nico está formado por secuencias repetidas de uno u otro tipo. El DNA
'repetitivo se puede dividir en dos categorías (figura 7.22): repeticiones en
toáo el genoma o repeticiones dispersas, cuyas unidades de repetición ind!
üdualel están distribuidas por el genoma de manera aparentemente alea-
toria, y DNA repetido en tándem, cuyas unidades de repetición están
übicadas próximas entre sí en una matriz.

Se exr¿¡er¡irq üf iA repetiCc en iánd€m efi Jús cefitrórnercs

y at{üs partes de ¡'üs crü{nosonlús eucúriafites 1,60

El DNA repetido en tándem se denomina también DNA satélite, por-

que los fragmentos de DNA que contienen secuencias repetidas en tán- 1,65

dem forman bandas "satélites" cuando se fracciona el DNA genómico

por centrifugación en gradiente de densidad (véase Nota sobre técnicas : .'. : Bandassatélites
Z.t). por ejemplo, cuando se rompe en fragmentos de 50-100 kb de 1,70
ffi:E.=il- Banda PrinciPal
longitud, el DNA humano forma una banda principal (densidad sumer-
gida de 1.,701 g cm-3) y tres bandas satélites (1,687;1,693 y 1,697 g 1,75
..-:

cm-5). La banda principal contiene fragmentos de DNA compuestos, en ,t:

su mayor parte, por secuencias de copia única con composiciones de :-:
GC cercanas al40,3o/o, el valor promedio para el genoma humano' Las 1,80

bandas satélites contienen fragmentos de DNA repetitivo y, por lo gcm -l

tanto, tienen contenido de GC y densidades sumergidas que son atípi-

cas del genoma en su conjunto (figura 7 .23). Este DNA repetitivo está
formado por largas series de repeticiones en tándem, qtizá de cientos Figura 7.23 DNA satélite del geno-
de kilobases de longitud. Un solo genoma puede contener varios tipos ma humano. EI DNA humano tiene
diferentes de DNA satélite, cada uno con una unidad de repetición dife- un contenido promedio de CC de
rente; estas unidades pueden medir de menos de 5 a más de 200 pb de 40,3o/o y una densidad sumergida
longitud. Las tres bandas satélites del DNA humano incluyen no menos promedio de 1,70,l I cm-s. Los frag-
de cuatro tipos de repetición diferentes. mentos formados principalmente por
una sola copia de DNA tienen un
contenido de CC cercano a este Pro-
medio y están contenidos en la
Ya hemos encontrado un tipo de DNA humano satélite: las repeticiones de banda principal del gradiente de den-
DNA alfoide halladas en las regiones centroméricas de los cromosomas sidad. Las bandas satélites de 1,687;
(sección 7.1.2). Si bien parte del DNA satélite está disperso por el genoma, 1,693 y 1,697 g cm-3 son fragmen-
la mayoría se localiza en los centrómeros, donde desempeña un papel tos que contienen DNA repetitivo. El
estructural, quizá como sitio de unión para una o más de las proteínas cen- contenido de CC de estos fragmentos
troméricas especiales. deoende de sus secuencias con moti-
vos repetidos y es diferente del pro-
medio del genoma, lo que significa
M inis*tél ítes y n"; irrosaté! ites cue estos frasmentos tienen distintas
Otros dos tipos de DNA repetido en, tándem también se clasifican como <jensidades sümergidas respecto del
DNA "satélite", aunque no aparecen como bandas satélites en los gradientes DNA de copia única y migran hasta
de densidad. Son minisatélites y microsatélites. Los minisatélites forman diferentes posiciones en el gradiente
complejos de hasta 20 kb de longitud, con unidades de repetición de hasta de densidad.

Capítulo 7 Cenomas nucleares eucariontes
Figura 7.24 Análisis de microsatélites
para determinar el perfil genético.
En este ejemplo, se han amplificado
por PCR los microsatélites localizados
en el brazo corto del cromosoma 6.
Se marcan los productos de la PCR
con una sustancia fluorescente azul o
verde y se los hace correr en un gel
de poliacrilamida; cada carril muestra
el perfil genético de un individuo dife-
rente. No hay dos individuos que ten-
gan el mismo perfil genético, porque
cada persona presenta una serie dife-
rente de variantes de longitud de los
microsatélites; las variantes dan origen
a bandas de distintos tamaños des-
pués de la PCR. Las bandas rojas son
marcadores de tamaño del DNA.
lmagen cortesía de Applied
Biosystems, Warrington, U K.
T
25 pb de longitud; los complejos de microsatélites son más cortos, en geÍle-
ral de menos de 150 pb, y la unidad de repetición suele ser de 13 pb o menor.
EI DNA minisatélite es ul segundo tipo de DNA repetitivo con el que ya esta-
mos familiarizados, debido a su asociación con características estructurales
de los cromosomas. El DNA telomérico, que comprende cientos de copias
del motivo 5'-ITTAGGG-3'en los seres humanos (véase figura 7.10), es un
ejemplo de minisatélite. Tenemos cierto grado de conocimiento sobre la for-
mación del DNA telomérico y sabemos que cumple una función importante
en la replicación del DNA (secci6n 15.2.4). Además de los minisatélites telo-
méricos, algunos genomas eucariontes contienen otros diversos complejos de
DNA minisatélite, muchos de los cuales, aunque no todos, se ubican cerca de
los extremos de los cromosomas. No se han identificado las funciones de
estas otras secuencias minisatélites:
Los microsatélites también son ejemplos de DNA repetido en tándem. En un
microsatélite, la unidad de repetición es corta: hasta 13 pb de longitud. El
tipo más común de microsatéiite humano son repeticiones dinucleotídicas,
con airededor de 140.000 copias en todo el genoma y cerca de la mitad de
ellas corresponden a repeticiones del motivo "CA". Las repeticiones de un
solo nucleótido (p. ej., AAAAA) le siguen en orden de frecuencia (alrededor
de 120.000 copias en total). Como en el caso de las repeticiones en todo el
genoma, no se ha esclarecido si los microsatélites cumplen alguna función,
Se sabe que surgen como consecuencia de un elTor en el proceso responsa-
ble de copiar el genoma durante la división celular (sección 16. 1 . 1 ) y podrí-
an set simplemente, productos ineütables de la replicación del genoma.
Aunque se desconoce su función, si es que tienen alguna, los microsatélites
han resultado muy útiles para los genetistas. Muchos microsatélites son varia-
bles, lo que implica que la cantidad de unidades de repetición en Ia matriz es
diferente en distintos miembros de una especie. Esto se debe a que, a veces,
se produce "deslizamiento" cuando se copia un microsatélite durante la repli
cación del DNA, lo que determina la inserción o, menos a menudo, la dele-
ción de una o más de las unidades de repetición (véase figura 16.5). No hay
dos seres humanos vivos en la actualidad que tengan exactamente la misma
combinación de variantes de longitud de lbs miciosatélites: si se examinan
suficientes microsatélites, se puede establecer un perfil genético paru cada
persona. Las únicas excepciones son los gemelos genéticamente idénticos. El
perfil genético es un instrumento bien conocido en la ciencia forense (figura
7.24), pero la identificación de criminales es una aplicación bastante trivial
de la variabilidad de los microsatélites. Los métodos rnás modemos aprove'
chan el hecho de que el perfil genético de una persona se hereda en parte de
la madre y en parte del padre. Esto implica que se pueden emplear microsa-
télites para establecer relaciones de parentesco y afinidades poblacionales, no
sólo para seres humanos, sino también para animales y vegetales.
trepeÉicion es aíspe.'s*s
Se considera que las secuencias de DNA repetido en tándem han surgi-
e
do por expansión de una secuencia progenitora, por deslizamiento (s/ip-
page) de la replicación, como se comentó para los microsatélites, o por
tr
procesos de recombinación de DNA (capítulo 17). Es probable que
d
estos dos eventos determinen una serie de repeticiones ligadas, más que
S
unidades de repetición individuales disperJas por el génoma. Por 1o
tanto, las repeticiones dispersas se deben de haber originado por un q
mecanismo diferente, alguno que pueda lograr que una copia de una
unidad de repetición aparezca en el genoma, en una posición aleiada de
la ubicación de la sequencia original. Esto reconoce como mecanisrno
.=-
 CaraeterÍsticas genéticas de los genomas nucleares eucariontes

r¡r§¡ liecuento la tfansposición. .v 1a n:a5,orí¡ de las repeticiones dispei'-

sas ilrisentan actir,id¿d transposicii:nal inherente. La tr;insposiciÓn taül-
bién es una característic¿i de algunos genollla§ virales, que *se pueden
insert¡rr en e1 genoma cle l¿l célula infect¿lcla ¡', clespués, desplazarse a dis-
tintü-s lugares clenro cle ese genofna. Es evidente que alp¡unas repeticio-
rrcs Llispelsas descienden cle \iirus tlansponibles X dada esta relaciÓn.
DosL:ündtelnos el tratamiento de estos y otfos tipos de repetición elr todo
ll g*r'ro,o, hasta el capítuk: 9, después que hayanos estudiado en deta-
11¿ l¡s características de los genomas virales.

ffi*g i n:**
El g*nr:ma nuclear eucarionte está disfibuido en una serie de molé-
.61s-r de DNA lineales, cada una de las cuales está contenida en un
cl'ür¡osoma. Dentro de un c1'onlosoma, el DNA es empaquetado por
asociación con proteínas histonas para fr:rmar los irucieosomas, que
intelactúan entre sí para dal origen a la fibra cle J0 nm y Órdenes más
altos de estructura cron-iatínica. La oi:ganización más cclmpacta corres-
pcncle a los cromosofilas en metafase, que pueden observarse con el
micr"oscopio óptico en las células en clivisión y que adoptan patlones
de bandeo cal'acterísticos después de la tinción. Los centrómelos,
visibles en los c1'Olllosomas en metafase, contienen proteín¿is especia-
les que forman el cinetocot'o, el punto de fijación para los microtúbu-
los que atrastl¿ln los cromoscmas clivididi:s haci¿l lcs núcleos hijos.
En §. cerer'ísise, eI DNA centronlérico que actúa conlo sitio de uniÓn
para estas proteínas es de alrededor de 125 pb de longitud, pero en la
ma!'i:ria de los otros eucariontes, esta regiÓn de DNA es mucho más
|a¡ga y está compuesta pür f)NA ¡epetitivo. I-os telÓmeros, las estruc-
tltr¿ls que mantienen los ertre¡nos del cromosoma. también contienen
DliA repetitivo y proteínas de unión especiales. l-os genes no presen-
t¿in úna distribución uniforme a 1o largo cle los cronlosol-1l¿ls: la clen-
siilail en los cromosolnas humanos varía cle 0 a 6'4 genes por 100 kb.
Las partes codificantes de los genes replesentan sólo una pL'quclla
polción del -genoma humano, menos clel 1,5o¡b, mientras que el 449á
de1 genornei está fürnrado por cliversos tipos cle -cecuencias cle DNA
repetitivo. En c¿lnrbio, e1 genoma de §. ¿'cret'isír¿¿ es r:lucho nrás com-
pacto y las secuencias lepeticlas ocr:piln sÓ1o t:\ 3,4c,b. Por 1o get-reral,
los genomas más glancles son lnenos conlp¿tctos, lo que explica por
quó olganismos con canticlacies sillilales de gencs pueden tent:r gencl-
mns de tamañr¡s ntu¡i difelentcs. Los selres humanos poscctt 30.000-
40.000 genes, alredeclor del doble que cl nem¿rtcclo Cuenarhubclitís
ele guns y más o menos la misma cantidacl c1r:e el ¿lrroz. I-as coinpara-
ciones de catiriogos de genes, que cnunleran las funciones de los genes
dc un genoma, sugieren que si bien todos los euc¿ltiontes tienen el
mismo conjunto básico cle genes, las especies más compiejas presen-
tan un maJ¡or núinero de genes en cada categoría funcional. Nluchos
genes estiin organizados en familias multigónic¿ls, ctlyos tniembros
ticnen secuencias sinlilates o idénticas, y cll algunas farnilias, co11l0
k:s genes de globina cie los vertebl'ados. los mielnbros scn erprcsados
en dif'erentes estadios ciel clesarrollo. Asimisr"no, los genorllas nuclearcs
eucar:iontes contienen vestigir:s evolutivos, coiTlo seudogenes y fi'agmer-r-
tos de genes no funcionales. El conteniclo c1e DirlA repetitivo se puccle
cliviclir en DliA dispel'so, gran parte del cual pi:esenta activiclacl transpo-
sicional. y, DNA repetido en táncleir, que inciuye e1 Dl.'lA saté1itc h¿rllado
en los centrórneros, minis¿rtólitcs como e1 DNA telou:érico y miclosatéiites
cllre los científicos t-orenses emplcan para clctemrinar el pcr:lil genético.
 "'':'1

r#l
d'i ,.'-.: {'E
\"\3&
-"3,
-"1,&
...q i .

JU
-'
.... !. r

*,.f,

§sw
:. S ,,-l fl,'-h. §r,'^u *e_flfu* *s ,,,,*. § S $ g*'i ¡,*
I
rif
-

ql {
-k- Á"fi:i*fi*H
4u* ñ qfu":P$ j"",, &__# ffi $A
3 &"Px-*d ffi ;§ Á*e
§ &*# I ?*d
# ¿r "*;

lrl. 1 i-,I l'r: i:i ti ! 1:i: i il iil i. ir::: i i,,rl:; f iil: !,lili

:ilitta{::j} ilijrrt'::.I:ri:r:r

Describir cómo se empaqueta el DNA bacteriano en un nucleoide y aportar evidencia experimental para
el modelo de dominios del nucleoide de Escherichio coli.

Dar ejemplos de genomas procariontes que son lineales o multipartitos y explicar por qué la presencia de
plásmidos en algunas células procariontes complica definir qué constituye el "genoma".

Reseñ¿r las caracterilicas importantes de Ia organización de los genes en los genomas procariontes.

Definir, con ejemplos, el término 'bperón".

Analizar la relación entre el número de genes y el tamaño del genoma en los procariontes, y especular
sobre el contenido det genoma procanonte mínimo y sobre la identidad de los genes distintrvos.

Analizar la hipótesis endosimbionte de los orÍgenes de los genomas de orgánulos.

Describir las características fÍsicas y el contenido de genes de los genomas de mitocondrias y cloroplastos.

Los procadontes son organismos cuyas células catecen de compartimen-

tos internos extensos. Hay dos grupos muy diferentes de procariontes,
que se distinguen entre sí por características genéticas y bioquímicas
típicas.
* Las bacterias, que incluyen la mayoría de los procariontes encontra-
dos comúnmente, como grailmegativos (p. ej., Escherichia calí),
grampositivos (p. ej., Bacillus subtilis), cianobacterias (p. ej.,
Anabaena) y muchos más.
u Las arqueobacterias (Arehaea), que no están tan bien estudiadas y
se han hallado, en su mayoúa, en ambientes extremos, como aguas
termales, estanques de aguas salinizadas y fondos anaerobios de
lagos.

En este capítulo, examinamos los genomas de los procariontes y también

los cle las mitocondrias y los cloroplastos eucadontes 1os cuales, colno des-
cienden de bacterias, tienen genomas que presentan muchas cal'acterísti-
cas plocaliontes. Debiclo a los tamaños relativamente pequeñr:s de los
genomas procariontes, se han publicado varios cientos de secuencias de
genomas completos de diversas bacterias y al'queobacterias en los úitimos
 Capítulo.8 Cenomas procariontes y de orgánulos eucariontes

años. En consecuencia, estamos comenzando a conocer mucho sobre 1a

collstitución de los genomas procariontes y, en algunos aspectos, sabemos
rnás de estos ol'ganismos que de los eucadontes. El cuadro que está sur-
giendo indica una inmensa variabilidad entre los procadontes en su con-
junto y, en algunos casos. aLrn entre especies estrechamente relacionadas.

Figura 8.1 Nucleoide de Éscherichia

&,
{?d5qr
i flmrarteristicas
fi s/4
m saÍ! :a
§ís§cffis {áe $ms
!'"a }rfl¡ r-:n,crí n rr Sgr
col'. Esta microfotografía electrónic¿ ;;u{{ugEáuJ ubH! {wár*e#
de transmisión muestra el cofte trans- Los genomas procariontes son muy diferentes de los eucariontes, en
versal de una célula de E. colien divi-
sión. El nucleoide es la zona de
particulal con l'especto a su organización física dentro de la cé1ula. Si
tinción clara en el centro de la célula. bien la paiabra "cromosoma" se emplea para describir las estructuras
lmagen cortesía de Conrad Woldringh. DNA-ploteínas presentes en las cálulas procariontes, es un non-lbre
erróneo, pues esta estructura presenta pocas similitudes con un cro- §l
mosoma eucarionte.
l¡
*"I"1 l-*.: cr*¡i¡ffi§&{§?*§ s$e §*s W{'ffi{ffir§*r§&*§ ul
L.
El concepto tradicional ha sido que, en un procarionte típico, el genoma p
está contenido en una sola molécula de DNA circular, ubicada dentro e¡
del nucleoide, la región de tincién clala de la célula procarionte, por 1o u
demás sin rasgos característicos (figura 8.1). Sin duda, esto es válido p,
parc E. coli y muchas de las otras bacterias estudiadas con frecuencia. ñ
Y
Sin embargo, como veremos, los conocimientos cada vez más profundos §r
sobre los genomas procariontes están llevando a cuestionar varios d* ios q
preconceptos establecidos durante la era pregenómica de la microbiolo- ñ
gía. Estos pleconceptos se relacionan tanto con la estructura física del 1't
tlr
genoma procarionte como con su organización genética. T{

,1.", ,1.::,-. j"*".1 .-;, ;, ;i C:' efil'::.lj(r.':i ,'),', r,t¡i':,';i .

,A1 igual que los cromosomas eucariontes, un genoma procarionte debe

complimirse en un espacio relativamente pequeño (el cromosoma circu-
lar de E. co/i tiene una circunferencia de i ,6 mm, mientras que una célu-
la de E. coli mide sólo 1 x 2 pm) y, al igual que en los eucariontes. esto
se logra con la ayuda de las proteínas de unión al DNA, que empaque-
tan el genoma en forma organizada.

La mayor parte de 1o que sabemos acerca de Ia organización del DNA en el

Figura 8.2 Superenrollamiento. El
diagrama muestra cómo el desenro-
llamrento de una molécula de DNA
circular bicatenario da por resultado
un superenrollamiento negativo.
nucleoide proviene de estudios de E. «tli. La primera característica que se
reconoció fue que el genoma circular de E. coli está superenrollado. E1 super-
enroliamiento aparece cuando se introducen giros adicionales en la doble
hélice del DNA (superenrollamiento positivo) o si se eliminan giros (super"

...-.---+ ..m+
DNA circular bicatenario Eliminar algunos giros La molécula forma un
de la doble hélice superenrollamiento
negativo
 Característic¡s lísicas de los genomas procariontes 2tl

Figura 8.3 Modelo de la estructura

del nucleoide de Escherichio coli.
Entre 40 y 50 bucres superenrollados
de DNA irradian de ias proteínas cen-
trales. Se iiuslra uno de los bucles en
forma circular, io que indica que ha
Bucle
habido una rotura en este segmento
roto - ausencia de
superenroilamienlo
de DNA, que determina una Pérdlda
del superenrollamiento.

Pr*!*ir*r
tt{:{i;t,l§ en¡ollado

enrollarniento negativo). En una molécula lineal, ia fuerza de torsión introdu-

cida pcr superenrollamiento o subenrollamiento se libera de inmediato por
la roiación áe los extlemos de la molécula de DNA, pero una moiécula cir-
c§}ar, que no tiene extremos, no puede reduct ia fuerza de este modo. En
.i caülbio, la molécula circular lesponde enrollándose alrededor de sí misma
para formar una estructula más compacta (figura 8.2). Por lo tanto, el supel-
enrollamiento es una manera ideal de empaquetar una molécula circular en
un pequeño espacio. En la década de 1970, el examen de nucleoides aislados
pemi¡ó obtener pof primem vez evidencia de que e1 superenrollamiento
participaba en el empaquetamiento del genoma circuiar de E. coli,lo que se
ionfimró en 1981, como caracteústica del DNA de células vivas. Se piensa
que en E. coti el superenrollamiento es genemdo y controlado por dos enzi-
mas, DNA girasa y DNA topoisomelasa I, que se analizarán con mayor deta-
lle en la seóción 15.1.2, ai examinar las funciones de estas enzimas en la
repiicación del DNA.

Los estudios cle nucLeoides aislad<¡s sugieren que la molécula de DNA de

E. ctsli no tiene libertad de rotación ilimitada una vez que se ploduce una
rotura. La explicación más probable es que el DNA bacteriano está unido
a proteínas que restringen su capacidad de relajación, de modo que la rota-
cibn en un sitio de rotuta detemina la pérdida del superenrollarriento de
sólo un pequeño segmento de la molécula (fig,ura 8.5). La evidencia más
fime para este modelo de clominios proviene de experimentos que apfove-
chan 1a capacidacl del tlimetilpsolaleno de distinguir entre DNA superen-
rollaclo y rála;ado. El trirnetilpsotaleno, al ser fotoactivado por un pulso cle
luz cie 360 nm de longitud de onda, se une at DN.,A. bicatenario a una velo-
ciclacl que es directamente pl'opot'cional al grado de fueza de torsión a ia §Bo
que está someticl¿l la molécula. Por 1o tanto, es posible anaiizar el gfadr: de o
c
a
superenrollamienro a través de i¿r cletern-iinación de ia cantldad de trime- o60
tilpsoraleno que se une a la molécula pcr unidad de tiempo. Tlas haber irra- g
diaclo célu1as de .8. coli para provocar roturas de una sola cadena en su§ €
.;É.
molécr:las de DNA, e1 grado de unión del trimet:ilpsoraleno es proporcio-
!
nal a la dosis de radiación (figura 8.4). Esta es la respuesta anticipada por .'e
c
c
el irodeio c1e dominios, en el cual el supet'enrollamiento global de Ia molé- f,x)
cula se relaja en forma gradual a medida que closis de ladiación más altas
causrln roturas dentro de un número creciente de dollinios. Por el contra-
rio. si ei nucleoido úe E. coli no estuviera r:rganizado en dominios, una sola
rotura de la molécula de DNA provocaría la pér'dida completa del superen-
rollamienlo: así, la irradiación ejercería un efectr: c1e todo o nacla sobre la
unión del trimetilpsor¿rleno.

Según elmoclelo actual. el DNA E. culi está unido a un núcleo cle proteí-
c1c Fisura 8.4 Cráfico que muestra la
nas del que in¿ldian hacia fuera 40 a 50 bucles superenrollaclos, dentro de l¿i rJlación entre la dosis de radiación
céluia. Cada bucle contiene alrededor de 100 kb de DNA superent'ollado, la y la unión de trimetilpsoraleno.
23' Capítulo I [enonlas prlcarrcntes y de orgdnulcs eucencntes

cantidad de DiriA que se desenrolla después de una sola rotura. El compr:-

nente ploteico del nucleoide comprende D|{,A girasa y DNA topoisomerasa
I, las dos enzimas fundamentales pala mantener el estado superenrollado,
así como un conjunto de ni: menos de cuatro proteínas que se piensa que
desempeñan un papel niás especítico en el empaquetamiento del DNA bac-
teriano. La más abundante de estas proteínas de empaquetamiento es lll,,
cu)-a estructura es mul,dit'erente de la de las histonas eucariontes, pero que
actúa de modo similar lbrmando un tetrámelo alrededor del cual se enrolian
alrededor de 60 pb de Dl'lA. Hay más o rrlenos 60.000 proteínas HU por
célu1a de E. coli, suficientes pala cubrir cerca de un quinto de la molécula de
DNA. pero no se sabe si los tetámeros están espaciados de manera unifor
me a 1o largo del Dl'lA o se limitan a la región central del nucleoide.

La explicación preüa se refiere específicamente al croirlüsoma de E. coll, con-

sideradc típico de los cromosomas bacterianos en general. Pero se debe ser
cuidadoso para distinguir entre el cromosoma bacteriano y elde un seglrndo
grupo de procadontes: las arqueobacterias. LIna de las razones por las cuales
las arqueobacterias se consideran un grupo distinto de organismos, diferer¡te
de las bacterias, es que no contienen proteínas de empaquetamiento como las
HU, sino proteínas mucho más sin:ilares a las histonas. Estas forman un
tetrámero que se asocia con alrededor de 80 pb cle DNA para cr:n{igurar una
estluctur"a similar a un nucleosoma eucarionte (véase tigura 7 .2). En la actua-
infonlación sobre el nucleoide de las arqueobacte-
1idad, se tiene muy poca
rias, pero se presume que estas proteínas similares a histonas tienen una
pafiicipación fundamentai en el empaquetamiento del DNA.

.:
E1 genorna de E. coli, como se mencionó. es una sola molécula circular de
D|,IA. Esto también es así en la vasta mayoría de los cl'omosomas de bacte-
rias y arqueobactedas que se han estudiado, pero se está descubriendo un
número cada vez mayor de versiones lineales. La primela de éstas se clescd-
bió en 1989 para Borrelia btLrgclorferi, el agente etiológico de ia enfennedad
de Lyme, y dulante los años siguientes se efectuaron descubrimientos simi-
lares para Streptomyces coelícolor y Agrobacteriurn tumefucíens. Las molé-
culas lineales tienen extremos libres, que se deben distinguir de roturas de
DNA, por lo que estos cromosomas requielen estructuras terminales equi-
valentes a los telómeros de los cromosornas eucariontes (sección7.1.2).En
Borrelia y AgrobucteritLrn,los extremos reales del cromosolna se distinglen
po1'que se fbrma un enlace ci:valente enre los extremos 5' y 3' de los poii-
nucieótidos de la doble hélice de DNA, y en Streptornyces, los extlcmos
parecen estar marcados por proteínas de unión especiales.

Una segrnda y más difundida vadación clel tema de E. coli es la pres;ncia.

Nucleoide
Plásmídos
Figura 8.5 Los plásmidos son
pequeñas moléculas de DNA circu-
lar, que se encuentran dentro de
algunas células procariontes.
en algunos procariontes" de genomas multipartitos, §lenomas que están ciivi
didos en dos o más moléculas de DNA. En estos genornas multipartitos suele
sel ull problema distinguir una páÍte genuina del genoma de un plásmido. Un
plásmido es un pequeño fragmento cle DNA, a menudo (aunque no siempre)
circular, que coexiste con el cromosoma pdncipal en una célula bacteriana
(figura .3.5). Algunos tipos de p1ásmido pueden integrarse al genoma princi
pal, pelo se considera que otros son siempre independientes. Los p1ásrnidos
contienen genes que no suelen estar presentes en el cromosoma pdncipal,
pero que, en muchos casos, no son esenciales para la bacteria y codifican
características, corno la resistencia a 1os antibióticr:s, que la bactelia no neoe-
sita si las concliciones ambientales son favorables (cuadro 8.1). Además de
esta aparente prescindibilidad, muchos plásmiclos se pueden transferir cle
una có1ula a otra ), en ocasiones, se encuentran los mismos plásmidos cn bac'
terias que pefienecen a clif'erentes especies. Estas clivelsas características de
 Caracteristicas fisicas de los genomas procariontes

Cuadro 8.1 Características de los plásmidos típicos

Funcíones de los genes

Üe r€slstencla Resistencia antibiótica

ll.'
::tt:

De lertllldaÚ Conjugación y transferencia de DNA F de E. coli

.'l
entre b¿cterias
,., Lítico Síntesis de toxinas que destruyen otras Col de E. coli, para producción de colicina
bacterias
Enzimas para el metabolismo de TOL de Pseudomonas putida, para el
molécul¿s atipicas metabolismo del tolueno

Patogenicidad \ de Agrobacterium tumefocienq que confiere

la capacidad de provocar la enfermedad aga-
lla de la corona en las plantas dicotiledóneas

Cuadro s.2 Ejemplos de organización del genoma en los Procariontes

coliKl2 Una molécula circular 4,639 4.405

. Vibrio choleroe El Tor N 16961 Dos moléculas circulares

tli Cromosoma principal 2,961 2.770
'l.
Megaplásmido 1,Ot3 t 15

:,:''
Pe in ocoCCu s ro d iod u ra ns R1 Cuatro moléculas circulares
Cromosoma I 2,649 2.633
Cromosoma 2 o,412 369
Megaplásmido o,117 145
Plásmido 0,046 40

burgdorferiB3l Siete u ocho moléculas circulares,

once moléculas lineales
Cromosoma lineal 0,9.lI 853
Plásmido circular cp9 0,o09 12
Plásmido circular cp26 0,026 29
Plásmido circular cp52t o,o32 No conocido
Plásmido lineal lp17 o,o17 25
Plásmido lineal lp25 o,o24 32
Plásmido lineal lp28-1 o,o27 32
Plásmido lineal lp28-2 0,o30 34
Plásmido lineal Ip28-5 o,o29 41
Plásmido lineal lp28-4 o,o27 43
Plásmido lineal lp36 o,o37 54
Plásmido lineal lp38 0,o39 52
Plásmido lineal lp54 0,054 76
Plásmido lineal lp56 o,056 No conocido

* Hay cinco
o seis versiones similares del plásmido c?32 por bacterra.
Capítulo B Cenomas procarionles v de orgánuk:s euc¿riontes

los plásmirlos sugieren que son enticlade-s independientes y que. en la miiyü-

ría de los casos, no se debe incluir el contenido plasmídico de una célr-rl:i pro-
c¿lrionte en la definición c1e su genoma.
En una bacteria como E, coli K12, que tiene un cromosoma c1e 4,6 l\{h
-v puede albergar diversas combinaciones de plásmidos, ninguno de los
cuales mide más que unas pocas kilobases y todos son prescindibl*s, r¡r
aceptable definir el cromosoma principal como e1 "genoma". En orrrs
procariontes esto 1-)o es tan fácil (cuaciro 8.2). Vibrío cltolerue,la bac-
teria patógena que provoca el cólera, tiene clos molécui¿rs circuiares de
DNA: una de 2,96 Mb y la otra de 1,07 i!Ib, y 7|c;b de ios 3.885 genes
delmicroorganismo se ubican en la más grande. Si bien parecerÍa r:bvio
que est¿is dos moléculas de DNA juntas constitr:,van el genoma de
Vibrio, Lrn examen más exhaustivo revela que la ma1'or'ía de los genes
parra las actividacles celulares centlales, como expresión del genorna y
generación de energía, así como los genes que confieren patogenicidad,
residen en 1¿r molécul¿r más grande. La moléctila más pequeña contiene
muchos genes esenciales, pero también tiene ciertas caracter'ísticas con-
sideradas típicas de los plásmidr:s, en particular', la presencia cle un
integrón, un conjunto de genes y otras secuencias de Dl'lA que pcrmi-
te a los plásmidos captllrar genes de bacteriófagos y otros plásmiclos.
Por lo tanto, parece posible que el genoma más pequeño sea un "nle-ea-
plásmido" adquirido por el ancestro de Vibrio en algírn período del
pasado evolutivo de la bacteria. Deínocot:clts rucliodurans R1. cu-vo
genoma resulta de particular interés pues contiene rnuchos gene¡i que
ayuclan a esta bacteria a resistir los efectos nociyos de la radiación. estár
construido de manera simil¿ir', con genes esenciales distribuidos entre
dos cromosomas cilculares y dos plásmidos. De todos moclos, los geno-
mas c1e l/ibrio y l)eínococr¿rs son bastante simples en comparación con
Borrelio bttrgclorferi 851, cuyo clomosoma lineal de 91 1 kb que contie-
ne 853 genes se acomp:iña por 17 o 1B plásrlidos lineales y circulares,
que contribuyen juntos a otl'as 533 kb y, pol lo menos, 430 gcncs. Si
bien se desconocen las funciones de estos gene.§, l,arios de los que hiin
sido identificados no serían considerados, en general, prescinclibles¡
por ejemplo, genes de ploteír-ras cle mer¡brana y bicsíntesis cle purinas.
La in-rplicación es que po1' 1o menos algunos de los plásnrido-.; de
Borreliu son coíIlponentes esenciales c1el genr:ma, 1o que plantea la
posibiliclad de que ciertos plocariontes tcllgan gcnomas rrruy multipar-
titos, que comprenden diversas moléculas cie DNA incleper-rdien¡es. más
afines a 1o que se observa en el nircleo euc¿ilionte qr-re al ordenamicnto
plocarionte "típico". Esta interpretación dcl genoma de Borreli« toda-
vía e s control,eLtida y se con,plica por el hecho cie que Ia b,acteria reia-
cionarla Treponemtt pullidum, cuyo genoma es un¿i soia molécLri¡ d{j
Dt\'lA r,ircular de 1.i58 kb con 1.041 genes, no e()r.rtiene uinguno de los
-qenes
presentcs en los plirsnridos de Borreliu.

la -! ,-"-*-"*X+*".,*&i a.'^§,:"**^* ¡* ;.'*

L.$*"'- "
"^i**e**
La loc¿rlización cle genes por ir-rspección cle secuencias es mucho más fáci1
en los plocariontes que en los eucariontes (sección 5. t . 1 ); en Ia r¡avoría de
los genonras plocadontes que han siclo secuenciaclos, se cLlenta con estinra-
ciones razonablemellte exactas de la cantidad c1e genes ;r iistas b¿istante
conrpletas de sus lunciones. Los resultados cic estos estudios han siclo sor-,
prenclentes v han obligaclo a 1os microbiólogos a leconsiclelar eI sig¡rifica"
clo de "especie" cuando se aplica a los plocariontes. Est¿ls cuestiones
evoir-rtivas se eranriran en 1¿l sección B.2.f. Plin-rero es necesalio estuciiar
cle qué rlanera sc olganizan los genes en ur] genonrii plocat'iontc.
 Caractensticas genéticas de los genomas procariontes 235

Origen de replicación Figura 8.6 Cenoma de Escherichio

I coli Kl2. Se muestra el mapa con el
-- lliBi :l Sñ81/icr,*. origen de replicación (sección 15.2.1)
..aÉ\uf .
,6e\-
, -,¡sllsw.
,qll
ubicado en la parte superior. Los
genes del lado externo del círculo son
,r.§s : transcritos en sentido horario y los del
-.{\}.
r\v -'--" lado interno, en sentido antihorario.
^1&- Imagen cortesía del Dr. F. R. Blattner.
,&- i-:,
!'M#/-
?

{dry
,§
*\-:. -
.', *k§§i
ei;;l*s;'
,stdt:]r
*q'
§.-

*"X"? ¿t*§et* §* {"}rgffisiidffie-. ir:r t*§i#s #fr &§§t

f*I", i1# IlfLis:¡ flr:r:et*J
I

Ya est¿rmos familiarizadcls con el concepto cle que los genomas bacteria-

nos rnllestran organizaciones genéticas compactas con muy poco espa-
'I
cio entle los genes, pues ésta fue una parte importante de nuestro debate
sobre los puntos f¡eltes y débiles del barrido de los m¿trcos de lectura
abiertos (ORF) cc¡mo medio de identificar gerres en la sec¡:encia de un
genoma (véase figura 5.3). Pala volver a destacar este punto, en ia figu-
ra 8.6 se ilustra el mapa génico circular, completo, del genoma de E. coli
K12. En el genoma de E. coli,lz¿¿r,DNA no cociificante, pero éste repre-
senta sólo el 1 19rc, del totai y está distribuido por el genoma en peque-
ños segmentos, que no aparecen cuando se dibuja el mapa en esta
escala. En tal aspecto, E. coli es típica de toclos los procariontes cuyo
genom¿l ha sido secuenciado hasta ahora: lcs genomas procariontes tie-
nen xluy poco espacio clesperdiciado. Algunas teorías postulan que esta
organización compacta es beneficios¿l pal'a ios procariontes, pues les
permite, por ejemplo, replicar su genolna con relativa rapidez, si bien
estas ideas nunca han sido avaladas por evideircia experimental sólida.

*r;:,*lri:;¡¡l* r-{* lts :;*;:,:; i:ti *i i;i:t:,.:.:tr;: ,:j:: f. l*ii

Obs*rvernos irrás de cerca el genoma de E. colí. La figura 8.7 muestra un
seglllento de 50 kb típico. Cuando se conlpara este seginento con una
parte car¿lcterística del genorna humano (véase figura 7.12), es evidente,
de inr-necliato. que en el segprento de E. coti hay mál genes y mucho menos
espacio entt'e ellos, con 85,99á del segmento ocupildo por 45 genes.
 Capítulo B Cenomas prccar-iontes y de orgánulos eucercnie^s

l§186 ls;
*': I tlrc dnoK car§ frxA

..,*dÍ1. @*@ ry ¿4 ..?ffi %m' ffi'* * "Y É**

]
.tr -ü
I
--- -

ir¡ r rlr r I ¡ I r r r i i r j r r ir l

c1ü201040 50 kb

.T;,-fl. .-*+ Algunos genes casi no tienen espacio entre sí; por ejemplo, thrA y thrl3
Repetición en
están separaclos por un solo nucleótido, y thrL- comienza en el nucleóti-
Cen todo el genoma
genes son un ejemplo de operón, un sn'upo de genes involucrados en una
ú¡*t§rdh&¿ery**
sola vía bioquímica (en e-.te caso, síntesis del aminoácido tr:eonina) y
que se expresan en conjunto. Los genes procadontes suelen sel más cor-
tos que los genes eucaríol-¡tes tespectivos y la L:ngitr"rd promedio de un
Figura 8.7 Segmento de 50 kb del gen bacteriano es de alredeclor de dos tercios respecto de ia de un gen
genoma de Escherichia coli. eucarionte. aun despr,rés cle hal:er eliminado los intrones de este último.
Los genes bacterianos parecen ser algo más iargos qr-re 1os de las arqlleo-
bacterias.

De la figura 8.7 es posible deducir otras dos caracter'ísticas de los gcao-

lnas procariontes. Primero. no ha.t, intr<¡nes en 1os genes de este segmen-
to dcl genoma cle E. coií. De hecho, E. coli no tiene ningún gen
cliscontinuo y se sr:e1e considerar que los genes cliscontinuos están casi
auseÍrtes en ii¡s plocariontes, con escasas excepciones que colTeslroir-
c1en, sobre todo, a las alqueobacterias. La segur:rda característica es que
las secuencias repetitivas son mu¡¡ infrecuentes. La mayoría de los geno-
mas procariontes no presentan nada equivalente a las familias de repe-
ticiones en toclo el genoma con alto número de copias observadas en los
genomíis eucaliontes. En cambio, tienen ciertas secuenci¿rs que podrían
estar repetidas en ot1'a pal'te del genoma; por ejernpio, las secuencias de
insercién ISI e IS186, que se pueden observar en el segmento de 50 kb
mostlaclo en la f igr-u'a 8.7. Hay ejemplos cL: elementos il'ansponibles,
secuencias con capaciciad de movel'se pol el genoma,v, en e1 caso de los
elementos de inserción. transferirse r1e un organisrno a otro, incluso a
veces. entre clos especies diferentes (sección 9.2.2). La-* posiciones dc
los elementos IS1 e IS186 mr¡stladas en la figur::r 8.7 hacen referencia
sólr: al aislailiento particular de E. colí del que se obtuvo esta secuen-
cia: si se exarnina un aislamiento diferente, las secuencias lS bien poclr:í'
an estal en clistintas posiciones o podrían e*§tar ausentes por contpleto
clel genoma. La mayoría de 1os otros genomas procariontes tier.ren nlu\
pocas secuencias repeticlas -casi no hay ninguna en el genoma dc 1,64
Mb cle Cont¡sylobaL:ter jejut'ti NCTCI 1 168* pero l-ra¡r excepciones, nola-
blemente ia bacteria de la meningitis l/eisserío meningiticlis 22491. qut
tienc rnás de 3.700 copias cie 15 tipos clil'er:entes cie secuencia repeticla,
que forman, en conjunto, casi el l1% clel genoma de 2,18 NIb.

i{iii f .. ^'{-; -:^l-

:.a}5 lrjii:í,:{3i"":) -". .'* -'l-i;fiii}tl{:,i ;:t.:;*tit":,,,t!*,;i
Una característica típica de los genomas procariontes representados por: ü.
c'oli es la plesencia de operones. Antes cie que se llegara a dilucirlar las',
secuencias de los genomas, se creía collocei'mr-ry bien los operones; ahou¡,
no se está t¿rn seguro de ello. -.,
,: ,r.l¡,i- ':,:i
gxF

,$,: l'l:i.,.,.'Fqe
Un operón es un Slarpo i1e genes aclyacentes entre sí en el genorrta. quizi
con sólo uno o dos nucleótidos entre e1 exffemi¡ de un gen y el coniene*
del siguiente. Todos los genes del oper:ón se expl'esan colno Llna sola urrl'
clacl. Este tipo de orclenaririento es cómún en los genomas procaric;ntes' Utl
ejer:rplo típico de E. colí es el operón de lactosa, e1 primero en scr desctl'
 Características genéticas de los genomas procariontes

rkb Figura 8.8 Dos operones de

§l úiir*r de lactos¿ l__,.,i
Escherichia coli. (A) Operón de l¿c-
lacZ lacY lacA tosa. Los lre§ genes se denominan
locZ, locY y lacA,los dos primeros
s€p¿rados por 52 pb, y los dos
segundos, por 64 pb. Los tres genes
se expresan juntos: /scX codifica la
iaclosa permeasa que transporta lac-
tos¿ hacia el interior de la céiula, y
lccZ y lacA codifican enzimas que
degradan la lactosa en sus compo-
La l¿*i-:rr,: il'irllle*1¡ transpoúa laclosa '
b-grl;rlclid*:; + .: r:r"::r r,' .,: degradan nentes de azúcar: galacfos¿ y glucosa.
h¿cia el interior de la célula la lactosa en galactosa + glucosa (B) Operón de triptófano, que contie-
G1:(){ G]:()-i G{¿OFi G.tz*l ne cinco genes que codifican enzimas
¡ l-O
I

*l &tstj
i^ &
involucradas en la ví¿ bioquimica de
Cr-r
\. \'.tu r,i' '
múitiples pasos que convierte ácido
l, F-O \.jt,-', 7lr
\c-i
F\-JH
¡l "§*t\- \/.¡ f(&
H
a)
\---y'H
+
GT\
corismico en el aminoécido tnptófano.
:ll lt Los genes del operón de triptófano
H*JHSI H C{-I H están más cerca que los del operón
Lactosa Calactosa Glucosa de lactosa: trpE y trpD se superponen
por 1 pb, al igual que trpB y trpA; trpD
y frpC están separados por 4 pb, y trpC
y trpB, por 12 pb. Véanse más detalles
{Bi Operún de triptófano
sobre la reguiación de estos operones
.
tkb en las secciones I L3.1 y 14.i.1.
i.. ... )

trpE trpD trpC trp9 trpA

\* l"/¿
Ácidocorísmico ** *"'.1 ry @' ..."..,...,.....

bierto, que contiene tres genes que intervienen en Ia conversión del disacá-
rido lactosa en unidades cle monosacáridos: giucosa y galactosa (figura
8.BA). Los monosacáridos son sustratos para la vía de la gh,rcólisis genera-
dora cie energía, de modo que la función de los genes del operón de lacto-
sá e¡f conyertir lactr:sa en uÍ]a fonla que pueda ser utilizada por E. colí
como fuente de energía. Como la lactosa no es un componente común del
nredio naturai de E. coli.la mayor parte del tiempo el operón de lactosa no
se expresa y 1a bacteria no fabrica las enzimas para utilizarla. Cuando se
dispr:r:e de lactosa, el operón se activa; se expresan juntos los tres genes, 1o
que deternina la síntesis coordinada de ias enzimas para la utilización de
la lactosa. Este ejemplo clásico de regulación génica en las bacterias se estu-
dia en detalle en la sección 1 1 .3.1.

En conjirnto, hay casi 600 oper:ones del genoma de E. coli l{-12, cada uno de
los cuales contiene dos o más genes y hay una cantidad similar en BctcilLus
stbtilis. Er-r la mayoúa de ios casos, los genes de un oper'ón guardan relación
funcional y codifican divelsas proteínas que participan en una sola actiüdad Figura 8.9 Operón típico del geno-
bioquímica, como la utilización de un azúcar como fuente de energía o la sín- ma de Aquífex aeolicus. Los genes
tesis de un aminoácido. Un ejen-rplo de esto último es el operón de triptófa- codifican las siguientes proteínas:
no de I. coli (figura B.8B). Los genetistas especializados en microbiología se gofQ subunidad C de glutamil-tRNA
sienten atraídos por la simplicidad de este sistema mediante el cual una bac- aminotransferasa, que participa en la
teria puecle controlar sus diversas actividades bioquínricas leg:lanclo la síntesis proteica; recA, proteÍna de
recombinación RecA; pilU, proteína de
expresión cie grupos cle genes relacionados agr-Lrpados en operones. Ésta movilidad torsional; cm& citidilatocina-
puerle ser una interpretación con'ecta de la función de los opetones de E. coli, sa, requerida para la síntesis de nucie-
ótidos de citidina; pgsA,
fosfotidilglicerofosfato sintasa, una
enzima que participa en l¿ biosíntesis
de lípidos; y recJ, endonucleasa espe-
gatC recA pilu cmk pgsA recJ cífica de una sola cadena Red, que
¡.@¡ @@@@@'@w,M.-..
,.
es otra proteína de recombinación.
 Capítulo B.Cenomas procarionies y de orgánuics eucariontes

Bacillus subtiÍis y muchos otros procariontes, pero el cuadro no es taü p¿

simple, por lo menos en algunas especies. Tanto la arqueobacteria LIL
Methafiococcus janruasclríi como la bacteria Aqwifex seolicus tienen tic
operones, pero los genes de un operón individual rara vez presentan algu.
na relación bioquímica. Por ejemplo, uno de los operones del genoma dq t,
L1'
A. aeolicus contiene seis genes ligados, que codifican dos proteínas involi¡-
cradas en la recombinación de DNA, una enzima que participa en la síntesis
j¿u
,r1 cü
proteica, una proteÍna requerida para la rnotilidad, una enzima que intervie-. :rt,r,u .. -.i. filll
ne en la sÍntesis de nucleótidos y una enzima para la sÍntesis de lípidos {figu- fill
ra 8.9). Esto es típico de la estructura de los operones de los genomas de d. .,, tei
aeolicus y 1.t4. jannaschii. En otras palabras, el concepto de que la expresiól
de un operón determina la sintesis coordinada de enzirnas requeridas para ,,,.¡ :'1'.1. Il1i
').:: RL:

'.t,,: ' PÜ
Por lo tanto, la determinación de los genomas han alterado nuestros cono: .,i.rr r m;
cimientos sobre los operone§. Sin duda, es dernasiado prematuro abando- r'i §U.
nar el concepto de que los operones tienen una participación fundamental ¡{ "-'
uu
en la regulación bioquímica de muchas bacterias, pero debemos explicar .ii.iili..,.l
, ,,, §el
las características inesperadas de los operones d,e A. ueolicus y M. janruas,
,1,,,'1t .'. nU
c&ii. Se ha señalado que tanto uno como otro son autótrofos, lo que sigl -. ,,.:. ., §rr
.,,11L1.L1L,

nifica que, a
diferencia de muchos procariontes, pueden sintetizátl 'r: t$l
compuestos orgánicos a partir de dióxido de carbono, pero nc queda claro q*'
cómo se podría utilizar esta similitud entre las especies para explicar la§ r., '
, "r Ilull
estructuras de sus operone§. ';:::,

' .,, t,, ,.

C*l

;1 "1 :f",1-.......*- :r Iist

''
,.¡ ' :' fI*
,tt eq''
',1't:,,.,:". mll
..,,: . t*§

Cuadro 8,3 Tamaño de los genomas y número de genes de diversos procariontes

Especie Tamaño delgenoma (Mb) Número

Bacterias
Mycoplosmo genitolium o,58 500

Streptococcu s pn eu m o n io e
2,16 2.300
Vibrio choleroe ElTor N l696l 4,O3 4.000
Myco bocte ri u m tu be rcu I osrs H37 Rv
4,41 4.000
Escherichio coli K]l2 4,64 4.400
Yersinio pesfrs CO92
4,65 4.1 00

Pseu d omo nos oeru g i noso ?AO1 6,26 5.700

Arqueobacterias
M eth a n ococcus ja n nosch i i 1,66 1.750
Archoeglobus fulgidus 2,18 2.500

Para la especie bacterias, se menciona la designación de la cepa (p. ej., "K12") si es especificada por el grupo que secuenció el genoma .a::' - ,, a'.'.': . ***{}
muchas especies bacterianas, distintas cepas presentan diferencias en el tamaño del genoma y el contenido de genes (sección 8.2.3).
 Características genéticas de los genomas procariontes

p.1i,.' i',,1riyrJti:obium japonictLm, y unos pocos genomas no secuencia-

áor ..,,', muchísimo más grandes Bscillus megateritLm, por ejemplo,
tienc un genoma enol'me de 30 Mb.

L.a rrayoría de los genomas están organizados de manera similar a E.

¿roll, 1* que significa que su tamaño es proporcional al número de genes,
con un promedio de alrededor de 950 genes por 1 NIb de DNA. Por 1o
tant¡. la cantidacl de genes varía en un amplio rango y estas cifras refle-
jan .'1 carácter de Ios nichos ecológicos dentro de los que viven diferen-
ies .-speci.'s de procariontes. I-os genomas más grandes tienden a
Deltcnecer a especies de vida libre que se encuentran en el suelo, el
meciio que se considera que aporta el espectro más amplio de condicio-
nes lisicas y biológicas, a las que los genomas de estas especies deben
poder responder. En el otro extremo de. Ia escala, muchos de los geno-
mas más pequeñr:s peltenesen a especies que son parásiios estrictos,
conto Mycoplasrua genitalium, que tiene sólo 470 genes en un genoma
de 0,58 Mb. La limitada capacidad de codificación de estos pequeños
genomas implica que estas especies no pueden sintetizar muchos
nutrientes y, por lo tanto, deben obtenerlos de sus huéspedes. En el cua-
dro 8.4, que compara el catálogo de genes de M. genitalium con el de É.
coll, se ilusra este hecho. Por ejemplo, se observa que E. coli tiene 131
genes para la biosíntesis de aminoácidos, mientras que &1. genitaliunt
tiene sólo uno que E. coli tiene 103 genes para síntesis de'cofactores en
comparación con cinco de lvl/ genitalittm.

Estas comparaciones han llevado a especular acerca de la cantidad mínin-ia

de genes requerida para especificar una célula de vida libre. Al principio,
consideraciones teóricas instaron a sugerir que 256 genes era el número
mínimo necesario, pero experimentos que han mutado cantidades crecien-
tes de genes de Nlycoplasrza indican que se necesitan 265-35A. Ha habido

Cuadro 8.4 Catálogos parciales de genes de Escherichio coli K12 y Mycoplasmo genitolíum

ii¡L,,ttiil,,i§i¡:;.. ...a¡;¡¡X;::r,,,.':,r?:1,,1?!§?ll$;:,{..* Número de genes de

t.:.:;.,;.*i::!:t,,,:;llffi¡:::,:,
§g8qiá*§¡:.ir *t.i\§'rllt. Kr2 w,.
Total de genes que codifican proteínas 4.288 470
Biosíntesis de aminoácidos ¡31 I
'r03
Bioslntesis de cofactores 5
Biosíntesis de nucleótidos 58 t9
237 17
Proteinas de la envoltura celular
Metabolismo energético 243 it
Metabolismo intermedio r88 6
Metabolismo lipídico 48 6
Replicación, recombinación y reparación del DNA I t5 32
Plegamiento de proteínas 9 7
Proteínas reguladoras 178 7
Transcrioción Eq t2
Traducción 182 t0t
Captación de moléculas del medio 427 34

Los números presentados se refieren só1o a aquellos Benes a los que se les pudo asignar funciones cuando se secuenciaron los genomas
Desde entonces, las asrgnaciones a genes adicionales no han modificado el cuadro general.
Capítulo 8 Cencrnas procaricnles y de orgánulos eucarionies

sirnilar interés en buscar genes "distintivü§": los que diferencian una especie
de otra. De los 470 genes del genoma de M. genitalium, s5O también estq,
presentes en 1a bacteria distantemente relacionada Bacillus subtilis,lo quc
sugiere que ias característisas bioquÍmicas y estñlcturales que diferencia:*
ua Mycoplasrnrs deur. Bacillus están codificadas por alrededor de 120 gene6
que son privativos del primero. Lamentablemente, las identidades de estc6
supuestos genes distintivos no aportan ningún indicio evidente acerca de

..:

W-2,-§ &sn*rmms pr{§ssr§ssst*§ y §*r§ü*pt* de esp*{i* :

Los proyectos de determinación de los genomas han trastacado nuestra

concepción de 1o que constituye una "especie" en elmundo procarionte. En
microbiología, esto siempre representó un problerna, porque las definicio-
nes biológicas convencionales de especie han sido difíciles de aplicar a los
microorganismos. Los primeros taxonomistas, como Linneo, describían las'
especies en términos morfológicos, y todos los miembros de una especie
presentaban características estructurales iguales o muy similares. Est*
forma de clasificación se mantuvo hasta principios del siglo xx y, en la
década de 1880, fue aplicada por primera vez a los microorganismos por
Robert Koch y otros investigadores, que emplearon pruebas de tinción ¡
bioquímicas para diferenciar las especies bacterianas. §in embargo, se reco-
nocía que este tipo de clasifieación era imprecisa, ya que muchas de las
especies resultantes estaban integradas por diversos tipos con propiedader
bastante diferentes. Un ejemplo es §. co# que, ai igual que muchas espe',
cies bacterianas, comprende cepas con caractedsticas patógenas distintivas
que varían de inocuas a letales. Durante el sigio xx, 1os biólogos redeiinie,.
ron el concepto de especie en términos evolutivos y, en la actualidad, con-
sideramos que una especie es un grupo de organismos que pueden ser
cruzados entre sí. De todos modos, esto es más problemático con lo$
microorganismos, pues hay diversos métodos que permiten el intercarnbio
de genes entre procariontes que, según sus propiedades bioquímicas y fisiq
lógicas, pertenecen a especies diferentes (véase figura 3.23). Por lo tanto,
la barrera al flujo de genes, que es fundarnental para el concepto de espq;
cie, no es válida en los procariontes.

La secuenciación del genoma ha destacado las dificultades para apliear el

concepto de especie a los procariontes. Se ha esclarecido que difelentes cepas
c1e una sola especie pueden tenelsecuencias genómicas muy distintas e, inclu- §., ,. '
so, pueden tener conjuntos individuales de genes específicos cie cepa. Esto se '!'it.:;r' ',.
observó por primera vezal comparar dos cepas de Helicobctcter pylttri, un:..§,,,, ', '
-
microorganismo que pl'ovoca ú1cera gástrica y otras enf'errnedades digestivas
hulnanas.LasdosCepaSSeaislaronene1ReinoUnidoy1osEstadosUnidos.
y tienen genomas de 1,67 Mb y 1,64 Mb, respectivamente. Ei genoma más ,§ "',,l,'
grande cc¡ntiene 1.552 genes y el más pequeño, 1.495 genes, de los ctsales ;':::t111,:,:',',';':;:.;,;;

1.406 están presentes en ambas cepas. En otras palabras, alrededor del 6-99á ,.:t:',1;.:§:':'t:"'::'':t:

del contenido de genes de cada genoma es privativo de esa cepa. Se detectó

lrrYU1ULI4UCD Urr rOJ yTU-IJIUUC¡UV¡ yALuélrr4a UU V l J t .t t t, r LIU 9ür

0137:H7 contiene genes adicionales que la toman más pató' ",,',,r2::;,;.,,,.,:-"'
Lrn caso cle qr:e
gena. K12 también tiene 234 segmentos de su propio DNA único, y aunque ,':::''
':1:;1i§.1''|:':,t

esfA( "ielr( K" qnn en nrn¡rredin rnás nenrreñaq nr¡e las isl¡q (-) conticn€fl, "q
 Carecterísticas genéticas de los genonras procariontes 2ttt

Ls¿neilcilld aott t¿
;iivr:c b octeri u ¡n tu be r cu I ^osis
Eacitlus sublllis
Synechocyst¡s PCC680i
Dei n a co ccus ra d i od u ran s 5"2
Archa e o g lo bu s fu I g id us >_¿

Aeropyrum pernix 5.2

Thermotogo marítima 6.4
, .r,,. Pyrococcus horikoshii 2.7
ttleth0 n a D a ale r i u m th e r m oa utro h i rum
p
Ha em oohilus influenzoe
'::: lTelicobacter PYlori 26695
.:,,., Aquilex aeolicus
t' Methanacoccusiannaschii
lreponema pallidun
Borrelia bur4dorferi 0.1

frickettsio prowazekii 0.0

Mytoplasma pneumaniae
Mycaplasmt genittt!ium

,,ri,,,. atrn así, 528 genes que están ausentes en O 1 57:H7 . Por k: tanto, la situación Figura 8.10 Repercusión de la trans-
],r., e§ quc E. ol57'H7 y E. «tli K12 tienen, cada una, urla selie de genes
cr¡li ferencia lateral de genes en el con-
espiecílicos
,,.:.'.,,,,'.':',,,;. de Cepa, que l:epl esentan el 26c¡ y el 12a/,t cle los catálogos de tenido de los genomas procariontes.
,,,, genes, respectivalnente. La variaciÓn es mucho más sustancial de 1a que El gráfico rruestra el DNA que es priva-
pol el concepto cle especie apllcado a.olg¿Inismos supedo- tivo de una especie particular en azul y
f,uecle ser tolerada el DNA que ha sidc adquirido por
i"r y es clifícil recanciliarla con cual{:luier clelinición de especie elaborada tr¿rsferenci¿ lateral de gene;, en rojo.
hasta iihora para mlcroorg¿ll1istnos. El número al final de cada barra incirca
el porcentaje del genoma que deriva
Las riificultades se agUdizan aún más cuando se examinal-l otros genomiis de de una transferencla lateral de genes.
bacteri;ts y arqueobactetias. Dada 1a facilidad con que los gencs pueden lluir Obséruese que este análisis omite las
entrc di-ctintas espeoies de pr:ocal'iontes. se anticipaba que, en ocasiones, se regiones intergénicas.
hallat'í¿rn los mismos genes en dil'erentes especies, pero el g:ado de transfe-
rencia lateral de genes i:evelado por 1a secuenciaciÓn ha sorprendido a
todos. L¿r mayoría de 1os genomas contienen algunos cientos cle kilobases de
DIrfA aclquiridos directamente cle una especie dilerente -l', en ciertos c¿lsos.
la cifr'¿r es n"rás alt¿r: así se h¿r obtenido el 12,8fó del genoma de E. ¿uli K12,
cori:cspondiente ¿1 0,59 VIb (fiplura S.10). Una segunda soryresa es que ira
habiciu tl'ansferencia entl'e especies nruy di1'erentes, aun entre bacterias y
"l'lrcrmotogtt mttritirnrt
arqueobacterias. Fot'ejemp1o, la bacteria telmofílica
tiene 1.877 genes, de los cua1es.l5t palecen haber sido obteniclos de
arqueobacteria.q. L¿i transferencia en ia r:tra clirección, de bacterias a arqueo-
baclerias, es igUal de prevalente. Ei cu¿rclro clue está surgiendo indica que li:s
plouu'ionte,< que viven en nichos ecológicos similarcs intercambian genes
ent¡:e sí para ¿luulentiir su aptitud indiviclual dc supervil,encia en su ¿inlbien-
te parliculrtr. Es pr:obsble clue t:ruciros de los getres c1e Thennotogtt que se
iran obteniclo de at'queob¿rctel'.i¿rs ha.van a¡'udaclo a esta bacte¡:ia a adquirir
su c,apacidad para tolerai' altas temperatul'as.

La secuenciación clel genorna tambiÉn ha leveladi¡ que muchas especies

baclelianas siguen sin identiJicar. Los microbiólogos lo habí¿rn sospecirado
durarrte nluchos años v han advertido q:-re las concliciones cle cultivo artifi-
.

ciales empleaclas pai'a aislal bacterias d" .r, hábitat:; naturales no se acle-
cui"ln a todas las especies, que muchas no crecel'íln en esas cOndiciones V
que. así, continuar'álr sin set'detectadas. Los profesiotrales del nuevo campo
de la rnetagenómica están encaranclo este problema obteniendr: secuencias
cle IINJA de todos los genomas de un detertrinado hábitat, pol ejernplo' de
agu¿l cle mar o de un suelo áciclo. Un estudio obtuvo una megabase de
secuencia de DNA bacteriano cle 1.500 litros de ngua superficial del Nlar
. cle los Salgazos. La secuencia incluía se§]lnentos cie los genolrlas cle más de
1.c!00 especies. de las cuales 148 eran totalmente nuevas. La metagenómi-
,.

secuencias de genomas de o::ganismos que nadie ha visto nunca.

Capítulo I Cenomas prccarrcntes y de orgánulos euc¡rir:nits

ffi,5 ffi*ffi.]rn&s *; * mrgesmut*s *¡JC#r;r¡sli*s el

Ahora, regresamos al mundo eucarionte para examinar los genomas pre- Á
sentes en las mitocondrias y los cloroplastos. La posibilidad de que tt
l"
algunos genes puedan estar ubicados fuera dei núcleo -genes extra"
cromosór¡ricos, como se los denominó ai principio- Iue planteada por" t-.

primera vez en la década de i950 para explicar los patrones dehercr:- lc

cra atiprcos úe trer:tos gene§ en e\ hongo Nertrosporo cf uss0, \a lelirdura ú
Saccharomyces cerevisíae y el alga fotosintética Chlamyclomottos reitr d
hsrdtii. Casi al mismo tiempo, ia microscopia electrónica ¡r los estudios tl'
bioquímicos aportaron indicios de que podría haber moléculas de DNA
en mitocondrias y cloroplastos. Por último, a principios de la década de H
§
1960, se reunieron estas diversas líneas de evidencia y se aceptó la exis-
tencia de genomas de miiocondrias y cloloplastos, independientes y dis- L
tintos del genoma nuclear eucarionte. UI
p
ci
. ;. * "J,'-,. j'f:u: {, - ¡ 35 ¡:,: fl. i: *.' i' - '- l¡,*
J: -"1 I
El descubrimiento de los genomas de orgánulos dio origen a muchas espe- p
culaciones acerca de sus odgenes. La mayoría de los biólogos aceptan h
ahora que la teoría endssimbionte es con'ecta, por lo menos en télminos ül
generales, aunque se consideraba bastante poco ortodoxa cuando se la pro- C'

puso por primera vez a fines de ia década de 1960. La teoría endosimbion- n

te se basa en la observación de que los procesos de expresión de genes que li
D
se producen en los orgánulos son similares, en muchos aspectos, a prüce-
sos equivalentes en las bacterias. Además. cuando se compararon ias u
secuencias nucleotídicas, se advirtió que los genes de orgánulos eran más n
similares a genes equivalentes de bacterias que a genes nucleares eucarion- n
tes. Por 1o tanto, la teoria endosimbionte sostiene que las rnitocondrias y
{:
los cloroplastos son vestigios de bacterias de üda libre que fomraron una
t_
asociación simbiótica con el precursor de la célula eucarionte, en los pri-
mel'os estadios de la evolución.

n
La teoría endosimbionte ha sido avalada por ei descubrimiento de orgat:is- t1

mos que parecen exhibir estadios de endosir¡biosis menos avanzados que ll

los observados en 1as mitocondrias y los clor:oplastos. Por ejemplo, el pr:o-
tozoo Cyunophora parctdoxa, cuyas estructuras fotosintéticas, denotliua-
das cianelas, son dil'erentes de los ck:roplastos y, en cambio, se asetrejan a
una cianobacteria ingerida, muestra un estadio precoz de endosirttbiosis.
De modo similar, las Rickettsia, que viven dentlo de céiulas eucarionte§,
podrían ser versiones modernas de las bacterias que dieron odgen a las
mitocondrias. También se ha sugerido que los hidrogenosorras de las rrico-
nlonas (micr:obios unicelulares, muchos de los cuales son parásitos) t'epre-
sentan un tipo avanzado de endosimbiosis mitocondrial, pues algtnos cle tt
ellos tienen un genoma, pero ia mayotia no. p

Si las mitocondrias y k:s cloroplastos fueron alguna vez bacterias cle vida f:

libre, debe haber habido una tlansferencia de genes del orgánulo al núcleo
l.it
desde que se inició la endosimbiosis. No sabemos cómo ocurrió ni tarnpo-
co si hubo una transferencia masiva de muchos genes de una vez o un tras- e
paso gladual de un sitio al otro. Pet'o sabemos que todavía tiene lugar la {j

translerencia de DNA del orgánulo al núc,leo y, sin duda, entre orgánulos. q

Est<¡ se descubrió a principios de la década de 1980, cuando se obtuviel"on L
f;
las primeras sec,r.ncias parciales de genonras de cloroplastos. Se obsei-r'ó
que, en algunas plantas, el genoma de los cloroplastos contiene segtrento§ i.
de DNA, a menudo genes enteros, que son copias de partes del genoma
(
mitocondrial. La implicación es que el así llamado DNA promiscuo ha sido lli
t:
transferido de un orgánulo a titl'o. En la actualidad, saber¡os que éste r:o es
 Genomas de orgénulos eucariontes

el ú;:ico lipo c1e transferencia posible. El genoma mitocondrial de

;4,rtbitlttpsis contiene cliversos segmentos de DNA nuclear', así como 16
fl.agrnentos del genoma del cloroplasto. incluidos seis gene.s cle IRNA que
hai conselvado su actividad después de la transferencia a la mitocondria.
El gcrroma nuclear de esta planta comprende varios segmento-e cortos de
lüs*gr.nomas de los cloroplastos y lzrs mitocondrias. así como un fragmento
¿e il* kb de DNA mitocondrial ubicado clentro de 1a regién centromérica
del cromosoma 2. Tarnbién se ha demostrado la transferencia de DNA
mitocr:nclrial a genomas nucleales de vertebrados.

&.3.3 {mrm*t*r{s**cxs §ísixxs §*s §*§3'*§}1*§ C* *rg$ma*}**

q$e

La n"ra-toría de los eucariontes ticnen genomas ilit<¡condriales y todos los

eucariontes fbtosintéticos tienen genomas de cloroplastos. A1 principio, se
pens¿lba que casi todos los gellomas de orgánr,rlos er¿ln mcléculas de DNA
.ireulares. La observación con el microscopia electrÓnico había reveiado
DNA lineal y circular en algunos olgánulos, pero se presuponía que las
molócu1as lineales eran merrJs fi'agf"nentos de genomas circulales que se
habían roto durante la pleparación pala Ia microscopio. Si bien todavía
crecmos que la mayoría de los genomas de mitocondrias y cloroplastos son
circuiares,Ieconoceülos clue ha¡, gran vat'iabilidad entle los diferentes ol'ga-
nistros. En nruchos eucariontes coexisten genomas circuiares con versiones
lineales en los orgánulos y, en el caso de los cloroplastos, con círculos más
pequeños que contienen subcomponentes del genoma en su conjunto. Este
útti,r'ro patrón alc¿rnza su máxima expresiÓn en las algas marin¿rs denomi-
nadas dinoflageladr:s, cuyos genomas de cloroplastos están divididos en
nunler6s6s cílcUlos pcclueños que contienen sólo un gen c¿rda uno.
Asimismo, adyertiilos ahol¿t que los genonlas mitoct.¡ndriales de alguno-s
euc*r'iontes microbi¿¡nos (p. ej., Pt¿rcmrccitLrn, Cltlttnrytltt?rtotlüs y vat'ias
levadul'as) siempre son lineales.
1 6"569 pb
número de copiiis cle los genomas cle orgá-
I.,fo sc conoce demasiado bie¡-r el
nulos. Cada mitocondi'ia humana contiene ¿riredeclor de l0 moléculas idén-
1ig¿"t, lo que signilica que ha.v alrededor de 8.000 por cálula. pero es
probable que }a canticlad total sea Inenol'en S. ¿'eizr¡isl¿¡e (menos de 6.500).
alrnque puecie haber niás cle 100 gr:nontils pol mitocondri¿i. Los microot'-
ganisrni:s fotcsintéticos como C|útwzyclo*r¿-¡r'l¿¿s tienen alrededor de 1.000
genonl¿ls de cloroplastos por célula, más o lrlenos un quinto de 1os que con-
tiene una célula vegetal supet'iot'. Un misterio qlle se relrlonta ¿r la década
de 1a:0 y nunca lesuelto de nl¿tnera satisfactoria e.c que, cuando se estu-
dian lus genes de orgánulos en ct:uzatnientos genéticos, los resultados
sugieren que hay sólo una copia dcl genü1la de l¿rs mitoconc{rias o los clo- .¡xM, Gen del complejo respiratorio

roplastos por célula. Es evidentc que e.§to no es asÍ, perr: indica que nues- ¿*,w Cen de RNA ribosómico
tro conocimicnto sobre la transmisiÓn cle genüln¿ls de orgánulos de los 6en de RNA de transferencia
prr:g*nitores a l¿i descendenci¿¡ clista de sel pelf'ecto.

E1 t:rm¿rño de 1c¡s genomas mitocondriales (cuaclt'r:8.5) es vat'iable yno

está t'el¿icionaclo con la complejid¿rd dc los olganistnos. La mayoría cle Figura 8.1I Cenoma mitocondrial
los animales multicelulat'es tienen genom¿ls mitoconclriales pequcños. humano. El genoma mitocondrial
con una or:ganización genética compacto: los genes estáin próritllos con humano es pequeño y comPacto, con
esc¿lsc) e spiicio errtre sí. El genonra nritoconch'ial humano (ligr:ra 8.1 1), escaso espacio desperdiciado, tanto
que tiene 16.569 pb, es característico c1e este tipr:. La ma.voría cle los es así que los genes ATP6 y ATPS se
superponen. Abreviaturas: ATP6, ATP8,
euc¿rf iontes inf'eriores, colro S. c:erev'isitrc (figr-rr:r B.l2) y las plantas
genes de las subunidades 6 y I de
lanerógarnas, tienen genomas rnitc¡conclriales más grancles Y lrlel-]os com- ÁTPasa; COl, COll, COlll, genes de las
pactos, y algunos cle lo-s geni:s contienen intt'cnes. Los genonras cle los subun dodes l, ll y lll de ciiocromo c
cloroplastos varian ilienos c1e tant¿lño (cuacll'c¡ 8.5) y la cstt'uctr"lt'a dr: la oxidasa, Cytb, gen de apocitocromo b;
nrayoría es similal' a la ilustracla en la ligura c3.1 3 para cl gcnoma clel clo- NDI-llD6, genes de las subunidades
roplasto de al'roz. l-6 de NADH hrdrogenasa.
l{¡t Capítulo 8 Cencmas procariontes y de orgánulcs eucariontes

Cuadro 8.5 Tamaño de los genomas de mitocondrias y cloroplastos

Especie Tipo de organismo Tamaño delgenoma (kb)

Cenornas de mitocondrias
Plasmodium folciparum Protozoo (parásho del paludismo) 6
Chlo mydomon o s rei n h o rdti i Alga verde 16
Mus musculus Vertebrado (ratón) t6
Homo sopiens Vertebrado (ser humano) 17
Metridium senile lnvertebrado (anémona de mar) 17
D rosop h i I a melo nogaste r Invertebrado (mosca de la fruta) 19
Chandrus crispus Alga roja 26
Aspergillus nidulons Hongo ascomiceto 33
Recl i n o mon os om eri co no Protozoo 69
Levadura 1t
Soccho romyces ce revi sio e
Suillus grisellus Hongo basidiomiceto 121
.r60
Brossico oleraceo Planta fanerógama (repollo)
Arabidopsis tholiona Planta fanerógama (algarroba) 367
Zea mays Planta fanerógama (maiz) 570
Cucumís melo Planta fanerógama (melén) 2.500

Cenomas de cloroplastos
Pisum sativum Planta fanerógama (guisante) 120
Marchantio polymorpho Hepática 121
Oryzo sativo Planta fanerógama (arroz) 136
Nicotiano tobocum Planta fanerógama (tabaco) 156
Ch I o mydo m o n a s rei n ho rdti i Alga verde 195

' ., ' ."'."','- ,,i"-ln r,. "l: ,,1. \*¿

!s:q ,; :j"::j1i: :q {j, nlf ..:nUl
'.."6" 4)
,

Los genomas de orgánulos son mucho más pequeños que los genomas
nucleares respectivos; por: lo tanto, preveiltos que su contenido de genes
es mucho más limitado, lo que por cierto es así. También en este caso
los genomas mitocondriales plesentan mayor variabilidad y el contenido
de genes v¿uía de cinco, para el parásito del paludisno P. fttlt:ipúruftt, a
92, para el protozoo Reclinornonüs ünlericanu (cuadro 8.6). Todos los
genomas mitocondliales contienen genes cle los rRNA no codificantes y
por 1o menos algunos de los colxponentes proteicos de i¿r cadena lespi-
ratolia, que es la principal característica bioquímica de la mitoconclria.
Los genomas más ricos en genes tambié¡ codifican tRNA, proteít-ras
ribosómicas y proteínas que intervienen en la transcripción, la tr¡duc-
ción y el transporte de c¡tl'as proteín:,is desde el citoplasma circunclante
hacia la mitocondria (cuadro 8.6). La mayoría de los genomas de cloro-
plastos parecen tener el mismo coniunto de alrededor de 200 genes, que
también codillcan rRNA y IIINA, así como ploteínas ribosómicas.v pro"
teínas que participair en 1¿r lotosíntesis (véase figur:a 8.13).

En el cuack'o 8.6 se detallan las características generales de los genornas

de orgánulos. Estos genomas especifican al¡¡unas de las ploteínas halla-

,W Cen del compleio respiraiorio
i&ffi 6en de RNA ribosómico ,,
Cuadro 8.6 Características de los genomas mitocondriales
,,,*O**ro total de genes
Tipos de genes
Cenes que codifican proteínas
Complejo respiratorio
Proteínas ribosómicas
: Proteínas de transporte
RNA polimerasa
Factor de traducción
Cenes de RNA funcionales
Cenes de RNA ribosómico
Cenes de RNA de transferencia
Número de intrones
Tamaño delgenoma (kb)
2l S rRNA
ffiffi¡ Gen de proteína ribosómica ffi lntrón
6en de RNA de transferencia ffi Cen de otros RNA
Plosmodium Chlomydomonos Homo
folciporum reinhardtii
5 12
3 7
3 7
o o
0 0
O o
U o
2 5
2 2
0 z
0 o
:0
o 1
6 i6
Genomas de orgánulos eucariontes
Figura 8.12 Cenoma mitocondrialde
Saccha romyces cerevísioe. Como sus
tamaños son relativamente pequeños,
muchos genomas mitocondriales han
sido secuenciados por completo. En el
genoma mitocondri¿l de levadura, los
genes están más ampliamente espacia-
dos que en el genoma mitocondrial
humano, y algunos de ellos tienen
intrones. Este tipo de organización es
típica de muchos eucariontes inferiores
y plantas. El genoma mitocondrial de
levadura contiene cinco marcos de lec-
tura abiertos adicionales (no represen-
tados en este mapa), que todavía no
han mostrado codificar productos géni-
cos funcionales, y también hay varios
genes localizados dentro de los intro-
nes de los genes discontinuos. La
mayorÍa de los últimos codifican proteí-
nas maturasa, que intervienen en el
corte y empalme de los infones de los
transcritos de estos genes. Abreviaturas:
ATP6, A-IP8, ATP9, genes de las subuni
dades 6, 8 y 9 de ATPasa;COl, COli,
COlll, genes de las subunidades l, lly lll
de citocromo c oxidasa; Cytb, gen de
apocitocromo b;var 1, gen de una pro-
teína asociada con ribosomas. El gen
de RNA 9S especifica el componente
RNA de la enzima ribonucleasa P
(sección 12.I .3).
Socchoramyces Arabidapsk Reclinamanos
sopiens cerevisiae thalicna americona
35 92
37 52
15 I 27 62
'13
7 17 24
'I
7 27
o -1 b
0 0 o 1
ar 0 o I
24 27 25 30
2 2 J 3
22 24 22 26
!
I 0 I
o 8 23 1
11 75 367 69
 Capítulo I Cenomas procariontes y de orgánulr:s eucarionles

Figura Ll3 Cenoma del cloroplasto

de arroz. se muestran los §enes
Só1o
con funciones conocjdas. Algunos de
ios genes contienen intrones, que no
están representados en este mapa.
Estos genes discontinuos compren-
den varios de los de IRNA, lo que
explica por qué los genes de tRNR
son de dtferente longrtud, aunque los
IRNA que especifican son todos de ,f,§,u
tamaño similar.
;::;
eea
§
¡ffi
pe¡D
m
rpoA ffi PsDL
psl0 I
I
psbl
psr( .l

"JIi I
rPlf* I
pst§
fp> ll ' ''I
rp,l,. ¡
tgt',

t,

§
{1
¡,F' J

s"{^ $
t;
3§
6 ,fl
p
ü
Ir
.r11|]!ffi.
trüüffitF Cen de fotosÍnlesis 6en de protelna ribosómica
ffi Cen de RitlA rr
de lransferencia
¡ffi Cen de RNA ribosómico Cen de RNA poiimerasa t.
fl.r

das en el orgánulo, pero no todas. Las otras proteínas son cocliiicadas

por genes nucleal'es, sintetizadas en e1 citoplasma y transpol.tadas hacia .
e1orgánu1o'Silacé1u1acuentaconmecaniinrospá.*t.u'"'.pol'taIprotL..
ínas hacia las mitoconclrias y los cloroplastos, r'
¿pb, qué noion esieciti-
:ad.as por el genoma nuclear todas las proté?nas de los orgánr:los?
Todavía no se encoÍrtró una respuesta conüncente a esta pr.gritr, ,un-
que se ha sugerido que por lo menos algunas de las protLínás coilifica-
das por los genomas cle los orgánuios son s*mamenie hidrátlbas y no
pueden§€rtIanSp0rtadasatr,avésdelasnrembranasquer.oc1c.anelas
mitocondrias y los clor:oplastos; por lo tanto, no pueclen pasar clcl cito-
plasma al interior del orgánulo. La única man*iu la quc l¿r cÉlrrla
puede ilevarlas a} orgánulo es fabricándolas en éste, ",-,
en primer lugar:

Wwxs*m*rx
I os procariontes comprenden dos tipos de organismos: las bacter.ias J'
las arqueobacterias. Ei genoma baiteriano está ubicarlo cie¡:ltro clel
nuc.leoide:la legión de tinción clara de ias células pr.ocariontcs
er.lt, por
lo demás" no tienen rasgos caracrerísticos. El DNÁ está fijaclo a proieí-
nas centrales cle unión de las cuales ir"raclian fuera cle [a célula ¿e +o a
50 bucles superenrollados de DNA. sabemos mucho menos acer.ca de :'
 Resumen 2¡t7

i;i equiYalentes dr- las arqueobactr-rias, pero es probabtre qr-re

'.tll't-tcturas
seaíi i-:,üstante dillrentes, pues éstas tienen prot"'ínas sirnilares a las his-
tonls ric los eucariontes en lugar de las ploteÍnas de1 nucleoide bactet'ia-
no. El genoma cle f. coli es una sola molécula de DNA circular, pero
¡¡l,¿tl1tos procariontes presentan genomas lineales y otros, genomas mul-
ripairi;.os compuestos pol dos o más moiéculas circr:lares o 1inea1es. En
lcs ui:sos más complejos, puede ser dificil distinguir qué moléculas son
parres genuinas del genoma y cuáles son p1ásmidos prescindibles, Los
genüm¿ls pt'ocariontes son muy compactos, con escaso DNA repetitivo.
Nluchos genes están organizados en operones, cuyos miembros se expre-
san juntos y pueden tener una relaciÓn funcional. La cantidad cle genes
está relacionada con el tamañr: dei genoma. Los genomas más grandes
pertdnecen a especies de vida libre halladas en el sueio, un medio que
ofrecc un amplio espectrc de condiciones físicas y biológicas a 1as que
estas especies deben ser capaces de responder. Los genomas más peque-
ños corresponden a especies que soit parásitos estrictos, como
t!.tcrs¡slttsmtt genituliur,?, que tiene sólo 470 genes. Se considera que
entr* 250 y 550 genes coltstituyen e1 conjunto mítimo requerido para
especiiicar una célula de vida libre. Los estudios de genomas procarion-
tes han complicado el concepto de especie para estos organismos, pues
k:s gcnomas de diferentes cepas de la misma especie suelen tener conte-
nidos de genes muy diferentes J/ puede haber transferencia lateral de
genes entl'e distintas especies. La metagenómica. el estudio de toclos 1os
genofi¿rs de un hábitat (como el agua de mar), está revelandr: que una
proporción sustancial de las especies presentes en un determinado hábi-
tat nunca se han identificado. Lr:s genornas de las mitocondrias y los clo-
roplastos de las céiulas eucaliontes tienen caracter'ísticas procariontes
porque descienden de bacterias de vida lible que fbr.rraron una asocia-
ción simbióiica con el precursor de la célula eucarionte. La mayor:ía cie
los genomas de las mitocondrias y los cloroplastos son cit:culares, quizá
mr-rltii:artitos, con uria canticlad de copias de 1.000 a 10.000 pol célula.
Los genomas mitocondriales varían de tamaño de 6 a 2.500 kb y contie-
ner: de 5 a 100 genes, incluidos genes pata IRNA, IRNA y proteínas
mitocondliales; por ejemplo, componentes del complejc, r'espiratorio.
Los genomas de los clorr:plastos son menos variables, la mayorí:r rnide
de 1 00 a 200 kb y tienen un conjunto de alrededor de 200 genes, casi
toclos los cuales codifican RNA funcionales y ploteínas fotosintéticas.
 ;'
§
::"ifá{fh} .#*,1 t-r& ¿:,,% 1,.&.,'% r^§ ffi S f 6,§ ^",, i ffi fl
e\+*Ixi-'át #."*f¿§;
i* & ffi& &'+-i._r kli§,r*i&ffi*"
B * &.{*$tu- Er ü § §".t* & §,po"
Hs
qd
fl- s .*qa §
"eq
#.r§&-#§
4"* ] r,_" t a
§,rqLlgr Jr S¡ds *rl, ,{4
A tr &§q,^
dq
r"i ; :§$*;áffi
-+* ff §1_ 4;1.*d -*:
§
§ * w
4-;d3 *ru 4*T§'ffi * ca-- '''*
s"'q'§*'relhf g
Y .us§

ñf,
Htr;á §L*tH &...fu-Fk § § §§"e v t &6k*.-r

§.'l *e**m*s d* }:s¿t*ri*§*§s: y sir{:r

rq§f4ffqryiq¡-", --"
§.? []ex:*xt*§ sss*ti{*s rx*§it*x

Reseñar las diversas maneras en las que se organizan los genomas de los bacteriófagos.

Disringuir entre las vías de infección litica y lisogénica, y dar detalles sobre los pasos claves de cada una.

Explicar las principales estrategias de replicación utilizad¿s por los virus eucarionies, en particular
los retroeiementos virales.

: Analí¿ar las características de los RNA satélites, los virusoides, los viroides y los priones.

Distinguir entre Íansposición conservadora y replicativa.

Describir en detalle las estructuras de los diferenles tipos de ret roelementos LTR y las relaciones entre ellos.

An¿lizar, con e]emplos, las características claves de los LINE y los SINE.

' Describir el espectro de transposones de DNA hallados en los procariontes.

Lrplicar por qué los transposones de DNA de los eucariontes fueron importantes en nuestro conocimiento
sobre la transposición.

Dar e¡emplos de transposones de DNA en vegetales y Drosophila melonogoster.

Los virus son la última y más simple forma de vida cuyos genomas investi-
garemos. De hecho, son tan simples desde el punto de vista biológico que
cabe preguntar si, en realidad, se los puede considerar organismos vivos. Las
dudas surgen, en parte, porque los virus se construyen a io largo de diferen-
tes líneas a partir de otras fornas de üda -los vims no son células- y, en
parte, por la naturaleza de su oiclo vital. Los vims son parásitos estrictos de
la clase más extrema: sólo se reproducen dentro de una célula huésped, y
para leplicarse y explesar sus genomas deben subvertir por 1o menos parte
de la maquinaria genética del huésped para que cumpla sus propios fines.
Algur:os virus tienen genes que codifican sus propias enzimas DNA polime-
rasa y RNA polimerasa, pero muchos dependen de las enzimas delhuésped
para 1a replicación y la transcripción del genoma. Todos 1os vims utilizan los
 Capítulo 9 Cenom¿s virales y elementi:s genéticos móvtles

Proteína Ácido ribosomas y el aparato de t¡aducción del huésped para la síntesis de pciipép-
\. nucleico
tidos que forman las cubiertas proteicas de su progenie. Esto signilica que
los genes del vir..ls deben ser compatibles con el sistema genético del hués-
a1 ped. Por lo tanto, ios virus son bastante específicos para determinados olgir-
.-. .i ,. .,1 ..r ',. ,.r nisnlos y cada tipo no puede infectar un arnplio espectro de especies"
¡:¡1r.r,
l't En este capítulo tarnbién consideraremos ios elernentos genéticos móvilts,
que rcpresentan una parte sustancial del componente repetitivo de los geno-
Icosaédrica Filamentosa Cabe:a y cola
mas eucariontes y procariontes. Vnculamos estos elementos con los genomas
virales porque, en los últimos años, se ha comprobado que por lo menos
algunas de estas secuencias repetitivas detivan de vin:s y son. en el-ecto, geno-
Figura 9.1 Los tres tipos de
estructura de cápside habitualmente mas virales que han perdido la capacidad de escapar de sus céiulas huésped.
presentados por los bacteriófagos.

¿, e s4*.* * *,!^ !..**É^*iá#

:r " § {"é.*;l $T§l r:}§ Li }: ?.rdr L L B l; ¡ Lt f""#-1
":B
ÜrE8b# k@k'#18@stL%.+'
3I
Si bien hay inmunerables tipos diferentes de virus, los que han recibidr: la
mayor atención de los genétistas son los que infectan bacterias. Éstos se
denominan bacteriófagos y se los ha estudiado con gran detalle desde la
década de 1930, cuando los primeros biólogos moleculares, sobre todo
Max Delbrück, eligieron a 1os fagos como organismos modeios convenien-
tes para estudiar los genes. Seguiremos el camino tomado por Delbnick y
utilizaremos los bacteriófagos como punto inicial para nuestra investiga-
ción de los genomas virales.

r, i t {,u',l tnefi.&
,r.r¡-' l r{iu
L¡ - §"¡pc'l¿>r§&§;ry,¿v¡:ut
l':¡L*"'e¿VaUf,¡42_¿

Lr:s bacteriófagos están fonnados por dos componentes básicos: proteí-

na y ácido nucleico. La proteína forma una cubierta, o cápside, dentro
de la cual está contenido el genoma de ácido nucleico. Hay tres e¡lruc-
turas básicas de cápside (figura 9.1):
* Icosaédrica, en la que subunidades polipeptídicas individuales (protóme-
ros) están ordenadas en una estmctura geométtica tridimensional que
rodea al ácido nucleico. Los ejemplos son el fago MS2, que infecta a
Escheríchía coli, y el fago PM2, que infecta a Pseudomoncts aeru§itosu.
* Fiiamentosa o helicoidal, en la que los protómeros configuran una
l-rélice que genera una estructura en forrna de vara; por ejemplo, el
fago de E. coli denominado Ml3.
,, Cabeza y co1a, una combinación de una cabeza icosaédrica, que cr:ntic-
ne el áciclo nucleico, unida a una cola filamentosa y, quizás, estn:cturas
adicionales que laciiitan el ing¡reso del ácido nucieico en la célula huós-
ped. Ésta es una estructura común presentada, por ejempio, por los
fagos de E. coli T4 y )", y elfago SPO1 de Bacilbts subtilis.

"':':..t.'.' ., : :;..t" ;'

Corresponde emplear el térnino "ácido nucleico" cuando nos refef imos a
genomas de f'agos porque, en algunos casos, estas moléculas están compues-
tas por RNA. Los ürus son una forrna de "vida" que contr-adice la conclusión
de Avery y cols., y la de l-{ershey y Chase de que e} material genético es DNA
(sección 1.1.1). Los fagos y otros vitus también lompen otra regla: sus geno-
m¿ls, sean de DNA o ae Rt ¡4, pueden ser tanto de una sola cadena cr:rno de
doble cadena. Se conoce todo un espectro de estructut'as de genoma diferen- I

tes entre los fagos, como se 1'esunle en el cuadro 9.1 . Lamayoría de los tipos
cle fago tienen*una sola rnolécula cte DNA o de RNA que contiene todo el
 Genomas de bacteriófagos y virus eucariantes !§5

Cu*drn 9"1 Características de algunos bacteriófagos tipicos y sus genomas

¡r**?,,,.:§§ffi:*r:i
Huésped ::&tiii§t$ §w Estructura delgenoma Tamaño del
:ir§h,§.§.. ffi genoma {kb)

Lschencnrc colt Cabeza y cola DNA lineal bicatenario ¿o< 48

E. coli lcosaédrica DNA circular q4 it
monocatenario
Pseudomonas lcosaédrica RNA lineal, segmentado, 2,9; 4;6,4 t3
phoseolicolo bicatenario
E. coil ñlamentosa DNA circular 6,4 t0
monocatenario
M§? L. colt lcosaédrica RNA line¿l 16 3
monocatenario
PM2 Pseudomonos lcosaédrica DNA lineal bicatenario t0 Alrededor de 2l
oeruginoso
.l00+
Bocillus subtilis Cabeza y cola DNA lineal bicatenario 150

12, T4, 16 L. colt LaDeza y cola DNA lineal bicatenario 166 I 50+

r7 L. colt Cabeza y cola DNA lineal bicatenario 39,9 55+

La e5iru¡1ura del genonra dada es la que corresponde a la cápside del fago; algunos genomas existen en diferentes formas dentro de la célula
huésped

genü1l1a. Sin embargo, esto no siempre es asi y alg¡;nos lagos RNA tienen
gens§ras segrnentados, 1o que signi{ica que sus genes son transportados por
una sede de moléculas de RNA diferentes. El tamaño de los genomas de los
lagos vada enornlemente, de alrededor de 1,6 kb en los fagos más pequeños.
a más cle 150 kb en los grandes, como T2, T4 y T6.

Los genom;rs de bacterióI'agos, a1 set relativamente pequeños, fueron de los

prinleros en ser estudiados de manera completa por k:s métr¡dr:s rápidos y
eficientes de secuenciación del DNA cl'eados a finales de [a década de
i970. El número c1e genes varía de sÓio tl'es, el-i el caso de N{S2, a más de
200, er-r los fagos cabeza y coia más cor:rplejos (véase cuadro 9.1). Por
supuesto, los genomas de lagos más pequeños contienen relativamente
pocos genes, pero éstos pueden estar organizados cle manera muy comple-
ja. Por ejemplo, el fago 0X17.+ logra empaqltetat'en su genofira informa-
ción biológica "ext1"a", pues vados de sus genes se supet'ponen (figura 9.2).
Estos genes superpuestos comparten secuencias nucleotídicas (p.ei., elgen
B estir contenido por completo dentro del gen A), pero coditjca pt'oductos
génicLrs diferentes, pues los transcritos son traducidos desde diferentes
posiciones iniciales y en distintos marcos de iectura. Los genes superpues-
tos no son infrecuentes en los vit-us. Los genomas c1e fagos más glandes
contienen más genes, 1o que refleja las estntcturas más complejas c1e la ciip-
side cie estos fagos y una clepenclencia del mayor númelo de enzimas cocli-
fic¿rdas por el fagr: durante el ciclo de infección. Por ejemplo, el genoma de
T4 tomprende 50 genes que pat'ticip¿in sólo r:n la constt'ucciÓn de la cápsi-
de riel fago (figura 9.3). Pese a su complejidad, aun estos fagos g::ancles
requieren por 1o menos algunas proteüras y RNA codilicados por e1 hués-
pecl pala cumplir sus ciclcs de infección.

fi.§rtl:';jr-r:,:., ;:i.:: r¡::*,li{o::,'i)t: ¡.:lt:: 1,.:,'; i;:r';¡::r::*: ti: ,:,:rl*ri*f:::;;::,

Las bacteliólagos se clasifican en dos grupos según su ciclo vital: lítico
y lisogénico. La difelencia fundarnental entre estos glupos es que un
 Capítulo 9 Cenomas vitales y elementos genáticos
Fígura 9.2 El genoma de $XI74
contiene genes superpuestos. El
genoma está formado por DNA
mr:nocatenario. La región expandida
muestra el comienzo y el final de la
superposición entre los genes E y D,
¡I
1;;x;;errTATGGTA.ü&&¡¿;&§_¡¿scAGTG.ATG,;§;:i]i]i':li]]]i.....::]],]]]]]]:
I ,.,
Figura 9.5 Cenoma de T4. El geno-
ma consiste en DNA bicatenario, y se
lo ilustra en la forma circular hallada
en la célula huésped. Sólo se mues-
tran los genes que codifican los com-
ponentes de la cápside del fago; se
omiten alrededor de '100 genes que
intervienen en otros aspectos del ciclo
vital del fago.
mÓviles
6li 5386bases §l
[itr
--
Y_.#
""{:{^u '''''
I
i '.ll...,,fl",', ', '.,
ñie: v,¡i !-.r 'É!u stop
,..".......-.., r-'-.- ,.,.,.,,...,,,,,...,....,...,.,.,.tr:r j
-;-*lt----,--*,..,_, '{_ -
{.? ce, - r i
rír,.,,r;::.,,,,r:,.r
I
, :,:tlirj.l,.1, :.::,,:,:::,, f
fago lítico destruye a su bactefia huésped muy poco después de ia infec- ,,,§;,'' .;,,,r, c
ción inicial, mientras que un fago lisogénico puede permanecer latente ,,¡¡.1¡,, ,,.,.,,., Í
dentro de su huésped por un período sustancial, aun a través de muchas ,,,.:;1il.,t:,::',.l. l'
generacionesdelácé1ulahuésped.Estosdosciclosvitalessonejempli
ficados por dos fagos de E. coli: el lítico (o virulento) T4 y el lisogénico ,¡.1¡.,.,¡.,...,:..r,',,, t'l
(o atemperado) 1.. ',,:
. ..
La serie T de fagos de E. coli (de T1 a T7) fue la primera de la que dispu- l.,.lillllll}.:iu,,i.,,,., .!-t
sieron los genetiitas moleculares y ha sido tema de mucho estudió. Su ciilo '.,.r$:,ll,l,l..ll,l..',', §
de infección lítica fue investigado por primera vez en 1939 por Emory Ellis
g''
",":,t!2:::1,,1,,,.:::',,',.
y Max Delbrück, que agregaron fagos T4 a un cultivo de E. coli, aguarda- t,.1|t,,,...,...,...,..;.' l{
ron 3 minutos paráque los fagos se unieran a las bacterias y, después, midie- ,r,:r,$,;,'::',,1,,,,'
'l:
t.li't''1"'t,tt,',,1.,.,,,,1,13
ron la cantidad de células infátadas durante un período dé OO minutos. Sus
se modifica durante los primeros 2á minutos de infección, y este período .,...,¡;,, ,¡,..,,,,,,,,,n;
latente es ei tiempo que necesitan los fagos para reproducirse dentro de sus .. ... 3l
huéspedes. Después áe 22 minutos, la cintidad de células infectadas comen- ,: - :(
zó a aumentar, io que indica que se había producido la lisis de los huéspe- lt,rttt::i..,....l.t.:.;;',,,ltlt
des originales y que los nuevos fagos que se habían producido estaban ..l',l..illl:ll.llr¡l'
in{ectando, en ese momento, otras céiulas del cultivo. La figura 9.48 mues- ., ..,,... ,. g.-
tra los eventos moleculares que tienen lugar en los diferentes estadios de :;!É.,":'::',:t:'":::,:'::
esta curva de crecimiento en unpaso. Elivento inicial es la fijaciáde Ia..!{r ¡,.'.',.L4
partícula del fago a una proteína ieceptora del lado exterao de la bacteria' ,.,',,,,*,,,,;,....l3
bistintos tipos áe fagos áenen diferentes receptores; por ejemplo, elrecep- ',,,:ll:,liliili1iiii'i{1:
tor para T4 es una ploteína denominada OmpC ("ó*p" tignlfi.u proteína ,',,,,1¡lllllll',l.llr..i'.
de la membrana externa), que es un tipo de porina, las proteínis l,ii-ion',,,,,,,,.'|3r...lllll.l
man los canales a través de la memb.u.ru extóma y facilitan li capta- ,.,',,,i ,,,,,,:,,,,,,,Y1
"alrü.
ción de nutrientes. Después de la fijación, el fago inyecta-su g.nor'á d' ..r,:r,rrri,r,r,,:,,,rflI
DNA en la célula a través de la estmctura de su cola. Inmediatamcnte des' j
'
pués del ingreso del DNA del fago, se detiene la síntesis de DNA, RNA | ',,,;f¡r¡¡.,¡1:tr
proteínas cléi huesped, y comienz-a ia transcripción del genoma del fago. A :'?í;;i§,'.;',,:,.§st
ios 5 minutos, Ia rnoléclla de DlrlA bacteriano se ha deipolimerizaiir: y]" 1ítl:.ll,llliii'&r¡,
nucleótidos resultantes son utilizaclos para la replicación áel genomn 9t-1u: , ,, ,.-,.!-u,
Después de 12 minutos, comienzan a aparecer las proteínas de la.áP:'-o-t ..,.tr,
del nuevo fago y se ensamblan las primeras partículas de fago completa'! ..-.. .-., u cl
Porú1timo,alfinaldelperíodolatente,lacé1u1aesta11ayliberaIoSntter.osj
-:..
¡-
 Genomas de bacteriófagos y virus eucariontes

Ce crecimiento en un Paso
{A} {ur.,l: {B) Ciclo de infección lÍtica
& Proteína receptora
,r,
' . El bacteriófago T4
'#§q'
Li¡f:t9rr.1 f,r1[till -"'''--.c.
-§{f se fija a la bacteria ¡., , ;.s{.--&-'@¡+9*4i.

-- E. coti ca\&
L- -,.#
ut-
@
Bacteriófago T4 ¡ El DNA del fago
., I .r inyectado
g '{1,§ en la célula
,,",.-t-11{;,",,,,..,.,,.."-.",--,.......,,..
z I0.
Ác¡.4-r
¿.-tsr'
05t0152025301540
Tiempo (minutos)
I Comienza la
I transcripción
I del orun del fago
fagos. Lln ciclo de inf'ección típico produce de 200 a 500 fagos T4 por célu-
la, todos los cuales pueden seguir infectando a otras bacterias.
La ma,voría de los fagos pueden cumplir el ciclo de infección lítica, pero / I :! ** -.
i l"r'l \' ;
algunos, como 1., también pueden seguir un ciclo lisogéi-rico. En la sección
2.2.1, cuando estudiairos el uso de los fagos I corro vectores de clonación,
descubrimos que, durante un ciclo de infección lisogénica, el genoma del ,)§A .+ *l¿:i

f'ago se integra al DNA del huésped. Esto sucede inrnediatamente después ¡ Replicación
{, det oNA det fago
del ingreso del DNA del fago en la célula y da origen a una forna latente
del baciedófago denominada profago (figura 9.5A). La integración tiene ,"ttll
],...;P¡!ii!iii]lr!¿]L¡'§]ll]¡]l!r¡f¡qir!¡]¡*d-

t t,¡
r'll.¡l.+ii'
lugar por recombinación específica de sitio (sección 17.2) entre secuencias .i
I lil
idénticas de 15 pb presentes en los genomas de 1. y E. coli. Esto significa 'r1:;:a:aHr:::{:'
que el genoma ), siempr:e se integra eir la misma posición dentro de la molé- ;3¡'A -+ ¿li\'& *sA
cula de DNA de E. coli. El profago integrado puede ser retenido en la molé- I Síntesis de proteínas
cula de DNA huésped durante muchas generaciones celulares, se replica I de la cápside
junto con el genoma bacteriano y es transferido con éste a las células hijas.
sin enrbargo, sobreviene un cambio alnlodo lítíco de infección si el profa- ' ll! 'l -)..
, llrlli
" i-i*'s :

go es inducido por algún estimulo químico o físico. cada uno de éstos pare- !
¡ -)¡Jr^,
" ii;
ce estar relacionado con daño dei DNA y, quizá por eso, señala ia muerte
inminente del huésped por causas naturales. En respuesta a estos estímu- sj!¿ .* f'r*i*irt*
Estalla la célula
los, un segundo evento de recornbinación escinde el genoma del fago del T
huésped, se liberan
DNA huésped, comienza la replicación del fago y se sintetizan las protei I
los nuevos fagos
nas de su cubierta (figura 9.58). Por último, la célula estalla y se iiberan
nueyos fagos i'. La lisogenia suma otro nivel de complejidad al ciclo vital
dellago y garantiza que éste pueda adoptar la estrategia de infección par-
ticutrar mejor adecuada para las condiciones prevalecientes.

Figura 9.4 Ciclo de infeccién lítica

9.1 , .: { *rr*;- *s {$# l;i{L§.§ *#{*r;e:ffit*s del bacteriófago T4. (A) Curva de
crecimiento en un paso, revelada por
Las cápsides de los virus eucariontes son icosaóclricas o filamentosas; la el experimento llevado a cabo por
estrrlctura cabeza y cola es privativa de 1os bacteliófagos. una caracte- Ellis y Delbrück (B) Eventos rnolecu-
rísticas distinta de 1os vilus eucariontes, en particulai de aquellos con lares que se producen durante el ciclo
huespecles animales, es que la cápsicle puecie éstar rodeada de una meñr- de infección lítica.
brana lipídica, que forma .rn coilpo.,inte aclicional a la estructura del
virus (llgura 9.6). Esta membrana deriva del huésped, cuando la nueva
partír'ula viral ai:andona la célula y, después. puede ser modificada por
inselción de prr:teínas específicas del virlus.

§,str¡:::{¡:rcs y *strirt*üi,:s C¡: r**lkr:rirj¡: d* l*: *€n*m*§

¡i'r, *rJ . Í,""j"- ,ri . -

Los genomas virales eucaliontes p1'csenran una gÍan varieciaci cle estr.uc-
turas (cuadro 9.2). Pueden ser de DNA o de RN¡\, de una sola caclen¿r
o de doble cadena (o parcialmente de dob]e caclena, con regiones lnono-
25§ Capítulo 9 Cenonras virales y elernenlcs genáticls mÓviies

{A} lntegración en el DNA huésPed catcnaf ias). lineales o circulares. segnlent¿lc1os o n0 Segmentarlos' Por
razünes cluc nllne¿l rladie h¿i complelldido, ia vasta lnalr§l'ía cle los virus
.ti,..::rr Ba«erióÍago i"
de las plantas tienen genom¿Is de RNA. E1 t¿lmaño del genotna cllbre
alrecleclor del mismo rango observaclo en los fagos, aunque lcls gencrt1ar
§:'
t- §*- -**-*'-'. vilale.q miis glandes (p.ej.,virus vaccinia [vacuna antivaliólica] son 2'10
";" \v^-^rf\- ' kb) son basiante ma¡r3¡s. que los gcnüinas dc los fagos rnás g1 ¿itldü''
:dd
-/^/
r'? L-, .r\-N
¿
,
' E. toli
' -' "- ^, -!*. -.",-,- *, ; Si bien la mayoda cie los úms eucaf iontes cumplen sólo el ciclo-de inl'ecciÓn
5itio de integración \ Recombinación lítica, unos pocos sc ocupan cle la maquinada genética de la céiula huésped
en el DNA de E. coli ! específica de sitio
en ia meclicia en q.te 1o h¿ice un bacteriófago. Muchos virus cr:existen con sus
células huésped áutar",,te períodos pr:olongados, quizás años, y las funciones
de la célula ie cietienen iólo hacia e1 final clel ciclo cle inf'ecciÓn, cuanclü 1a
Profago 1,
progenie del vhr,rs alutacenada en la célula se libela. Otros virus cumplen
Numerosas
ciclás c1e inl'ección sirnilares aicle M15 en E. coli (secciÓn 4.1.1) 1' sintcrizan
(Bi Escisión y síntesis ¡/
rÉ dlvtsloneS continsamente ntlev¿is partículas vilales que son expulsadas cle la cé1u1a'
Est¿ls infeccioncs pueden sobrevenir a lalgo plazo, atlnque el genoma viral no
de nuevos fagos
7 celulares
g
r lnducción
se integre al DNAhuésped, pero esto no significa que no haya-virts eucarion-
},
tes equivalentes a bacteriófagos lisogénicos. Diversos vims de DNA y RI'JA
DNA
escindido ¡f del profago
," pr.d"n integrar al genoma de su huésped, a veces cr:n efectos drásticos
soÉre la célula huéspJd. t,os retroelementos virales son ejemplos de vil'tts
eucariontes integr:ados. Sus vías de replicación incluyen uíl nuevo paso, en el
que una versión Rl'lA clel genoma se convielte en DN¡\' Hay dos clases de
¡ Expresión de los genes del rLtrr:eiemento viral: 1os retrovirus, cuyas cápsides cotttienen la versiÓn R\iA
I fago, replicació.n del DNA. clel genoma, y los pararretrovinrs, cuyo genonla l'ecubierto_ de una cápside
está*compr-resio poi. DIIIA. En 1970. Hi¡ward Temin y David Baltimore con-
s¡nlesrs de la capslde

fir:naron, en lolma ir-iclependiente, tal capacidad de los retro-elelnentos Yira-

flj*;**ne^*o
1" ü._;.U¡ *{s
"6*&
Se liberan
nuevos fagos 7.
les cle convei1ir RNA en DNA. Tlabajando con células infectadas pr:r
retrovirus, an'lbos ¿lislaron la enzima llanuda ahor¿l transcriptasa inversa,
cLlle es capaz cle h¿rcer una copia f)NA de un molde c1e Ri{A (y es de il¡uelt-
ü utiliclai en el estuclio experimental cle genomas; sección 2.1'1). El genoma
Figura 9.5 Ciclo de infección lisogé- l'etro\rilal típico es una ntolócula de Rl{A monocatenario, de 6'000 a 9.000
nica del bacteriófago )'. Tras la nucleóticlos de longituri. Despr:ós del ingreso en la cólu1a, c1 genoma es copia-
inducción, el ciclo de infección es clo en DNA bicatenario por unas pocas moléculas de tlanscriptasa invers¿l
sir¡ilar al modo líticc. Véase una des- que e1virus lleva en su cí]psicle. La versión de cloble caclena del genon:a se
crrpción de cómo se regula Ia expre-
intcgr:a, entonces, al DNA cle1 huésped (figr:ra 9.7). A clil'er:cncia cle ]". el
sión del genoma i durante la
lrsogenia en la sección 14.3..l. genima r.etror,il¿ll nc tiene ninguna similitr-rcl de secuencia coÍl su sitic de
inserción r,.n el DNA hr-réspecl. Lil integración del genolll¿) viral en el Dli,{
¡uésped es Lln pi'etl'equisitCI p¿ira la expfesióI"] de los genes del retl0\¡il't1-c, 'iuc
,o,-, ir", v se dónominan gag pol y ern' (ligura 9.8). Cada uno codilica una
poliproteúra. qlle es clegraclacla, clespuÓs de la tt'aclucción, en clcs o más pt'o-
itu.iou gónicss func,ionlles. Estos piccluctos colltllt'el-lL1en las proteínas cle la
cubier:ri viral (cletitacl¿rs cle cr¡1,) y la trallscf iptas¿i invers¿l (deiivacla de Trol)'
1,os pxtcl:ctos proteico* ,. .u,-,rtit an crol"l ti'anscritos de RIrIA cle longiLr-rd
.urril*t, del genr:ma letroviral pat'a producit'tlucvas partículas r,ir';rles.
--
I1n 1983-1984, se clemostró que los agentes etiológicos clel sida (síndlcxtre
Espículas

Membr¡n¡ cle inmunocleficiencia aclqui::'icla) erat retl'ovirus. El primer virus de1 sida
frre aislacio en lb1rrril independiente pol' clos grr:pos, clirigidos pol Lrtc
. RNA
klontagnier: y llobert Gallo. Este vilr:s se clellomina Yir:ll-c cle la inmunod¡:'
Protetná d€ lc ficiencil huirana, o FII\r1, v es t'csponsable rle la lonn¿r má5 prevalente -Y
cápside patógcna rlel sínclron-re. En 1 985, Nlontagnier cle,sct-tbrió tln,vil-tts relacioila-
Ao, J nifr-2, nteltos di{unc1ic1o }'que calrsa una fot:ln¿t más leve de la enler-
medacl. Los HiV atacan cierto-s tipos cle linfocitos cle1toll"ente circulatorio'
1o q6c clepr-irne la lespucstii it"ununitarirl rlel huéspecl. Estos linfbcitos tlans-
puitun e,i u,-, srrp",,ticic múltiplcs copias c1e nr-r¿'l prr:teítr:i llanlad¿r Cf)4, que
Figura 9.6 Estructura de un retrovi-
ru5 eucarionte. La cápsrde está rode- irctira corno rcccptor clel vin-is. Una partícula de HIV se une a unlt plotcí-
adc por ur¡ nl:mbr,:n; lip,l' I a lr na CD4 r, clcsp,-rés, inglesa en c1 linlocito 1r'as l¿r fusión cle su envoltura 1ipí-
que se un€n otras proleínas del vtrus. clica con la memblana celulat'.
 Cenomas de bacteriófagos y virus eucariontes 25t

C*¡xdro 9.2 Características de algunos virus eucariontes típicos y sus genoma§

:,u:irl3a::l§§iilillffi l''!!11:
Vi:'us Huésped Estructura del genoma 1á áñdw Número
iffi$ de genes

rl
Adenovirus Mamíferos DNA lineal bicatenario 36 30
z1
Hepatitis B Mamíferos DNA circular parcialmente 4
bicatenario
1)
Virus de la gripe Mamíferos RNA lineal, segmentado, 22
monocatenario
'1,6
.Parvovirus Mamíferos OruR lineal monocatenario
"Poliovirus Mamiferos RNA lineal monocaten¿rio 8

Reovirus Mamíferos Rry4 lineal, segmentado, 22,5 22

bicatenario
Retrovirus Mamíferos, aves RNA lineal monocatenario 6-9 3
rSV+0 Monos DNA circular bicatenario 5 5

Virus del mosaico del

, tabaco Plantas RNA lineal monocatenario 6,4 6
. Virus vaccinia (vacu-
na antivariólica) Mamiferos DNA circular bicatenario 244 240

La esiirítura del genoma dada es la de ta cápside viral; algunos genomas existen en diferentes formas dentro de la célula huésped

Figura 9^7 lnserción de un genoma

*x
& retroviral en un cromosoma huésped.
11#
DNA huésped
#
* l:

,li'
&

r RNA viral ul\A vtrat

Retrovirus
ffm r: lnyección inversa
' lntegración
11l&:;?
rry:*".;/
§* "......*....f --"::""'""'
RNA
i
, -re) w
ü.§ ,ié

Transcriptasa
tnve¡54
!
,-&-'---
&
:it

«
*t
§ *§
&
&
Citoplasma I Núcleo

Los virus ocupan el línlite entrc el mundo vivo y el inerte. En ei mismo

borde de este Iímite -o, quizá, más allá de é1- residen diversas moiécu-
las de ácido nucleico que podrían ser clasificadas o no como genomas;
por ejernplo, los RNA iat¿lites o los virusoides. Éstas son moléculas de
RI'{A, de alrededor de 320-400 nucleótidos de iongitud, que no codifi-
can 1as ploteínas de su propia cápside, sino que se fasladan de una célu- §R gag pol LTR

la a otra dentro de las cápsides de virus auxili¿ires. La distinciÓn entre

lo:; clos grupos es que un virus satélite comparte la cápside con el geno-
m¿l del virus auxiiiar', mientras que una molécula de RNA virusoide se
recubre de una cápside por sí misma. Por lo general, se 1os considera
par'ásitos de sus virus auxilial'es, aunque parece haber al menos unos Figura 9.8 Cenoma de un retrovi-
rus. Cada LTR es una repetición termi-
pocos casos en los que e1 auxiliar no se puede replicar sin el RNA saté- nal larga de 25O-1.a00 pb, que tiene
lite o el virusoide, 1o que sugiere que po1'lo menos algunas de las rela- una participación importante en la
ciones son sinbióticas. Tanto los R.NA satélites conto los virusoides replicación del genoma
pt'*dominan en los vegetales, al igual que un grupo más extt'emo deno- (véase sección 17.3.2) "
 Capítulo 9 Cenom¿s virales y elemenlos genéiicos móviles

(A) Escisión autocatali¿ada de RNA de vircideE

ülinado viroides. Éstos son ilolécujas cle RF:|A de 2.10 a J75 nr-rcicóticlos de
y virusoides
longitud, que no coÍltienen genes y nunüa se recubren de una cápside, por
Genomas unidos de cabeza a cola
lo que se propagan de una céLula a etra como R¡iA desnudo. Incluyen algu-
nos patógenos importantes desde el punto de vista económico, como e1
Estisión autocatalizada viroide de la exocortis de los cítricos, que l'educe el crecimiento de e.ctos
I árboles frutales. Las rnoléculas cie viroides y vin-rsoides sor-l cil'culares ! d,;.,
.:,

Cenomas lineales individuales
I Adopción de
I circularidad
una sola caden¿r, y son replicadas por enzimas codificadas por los genomas
del huésped o del virus auxiliar. El proceso de replicación detennina una
serie de RNA unidos de cabeza a cola \: en algunos viroides v virusoides,
éstos son escindidos por una reacción autocatalizada en la que la molécula u
de RNA act(ra como una enzima (figula 9.9). En Ia sección 12.2.4, se estu- t1
dian con mayor detalle estas enzimas RNA. D

(B) Estructura de escisión -tr

Las moléculas de ácidos nucleicos que se replican dentro cle células vegeta-
3' 5'
}-d §scisián
les pueden, quizá, considetarse genomas, aunqlle no contengan genes. No ',
.,
ñI
3r.*?ek -A^
.¿ u\( ,/ se puede decir lo mismo de los priones, pues esras pailículas infeccicsas, 'l st
{q h¡.cb
cüe
ryryt{rJu & causantes de enfennedad, no contienen ácidos nucleicos. Los priones son la ,1, ti
,¡J!l$d¡rN # causa de la encefalopatía espongifonne ovina de oünos y caprinos, y su ,"',., L
&n*d""'*A^ %*d
§U h'ansmisión al ganado v¿]cuno ha originado la nueva enl'er:nedad llar:lada É1
ll ti :

& encefalopati¿ ¿-spongiforme bovina (EEB). Si la transmisión adicional a ..i.,: t.l

seres humanos provoca Ia foma variante de la enfernedad de Creutzf'eldr-
.:.
Iakob (ECj) es motivo de controversia, aunque es aceptado por muchos bió-
Figura 9.9 Escisión autocatalizada logos. Al principio, se creía que los pl'iones eran vir.ls, pelo ahora es §
de genomas ligados durante la er¡idente que están compuestos sóio por proteína. La versión normal de la :'.: L
replicación de viroides y virusoides. ploteína del prión, Ilamada PlPc, es codificada por un gen nuclear de mamí- , tl'
(A) Vía de replicación. (B) Estructura
"en cabeza de martillo", que se forma
fero y sintetizada en ei encéfalo, aunque se desconoce su función. La PrPc .r
.,,,i
ir
en cada sitio de escisión y tiene activi-
es digerida con facilidad por prr:teasas, mientras qlle la versión infeccios¿r, .ü{
PTPSC, tiene una estructr.lra con mayor predonrinio de hojas F, que es resis- .rir' d,
d¿d enzimática. N, cualquier nucieótido f\
tenie a las proteasas y forrna agegados fib::ilares que se observan en los teji- 1)

il. i:li
clos infectados. Una vez dentro de la célula, las moléculas de PrPsc pueclen r¡ te
convertir ploteinas PrPc recién sintetizadas en la fbmra inleccios¿r, pot un :i
§r
,,lr &
mecanismo que toclavía no se conoce. y pl'ovocar el estadr: patológico. La c)l
tlansf'elencia de una o nrás de estas ploteínas PrPsc a un nuel¡o animal , ¿ll

causa la acumulación de nuer¡as proteínas FlPsc en el encéfa1o cle ese ani-

): : .¡.r,li mal y tlansr:nite la enfemredad (figura 9.10). Se conocen ploteínas infeccio- '',t
§
s¿'rs con propiedades similares en los eucat'iontes inf-erjr"¡res; pr:r ejemplo, los :. Ui

lnfección por PrF.

priones Ur:e3 y Psi+ de Succharonzyces terey'isictc. No obstante. es evidente ''.t pr
I que los priones son producttss géníctss más que matelial genético y, pese a .i Lll

^"@*PrP \ sus propiedades inl'ecciosas, qur: pr'ovocaron conlusión general respecto de '. dr
ffiprp',y' la categoría a la que corresponden, no están lelacionados con virus ni con .:
it
I(
ffii;,'JP partícui¿rs subvirales, como viroicies y virusoides. §{

tr§ffi
rh,% &q, t
:...

Estado patológico #.ffi ffi §e«x:¡ ww§,ws 6*w,&k§xaps rx¡*w!fi es

I
En los capítuios 7 y I aprendimos que los genomas eucariontes ): en nlenor
1
t_
ffi* r)t
medida, los procariontes, contienen repeticir:nes en todo el genoma o dis-
pel'sas, algunas yeces con varios miles de copias por genom¿i y distribución rr Pl
aparentemente aleatolia de cada unidad de repetición (sección 7.2.4).Para :,' rc
IL
muchas repeticiones dispersas. el pertrón cie distribución en toclo el genoma
se establece por transposición, proceso por el cual un segmento de DNA ,t,:, . m
Figura 9.10 Modo de acción de un se puede desplazal de una posición a otr:a en un genonu. Estos segmentos .:.t::' ,. lll
.

prión. Una oveja normal, sana. tiene mór,iles se denorninan elementos transponibles o transposones. Algunos rrri f)
ptoreínas PrP( en el encéf¿lo. La tipos se nrueven pol'1-111 proceso conseryador. que consiste en la escisión cle v¡
,',ta
infección por moléculas PrPsc jnduce
1a secuenci:r de sr-r posición original y su reinser:ción en otta pal'te. Pol ltr .,: tü
la conversíón de proteínas PrPc reclén
sintetizadas en PrPsc, que provocan el tanto, la transposición conservadora determina sólo ei cambio de posición .|", n]

estado patológico: encefalopatia del tr:ansposón en el genoma, sin aumentar su cantidad de copias (figura '''':'' ' ¿1r

espongiforme ovina. 9.1 I ). Pol el contralio. la transposición replicativa representa un aumento rl

 Elementos genéiicos móviles 26t

Figura 9.I'l Transposición ccriserva-

dora y replicativa.

Conservadora Replicativa

'.:@.-
i§ ";;.-*aÁ@ ¡ ¡' ,i'*"*@e&5t¡tliffife ¿ J , ¡ a¡ffi*m*¡§*m¿ ¡ ¡ e'@44*ge@¡¡* É,

del número de copias, pues, durante este proceso, el elemento original se Retrotransposón
#M
m¿intiene en e1 lugar, mientras se inserta una copia en una posición nueva. ¡-drya¡-5..

Por consiguiente, este proceso replicativo induce una proliferación del \l Transcripción
transposÓn en posicioires dispersas del genoma.
M. RNAdeun¿
ffi
Ambr:s tipos de transposición implican recombinación, y, pol lo tanto,
sord(doend

se tratarán los deralles de los procesos al estudiar ia recombinación y los \ Transcripción inversa

tipos relacionados de reordenamiento de los genomas, en el capítulo 17. \

Lo que aquí interesa es la variedad de estructuras presentadas por los w
...- DNAdedoble
elenlentos transponibles haliados en los genomas eucariontes y proca-
cacen¿

riontes, y la relación entre estos elementos y los genomas virales.

§einteBración
.w@

§.á.? ?rmex%p*§i{&*ffi x trxv&s *§e l*a"s ffie*& ám**rrm*eiiari* Retrotransposón Copia deretrotransposón
Los transposones replic¿rtivos se pueden subdividir además en k¡s que se
transpoÍIen a través de un RNA intermediarir: ¡, los que no. El proceso que
involucra un RNA interrnediario, que se denomina retrotransposición,
Figura 9.12 Retrotransposición. Al
cornienza con la síntesis de una cr:pia RIrIA del tr:ansposón por el proceso
de tlanscdpción nr:rnal (fi$lra 9.12\. Después, el transcrito es copiado en
-
comparar con Ia figura 7.20 se obser-
va que los eventos son básicamente
Dl{A bicatenario, que al principio existe como una molécula independien- los mismos que los que dan origen a
te luera del genoma. Por último, la cr:pia DNA del transposón se integra ai un seudogén procesado.
gencma, quizás otra vez en el mismo cromosorna que ocupaba la unidad
originai o tai vez en un cromosoü1a diferente. El resultado final es que
ahor:a hay dos copias del transposón en dil'erentes puntos del genoma.

Si se compara el mecanismo de retl'otransposición con ei de leplicación de

un retroelemento vilal, colno lruestra la figur:a 9.7, se observa que los dcs
procesos son muy similares: 1¿r única diferencia es que ia molécula cle RNA
que inicia e1 proceso se transcribe de una secuencia genómica endógena
durante la retrotranspcsición y de un genoma virai exógeno durante la
replic;ición de un leiroelemento virai. Esta estlecha similitud nos alerta
sobl'e las relaciones que existen entl'e estos cios tipos de elementos.

L*s tr*;nsp*s*fr*§ d* tr§i& *** r*p*tiri***s **r;wi¡:*l*s ktr§*s

Elemento Iy
*sl-:::: r*f *r¡**xdr:s {{}fr r*{§**l{:ff1*nt*s vir*:i*s
r§
Los transposones de RNA, o retroelementos, son característicos de los
genomas eucariontes, pero hasta ahora no se los ha descubierto en los
procariontes. Se los puede clasificar, en términos generale-s, en dos tipos: ¡ Recombinación
I entre LTR
los que tienen repeticiones terminales largas (LTR) y los que no. Los
retroelementos virales (véase figur:a 9.8) tarnbién tienen repeticiones ter'- I n ,,|e1á;i*@;e*;,aá.:! v,
t¡inales largas, que desempeñan un papel central en e1 proceso por el
que la copia RNA de un elementr: LTR es transcrita inversamente a Elemento "solo delta"
DNA bicatenario (sección 1,7.3.2). Ahora, se ha esclarecidr¡ que estos
virus son uno de los miembros de una superfamilia c1e elei¡entos. qur-
también incluye los transposones LfR er:rdógenos. El primero de ir¡s e1e- iigura 9.13 La recombinación homó-
mentos endógenos que se descublió fue la secuencia Iy de ievadura, que Ioga entre las LTR a uno u otro extre-
tiene 6,3 kb de longitud y una cantidad de copias de 25-35 en la mayo- rno de un elemento Ty podria dar
ría de los genomas de Sacchctramyces cerevisice: cabe leccrdar que uno origen a una secuencia delta.
261 Capítulo 9 Cenom¿s virales y elementcs genéirccs mévrles

(A) Retroelementoviral
de estos elementos estaba presente en el segfnento de 50 kb del genorha d
gag pot env de levadura examinado en la sección 7.2.2 {véase figura 7.158}. Los fi
LTR LTR
genomas de levadura también contienen alrededor de 100 copias adicio- d
-/ KD
nales de las LIR de 330 pb de los elementos fy, estas secuencias "sól* r
delta" prsbablemente surgen por recombinaeión homóloga entre las do* d
llIR de un elernento Ty, que podrían escindir la rnayor parte del elemry:¡; r
(B) Retroelemenlo Tyl/copia to y dejar una sola LTR. {figura 9.13). Es probable que este evento de a
b
escisión no esté relacionado con la transposición de un eiernento 7y, que ri
§R gag po¡ LTR tiene lugar mediante el proceso mediado por RNA mostrado en la figu. h
¡¡ ¿.
ra 9.1,2. A
u
-7 kb
r
Hay varios tipos de elqnento § en los genornas de levadura. El más abur¡ §
dante de éstos, Tyl, es similar al retroelemento copía de la mosca de la d
(€) Rekoelemenlo Tyi/gypsy
fruta. Por 1o tanto, estos elementos se denominan, en la actualidad, familia
LTR gag po¡ knv" LTR
Tyl/copia. Si se cornpara la estructura de un retroeiemento Tyl/copia con
-.,-rry14e;'!t'"*,1*Y''¡'."@tq@*.e?i4ir%-.'
¿¡d&%¡¡ la de un retroelemento viral, se observan relaciones familiares evidentes
-7 kb (figura 9.14A y B). Cada elemento Ty1/copia contiene dos genes, denomi-
naáos TVA y "üB en la levadura, que son similares a los genes gag y pot de
un retroelemento viral. En particula(, TyB codifica una poliproteína que
incluye la transcriptasa inversa, que desempeña un papel fundamental eni
Figura 9.14 Estructuras de los geno- la transposición ds un elementa Tyl/copia. Sin embargo, cabe observar
mas de retroelementos LTR.
que este elemento carece de un equivalente de un gen env viral, que codi. t¡
fica las proteínas de la cubierta viral. Esto significa que los retroelementos ó
e
Tyl/copia no pueden formar partículas virales infeccissas y, por lo tanto¡ ü
no pueden escapar de su sélula huésped. Pero sí forman partículas sirnila. n
resá virus (VLP), que consisten en cópias RNA y DNA de los retroelemen-
tos unidas a las proteínas centrales derivadas de la poliproteína TyA. En
cambio, los miembros de una segunda familia de retroelementos LTR,
denominada Ty3/gypsy (tambien derivada de versiones de levadura y
mosca de la fruta) tienen, de hecho, un equivalente dei ger, €nv (figura
9.14C), y por lo menos algunos de ellos pueden formar virus infectantesi
Estas versiones infecciosas, aunque se las clasifica como transposones
endógenos, deben considerarse retroelementos virales. ,

Los retroelementos virales representan una parte sustancial de mucho§

genomas eucariontes y abundan en los genomas de las plantas más grande§;
sobre todo aquellas de gramíneas como el ma:u (véase figura 7.15D);
También son un componente importante de los genomas de los invertebra-,

Cuadro 9.3 Elementos transponibles en el genoma humano

Clase Familia Cantidad aproximada de copias Fracción del genoma {o/o}

SINE Alu 1.200.000 10,7

MIR 45O.OO0 2,5
MIRs 85.O00 o,4
LINE LIN E- I 600.000 17,3

LINE-2 370.000 3,3

LINE-3 44.AAO o,3
Retroelementos LTR ERV 240.OOO 4,7

MaLR 285.OO0 J,O

Transposones de DNA MER-I 213.000 14

MER-2 68.OO0 1

Otras 60.000 o,4

 Elementos genéticos móviles

(A)
dos y algunos vertebrados, pero en los genomas humanos y de otros rnamí- Lt¡'lE
poli(A)
feros, todos los elementos LTR parecen ser retroelementos virales degrada-
lgag? pol
dcs, más que verdaderos transposones. Estas secuencias se denominan ,.6@...6d
1

retrovirus endógenos i§RV) que, con una cantidad de copias de alrededor

-6 kb
de 240.000, representan el 4,7a/o del genoma humano {cuadro 9.3). Los
ERV humanos miden de 6 a 11 kb de longitud y tienen copias de los genes
gag, poly env. Sibien la mayoría contiene mutaciones o delrciones que inac- (B) SrNE
i-ivan uno o más de estos genes, unos pocos miembros del grupo de ERV poli(A)
humanos ERV-K tienen secuencias funcionales. A1 comparar las posiciones
<
de los elementos ERV-K de los genomas de diferentes indiüduos, se ha infe- -+-
rido que por lo menos algunos de ellos son kansposones activos. Sin embar- -0.3 kb
go, la mayoria de los ERV humanos son secuencias inactivas sin capacidad
de proliferación adicional.
-
Figura 9.15 Retroelementos no LTR.
Tanto los LINE como los SINE tienen
§mnsB*scrass #s §ff§ ry*;* ssrrrsr? d* {"§§ secuencias de poli(A) en los extremos 3'.
No todos los tipos de transposón de RNA tienen elementos LIR. En los
mamíferos, los tipos más importantes de retroelementos sin LIR, o retro-
pssones, son los LINE (elementos nucleares largos dispersos) y los §INE
(elementos nucleares cortos dispersos). Los SINE tienen la máxima canti-
dad de copias para cualquier tipo de DNA repetitivo disperso en el geno-
ma humano: más de 1,7 miilones de copias que comprenden el l4o/o del
genoma en su conjunto (cuadro 9.3). Los LINE son menos frecuentes, con
apsnas más de un millón de copias, pero al ser más largos, representan una
mayor fracción dei genoma: más del 2Uo/a.La abundancia de LINE y SINE
en el genoma humano se destaca por su frecuencia en el segmento de 50
kb que consideramos en la sección 7.2.2 tvéase figura 7.12).

El genoma humano contiens tres familias de LINE, de las cuales un grupo,

L$'¡E-l, es el más frecuente y ei único tipo con capacidad de transposición,
en tanto que ias familias LINE-2 y LINE-3 están formadas por vestigios
inactivos. Un elementc LINE-1 de longitud completa tiene 6,1 kb y dos
genes, uno de los cuales codifica una poliproteína similar al producto del
gen viral pol tfigsra9.l5A). l.{o hay LTR, pero el extremo 3' del LINE está
marcado por una serie de pares de bases A-T, que forman lo que se suele
denorninar secuencia de poli(A) (aunque, por supuesto, es ufia secuencia
de poli(T) en la otra cadena del DNA). No todas las copias de LINE-I son
de longitud completa, porque la transcriptasa inversa codificada por LINE
no siempre hace una copia de DNA completa del transcrito RNA inicial, lo
que significa que se puede perder parte del exffemo 3' del LINE. Este even-
to de truncamiento es tan frecuente que sólo el 1o/o de los elementos LINE-
I del genoma humano son versiones de longitud compieta, y el tamaño
promedio de las copias es de sólo 900 pb. Si bien la transposición de LINE-
1 es un evento raro, se ha observado en células cultivadas y parece ser res-
ponsable de la hemofilia en algunos pacientes, debido al movimiento de
rma secuencia LINE-I al gen del factor VIII, que altera el gen y, por ende,
Mitad izquierda Mitad derecha
impide la sÍntesis de esta importante proteína de coagulación de la sangre.

Los §INE son mucho más cortos que los LINE, miden sóio de 100 a 400
pb y no contienen ningún gen, lo que significa que no fabrican sus pro-
pias enzimas transcriptasas inversas (figura 9.158). En cambio, o'piden
ptestadas" transcriptasas inversas que han sido sintetizadas por LINE. Figura 9.16 Estructura de un elemen-
El SINE más común de los genomas de primates es Alu, que tiene aire- to AIu. El elemento está formado por
dos mitades, cada una de 120 pb, con
dedor de 7,2 millones de copias en los seres humancs (cuadro 9.3). Un
una inserción de31-32 pb en la mitad
elemento Alu comprende dos mitades, cada mitad cornpÉesta por una derecha, y una cola de poli(A) en el
secuencia de 120 pb similar, con una inserción de 31-32 pb en ia mitad extremo 31 Las dos mitades (excluida la
derecha (figura 9.16). El genoma de ratón tiene un elemento relaciona- inserción) tienen una identidad de
do, denominado 81, de 130 pb de longitud y equivalente a la mitad de secuencias de alrededor del 85o/o.
26{ Capítulo 9 Cenomas virales y elementos genéticos nróviies

Figura 9.'17 Transpossnes de DNA {A) Secuencia de inserción

de procariontes. Se muestran cuatro
tipos. Las secuencias de inserción, los Transposasa
transposones de tipo Tn3 y los fagos ;; -0.1 kb
transponibles están flanqueados por
secuencias repetidas terminales inver-
tidas (lTR) cortas (( 5O pb). El gen
de resolvasa del transposón de tipo
Tn3 codifica una proteína involucrada {B) Transposón €ompuesto
en el proceso de transposición.
;, 2.5-]0 kb
ts Genes de resistencia
a los antibióticos

(C) Transposén de tipo Tn3

Resolvasa ITR
;; -5 kb
Transposasa Cen de resistencia
a los antibióticos

(D) Fago transponible

I
ITR Cenes de lisis ITR
;;;; -38 kb (
Cenes de integracién Cenes de la t
y replicacién cubierta proteica {:

I
I:

una secuencia Alu. Algunos elementos Alu son copiados activamente en T

RNA, lo que peurite su proliferación.

A1u deriva del gen de RNA 7SL, un RNA no codificante involucrado en

ei movimiento de proteínas alrededor de la célula. El primer eleinento
Alu puede haber surgido por traÍIscripción inversa accidental cle una
molécula de RNA 7SL e integración de ia copia DNA al genoma huma-
no. Otros SINE derivan de genes tRNA que, al igual que el gen de RNA
7SL, son transcritos por Ia RNA polimerasa III en células eucariontes
(sección 71.2.1), lo que sugiere que algunas características de los trans-
critos sintetizados por esta polimerasa predisponen a estas moléculas a
su conversión ocasional en retroposones.

: "2"? Trm¡lsmq:s#f,)-11:
¡ iá, {3}rr
No todos los transposones requieren un RNA intermediario. Nluchos pueden
tmnsponerce de una manera DNA-DNA n:ás dit'ecta. En ios euc¿ttiontes.
estos transposones de DNA son menos colrrunes que los retrotl'ansposone§,
pero tienen un lugat'especial en genética, porque una f'amilia de tt'atlsposo-
nes de DNA de plantas -los elementr:s AclDs del maíz- fueron ios ptirneros
elementos transponibles descubiertos porBarbara McClintock en la década
cle 1950. Sr-rs conclusiones -que algxrnos genes son móviles y pueden despla-
zarse de una posición a otra en un cromosoma- se basaron en experimentos
genéticos sofisticados, pero la base molecular de la transposiciór flo Sc- coflo'
ció sino hasta finales cle la década de 1970.

l,*s"frcrnsp*s*r:cs ## #ff§ s*r¡ rsr??#r'§#s e# fss §*{?*{$3*§ #{*e§{i$}ry

Los transposones cle DNA son L1n componente importante cle nluchos
genomas procariontes. Las secuencias de inserción, IS1 e IS186,
 Elementos genéticos móviles

en el segmcnto de 50 kb dc Dl.lA cle {,. coÍi que examin¿1rtos en 1a sección Eiemento Ac Elernento Ds
8.?.1 lvéase tig¡:ra 8.7), son ejerlplos de transpcsones c1,r'Di{A. y r:n solc IR IR IR
I
IR

flu-r1r)l1)ir de f.. cc,li puede contener l-rasta 20 de éstos de di"'elsos tipos. La ry§§re*ed&§rir¡a
i.,.,.r,.r. palte c1e la sccuencia de una IS es captada por tlno o dos genes que ;íl iri ii:l: :ri:r;.::;t¿
que cataliza su transposición (figur:a ,lll ¡t:: :r.
especilican la enzima transposasa, I

ü.17;\). Hay un par de repeticiones invertidas a uno y otl"o extrenlo de cada I

elemcnto iS, de 9 pb a 41 pb de longitud -se'g¡-rn el tipo de IS, y la inserción , ...
. Transposasa

del elernento en el DlliA cliana crea un par de Íepeticiones directus cal'tas

14-1i pb) en el genoma huésped. Los elementos iS se pueden transponer
pot' mecanisruo replicattivo o consewador.
nárkM
üffiff.K
lo-r elementos lS tarnbién son componentes de uu segundo tipr: de I
.ansposón cle Dr\A, cal'acterizado po1' primera vez en E. co{i y que l
Transposición
I
+
Transposición
ahoril -se sabe que es cr:mún en nruchos procariontes. Estos transposo-
nes cosrpuestos están folmados pol un par de elementos IS que l1an-
quean un st:gmento de DNA que suele contener Lrno o más genes. a
Figura 9.,l8 Familia de transposones
menudo algunos que cr:difican resistenci¿i a los antibióticos (figula AclDs del maí2. EI elemento Ac de
9.17§). Pol ejemplo, Tn10 contiene un gen de resistencia a la tetlacicli- longitud completa mide 4,2 kb y con-
na, -v Tn5 y Tn903 llevan un gen de resistencia a la kanamicina. Algunos tiene un gen de transposasa funcio-
transposones compuestos tienen elementos iS idénticc¡§ en uno y otro nal. La transposasa reconoce las
extr*firo, y oflos tienen un elemento de un tipo y r:no de otro. En algu- repeticiones invertldas (lR) de I I pb
nos c;isos, 1os elementos 15 están orientados coil1o repeticiones clirectas a uno y otro extremo de la secuencia
Ac, y cataliza su transposición. EI ele-
y,, en r.rcasiones, colrlo lepet.iciones inveltidas. Estas variaciones no pa1'e-
mento Ds tiene una deleclón interna
cen al"ectar e1 mecanismo de transposición de un transposón compues- y, por lo tanto, no srntetiza su propia
to, clue tiene carácter conservarior y es catalizado pot'1a transposasa transposasa. Pero presenta, aun así,
codiflcada por uno o ambos elementos lS. las secuencias IR, que son reconoci-
das por la transposasa fabncada por el
En los plocarionles, se conocen otras diversas clases cle transposones de elementos Ac. Por ende, el elementos
DNA. Dos tipos impr:rtantes de E. coli son: Ds tambrén puede transponerse. Hay
alrededor de diez tipos diferentes de
* Transposones de tipo Tn5, que tienen su prr:pio gen de transposasa elementos Ds en el genoma del maí2,
), pür lo tanto, no lequieren elementos IS que ios llanqueen para con deieclones que varían de tamaño
tfansponerse (figura 9.17C). Los elementos Tn3 presentan tl'anspo- de 194 pb a varias kilobases.
-ciciór-I r:eplica tiva.
* §agos transponibnes, que son virus bacterianos que se ttansponen
replicativarrente como parte de su ciclo de infección normal (figura
9.I 7D).

Figura 9.1 9 Pigmentación variegada

de granos de maíz causada por
transposición en células somáticas.
Las formas muy ccloreadas de Zeo
mays se conocen popularnrente
como "maíz indio'i lmagen cortesía de
Lena Struwe.
 Capítulo 9 Cenomas virales y elernenios genéiiccs nróviles

Mosca de {*s frrrtsp#§#r:}*s #e S*1"4

laboraiorio macho Mosca silvesire hembra
gf ,?üfn$5 e{,¡cürdüfi ffs
r a'
El genoma humano contiene alrededor de i50.000 transposones
\L',r
s',ñ- \,
\,,,1,1
DNA de diversos tipos (cuadro 9.3), todos con repericiones invertiCa:
ds
/^t -rJl+.L-
1/\h
/i/\
'u1J' ^ ,r{ ,rr
'f!'' terminaies y con un gen de una enzima transposasa que cataliza el even-
crlg to de transposición. Sin embargo, la vasta mayoría de estos elementi¡.
I son inactivos, polque el gen de transposasa no es funcional o porque 1as
\
JU
¿,- secuencias de los extremos dei transposón, que son esenciales para ia
lA\-
/41 Iñ
^,é
transposición activa, faltan o presentan mutaciones.
\V/
Progenie normal ;;;;;; Los transposones de DNA activos son más comunes en las plantas, e inclu-
de alleraciones
yen el transposón AclDs, el primero descubierto por McClintock, y el ele-
génicas
mento Spm, que se hallan, ambos, en el maíz. Una característica importante
Mosca de laboratorio Mosca silvestre
de estos transposones vegetales es que rabajan juntos en grupos de fami-
hembra macho
a- lias. Por ejemplo, el elemento Ac codifica una transposasa activa que reco-
\;f \rir- noce tanto elementos Ac como secuencias Ds. Estas últimas son versiones
--álrFe t¿ *;'rru de Ac que tienen deieciones intemas que eliminan parte dei gen de transpo-
ln\
./r I r\
^ dr\\
ll\v//l'r
w/ r sasa, 1o que signi{lca que un elemento Ds no puede fabricar su propia rans-
,+
a¡d posasa y sólo se puede mover a través de la actiüdad de la transposasa
sintetizada por un eiemento Ac de longitud completa (fi¡sra 9.18). De
\"/-
J:-L "l modo similar, los elementos Spm de longitud completa se acompañan por
,,1i
/i\iñ
\V./
versiones con deleciones, que se transponen mediante enzimas transposasa
Progenieestéril codificadas por elementos intactos. La actividad de los elementos Ac es evi-
r ..,., dente durante el ciclo vital normal de una planta de maiz; la transposición
¿*nil;r p'rr
rliilrrl:r*iiitli:x en las células somáticas induce cambios de la expresión de genes. que se
.1 ;:i ,,,., r. manifiestan, por ejemplo, por la pigmentación variegada de ios grailüs de
maíz (figura 9.19).
Figura 9.20 Disgenesia híbrida. Los
cruzamientos entre moscas de labora- McClintock adürtió que el genoma del maíz contiene elementos tlansponi-
torio machos y moscas silvestres hem- bles a partir de sus estudios sobre Ia base genética de los diferentes patlo-
bras dan una progenie normal, pero nes de color plesentados por 1o granos. EI elernento P, un transposón de
cuando el macho es una mosca silves- DNA de Drosophila melanogaster, se descubrió de rnanera similar a1 estu.
tre, la progenie es estéril. Una posible
diar un evento genético infrecuente que, según se vio, surge por transposi-
explicación de la disgenesia híbrida es 1

que el citoplasma de las moscas con ción. Este evento se denomina disgenesia híbrida y se observa cuanclo se I

elementos P (P+ en el diagrama) con- cruzan hembras de cepas de laboratorio de D. me/anogcster con machos de ::
tiene un represor que impide la trans- poblaciones silvestles. La descendencia lesultante de estcs cluzaürientos es ¡
posición del elemento P El huevo estérii y tiene anormalidades cromosómicas junto con otras disfunciones I
fecundado que resulta de un cruza- genéticas. La explicación es que los genomas de las moscas cle la fr-Lita sil-
miento entre una mosca hembra P+ y vestres contienen velsiones inactivas del elemento P *transposones de DNA t
una mosc¿ macho P- contendrá este
típicos que comprenden un gen de tlansposasa flanqueado por repericiones I
represor y, así, los descendientes scn
normales. En cambio, el represor no invertidas terminales- pero las cepas de laboratodo carecen de estos ele-
será transportado en el espermatozoide mentos. Después dei cruzamiento, los eiementos heredados de las nroscas t
de una mosca m¿cho P+, de manera de la fiuta silvestres se toman activos en los huevos fecundados, se t1'anspo- I
que el huevo fecundado de un cruza- nen a diversas posiciones nuevas e inducen las alteraciones génicas carflctc- I
miento entre una mosca macho P* y rísticas cle la disgenesia híbrida ({igura 9.20). No se sabe con exactitud el .{
a
una mosc¿ hembra P- carecerá del motivo de esta activación, pero una pregunta más interesante es por quú los
represor, lo que posibilita la transposi-
genomas de las poblaciones silvestres de D. metutTogoster contienen e lL'ntel'l- t
oón del elemenro P y origina una pro-
genie con disgenesia hibrida. los P y las cepas de laboratorio no. La mayoría de las cepas de labolatorio
descienden de moscas recolectadas por Thomas Hunt Morgan hace alrede-
.

dor de noventa años, utilizadas por é1 y sus colegas en los primet'os experi"
mentos cie mapeo genético (sección 3.2.3). Parece que, en ese entonces, la§ t
poblaciones silvestres carecían de elementos P, que han proliferado cle algun
modo en los genomas silvestres desde aquellos años. La incapacidad cle las
lxoscas silvestres y de laboratorio para generar descendencia viable irlplic*
que est¿rs dos poblaciones no cr.rmplen uno de los criterios principales
entpleados para identificar especies biológicas: la capacidad de todr:s los
individuos de apalearse productivamente. Esto plantea la interesantc posl'
bilidad cle que la evolución de las especies esté impulsacia, por lo nrelros erl
 767

at:...

atmmos organismos, por la proliferación diferencial de elementos transponi-

bles derrtro de los genomas de miembros de distintas poblaciones.
ii..
'l:;

:'.:
Wxswmam
§os primeros estudios de virus se han concentrado, en gran medida, en
¡g bacteriófagos: virus que infectan bacterias. Los bacteriófagos están
r¿ompuestos por proteínas y ácidos nucleicos; las proteínas forman una
idpside que encierra al genoma. Hay tres tipos básicos de estructura de
tcápside y muchos tipos de organización del genoma; diferentes fagos tie-
llren genomas de DNA o de RNA monocatenario o bicatenario, algunos
,ton todo el genoma contenido en una sola molécuia y otros con geno-
mas segmentados. Los bacteriófagos cumplen dos ciclos de infección
distintos. Todos los fagos pueden infectar a través del ciclo lítico, lo que
,determina la inmediata síntesis de nuevos bacteriófagos, que se suele
ácompañar por la muerte de la célula huésped. Algunos también pueden
§umplir el ciclo lisogénico, durante el cual se inserta una copia del geno-
*a del fago en el DNA huésped, donde puede pernanecer en forma
,futente durante muchas generaciones celulares. Los vin¡s eucariontes
raon igual de diversos en cuanto a la organización del genoma, pero pre-
*entan sólo dos estructuras de cápside. La mayoría de los virus eucarion-
tes cumplen un ciclo de infección lítica, si bien esto no siempre provoca
.fu muerte inmediata de la célula huésped. Una serie de virus de DNA y
$e RNA pueden integrar sus genomas a cromosomas eucariontes dá
inanera similar a la de un bacteriófago lisogénico. Los retroelementos
üralss, que incluyen el HIV el agente etiológico del sida, son ejemplos
le virus de RNA integrados. Los RNA satélites y los virusoides son dis-
:trntos tipos de moléculas de RNA infectantes que no contienen genes y
.'ilependen de otros virus para su transmisión. Los viroides son pequeñas
,.moléculas de RNA infectantes que nunca se recubren de una cápside, y
Ios priones son proteínas infectantes. Algunos elementos genéticos
i¡óviles, que son secuencias de DNA que se pueden transponer dentro
.de un genoma, pero no pueden escapar de la célula, están relacionados
con yirus de RNA. Estos elementos se transponen a trayés de un RNA
iirlermediario por una vía sirnilar al proceso de infección de los retroe-
lementos virales. Los retroelementos Ty1/copia y Ty3/gypsy, y los rero-
virus endógenos de mamíferos son los elementos móviles rnás
iestrecharnente relacionados con ürus de RNA. Los genomas de mamí-
feros también contienen otros tipos de transposón de RNA, denomina-
dos LINE y SINE, la mayoría de los cuales han perdido su capacidad de
transposición. Los transposones de DNA no utilizan un RNA interme-
diario en su vía de transposición. Estos transposones son comunes en las
tracterias, dentro de las cuales son rcsponsables de la propagación de
genes que codifican la resistencia antibiótica. Los transposones de DNA
están menos difundidos en los eucariontes, pero hay algunos ejemplos
importantes. como el transposón AclDs del i¡aí2, el-priáer transposón
en set estudiado de modo detallado, y el elemento P de Drosophila
mel*nogast€r, que es responsable de la disgenesia híbrida que se obser-
va cuando se cruzan hembras de moscas de la fruta de laboratorio con
machos de moscas silvestres.

''¡l ¡i!1,: ,, r11 , .

 '. | ,,...)a.

Pal'le 3 - Funcionamiento
n:;n los hecl-ros que
inforrrración biol
rl ;.r: t.i § i;: rrri r:r1 .lrl li !; lj lrrr .,fr

| :':,t:.:.\:a i::,i",'":',
transcriptoma (capítulo 12) l't i: l'.'. l:l

13). Pol último, en el capít

diversas estrategias que uti
regular la erpresión de sus genomas.
bilitan que la actividad rlel genoma
le s extracelulares y permiten que organlsmos
n:ulticeluiares sigan vías de desarrollo compiejas'
 it,l *iri'rLt* iti *i:i,,tl
lü I i'l**:I¡;ih» d* 1¿ rr*r:;lii"i*
ij *ri,.*li*r **: 1*:;:ii;:*
l¡.3 ful*;1¡li;*r;i*t *t1 *l'JÁ y t.::.;"r:;::r.::r

ffi;rt¿,r,:;lr:: fl.i'li
, §{:lttitrl

Dex¡ibir la arquitectura interna del núcleo eucarionte.

lr

Drstt',;l,ir entre tos térmrnos "heterocromalin¿ conslitutiva", "heterocromatina lacultativa" y "eucromatina".

Analr:¡r las c¿racterísticas claves de los dominios funcionales, los aisl¿dores y tas regiones de control de
, Iocus, y describir la experiencia experimental que avala el conocimiento actu¿l sobre estas estructuras.

.: Proporcionar detalles sobre la acetilación y la desacetilación de histonas, y explicar cómo influyen estas
modifrcaciones en la exprestón del genoma.

; Mencionar los olros tipos de modificación quimica que pueden sufrir las proteinas histona y vincular esta
inlo,m¿c'on con el concepto de "código de hislonas".

Enurciar por qué es importante la posición de los nucleosomas para Ia expresrón del genoma y aportar
detalles de complejos proteicos involucrados en la remodelacién de nucleosomas.

Erplir¿¡ 6e*o se produce la metilación del DNA y comentar la importancia de la metrlación en el silencia-
mrerro del genoma

Preris¡r la parlicipación de la metilación del DNA en el sellado genómico y la desactivación de X.

Para que la célu1a utilice 1a infr:rrn¿lción biolÓgica contenid¿l dentt'o de su

gc:non1¿I, se deben exprcsar de nt¿luel¿l coofdina.{il grllpos cle genes, el1 los
que cacl:i gen representa tlna sola uniclad de inforl¡aciÓn. Esta expl'esión
coor.linada de genes detenlina la contposición del tl¿lnscdptolna ql1e, a sLi
yez. especitjca el c¿lr¿icter de1 proteoma y define las activid¿ides que l¿r c,élu-
la puecle llev¿lr a cabo. En la Parte i dt Gertortr¿rJ se examinal'oll los even-
tos que inclucen 1¿l transferencia cle infol'rnaciÓn biológic;r del genorr"ra al
protcüln¿i. Los primet'os corlocitnientos de esto¡i eventos pl'oviniel'on de
estudios de genes individuale,s, a lnenudo como DIJA "desnudo" en expe-
rimefitos cle tubos de ensar-o. Estos experimetttos posibilitaron uÍia inter-
pretación cie ier expresión cle genes la cual ha sido refinada en los últin-ros
años por estudios más complejos qlle han tenicio más en cuenta qlle, c1-] I'ea-
 '10
Capítulo_ Acceso al genome

lidad, es ei genoma el que se expresa y no los genes individuales, \' que csta ,,,,*- ..,,,,,,,,,

expresión tiene lugar en cálr-llas vivas y no en tubos de ensayo.

:

En este capítulo, comenzañlos la investigación cle la expresión c1el ger-ro- ',,"':3l,¡¡¡.¡...l.

n:a examinando la lepercusiÓn sustancial e itlportante qtle tiene el ."ii:'',::',t':''.:

medio nuclear soble la utilizacrón óe la infor:mación biológita tonl.,'
da en los genomas de eucariontes; la accesibilidad a esa ltformacióir .','r".',ttt',',::,,:
dependede1amaneradeempaquetar.e1DNAen1acroir"latirray1.t-Spon.
deaprocesoSquepuedensi1enciaroclesactil,arpartedeunCIolT]os0na
c todo é1. En e1 capítulo I I se describen los eventos involucrados en la .i€''.. rr:

iniciación de la transcripción y se destaca más el papel cruciai que de- .l,ll¡,,.,,,',,

senrpeñan las proteínas de unión al DNA durante los prit:ret'os estadios -.-- '

de expresión de1 genoma. En el capítulo 12 se consideta la síntesis de

transcritos y su rrli'erior procesarrliento err R.N;\ 1'unciona.les. y en el capí-
tulo 1i se tratan los eyentos equivalentes que llevan a la síntesis dcl i:ro-
teoma. A medida que avance en la lectura de ios capítulos 10-13
descublirá que es pi:sible controlar la cornposición del transcriptotla 1,
clel proteoma en diversos estadios, clurante la cadena global de eventos
que representan la expresión del genoma. Estos hilos reguladores se l'eu-
nirán en el capítulo 14, en donde se analiza cÓmo cambia la actividad
clel genoma en respuesta a señales extracelulales, y dulante la dileren-
ciación y el desarrollo,

B #. N §3*;rxtrm d*§ m*x§x.m

Cuando se observa la secuencia de un genoma escrita como una serie de
A, C, G y T, o dibujada corrlo Lr1-l mapa (p. ej., en la figur:a 7.2), hay una
tendencia a imaginar que todas ias partes de1genorna son fácilmellte acce-
sibles para las ploteínas de unión ai DNA, que son responsables d¿ su
expresión. En l.ealidad, la situaciÓn es muy diferente. E1 DNA del núcleo
de una céiula eucarionte o de1 nucleoide de un procarionte está unido a
diversas proteínas que no participan directamente en la erpresiÓn dcl
genoma y que deben ser desplazadas pat'a que la RNA polimelasa y otm§
pl.oteínas de erpresión ¿rccedan a los genes. Se s¿rbe muy poco sobre 1o que
nl lespecto sucede en los procariontes, 1o que refleja nllestl'o conccimien-
t0 en genel'al escaso acerca de la organizactÓn física del genom¿l proc¡-
rionte (sección 8.1.1), pero se está con"lenzando a c01l1p1'endt-l' cólno
influye el enipaquetamiento clomatínico del DNA (sección 7 .1.1) sobre la
exprásión dei genoma en los eucariontes. Ésta es un át'ea intelesante de la la ':.§t,...,:.,,...,
biología molecular', y la investigaciór'r reciente indica que las histonas y ,',,,,ffi
otras-proteínas cie empaquetamlento no son sólo estlucturas inet:les alre- 'r'r:1"r.'{:'l
üeclol og las (.uate§ §e §lllUlra |Jl rJl\.11, srrlL) LiLlu lrdr'LrLrP.rrr érwrr
dedordelascua1esseenlo1laelDNA,sinoqtrepar:ticiparractiVa1llC11tCCn
losplocesoSquedetefminanquéparteSde1genomaSeexpIeSanCn!l,
célula dada, Muchos cle los clescubr:imientos en este c¿impo han sido :11;:.tl't;;"';:',.';,':',t,,-;,.

impulsaclos po1' nuevos conocimientos de la subestructura dr;l núcleo,.-.llii"r;)...,t

, .,,,,

;t,!;:,fr,l;,,, ;,.,.,

i É^r*r-iitec{:srñ interr:,: riel

rl I §' '.'"x-""-- ¡rrie it* cL,lce-,1'ic'r¡"ttt
La arquiteciura inte¡na del núcleo fue examinada por primera ver;i§,,,,:¡::':,.
n1eü1ante microscopia opuca
nrediante lllcroscopla zLPaLvIILU f'alta
electrónica. La aparente
óptica y ereclroluciJ. O* !DLr"* r*ri!;".::',,"',::",,''
l.lL¿1 tru .,..:..,.r,rrr,
._1,rit.itii

de que ""t.t1c''.
el inle'
tura que surgió cle estos estudios clio origen al concept<t ;;'::;:i;;i,:,:a:,:,,;,,,1:',:,,,,.1,,,1;,:;,'

rior dll nírcléo es relativamente homogóneo, una típica "caja negra", erL''':t:;,;;;;),1;;,.,,,;,,;:'l' '
el habla común. En los últimos años, esta interpretación ha sido deses":Ü,.,''t",.:.''t,,:,::,,
timacla y, en la actualidacl, apreciamos que e1 núcle<¡ tiene una corrrplcja :, ,.,'
estructuta interna que está relacionacla lon ]as diversas actividades bio'r iri.l.it,ri;i'.. lr:...\ .:rl

químicas que debe cumplir. De hecho, el interior del núcleo es lan co111'

pl.lo .oroi el citoplasma de la célula; la única diferencia es quc' cn ,i.... :. , ..,

w Dentro del núcleo

il t"::'ii'l:,llii

, ,' (Ai Fibras citoplásmicas (B) (c)

Límite
citoplasmático-nuclear

Red fibrosa en
el interior del núcleo

contr"aste con el citoplasma, los compaltimentos funcionales intranucle-

Figura 10.1 Arquitectura interna del
ares no están encerrados individualmente pol membl'anas y, así, no son núcleo eucarionte. (A) Microfotografía
visibles cuando se observa la célula mediante técnicas convencionales de electrónica de transmisión que muestra
microscopia óptica o electrónica. la matriz nuclear de una célula HeLa
humana cultivada. Se trataron las cálu-
las con un detergente no iónico para
§J *i#** li*r;*: ¿;n* #sfriJ*f#r# ri]tr*rr?* lir:.: i],-#t' l(t,,'a eliminar las membranas, digeridas con
Este cuadro revisado de la estructura nuclear ha surgido de dos nuevos tipos una desoxirribonucleasa para degradar
de análisis microscópico. Pr:imero, la microscopia electrónica convencional la mayor parte del DNA, y se lo extrajo
con sulfato de amonio para hacer lo
ha sido complementada por el examen de células de rnamíferos preparadas
mismo con histonas y otras proteínas
de una manera especial. Tias la disolución de las membranas por sumersión asociadas con cromatina. (B) y (C)
en un detergente no iónicr: suaye, como al¡¡:no de los compuestos Tween, lmágenes de núcleos vivos que contie-
seguida de katamiento con una desoxirribonucleasa para degradar el DNA nen proteínas marcadas con sustancias
nuclear y extracción con sal para eliminar las proteínas histonas química- fluorescentes (véase Nota sobre técni-
mente básicas, se ha observado que la subestructura nuclear es una red com- cas 10.1). En (B), se muestra el nuclé-
pleja de fibrillas de proteínas y RNA, denominada matriz nuclear {figura olo, en azul, y los cuerpos de Cajal, en
amarillo. Las áreas púrpura (C) indican
10.1A). La matnz atlaviesa todo el núcleo y comprende regiones detinidas
las posiciones de las proteínas involu-
comc andamiaje cromosórnico, que modifican su estructura durante ia divi- cradas en el corte y empalme de Rl\A.
sión celular:, 1o que determina la conclensación de k:s cromosorras en sus lmagen (A) reimpresa con autorización
tbn:ras de metafase (véase figura 7.4). de Penman et al., Symp. Quant Biol.,
.I0]3.
45, Copyright 1982 Cold Spring
Harbor Laboratory Press. lmágenes (B)
Un segundo tipo nuevo de microscopia ha incorporado la utilización de mar-
y (C) reimpresas de Mistel¡ (20O1),
cadores fluorescentes, destinados específicamente a revelar áreas intranucie- Scrence, 291,843-847.
ares donde tienen lugar determinadas actir¡idades bioquímicas. Desde hace
muchos años, se ha reconocido elmrcléolo (iigura 10.i8), que es el centro
de síntesis y procesamiento de moléculas de rRNA, pues es la única estruc-
tura intranuclear que se puede visualizar por microscopia electrónica conven-
cional. La marcaciónL fluorescente
rruurLruvrrlv dirigida
uu rSrus ar r.ro proteínas
a las lJrvlvrlral involucradas
ur Yv¡r en el
cofie y empalme del RNA (sección 12.2.2) ha mostrado que su actividacl
también se localiza en regiones definidas (figura 10.1C), aunque éstas tienen
una distribución más amplia y menor de§nición que los nucléolos. Después
de la marcación fluorescente, se obsetwan además otras estmcturas, como los
cuerpos de Cajai (visibles en la figura 10.18), que probablemente participan
en la síntesis de RNA nucleares pequeños (sección 12.2.2).

Se podría considerar que ia complejidad de la matdz nucleal, ilustr:acla

en la figura 10.1A, indica que el núc1eo tiene un medio intemo estático,
con limitado moyimiento de moléculas de un sitio a otro. Otra técnica
microscópica nueva, denominada recuperación de la fluorescencia tras
el fotoblanqueo (FRAP; véase Nota sobre técnicas 10.1), que pemite
visualizar el movimiento c1e las proteínas dentro del núcleo, revela que
e§to no es así. La miglación de 1as proteínas nucleares no es tan rápida
como cabría supoller si nada obstaculizase su movimiento, lo que es
completamente esperable en vista de las grandes cantidades de DNA y
de RhlA del núcleo pero, aun así, una proteína puede atravesaL tocio el
 Capítulo 10 Accesc ai genoma

Nota sobre técnicas IO.l Recuperación de la fluorescencia tras el fotoblanqueo (FMP)

Vísuolizacién de lo movilidad de las proteínas en las núcleos vivos

La FRAP es, quizá, la más informativa de las diversas técnicas
microscópicas innovadoras que han ampliado nuestro cono-
cimiento sobre la subestructura nuclear. Ha permitido, por pn-
mera vez, visualizar el movimiento de las proteínas dentro de
núcleos vivos, y los datos resultantes permiten investigar
modelos biofísicos de dinamismo de las proteinas.
El punto inicial de un experimento de FRAP es un núcleo
en el que cada copia de la proteína de interés lleva una
etiqueta fluorescente. No es posible marcar las molécu-
las de proteína in vitro y, después, reintroducirlas en el
núcleo, de manera que el organismo huésped debe ser
manipulado genétícamente para que la etiqueta fluores-
cente forme parte de la proteína que es sintetizada in
vivo. Esto se logra ligando la secuencia de codificación
de la protefna fluorescente verde al gen de la proteína
estudiada. Después, se aplican técnic¿s de clonacién
estándares para insertar el gen modificado en el genoma
huésped, lo que origina una célula recombinante que
sintetiza una versión fluorescente de la proteína. La
observación de la célula con un microscopio de fluores-
cencia revela, ahora, la distribución de la proteína m¿rca-
da dentro del núcleo.
Para estudiar la movilidad de la proteína, se fotoblanquea
una pequeña zona del núcleo por exposición a un pulso
rigurosamente enfocado de un láser de alta energía. El
pulso láser des¿ctiva la señal fluorescente en la zona
expuesta, lo que deja una región que aparece blanquea-
da en la imagen microscópica. Esta zona blanqueada
recupera gradualmente su señal fluorescente, pero no
por una reversión del efecto de blanqueo, sino por migra-
ción a la zon¿ blanqueada de proteínas fluorescentes
desde la zona no expuesta del núcleo. Por lo tanto, la
rápida aparición de la señal fluorescente en la zona blan-
queada indica que las proteínas marcadas son muy móvi-
les, mientras que una recuperación lenta señala que las
proteínas son relativamente estáticas. Se puede utilizar la
cinética de la recuperación de la señal para investigar
modelos teóricos de dinamismo de las proteínas deriva-
dos de parámetros biofísicos, como constantes de unión
y velocidades de flujo.

diárnetlo de un núcleo en minutos. Por lo tanto, las ploteínas involucla'

das en Ia expresión del genoma tienen la libertad necesaria para desplazar-
se de un sitio de activdad a otro, según impongan los catnbiantes
requerimientos de la célula. En particular:, las histonas ligadoras (sección
7.1.l) se desprenden y se vuelven a fijar continuamente a sus sitios de
unión en el genor¡a. Este descubrimiento es irnportante pol'que destaca
que 1os complejos Dt',{A-proteínas que componen la cromatina son diná-
micos, una observación que tiene considerable relevancia para la expre-
sión del genoma, corrlo se comenta más ¿rdelante en este capítulo.

l-::#* fr.i.jiii*${.¡il;r't ,l;iti,i?r :,:j i.}rr.]ij',r,aJ ¡*1,,'ii¡.:¡i* ¡:l¡,,,'¡::¡'t::: ;it";t ¡:;,';{!t:,..,

Figura 1 0.2 Territorios cromosómi-
cos. Se han pintado los cromosomas
humanos i8 (HSA 18) y 19 (HS.A
19) de verde y rojo, respectivamente.
Cada uno ocupa su propio territorio
definido dentro del núcleo. lmagen
cortesía de Wendy Bickmore.
Al principio, se pensaba que la distribución de los cromosomas dentro de
un núcleo eucarionte es aleatr:ria. Ahola se sabe que este concepto es inco-
lr'ecto y que cada c1'omosoma ocupa su propio espacio o territorio. Esto se
puecle visualizar por el pintado de cromosomas, que es una versión de
hibridación in situ fluorescente (FISH; sección 3.3.2) en la que la sonda de
hibridación es ufla mezcla de rnoláculas de DNA, caáa una específica para
diferentes regiones de un solo cromosoma. Ei pintado de cromosomas,
cuando se lo aplica a núcleos en interfase, revela los territorios ocupados
por cada cromosoma (figura 10.2). Estos teritorios abarcan la mayor parle
del espacio dentro del núcleo, perc están separados entre sí por regiones
no cromatínicas, dentro de las cuales se ubican las enzimas y otras pl'otel-
nas involucradas en la expresión del ger-roma.

Los territorios cromosómicos parecen ser bastante estátictls dent¡:o de

un cleterminado núcleo. Se ha llegado a esta conclusión a partir de expe-
limentos en los que se maroan proteínas CENP-B, componentes de los
centrón:erc¡s (sección 7.1.2), con pt'oteína fluorescente verde (véase
I'lota sobre técnicas l0.i) y se obselvan las localizaciones de estas pro'
teínas, y por ende de los centlómeros, durante un período. En conjunt«r'
cada centrómel'o permanece estático durante todo ei ciclo celular, aun'
 Dentro del núcleo 1r3

lixlra 'l 0.3 Productos de translocaciÓn entre los cromosomas humanos 9 y

zí. ¡la izquierda, se muestran ios cromosomas humanos 9y 22 normales, y a .á
la r,lerecha, los productos de translocación. El cromosor¡a Filadelfla es el más
p;lueño de los dos productos de translocaclón. Los cromosomas 9 y 22 suelen ,fl
io,,,p"tt" en las posiciones rndicadas. A menudo, las roturas se reparan de §
q'¡¿narü correcta, pero a veces l¿ reparación incorrecta genera productos híbridos.
1W
Se consider¿ que la frecuencia relattvamente alta con la que aparece el cromoso-
nr¡ Filadelfia indrca que los cromosornas 9 y 22 ocupan territorios adyacentes en §,,1i

el núcleo humano. El punto de rotura del cromosoma 9 reside dentro del gen
ilil.4
§iir ':!

ABL, cuyo producto participa en el señaiamiento celular (secciÓn 14.1.2). La

translocación añade una nueva Secuencia de codificación al comienzo de este
gen, lo que da origen a una proteina anormal, que causa transformación celular y *:ii!l]]+
:22
[ro,.oca leucemia mielorde crónica. ;-q
a
a
;ll§
ü
§ .9
que hay episodios ocasionales de movimiento relativan-iente lento. Si tt
ry ry

bien los territolios son bastante estáticos durante Ia vida de la célula, 1a

Productos
nrayolía de ios estudios sugieren que su posición reiativa no se mantie- Cromosomas
normales de translocación
ne después de la división celular, pues se observan diferentes patrones
en 1os núcleos de las células hijas. De toclos modos, puede haber ciertas
lirljtaciones sobre las localizaciones de los territorios, ya que desde hace
vai'ios ¿tños se sabe que las translocaciones cromosómicas, que provo-
can la unión de un segmento de un cromosoma a otro cl'olllosoma, son
más frecuentes entre ciertos pares que elltre otros. Por ejenrplo, una
translocación entre los cromosomas humanos 9 y 22, que determina e1
producto anol'mal llamado cromosoma Filadelfia, es una causa común
de leucemia mieloide cr'ónica (figura 10.3). La repetición de la misma
translocación sugiere que los territot-ios del par de cromosomas que
interactúan suelen estar cerca uno de r¡tro en el núcleo. Tambión hay evi-
dencia de que, por lo menos en algunos organismos, ciertos cl'omosomas
ocupan, de preferencia, terlitorios próximos a la periferia dsl núcleo. Er-l
esLa región, la expr:esión de1 genoma es relativamente escasa y suelen
localizalse allí los crolnosonras que contienen pocos genes acti!'os; por
ejerrrplo, los macrocromosoirlas del genoma del pollo (sección 7.1.2).

I-a posición de genes activos dentro de ten{tot'ios croinosólnicos individua-

les es otlo tetla de debate. Alguna vez, se consideró que los genes activos
est¿rban ubicados en 1a superficie de un territot'io, adyacentes a la legiÓn no
cromatínica y, por io tanto, eran fácilmente accesibies para las enzimas y
las proteínas involucradas en Ia transcripcióu de genes (figura 10.4). En Ia r r,lllraair:.rt ñ.!iillll:1:i::;li1¡l
actualidad, se está cuestionando este concepto, debido en parte al resulta-
rlo de experimentr¡s que mostraron que los transcdtos de RNA se distribu- ,,il¡, ' lrliil" i't¡rti::'

yen dentro de los telr:itorios, ¿isí como sobt'e sus superficies' El ex¿imen
nticroscópico más refinado reveió que hay canales que atlaviesan terlito-
l'ios cromosómicos y vinculan diferentes partes de las regiones no cfomatí- / I '.t.:ritultif!r:!
¡ricas, 1o que aporta un medio por el que la maquinaria de transclipción Poro nuclear
puede penetrar en ias partes intei:ras de estos territot'ios.

i r";--i #**ll¡;;r',, d* fl:r :n; ii*:*

ll,n la sección7,1.1 aprendimos que la cromatina es el complejo de DNA
genómico y proteínas cromosómioas presentes en el núcleo eucarionte.
La estructura de la cromatina es jerárquica y varía de los dos niveles Figura 10.4 Territorios cromosórni-
nínimos de empaquetamiento cle DNA -el nuoieosoma y la fibra de cro- cos. La vista de la izqurerda muestra
matina de 30 nm (véanse figuras 7.2 y 7.3)- a los cromosomas en meta- el modelo original, en el que cada
territorio forma un bloque, lo que
1'ase, que l'epresentan la forma más compacta de cromatina en los implica que los genes activos se ubi-
cucariontes y sólo aparecen dut'ante 1a división nuclear. Después de la can en la superficie de un territorio.
r.livisión, los ct'omosomas se tornan ttleltos compactos y 11o se los puede La vista de la derecha presenta el
distinguir como estructuras indivicluales, a menos que se apliquen técni- modelo revisado, con canales que
cas especializadas, con-io el pintaclo cle cromosomas. Cuando se exami- atraviesan los territorios.

I
280 Capítulo 10 Acceso al genoma
Núcleo
M¡triz nuclear
Bucles de Dl'lA
Regiones ricas
en AT = MAR o SAR
Fibra de cromatina de 30 nm
Figura 10.5 Esquema de organiza-
ción del DNA en el núcleo. La matriz
nuclear es una estructura fibrosa,
b¿sada en proreínas, cuya composi-
ción y ordenam¡ento precisos en el
núcleo no se describió. Se considera
que la eucromatina, predominante-
mente en forma de flbra de cromati-
na de 30 nm (véase figura 7.3), está
unida a la matriz por secuencias ricas
en Al denorninadas regiones asocia.
das con la matriz o regiones de unión
al andamiaje (MAR o SAR).
Figura 10.6 Dominio funcional en
una región sensible a DNasa L
nan por rnicroscopia óptica los núcleos que no se encuentran en la fase
de división, todo lo que se pusde vsr es una mezcla de zonas de tinción
claras y oscuras dentro del núcleo. Las zonas ascuras se denorninan
heterocromatina y contienen DNA, que todayia conserva una organiza-
ción relativamente compacta, aunque menos que durante la metafase. Se
reconocen dos tipos de heterocromatina:
c Heterocromatina sonstit{rtiya: es una característica permanente de
todas las células y representa DNA que no contiens genss, por 1o que
siempre puede mantenerse en una organización compacta. Esta frac-
ción comprende el DNA centroméricCI y telomérico, así como ciertas
regiones de algunos otros cromosomas. Por ejemplo, la mayor parte
del cromosorna humano Y está formada por heterocromatina consti-
tutiva (véase figura 7.5).
i, Heterocromatina facultativa: no es una característica pernanente. pero
se obsewa en algunas células parte del tiempo. Se considera que la hete- .::
roclomatina facultativa contiene genes que son inactivos en algunas ,1,r:
célu1asoena1gunosperíodosdelciciocelu1ar.CuandoeStosgeneSSon
inactivos, sus regiones de DNA se compactan en heterocromatina.
Se acepta que la organización de la heterocromatina es tan compacta
que las proteínas que participan en la expresión del genoma simplernen-
te no pueden acceder a este tipo de DNA. En carnbio, las partes de DNA
cromosómica donde se localizan genes activos son menos compactas y
permiten el ingreso de esas proteínas. Estas regiones se denominan
eucromatina. No se conoce la organización exacta del DNA dentro de la
eucromatina, pero con el microscopio electrónico se pueden observar
bucles de DNA dentro de las regiones de eucromatina, cada uno de 40
kb a 100 kb de longitud y, predominantemente, en forma de fibra de cro-
matina de 30 nm. I-os bucles están unidcs a la matriz nuclear mediante
segmentos de DNA ricos en AT llarnados regiones asociadas con la
matriz {matrix-associatedr€giot §, &IAR) o regiones de filación al anda-
rniaje {scaffold attachment re§ans, §AR} {figura 1ü.5).
Los bucles de DNA entre los puntos de unión a 1a matriz nuclear se deno-
minan dominios estructurales. Un interrogante interesante es la relación
precisa entre éstos y los dominios funcisnales, que se pueden discriminar
cuando se examina la región de DNA que rodea a un gen o a una serie de
genes expresados. Un dominio funcional se delinea tratando una región de
cromatina purificada con desoxirribonucleasa I (DNasa I) que, por ser
una proteina de unión al DNA, no puede acceder a las regiones más com'
pactadas de DNA {figura 10.6). Las regiones sensibles a DNasa I se
extienden a uno y otro lado de un gen o una serie de genes que está sien-
do expresado, 1o que indica que, en esta zona, la cromatina tiene una orga-
nización más abierta, aunque no se ha esclarecido si esta organización
corresponde a la fibra de 30 nm o a 1a estructura "cr..lentas de collar" (figu-
ra 7 .2A). La intuición sugiere que debe haber una correspondencia e*tre
dominios estructurales y funcionales, y este concepto es avalado por la
localización de algunas MAR, que marcan los límites de un dominio
estructural, en el margen de un dominio funcional. Pero la corresponden-
cia no payece ser completa, porque algunos dominios estructurales contie-
nen genes que no son cxpresados al rnismo tiempo, y los límites de algunos
cle esos dominios residen dentro de genes.
lnsensible a DNasa I lnsensible a Drtla¡¡ I
Región sensible a DNas¿ I
 Dentro del núcleo

Lcs límites de los dorninios luncionales están marcados por secuencias

c,le 1-2 kb de longitud, llamadas aisladores. Las secuencias aislacloras
rkb
Irre ron descubiertas en Drosop hila y, ahora, se las ha identificaclo en una i. *l

seric de eucariontes. Las mejor estudiadas son e1 par de secuencias

denominadas scs y scs' (scs significa "estructura cromatínica especiali-
zadá"). que -se localizan a uno ),'otro lado de los dos genes lzsp7$ en el Figura Io"7 Secuencias aisladoras
genoma de la mosca de la frtita (figura 10'7). en el genoma de la mosca de la
fruta. El diagrama muestra la región
Lr:s aisladoles presentan clos propiedades especiales relacionadas con su del genoma de Drosophila que con-
papel como delimitadores de dominios luncionales. El primero es su tlene los dos genes hsp70.Las
secuencias ¿isladoras scs y scs' se
capecidad de superar el efecto posicional, que ocurre durante un expe- encuentran a uno y otro lado del par
rinlento de clonación de genes con un huésped eucarionte. E[ efecto de genes. Las flechas bajo los dos
pr:sicional se refiere a la variabilidad de la expresión de genes que se genes indican que éstos residen en
óbs".ru después que Se ha insertado un nuevo gen en un cl"onlosolrl¿r diferentes cadenas de Ia doble hélice
euc¿lrionte. Se considera que obeclece al carácter aleatorio del evento de y, por lo tanto, se transcriben en
inserción, que podría llevar al gen a una región de cromatina muy empa- direcciones opuestas.
quetada. donde será inactivo, o a una zona de cromatina abierta, donde
se expresará (figura 10.8A). Se demostró la capacidad de scs y scs'de
supel'ar el efecto posicional colocándolas a uno y otro lado de un gen
paia el color de ojos de la mosca de la fruta. Cuando estaba flanqueado
por los aisladores, este gen siempre mostraba alta expresiÓn al ser rein-
lertado en el genoma de Drosophilct, a diferencia de la expresión varia-
ble observada cuando se cionaba el gen sin los aisladores (figura l0.BB)'
La deducción de este experimento y otros relacionados es que los aisla-
dores pueden inducir modificaciones del empaquetamiento de la croma-
tina y, por ende, estabiecer un dominio funcional cuando se los inserta
en Lin nuevo sitio del genoma.

Asimismo, los aisladores mantienen la independencia de cada dominio fun- Figura IO.8 Efecto posicional- (A)
cional, 1o que impide la "convelsación cruzada" entt'e dominios adyacentes' Un gen clonado insertado en una
Si se escinde scs o scs' de su ubicación nortral, y se la reinserta entre un gen región de cromatina altamente empa-
quetada será inactivo, pero uno inser-
y los módulos reggiadot'es conlente arriba que contlolan la explesiÓn de ese
tado en cromatina abierta se
gen. el gen ya no responde a sus rróduios leguladore-c: se "¿¡ísla" de sus efec- expresará. (B) Resultados de experi-
tos (figr-rr:r i0.9A). Esla observación sugiere que, en sus posiciones nonna- mentos de clonación sin secuencias
les, lr¡s ai-sladores impiclen que los genes de un dominio sean inf'luidos por aisladoras (rojo) y con elias (azul).
los módulos regulaclores presentes en un dominio adyacente (figura 10.9R)' Cuando no hay aisladores, el nivel de
expresión del gen clonado es variable,
Todavía no se sabe cómo desempeñan su papel los aisladores, pero se pt'e- lo que depende de si se inserta en
cromatina enrpaquetada o abierta.
surna que el componel-rte luncional no es la secuencia ¿lisladot'¿l en sí
Cuando el gen está flanqueado por
misma, sino las proteínas de unión al DNA, como Su(FIw) de Drutsoplzilrt, aisladores, el nivel de expresión es
que -sü unen específicatnente a los aislacl<¡res. Estas protrínas, además de uniformemente alto, pues los aisl¿do-
unii'.Ee a los aisladores, forman asociaciones con la matriz nuclear, 1o que res establecen un dominio funcional
quizíts indique que los clominios funcion¿iles clue definen también son en el sitio de inserción.

(A) Efecto posicional iB) Los aisladores superan el eferto posicicnal

c tvu
.iñ
. "i:,.,..1. -l
'.il -.,...,-

G
,&r/*- ? ,','-¡..ti.:i
w,t**
o
i,i, dffi.lo,-o -&.
-x:r-:§&\\
o
§o
.F
/pry". §-
§
E
$¿
Nivel de expresión Alto nivel
.=
Z.
0
1234567
escaso o nulo de expresión Genes clonados
it¡ llirl.:iir:t,.. 1...11'
28? Capítulo 10 AcL,¿sc ai grnr:ma

Figura 10.9 Las aisladores rnantie- {Ai Los aisladores bloqueen l¿s señales reguladcras que controlan la expresién de genes
nen la independencia de un domi-
nio funcional. (A) Cuando se locaiiza
entre Lrn gen y sus modulos regulado- . Las señales reguladoras
influyen en la expresión de genes
r:s ccn,enle ¿rr'b¿, u¡¿ s:.-rte:ci¿ ¿,;,
ladora impide que las señales
rct,rl¿dore' al;¿nc:^ qi ger.. (Br Er !M \4q.!3e@.

sus pcsiciones norn¿ies. los a'sl¿do- Módulos reguladores Cen

res iirrpiden la conversación cruzada
entre dominios funcionales, de n-tane-
ra que los médulos reguladores de un
gen no influyen en la expresión de un Señales bioqueadas
gen de un dominio diferente.

;r;;&z;ñi;&
-8 ;,
Aislador

{B) Los aisladores impiden la conversacién «uzada entre dominios funrionales

sí Sí

ñ ñ

clominios estructr.rales dentri: de la crom¿itina. Ést¿r es una hipótesis inte-

l'es¿lnte quL' st: puede vinculal'con la capacidad c1e los aisladoles de est¿rble-
cet'regiones de clotlatina abi*rtas e impeciir la convcrs¿tción cruzacla entre
dr:minios f'¡¡ncion¿iles, pelo it-rplica que los aisladores contiencn secucncias
I\,IAR. lo que no ha sido plobado. Pi:l'lo t¿lnto, la eqr:ivalencia entre clomi-
nios funcion:,i1es y estructurales sigur siendo esquiva.

,4r'qi;,.;*:; t'iii,:li',¿:t::s it;*r-'.,t,,¡i*,iirl; t:{:¡ili.üí.r¡t ir:#iatr¡*.i t!::: t_*ttrt,. _: :: .-..:-.

La fonlación y el mantenimiento de un dominio luncional abierto. por:

lo nrenr:s en cierlos casos, depende de una secuenci¿r de DNA denotli-
Figura 1O.10 Los sitios hipersensi-
bles a DNasa I indican la posición
nada región cfe controtr de locus o LCR. A1 igual que los aisladores, una
de la región de control de locus LCR pr-rcde superar el e{'ecto posicionzrl cuando sc liga a un nue\ro gel}
para el complejo (cluster) de genes qlle es inseltaclo ün u1r clollosoma eucarionte. A clifel'encia de los aisla- i
de p-globina humana. Hay una serie dores. una LCR tau:bién eslilt"lul¿i la expresión de gene-r contenidos clen- {
de sitios hipersensibles en las 20 kb tl'o de su dorninio iuncional. t
de DNA corriente arriba del comienzo
del complejo de genes de p-globina, I
los cuales ffiarcan la posición de la Las LCI?" fuelon descubieltas clliraÍlre L1n estudio cle los genes de |3-glo- l
región de control de locus. Se obser- bina humana (secciór-r 7.?.3) y, en la actualidad, se consirlel.a que parti- r
van otros sitios hipersensibles inme- cipan en lzr explesióu de nruclros gcnes que sólo solr ¿lctiyos en algur-ros f
diatamente corriente arriba de cada tejiclos o dulante ciertos estadios clel c1esarrol1o. La LCli. r1e globina se t)
gen, en la posición donde la RNA loc¿iliz¿r en una ertensión de DNA cle a1::ecledol de 12 kb c1e longitr-rd. i
polimerasa se une ¿l DNA. Estos sitios
I
hipersensibles son específicos para
diferentes estadios de desarrollo v l
sólo se los observa durante la etapa {:
en la que el gen adyacente es ¿ctivo. Sifi*s i"ripers**sibi*s {i
La región de 60 kb aqui mostrada ;rlll1'á*E¿l q & üs § p complejode b
representa todo el dominio funcional ¡;xffiffi¿:,W;ffiry
!...
a;;xffi_ti genesde ll
de p-globina. Véase más información ...................

Región de conirol l3-globina l;

sobre la regulación madurativa de la de locus §l
expresión del complejo de genes de 1..... ........... I

B-globina en la figura 7.19. ro kb

 Dentro del núcleo 283

Figura 10. 11 Dos maneras en las

que la estructura de la cromatina
puede influir en la expresión de
genes. Una región de cromatina no
ernpaquetad¿ en ld que los gere:
son accesibl-^s es flanqueada por Ccs
segmentos más compactos. Dentro
de la región no empaquetada, la posi-
ción de los nucieosomas influye en la
expresión génica. A la izqurerda, los
nucleosomas muestran espaciamien:c
regular, como en la típica estructura
"en cuentas de ccllar". A l¿ derecha, la
posición de los nrcleosomas ha cam-
biado y ha quedado expuesta una
ESTRUCTURA A ESTRUCTURA B corta extensión de DNA, de alrededor
Nucleosomas Nucleosomas de 3O0 pb de longitud.
regularmente reposicionados
espaciados

ubicad¿i cordente alriba cle los genes del dominio h"incional de p-giobi-
na 60 kb (ligura 10.10). Al principio, la LCR se identificó dur"ante
c1c
estuclios de pacientes con talasemia, una enfermedad hematológica
secur")daria ¿i cl*fectos de las pl'oteínas cr- o B-globir:a. Nluchas talasemias
se clcl¡en a mutaciones de las resiones de codiiicación de los genes de
globina, pero 111'Ias pocas fueron mapeadas eÍ] una región cle 12 kb
corriente arriba del conrplejo {cluster\ de genes de B-globin:i, la región
llauracla ahora LCR. La capacidad cle causal talasemi¿r de las mutaciones
cle la LCR es una clar'¿i incticación de que la alteración de la LCR provo-
ca Lrna pórdida de expresión del gen cle globina.

El estudio nrás detallado de la LCR del gen de B-globina ha mosraclo

quc contiene cinco sitios hipersensil,tres a Di§asa I distintos, regiones
col't¿is de DNA qlle son escindidas pol DNasa I con más facilidad que
otras pal'tes del donlinio funcional. Se cr:nsidela que estcs sitios coil"lci-
den ci:n posiciones en las que hay mociificaciói: o ar:sencia de nucleoso-
nl¿rs _y qlle, por 1o tanto. son accesibles a las pl'oteínas cle unión al DN{;\.
Estas ploteín¿ls y r-)o la secuencia de DNA de la LCR, controlan la estl'uc-
tura de la cromatina dentro clel dominio funcional. No se sabe con e,\ac-
titucl cle qué rranci:a, ni en respuest¿i a qué señales bioquírnica.s.

También hay sitios hipersensibies a DN¿lsa I inmediatalnente colriente

arribr de cada uno de 1os genes del dominio funcional de B-globina
(r,éase figura 10.10) en las posiciones donde se ensainbla el complejo de
iniciación de ia tlansclipción en el DNA (sección l1 .2.2). Estas posicio-
nes cle ensamblaje ilustran una c¿rracterística interesante de los sitios
hipersensibles a DNasa I: no son cornponentes invaliables de un domi-
nio funcional. Cabe recordar que los diferentes genes c1e globina de tipo-
B se expresan en distintos estadios clel ciclo de desarrollo humano: e es
activo en el embrión temprano; Cy y A.¿, er:r el feto; y E y F, en el adulto
(véase figula 7.19). Sólo cuando el gerr es activo, un sitio hipersensible
Ilal'ca su posición de ensamblaje para el complejo de iniciación de la
transcripción. Al principio, se pensaba que esto era un efecto de \a
expresión diferenciai de estos genes; en otras palabras, que en ausencia
de activiclad del gen, los nucleosomas podían cubrir el sitio de ensarn-
blaje, plesumiblernente para ser empujados a un lado cuando llegase eI
nlomento de expresión del gen. Ahora, se considera que la presencia o
la ausenci¿i de nucleosomas es una c{tusa de expresión del gen y que áste
se clesactiva si los nucleosomas cubren el sitio de ensamblaje, o se acti-
va si hay un acceso abielto al sitio.
284 Capítulo l0 Acceso al genoma

Figura I0.12 Posíciones en las que se TJ

unen grupos acetil dentro de las H2A SC RCKQCCKARAKAKTRS S R rl
t0 20
regiones N-terminales de las cuatro
histonas centrales. Cada secuencia
,1't :. .t..
:,
.t,.
comienza con el aminoácido N-terminal.
H2B PE P5 KSAPAP KKCS KKA I T KA*..,
l0 20

H3 ARTKQTARK 5 T C C K A P R K Q L A T K A R K 5 A P.."'*-'"'
t0 20

:. l:. 1: -

H4 S C R C KG 6 KG L C K GC A K R H R K***,
r0 20

m
'!

:§"3 ffimd§'§*mme§*m ¿§* üx #r*,sv¡ffie§*ir

; *i{p,1¡#m§wm d*§ gmrp*ffi§ffi
En las secciones previas se presentaron dos maneras a través de ias cua-
,'.L;
1esla estructura de la cromatina puede influir en la expresión del geno-
r§e
nra (figura 10.11):
pr
* El grado de empaquetamiento de la cromatina presentado por un
,u§
segmento de un crornosoma deternlina si los genes de ese segmento §]
se expfesan o no. b,
', Si un gen es accesible, su transcripción es influida pol el car'ácter y ',§f
pr
la posicióir precisos de los nucleosomas de la región doncie se enseül-
C(
blará el compiejo de iniciación de la transcripción.
la
n¿
En los últimos años, ha habido avances significativos en el conocimien- SC

to de ambos tipos de modificación c1e la cromatina. Comenzaremos por ,Qt

1os procesos que inciclen en el emp¿lquetamiento de la cromatina. hi
hi

]f {-i"1" i ifirqi}i$§¿:,:;i{¡*y& q§{rfi;ü,*

&x* fu}*t*¡:x* v:lw ,CI

Los nucieosomas pa1'ecen ser los detelminantes plimarios de la activi- fl.:

clad del genoma en los eucariontes, no sólo en viltucl de su posició¡r en nt
qr
le,

Figura 'l O.l3 Dos vistas del octáme-

ro central del nucleosoma. La visia
de la izquierda es descendente desde
la parte superior del octámero en
forma de barril; la vista cle l¡ derecha
es lateral. Se ih-rstr¿n en marrón y
verde las dos cadenas de la doble
hélice de DNA, enrolladas alrededor
del octán,e.o. Este compr(:nde un
tetrámero central de dos subunidades
de histona H3 (azul) y Cos de histone
H4 (verde brillante), rnás un par de
dimeros H2A (amarillo)-H2B (rojo),
uno encirn¿ y uno debajo del tetrá-
mero central. Obsérvense las colas
N-terminal de las proteÍnes histon¿s,
que protruyen del octámero central.
Reimpreso con autorizaciórr de Luger
et ol., (199tr), Nature, 389,251-260.
w
'''lrr''

Modilicación de la cromatina y expresién del genoma 285

iJlitl ci:ldena de DNA, sino tan-rbién polque la estl"uctura química precisa

de 1¿is ploteínas histonas contenidas dentro de los nucleosomas es el
principal factor que determina el gr:ado de empaquetamiento presenta-
á,: por un segmento de cromatina.

{"* ¿:r*filscidr; d* l*rs Sisf*mr*s imfl*;y* #?? ¿??{.r§&§s r1#*d*s

$#t/*clr#s" t#r?'?# f*r exPr*sídirl d*J s¡*§isv??#
De los diversos tipos de modificación que pueden sufrir 1as proteínas
histona 1a mejor estudiada es la aeetilación de histonas: la unión de gru-
pos acetil a aminoácidos iisina en las regiones N-terminales de cada una
de las molécu1as cen1¡ales (figura 10.12). Estos extremos N forman
colas que protruyen del octámero central del nucleosoma (figura 10.13),
y su aéetiláción reduce la afinidad de las histonas por el DNA y, posible-
*.nt., reduce también la Ínteracción entre nucleosomas individuales, 1o
que clesestabiliza la fibra de cromatina de 30 nm. Por 1o generai, las his-
ttnas de la heterocromatina no están acetiladas, mientras que las de los
dominios funcionales sí, una clara indicación de que este tipo de modi-
ficación está reiacionada con el empaquetamiento del DNA.

La importancia de la acetiiaciÓn de histonas para 1a expresión del genoma

se ilesiacó en 1996 cuando, tras varios años de pruebas, se identificaron los
primeros ejemplos de histonas acetiltransferasas (HAT), las enzimas que
ág¡'egan glupos acetil a las histonas. Se advirtió que algunas proteínas que
ejercían influencias importantes sobre la expresión del genoma ptesenta-
ban actividad de HAT. Por ejemplo, una de las ptimeras HAT en ser des-
cubiertas, la proteína Tetrahymenr¿ denominada p55, es homóloga a la
proteína de levadura GCN5, que se sabía que activaba e1 ensamblaje del
-omplejo
de iniciación de la transcripciÓn (sección 11.3.2), De modo simi-
lar li proteína de mamíferos llamada p300/CBP, a la que se le había asig-
naclo una participación olalamente definida en la activación de diversos
genes, resultó Ser una HAL Estas obser-vaciones, más la demostración de
que cliferentes tipos de céiula presentan distintos patrones de acetilación de
histc,nus, subrayan el papel prominente que desempeña la acetilación de
histonas en la regulación de la expresión del genoma.

Cada HAT puecle acetilar histonas en el tubo cle ensayo, pero la mayoúa tiene
acti.,,iclad insignificante en los nucleosom¿ls intactos, lo que indica que, en el
núcleo, las HAT no tlabajan, casi sin duda, de lrlanerá independiente, sino
que forman complejos multiproteicos, como los complejos SAGA y ADA de
levadura, y el complejo TFTC de los seres humanos. Estos complejos son típi-
cos dc las glandes estluctul'as n-rultiproteicas que catalizan y regulan 1os dis-
tintos pasos de expresión de1 genoma, de las cuaies hallaremos muchos
ejenlpl:s a medida que proglesemos por 1os siguientes capítulos. Por ejem-
plo. SAGA comprende no menos de 15 proteínas con una lnasa molecular
coinh,inada cle 1,8 millones. El complejo mide l8 x 28 nm, 1o qr-re significa
que es más grande que el octáme1o central del nucleosoma que. con su l)NA
asociado, eJd" t I x 13 nm, y compalable en una dimensión con la fibra de
cromatina de 30 nm. Alipral que GCN5 -la prcteína con actividad de HAT-
el con:rplejo SAGA contiene un conjunto de prgteínas reiacionadas con la
proteína cle unión a TAIA (TBP), que inicia el proceso de transcripción de
un gen (sección 11.2.3\, así como cinco de los factores asociados con TBP
(TAh), que ayudan a la TBP a cumplir su papel. La complejidad de SAGA y
otlos complejos HAT, y la presencia dentro de estos complejos de proteínas
con lunciones definidas en la iniciación de la expresión de genes, indican que
1os eventos indiüduales que determiuan la activación de un gen estáin irtima-
mente relacionados, y que la acetilación de histonas es una parte integral,
pel* sólo una parte, del proceso global.
 M'-'
:'4,.,...:. : '

Capítulo lo Acceso al genoma

.. ,,t , ....'
Ha-v por meni:s cinco lan-rilias diferentes de proteínas HAT. Las ace-
1o
tiltransferasas relacionadas con GCI{5. o GN,{T, que son componentes
de SGA, ADA y TFTC, se asocian claramente con la transcripciÓn de ..
genes, pero también participan en la reparación de algunos tipos dr
DNA dañado, en particulclr roturos dc la doble cadena y lesiones secun-
darias a irladiación ultravioleta (sección 16.2.4). Una segunda far-ni1i;i
de HAT, denominada NIYST por las letras iniciales de cuatro de sus pro-
teínas, participa, de modo sir:rilar, en la activación de la transcripción y
la reparación del DNA, y también ha sido irnplicada en el control del
ciclo celulal:, aunque esto puede ser sólo otro aspecto de la ftnciÓn de
reparación del DNA. pues el ciclo celular se interrumpe ante un daño
extenso del genoma (sección 15.3.2). Diferentes complejos parecen ¿ice-
tilar distintas histonas; algunos también pueden acetilar otras proteínas
involucradas en la expresión del genoma, col1lo los factores de tr:anscrip-
ción genelales TFIIE y TFIIF, que se detallan en la secciÓn i1.2.f. For
lo tanto, las HAT están sulgiendo como proteínas versátiles que pueden
cumplir diversas funciones en la expresión, la replicación y el manteni-
miento del genoma.

.-., t.,....._-.- ,i.: . .-- ... ':..'.;.'). ) ¡"-.,-.,:.-..r;1.1;-'-'.

La activación de los genes debe ser reversibie; de lo contrario, ios genes

activados permanecerán activos en fonrla permanente. Por ende, no sor-
prende que haya un conjunto de enzimas capaces de eliminar los grtlpos
acetil de 1as colas de histona, k: que anula los efectos activadores de la
transcripción de las HAT, descritos antes. Ésta es la función de las his'
tonas desacetilasas (HDAC). La relación entre actividad de IIDAC y
silenciamiento de genes se estableció en 1996, cuando se comprobó que
la HDACI de mamíferos, Ia primera de estas enzimas en sel: descubier-
tas, estaba relacionada con la proteína de levaclura Rpd3, que se sabía
que reprimía ia transu:ipción. Por 1o tanto, este vínculo entre desaceti-
lación de histonas y represión de la transcripción se estableció de ia
misma manera que el vínculo entre acetilación y activación: mostlando
clue dos proteínas que, al principio, se crcía quc te'nían clifetentes activi-
dades estaban. de hecho, relacionadas. Estos son buenos eiemplos del
vaiol del análisis de homología en estudios de función de genes y pt'ote-
ínas (sección 5.2.1).

Las HDAC, al iguai que las HAT, integran complejos rnultipr:oteicos' ,,,
Uno de elios es el complejo SinS de los mamíferos, que complende no ,,..,

rrenos de siete pr:oteínas, como HDACI y HDAC2, junto con otl'as que
no presentan actividad de desacetilasa, pero que cumplen funciotres
auxiliares esenciales para el proceso. Por ejemplo, RbAp46 y RbAp'|S
son proteínas auxiliares, n-liembros del complejo Sin5, y se considera
que contribuyen a la capacidad de unión a las histonas. Se las reconoció ,,;,:;,.:,,

por primera vez por su asociación con la pt'oteína del retinoblastr:ma, ..

que controla la proliferación ceiular porque inhibe la expresión de diver'-
sos genes hasta que se requieren sus actividades y que, al mutal, provo-
ca cánc".. Esta relación entre SinS y una proteína implicada en el cánct-'r
apoItaunpoderosoaIgumentosobre1aimportanciac1eladesacetilación
dehistonasenelsi1enciamientodegenes.otrosconrplejosdedesaceti
1aciónsonNuRDdemamíferoS,quecombinaHDAC1yHDAC2conun
conjunto diferentes de proteínas auxiliares, y Sir2 de levadura, que difie-
::

re de otras HDAC porque tiene un requerimiento de energía. Las carac-

terísticas distintivas de Sir2 muestran que las HDAC son más divelsas
de lo que se advirtió al pr:incipio, 1o que indica, quizá, que todavía rcs-
tan por descubrir nuevos papeles de la desacetilación de histonas.
 Modificación de la crornatina y expresién del genoma 2S7

..:.:: :'.,a,:. i.l, .i;l l' i.l t:ji i.li. '1,.:|.

I Figura 10.14 Modificaciones de las
1:,
ARTKQTARKS TGCKAP KKQLA TKARK§A P **' regiones N-terminales de las histo-
IO nas H3 y H4 de mamíferos. Se
muestran todas las modificaciones
i' ,r,.: ¡1,i: ¡' ..,1
| conocid¿s que ocurren en estas regio-
:ii: I I' nes. Abreviaturas: Ac¡ acetilación;
S6R6KC6KCt 6KCCAK RHRK*," 20 Me, metilación; P, fosforiiación.
tü

Los estudios de los complejos HDAC est¿rn comenzando a revelar vínculos

entre los diferentes mecanismos de activación y silenciamiento de1 genoma.
Tanto Sin3 como NuRD contienen proteínas que se unen al DNA metila-
do tsección 10.3.1) y NuRD contiene proteínas muy similares a componen-
tes clei complejo de remodelaciÓn de nucleosomas Swi/Snf (sección
10.2.2). De hecho, NuRD no actúa colno un aparato típico de remodela-
ción de nucleosomas in vitro. Sin duda, nuevas investigaciones revelarán
ot1'os vínculos entre 1o qr"re consideramos, en la actualidad, diferentes tipos
de sistemas de modificación de la cromatina pero que, en realidad, pueden
se¡ sólo distintas facetas de un gran diseño único.
rffii:i*
'ffi§:i.i:§

:,i.§l:l.:49
.!W,.-aa§1, La acetilación/desacetilación de lisina es la fonna mejor estudiada de
:W.;., mt¡dificación de histon¿ls, pero no es el único tipo. Se conocen otras tres
iii$,:¿ili:
clases de modificación covalente:
.* i:r§a
¡§§iliií::
* §,{etilación de residuos lisina y arginina de las regiones N-terminal de
las histonas H3 y H4. En un principio, se consideraba que la metila-
ción era irreversible y, por io tanto, respr:nsable de cambios perma-
:i&ialiü:l.
nentes de la estÍuctura de la cromatina. El descr-rbrimiento de
.#--:.'§ enzimas que desmetilan los residuos lisina y arginina ha cuestionado
este concepto, aunque aítn se acepta que los ef'ectos de la metilaciÓn
son bastante prolongados.
jffir§
* Fosforilación de resicluos serina de las regiones N-terminales de
I"I2A, H2B, H3 Y H4,

r:§:ils¡
u Ubicuitinación cle resiciuos iisina de 1os extremos C de H2A v H2B.
:.é*lli¡:¡*ii Esta moclificación consiste en el aglegaclo de la pequeña proteína
,|.&:'§Éi.'.
ccmún ("ubicua"), denomin¿tda utricuitina, o una proteína reiaciona-
da bastante inúti1 llarnada §UMO.
.:rl$. ) l,iiü

Al igual que la acetil¿rción,estos otros tipos de modificación infiuyen

en la estructura cle la cromatina y ejercen una repercusión signilicati-
..ffi:rriul! v¿i .qobre 1a actividad celuiar. Por ejemplo, 1a fosfolilación cle la histo-
i,,*.:,r:ii! n¿i l{3
y de la otra histr:na ligador:a se ha asociaclo con 1a formación de
cr'ornosomas en nretafase. y lei ubicuitinación de la histona FI2B forma
.:r3,aa:f;
par:te del papel general que desempeña la ubicuitina en el control del
:#ti:$.
ciclo celular. Resultan de particular interés los efectos de ia metilación
de un par de aminoácidos lisin¿i en ia cuarta y la novena posición res-
r*A::ré: pecto del extremo N de ia histona I-13. La metilación de lisina-9 forma
un sitio de unión parer la proteína FIP1. que inciuce empaquetamientr:
tlt&:riqi:l
de 1a clomatina y -silencia 1a expresión de genes, pero este evento es
bloqueado por: la presencia de dos o tl'es gl'upos metilo unidos a lisi-
iiliiÍti,::üiri:
ir*B.rjliii.,¡: na-4. Pc¡r 1o tanto, 1a metilación de lisina-4 plomr:eve un¿l estructur:a
.:Iit::§j
de cl'omatina abierta y se a.socia con genes activos. Dentro del domi-
nio funcioi-lal de p-globiira y, plobablemente, en otras pa1'tes, 1a meti-
JES*#,}]
,.#itri1, lación de lisina-4 también impide la unión de la NuRD desacetilasa a
la histona H3, lo que galantiza clue esta histona pertÍ)anezca acetilada.
¿\sí, la metilación clc lisina-4 pr-rede actuar junto con la acetilación c1e
histonas para activar regiones cle cromatina.
 Capítulo. l0 Acceso al genorna

Figura 10.15 El patrón de modifica- Crom0soma 2l

cion¿s de hístonas está relacionado Lisina-4 dimetilada tr I
con la actividad génica. Se muestran Lisina-4 trimetilada i I

segmentos de los cromosomas Lisinas-9/l 4 acetiladas

hum¿nos 21 y 22, cada uno de I 0O
kb de longitud. Se ilustran las regio- IFN6R2
C2lorf55
nes enriquecidas en lisina-4 dimetila-
da, lisina-4 trimetil¿da, y lisina-9 y
Cromosoma 22
lisin¿-l 4 acetiiad¿s de fibroblastos
pulmonares respecto de las localiza- Lisina-4 dimetilada I I
ciones de genes conocidos. Las fie- Lisina-4 trimetilad a
ch¿s indican ias direcciones en las Lis¡nas-9/l 4 acetiladas
que se transcriben los genes. i.firr..---.1i*++
HIRA T+ LOCr289 cDc45L
MRPL4O

En conjunto, se sabe que 29 sitios de las regiones N- y C-ter:ninai de ias

cuatro histonas centrales están sujetos a modificación covalente (figua
10.14). Nuestro conocimiento cada vez mayor sobre las diversas modifica-
ciones de histonas que se producen y de la manera como distinias modifi-
caciones trabajan juntas, ha ilevado a sugerir que hay un cédigo de
histonas, mediante el cual el patrón de modificaciones químicas especiflca
qué regiones del genoma se expresan en un momento particular e impcne
otros aspectos de la biología del genoma, como la reparación de sitios daña-
dos y la coordinación de ia replicación del genoma con el ciclo celular. La
idea todavía no está probada, pero es evidente que el patrón de modifica-
ciones de histonas específicas dentro del genoma está íntimamente víncu-
Lft),*j$;s lado con la actividad génica. Por ejemplo, estudios de los cromosornas
humanos 21. y 22 han mostrado que regiones de estos crornosomas donde
la lisina-4 de la histona H3 está trimetilada y la lisina-9 y la lisina-14 están
acetiladas corresponden a Los puntos iniciales de transcripción de genes
Activación por activos y que, a veces, también se observa lisina-4 din:etilada en estas regio-
6ACA nes (figura 10.15). Al igual que en todos los aspectos de modificación de
la cromatina, la cuestión clave es distilguir causa de efecto: ¿estos patro-
nes de modificación de histonas son la razón por la cuai estos genes parti-
culares son activos o son un mero producto de degradación de ios procesos
responsables de su activación?

Figura 10.16 La activación del gen
hspTA se asocia con la creación de
una región hipersensible a DNasa L
El diagrama muestra el reposiciona-
miento de nucleosomas, inmediata-
mente corriente aniba del comienzo
del gen, cuando éste se activa.
§&"x"3 Xxx§§xx*xcs§w &x §« resmmde§«x§Sx* d* max*§wffi§&§ssffis
ess §s exp§*s§&m de§ &esses&e
El segundo tipo de modificación de la cromatina que puede influir en ia
expresión del genoma es la rernodelación de nucleossmas. Este término
hace referencia a la modificación o el reposicionamiento de nucleosomas
dentro de una corta región del genoma, de rnanera que las proteínas de

Remodelación Deslizamiento Transferencia

..

ry
tii i \ \¡
Figura 1O.17 Remodelación, -W':'
deslizamiento y transferencia de ,w.1.
r&É:i,,
,ffii::,:
nucleosomas.
 Modificación de la cromatina y expresión del genoma 289

L:ni{in a1 DNA puedan acceclel a sus sitios de unión. E,sto no parece ser
un rcquisito esencial para 1a transcilpción de todos los genes y por 1o
ntsilüs en algunos casos, es posible que una ploteína que activa la expre-
siún r1e un gen ejerza s¡: efecto por unión a las supelficies de nucler:so-
nlas o por algún tipo de interacción con el DNA ligador, sln afect¿lt'las
pu:iciones de los nucleosomas. En oiros ejempios. el reposicionanliento
de los nucleosomas ha rnostrado con claridad ser L1n prerrequisito para
la activación de genes. Pr:r: ejer:nplo, 1a transctipción de1 gen hsp70 de
Drosopltilct melunogctstel', que codifica una pt'oteína involucracla en e1
plegamiento de otlas proteínas (sección 15.3.1), es activada por ia pro-
teína GAGA en respuesta a L1n choque térmico. La activación se asocia
con la creación de una región hipelsensible a Dl\asa I (sección 10.1.2)
corriente alliba de hsp70. una eviclente indicación de que se han despla-
zaCr', los nucieosontas de esta región y ha quedado expucsto un segmen-
to c1e DNA desnudo (figura 10.16).

A clifelencia de la acetilación y las otras modificaciones químicas anali-

zadas en la sección anterioÍ, la I'emodelación de nucleosomas no irnpli-
c¿l altelaciones covalentes de las moléculas de histona. En cambio, es
indr-rcida pol'un proceso dependiente de energía que debilita el contac-
to entre ei nucleosoma y el DNA con el que se asocia. Puede haber tles
tip.os cle cambios (figula 10.17):
* Remodelación, en sentid{l estdcto, implica una modificación de la
estluctura del nucleosorna, pero ningún cambio rie su posición. l'lo
se conoce el carácter de ia modificación estt'uctural, pero cuando se
la induce in vitro, el resultado es la cluplicación del tamaño del nucie-
h1
osoma y una mayor sensibiiidad a la DNasa del DNA unido. t-- i
FI
* E1 deslizamiento, o desplazamiento cls, desplaza físicamente a1
tr1
t-l
L-!
nucleosorna a 1o largo clei DNA. l_l
{t
*, I-a transferencia, o desplazarniento trans, determina que el nucleoso-
ma pase a una segllnda n-rolécula cle DNA o a una parte no ad5,acen- I¡ Replicación del DNA

te de Ia rnisnra molécula.
A1 igual que las hislonas acetiltranslerasas, las proteínas lesponsables
ttr'-1
lLj

dr la rerlodelaciór'r de nucleosomas tlabajan juntas en grandes com- ^, l- 1

1.,
-j
]:'.J
plejos. Uno de ellos es Swi/Snl, que está formado por no tnenos de 1 ,. l:
1 rl.:il
prr:teínas y está presente en muchos eucariontes. Por ahora, poco se . *1
ts! :a "l
sabe ¿rcelca de la manera corrro Swi/Snf, o cualquier otro conrplejo de Cadena --f1: .i-:¡
i. -l
relnodelación de nucleosomas, cumple su función de mejorat'el acce- progenitora
su al genorla. Ninguno de los componentes de Srvi/Snf parece tener ¡ Metilación

c:rpacidad de unión al DNA, pol Io que el complejo debe de ser p1'o- I *I

de manteni-
miento
visto a su sitio diana pol otras proteínas. Se han detectado interaccio- '.r d-,t
L-¡ ",r r-*.¡
nes entre Swi/Snf y HAT, lo que sugiere que la remodelación de ' s* L) -l
nucleosornas podría tenei: lugar junto con la acetilación de histonas.
"1 .-l
I
rI
q-} . *.1
E,sta es una hipótesis intelesante pol'que vincula las dos actividades
que, en la actuaiidad, se consideran básicas para la activación del §-"ti
&--a:
r--l
r--l
gei-loma. Perc esta hipótesis adolece de probierlas, porque Swi/Snf no I Metilación
p¿r1'ece ejelcel un efecto global sobre todo el genorna, sino que influye +I d" roro
en la expresión de geries sólo en una cantidad limitada de posiciones: -l
tn el caso de 1a levadwa, quizá no er1 más del 69/a de todos los genes -l
-l
del genoma. Esta observación sugiere que las interacciones más impor- -l
tl:...:t
lantes de Su,i/Snf tal vez no se¿in con HAT, qr-re trabajan en todo el :,.-- I

genorr¿), sino con otras proteínas que tienen como diana un conjunto
limitado dc genes. Las candidatas más pr:obables para estas otras plo-
teínas son los ¿rctiyadores de 1a tlanscripción (sección 11.3.2), cada
ur:o de los cuales es específico para un pequeño núrnero de genes y Figura 1O.18 Metilación de mante-
algunos de cllos folnlan asoci¿rciones con Swi/Snf in vitro. nimiento y metilación de novo.

Capítulo l0 Acceso al genoma
< lon--
z.
§ac
'ü
ñ .
't
9-^
§o
c genom¿t, quizá de cromosornas enteros, .v el estado mcdificado es her*-
§e
s?
Zo
468
Edad del embrión (días)
Figura I0"I9 Evidencia experimental
de que las DNA metiltransferasas
5a y 5b son metilasas de novo. El
gráfico muestra el nivel globai de
metilación del DNA en embriones de
ratones normales (tipo silvestre) y en
ratones con desactivación génica
$nockout) de Dnmt3. En los embrio-
nes normales, el nivel de metil¿ción
del DNA aumenta debido a la metila-
ción de novo llevada a cabo por las
DNA metiltransferasas 3a y 5b, pero
en los embriones knockouf, el nivel
de metilación del DNA se mantiene
en su valor original.
',W§
',.', ,
, , ,., ,'.
l'.
.:
*tr"§ §ffiwd&$§qmqám;r r.:.1 #Fiñ y esffitr**I** l.r
" ! #§ {}&E§É 1! & 4&
También se pueden lograr modificaciones importantes cle la acriviclad
del genorna a tlavés de cambios quimicos del propio DNA. Estos cam-
bios se asoci¿ln con el silenciar¡iento semipermaner'lte cle regiones clel
daclo, a menudo, por ia plogenie que surge cle la división celu1ar. Las
modificaciones se producen por rnetilación del DI{A.
: r1 y y fl,1 -*-: ..- .J^! , * -,,1i-*:"'.* ,{o! f'tl" '
En los euca¡'iontes, citosina de las moléculas de DNA crorlo-
1as bases
sómic<¡ a veces son modificadas a 5-metilcitosina por e1 agregaclo cle gru-
pos metilo, por enzimas denon-iinadas DNA metiltransf'erasas (vóase
figura 3.29). La metil¿rción de la citosina es bast¿rnte ra1'a en los euca-
riontes inferiores. pero en los veltebrados está metilado hasta ei 1ü9,á
del nírmero total de bases citosina de un genoma y en 1os vegetales
puede alcanzar el 509á. Este patrón de metilación n<¡ es aleatorio sino
que se limita a la citosina de algunas copias de las secuencias 5'-CG-3'
1,, en los vegetales, 5'-CNIG-3'. Se han distinguido dos tipos cie actividad
de metilación (figura 10.18). La primera es la metilación de manteni-
rniento que, tras la replicación clel ge11oflra, es responsable de ¿Igregar
grupos metilo a la cadena recién sintetizada de Dt-r-A en posiciones
opuestas a los sitir:s metilados de ia cadena progenitora (sección
16.2.3). Por 1o tanto, la actividad de mantenimiento garantiza q:-re ias
dos moléculas de DNA hijas conserven el p:rtrón c1e metilación de la
molécula progenitora, 1o que signilica que éste se puede herecJar después
cle la división celular. La segunda actividad es la metila ctón de no1)o, qse
añade grupos metilo en posiciones totalmente nue'r'as y, así, cambia el
patrón de metilación en una región iocalizad¿r del genoma.
Las DNA metiltlansferasas han siclo muv estudiad¿rs y sr:n similarfs en
torlos los orgilnismos, desde las bactelias (que metilan su DNA p¿]ra pro-
tegerlo de l:r degradación por sus endonucleasas de restricción, l¡ clue
les permite a estas enzimas dir:igirse al DNA dei bacteriólago invasor)
hasta lr:s mamíferos, como los seles humanos. Si bier-r hay numerosos
tr:abajos con estas enzimas, durante varios años, I¿i aparerite presencia dc
sólo una DNA metiltr¿ursf-elasa en las células cle mamíf'eros lue algo cles-
concert¿]nte. Esta enzima, llamada ahora DNA metiltransfetasa I
(Dnnrtl ), es respr:nsable de la metilación de nlantenimiento, pero no de ,:I
',§
la metilación de novo, pol'que los ratones con desactivación gónica
d
tlcnockout) de Dnmtl ptieden, aun así. llcval a cabo metilación tle not'o.
como levela su capacidaci cle añadir grupos nletik¡ a1 genoma de DNA
.d
de un retrovirus infectante. Durants fines de la dÉcada cle 1990, época
en la que la mayoría de los genes humanos y los genomas cle ratún se t
,l;
habían vuelto accesibles como etiquetas de secuencias expresitc.las (""ec-
ción 5.3.3), las búsquedas en las bases de clatos pertinentes cle homó1o- ,tl
gos cle lJnrntl revelaron clos genes -DnmtSa 5,'DnmtSb- que, ahora se F
sabe que codifican ias metiltlansferasas tle nctvts. Los latones con rstos
genes desactivados no pueden completar sus vías de desarrollo: ac¡r.rcllos
fon ur-, gen Dnmt.3b clesactivaclo mueren a los pocos días clesputis clcl
nacimiento 5, 1os que carecen cle Dnmtia sobreviven só1o I a 2 seirranas
más. E1 análisis de los patl'ones de metilación ciel DNA de ios emblic¡nes
clulante el per'íoclo anterior a la muerte mLlestra que, en los ratones
hnckout, el grado cle metilación clel DNA es sólo 1a rnitaci del observa'
clo en los ¡atones nor"males (figur:a t 0. 1 9 ), lo que inclica que hay metiln-
 Modificación del DNA y expresión del genoma 29r

lsla CpC Figura 10.20 Un modelo de la rela-

ción entre metilación del DNA y
expresión del genoma. La metilación
de la isla CpC corriente arriba de un
gen aporla señales de reconocimiento
¡t{e §l1e para los componentes proteína de
i I
Á!-.-,a'- ed.*s '-- rr^+ir--,',
Meülación
uc to r)ta LPU
unión a metil-CpC (MeCP) del com-
plejo histona desacetilasa (HDAC). El
HDAC modifica la cromatina de la
I
--+ región de la isla CpC y, por io tanto,
&l*r-'r1,ll desactiva el gen. Obsérvese que las
l
,e*r*rr.*ffirh(
¡¿ M, *¡ HDACseune posiciones relativas y los tamaños de
a través de MeCp
Ia isla CpC y el gen no están

I dibujados a escala.

Cromatina empaquetada
4[fltflnlr
,:ción de mantenimiento, resultante de la actividad de Dnmt1, pero está
,'ausente la metilación d,e novo, y estos ratones no presentan, por ende,
gún aumento del nivel global de metilación del DNA con el tiempo.

La metilación tanto de mantenimiento como de novo determina la repre-

sión de la actividad génica. Esto se ha mostrado en experimentos de clo-
nación en los cuales se introdujeron genes metilados o no metilados en
. óélulas y se midieron sus niveles de expresión: no hay expresión si la
.¡secuencia de DNA está metilada. La relación con la expresión de genes
también es evidente cuando se examinan los patrones de metilación de
,:DNA cromosómicos, que muestran que los genes activos se ubican en
regiones no metiladas. Por ejemplo, en los seres humanos, el 4050%
del total de genes se localiza cerca de islas cpG (sección 5.1.1) y el esta-
do de metilación de la isla CpG refleja el patrón de expresión del gen
iadyacente. Los genes constitutivos
-los que son expresados por toáos
.',lostejidos- tienen islas cpG no metiladas, mientrai que las islas cpG
iadas con genes específicos de tejidos no están metiladas sólo enlos
,tejidos donde se expresa el gen. obsérvese que como el patrón de meti-
lación se mantiene después de la división celular, las células hijas here-
dan tra información que especifica qué genes se deben expresaL lo que
asegura que un tejido diferenciado mantenga el patrón de expresión de
genes apropiado, aunque se reemplacen las células del tejido o se aña-
dan células nuevas.

Los estudios de enfermedades humanas destacan la importancia de la

metilación del DNA. Ei síndrome ICF (inmunodeficiencia, inestabilidad
dgl s"rrt.ó*ero y anomalías faciales) que, como su nombre sugiere, tiene
efectos fenotípicos de amplio espectró, se asocia con hipome-tilaeión de
diversas regiones genómicas y ei causado por una mutáción del gen de
Dnmtib. La situación inversa -la hipermetilación- se observa deritro de
'las islas cpG de genes que muestran patrones de expresión alterados en
'ciertos tipos de cáncer, aunque la metilación anodral, en estos caso§,
podría ser también un resultado y no una cause dei estado patorógico.

Durante muchos años, el mecanismo por el cual la metilación infiuye en

la expresión del genoma fue un acertijb. En la actualidad, se sabe qüe las
proteínas de unión a metil-cpG (MecP) son componentes de lo§ com-
plejos de histona desacetilasás sin3 y NuRD. Esie descubrimiento ha
dado origen a un modelo en el que lai islas cpG metiladas son ros sitios
diana para la unión de complejos HDAC, que modifican Ia cromatina
circundante para silenciar ioi génes adyacenles (figura rc.2».
 292 CaPrtulo l0 .\ctÉso ar ge:,or:a

Crornosoma 1 I paterno

lgf7 r!¡j H19 :riirl Dos fenómenüs iÍItel'esantes, denominados sellado genómico tirnpronta
_ ,,ryry§3*te.i ...-:. .. -:i-..1.r:6i@.§.j,.:9,.:.1.
i r §é99ry!{r*&es:'ú;;';]ii:*, | &¡de¿&d¡eq@s{dde, ,
: genónnica) y desactivación de X, itpoltan evidencia adicional, si ts neccsaria, .
de la r:elación entre la metilación del Dl'lA y el silenciamiento del genoma. .fili,.l,..

Cromosoma maternú
El sellado genómico es una característic¿l relativamente infrecu*r-lirr
, ,',:'',;i(:,":':1,""','
cxple- ,,,ii.r ,',
1.1
pero importante, de los genomas de mamíferos, por la que sólo se
i!*1* &{*
.

,-"-6¡ SaunOdeunpardegenesp1.eSenteSencromoSomashomÓlogrlscicun
. ¡";**ei.-*".
á..-,fu.€,, É¡ler-E3¡¡¡.IÉs..
núcieoc{ip1oide,nrienttasquee1Se€undoessi1enciadopOrnretilaciÓn,.,;'l
También se observa en algunos insectos (aunque, en apadencia. no r.n ,

Drosophílct melünogaster) v algunos vegetales. Siemple es ei misma ,,,;:i§.,;a.,,,,,,.,;.,:,;::,.,:.:,':,',

miembro cle un par de genes e1 que está sellado y, por ende. es inacrivo: " :

ena1gunosgeneS,éstaes1aversiÓnheredadade1alrradre)-.cllotroS
¡B¡*frWffi*úid Lren aOIVO
genes, es la versiÓn paterna. Algo más de 60 genes de seres hum¿lnos n ,,,r§..:,:,,,,:,,,,
Len rmpreso
ratones han mostlaclo sellado; por ejemplo, los genes que codifican pro- -¡t...',".
teínas y RltiA funcionales. Los genes sellaclos se distribuyen por todo el . ,,,.,.,.,'n
I

genoma, pero tienden a agruparse en compiejos. Por ejemplo, en los §,.,.'i,,t i

sereshumanoS,hayunSegment<¡de2,2Mbc1e1Cron1O§olnal5quecc-in.
Figura i0.21 Par de genes impresos tiene no menos de diez genes sellados y una región más pequeña cL'l cro- l

en el cromosoma humano 11.lgf2 mosolra 11, de I Mb, que contiene ocho genes sellados. ;
está impreso en el cromosom¿ hered¿-
do de la madre y l-l I 9 eslá impreso en En los seres humanos, un ejempio de un gen sellado es 1g/2. que cociifi, ,$l),1.,,1..',t'.., ',

el cromosoma paterno. El dibujo no está ca un factor de crecimiento, una proteína inl.olucrada en el señalanlicn- , ,
hecho a escala; los dos genes están
separados por alrededor de 9o kb.
to intercelular (sección 14.1). Só1o el gen paterno es activo (ligura 'l'*;,',.,1,;;¡;:,: ,
10.21) porque, en el cromi:soma hereclado de la madre. están metilados . ,,,. , Í
diversos segmentos del DNA de la región de lgf2,lo que impide la e'.pre- (
sión de esta copia del gen. Un segundo gen sellado, lI19,se ubica rpro- |

{A) Desactivación de cariotipos atípicos

ximadamente a 9O kb de 1gf2, pero el sellado es inverso: la vctsión I
materna de H19 es activa y la versión patelna está silenciada. El sellado ,1,!-,..'r,,.,..... : ,
,1§ !§ :i
está cr:ntrolado por elementos de control de impresión, secllencias de ,:§: , .,¡r-: I
-i !

j* ).¡ J.i DI{A que se hallan dentro de unas poc¿ls kilobases de cornplejos cle ,- ,(
, ¡ genes sellados. Estos centi'os median la metilación de las regionc.. sella-
+I d¿-s, pero todavia no se describió en cietalle slr mecanismo de acción. , '::'1".,',:,L,'.',;,,1;;,,.,,1

'ilt:¡ '§Í ]' r' Asimismo, hay incerticlumbre respectü de la función del sc11ado. Una . . ,
fl .¡ ,l posibilidacl es qlle participe en el desarrollo, pr:rque los ratones p¿)rteno' -r):,' .,,,..r, ,
genéticos creados en folma artificial, que tienen dos copias de1 genonra .iii:iii,.'r:' ',.'r: : (
materno, no se desarrollan de manera apr:opiada. También se han plo .. . (
(B) La desactivación implica el recuentc de cromosomas
puesto explicaciones más sutiies basaclas eri los conflictos cvolutivos , - . r
entre machos y hernbt'as de una especie. ',,;,.'1i,,..;;..,,,,,,.,r,,,,.,,.,,t,,

,AA AAAA
§#MW&8 La clcsactivación c1e X es menos enig:rráiica. Ésta es una fr:nna especial ,,,,.!',,,,..tt,'' í
g:i ¡r'"1 d!& .qB
cle se1l¿lclo que induce una dcsactiyación c¿isi total de uno rie los cromo- ,,:,.:'.,'..'.',".", I
#&88ffi#& ** iÉd *a ;d
I I
¡
somas X de uua célula cle un mallífero hembla. Se produce parque las :'":l?'t,",,,:::,:,'.,',"" I,
.t J

AA
§§ *s f ¡ *"
w{eF
§r**
St a"r, §-e- &'+,
§9
Figura '1O.22 Desactivación de X. (A)
Sr hay un solc crorncsor¡a X, no se
produce desactivacrón; si hay tres cro-
mosomas X, se desactivan dos. (B) Se
desactivan tres cromosomas X en un¿
célula qr:e presenta un complemento
d'plo Cc ci: ¿utoson,¿s (qA), pero
cuatr0 cromoscmaS X. En c¿r¡bio,
sólo se des¿ctivan dos cromosomas X
si la célula es tetraploide (AAAA).
AAAA uno. Si anlbos clolnosomas X de l¿:s hembras f uesen activos las piotcí- " I
'W \&;! .u § nas coclificadas por genos clel cror¡osoma X se podfian sintetizar al 't:i;¡'.;:',',,',,:::,,:,',,.,,:,,.,,,
g
\&Á a& Á - Á doble de velociclad en las hemblas que en l<¡s machos. Para evitar estilrr.,r'1i.,::,,r,.. c
cuestión inconyenierlto, se silencia uno de los crolnosomas X cle la hett- ,.,l,it , ,,,','', t,
bra, qr,re es visualizado en el nircleo como una estructul:a condensada' 'l ...,'.,,, ,. I
denominada corpúsculo de Barr, totalrnente fonnado por hetcroe roma- -. l,
iina. I-¿l rnayoría de 1os genes dcl cromosorna X desactir.aclo son silen- ',,.;, :, 1.:rr. r
ciaclo'q, p..o, pot,uror,,.Jque se ciesconocen, ah"ecleclor rlel 20'.lc cscap1l .,......,.,,,.,.,, . t'
al pr"oceso y sigue sienclo funcional.
:
',.f,.r,,',,',r, §
El sijenciainiento sob¡:eyiene en etapas telnpranas
''.'-t"'-'- ,."' del desarrr:llo enrl-rriona-
lic y es controlaclo pol el cenlro cle de.cactivación de X (Xic), unn region,,, región ,,,,:¡l.: ..r..,''.'r
diferenciacia que se haila en c¿rda cronlosonra X. En trua célula -comtdda fi',,,.:,,,,*1',',',,, l'1tt
clesactil,ación cle X. el centro cle clesactivación cle uno de los clon-iosoinas *
tl
 Resumen

X i;riria fbrmación de heterocromatina, que se pt'opaga dei punto cle

1a
nucie¿lción hasta que alecta todo e1 crortosonla, con excepción de algunos
sespiüntos cortos que contienen los genes que permanecen activos. El pro-
ceso tarda varios días en completarse. Irlo se conoce el mecanismo exacto,
ncr() pirl'ticipa un gen, llarnadr: Xisf (aunque ei proceso no depende por
c.rrrr¡rl.'to de éll ubicado en e1 centro de ciesactivación, que es transcrito a
un Rl\A no codificante de 25 kb. cuyas copias reüsten el cromosoma a
nredida que se fonrra la heterocromatina. A1 mismo tiempo, se producen
diversas modificaciones de las histonas. Hay metilación de ia lisina-9 cle la
histona H5 (cabe recordar que esta modificación se asocia con desactiva-
ción ilel genoma, sección 10.2.1), desacetilación de la histona H4 (coino
suele ocun'ir en la heterocromatina) y reemplazo de las n:oléculas de his-
tona H2A por una histona especial; macro-H2A1. Ciertas secuencias de
DN¡\ son hipennetiladas por la DNA inetiltransf'erasa 3a, aunque esto
parece tenel lugar una vez establecido el estado inactivo. La desactivación
de X es hereditaria y se observa en todas las cé1ulas que descienclen cle la
inicial, en la que tuvo ltigar la desactivación.

En uira hembra diploide normal, un cromosoma X está desactivado y el

otrlr i.e mantiene activo. En hemblas dipk:ides con constituciones atípi-
cas de los cromosomas sexuales, el pl'oceso determina, aun así, que un
solo crorllosoma X sea activo. Por ejemplo, en los raros individuos que
tienen un solo cromosoma X no sobreviene desactivación, y en aquellos
con L1n cariotipo XXX, clos cie los tres cl'omosümas X están desactiva-
dos (figura 10.22A). Esto implica que debe haber: un riecanismo que
cuente los cromosomas X clel núcleo y desactive la cantidaci apropiada.
De hecho, este mecanismo no sólo cuenta los cromosomas X, sino tam-
bién los autosomas y compara ambos números. Esto es evidente porque
si la célula tiene cuatro cromosomas X, pero por 1o demás es diploide,
hay tles croÍrosomas X desactivados; en cambio, si es tetraploide (tiene
clratr"o cromosomas X y también cuatro copias de cada autosoma), dos
cronrosomas X están desactivados (figura 10.228). [,a manera en que lzr
cé1ula cuenta sus cromosomas ha desconcertado a los citogenetistas
durante muchos años y 1o sigue haciendo, pero las investigaciones más
recientes sugieren qr.re el ploceso es controlado por dos genes clei centro
de clesactivación cle X, denominados Tlsi-r" y Xite: la cieleción o la soble-
exprcsión de uno de estos genes o de ambos causa la desactivación de
una cantidad incorrecta de cromosonlas.

t1 1:-l ... ,.,. r,. ,r I ¡ll: .i .,

El medio nuclear ejerce una repercusión sustancial e importante sobre

la expresión del genoma. Un nircleo eucarionte tiene una estl'uctu1'a
inter¡ra muy ordenaclii, que cornprende una red compleja de {ibrillas de
proteínas y RNA denominada ntatrs.z nuclear. Cada cromosoma ocupa
su propio teruitorio dentlo del núcleq:; estos territorios están separados
entre sí por legiones no clomatínicas, dentlo de las cuales se localizan
las enzimas y otras proteínas involucradas en la expresión del genr:n-ra.
La lorma más compacta de clomatina es la hetel'r¡cromatina, donde se
loc¡iiizan genes inaccesibles que no pueclen expl'esarse. La heterocloma-
tina constitutiva es una característica pelmanente de todas ias céluias y
lepresenta DNA que no contiene genes, mientras que la hetelocromati-
na facultativa no es pen:nanente, y se considera que contiene genes que
solt inactiyos en algunos tejidos o en algunos est¿ldios del ciclo ce1u1ar.
El tipo más abierto de cromatina. llamaclo eucronratina, está olganizado
en bucles unidos a ia matriz nucleal', que cotl'espi¡nden, quizírs, a domi-
nios t'uncionales en los que están arganizados los genes presentes en el
gerlonl¿]. Cada dominio funcional está delinritado por" un pal'de aislado-
294 Capítulc l0 Acceso al genoma

res y algunos contienen regiones de control de locus, que participan en

la regulación de la expresión de los genes contenidos en el dominio. Los
nucleosomas parecen ser los determinantes primarios de la actividad del
genoma en los eucariontes, no sóIo en virtud de su posición en una cade-
na de DNA, sino también porque la estructura química precisa de las
proteínas histonas contenidas dentro de los nucleosomas es el principai
factor que determina el grado de empaquetamiento de un segmentc de
cromatina. La acetilación de aminoácidos lisina en las regiones N-ter-
minales de cada una de las histonas centrales se asocia con la activación
de una región del genoma, y la desacetilación induce el silenciamiento
del genoma. Las histonas también pueden ser modificadas por metiia-
ción, fosforilación y ubicuitinación, y cada uno de estos eventos ejerce
efectos distintos y específicos sobre la actividad de los genes adyacen-
tes. Puede haber un código de histonas por el cual e1 genoma interpre-
ta las combinaciones de estas diversas modificaciones. La expresión de
algunos genes, aunque no de todos, exige el reposicionamiento de los
nucleosomas. Algunas regiones del genoma también pueden ser silen-
ciadas por metiiación del DNA y es posíble que las enzimas pertinentes
trabajen junto con las histonas desacetilasas. La metilación es respon-
sable de la seliado genómica, que determina que uno de un par de genes
de cromosomas homólogos sea silenciado, y de la desactivación de X,
que induce la desactivación casi completa de uno de los cromosomas X
de un núcleo femenino.
 6§s'x*
&* :"* ra se» Ye"e h"%S& x e": 6r #4",*§
;**" á'&^;***§ á ##
B *-q
¡i§&§-*d
s-"R €",}qJ§§ $§"*f §q;$§k" # {m t
ESq*q
.s
§§§ §§s
§ **t ,,
l*,ti"y&
q*u*'$ ffi er"p&%*&h
3q ,f'.*
t .{'-*§ ffi §ffi&fl§ffiffi#ffiffi
fl}§ fui § fl "q #

** .!rf

:
**§r,. i* -s.so*. {r^\*@ **ü
ffref,wÁg*
e",g ry $# 1-&ffi&éhLg§$Jtu"§Lr#3

;].ffi*s$§*& *w,***.*g cxp,á:§ai?*,§§i,##h#§:e 5*T {ig}&; d,*¡ ,,,,,,

r

" Describir los motivos estructurales claves que permiten que las proteínas formen uniones especfficas de
I
secuencia con las moléculas de DNA.

Reseñar las diversas técnicas empleadas para localizar la posición en la que una protelna de unión al DNA
se une a una molécula de DNA.

i
Analizar las características de la doble hélice que son importantes para las interacciones entre el DNA y
: sus proteinas de unión, y proporcionar detalles de los eventos qufmicos sobre los que se basan estas
interacciones.

ldentificar las caraclerísticas claves de las diversas RNA polimerasas procariontes y eucariontes, y describir
la estructura de las secuenci¿s promotoras que reconocen.
.:--------'------
l precisarcómoseensamblael complejodeiniciacióndelatranscripcióndeEscherichiaco/ryanalizarlas
r distintas maneras de controlar este proceso, diferenciando, en partlcular, los mecanismos de control cons-
titutrvos y reguladores.

Detallar el ensamblaie del complejo de iniciación de la transcripción de la RNA polimerasa ll en los euca-
riontes y reseñar los ptocesos equivalentes para las RNA polimerasas I y lll-

De;cribir, con ejemplos, la estructura modular de los promotores eucariontes.

I. Explicar cómo influyen los activadores y los represores en el ensamblaje de los complejos de iniciaciÓn de
la transcripción en ios eucariontes.

Comentar nuestro conocimiento actu¿l de las estructuras de los compleios mediadores y sus funciones en
la iniciación de la kanscripción y en los eucariontes.

El producto inicial de la transcripción del genoma es el transcriptoma,

el Conjunto de moléculas de RNA derivadas de los genes que codifican
proteínas, cuya inforrnación biológica
-1.2).es requerida
por la célula en un
mc'mento paiticular (véase figura trl transcriptoma es mantenido
por: el progeso denominado transcripción, mediante el cual cada gen es
copiadó en moléculas de RNA. Alguna vez, se consideró que la trans-
cripción era sólo "el DNA fabrica RNA", y eso es lo que sucede, en esen-
cia, pero ahora advertimos que el proceso que lleva del genoma al
transcriptoma es mucho más complejo que lo sugerido por esta trivial
 Capítulo I1 Ensamblaje del complejo Ce rniciación de la lranscripción

§*¡:
enunciación. §n la actualidad, esta parte de la expresión del genoma se
divide en dos etapas claves (figura 11.1). ':

Compleio
PASO 1: iniciación
de la transcripción
* Iniciación de la transcripción, que determina el ensamblaje corrient§
de iniciación arriba del gen del complejo de proteínas, incluidas la enzima RN§
de la transcripcíón polimerasa y sus diversas proteínas accesorias, que después copier&$
el gen en un transcrito de RNA. Los eventos que determinan si un
gen e§ realmente transcrito o no soll inherentes a e§te paso.
,

PASO 2: síntesis CI Síntesis y procesamiento del RNA, que cornienza cuando la RNA
y procesamiento polimerasa abandona la región de iniciación y cornienza a fabricar
de RNA
una copia RNA del gen, y finaliza una vez que se han completado los
eventos de procesamiento y modi{icación que con'rierten el transcri-:
to inicial en una molécula de RNA maduro, capaz de cumplir su fun-
ción en la célula.

En este capítulo se describe el inicio de la transcripción y en el capí-

tulo 12 la síntesis y el procesamiento del RNA. Pero antes de comen-
Figura 1l.l Los dos estadios del
proceso que lleva del genoma
al transcriptoma.

Cuadro lI.'l Funciones de las proteínas de unión al DNA y al RNA

Protelnas de unión al DNA

Expresión del genoma
lniciación de la transcripcién Proteína de unión a TATA eucarionte (sección 11.2.3)
Subunidad o de RNA polimerasa bacteriana (sección 11.2.3)
'l
Síntesis de RNA RNA polimerasas (sección I .2.,l)
Regulación de la transcripción Activadores y represores eucariontes (sección f 1.3.2)
Represores baclerianos (sección I 1.3.'l)
Empaquetamiento del DNA Histonas eucariontes (sección 7" 1 .1)
Proteínas del nucleoide bacterianas (sección 8.1.1)
Recombinación del DNA RecA (sección 17.1.2)
Reparación del DNA DNA glucosilasas, nucleasas (sección 16.2.2)
Replicación del DNA Proteínas de reconocimiento del origen (sección 15.2.1)
DNA polimerasas y ligasas (secciones 2.1.1, 2.1.3 y 15.2.2)
Proteínas de unión a una sola cadena (sección 15.2.2)
DNA topoisomerasas (sección 15.,l .2)
Otras .l.2)
Endonucleasas de restricción procariontes (sección 2.

Protelnas de unión al RNA

Expresión del genoma
Corte y empalme de intrones Proteínas snRNP (sección 12.2.2)
Poliadenilación del mRNA CPSñ CstF (sección 12.2.1)
Edición del mRNA Adenosina desaminasas (sección 12.2.5)
Procesamiento del rRNA y el tRtrtR Ribonucleasas (secciones 12.1.3 y 12.2.4)
lraouccron Aminoacil-tRNA sintetasas (sección l3.l.l )
Factores de traducción (secciones 13.2.2, 13.2.3 y 13.2.4)
Degradación del RNA y
Ribonucleasas (secciones 12"1.4 12.2.6)
Estructura ribosómica
Proteínas ribosómicas (sección 13.2.1)
 Proteínas de unión al DNA y sus sitios de unión r03

zár i} tratar estos temas, es preciso considerar algunos conceptos

i. básicos. Las participantes centrales de la transcripción son las pfote-
íoas de unión al DNA, que se unen al genoma para cumplir su¡ fun-
ciones bioquímicas (véase cuadro 11.1). Las histonas son ejemplos
de esas proteÍnas y hallaremos muchas otras más adelante en e§te
misnro capítulo al estudiar el ensamblaje de los complejos de inicia-
ción de procariontes y eucariontes. También hay proteínas de unión
al DIdA que intervienen en la replicación, la reparación y ia recom-
l,
binación del DNA, así como un gran grupo de proteínas relacionadas
que se unen al RNA en lugar de al DNA (véase cuadro 11.1). Muchas
proteínas de unión a1 DNA reconocen secuencias nucleotídicas espe-
.ífi"u, y se unen, en forma predominante, a estos sitios diana, mien-
tras que otras Se unen de manefa no específica en diversas posiciones
del genoma.

El mecanismo de acción de las proteínas de unión al DNA es básico

para la iniciación de la transcripción; si no se conoce su funciona-
miento, no será posible comprender cómo se utiliza la información
del genoma. Por lo tanto, invertiremos cierto tiempo en examinar
qué se sabe acerca de las proteínas de unión al DNA y cómo interac-
túan con el genoma.

§i. i tr.;'* ieár¡r ltiii ,{t}# ;.1i'.'§,r:i§? ;} i t]ir;qsL

§,i
] .":' ;' r' .'
,": '" : :*¡;:
Nuestro principal interés corresponde a las proteínas que pueden
tener como diana una secuencia nucleotídica específicay, por ende, se
unen a una limitada cantidad de posiciones de una molécula de DNA,
que es el tipo de interacción más importante para la expresión del
genoma. Para unirse de esta manera específica, una proteína debe
entrar en contacto con la doble hélice de modo tal que pueda recono-
cer la secuencia nucleotídica, lo que, en general, exige que parte de ia
proteína penetre en el surco mayor o menor de la hélice (véanse figu-
ras i.BA y 1.9) para lograr una lectura directa de la secuencia (sec-
ciún 11.1.1). Por io regular, esto se acompaña por interacciones más
generales con la superficie de la molécula de DNA, que pueden esta-
bilizar sólo el complejo DNA-proteína o pueden acceder a informa-
ción indirecta sobre la secuencia nucleotídica, que es aportada por la
conformación de la hélice.

3' : : .,,, -..d. .: i "3. ti.

,'..' ,i'.r .;
1"
{:' ':ft}# " ,i- 4^,.'"'t^
Se han determinado las estructuras de muchas proteínas, incluidas
más de 100 que se unen al DNA o al RNA, por métodos como cris-
talografía de rayos X y espectroscopia por resonancia magnética
(RM) (Xota sobre técnicas 11.1). Cuando se comparan las estructu-
ras de las proteínas de unión al DNA específicas de secuencia, se
ob.serva de inmediato que la familia, en su conjunto, se puede divi-
dir en una cantidad limitada de grupos diferentes sobre la base de la
estructura dei segmento de la proteína que interactúa con la molécu- Figum 1 1.2 Motivo hélice-giro-hélice.
la de DNA (cuadro ll.2). Cada uno de estos motivos de unión al EI dibujo muestra la orientación del
DNA está presente en una serie de proteínas, a menudo de organis- motivo hélice-giro-hélice (en violeta)
del represor del bacteriófago 434 de
mos muy diferentes, y es probable que por Io menos algunos de ellos Escherichio coli en el surco mayor de
hayan evolucionado más de una vez. Estudiaremos en detalle dos -el la doble hélice de DNA. "N" y "C"
rn*tivo hélice-giro-hélice (HTH) y ei dedo de cinc- y analizaremos indican los extremos N y C del
en forma sucinta los otros. motivo, respectivamente.
 Capítulo 11 tnsamblaje del complejo de iniciación de la transcripción
Nota soble tárricas I l.I Cristalografía de rayos X y especlroscopia por resonancia magnética
Métados pora estudíar los estructuras de los proteínas
Una vez purificada una proteina de unión al DNA o al
RNA, se puede intentar determinar su estructura, en ais-
l¿miento o fijada a su sitio de unión. Esto permite espe-
cificar la estructura precisa de la parte de unión al ácido
nucleico de la proteína, y dilucidar la identidad y el
carácter de los contactos con la molécula de DNA o de
RNA. Dos técnicas -cristalografía de rayos X y espectros-
copia por resonancia magnética (RM)- son básicas para
esta área de investigación.
La cristalografía de rayos X, una técnica de larga data
cuyos antecedentes se remontan a finales del siglo xrx ,
se basa en la difracción de rayos X. Estos rayos presen-
tan longitudes de onda muy cortas -de O,0l nm a l0
nm- que son 4.000 veces más cortas que la luz visible
y comparables con los espaciamientos entre los átomos
de estructuras químicas. Cuando se dirige un haz de
rayos X a un cristal, algunos de ellos lo atraviesan direc-
tamente, pero otros presentan difracción y emergen del
cristal en un ángulo diferente del de entrada (figura
{A) Producción de un patrón de difracción
Película sensible a los rayos X
Cristal
(€) Parte del mapa de densidad de electrones de la ribonucleasa
y los camplejos proteína-ácido nucleico
T 1 I . I A). Si el cristal está formado por muchas copias dr
la misma molécula, todas en una disposición regular,
entonces, diferentes rayos X presentan modos similares
de difracción, lo que determina círculos superpuestos
de ondas de difracción que interfieren entre sí. Una pelí-
cula fotográfica sensible a los rayos X o un detector elec-
trónico colocado a través del haz revela una serie de
manchas (figura TIl.lB), un Patrón de difracción de
rayos X, a partir del cual se puede deducir la estructura
de la molécula del cristal. Esto se debe a que la posición
relativa de las manchas indica la disposición de las
Figura Tl t.1 Cristalografía de rayos X. (A) Se obtiene un
patrón de difracción de rayos X haciendo pasar un haz de rayos X
a través de un cristal.de la molécula estudiada. (B) Patrón de
difracción obtenido con cristales de ribonucleasa. (C) Parte del
mapa de densidad de electrones derivado de este patrón de
difracción. (D) Si este mapa de densidad de electrones tiene
suficiente resolución, es posible identificar los grupos R de ami-
noácidos individuales, como se muestra aquí para la tirosina.
(B) Patrón de difracción de rayos X de ribonudeasa
(D)
' ' lnterpretación de un mapa de densidad de electrones: mapa
de dánsidad de electronás con resolución de 2A que revela
un grupo R de tirosina
L--:r -\\
:-L-
':./7lllr.:
ll u//'.
---J
:-\ \ '!=l'' I

müléculas del cristal, y sus intensidades relativas apor-
ñn información sobre la estructura de la molécula.
Cuanto más compleja es la molécula, mayor es el
núnrero de manchas y la cantidad de comparaciones
flu€ se deben efectuar entre ellas" Por lo tanto, se
rlquiere asistencia computarizada Para todas las molé-
culas, excepto las más simples. Si el estudio es exitoso,
el resultado es un maPa de densidad de electrones
(figura Tll.lC y D) que, en el caso de una proteína,
próporciona un gráfico del polipéptido plegado, a partir
del cual se puede determinar la posición de su configu-
ración estructural, como hélice c¿ u hoja p. Si es suficien-
temente detallado, se pueden identificar los grupos R
de cada aminoácido del polipéptido y establecer las
orientaciones relativas que guardan entre sí, lo que per-
mite deducir enl¿ces de hidrógeno y otras interacciones
químicas dentro de la estructura de la proteína. Con
suerte, estas deducciones posibilitan la creación de un
modelo tridimensional, detallado, de la proteÍna.
Al igual que la cristalografía de rayos X, la RM es una téc-
nicá de larga data, cuyos orÍgenes se remontan a la pri-
mera parte del siglo xx, y que fue descrita por primera
vez en 1936. El principio de la técnica es que Ia rotación
:'
de un núcleo químico con carga genera un momento
magnético. Cuando se aplica un camPo electromagnéti-
co, la rotación del núcleo se orienta eñ una de dos
maneras, denominadas cr y B (figura T11.2), y la orien-
tación a (que está alineada con el camPo magnético)
tlene una energía ligeramente menor. En la espectros-
copia por RM, se determina la magnitud de esta diferen-
cia de energÍa midiendo la frecuencia de la radiación
electromagnética necesaria para inducir la transición de
& a g, y este valor se describe como la frecuencia de
resonancia del núcleo en estudio. El punto crítico es
que, aunque cada tipo de núcleo (p.ej, lH, l3C, lsN)
tiene su propia frecuencia de resonancia especifica, la
frecuencia medida suele ser algo dlferente del valor
estándar (en general, la diferencia es menor de 1o par-
tes por millón), porque los electrones en la vecind¿d del
núcleo en rotación Io protegen, en cierta medida, del
campo electromagnético aplicado. Este desplazamiento
químico (la diferencia entre la energía de'resonancia
observada y el valor estándar para el núcleo en estudio)
permite inferir el medio químico del núcleo y, por lo
tanto, aporta información estructural. Tipos particulares
de análisis (denominados COSY y TOCSY) posibilitan la
identificación de los átomos unidos por enlaces quími-
cos al núcleo en rotación; otros análisis (p ej., NOESY)
identifican los álomos que están espacialmente cerca
del núcleo en rotación, pero que no tienen conexión
directa con éste. No todos los núcleos químicos son
adecuados para RM. La mayoría de los proyectos de RM
de proteínas son estudios de 1H, cuyo objetrvo es iden-
tificar los medios químicos y los enlaces covalentes de
c¿da étomo de hidrógeno y, a partir de esa información,
inferir la estructura global de la proteína. Estos estudios
suelen ser complementados con análisis de proteínas
sustituidas en las que se han reemplazado por
menos algunos de lqs átomos de carbono o de niiróge-
Proieínas de unión al DNA y sus sitics de unión ¡05
I ;&.
;t:':':t §
vir:tr.:
."q:§;;;*. "\
*iá"-"' *
¡
t^
l
, ü esPrnp .'
-It
,
I
Radiación
electromagnéiica o.r'*,¡ ¿-- :
de frecuencia
adecuada rt' esDln
Ct
Figura T1'1.2 Base de la RM. Un núcleo en rotación
puede adoptar una u otra de dos orientaciones en un
campo electromagnético aplicado. Se determina la dife-
rencia de energia entre los estados de espín a y B
midiendo la frecuencia de la radiación electromagnética
necesaria para inducir una transición cr-+$.
no por los isótopos raros l3C y lsN, que también dan
buenos resultados con RM.
La RM, cuando es exitosa, determina el mismo nivel de
resolución que la cristalografía de rayos X y, así, aporta
información muy detallada sobre la estructura proteica.
La principal ventaja de la RM es que trabaja con molé-
culas en solución y, por lo tanto, evita los problemas
que a veces aparecen al intentar obtener cristales de
una proteína para análisis con rayos X. Los estudios de
soluciones también son más flexibles si el objetivo es
examinar cambios de la estructura proteica, como los
observados durante el plegamiento de las proteínas o
en respuesta a la adición de un sustrato. La desventaia
de la RM es que sólo es adecuada para proteín¿s rela-
tivamente pequeñas. Esto se debe a varias razones,
una de las cuales es la necesidad de identificar las fre-
cuencias de resonancia de todos, o la mayor Parte
posible, de los núcleos lH, o de otro tipo, en estudio.
Esto depende de que los diversos nÚcleos tengan dis-
tintos desplazamientos químicos Para que sus frecuen-
cias no se superpongan. Cuanto más grande es la
proteína, mayor es la cantidad de núcleos y mayores
son las probabilidades de que se suPerpongan las fre-
cuencias y se pierda la información estructural, Aunque
esto limita la aplicabilidad de la RM, la técnica es, aun
así, muy valiosa. Hay muchas proteínas interesantes
suficientemente pequeñas Para ser estudiadas por RM,
y también se puede obtener información importante
por análisis estructural de péptidos que, aunque no son
proteínas completas, pueden actu¿r como modelos
para aspectos de la actividad de la proteína, como la
unión a los ácidos nucleicos.
lo
 Capítulo II Ensamblaje del complejo de iniciación de la transcripción

Cu¿dro 'l'1.2 Motivos de unión al DNA

Motivo Ejemplos de proteínas con este motivo

Motivos dé un¡ón al Dl,lA específicos de secuencía

Familia hélice-giro-hélice
Hél ice-giro-hélice convencional Represor de lactosa, represor de triptófano óe Escherichio coli
Homeodominio Proteína antennapedi a de Drosophila
Homeodominio apareado Factor de transcripción Pax de vertebrados
Dominio POU Proteínas reguladoras P¡t-1, Oct-l y Od-2 de vertebrados
Hélice-giro-hélice alada Proteína reguladora CABP de eucariontes superiores
Dominio del grupo de alta movilidad (HMC) Proteína de determinación de sexo SRY de mamíferos
Familia dedos de cinc
Dedo Cys2His2 Factor de transcripción TFlllA de eucariontes
Dedo de cinc multicisteína Familia de receptores de esteroides de eucariontes superiores
Complejo binuclear de cinc F¿ctor de transcripción CAL4 de levadura
Dominio básico Factor de transcripción CCN4 de levadura
Cinta-hélice-hélice Represores MetJ, Arc y Mnt bacterianos
Dominio TBP Proteína de unión a TATA eucarionte
Dímero de barril B Proteína E2 de papilomavirus
Dominio de homología Rel (RHB) Faclor de transcripción NF-rB

Motivos de unión al DNA no específicos de secuencia

Pliegue de histona Histonas eucariontes
Motivo HUllHF* Proteínas HU e IHF bacterianas

Hendidura de polimerasa DNA y RNA polimerasas

*El motivo HU/IHF es un motivo de unión al DNA no específico de secuencia de las proteínas HU bacterianas (las proteínas de empaquetamien-
to del nucléolo; sección 8.1.1), pero dirige la unión especlfica de secuencia de la proteína IHF (factor de integración al huésped) (sección 17.2.1).

#l rm*$r* &Sffregir*r-&Sfrae ss§** Sr*$§r?f* §§?

l'l
.,,,,-11§
wti
a::.
2
Figura 1L3 Motivo homeodominio. Se
muestran las primeras tres hélices de un
homeodominio típico, con la hélice 3
orientada en el surco mayor y la hélice I
que hace contactos en el surco menor.
Las hélices l-3 transcurren en dirección
N-+C a lo largo del motivo.
#;s*c{},.§s$?tr#§ y §¿i§#rr*fl§s§§
El motivo HTH fue la primera esfilctura de unión al DNA identificada.
Como su nombre sugiere, el motivo está formado por dos hélices c{, separa-
; das por un giro (figura 11.2). Este último no es una conforrnación aleatoria,
sino una estructura específica, denominada gr"o g, formada por cuatro arní-
s noácidos, el segundo de los cuales suele ser glicina. Este giro, junto con la pú-
?
q
mera hélice u, ubica la segunda hélice s en la superficie de la proteína, con
A"¿ una orientación que posibilita que ésta encaje dentro del surco mayor dc una
....."§
molécula de DNA. Por lo tanto, esta segunda hélice cr es la hélice de recono'
cimiento, que establece los contactos vitales que permiten leer la secuencia
;W de DNA. Por lo general, la estructura HTH tiene alrededor de 2O aminoáci:
dos de longitud y, así, es sólo una pequeña parte de toda la proteína. Algunas
de ias otras partes de la proteína fonr:ran uniones con la superficie de Ia molé,
cula de DNA, sobre todo para al,udar al posicionamiento corecto de la héli-
ce de reconocimiento dentro del surco mayor. i
Muchas proteínas de unión al DNA procariontes y eucariontes utilizan
un motivo HTH. En las bacterias, estos motivos están presentes en algui
nas de las pr:oteínas reguladoras mejor estudiadas, que activan y desac-
tivan la expresión de genes individuales. Un ejemplo es el represor de,
Iactosa, que regula la expresión del operón de lactosa (sección 11.3.llii
w
.-l ::.1 .::ri lri:llll'iri'r.i
Prsteínas de unión al §N,A y sus sitios de uniún

I ¡s cliv*rsas proteínas FITI-I eucaliontes comprenc.len muchas de las pro-

pieii¿t,lrs dc unión al Dfi.\ ciue.§ori impottantes pala 1;r regulación de l¿r
esprr.iún de1 gcnoma clurante e1 desarroilo. como las proteínas de1
hoireodominio. cr-Lyas funciones analizar-emos en ia sección i4.5.¿1. El
homecdr:minio es un motivo l{TI'l extendido, pre."ente en tocias estas
¡,:r,rdi,r.rs. Est¿i con-ctituido por 60 ;rminoácidos que loman cuatro héli-
#
lW.
..r o.. .1.' las e r-r¿iles l¿is números 2 y' 3 están separaclas pol un giro i3, 1a %-.
l

número 5 actúa conro hélice de reconocimiento y la número 1 establece fv<

!rJ f'

contilctos con el surco nlenor (figura I1.3). Ot¡:as versiones del mr:tivo .,;itrrHis

HTH hallado en 1o,§ euc¿tt'ii:ntes son: Zn

* El dorninio POIJ, qlle se suele hallal en proteíniis que también tie-

nen un homeodominio. y es pr:obable que los dos motivos trabajen
juntos r-iniéndose a diferentes regiones de una doble hélice. La deno-
nrinación "POU'proviene de las letras inici¿rles de los nombres de las
plimeras proteínas en las que se descubrió este dominio.
* El motivo hélice-giro-hélice alada es otra versión extendida cie 1¿r
estluctur¿r HTH básica, que presenta una tercera hé1ice « a un lacio
d¿inrotivo HTH y una hoja B del otro lado.
Figura 1 1.4 Dedo de cinc Cysz-Hisz.
N{uchas proteínas procaliontes y eucariontes tienen un motivo HTH, Este dedo de cinc particular pertenece
pelo ias det¿rlles de la inter¿lcción cle la hé1ice de reconocimiento con el a la proteína SWl5 de levadura. El
sr11'co lnayof i:ro so1"t exactamente los mistnos en todos los casos. La lon- átomo de cinc está mantenido entre
gitud cle la hólice de reconocimiento vitría y suele ser nlayor en 1as pro- dos cisteínas dentro de la hoja p del
teínas eucariontes. la orientación de ia hélice en e1 sltrco nlayor no motivo y dos histidinas de la hélrce cx.
Las líneas naranjas indlcan los grupos
siemple es ia misma y 1a posición dentlo de la l"rélice de reconc¡cimiento
R de estos aminoácidos. "N" y "C"
de los aminoáciclos que tienen contacto cr:n 1os nucleótidos es ciiferente. indican los extremos N y C del moti-
vo, respectivamente.
l*s ¡:rliJ¡:,1 i,:
*ír¡* §*i; {:i:}§;#I;*$ *c i*;s ¡..-'rr:i*;i:*s *¡:r*¡i¿:d?r*s
El segundo tipo de rlotivo de r:nión a1 Dl''lA que estudiareínos en deta-
l1e es cl dedo tle ci nr, que es raro en las prote ínas procarionte s, pero l-nu)i
común en las eucariontes. En el hehninto Cuent¡rhubrlitis elegcrns, pafe-
ce h¡¡ber más c1e 500 proteínas dil'elentes en declo de cinc de un total de
19.000 proteínas, -y se e-stinla qr-re el 19ó de toclos los genes de m¿itlífe-
ros roclifican e*(tas proteínas.
/\/1,

Hii-v no menos de seis velsionc's diferentes de cledo de cinc. El primero estu-

di¿lcir¡ en detalle lue el dedo Cys2His2, qlre comprende una serie de alrede-
"'W,s #
f
,",' l
*...:,
\.

Y"W-& *r
clor clc 12 arninoácidos, inck-ridas dos cisteínas ¡,clos histidi¡3-t, que fbnrr¿in
un scgllento de hoja B seguiclo de una hélice cr. Estas dos estructur¿rs, que "e%
fot'man el "decio" que se plo)'ecta cle la sr-rper:ficie de la proteína. mantienen
w
entrc ellas un átcmo de cinc unido, coordin¿ido con las dos cisteínas y lets
@
éffia
clos histidinas (figur"a 1 1.4). La hélice c¿ es la parte riel motivo que estable-
ce los contactos críticos clentro clel surco mtlyll'; su posición dentlo del w # W@ry
-Eh *)
@.4r.
6',e.-'
sllrüo es detemrinacla pol la hoja B, clue interactúa con e1 esqueleto cle ¿rzú- { N
carfosfato clcl DNA, y el átorno c1e cinc, que mantiene la hoja B v la hélice §l;;
cr en las posiciones relatiy¿rs api'opiadas entre sí. Otlas versiones de cleclo
*4M##
dc einc clifielen en 1a estructura c1el dedo: alguniis c¿irecen ciel con-rponente -
L
I
'\¡'**"
?/

de hoja p y están fornadas sólo por: una o rnás hélices «, y tarnbién varía
el modo prcciso cn que el átomo de cinc se mantiene en su iugar. Pol ejem-
plc. los dedos de cinc multicisteína carecen de histidinas y e1 átomo de cinc
está coorciinaclo entre cllatro cisteínas. Figura 1 |.5 Dedo de cinc receptor
de esteroides" Se ilustran como líne-
as naranjas los grupos R de los aml-
Una característica interesante clei ciedo cle cinc es que, a veces, se ob-se-t'van
noácidos involucrados en las
nrúltiplcs copias de1 cledo en un¿l sola ploteína. \,'arias proleínas tienen dos, interacciones con Ios átomos de cinc.
tres o cuatro dedos dc cinc. per:o hay ejemplos con muchos más; 57 en una "N" y "C" indican los extremos N y C
ploteína de sapo. IJn la mayoría r1e los casos. se consiclera que cacla dedo del motivo, respectivarnente.
 CapÍtulo 1i Ensanblaje del coinplelo de inici¿clén de la fansciipción

de cinc establece conractos independientes con la urolécula dc DNA, pero

en algunos caso-§ 1a l'e1ación entre dilerentes declos es más compleja. [,n un
c** §@ gr1lpo pal'ricuiar de proteírus -la familia de leceptores nu.rlca::es o esteroi-
des- se combinan dos hélices « que contic'nen seis cisteín¿rs para coordinar
dos átomos cle cinc en un soio dominio de unión al DNA, más granclc qur
un dedo de cinc convencional ltigura 1 1.5). Dentro de este motivo, llli1.;:(:
i:
Í
que una cle las hélices « inglesa en e1 surco nta\ol', mir.nrl:as que la scguti-
N da hace contacto con otras proteínas.

r"1,i.',,-..-. -*-.-.J:...- -,.- * ::-;j-..- .-- ..,i....*--.-.

l\i
\.L
\-ry-#* Lr:s otlos rxotivos cle unión al Di\,fA distintos descubieltos en diferentes
ploteínas son:
i'.1 .;w
§*.',,,
K-'-\ i&'l-
'.Ll
:&r¡§ * El dominio básico, en e1 que la estructllra de reconocimiento del
§'' -
M
w§ DNA es una hélice « que contiene un ¿ilto número de aminoáciclos
básicos (p. ej., arginina, serina y treonina). Una peculiaridad dc este
illotivo
es que la héiice cr só1o se foma cuando la proteína interactira
con el DNA: cuanclo no está unicl¿r, la hélice tiene una esrructura de-
sorganizada. Se encuentran clominir:s básicos en uÍIa serie de proteí-
nas eucar"iontes involucradas en la transcripciór:r de D|{A a IiNA.
Figura 1 1.6 Motivo cinta-hélice-héli- El motivo cinta.hélice-hétrice. que es uno de los pocos motivos que
ce. El dibujo corresponde al motivo logrii unión al DNA específica de secuencia sin utilizal' una hélice a
cinta-hélice-hélice del represor de
MetJ de Eschenchto coli, que consiste
como estructllra de reconocimientr:. En su lugar, la cinta (dos cade-
en un dimero de dos proteínas idénii- nas de una hoja f3) entra en contacto con el surco mayor (figut'a
cas, una representada en gris y la otra 1 1.6). Los motivos cinta-hélice-hélice se etlcuentran en algunas pro-
en violeta. Las cadenas p a Ia izquier- teínas de regulación de genes en ias bacterias.
da de la estructura contactan con el
surco mayor de Ia doble hélice. "N" y El dominio TBF, clue hast¿l ¿rhor¿i sólo se ha clescr-rbierto en la prote-
"C" indican lcs extremos N- y C- del ína de unión a TATA (sección 11.2.3), a 1o que debe sr"r nombre. Al
motivo, respectiva mente. igual qr:e el motivo cinta-hélice-hélice, 1a estructura de reconoci-
miento üs una hr:ja p pero, en este caso, 1os contactos principal*s soir
con el su1"co menor de la n'roiécula de DNA, no con el mayi:r'.

Las proteínas cle unión al RNA tantbién presentan motivos especilicos

que forman ia unión con la nlolécula de RNA, los nrás importantcs de
los cuales son:
* El dominio de ribonucleoproteína (Rt{p), que cornprende crratro
cadenas p y dos hélices tx en el orden fl-rx-F-F-a-|3. Las dos cadenas p
centrales establecen las uniones críticas con 1a molécula cle l1lr,lA. El
domir:rio RNP es el motivo cle unión al RNA más común y se k: ha
hallaclo en más de 250 ploteínas.
* El dominio de unión al RNA de doble cadena (dsRBD), clue es sinri-
lar al dominio RNP, pero tiene la estructura u-p-$-a. La función de
unión al RNA reside entre la caclena $ y la hélice cx al final cie la
Proteínas de unión al DNA
estructura. Como su nomble 1o indica, el mr:livo se halla en pl'oteí-
nas qlle se unen a Rl'lA bicatenario.
. :
*
:i:rrlili
rü:iir
E1 dominio de homología K tiene la estructula p-cl"-ry-B-B-u, 1,'le lun'
\a \\lx ción de unión re-.ide entle el par de hé1ices ry". E,s relativantente infre-
++ cuente, pero est¿l presente en por 1o llenos una proteína de uniÓn al
t*.-*»;"*";e-t Wq4&'44W.)
_\e4¿erwl&,
r¿ e I
RNA nucleal'.
200 bp
Además, e1 homeodolrinio de unión al DNA tarnbién puecle tener acti-
Figura 1.1.7 Los sitios de unión para
vidad c1e unión al RNA en al-9unas proteínas. Una proteína l'ibosóurica
las proteínas de unión al DNA utiliza u1"14 estl'uctura similar a un homcodominio pala unilse a lRi\'lA y
están ubicados inmediatarnente aigunas proteínas del homeodominio, oomo Bicoicl cle l)rosoplt.ilu ntelt¡'
corriente arriba de un gen. tlogttster (sección 14.5.4) sc pr.rcclen unil tanto al DNA cor-no a1 RfiA.
W
Li ti.., i

Proteinas de unión al DNA y sus sitios de unión ¡09

. r '! I n--.1;, =-i:, 1. ,;.. r.-.

1¡; }:.} :-l^"..-.^ {lu ,i^." ".1¿l --.
-J"" {.."'*"
¡ 1., -'. '-.{rLrdJ¡*É}"-!;. }11-¡:t{ir¡}i:-'3 &;l'L'-, Fragmentos Fragmentos
r- *l;-- -l Lr.{.#"
tr-.:.,,'- H.: t.";l ---.;^".--*. de
S8;.¡!ri--lll Ci HeIIJ¡¡";{.i reslriccíón
de restricción
!llrlla:n¿ni.r{.1f..:.
A ruenudo, lo prin-rerc que se descubre de una proteína de unión al DNA no
es.su identidad, sino las calactedsticas de l¿r secuencia de DNA que recono-
ce. fsto se debe a que experimentos de ger-rética y biologÍa molecuiáL que se
consiilerarán más adelante en este capítulo, han mostrado que muchas de las
pro{einas que participan en la expresión del genoma se unen a secuencias cor-
tas de DNA inmediatamente coniente an:iba de los genes soble los que actír-
an (figr.rra 1 L7). Esto significa que la secuencia de un gen recién descubierto,
si se supone que contiene tanto el DNA codificante como las legiones
coniente arriba c1e éste, pennite acceso inmediato a los sitios de unión de por
lo lrienos algunas de las proteiras responsables de su expr:esión. En conse-
cuencia, se han ideado divelsos métodos par:a localizal'los sitios de unión a Banda
retrasada
las proteínas dentro de fragmentos cle DlrlA de hasta varias kilobases cle lon-
girud, 1os cuales funcionan pedectamente bien aun cuanclo no se hayan iden-
tificaclo las proteínas de unión a1 DNA pertinentes. Figura 1 I.8 Análisis de retardo en
gel. 5e ha mezclado un extracto nucle-
ar con un producto de la disgestión
l* l:,:¡:;,-; 5* r*i*¡#i; r,'; q*l iJ::.ri;l:,: i.,',*;;i::*,...:::s r¡* ,üff¡t por enzimas de restricción de DNA, y
Ll rr
,-. * -.,, a.. ,'.. _-,- se ha unido una proteína de unión al
DNA del extracto a uno de los frag-
El plimero de estos néiodos aprovecha la diferencia sustancial entr.e las pro- mentos de restricción. El complejo
pieclacles electroforéricas del fiagmento de DNA "desnudo" y el que estír DNA-proteína tiene una masa molecu-
unido a una proteína. Cabe recordal que los fragmentos de DNA se separan lar mayor que el DNA "desnudo" y, por
mecliante electroforesis en gel c1e agarosa, porque los fragrnentos más peque- lo tanto, corre con más lentitud duran-
ños nrigran a favés de la estn:ctul'a poÍosa del gel con más rapídez que k:s te Ia electroforesis en gel. En conse-
cuencia, la b¿nda para este fragmento
fiag:rrentos rnás glandes (véiise Nota sobre técnicas 2.2). Si un fragmento de
está retrasada y se la puede reconocer
Di§A lleva una proteína unida, verá obstaculizada su movilidad a tlavés del por comparación con el patrón de ban-
gel: por k: tanto, el complejo DNA-proteína forma una banda en una posi- deo generado por los fragmentos de
ción nrás cercana al punto iniciai (figula I 1.8). La aplicación de esta técnica restricción que no han sido mezclados
se dcnomina análisis de retardo en gel. En Ia práctica, la técnica se lleva a con el extracto nuclear.
cabo con un conjunto de fragmentos de restricción que abarcan 1a región
doncle se considera que hay un sitio de unión a la proteína. Se mezcla el pro-
duct<¡ de Ia digestión con u1'I extracto de proteínas nucleares (plesuponiendo
que ¡ie está estudiando a un eucarionte) y se identifican los fragmentos retla-
sados comparando el patrón de bandeo obtenido tras ia electroibresis con el
patlón de los fragmentos de restdcción qlle no han sido mezclados con pro-
teÍnas. Se utiliza un extracto nuclear porque, en este estadio del proyecto, en
general no se ha purificado el DNA-proteína de unién. En canbio, si se dis-
pone de la proteína, el experimento se puede practicar con Ia misma faciliclad
con la proteína pura que con un extracto mixto.

l:- : '-'- , -..1. r-'^ , Í': ,¡ ,i i '-; ":

I

d{} r, ii1 i: i, {-}i' *:s.: r:íl i.* ri

El análisis de retardo en gel aporta una indicación genelal de la loca-
lización de un sitio cle unión a ia proteína en una sácuencia de DNA,
pero no especifica el sitio con gran exactitud. A menudo, el fragmen-
to retrasado mide varios cientos de pares de bases, en comparación
con la longitud prevista del sitio de unión de unas pocas decenas de
pares de bases como máximr:, y no hay ninguna indicación de dónde
reside el sitio de unión en el fragmento retl'asado. Asimisnro, un frag-
mento retrasado largo podría contenel' distintos sitios de unión par.a
val'ias proteínas; como alternativa, el sitio de unión de un fragmento
bastante pequeño quizás incluya también nucleótidos cie fragi-rentos
advacentes, que no folman por sí mismos un complejo estabie con la
proteína y", así, no proclucen retardo en gel. Por lo tanto, lc¡s estudios
de retardo en gel son uil pul1to inicial, pe{o se requieren otras técnicas
para obtener información más exacta.
3I0 Capítulo ll Ensamblaje del complejo de inicjación de la transcripción

Figura 1.I.9 Determinación de la Fragmentos de restricción marcados en un extremo

huella genética con DNasa l. Los '.'-, :l t ': :.' , a'*....* a*-""'u.
fragmentos de restricción empleados al a-..
comienzo del procedimiento se deben §ru,m §;l¡w
mercar sólo en un extremo. Por lo
general, esto se logra tratando un con-
junto de fragmentos de restricción más
-ext!'actc-r"1
largos con una enzima que fija marc¿- \actonucrear .-- Frr:ieln¡ dr Llni** ,:1 üsA

.}ffi
dores en umbos extremos y, después,
se cortan estas moléculas marcadas a*@r« r ..&' *
con una segunda enzima de restricción ¡3,:.;,&
y se purifica uno de los conjuntos de -i!,x$;<* §;&xa
fragmentos terminales. El tratamiento
con DNasa I se lleva a cabo en presen- I Digest¡ón l¡mítada ! Digestión limitada
cia de una sal de manganeso¡ que tr con DNasa I I con DNasa I

induce que la enzima practique corles *;;&i'¿w §;»&«

de doble cadena, ¿leatorios, en las
moléculas diana, lo que origina frag-
mentos de extremos romos. "3:{** e¿"«&s,
{h:r;;:&: *
&;»x,&la

Producto de digestión
Electroforesis..:e proteica, electroforesis
autorradiografia en gel, autorradiografía
\

§ii*(,s»s;;
I
I "lluella genética"

*j:r¡i]@

l»;::¡:* *iM §
*:;;;** dt
;ct;rw* S¡:*:r,,m

Se puede proseguir el trabajo iniciado con el retardo en gel, con análisis

de protección de la modificacién. La base de estas técnicas consiste en
que si una molécula de DNA lleva una proteína unida, entonces, parte:
de su secuencia nucleatídica estará protegida de una madificación" Hay.
dos maneras de efectuar la modificación:
e Por tratamiento cori una nucleasa, que degrada todos los enlaces fos.
fodiéster,except0losprotegido§porlaproteínaunid.a.
e Por exposición a un agente de metilación, como el dimetil sulfato, It:
que añade grupos metilo a nucleótidos G. Cualquier § protegida por er
la proteína unida no será metilada. dr
t-lt
En las figuras 1 1.9 y I 1.10 se rnuestran los detalles prácticos de las dos téc., be
nicas. Ambas utilizan un procedimiento experimental denominado determi'. p{
naeién de la huella gesétisa (footprintin§. En la determinación de la huella ur
genética con nucleasa, el fiagmento de DNA examinado se marca en un
extremo, se lo hace formar un complejo con la proteína de unión (comq
extracto nuclear o como proteína pura) y se 10 trata con desoxirribonucleas4
I (DNasa I). Por 1o general, la DNasa I degrada todos los eniaces fosfodiés., ,; \.
ter y sólo deja el segmento de DNA protegido por la proteína de unión. Esto lt'{ I
no es muy útil porque puede ser difícil secuenciar un fragrnento tan pequ§: cir
ño. Es más rápido aplicar el enfoque más sutil ilustrado en la figura 1 1.9. bl aj
tratamiento cón nuileasa se pfactica en condiciones limitantes, comc baja ttL
temperatura o muy escasa concentración de enzima, de rnanera que, en pre.: flrl

medio, cada copia dei fragmento de DNA sufre un único "everto", 10 que sig. ult
nifica que es degradado en sólo una posición de su longitud. Si bien cada, CA:
fragrnento se colta sólo una vez, etr toda la población de fragmentos, todÚ&! :..,. tf;í
los enlaces se degradan, excepto los protegidos por la proteÍna unida. Ahorq¡ r,,
iin
 Proteínas de unién al DNA y sus sitios de unión 3¡t

tragmentos de restricción marcados en un extremo Figura 1 I.10 Análisis de protección

li,:rr::il¡:r itlttttit,li &;;r;::;t;:; r8i:ei;]*:ri de la modificación con dimetilsulfato
3 (DMS). La técnica es similar a la deter'
ñ&:;»iriilJsli *r§:*:;*§ii minación de la huella genétlca con
DNasa l. En lugar de la digestrón ccn
DNasa l, se tratan los fragrnerto; llr-r
cantiúa¿es linit¿d¿s de Dl" i - li¿r (:'-.r.
- extr¿do nudear + extracto nuclear

Prulei¡:¿ d* resulie metilada un¿ sola b¿se gu¿nina

Llnil_¡ ll U\¡ de c¿da fragmento. Las guarinas que
:. S---.:......-..;.i; §.-i;-,iii,,i:.:,; 'lr,l *L:i§&ii.. *"r-i,w,,,,-- están protegidas por la proteína unida
p*.@'-, no pueden ser modificadas. Después
.r.,t,a.t::& qlr;m$}ll,x 6rr,;.§*:
W .it i§&i»iwi i'ii*r,;lr: de eliminar la proteína, se trata el DNA
con piperidlna, que provoc¿ coftes en
I Tratamiento limitado I Tr¿tamiento limitado
las posiciones nucleotídicas modificadas.
C modificada 1 con Dl\4S l con DMS
Para simplifrca; el diagrama muestra las
moléculas de doble cadena degradadas
6,J't e} .piz.!;ffi;r 6r..-...;§!;,«,.i.,
en este estadio. De hecho, sólo presen-
*ii;,:;:tr:L:m; r"_-&*- tan muescas, pues Ia piperidida sólo
.6r|,á;*wrlt;; i§;]i];];;r;:áiii,li &,r:l;$¡» *.l*Spu§
corta la cadena modificada, en lugar de
electuar un corte de doble cadena a tra-
*I
Pireridina Producto de digestión
I proteica, piperidina vés de toda la molécula. Por lo tanto, las
muestras se examinan mediante elec-
&:É;ii;;,.;rii $.lrrtr,rirrr.r":.:":r; troforesis en gel de desnaturolización,
de modo que se separen las dos cade-
&;:. '-;:1ffiiü &diiüir;á;i ;,
nas. La autorradiografía resultante mues-
tra los tamaños de las cadenas que
\./ tienen un extremo marcado y un efire-
\,/ mo creado por la muesca produclda por
5L1i:?l?:',,',:.:i.:1Í5,,ua,og,uii\ ./ 5,.1it?l?:','ffx,,Y'ur.Í3,.,ua¡os,ur*
la piperidina. El patrón de bandeo de las
cadenas de DNA control -aquellas no
tlt?kii La :.: : ::,. :;':. :".,,,
incubadas con el extracto nudear- indF
&.,.1

::;,il;; -, .,, I -,.,,..& {PJ;lijrliiÉriffi :

ca las posiciones de las guaninas (C) en
o* , "Huella genética
el fragmento de restricción y la huella
"'',.'i";j]']l;]]l];'],;'''']'''.''á

...-..r.,...t-:..i;i.:i.:s
genética observada en el patrón de ban-
§ñ»;¿r#i§ deo de la muestra de prueba muestra
áe*eea ;,:.
§§.a,:,t t : :: ::.,,,,,

e'j+sü*a W.rrffi;: qué C fueron proteg,das.

§:*il;ll'lii:;i

§..rt.t""t....1'::,

se elimina la proteína. se practica electroforesis de Ia mezcla y se visualizan

los {ragmentos marcados. Cacia uno de estos fragmento-s tiene el marcadi:r
en un extremo y ui'r sitio cle escisión en el otro. El resultado es utla escalel'a
c1e bancias que conesponden a fragmentos que difieren de longitud por un
nucleótido, con lotul'a de la escalera por una zona en blanco donde no hay
banrlas marcadas. Esta zona en blanco, o "huella genética", con'esponde a las
posiciones de ios enlaces fosfodióster pr:otegidos y, por ende, de la proteíl"ra
unicla, en el DNA inicial.

J.
t ' ;'
lio se debe confundir 1a protección de la modificación con la rnodifica-
cién de interferencia, una técnica difelente que aporta otra dimensión
a1 estudio de la unión a las proteínas. La modilicación de interferencia
trabaja sobre la base de que si se altel'a un nucleótido crucial para ia
unión a las proteínas, por ejernplo mediante metilación. se puede impe-
dir 1a unión. En ia figura 1 i.1 1 se ilustra una de estas familias de técni-
cas. Se trata e1 fragmento de DNA, marcado en Lrn extremo, con el
re¿lctivo cle modificación, en este caso dimetilsulfato, en condiciones
li¡nitantes, de modo que sólo se metile una guanina por liagrnento. Se
 tt2 Capítulo 1l Ensam'olaje del cornplejo de iniciación de la transcripción

tragmentos de restricción marcados en un extremo añade la proteína de unión o el extracto nuclear y se practica electrüfo-
l'esis de los fragmentos. Se observan dos bandas: una que conesponde
sii:]..,!!il-,ij:r;.!l.l,¡l]14
al complejo DNA-proteína y una que contiene DNA sin proteína unicla.
§:-r:i,.;]' Esta últirna contiene moléculas que no han podido unirse a la proteína
t Tratamientolimitante porque el tratamiento de metilación ha modificado una o más G, que
{ con dimetilsulfato son cruciales para ia unión. Para identificar qué G están modificadas, ¡.'
*.'I--_- ----*- 6 modificada purifica el fragmento a partir del gel y se lo trata con piperidina, e1 com-
!t;;l;;;:;;*
s
puesto que degrada el DNA en los nucleótidos metilguanina. El resulta-
6.»*aulla do de este tratamiento es que cada tragmento es cartado en dos
I Añadir extracto nu(lear segmentos, uno de los cuales contiene el marcador. La longitud o las ion-
? I gitudes del segmento o los segmentos marcados, determinadas por una
**i.,*&:---- [-]l;l segunda corrida electroforética, señalan qué nucleótidos del fragmento
11l U,'¡. ¡
original fueron metilados y, así, identifican las posiciones de las G que
,§¡e*gw*
participan en la reacción de unión, en ia secuencia de DNA. Se pueden
, 8ry,,lo*t ..---
Aulencr¿ du unión
utilizar técnicas equivalentes para identificar nucleótidos A, C y T invo-
llltf"lt'*t
flr¡ ,iIA isitio btoqu*arior
ál luclados en la unión.
\s+ ! Electroforesis en gel

..-;,+4.;iil!@ffiffi
.,:.44,1§!!!ffi
¿ i ; ,:
Í¡iiefñCClüf"l *ir:rC *i t.;'\F\ '.' Íi.i5
$)s*á*i;i1xs da **m}*x
., :,r:r.r.,:,.:l.-..#rÉlw
":

Banda no reirasada
(sin nroteína unida) En los últin-ros años, ha comenzado a cambiar nuestro conocimiento si:bre
"
ri
ia participación de la molécula de D|'lA en la interacción con una proteina
,:¡i';irir:'!:::::j
de unión. Siempre se ha aceptado que las proteínas que reconocen una
secuencia especílica como su sitio de unión pueden locaiizar este sitio c-sta-
I PiPeridina
¿ bleciendo contactos con grupos químicos unidos a las bases que están
;".j,:¡i;:ir;t-*:r rlt ;;;.lisi nü expuestas dentro de los surcos mayor y menor, que forman una espiral alre-
' '\ dedor de la doble hélice (véase figura 1.8). En la actualidad, se reconoce
¡ Electroforesis en gel,
'- + autorradiografía que la secuencia nucleotídica también incide en la confomración precisa de
cada región de la hélice y que estas características de conformación repre-
sentan una segunda manera. menos directa, en la que la secuencia de DNA
es de zoo pb,
puede influir en la unión a las proteínas.
por lo tanto...

i-;;iL,'i;: rii,"J{l¿: ;i; 1,..: :*:l:t¡l;i; :-í* *:,-. - -, : -..--

200 pb
A partil de la estructura de doble hélice descrita por lVatson y Crick
(sección 1.1.2). era evidente que, aunque las bases nricleotídicas se
encuentran en el interior de la molécula de Dl{A, no están sepultadas
Figura 1 1.'l 1 Análisis de modificación
por completo y algunos de los gl'rlpos químicos unidos a las bases púri-
de interferencia con dimetilsulfato cas y pirimídicas son accesibles desde el exterior de la hélice. Por lo
(DMS). Véase la descripción del proce- tanto, debería ser posible la lectura directa de la secuencia nr:cleotídica
dimiento para obtener lragmentos de sin lornper los pares de bases ni abrir la molécula.
DNA marcados en un solo extremo en
el epígrafe de la figura 1 1.9.
Para lbrrnal enlaces químicos con los grupos unidos a ias bases nucleotídi-
cas, una proteína de unión debe establecer contactos dentro de uno c los
dos surcos de la superficie de la hélice. En la forma B cle DNA, la identi-
dad y la orientación de 1as partes expuestas de las bases dentro del surco
mayol"s«:n taies que 1a mayoría de las secuencias pueden leerse sin ambi-
güedad, mientras que dentro del surco nlenor, es posible iclentificar si cada
par de bases es A-T o G-C, pero es difícii saber qué cadena de la hélice
ocupa cada nucleótido del par (figura 11.12). Por 1o tanto, la lectura dilec-
ta de la forma B implica, en foima preclominante, contactos en el surco
mayor. En otros tipos de DI{A. hal,mucha menos información sobre los
contactos fonnados con las proteínas de unión, pero es probable que el
cuadro sea bastante diferente. Por ejemplo, en la foma A, el surco mayor
es profundo y angosto. lo que dificulta la penetración por: cualquier petrte
de una molécula proteica (véase cuadro 1.1). Así, es probable que el surco
menor, más superficial, desempeñe 1a parte principal en la lectut'a directa.
En el Z-DNA, el surco mayol'casi no existe, y la lectura directa es posible,
en cierta n-redicla. sin traspasar la superficie de la hélice.
 Proteínas de unión al DNA y sus sitios de unión rt3

Surro mayor
{;:: ::::,,,::;'!,\'rll,l'J l;"';:.i;:.."'::;,:;:.ll;'...,.], ii:.::lj'',:ila *le'l:i:-;.:;:l'i:j:',"{{i;: VdW
I
,
!i plincipio. DNA celular tenían estrllctu-
se pensába que las moléculas cle
,
ras llastante unifonles, compuestas soble todo por: la forma B de la doble
héliie. Algur-ros segmentos co1'tos pr:drían ser de l¿r fotma A y podúa haber ri

aigrrnos haces c1e Z-DNIA, en especial cerca de los extremos de una molé-
culu. pero la ma.vor parte de la longitud de 1a doble hélice sería de B-DNIA
inr.ariable. En la actualidad. se reconoce que el DNA es mucho más poli-
mcrfo y qlle es posible que coexistan las configur:acir:nes de A-DNA, Í
B-DNA y Z-DNA, y otras intennedias entre ellas, dentro de una sola molé- ':t"

cutr¡ de DNÍA, con difelentcs estructuras en distintas partes de ia moiécula. § ! I t

! lI
Estas variaciones cle confotmación dependen de la secuencia, y se deben,
$
,]
I I
en !¡:an medida, a las interacciones de apilamiento de bases que se pr:odu- i g
§
a
:_
'rCi'i a
cen .ntre pare-. de bases adS,acentes. Además de deterrninal junto al apare-
§urco menor
anriento de bases la estabilidad de la hélice, el apilamiento de bases
tar:rbién influye en el grado de rotación que se produce alrededor de los
enlaces covalentes dentro de cada nucieótido y, en consecuencia, deterrni-
na la confomación de la hé1ice en una posición particular. Las identidades Figura I I .12 Reconocimiento de un
de los pares de bases vecinos inlluyen en las posibilidades de rotación de par de bases A-T en Ia doble hélice
un par de bases, a tlavés de ias interacciones de apilamiento de bases. Esto de forma B. Se muestra el bosquejo
significa qr-re la secuencia nucleotídica incide de manela indirecta en la con- de un par de bases A-T (figura 1.88)
con flechas que indican las característi-
lbnnación global de 1a hé1ice. 1o que quizás ¿Ipofta infonnación estructural
cas químicas que se pueden reconocer
que una proteína de unión puecie usar para ayudar a localizar su sitio de accediendo al par de b¿ses a través
uniirn apropiado en una molécula cie DNA. Pol ahot'a, esto es sÓlo una del surco mayor (arnba) y del surco
posibilidad teór'ica, pues no se ha identificado ninguna ploteína que reco- menor (abajo). En el surco mayor, Ias
nozca específicamente una fbnna no B de la hélice, pero muchos investiga- características químicas son asimétricas,
doles creen que es probable que la confonnación de la hélice tenga algpna y se puede identificar la orientación del
palticipación en la interacciórt entre ei DNA y las proteínas. par A{ mediante una proteína de
unión. Durante algún tiempo, se consi-
deró que esto no era posible en el
Un segur-rdo tipo de cambio c1e conforrnación es la torsión (bendin§ del surco menor, porque se pensaba que
DhJA. Esto no se refiele a 1a llexibiliclacl natural del Dl\A. qr:e le per:mite sólo estaban presentes las dos caracte-
fbmral cílcuios y superenl'o1larse, sino a posiciones localizadas clonde la rísticas llustradas en gris y que éstas
secuencia nucleotídica causa la torsión del DIrlA. Como otras variaciones erar ¿simétricas. Utilizando estas dos
de confbmración, 1a torsión del DNA clepende de 1a secuenci¿i. En particu- características, la proteína de unión
lar'. una molécula c1e DNA en 1a que un polinucleótido contiene dos o nrás podía reconocer el par de bases A-l
pero n{l podia saber qué nucleótido
glupos cie adeninas repetidas -cacla Ell'upo con 3-5 A. ¡, los grupos inclivi-
está en qué cadena de l¿ hélice.
duales separacl:s por 10 u 11 nucleóticlos- plesentará torsión en el extl'e- Recientemente, se han descubierto las
mr: 3' de ia reg-ión rica en aclenina. Al igual que en el caso de la car¿cteristicas iluslradas en verde, lo
confon¡ración cle 1a hélice, tod¿lvía no se sabe en c1ué meclida influye la tc¡r- qr:e sugiere qr:e, de hecho, se podría
sión clel DNA en la unión a las pt'oteína§, aunque la torsión inclucida pot' discernir la orientación del par a través
prorrínas en sitios llexibles tiene una función claralxente denrostr¿icl¿l en I¿t del surco menor. Abreviaturas: a, enla-
regulaciór:r cle algunos genes (sección 1i.3.2). ce de hrdrógeno aceptor; d, enlace de
hidrógeno donante; vdW, interacción
de van der Waals.
{ ::-:' ! ; ;i,,,,
¡ í:i} l,'# ;,I i}.::;,,r1 i' li-j.t:, tra.} lir,i,r'} r-.:
Los contactos estableciclos entle el DNA -v sr-is proteínas cle unión no son
covalentes. Dentro de1 surco mayol, se foman enlaces di: hich'ógeno entl'e
la.c bases nucleotíclicas -v los €frupos R de los aminoáciclos cle la estructur¿)
de leconocimiento de la proteína. nrie¡ltras que en el surco lt1eno1', son más
importantes las interacciones hidr'ófobas. En 1a superl'icie cle la l'rélice cle
Dlri¡\. 1as principales interacciones son electrostiiticas. entre las cargas
negativas del componente fosfato de cada nucleóticlo y las cargas po-<itivits
de los grrlpos R c1e ios aminoáciclos, colrlo lisina y alginina, aunque tatr-
bién hay algunos eniaces cle hidrógenc. En ciertos casos, 1os eniaces de
hich'ógeno en la super'ficie de la hélicc o en el surco mayor son clilectos
enlxe el DlrA y la ploteína: elr üt1ros. son necliados por moléculas de aguit.
Se puederr l-iacer pocas generalizaciolles: en este nivelde interacción DNA-
proteína, caclii ejemplo tiene sus propias calacterísticas itnicas, y los deta-
5¡jt Capitulo.l l Ersambl;je del ccrnpieji: dr¡ rncr¡rión
@ es que estas úitimas son lnás favol'ables desde el punto cle lista rc.n¡c¡diná-
,{-¡}.W*E/i\
jlt
,, :,' /X\wv:r/
W Sry
\
{ffiÜ( //\';#q
ry* \ \
Figura 11.13 Cremallera de leuci-
na. Esr¿ es una crern¿llera de leuci-
na Ce tipo bZlP. L¿s esiructur:s rolas
y anaranjadas son partes de dileren-
tes proteínas. Cada conjunto de esfe-
ras rapresenta el grupo R de un
aminoácido leucina. Las leucinas de
las dos hélices se esocian entre sí
mediante interacciones hidrófobas
que mantienen unidas a las dos pro-
tein¿s en un dirr.ero. En este e;em-
plo, Ias hélices de dimerizacrón se
ex;ienden para f,:i'mar un per de
mori'¡os Je r-rnión al DN,\ de d¡nri-
nios básicos y se muestra que esta-
blecen contactos en el surco mavot.
Jr i; tiarscr-ipción
l1es dcl enlace debcn ser dcscifrados por estudios estructurales más que por
compilraciones co1') ctras ploteínas.
[-a mavoria cie lzrs ploteínls que reconoccn secuenci¿ls nucleotídicas específ i-
cas también pucden unirse de modo inespecífico a otr¿ls parres de 1a mo1écu-
la de DNA. De hecho, se ha sugericlo cir:e l¿i cantidacl de DNA cle una célula
es tan Eande y el nún-rero de proteínas cle unión tan pequeño, eue las prote-
ínas pasan la mayor pal'te cle su tlempo, si no todo, r-uridas inespecíficamerr-
te a1 DNA. La difelencia entre las fbrnras inespecíficas y especificas de unión
lurico. En consecuenci¿l, Llna proteína se puede unir a su sitio específico. ar-rn-
que ha1: literalmente, millones cle otl'os sitios ¿r los que podría h¿rcer:lc de
nlanera inespecílica. Pala io¡¡'al esta ventaja termodinálnica, el proceso clc
urión espu-cíljca clebe involuu'ar la máxi¡la c¿lntidad posible de con[aüros
DNA-ploteína, lo que explica. en parre, por qué las estrltcluras de reconoci-
miento de muchos motivos de unión a1 DNA lran evolucionado pala adarp-
tarse ajustaclameÍite al surco mavolde la hélice, donde la opoltunidacl de
contactos DNA-proteína es márit¡a. T¿rmbién explica pr:r'qué alguuas inter-
acciones Dl',lA-proteína cleterminan cambios de confbrrlación de uno u ollil. :
1o que aumenta tr:davía más la complementarieclad de lus super'ficies intul'ac-
tivas y peimitc que se est¿lblezcan ofios enlaces.
Asimismr:, ia necesidad cle maxirnizar los contactos para asegurar la espe-
cificidad es una de las t"azones por las cuales muchas proteínas de ur:ión
a1 DNA son dírneros, fonnados pol cios proteíuas unidas entre sí. Éste es
el caso de la mayor'ía de 1as proteínas HTH y cle n"iuchas del tipo dedo cle
cinc, La dimerización ocun"e de n"rodo que los motivos de unión al Dl'lA
cle las dos ploteiras pueclen accecler". ambos, a la hélice, quizá con cierto
graclo c1e coopelación entlc cll:s, cle nrodo que el númelo de cont¿ictos
resultantes es ruás del doble dcl que puede establecer un lrronómerr¡.
Adernás dc sus motivos de unión a1 DNA, mucl"las proteínas cotltirnen
i¡tros clolninios c¿rractclísticos quc ltai'ticipal-I efi los colltactos pl'oteína-
proteína, qr-re clerivan en la folrlación c1c clírnel'os. Uno cie éstos es la cre-
mallera de leucina, una hé1ice o. que sc enlolla de llallet'a más cerrada quc
1o nornral y pr:eseÍlta una selie de leucinas e1t una cle sus caras. Éstas pue-
clen establecer contaütos con las lcucil-r¿ls cle 1a cremallera clc una segunda
proteína y forrnar un díllero (figur:a 11.11). Un segunclo dorninio de
clinleriz¿rción se denr¡n:in¿1, b¿lstante desafortunad¿rmentc, motivo hélice-
bucle-hélice, que es cliferente clel nrotivo cle ¡:nión al DtJA hólice-giLo-hóli-
ce , con el que no se lo debe confundil:
Una pregunt¿l interesante es si la especificidad de unión al Dl'lA st
puecle conocef con sr-rficiente c{etalle par':r pledecil' l¿r secuencia clc. un
sitio cliana de una proteína a partir clel exanren de la estructul'a c1e la
hélice de l'econocimiento de un rlotivcl cle unión ai DNA. l"lasta ahora,
este objetivo nos ha eludiclo en grall rnectid¿r. pero ha sido posible ileclu-
cir algunas t'eglas de interacciór-i que invoklct'an a cieltos tipos de r{edo
de cinc. En est¿ls ploteínas, cuatro anrinoáciclos -11'es de la hélice cle
reconocimiento y uno in¡-necli¿rtamentc aclyacente a ella- forman uniones
cr'íticas con las bases nucleotíclicas clc1 sitio diana. Algunas de estas unio-
nes involucl'¿rn un sclo aminoárciclo con una sola base; otlas, dc¡s alrino-
ácidos can una l¡ase . Al cornpal'ar las sccuenci¿rs de aminoácidos clc ias
l-rólices de lecor-locimiento de distintos dcclos de cinc con las secuencias
c1e nucleótidos de los sitios cle uniólr, l"la -sicir'¡ posible identificar: ulra serie
cL't'eglas que rigen la interacción. Éstas permiten preclecir la secuencia
nucleotídica espccílica para una nueva ploteína cledo de cinc una vez
que se conoce la compr:sición cle anrilloácidos de su hélice c1c recorroci-
nlientr:, aunque se clebe admitil que es posible cicrta arnbigiiedad.
 lnteracciones DNA-proteina durante la iniciación de la transcripcion 3:5

Cu;:rlio I.l.3 Funciones de las tres RNA polimerasas nucleare§ eucariontes

ñl.lA polimerasa I Cenes de RNA ribosómico (rRNA) 285; 5,8S y l85

RhlA polimerasa ll Cenes que codifican proteínas, genes de la mayoria de los RNA nucleares pequeños (snRN,A),
genes de micro-RNA (miRNA)
RNA polimerasa lll Cenes de RNA de tr¿nsferencia (IRNA), rRNA 55, snRNA U6. RNA nucleolares pequeños (sno)

§ .$
"3 §xámrxq*§*sx*s ffiM&-6xrmk*áetx e$exrmsx.&m
§xi Irx§s§mq§*w d* §x &rffis'*sc§'§p*§wm
Ahot'¿r que hemos establecido quc las interacciones DNA-proteína son la
clave para comprender 1a iniciación de 1a tlanscripción, es posibie erami-
nar los eventos involucrados en e1 ensamblaje clel compleio de irlieiaeión.
Lo halemos en dos etapas. Pt'illero, estudiaremos las intel'acciones DI\A-
pr.oteína que parlicipan en la iniciación de la tlansctipciótr. Después. en la
iección 11.5, investigaremos cómo se puede contlolar e[ ensar"nblzrje del
conrplejo de iniciación y su capacidad para iniciar la tlansclipción median-
te diversas proteínas aciicionales que lesponden a estímulos intt'acelulares
i: crtracelulal'es, y que galantizan que se tlanscriban los genes correctos en
los momentos apropiados.

{Ai Uniún directa de la RNA polirrerasa

1T,1"-} ffif*& pi:§im:xrms*x
[n sección 1.2.1 apler-rdimos que l¿r-s elrzimas responsabies de 1a t]'ans-
l¿r RNA polimerasa
clipción de DNA a RNA se ll¿rman RNA polimer'¿rs¿rs dependientes de1
Dl'lA. La transcripción de genes nucleales eucariol-ites requiele tles RIJA \
poli:rerasas cliJer:enles: RNA polimerasa tr. RNA polimerasa II v RNA ,
,-*,--á*;;1iM{e-,:-,,e¡q¿6,*¡¡@!¡&¡r¿*88
'ijer,aijlr:rrau,ó,lÁ&¡¡:&.re,
polimerasa III. Todas son ploteínas con rnúltiples subr-rnidades (8-12 s¡-rb-
r-rnidaile,.), con una masa nlolecr-tlal de nlás de 500 kDa. l)esde el punto de
vista estructural, estas polinret'asas son bastante similal'es entre sí: las tres
,qubuniclades más glancles están estrechamente lelacir¡naclas 3' algun:rs de {§) Unión indirecia de la RNA polimerasa
las r¡rás pequeñas se encuentt'alt el"l más cie una euzitt-ia; er: cambio, clesde
el punto dc vista {'uncir:nal. son i:astante clistintas. Cacla una trab:rja sob::e
RNA polimerasa
tul.r glllpo diferente cle genes, sin posibilidad de intercar¡bio (cuacllo i 1,1).
l"a investigación ha cliligido l¿r atención, en su mayol'pat'te, a 1a RNA poli-
meras¿l II, pues esla enzinra es ia que ti:anscribe genes qtle codifican prote-
ínls. 'lambién actúa sobre un conjunto cle genes que especific¿in 1os
snlLl{A, que participan en el pt'ocesamiento del RNA, y soble los genes de
Plataforma formada pcr una
los nriRNA. La ilNA polin-ierasa ill tr¿rnscribe otros genes de RNA pequc- proteína de unión al DNA
ños, incluicios 1os de tllNA. La I{N¿\ polirnerasa I tlanscdbe 1as unidaclcs
cle lepetición multicopia qllc contienen los ge-nes de IRNA 28S; 5,8S y I BS.
Err la sección 1.2.2 se resurnen las llnciones de todos estos RirJA, qllc se
an¿rlizan en cletalle en los capítulos 12y 13. Figura 'l 1.'l 4 Dos maneras en las
que las RNA polimerasas se unen a
sus promotores. (A) Reconorimienlo
Las alqueobacterias (alch¿rea) tienen una sola Ii.NA polimetasa de cstlalctu- directo del promotor por la RNA poli-
ra lnuy simiial a la de las enzimas eucat'iontes. Pero ésta no es típica de los merasa, como sucede en las bacte-
procariontes en general, ya que la RNA polirnerasa bactet'iana es muy dife- rias. (B) Reconocimientc del
promotor por una proteÍna de uniÓn
rente: e-stá for:nacla sólo por: cinco subunidades y su crolnposición se describe
al DNA, que forma una plataforma
como c/-rf3f3'o (dos subunid¿rdes o, Lrna p, una $' -v una o). Las subunid¿rdes sobre la cual se une l¿ RNA polimera-
s., [3 .y B' son equivalentes a las tres subunidades más grancles de las RNA sa. Este mec¿nismo ind'recto se
poliuerasas eucaliontes, pero la subuniriad o tienen sus propias pr:opiedades observa en ias RNA polimerasas
especi:iles, tanto respecto de la esuuctula, según velemos en la siguiente sec- eucarion -es y arqueobacterianas.
3t6 Capítulo, 11 Ensamblaje del complelo de iniciación de la transcripción

Figura 1 l.l5 Promotor del operón

de lactosa de Eschericltio coli. El
promotor está localizado inmedi¿ta-
mente corriente arriba de lacZ, el prv 38 pb al
mer gen del operón. La secuencia de comien¿o
de lacZ
DNA muestra las posiciones de las
secuencias *35 y -10, los dos com-
;:;::;:) i;
ponentes de secuencia distintos del
promotor. Compárense estas secuen-
cias con las secuencias consenso
descritas en ei teKo. Véase más infor-
mación sobre el operón de lactosa ción, como de la función. Los cloroplastos también tienen una RNIA pr:lime-
en la figura 8.8A. rasa muy similar a la enzima bacteriana, lo que refleja los oúgenes bacteria-
nos de estos orgánulos (sección 8.3.1). Sin embargo, la RNA polimerasa
mitocondrial, fotmada por una sola subunidad con una masa molecular de
140 kDa, está más estrechamente reiacionada con las RNA polimerasas de
ciertos bacteriófagos que con la versión bacteriana convencional.

'§
?..?.? §*qa**{'§a!.ffis t*
r*,:#§}*{§{§§**v}t<: p#fls §*
!*árixs§*m d* §;x trxa"tser§pei*r"l
Es esencial que ios complejos de iniciación de la transcr{pción se ccnstruyan
en las posiciones comectas de las rnoléculas de DNA. Estas posiciones están
marcadas por secuencias diana que son reconocidas por la propia RNA poli-
merasa o por una proteína de unión al DNA que, una vez unida a éste. foma
una plataforma sobre la que se une la RNA poiimerasa (véase figula 1 1. 14).

.'- '.-". I I :' ''t'l"'':- ; " ''"¡ '

En bacterias, la secuencia diana para la unión de la RNA polimer-asa

1as
se clenomina promotor. En 1964, los genetistas emplearr:n por primera
vez este término pal'a describir las funciones de un locus que se localiza
inmediatamente corliente alriba de los tres genes del operÓn de lactosa
(figura 11.15). Cuando se inactivaba este locus pol mutación, no se
expresiiban los genes del operón; por lo tanto, ei locus parecía prontover
la expresión cle los genes. I-loy sabernos que esto se ciebe a que el locus
es el sitio de unión para la RNA polinleras¿i que transcribe el r:perón.

Las secuencias que fonnan el promotor de Esclterichíct coli se iclentificaron

por primera vez comparando las t'egiones corriente arriba de más de 100
genes. Se plesumió que las secuencias promotoras serían muy similat'es en
todos los genes )', pol io tanto. deberían se1' reconocibles al comparar las
regiones colriente arliba. Estos análisis mostt'aron que e1 protnotor cie
E. coli consta cle clos seg]-nentos, cada uno de seis nucleóticlos, descritos de
la siguiente mallera (véase figgra 1 1.15):

.cecuencia *35 5'-T TCACA-3'

secuenci¿r *10 5'-iIAII'\AT-3'

Cuadro I 1.4 Secuencias de promotores de Eschericfiio coli

Seiuencía iu ,
P¡b'r¡0t¡Í:::l,r..:i:1,*§: *i ' ' ::Secuediia -lo
.

;¡:. .rr
Consenso 5,-TTCACA_3' 5'_TATAAT-3,
Operón de lactosa 5,-TTTACA_3' 5,_TATCTT.3,
Operón de triptófano 5,_TTCACA-3' 5,-TTAACT_3'
 lnteracciones DNA-proteína durante la iniciación de la transcripción ,17

ñ, -:or -100 +l +100 +?00

Figura 1Lt6 Estructuras de los pro-
UCE 45 +20 motores eucariontes. Las abreviatu-
j:;):¡llñl;; ; --;;;";;;**;.-;;;;;:á; RNA polimerasa I ras están definid¿s en el texto.
PSETATA DPE
:ü;***i.; ,.) ;-,.::;::ar:;;:l;::: ; RNA polimerasa ll
CC ¡nr
Secuencia A §ecuenci¿ C
|i;;;;e;,& RNA polimerasa lll de tipo I

Secuencia A Secuencia B
::t:;,,;;;;l;; ; ZG;;;;:;;;;:;; RNA polimeraSa lll de tipo 2

PSE TATA
RNA polimerasa lll de tipo 3

Éstas son secuencias consenso y, por lo tanto, describen el "promedio" de

todas las secuencias promotoras de E. coli: las secuensias reales corriente
ar.t:iba de cualquier gen pafiicular podrían ser algo diferentes (cuadro 11.4).
Los nombres de las secuencias indican sus posiciones relativas respecto de1
p$1to en el que comienza la transcripción. El nucleótido localizado en este
pnnto se rotula "+1" y se encuentra alrededor de 20 a 600 nucleótidos
con"iente arriba del comienzo de la región de codificación del gen. El espacio
entre ambas secuencias es importante, porque coloca a los dcs motivos en la
misrna cara de la doble hélice, lo que facilita sus interacciones con el compo-
nente de unión al DNA de la RNA polimerasa (sección 11.2.3).

lcs pr*m:***r*s xwc*ri*,r",*#§ sss rncis r*n:pley*s

En los eucariontes, el término "promotor" se utiliza para describir todas las
secuencias importantes para Ia iniciaeión de la transcripción de un gen.
Para algunos genes, estas secuencias pueden ser numerosas y diversas en
sus funciones, e incluyen no sólo el promotor central, denominado a yeces
promotsr basal, que es el sitio en el que se ensambla el complejo de inicia-
ción, sino tarnbién uno o más elementcs promotores corriente arriba que,
corno su nombre lo indica, residen corriente arriba del promotor central.
Por lo general, el ensamblaje del complejo de iniciación en el promotor cen-
tral puede tener lugar en ausencia de ios elementos coruiente arriba, pero
sólo de manera ineficiente. Esto indica que por lo menos algunas de las pro-
teínas que se uneÍl a los elementos corriente arriba son activadores de la
transcripción y, por lo tanto, "promueven" la expresión génica. Así, se jus-
tilica incluir estas secuencias en el "promotor".

Cada una de ias tres RNA polimerasas eucariontes reconoce un tipo

diferente de secuencia promotora; de hecho, la diferencia entre los pro-
fnotores es la que define qué genes son transcritos por cuál polimerasa.
En los vertebrados, los detalles son los siguientes (figura 11.16):
* Los promotores de la RNA polimerasa I consisten en un promotor
central que abarca el punto de inicio de la transcripción, entre los
nucleótidos -45 y +2A, y un elemento de control corriente arriba
{UCE), alrededor de otras 100 pb corriente arriba.
a Los promotores de la RNA polirrerasa II son variables y se pueden
extender por varias kilobases corriente arriba del sitio de inicio de
la transcripcién. El promotor central está formado por dos seg-
§rentos principales: la secuencia TATA o *25 (consenso 5'*TATA-
WAAR-3', donde W es A o T, y R es A o G) y la secuencia
iniciadora (Inr) (consenso en mamíferos 5'-YCANTYY-3', donde
Y es C o T, y N es cualquier nucleótido), localizada alrededor del
nucleótido + 1. Algunos genes transcritos por la RNA polimerasa
 .irW'
:
. .' ,:.,1 .: .

,,ili

3t8 Capítulo .l) [nsarnblale del complelo de iniciación de la tri'r.r''p- cr

Promotoi central Posición +l II tierren sólo un* cle estüs dos cotr"rponentes dcl promotür centr¿tl,
D¡.JA y algunos, sorprendentemente, no tienen ninguno. Estos últin"rr¡s
se denominan genes "nul,¡-.". Aun así, son tra11süI'itos, aunque la
posición inicial de la transcripción es más variable que en un gdn
I La RNA polimerasa con una secuencia TATA o tlna secuencia Inr. Unos pocos günes
.t se une ál promotor
tienen secucncias adicionales qr.1e. a veces, se consideran paltc i.1';i
RNA polimerasa
,.,.. :..tttil promotor ccntfal. Por ejemplo:
n:trn: tTrii Tfl .' rri-ir:-i-'¡]:-'rr . E1 elemento promctor corriente abajo (DPE; localizado en las ,',,,''

pasiciones de +28 a +32), que tiene una sectlencia variable. L'r'ro

-" se 1o ha identificado por su capacidarl de unirse a TFIID, un cürll-
I Conversiórr del plejo proteico que desempeña un papei central en el complejo cJr
üI cerrado en abierto
complejo promotor preiniciación (sección 1 1.2.5).
r Un motivo de 7 pb dco en GC inmecliatamente con"iente arriba ',

de la secuencia TATA, que es reconocido por TFIIB, otro coilrpo-

nente del complejo de preiniciación.

. El elemento de secuencia proximal (PSE), que se localiza entle las

I Iniciación de la posiciones -45 -v -6ü corriente au'iba de los genes du' snRNA
I síntesis de RNA
transcritus por la RNA polimelasa IL

Al igual que los colxponcntcs ciel promotol'central, los genes transcri-

tos por la RNA polimerasa II tienen diversos elementos prolrotolcs
corr:iente an'iba, cu.vas lunciones se considelan en la sección I 1.1'2'

{
Despe¡e del promotor
Figura 1 'l " l7 Esquema generalizado
de los eventos que se producen
durante la iniciación de la transcrip-
ción. Se ilustra el promotor central en
verde, y se indica el sitio de iniciación
Ce la trar,scrrpc,ón con un purlo rojo
Después de la unión de la RNA poli-
,* I-os pfon-)otores de la ltNA polimerasa III scn valiables y pel'tenecL-n a
no menos de tres categorias. f),¡s cle e11as son atípicas. ya que las
secuencias importantes se ubican dentlo de 1os genes cuy¿l tr:ansct'ipciÓn
pronlueven. Estas secuencias suelen abarcal de 50 a 100 pb y colllirren-
clen dos secuenciits conservacias separadas por una región vailablc. La
tercela categot'ía de promotor de la I1NA polirnel'asa Ill es similar a los
promotores de la RlriA polinrerasa I{, con una secuencia TATA ,v una
selie de elementos promotoles adicionales (que, a veces, inclu¡,'en el
PSE mencionadc antes) ubicadas coll'iente arriba dei gen diana. Cabe
destacar que esta disposición se c¡bserva en el gen U6, el único gen dt
snRNA transcdto por la RNA pr:limet'asa III; todos ios denlás son traÍIs-
critos por la RliA poiimerasa II.
j l":.3 §*s*;lh3:tir r:i¡,,:i ,i:{};i?}l*;, ., l

meTasa, el complelo cerrado se con-

vierte en complejo abierto por rotura
de pares de bases dentro de una
corla región de la doble hélice de
DNA. Se inicia la síntesis de RNA,
pero no se Iogra transcripción exitosa
hasta que la polimerasa se aieja de la
región del promotor.
En un senticlo general, 1a iniciación de la transcripción opera rle la
luism¿r nlal'Iel'a con los cuatro tipos de RNA polinlel'asa que henro's
consicleraclo (figura 11.17). La polinlerasa bacteriana y las tt'es ¿nzi-
mas eucat"iontes contienzan por unirse, en folma dilecta o a trirvés d¿
pr"CteínaS accesOrias, a Su plqmotol' O a SuS SecgenciaS pl'olllotoras
centrales. A continuación, este complejo promotor cerrado se convier-
te en un complejo prornotor abierto pol: rotlll¿l de una linitada uailti-
clad cle po.es de base-s alrededor del sitio de iniciación cle la transclipciÓn.
Por último, 1a RIriA polimerasa se aleja del promotor. Este último paso
es más cornplicaclo áe io que podr'ía lrute.á,., pues algunos intentos de
la polinrerasa de lograr el "despeje" del promotor (promotor cte*rett'
ce) no son eficaces y dan origen a tr¿ulscfitos truncados, que se degra-
clan poco después cle su síntelis. Por 1o tanto, [a verdadel:a lir¡¿rlización
de lá etapa dó iniciación de la transcripción es el estabiecim.iento cle un
complejó de transcripción estable que esté transcribiendo actirarnc'trlc
el gen al que está unido.
,,tt,r,'i|li i....
r'::-i]...::':'
r'iiirrh,..
 lnteracciones DNA-proteína durante la iniciación de la transcripción II9

Si bien el esquema mosttaclo en la figura 1 1 . l7 es cotrecto en términos Secuencia -15

generales para las cu¿rtlo RNA pr:limeL¿]sas, Ios detalles son diferentes
p:ira cada una. Comenz&remos con los eventos rnás sit:rples, que sr:
observan en E. coll y otl'as bacterias para tratal', después, las ramifica-
ci,¡nes de la iniciación de la transclipción en los eucariontes.
.-
,
-'"ffi'ti.ffi
-m;!:, i r.
ffi¡}#-:: l ,','.Sw I¡
La RNA polimerasa
.-q.{*, i*l\ .: I reconocela
' ;t l. ,I Mt
. *:r4.,a -
§
!::it:it:,:i*:t,$* i;:-i l:¡;¡::f{'jü::i'i,+ ** iL {i.r ".!ii.il::fuJk;jlerl#
sec¡encia -35

En E. toli, se establece un contacto directo entre e1 promotor y 1a RNA \

poiimerasa. La especificidad de secuencia de la polimerasa reside en su
subunidad o: la "enzima central", que carece de este componente, sólo
puede fonnar uniones laxas e inespecíficas con el DNA.
t
Los estudios de mutación de los pt'olrlotoles de E. coli iran mostrado qr-re
los cambios dc la secuencia -35 af-ectan la capaciclad de unión de la RNA
polimerasa, mientras qr-re los cambios de la secuencia -10 influyen en la
cr:nversión del complejo promotor cerraclo en la forma abieta. Estos t'esul-
tados llt-'varon a crear el modek: de il-riciación de la transcripción en E. coli La apertura de
ilrr.'stracto en la figura I 1.18, donde e1 reconocimiento del promotor se pro- la hélice se inicia
en la secuencia -10
duce por interacción entre la sr,rbunidad o'y la secuencia -35, que forman
urr compiejo promotor cemado en el que la RNA polimerasa abarca alrede-
dor de 80 pb, desde corriente ardba de la secuencia -35 hasta corriente
de bajo de Ia secuencia -10. El complejo pl'omotor cerrado es convertido en
1a fonna abierta por la acción combinada de las subunidades B' y o, que
rompen los pares de bases dentro de la secuencia -10. El modelo es com-
patible con el hecho de que las secuencias *10 de diferentes prornotores
esrán constituiclas en fonna pr:incipzrl o total por pares de bases A-T, que
son más dóblles que los pares G-C, plles están uniclos só1o por dos enlaces Figura I 1.18 lniciación de la trans-
de hiclrógeno en lugar de tres (véase figura 1.BB). cripción en Escherichia coli. La RNA
polimerasa óe E. cali reconoce la
secuencia -55 como su secuencia de
La apeltura de la hélice implica contactos entre la polimerasa y la cade- unión. Después de la unión al DNA,
n* coclilicante (la que no es cr:piada en l{"1¡lA) y, también en este caso, l¿t comienza la transición de compleio
sul¡unidad o tiene una particip¿tción centt'al. Sin embargo, esta subuni- cerrado a abierto por rotura de pares
clad no es de fundamental irnpoltancia, porque se suele disociar iaunque de bases de la secuencia -'l0, ric¿ en
nc siernpre) poco después cle con'ipletada la iniciación, 1o que convie:rte AT. Obsérvese que, aunque 1a polime-
r¿sa se rnuestra como una eslructura
a la holoenzima (cr7Bp'o) en l¿l enzima central ((cr2Bp'), que lleva a cabo
única, es ia subunidad o la que tiene
ia l'ase cle elongación de la transcripción (sección 12.1.1). En un princi- actividad de unión al DNA específica
pio, 1a enzima central cubrc alrecleclor cle 60 pb clei DNA, pero poco des- de secuencla y, por lo t¿nto, reconoce
puós clel cornienzo de la elongación. la polirnerasa sufre un segundo la secuencia -35. Para eventos ulte-
cainbio c1e confornración, 1o que reduce su huella genética a 30-40 pb. riores que llevan al despeje del pro-
motor, remítase a la figura 11.17.

l¡:i:i::ririr¡ r-l¡: lt: tr**tr-,r'iür:i*x í3/:;{ {{} ft?é§,. ;;*lirr;*r*s¿r /J

¿.Cómo se compara la serie cle cventos fácilmente comprensibles observa-

clos en E. coli con 1os plocesos equivalentes en los eucariontes? El estudio
de la RNA polimelasa II mostrar'á que la iniciación de la tr¿inscripción
euc¿rlionte involucra mí]s proteínas y presenta ott'as complejidacles.

l.a pdmera diferencia entre la iniciación de la trar-rscripción en E. coli y en 1os

eucariontes es qlle las RNA polimerasers eucat'iontes no reconocen direct¿t-
nlente a sus secuencias pronrotoras centrales. Pala los genes tlansci'itos por
la Rl\lA polimerasa II, el contacto inicial se efectúa a través del factor de
trar:scripción general ((}Tf) TFIID, un «:mplejo fomaclo pr:r la proteína de
unión a TATA (TBP) y al menos 12 factores asociados con TBP, o TA.F. La
TBP e.s una proteira específica de secuencia que se une al DNA a tl'avés de
su inusual domiirio TBP (sección i 1 .1.1), c¡ue establece contacto con el surco
ntenol'en la región de la secuencia TATA. Los estudios pot'cristalografía de
t'a.yr:s X de la TBP revelan que tiene una lbnna en silla de montat que envuel-
¡20 Capitulo ll Ensamblaje del complelo de iniciación de Ia transcripctén
Figura I '1.19 La unión de TBP a la
secuencia TATA forma una plataforma
sobre la cual se puede ensamblar el
complejo de iniciación. Se muestra el
dímero de proteinas TBP en marrón y
el DNA, en plateado. lmagen cortesía
de Song Tan, Penn State University.
Figura 1 1.20 Dímeros formados
entre TAF¡142frAFt$2 y las histonas
H3/H4. Los dibujos muestran las orien-
taciones de los pliegues de histonas del
par de proteínas de cada compleio.
Cuadrc I1.5 Funciones de los factores de transcripción generales humanos (CTF)
ffifÍffi#1il:ñ;i.t]. §ff:,
TFIID (componente de TBP)
TFilD (rAD
TFIIA
TFIIB
TFIIF
tFiltr
TFIIH
ve parcialmente a la doble hélice y for"ma una platafoirna sobre la que-se
puede ensamblar ei resto del complejo de iniciación (figura 1 1 . 1 9).
Los TAF ayudan en la unión de la TBP a l¿r secuencia TATA y, en conjunto
con otras proteínas denominadas cofactores dependientes de TA§ e inieia-
dor (TIC), qr.rizá participen también en el reconocimiento de la secuencia Inr.
sobre todr: en ios promotores que carecen de una secuencia TAIA. Los T;{fi
son proteínas interesantes que parecen desempeñar diversos papeles duran-
te la iniciación de ia transcripción y, asimismo, dutante otros eventos relacio-
nados con el ensamblaje de complejos n*ultiproteicos en el genoma. Cinco de
los TAF de lwadura también están presentes en SAGA, uno de los comple-
jos de acetiltransferasas de histonas que se trata en la sección 10.2.1, y el
TAFl de Drosophila melanogaster tiene una actividad de cinasa que le per-
mite fosforilar la serina-53 de ia histona H2B, io que activa la expresión de
genes adyacentes (sección 10.2.1). Asimismo, se ha implicadr: a los TAF en
el conrrol de1 ciclo celular de diversos eucariontes y la regulación de los cam-
bios evolutivos que determinan la formación de gametos en los animales.
Estudios estructurales de los TAF han aportado un indicio sobre cómo de-
sempeñan sus múltiples papeles; han mostrado que por 1o menos tres de ellos
contienen trn pliegue de histona -un motivo de unión al DNA no específico
de secuencia, que consiste en una hélice a larga flanqueada a cada iado por
dos hélices u rnás coftas*, que es una caracteústica de las histonas (r'éase
cuadro 11.2). En el complejo formado entre TAF¡42 y TAFg62, los dos plie-
gues de histona están orientados casi de la misma manera que en el dímero
áe histona lH3/H4 hallado en el tetrámero central de la partícula centlal del
nucler:soma (figura 11.20). Se ha propuesto que estos TAF podrÍan fom:ar
áYñ+
,,,,§
t*f,,ez "
.
::,::::.:,;p
'v
" üg
f&
r r f .!".
'. ' -***É /" N
,,aN" E{&t ...Lffi
:l --ka,
,,,r,rrll1;tl§:li
¡Frr:r:# ¡w
,. .-:.*§ .:.,,,. L "#'é
*ia
asL
ha. q,@ -a;
t:qr$*r § .G.
qffi#,
@x..-, A
§ .ki{iitirr¡-
Función
Reconocimiento de la secuencia TATA y, posiblemente, la secuencia lnr; forma una
plataforma para la unión de TFIIB
Reconocimiento del promotor central; regulación de la unión de TBP
Estabrliza la TBP y la unión de TAF
lntermediario en el reclutamiento de la RNA polimerasa ll; influye en la selección del
punto de inicio de la transcripción
Reclutamiento de la RNA polimerasa ll; interacción con la cadena codificante
lntermediario en el reclutamiento de TFIIH; modula las diversas actividades de TFIIH
Actividad de helicasa responsable de la transición del complejo Promotor cerrado ¿1
abierto; posiblemente'influya en el despeje del promotor por fosforilaciÓn del
dominio'C terminal de la subunidad más grande de la RNA polimerasa ll
 lnteracciones DNA-proteína durante la inlciación de la transcripcién

urlü estrllctura de unión ai DNA similal a un nucleosorna: este seud,¡nucleo-

scxra actuaria como plataforrr.a para el ensan:blaje del ci:mplejo de inicia-
ción. La idea es interesante, pero se lequiele mayof inl,estlgación para
determinar si las similitudes enti:e TAF e histon¿rs se extienden a lcs detalles
de la unión entre el con'rplejo de iniciación y su DNA diana. Los TAF care-
c*n c1e ciertos aminoácidos que se consideran esenciales para estabilizar los
contactos entre nucleosolras leaL's y DNA, y las sirnilitudes podrian retl-iar
sólo una equivalencia de las interacciones ploteína-pr"oteína dentro de1 com-
plejo de iniciación y elnr.lcleo,.oma, en lugar de tener una importancia dir*c-
ra respecto cle la unión alDNA.

Después c1e c¡ue la TBP se ha unido al plomotor cenral, se fblma el cour-

plejo de preiniciación (FIC) por reclutamiento c1e otros GTF. cuyas fun-
ciones se resumen en el cuadro 1 L5. La unión a TBP induce una to¡sión
de ah'ededor de 80" en el DNA, que ensarlcha el sllrco menor en 1a
región de Ia secuencia TATA (figura 11.21). Ahora, el TFIIB se une a1
cor.nplejo, lo que implica contactos con la secuencia TATA, a través de1
surüo nlenor ens¿inchado, y con e1 motivo de reconocimienti: de TFIIB
intr:ediatamente colriente arliba de la secuencia TATA, a tt'avés del Figura 1,l.21 La unión deTBP induce
sur:üo mayor (sección 11.2.2). Estas uniones garantizan Ia posición una torsión de la rnolécula de DNA.
cor'recla respecto del sitio de inicio de la transcripción por'la RNA poli- Se ilustra la TBP en violeta y el DNA en
verde. La tarsión del DNA abre el surco
melasa Ii, que es llevada hacia el cr:mplejo por TFIIF. El complejo de
menor; lo que facilita la unión de TFilB.
preiniciación se completa con el agregado de TFIIE y TFilH, el último (Cortesí,a de Stephen K. Burley).
de krs cuales tiene actividad de helicasa y se considera qlle rontpe el apa-
reamiento cle bases dcl DNA, lo que conr.'ieLte al promotor en su forma
abierta. El TFIIH es una proteína interesante, pues talrbién participa en
la repar:ación clel Dl'lA (algunos de sus tipos están acoplados con la
transcripción), y volveremos a considerarlo al estudiar Ir:s mecanismos
de reparación del DNA en la sección 16.2.2.

La activ¿rción del complejo de iniciación requiele el agregado de grupos

fbsf¿rto al dorninio C terminal (CTD) de Ia subunidad más grande de la
RNA polirnerasa ll. En los mamíferos, este dominio consiste en 52 repe-
ticiones de la secuencia de siete airinoácidos Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-
Ser. Dos de las tres selinas de cada unidad de repetición se pueden
modificar por agregado de un g1"Llpo fosfato, lo que causa un cambio
su-ctancial de las plopiedades iónicas de la polin-rerasa. Unavez fosfoli-
1ac1a, la polimerasa puede abandonar el cornplejo de iniciación y comen-
zai: a sintetizar RNA. La fosforilación poch'ía estal a cargo de TFIIH, que
tiene la capacidad de pr:oteincinasa apropiada, o pod::ía ser u1la ftinción
ciei mediador (sección 11.3.2), que tlansduce señales de las proteínas
activ¿rclot'as que regulan la erpresión de genes individuales. Tras la par-
ticla de la polimerasa, por 1o menos algunos de los GTF se desprenden
de1 promoto'' central, pe1'o permaílecren TFilD, TFIIA y TFIIH, lo que
posibilita la reiniciación sin necesidad de reconstruir todc¡ el ensambla-
je desde el conrienzo. Pr:r lo tanto, la reiniciación es un proceso rnás
rírpido que la iniciación primaria, 1o que significa qLle una vez que un
gen está activado. se pueclen injci¿rr transcritos ¿r partir de su promotor
con relativa f'acilidad h¿rsta el momento ei"l que un nuevo conjunto de
señales desactive al gen.

l*i;:i*:íq|* d: l* ly¡i.:;srt;"t.¡ ';,- - ril;4 p*lirn*rxs*s i'¡ llt

La iniciación de Ia transclipción en los promotoles de RitiA polimerasa I
y ill irnplica eventos sinrilares a los observados con la RNA polimelasa II,
pelo los detalles son diferentes. Una de las similitudes más llamatiyas es
que la TBP, identificada plimero como el componente ciave de unión al
I)NA específico cle secuencia del complejo de preinici¿rción de RNA poli-
t27 Capítulo l'l [nsarr.lble1e del com¡'e1r C. rn l,¿r,cr Ct la lrtnstriprÓn

Figura 1 1.22 Niveles primario y

secundario de regulación del geno-
ma. Según este esquema, ia regula- PRTMARTA lniciación de
ción "primaria" de expresión del aI I la transcripción
genoma se produce en la iniciación
de la transcripción, y este paso deter-
mina qué genes son expresados por
#ffi
una célula particular en un determina- ! sECUNDARIA I Estadics rnás tardios

do momento y establece las tasas

I .l
-/\ de Ia expresién de genes

relativas de expresión de los genes ./\ ¿\

que están activados. La regulación lr¡lir ttta :i ,,¡ ,"¡ ..r!

"secundaria" consiste en todos los

pasos de la vía de expresión dei
;r.{}§
a!&! ri.
l-¡.r,I ,"jej 1,.,t,

genoma posteriores a la iniciación de Teiido Tejido Tejido Tejido

la transcripción y sirve para modular la
cantrdad de proteína sintetizada o
para modificar de alguna manera el
carácter de la proteína, por eiemplo,
a través de modifrcación química.
1)
merasa ll, también participa en la iniciac,ión de 1a transcripción por ias
otras dos I1NA polimerasas eucariontes.
El complejo de iniciación de la RliA polimerasa I está fr:rmado pol cua- :l

tro complejos proteicos, además de ia polimel'asa propiamente clicha.

Uno de éstos, UBF, es un clímero de proteínas idénticas, que inter¿rctúa I
ci:n el plomotor central )'- co11 el elemento de conÍol corriente ari-iba I

(véase figgra 11.16). El UBF es otr:¿r proteína que, como aigunos de k:s t.r.

TAF de la RNA polimelasa II, se ¿isemejer et una histona ¡, puede form¿ir

..

una estructura sirnilar a un nucleosoma en la región pronlotora. Un

segunclo complejo proteico, denonrinado SL1 en ios seres humanas y
TIFIB en los 1'aton€s, contiene TBP il junlo con UBF'. dirige a la RirA
pr:limerasa I y a los dos írltimos cornplejos. TIFIA y TIFiC. hacia el pr:o-
mctor. Alprincipio, se pensaba que el complejo cle iniciación se consiru- .,d
ía c1e manela escak:nacla, pero estudio-c recientes sugieren que la R.NIA ..t{
polimerasa i se une a los cuatros complejos proteicos antes cie recono-
,, I
cer al promcltor y que todo el ensamblaje se une al DNA en un solo paso, L
L
-t
Los plomotores cle RNA polimerasa lll tienen estructura variable (r,éase lig:r"r-
ra 1 1 . 1 6). y esto se ve reflejado por la falta de unilbrrnidad de los prr:cesos a
,, \
a
travé,s dc los cuales se los reconoce. La iniciación en las difelentes ciitegrit'ías
de promotor cle RNA polinrela-*a ill
requiere clistintr:s conjuntos cle GTI
,.c
¡

pelo cada tipo cle proceso de iniciación involucla a TFIIIB. una cle cr:yits C,
subuniclades es la TBP. Con plomotores clel tipo obsewado en el gen de )
snR|{A de U6, que contiene una secuencia TATA. es prcbable que ia TllP se
una clirectamente ¿11 Dh,iA. En los p1"omotol'es clc la RNA polimerasa I{{ que .,.t'.

lesiden dentro de genes y que carecen de secucncia T§llA, la unión c1c TllP i..

.F
tiene lugar a través cle un p:rr de factores de ensamblaje clenominado.q TIillTA :U
TFIIIC. El n<¡rltre "f¿rctrx cle ensamblaje" inclica que estas clos proteínas Ll
"v
son necesarias sólo para l;r uniór-r de TIIP al promotor y que no son esencia- .ü
les pala la unión utrtelir:r'c1e 1a I1NA polirnerasa IIL .'t ,
,¿
ff
á *F & & $ * * *§
E : "5 áq*H{*§*fl,*Wwe ffi* §ffi §§§§{X&*&WW ,cl
I
o
&* §m *wwwwxw&pwá&w Xl
A nledida que ayancemos por l,:s siguientes capítulos. l'lallalcuros una rI,(
scrie de esti:ategias que utilizan los organistnos para regular la expresiÓn t{
c1e los genes individr-rales. Descubriremos que casi todr:s los pasos de la p
vía que Ileva del genoma al pt'oteoma están slljetos a cierto grado de con- d,
trol. De todos estos sistenras reguladoles, palece que la iniciación de la
tr:ansclipción es ia etapa en la que se ejel'cen los contloles cl'uciaies C
sobre la expresión de gcncs incli,-icluales (ios controles que tienen ia Ll;
máxima lepercusión sob¡:e las pr:opieclades bioquímicas de la cél¡:la).
 Regulación de la iniciación de la transcripción

L,sr;,es perfectamente comprensible. Tiene sentidü que la iniciación de {A) Un gen de choque térmico de f. cali
l¿ tra;rscripción, a1 ser e1 primer paso de la expresión de1 genofila, sea la
etapii de regr"rlación "primaria", que es el nivel de regulación que deter-
Promotor de

rnina qué genes se expl'esan. Cabría esperar que los pasos ulteriores de Cen de choque térmico
ls r,,il respondan a la regulación "secundaria", cuya función no es desac-
rivar o activar genes, sino modular la expresión mediante pequeños cam-
bios c1,: la velocidad de síntesis dei producto proteico o, quizás, algún ': -44 -36 -
tipo cle modificación del carácter de1 producto (figura 11.22).
10

I ., . ll T il i ¡! t- {", {- ... .. -{- {:,}. i l,l i' ...

En el capítulo 10 consideramos cómo puede influir la estructura de la cro-
rnatina en la expresión génica al controlar ia posibilidad de acceso de las
secuL'ncias promotoras a la RNA polimerasa y sus poteínas asociadas. Ésta
(B) Reconocimiento por
es sólo una manera como puede regularse la iniciación de la transcripción. la subunidad o,32

Para cbtener un cuadr<¡ más amplio, se establecen alp¡.rnos pdncipios gene-

¡le#ña
rales cn 1as bacterias y, después, se examinan los eventos en los eucariontes. {ti*attr
\ 70 -4r
§
¡¡.al{d§La&a&aa§¡¡{¡f*!*e § ¡

tr"- "r"..""... -!- "..,"

La RNA polimerasa o70 no se puede unir

En las bacterias como E. coli, se reconocen dos maneras de controiar la ,,. 12 {

- *x,
iniciación de la transcripción:
.-@--

a Control constitutivo, que depende de la estructura del promotor. La RNA polimerasa o32 se une al promotor

* Control regulador, que depende de la influencia de las proteínas

de choque térmico

reguladoras.

*"* ssfr¿¡rfx rrx r§*§ g*r Figura 11.23 Reconocimiento de un

d* lrv frer¡:¡s*r§p*{*n gen de choque térmico de
Escherichiq coli par la subunidad
La secuencia consenso para ei promotor de E. coli (sección 11.2.2) es o:2. (A) La secuencia del promotor de
bastante variable, con un espectro de motivos diferentes permisibles choque térmico es diferente de la del
tanto en la secuencia -55 como en la -10 (véase cuadro 11.4). Estas promotor normal de E. coli (compare
f. variaciones, junto con las características de la secuencia peor definida con el cuadro I L4). (B) El promotor
alrededor del sitio de inicio de la transcripción en alrededor de ios pri- de choque térmico no es reconocido
meros 50 nucleótidos de la unidad de transcripción, afectan la eficiencia por la RNA polimerasa normal de E. coli
que contiene Ia subunidad G7o, pero es
del promotor. Se define eficiencia como la cantidad de iniciaciones pro-
reconocido por la RNA polimerasa o32,
ductivas promovidas por segundo; e iniciación productiva, como la que que está activa durante el choque tér-
determina el despeje del promotor y el comienzo de la síntesis de un mico. Abreviatura: N, cualquier nucleóti-
transcrito de longitud completa por la RNA polimerasa. No se conoce la do. Véanse más detalles sobre el uso
manera exacta como la secuencia del promotor incide en la iniciación de nuevos factores o por las bacterias
pero, de nuestro análisis sobre los eventos involucrados en la iniciación en la sección 14"3.2.
de la transcripción (sección 11.2.3), podríamos prever, intuitiyamente,
que la secuencia precisa -35 influirá en el reconocimiento por la sub-
unidad o y, por 1o tanto, en ia tasa de unión de la RNA polimerasa; que
la transición del complejo prornotor cerrado a abierto podría depender
de la secuencia -10; y que la secuencia del nucieótido +1 e inmediata-
mente corriente debajo de éste podría influir en la frecuencia de inicia-
ciones abortivas (las que terminan antes c1e avanzar mucho en la unidad
de transcripción). Todo esto es especulativo, pero es una "hipótesis de
trabajo". Lo que queda olaro es que la eficiencia de diferentes promoto-
res varía 1.000 veces: los promotores más eficientes (ilamados promo-
tores fuertes) dirigen 1.000 veces más iniciaciones productivas que los
promotores más débi1es. Nos referimos a estas diferencias como veloci-
dad basal de iniciación de la transcripción.

Cabe observar que la velocidad basal de iniciación de ia transcdpción de

ul't gen está programada por Ia secuencia de su promotor y, por 1o tanto,
en circunstancias normalesr no puede ser modificada. Podría ser cambia-
324 Capítulo 11 tnsamblaje dei complejo de inici¿ción de ia transcripción

(A) Operador de lactosa laú lacY locA

Operón de lactosa

-20 * +20
;i-40
!

iri¡i¡;&idó&üi{.l A G G c . : i Á
tt l0

: ;;
ll I LALA*',
l

\*r!t¿nt¡tt -,t¡

(B) Modeio original de la regulación de lactos¿

AUSENCIA DE LACTOSA PRESENCIA DE LACTOSA
El represor de lactosa se EI complejo represor-
puede unir al operador
La RNA polimerasa
no se puede unir r,
. . La RNA polimerasa alolactosa no se puede
se puede unir unir al operador
al promotor

.. -.-.r,r-,.,ffi,.,.¡i61'l.,!'!,l!¡¡:¡.{!e$r
tocl i
*---ffiai
lacZ
¡¡,ó,r.**.6i¡&,ryfl¡

Represor
de lactosa
Represor
de lactosa
r Alolactosa

Figura 1 1.24 Regulación del operón de lactosa de Eschericttia coli. (A) La secuencia del operador reside inmediatamente corrien-
te abajo del promotor del operón de lactosa. Est¿ secuencia tiene simetría inveftida: cuando se lee en la dirección 5'--+3',la secuencia
es la misma en ambas cadenas. Esto permite que dos subunidades de la proteína represora tetramérica hagan contacto con un¿ sola
secuencia del operador. (B) En el modelo original de regulación de lactosa, se considera que el represor de-lactosa es un simple dis-
positivo de bloqueo que se une al operador e impide que la RNA polimerasa acceda al promotor. Por lo tanto, se desactivan lbs tres
genes del operón. Esta es la skuación en ausencia de lactosa, aunque la transcnpción no es bloqueada por completo, pues el repre-
sor ocasionalmente se desprende, lo que permite que se formen unos pocos transcritos. Debido a este nivei basal de transcripción, la
bacteria siempre tiene unas pocas copias de cad¿ una de las tres enzimas codificadas por el operén (véase figura 8.BA), probable-
mente menos de cinco de cada una. Esto significa que, cuando Ia bacteria encuentra un¿ fuente de lactosa, puede transpoñar unas
pocas moléculas al interior de la célula, y dividirlas en glucosa y galactosa. La alolactosa, un isómero de la lactosa, es un intermediario
en esta reacción, que induce expresión del operón de lactosa al unine con el represor, lo que provoca un cambio de conformación
de este último que ie impide unirse al ope¡ón Esto permite que la RNA polimerasa se una al promotor y transcriba los tres genes.
Cuando Ia inducción es completa, hay alrededor de 5.0o0 copras de cada producto proteico en Ia célula. Cuando se agota ej sumi-
nislro de lactosa y ya no hay alolactosa, el represor se vuelve a unir al operador y se desactiva el operón. Los transcritoidel operón,
que tienen una semivida inferior a 3 minr:tos, se degradan y ya no se fabrican enzimas. Obsérvese que las formas de las estructuras
del operón y la polimerasa aquí ilustradas son puramente esquemáticas.

da por una mutación que altere un nucleótido crucial del promotor, 1o cual
sucede sin duda algunas veces, pÉro no es algo que la bacteria pueda cün-
trolar. En cambio, la bacteria puede determinar qué secuencias promotor"as
son favorecidas modificando la subunidad o de su RNA polimerasa. La sub-
unidad a'es la pafte de la polimerasa que tiene la capacidad de unión al DNA
específica de secuensia {sección 11.2.3}, de modo que reemplazar una vor.
sión ds esta subunidad por una versión diferente con un motivo de unión al
DNA ligerarnente distinto, y por ende una especificidad de secuencia modi-
ficada, detenlinaría que se reconociera un conjrmto diferente de promotores.
En E. coli,la subunidad s convencional, que reconoce la secuencia promo-
tora corisenso y dirige así ia transcripción de la mayoúa de los genes, se deno-
mina <v70 (su masa molecular es de alrededor de 7O kDa). E. coli también
tiene una segunda subunidad §, §i2, que es fabricada cuando la bacteria se
expone a un choque térmico. Durante éste, E. ctii, cama otlos organismos,
activa una serie de genes que codifican proteínas especiales, que ayudari a la
bacteria a tolerar la agresión (figura 1,\.23). Estos genes tienen secuencias
promotorás especiales, que son específicamente reconocidas por la subuni-
dad o32. Por lo tanto, la bacteria puede activar todo un espectro de genes
diferentes mediante una simple alteración de la estructura de su RNA poli-
merasa. Este sistema es común en las bacterias: por ejemplo, Klebsiella pneu-
moniae lo utiliza para controlar la expresión de genes involucrados en la
fijación de nitrógeno, en este caso con la subtrnidad c54, y especies de
Bacillus emplean todo un especko de diferentes subrinidades o" para activat
w
lnteracciones DNA-proteina durante la iniciación de la transcripción

AU5ENCI,A DE TruMÓTANO PRESENCIA DE TMPTÓTANO

El represor de
kiptófano EI compleio
no se puede unir represor-triptófano se
La RNA polimerasa al operador La RNA polimerasa une al operador
se puede unir no se puede '...
unir ,
_
':
alpromotor .. .: alpromotor '§
. trpE
---
It*pre:*r
*e trlpt*i*n*
ürpr*s*r Triptófano
d* tripi*f*;:*

o dr:sactivar gnipos de genes durante el cambio de ctecimiento normal a for-

Figura 1 1.25 Regulación del operón
irinción de esporas (sección 14.3.».
de triptófano de Escherichia coli. La
regulación se produce a través de un
., sistema represor-operador de manera
similar a la descrita para el operón de
La estn:ctura del promotor detemrina la velocidad basal de iniciación de la lactosa, pero con la diferencia de que
ü:anscripción de un gen bacteriano pero, con excepción del reconocimiento el operón es reprimido por la molécu-
por subunidades o alternativas, no aporta ningún medio general por el que la reguladora, triptófano, que es el pro-
la expresión del gen pueda responder a cambios del medio o a requerimien- ducto de la vía bioquímrca
especificada por los genes del operón
ti:s bioquímicos de la célula. Son necesarios otros tipr:s de control regulador.
(véase figura 8.88). Cuando hay triptó-
fano y, por ende, no es preciso sinteti-
A principios de la década de 1960, Francois |acob, |acques Monod y ottos zarlo, el operón se desactiva porque el
g*netistas sentaron la base de nuestros conocimientos del contt'oi regulador complejo represor-triptófano se une al
sr:bre la iniciación de la transcripción en las bacterias al estudiar el operór-r de operador. En ausencia de triptófano, el
lactosa y otlos sistemas n:odeios. Ya hemos visto cómo este trabajo pemritió represor no se puede unir al operador
y el operón se expres¿.
descubrir el promotor del operón de lactosa (sección 11.2.2). Asimismo,
d*terminó la identificación del operador, una región adyacente al promotor'
que regula la iniciación de la transcripción de1 oper'ón (figura 1 1.24A). El
modelo original consideraba que una ploteína de unión al DNA -el represor
de lactosa- se unía al operador e impedía que la RNA poiimerasa se uniera
al promotor, simplemente por negarle el acceso ai segmento de DNA perti-
ner-rte (§gJura 11.248). Que elrepresor se una depende cle la presencia en la
célula de alolactosa, un isómero de lactosa; esta última es el sustrato de la vía
bioquímica de las enzimas codificadas por los tres genes del operón. La alo-
lactos¿r es un inductor del operón de lactosa. Cuando hay alolactosa, ésta se
une al represor de lactosa, 1o que caus¿t un ligero cambio estmctural que
impide que los motivos HTH del represor reconozcan al operador como un
sitio de unión al DNA. Por lo tanto, el compiejo alolactosa-represor no se
puede unir al operador, Io que permite que la RNA polimerasa acceda al pro-
motor. Cuando se agota el sui:rinistro de lactosa y no queda nada de alolac-
tosa para unirse a1 represol, éste se r,'uelve a unir al operador: e impide la
tr;uiscripción. Por consiguiente, el operón se expresa sólo cuando se necesi-
tan las enzimas que éste codifica.

La secuenciación del DNA de la región de conÍol y los estuclios estruc-

tulales del represor unidos a su operaclor han confirmado la mayor parte
del esquema original de regulación del operón de lactosa. La única com-
plicación ha siclo el descubrimiento de qr-re el represor tiene tres posibles
sitios de unión, centrados en las posiciones nucleotídicas -82, +11 ¡r
+412. El operador, definido por estuclios genéticos, es 1a secuencia loca-
lizacla en +11 (véase figura 11.24A), y cabría esperar que éste fuese el
ílnico de los tres sitios que al ser ocupado por el represor impidiese el
ricceso de la RNA polimerasa al promotor. Pero los otlos dos sitios tam-
lrién desempeñan aigírn papel en la represión, pues su eliminación, cle
1ranel'a individual o en conjunto, altera de manera sigrificativa la capa-
cidad del represor de desactivar la expresión de los genes. El represol es
 w
'¡'
"il

126 Capítulo II Ensamblaje del compieio de iniciación de la transcripción

Figura 11.26 Las múltiples dianas trpR

del represor de triptófano.

aroH Operón de triptófano

Controla la síntesis de una Controla la síntesis de enzimas para los

enzima para un paso temprano de la pasos finales de la síntesis de triptófano
síntesis de aminoácidos aromáticos

un tetrámero de cuatro subunidades idénticas que trabajan en pareE

para unirse a un solo operador, por lo que el represor tiene la capacidad
de unirse a dos de los tres sitios del operador al mismo tiempo. Una
posibilidad es que la unión de un par de subunidades al sitio + 1 1 sea
potenciada o estabilizada por la unión del otro par de subunidades al
sitio -82 o +412. También es posible que el represor pueda unirse a un
par de secuencias del operador de manera tal que no bloquee la unión
áe la polimerasa ai promotor, pero sí impida un paso ulterior de la ini-
ciación, como la forrnación del compiejo prornotor abierto.

El principio básico del control regulador de la iniciación de la transcripción,

ilustrado por el operón de lactosa, es que la unión de una proteína de unión
al DNA ásu sitio de reconocimiento específico puede influir en los eventos
involucrados en el ensamblaje del complejo de iniciación de la transcripción
o en la iniciación de la síntesis productiva de RNA por una RNA polimera-
sa. Se observan algunas variaciones de este tema en oftos genes bacterianos:
a Algunos represores responden no a un inductot sino a un correpre-
sor; por ejemplo, el operón de triptófano de E. cali, que codifica un
conjunto de genes involucrados en la síntesis de triptófano (véase
figura B.BB). A diferencia del operón de lactosa, la molácula regula-
dora del operón de triptófano no es un sus*ato para la vía bioquími-
ca pertinente, sino el producto, el triptófano propiamente dicho
(figura 1t.25). Sóio cuando e1 triptófano se une al represor de trip'
tófano, este último puede unirse al operador. Por lo tanto, el operón
de triptófano se desactiva en presencia de triptófano y se activa cuan-
do se necesita este aminoácido.
., Algunas proteínas de unión al DNA son activadores, en lugar de .'.'.,i',i,,,',,',,t-'
ejemplo
.epresore.o, de la iniciación de la transcripción. En E. colí, el
ttl")1"':":':"""'':"'

mejor estudiado es la proteína activadora por catabolitos, que se unc

a sitios corriente arriba de varios operones, incluido el operón de lac- '
::':':',:,t:,',':,':.::::,
,

tosa, y aumenta la eficiencia de la iniciación de la transcripción' 'l,..li.,.r,,., ,,,

quizá por establecer un contacto directo con la RNA polimerasa. En ..,,iltli...ii.i l

la sección 14.1.1 se analiza la función biológica de la proteína acti- ,,,,r.:::':.'r,

vadora por catabolitos.
e El mismo represor o activador puede controlat dos o más promoto:
res. Por ejemplo, en E. coli, el represor de triptófano controla el opel
rón de triptófano, el gen aroH (que especifica una enzima de un paso
temprano de la vía bioquímica que produce triptófano) y el gen lrpff
(que es el propio gen del represor de triptófano, lo que significa-,q4e
liproteínárepresóra es sintetizada sólo cuando se la necesita) (figu¡
ru 11.26).
M l''
.,,,.,,l]','l ' Regulación de la iniciación de la tranxripción
,"li ilt:ii'.'i i ,

' ,a i"..'

Las secuencias de reconocimiento de las proteínas de unión atr DNA

l'.¡¡,.l..l...' pueden trabajar en forma aislada o conjunta para aumeatar o repri-
'.:i..
n:ir la transcripción de genes con los que no están estrechamente
relacionadas. Estos potenciadores o silenciadores no son comunes
::l'

,'
en las bacterias, aunque se conocen algunos ejemplos, como un
.......
potenciador que actúa sobre ios genes de choque térmico de E. coli,
cuyos promotores son reconocidos por la versión o52 de la RNA poli
',, '' merasa. Como están tan lejos de los genes que controlan, sólo pue-
ta den establecer un contacto con la RNA polimerasa si el DNA forma
un bucle. Una característica típica es que un solo potenciador o silen-
ciador puede controlar la expresión de más de un gen.
.. .t, ''

Todos estos principios básicos de regulación de genes se aplican no sólo

a las bacterias, sino también a los eucariontes, como se verá en la
siguiente sección.

,§§"§.X §*xxárm§ d* Xm §xx§c§mq&*sx d* $m grmrxs«r&pc§&m

*ffi §es §&§€erá#§s€es
La lección clave que hemos aprendido del examen del control de la trans-
:
cripcién en las bacterias es que las proteinas de unión al DNA que rscono-
cen secuencias específicas localizadas cerca del sitio de unión para la RNA
polimerasa pueden influir en la iniciación de la transcripción. Esta también
es la base del control de la transcripción en los eucariontes, con dos dife-
rencias, la primera de las cuales está referida a la velocidad basal de inicia-
ción de la transcripción. La RNA polimerasa bacteriana tiene gran afinidad
por su promotor y la velocidad basal de iniciación de la transcripción es
relativamente alta para todos los promotores, excepto los más débiles. En
la mayoria de los genes eucariontes, es válido 1o inverso. Los complejos de
preiniciación de las RNA polimerasas II y III no se ensarnblan de manera
e{iciente, y 1a velocidad basal de iniciación de la transcripción es, por lo
tantc, muy baja, independienternente de cuán "fuerte" sea el promotor.
Para lograr una iniciaciónettcaz, otras proteínas deben activar la formación
del complejo. Esto significa gue, en comparación con las bacterias, los
eupariontes aplican diferentes estrategias para controlar la iniciación de la
transcripción y los activadorep desempeñan un papel mucho más promi-
nente que las proteínas repressras.

La segunda diferencia es que, al igual que todos los aspectos de la expresión

del genoma, los procesos que regulan la iniciación de la transcripción en los
eucariontes son mucho más complejos que los observados en las bacterias.

os pr*n:*rf*res *r¡c*r'lerrlfws {* {tti I n * fi ¡¡:<5#¿;f*s r*Sr{"rfff##r*s

fl

Esta mayor complejidad es evidente cuando se examinan promotores

eucariontes. La iniciacién de.la transcripción de un gen típico que
codifica proteínas es influida por diversas señales bioquímicas dife-
rentes que actúan juntas para garantizar que el gen se exprese en el
nivel preciso apropiado para las condiciones que prevalecen dentro
y fuera de la célula en la que se ubica el gen. Un promotor de RNA
polirnerasa II puede considerarse una serie de módulos, cada uno de
1os cuales comprende una secuencia corta de nucleótidos y actúa
como el sitio de unión para una proteína que incide en el ensambla-
je del complejo de iniciación de la transcripción. La RNA polimera-
sa II transcribe rnuchos genes diferentes (más de 3O:000 en los seres
humanos), pero sólo hay una cantidad limitada de módulos promo-
tores para esta polimerasa. Por lo tanto, el pakóa de expresión de un
gen está determinado no por un médulo individual, sino por la com-

328 Capítulo 11 Ensamblaje del ccmplelo de iniciación de la lranscripcrón
CC A5 OCT
s0 pb
Figura I L27 Estructura modular
del promotor del gen de insulina
humano.
Figura 1 1.28 Promotores alternati-
vos. Se muestran las posiciones de
siete promotores altern¿tivos para el
gen de distrofina humano. Las abrevia-
turas indican eltejido dentro del que
cada promotor es activo: C, tejido corli-
cal; M, músculo; Ce, cerebelo; R, tejido
retiniano (y también tejido cerebral y
cardíaco); SNC, sistema nervioso cen-
tral (y también riñón); S, células de
Schwann; C, general (la mayoría de los
tejidos aparle de músculo).
TStmr
.,.rrlt|¡-¡¡1l,¡¡,, ..
i, ilt...-.1
E2 A3 CRE A2 EI A1 G1 TATA Cen
Nombre del módulo GC, A5
ii.i&;¡ Elementos promotores basales
."-i¡x-., Módulos específicos de cel,.rla
binación de módulos dentro de su promotor y, quizá, por sus posi-
ciones relativas. El grado de iniciación de la transcripción que tiene
lugar depende de qué módulos están ocupados por sus proteínas de
unión en un momento dado.
Los módulos de un promotor de RNA polimerasa II pueden categorizar-
se de diversas maneras. Un esquema es el siguiente:
'*, Los módulos del promotor central (sección 11.2.2), de los cuales los
más importantes son 1a secuencia TATA y la secuencia Inr.
Los elementos promotores basales son móduios presentes en muchos
promotores de RNA polimerasa Ii y fijan el nivel basal de iniciación de la
fianscripción, sin responder a ninguna señal específica de tejido o de de-
sanollo. Éstos son la secuencia CAAI (consenso 5'-GGCCAATCT-3'),
reconocida por los activadores NF-1 y NF-Y; la secuencia GC (consenso i
5'-GGGCGG-3'), reconocida por el activador Sp1;y el móduio octáme- I
ro (consenso 5-ATGCAA,T\T-3'), reconocida por Oct-l. !
Los módulos de respuesta se encuentran corriente arriba de divcrsos
genes y permiten que la iniciación de la transcripción responda a
señales generales extracelulares. Por ejemplo, ei módulo de respues-,
ta a AMP cíclico CRE (consenso 5'-'WCGTCA-3', donde W es A o-
T), reconocido por el activador CREB; el módulo de choque térmicir
(consenso 5' CTNGAATNTTCTAGA-3', donde N es cualquier
nucleótido), reconocido por Hsp70 y otros activadores; y el módulo
de respuesta al suero (consenso 5'-CCWWWWWWGG*3'), recono-
cido por el factor de respuesta al suero.
Los módulos específicos de células se localizan en los promototes
genes que son expresados por un solo tipo de tejido. Por ejernplo
módulo eritloide (consenso 5'-WGAfARJ', donde R es A o G), que
el sitio de unión del activador GAIA-1; el módulo de células hipofisa
(consenso 5'-AIATTCAT-3'), reconocido por Pit-I; ei módulo de m
blastos (consenso 5'*CAACTGAC-3'), reconocido por MyoD; y
módulo de células linfoides o sitio rB (consenso 5'-GGGACTTTCC-
reconocido por NF-xB. Obsérvese que en las células linfoides, e1mód
octámero es reconocido por el activador Oct-2 específico de tejido.
Los módulos para reguladores del desarrollo median la expresi
de genes que son actívos en determinados estadios del desarrol
Dos ejemplos de Drosophila son el módulo Bicoid (consensü
5'-TCCTAATCCC*3') y ei módulo Antennapedia (conse
5'-TH,r{IAATAATAATAA-3') (sección 1 4.3.4) .
Frcfl:*§clr*s *ltern¡tivas
Cíi, C* * {§5 5 ü
{* tr f* üY F"4 f4 .f""r'
500 1.000 1,500 2.000
&e;*e:¿'a,;..-rr, ...:':'
(a¡i¡i ilúfaa,lrarr¡ir**aii§rl*ariir.ffi ¡rr 5ñi¡¡llx¡alil
Cen humano de distrofina
 Regulación de la iniciacién de Ia transcripcién

r ¡i,::¡*r **;ff-%** %"\% Figura I 1.29 Activadores de la ini-

A(tlvo'-'' ** ciación de la transcripción en los
üi eucariontes. El activador azul está
;;i::::j;;'l
unido a un módulo regulador corrien-
Po tercl¿dor te arriba de un gen e influye en la ini-
ciación de la transcripción únicamenie
en ese gen solo. El activador verde
está unido a un sitio dentro de un
En 1* figura 17.27 se muestra la estn:ctura modulü de un promotor de potenciador e incide en la transcrip-
RI{A polimerasa I1 típico. Al igual que los módu1os de la región inmedia- ción de los tres genes.
tarnente coniente arriba del gen, el mismo módul: y otros también pueden
estal' contenidos dentro de potenciadores, que tienen de 200 a 300 pb de
longitud y se pueden iocalizar a cierta distancia colriente arriba o corrien-
te abajo de su gen diana. Los silenciadores son similares a los potenciado-
res pcro, como sugiere su nombre, sus módulos ejercen una influencia
negarjva. en lugar de potenciadola, sobre la iniciación de la transcripción.

Se observa otro nivel de complejidad en algunos genes que tienen pro-

motores alternativos, que dan origen a diferentes versiones del transcli-
to especificado por el gen. Un ejemplo es e1 gen de distrofina humano,
que ha sido muy estudiado pues sus defectos provocan la enfermedad
genética denominada distt'ofia muscular de Duchenne. El gen de distro-
fina es uno de 1os más grandes conociclos en el genoma huinano: se
extiende pot 2,4 Mb y contiene 78 intrones. Tiene por lo menos siete
promütores alternativos (figura 1 I.2B). Tres de ellos residen corriente
arriba del gen y dan origen a transctitos de longitud completa, que sólo
difielr:n en la identidad del primer exón; estos tres promotores son acti-
vos en tejido cortical, músculos y cerebelo. Los otrr:s cuatro promotores
están ubicados dentro del gen y odginan transcritos acortados que, tam-
bién en este caso, se sintetizan cle una manera específica para cada teji-
do. Cada promotor tiene su propia estructula modular, aunque todos
son inf-luidos pol1as mismas secuencias potenciadoras y silenciadoras.
Los p::omotores alternativos también se utilizan para generar versiones
relacionadas de algunas proteínas en diferentes estaciios del desarrollo y
pat"a pelrnitir que una sola célula sintetice proteínas similares con pro-
pieclades bioquímicas ligeramente diferentes. Este último punto indica
que, aunque se los suele denominar promotores "altelnativos", es más
colrecto llamarlos promotores "mir1tiples", ya qtie más de uno puecie
estar activo al inisino tiempo. De hecho. ésta puecle ser una situación
normal para muchos genes. Por ejemplo, un estudio de todo el genoma
ha revelado que hay 10.500 pronrotores activos en los {ibroblastos
humanos, pero que estos promotores impulsan ia expresión de menos de
8.000 genes, 1o que indica que una cantidad sustancial de genes se
expl:esa en estas células de dos o más promotol'es en forma simultánea.

*ri 1,..:, i *í: ;i:¡ f i * * íl::.

Una ploteírla que estimula la iniciación de Ia tlanscripción se denomina
actir¡ador, si es una proteína de unión ai DNA específica de secuencia.
o coactivador, si se une inespecíflcamente al DNA o trabaja mediante
interacciones proteína-proteína. Algunos actiyadoles reconocen elemen-
tos promotores c<¡rriente arriba e inciden en la iniciación de la transcrip-
ción sólo en el promotor al que están unidos estos elementos; otros
activadores tienen por diana sitios clentro de potenciadores e influyen en
la ti:anscripción de varios genes a1 mistrio tien-rpo (figura 11 .29). Al igual
ql¡e en las bacterias, los potenciadores eucariontes pueden estar a cierta
distancia de sus genes, y su especificidad respecto de la diana es asegu-
rada por: la presencia de aisladores a uno y otro lado de cada dominio
550 Capítulo.ll Ensamblaie del ccmpleio de iniciacién de la lranscripciÓn

funcional, 1o que impide que potenciadores dentro de ese dominio inci-

dan en la expresión de genes de dominios adyacentes (sección 10.1.2)..
Ya sea que s¿ una a un elemento promotor corriente arriba o a un poten-
ciador áár ditturrte, el activador estabiliza el complejo de preiniciación.
Los coactivadores son mucho más diversos. Comprenden complejos ds
acetiiación de histonas, como SAGA (sección 10.2.1), y complejos e]*
remodelación de nucleosornas, como Swi/Snf (sección 10.2.2). Otras prq-
teínas clasificadas como coactivadores influyen en la expresión de genes al
introducir torsiones y otras distorsiones en el DNA, quizá como preludio a
una modificación de 1a eromatina, o tal Yez pafa acercar proteína§ unidas
a sitios no adyacentes, 1o que permite que los factores unidos trabden lun-
tos en io quase ha denominado estructufa potenciadora- La SRY que e§
la proteínáresponsable de determinar el sexo de los mamíferos, es un ejem:
plo de coactivador que trabaja de esta mane a.

Se ha considerado que los activadores son importantes para la iniciación r

por las RNA polimérasas II y III, pero su función en los promotores de

Figura 1 I.30 lnteracción entre el
médiador de levadura y el comple-
jo preiniciación de la RNA Polime-
rasá tl. Se ilustra en blanco el
complejo de preiniciación y, en naran-
ia, e[mediador. Reimpreso de
'Molecular
Cel, Vol. 10, Davis et o/.,
'structure of the Yeast RNA
Polimerase ll HoloenzYme', 4O9-4,l 5,
2002, con autorización de Elsevier.
ilNA polimerása I no está tan bien definida. La RNA polimerasa.I es atípi- :
ca pu;s transcribe sólo un conjunto aislado de genes: las múltiples copias ',
de ia unidad de transcripción que contiene las secuencias de rRNA 28§;
5,8S y 18S (sección 7 .2.3). La mayoría de las células expfesan contimra'
mente estos genes, pero su velocidad de transcripción varía durante el ciclo
celular y estlsujetfa cierto grado de regulación específica de tejido. Si bien
no se dlscribió en detalle ei mecanismo regulador, investigaciones recien-
tes han sugerido la participación del factor de terminación de RNA poli-
merasa i. Bste factor, llamado TTF-I en Iatones y Reblp en Sacchatamyces
cerwisiae,fue identificado por primera vez como activador de la transcdp-
ción por RNA polimerasa II. Párece que el factor de tetminación.tambi&"1)i
pued; acdvaf 1á transcripción por RNA polimerasa I y se ha-localizado un,i!:i
iltio d" uniónpara esta enzima inmediatamente corriente arriba del prornd:
tor para la unidad de transcripciÓn de rRNA. -,

#l v:r:*#jav#*a #sr#&l*## n/ r*r:¡f*xef* 43§]rr* {..i§} $6?Á/#dsr y 8l

rsff?ñl*/# r§* gsrx§xzí*ixri*r"l #* §$t',4 p*firw#r#§# l§
una caractedstica crucial del tipo "tradicional" de activador -los que §
unen a elementos promotores coriente arriba o a potenciadores- es e] co$
tacto que se estabiece con el coraplejo de preiniciación. La parte dcl 1:ti' ,,.,,,

vador involucrada en este contacto se llama dominio de activación' r'r'.''

Estuclios estmcturales han mosÚado que, si bien los dominios dc activa-

ción son variables, ]a rnayoría de ellos pertenecen a una de tres categorí
. Dominios ácidos: son aquellos relativamente ricos en aminoáciclos
áciclos (ácicio aspártico y a"i,to glutárnico). Ésta es la categoría más
común de dominio de activación.
* Dominios ricos en glutamina: hallados a menudo en actir'¿ldores
cuyos motivos de unión al DNA son del tipo horneodominio o fOU..:
isección 11.1.1).
* Dominios ricos en prolina: son los menos comune§.
Durante vados años, no se conocielon los ciet¿rlles cle la interacción entfelo§
activaciores y el complejo de preiniciación cle RNA polimerasa II y ei tr¿ia-
jo con dii'erentes o.grrir*ou apoltaba eviclencia upur"rt.*"nte tontladic-'
toria. Diversos estuclios cle interacción proteí¡a-proteína habían sugerido
clue poclía haber contactos directos entle difel'entes activadores y_raliaspar
tes ciel complejo, y se implicó a TBP, cliversos TAn TFIIB. TFIII I i R|l
polimerasa II en cliferentes irrt".a".iones. L¿i identificación de un gr:":9I;
a
plejo proteico, cienominaclo mediador, en ia levadura sr-rgirió la solucir¡n
 Regulación de la iniciación de la transcripción ,rt

Figura I l.3l Conformación de los

dominios FOU delactivador Pit-l
unido a sus sitios diana corriente arri-
ba de los genes de prolactina
(izquierda) y hormona del crecirnien-
to (derecha). Pi:-I es un crr:::rr.t, i.:J.
monómero tiene dos domrntos PCLr.
Los dos dominios de un monómerc se
muestran en rojo y los dos dcr¡inlos del
otro monómero, en azul. Los barriies son
a-héi¡ces, y a5 es la hélice de reconoci-
miento de cada dominio. Obséruese la
diferencia entre ias conformaciones de
los dominios cuando están unidos a los
dos sitios de unión. La estrudura más
abierta adoptad¿ en el sitro de la hormo-
na del crecimiento permite que el dím*'
ro Pit- i interactúe con N-CoR y otras
proteínas para reprimir la transcripción
del gen de esa hormona. Por lo tanto,
Pit-l activa el gen de prolactina, pero
reprime el gen de la hormona del creci-
miento. Reimpreso con autorización de
este acel'tijo. El mediador de levadura contiene 21 subunidades que fomran Scully ef al., Science, 29A, 1)27-1 131 .
una estructura con dorrinios definidos: cabeza, medio y cola. Esta últü¡a íó 2000 AMS.
establece contacto físico con una proteína actiYadora unida a su secuencia
de reconocimiento en el DNA, y las secciones medio y cabeza interactúan
con el complejo cle preiniciación (ligula 1 1.50). Por'1o tanto, en lugar de una
asociación dilecta entre el activaclol y el complejo cle preiniciación, hay una
asociación inclilecta, con transducción cle la señ¿il de activ¿rción por el
nrecliaclor'. Al principio, se consideraba que el rnediador activaba ia inicia-
ción cle ia transcripción fosforilancio directamente el CTD de la RNA poli-
merasa II, lo que estimulaba ei despeje del promotor (secciÓn 11.2.3); ahora
se sabe qtie esta activiclacl de cinasa depende de I(n28, una subunidad de
TFllH. Hay evidencia de que el ttediaclor puedc estimular la actividad de
Kin28, pero ósta no es su única intelacción con el complejo de preiniciaciór-r
y toclavía no se ha esclareciclo cómo regula, preciszimente. l¿r iniciacjón de 1a
tleurscr"ipción. El meciiaclor está plesente cuanclo la TBP se une ¿r la secuen-
cia T§TA y podr'ía inteelar 1a platafoima sobt"e let que se construye el resto
del co;nplejo cle preiniciación. Un factor que complica aún más el ter:ra es
que el rledi¿ldor tlanscluce señales no sóio cle ac,tivadores, sino también de
repfcsores. 1o que irnplica que su inl1uencia sobl'e el complejo cle preinicia-
cióil clebe ser t¿rnto positiva como negatir.a.

Lo." mecliadoles cie lo.c cucal'iontes supeliores son más grandes que el com-
pk'ja c1e levadura, con 30 o más pt'oteínas en la versión humana. Una carac-
terística del rnecliaclor de los m¿ulífelos es que su composición proteica es
variable, 1o qr-re plantea la posibilidad de que haya varias velsiones y quc
cacln una lcsponcla a un conjunto clifel'ente clc activadores, ¿lunqtte quizás
ha¡;a sr-rperposiciones. La opinión act¡:al tiende a considelar que un media-
dor es un comironente obligatorio del corrplejo cle pleiniciación cie RNA
polir:-ielasa II y c1r-re el efecto estinrulaclor cle todr¡s los ¿tctivadores pasa a
trar,és clel nrediador'. Sin cnrbargo, r1o -se pr-recle desc¿xtar la posibiiidacl cle
que algurros activadore's sorteen al rnec{iador y ejerzan un efecto directo
sobl'e una u otl'¿r parte del complejo de pr:einiciación.

La uravol palte cle ia investigación sobre la regulación de la iniciación de la

transcripción en los euc¿li'iontes se ha concentrado en la ¿ictiv¿tciÓn; en
paile, pofqlle el i:ajo nir,elde iniciación basal obsen'aclo en los pt'otnotores
CapÍtulo 'll Ensambl:je del complejo de iniciación de la transcripción

de RNA polimerusa II y Iil sugiere que es improbable que la represión de

la iniciación, tan clucial en las bacterias (sección 11.i.1), desempeñe u¡
papel importante en el control de la tlanscripción en los eucaliontet.
Probablemente, este concepto es incorrecto, pues se está descubriendo una
cantidad cada vez mayor de proteínas de unión al DNA que reprimen la ini-
c,iación de la transcripción y se unen a elementos promotores cordente a;-ri
ba o a sitios más distantes en silenciadores. Aigunas inlluyen de mirner¿r
general en 1a expresión del genoma a travós de 1a desacetilación de histr-
nas (sección lO.2.l) o 1a metilación del DNA (sección 10.i.1), pero otras
ejercen efectos más específicos en promotores individuales. Por ejemplo,
los represores de levadura denominados Motl y NC2 inhiben el ensanrbla-
je del complejo de preiniciación al unirse directamente a la TBl']y alterar su
actividad. Motl hace que la TBP se disocie del DNA y NC2 impide el
ensarnblaje uiterior del complejo sobre la TBP unida. Estos dos reprcsores
tienen un amplio espectro de activiclad e inactiyan un gran $upo de genes,
como lo hace el represor Ssn6-Tup l, que es uno de los principales silencia-
dores de genes de la levadura Schizosacclruromy{:es p,tmbe y que tiene
hon'rólogos en muchos otros eucadontes.

Otra indicación de Ia impoltancia de ia replesión de la transclipción cn

los eucaliontes proviene de demostrar que alpS:nas proteínas pueden
ejercer efectos tanto activadores como represores, según las circunstan-
c,ias. Pol ejemplo, NC2 reprime la iniciación de la transclipción de pro-
motol'es con una secuencia TATA, pelo tiene un ef'ecto activadol sobre
los promotores que carecen de esa secuencia. Pit-1, que es ia primera de
l¿lstres proteínas por las que eldominio POU lecibe su n<¡mbre (sección
11.1.1), activa algunos genes ¡ r'eprirne otros, lo que depende cie la
secuencia del sitio de unión al DNA. La presencia en este sitir: cle dc¡"s
nucleótidos adicionales induce un cambio de cr¡nformación de Pit-1. que
le pelmite interactual' corl u1-lÍl segunda proteína denominada N-CoR y
reprin-iil la tt'anscripción del gen diana (figura 11.31).

fl*¡:ÍT ¡:l ** l*;s ¡:rf¡yi#*#*s #¡: l*s tltti?*d*{*: y l,:.s r*É¡*ssrr',

La operaciórr de cada activadol y represor debe ser controlada paf il gamn-
tizar que una célula exprest.r el cor-rjunto de genes apropiados. Volveremos
a tratal esta cuestión en el capítulo 14, en el que será el tenra centrai del
estudio sobre las manel'as córno se legula la activiclad dei genoma en res-
puesta a señales extracelulal:es, y durante la diferenciación y el desarrollo.

Hay vadas mal-Ieras de regular un activadol'o un represol'. Una pr:sibili-

dad es contlolar su síntesis, pero esto no permite cambios rápidr:s de la
expresión del genorla, pol'que la acumulación de un activaclor o Lln
represor en la cóluia. o su destrucción c,uando rfo es necesario, den:an'
da tiempo. Por Io tanto, este tipo de control se asocia con activadüres )'
repl'esores responsables de mantener patl'ones estahles de expresión del
genoñla: por ejemplo, los responsables cle la dife¡enclación celular y
algunos aspectos del desarrollo. Otra n-ranera de controlar un activador
o un represor es por modificación química, como fosforilación, o por
inducción de un cambio en su conformación. Estos cambios son mucho
mirs rápidos que la síntesis cle not,o,5, pcrmiten clue la célula re-,,rpondaa
colnpuestos de señalamiento extracelular que inducen canrbios transito-
r:ios de la explesiór-r del genoma. Los detalles de e-stos diversos mccanis"
mos reguladores se eran-riu¿rn en el capítulo 1¿1.
 Resumen

§c**;'**m
lr:s participantes centrales de la transcripción .v otro-c aspectos de la
actividad del genoma son las proteínas de unión al D).iA, qLle sL- unen a1
gcnrrlria prtra cunrplir sus funciones bioquímicas. Muchas de estas pro-
i;ín ,s s.- pucJen unir a secuencias específicas de DliA a través de moti-
vus dc unión a1 D\JA. con:ro la estluctura hé1ice-giro-hélice o el dedo de
cinc. Es posible identificar sus posiciones de unión en las molóculas de
DNA por análisis de retardo en gel, y delinearlas con mayor detalle
rnedi¡inte análisis de protección de la modificación y de modificación de
interferencia. Algunas proteínas teconocen sus sitios de unión por lectu-
ra directa de la secuencia de DNA, lo que es posible estableciendo cr:n-
taclos dentro clel surco nlayor de la doble hélice, pues allí se puede
deternrinar la identidad de los nucleótidos a partir de ias posiciones de
los grupr:s químicos unidos a li:s nucleótidos púricr:s y pirimídicr:s. La
lectula directa puede ser inl"luida por divet'sos efectos indirectos que
ejerce la secuencia nucleotídíca sobre la confcrmación de la hélice,
como la formación de torsiones en secuencias ricas en adenina. N{uchas
proteínas de unión al DNA actúan como dímeros y establecen contacto
simultáneo con la hélice en dos posiciones. Estructulas especiales de la
super:ficie de ia ploteína, como las cremalleras de leucin¿r, favorecen la
dimerización. Las bacterias tienen una sola RNA polimerasa que tl'ans-
cribe todos los genes del genoma, pero los eucariontes tienen tt'es RNA
polimerasas nucleares diferentes y una enzima distinta que trabaja en las
mitocondrias. Las secuencias promotol'as n:larcan las posiciones en las
que se debe ei:samblar el complejo de iniciación de ia transclipción. El
promotor bacteriano está formado por dos sepiirentos de secuencia, pero
los prorlotol'es eucariontes son mucho más complejos; tienen una
estructura modular que incluye secuencias que son t'econocidas por el
complejo de iniciación y otras que actúan como sitios de unión para pro-
teínas reguladoras. La RNA polimerasa bacteriana se une clilectamente
a su ir:onlotor, pero los complejos de iniciación para cada tipo de R"l'lA
polimerasa eucarionte contienen ploteínas auxiliares y deben construír-
se en lorma ordenada. La iniciación exitosa da por resultado un comple-
jo cle polimerasa competente para lograr el despeje de1 promotor e
iniciar el proceso de transcripción. La iniciación de la transcripción es
un p¿lso clave en la regulación de la erpresión del genoma. Algunas bac-
terias pueden alterar la estructura de su RNA polirnerasa, por 1o que la
enzima l'econoce un conjunto distinto de promotoles $ por ende, trans-
cribe un conjunto diferente cle genes. En las bacterias, Ia expresión de
genes individuales también puede ser controiada por proteínas activado-
ras y represoras. Lo mismo es válido para los eucariontes, aunque las
proteínas activadoras parecen n-rás importantes que las represolas. Las
proteínas regulacloras se unen a sitios adyacentes o algo distantes de los
ptonrotoires que controlan. En los eucariontes, 1a activación del cornple-
jo de iniciación de Ia transcripción tiene lugal a través del mediador, una
proteína de múltiples subunidades qlle lbrma un puente físico entre un
actii.'ador y la RNA polimerasa.
 #ee
&..
.r
d &de W
.ás-% -dtu s* #' '-
§{&*dq{.&ek" ii.r
q-
"\§§ §

"#áX §Lk**J§*§
* :r # g §'x*ffi s r;
u,q*"ffa tr*'s%s*-#ffift**ffismF t§-91 d-$ffi$ §*§ §%"§d-l
fuJ, *§L,l:T#ffid $ 1 ffi ffi{:; } : &.qu*i tuJe";§ } \§ \§ff*'"
I

r - -. 1 ')\''
- .r,:.., ¡ _ _,^"":i.;. :. __,.,1" ¡_
l,¡..rj.l1l irli i:..1'i

ii I litt*;r* ? §r*ir,rilni*ni* d*i §,l.ldc

3ir lalIln*l:l

Detallar las fases de elongación y terminación de la transcripción en E. coli y explicar cómo son reguladas
éstas por proteínas de antiterminación, atenuación y escisión del transcrito.
Dor las proteinas

Describir los eventos de corte y las modificaciones qulmicas involucrados en el procesamiento de RNA
func.onal en las bacterias.

Resumir nuelro conocimiento actual sobre la degradación del RNA en las bacterias.

Det¿llar la elongación y la terminación de los transcritos eucariontes, incluidos los procesos responsables
del encapuchamiento y la poliadenilación de mRNA eucariontes.

Distinguir entre las vías de corte y empalme de diferentes tipos de infón, y puntualizal en particular, el
corte y empalme de intrones CU-AG, con ejemplos de corte y empalme ¿lternativo, y transempalme.

Describir la sÍntesis y el procesamiento de RNA funcional en los eucariontes.

Definir el término 'tibozima" y dar ejemplos de ribozimas.

Explirar cdmo se modifican químicamente los rRNA euc¿riontes en determinadas posiciones nucleotídicas.

Dar ejemplos de la edición del RNA en los mamíferos y describir, en términos generales, los tipos más
complejos de edición del RNA observados en otros eucariontes.

Describir los mecanismos de degradación del RNA eucarionte poniendo el acento en la participación de
los siRNA y los miRNA, en el silenciamiento del RNA.

Reseñ¿r los eventos involucrados en el transporte de RNA eucariontes del nticleo al citoplasma.

La i*iciación de la transcripción, que culmina con el alejamiento de la

RNA polimerasa del promotor y el comienzo de la síntesis de una molé-
cula de RNA, es sólo el primer paso de la vía de expresión del genoma.
En este capítulo y el siguiente, seguiremos la continuación del proceso y
exarninaremos cómo la transcripción y la traducción determinan, pcr
últiuro, la síntesis del proteoma. §e comienza par 1a síntesis y el proce-
samiento de los RNA, incluidos ios mRNA, que forrnan el transcripto-
ma y especifican el contenido de proteínas de la célula, y los RNA
funcionales, que desempeñan papeles esenciales en la expresión dei
genoma y otros aspectos de 1a biología celular (sección L2.2). Los fenó-
,4? Capítulo .12 Síntesis y procesamiento del RNA

menos de base son similales en procariontes y eucariontes, pero hay

cliferencias sustanciales en algunos de los detalles; los eucariontes pre-
sentan procesos de mayor complejidad, al igual que en otros aspectos de
la expresión dei genoma. Por 10 tanto se estudia en primer término la
síntesis y el procesamiento del RNA en las bacterias.

'x? §
- e.r6-!ry$€!€"
^,
V ffirfffi(*$#gffilfrffig{}
! c
{,9* {#§
g.1 FJ
g§¡er¿ [l §1"] r-?&
r&
g€*!Lt§HE¡ryd ü{* ñ §,c r.t {i

Como hay una sola Ri\A polimerasa bactedana (sección 1L.2.1), ei mecanis-
mo genelal de la síntesis de RNA es el mismo en todos los genes bacterianos.
Sin embargo, surgen diferencias cuando se consideran los mecanismos de
reguiación de la sÍntesis de transcritos de genes individuales.

l¡
Extremo 5'-P ....i,
Figura 12.1 Base química de la sín-
tesis de RNA. Compárese esta reac- o-
trl
o- o- '..lii
: .:,,. ' (
ción con la polimerización del DNA -O-P-O-P-O-P-O-CHz
ilustrada en Ia figura 1.6. tlrlrl
ooo :"' '

t
rr
I ( ffi (
o:p-o-iH, H¿"l;:*§
l_
vt\,/ >o--] 'i.L
t,
I)5-l I

al

1C

d
rr/ o-
o-
-o-P-o-P-o-P.,
o-

¡l rl I \'^
ooo- I
5'CHe

OH OH
O* O- -li:ljt;
I I
-o-P-o-P-ü:
rl ll
o o t:.,,t,::::
Pirofosfato
o-
lll
o- o-
-o-P-o*P*o-P-o
lltlrl
o U

ooH
O:P-O-
I
óu" W
O*
I t-o-I-\]
Is'
ooH
I

t,
O:P-O-CHz
I

LJ
 Síntesis y procesamiento de los RNA bacterianos 543

;; ,,;. ttX.:§"19§ív"s**sis **m §*m tr¿x;xserltms fumct,xrsmffi*s

't;1.,,,,;;l;;i;1.,.,;,,,,,;;:.
En la ligura 12.1 se muestra la base química de la síntesis de RNA depen- 5'
',.,,',t;",:,:i;:,,,',:,',,,'.',,',:.. dienre del molde. Se añaden ribonucleótidos, uno tras otro, al extremo
en j'
iiii]r::,,,tttr clecinriento dei transcrito de RNA, y ia identidad de cada nucleótido está .. -l..
:,,',,.,,:i1l;;;.,':',.'' rspeciÍbada por las reglas de apareamiento de bases: la base A se aparea con

,',;,,,';t:;,,;i,..,,:.,:.
'l a U; ia base G, con C. Durante [a adición de cada nucleótido, se eliminan RNA polimerasa

;:.::,,::1§,;,'., los fbsfatos

p y y del nucleótido que ingr:esa y el grupo oxhiddlo del carboiro
tt d¿l i'
nucleóiido presente al final de la cadena.
,,.,rr,,,:*, Figura 12.2 Esquema del complejo
de elongación de la transcripción
{lc .'" -','-,.': 4. ¿.'t ¡ i- i:,:01 .n ,- ,"1 {:"i ,'.r1.¡,..'-" :; it-^.,. ' ^"-.,.-
de Escherichia cali. La RNA polime-
1,..§,,, rasa cubre alrededor de 30 pb de
,i,,i Durante la etapa de elongación de la transcripción, la RNA polimerasa bac- DNA, inciuida una burbuja de trans-
,,r,:,,,,,,,,,,,,,,r,r,1i teriana
se encuentta en su forma de enzima central, que comprende cuatrr:
,lr:l,rrrrrr:.irllriiiil.. _--.^¡.^í,^^-. __^1^t:' -' .-- - ,
cripción de 12-14 pb, con el RNA
proLeínas: dos -l^- subunidades
^".L-.*:l^-J-^ ^_ relativamente
cr pequeñas (alrédedor de 35 unido a ia cadena molde de DNA por
',ii i'iiii kDa) y una de cada una de las subunidades $ y ts' relacionadas (ambas de aproximadamente ocho pares de
:..i1,... ...'.. .,1..^J,-.J,.- r^ 1</1 l,n^\. l^ ^-.L.--iJ-r
_ ,t, alrededor
de 150 kDa); la subunidad o, -.-, deiempeña
- que -l
el papel fundamen- bases RNA-DNA. La flecha muestr¿ la
:::rrr,,r,,

.,,,1.
i, tal en la iniciación de la fanscripción, suele habef abandónádo el comple- dirección en la que se mueve la RNA
polimerasa a lo largo del DNA.
,..¡.. jo en esta etapa (sección 11.2.3). La RNA polimerasa cubr.e alredecloi de
,,,ii 30
'..:.1 i.
*L ,l^1 nNr *^1J^
"ñ pb del DNA
:.^-..1--:r^ 1- t- ,...1 .r I
^ molde, incluida 1a burbuja de transcripción de 12-14 pb,
:'.,,i ,,.', ,' dentro de la que
':r:'ii'r'.. 'r ,l¡¡r¡"n .1^ 1- +,.^--^..j*^
^,,^ el^'l transcrito en ^"^ crecimiento
^.-^,-:.^^:^ estáI uniclo
-. -t t r
a la cadena *oi.l.
r

,,,,;;;:,';;. de Dl{A por: alrededor de ocho pares

de bases RNA-DNA (figur.a 12.2).
.
,1.:,::.:a'::.1: :...'.,,

,'.,'.",.,';,::.;,';:." La RNA polimerasa debe asir con firmeza tanto al DNA molde como al Figura 12.3 lnteracciones dentro de
. - r i ñ\ii e t la RNA polimerasa bacteriana. Se
,,' RlilA que
---^ -- --,a
se estáfabricando para evitar que el complejo de transcripción muestran en naranja las subunidades
, se separe antes de alcanzal el final del gen. sin embargo, esta sujéción
F y $' de la RNA polimerasa; ios
,,, no debe ser tan intensa que impida el movimiento de lipolimerasa a lo números indican las posiciones de los
,, :, largo del DNA. Para comprender cómo se satisfacen ástos requisitos aminoácidos que, según estudios de
,.'.,,, .',,
apárentemente contradictorios, se han estudiado las interacciones entre enlaces transversales, residen cerca
,::: la polimerasa, el DNA molde y el transcrito de RNA por cristalografía de uno o más de los polinucleótidos
",:" DNA/RNA dentro dei conrplejo. Las
r,i, ,' de rayos X (véase Nota sobre técnicas 1 r.1), combinacli cur,
interacciones reveladas por enlaces
,',,''
.'.''' tos de enlaces transversales en los que se forman en]aces "rp".I*.,"r-
cóvalentes transversales se ilustran como líneas
: , entl'e el DNA o eIRNA y la polimerasa, que penniten identificar.ios ami- rosadas delgadas.

200 400 600 800 1000 1200

§., - 492 .: S1E
ffi tlti7,:§i:W;-1.1/i::t:,]f, ln$üi§§§§§.lffi i]]]§lii$lill##§glsx§ .
élB
*.
.'""."'"
922
¿,iiffir , ; "
qq1 LVS luti5 1230... 1304
-, icaa
130 {83 .2s9' ..... 805 1243 '-'" Lys 1306
\-.-\ i\

iiii
rl
..:""'
Cadena gue no es molde
\.. Corriente arriba del DNA ''''...
Coniente abajo del DNA
s'*&glc?&mee*r
I i,.

5',.'-.
nÑÉr"

ú
'
"-f/ Región encerrada r.
por la polimerasa
ll ..t' // ,.,/
:
:.F ,-'ír,,ZEl/' /
;pe*loa130 2esjso4ggj:466
.1

ross j,ls*ejrzoo
',1

W 200 400 600 800 1000 12AO '1400

54rt Capitulo 12 Sintesis y procesamtento del Rl\A
Figura 12.4 Modelo del complejo
de elongacién de la transcripción
bacteriano. Las subunidades p y P'
de la RNA polimerasa se ilustran en
azul/verde y rosa, respectivamente; la
doble hélice es de color rojo (cadena
molde) y amarillo (cadena que n0 es
molde); el transcrito de RNA es ocre.
Las dos vistas muestran que la doble
hélice reside entre las subunidades
p y pf dentro de una depresrón en la
superficie encerrad¿ de p'. Las flechas
indican la dirección en la que se
mueve el DNA a través de la polime-
rasa. Reimpreso con autorización de
Korzheva et al, Science, 289,
619-625. O 2000 AAAS.
,.'"#,
ñ'¡:
r'§
noácidos más cercanos al Dl'lA y al RNA. Lcs experimentos de enlaces
transversaies utilizan diversos compuestos fotorreactivos que se putden
unir a moiéculas de DNA y RNA sintéticas. Después dei ensamblaje dei
complejo, los marcadores son activados mediante un pulso de luz, de
manera que forman enlaces transversales entre el ácido nucieico y cual-
quier aminoácido de la polimerasa que esté ubicado cerca de la posiriiin
del marcador. Aigunos marcadotes forman enLaces transversales con cual-
quier aminoácido, mientras que otros son más discriminatorios ¡ pi:r
ejemplo, sólo se unen a lisinas. Tras la formación de enlaces transversales,
se desensambla la RNA polimerasa en subunidades y se trata cada sub-
unidad con bromuro de cianógeno (cianuro de bromo), que corta los poli-
péptidos específicamente en los residuos metionina, lo que origina un
conjunto característico de fragmentos. Después, se identifican los frag-
mentos unidos por enlaces transversales al ácido nucleico. Estos fragmen-
tos deberían contener los aminoácidos adyacentes al marcador en el
complejo de eiongación de la transcripción intacto. Identlficando la mayor .1.
cantidad posible de enlaces transversales, se puede construir un rfiapa
detallado (figura 12.3). Luego, esta información se puede combinar con
los datos estructurales obtenidos por cristalografía de rayos X para cons-
truir un modelo del complejo de elongación de la ttanscripción que rnues-
tre la posición precisa de las difd?entes partes de la doble hélice de DNA
y del transcrito de RNA dentro de ia polimerasa (figura 12.4). Estos expe-
dmentos han mostrado que la doble hélice reside entre las subunidades B
y B', dentro de una depresión sobre ia superficie encerrada de B'. El sitio
activo para la síntesis de RNA también está ente estas dos subunidades,
y la cadena de DNA que no es molde forma un bucie que se aleja del sitio
y se mantiene dentro de ia subunidad B. El transcrito de RNA extruye del
complejo a través de un canal formado, en parte, por la subunidad F, y en
parte, por ia subunidad F' (en la parte inferior derecha de las estructura§
de la figura 12.4).
La polimerasa no sintetiza su transcrito a una velocidad constante. Por el
contrario, ia síntesis es discontinua, con períodos de elongación rápida
entremezclados con breves pausas, durante las cuales el sitio activo de la
polimerasa sufre un iigero reordenamiento estructural. Rara Yez, una pausa
dura más de 6 milisegundos y podría estar acompañada pol el movimien-
to inverso de la polirnerasa (retroceso) por elmolde. Las pausas son aiea-
torias y no dependen de ninguna característica particular del DNA mo1de,
La pausa cumple una función importante en la terminación del transcrito,
como ya se mencionó, pero por ahora, no se sabe si es la única.
210
q)
:
,1't:- '
: lrr. :
.. .r..1 1i.,.,.
 Síntesis y procesamiento de los RNA bacterianos 3r*5

ti.l..li.ii.,illlliii..ill:..' En la actualidad, se piensa que la transct'ipción es un proceso clisconti-

nuo, v que la polirnu-rasa efectúa pausas regulares y "elige" entre conti-
r.,.t::iir.itii..lii :
,i.ii.iii,,i.,...i..i.1...i..,lil

nuar ia elongación, añadiendo más ribonucleótidos al transcrito, o

;;"':::;:11:1':;::1,',.;,
tiva se¿i más favorable desde el punto de vista termodinámico. Este
":' ':::,',,.':.','.,,:
modcio hace hincapié en que, para que haya terminación, la polimerasa

,,,t,.,..,.,, favorable que la síntesis continuada de Rt'.{A.

Las bacterias parecen aplicar dos estrateglas para terminar la transcripción.

En §,. colí, alrededor de la mitad de ias posiciones en las que termina la
tran.rcripción coresponden a secuencias de DNA donde la cadena molde
contiene un palíndromo invertido seguido de una serie de nucleótidos de
desoxiadenosina (figura 12.5). Se considera que estos terminadores intrín-
secos emplean dos procesos para promover la disociación de la poiimerasa
y desestabilizar la unión al molde dei transcrito en crecimiento. Primero.
cuandc se transcribe el palíndromo invertido, la secuencia de RNA se plie-
ga eñ una horquilla estable y este apareamiento de bases RNA-RNA es favo-
recido respecto dei apareamiento DNA-RNA, que suele ocurrir dentro de la
burbr-ija de transcripción. Esto reduce la cantidad de contactos establecidos
entre el molde y el kanscrito, lo que debiiita la interacción globai y favore-
ce la disociación. Segundo, la interacción se debilita aún más cuando se
transcribe la serie de A dei molde, porqlle 1os pares de bases A-U resultan-
tes tienen sólo dos enlaces de hidrógeno cada uno, en comparación con tres
para cada par de bases G-C. El resultado neto es que se favorece la tenni-
nación respecto de la elongación continuada. Este modelo es fácil de racio-
nalizar con las propiedades conocidas de los híbridos DNA-RNA, pero se ha
planteado una hipótesis alterrrativa por el resultado de los experimentos de
enlaces transversales, que han mostrado que la horquilla de RNA entra en
contacto con una estructura en colgajo de la superficie extema de la sub-
unidad p de 1a RNA polimerasa, adyacente ai punto de salida del canal a tra-
vés riel cual emerge ei RNA del complejo (ñgura 12.6). Si bien la estructu-
ra en colgajo está bastante distante (alrededor de 6,5 nm) del sitio activo de
la poiimelasa, se establece una conexión directa entre ambos mediante un
segmento de la hoja p dentro de la subunidad p Por lo tanto, elmovimien-
to del coigajo podría afectar la posición de los anrinoáciclos dentro del sitio
activo, 1o que quizá provoca la rotura de los pares de bases DNA-RNA y la
terminación de la transcripción. Otra evidencia que avala este modeio pro-
viene cle la demostración de que la proteína NusA, que potencia la termina-
ción en los terminadores intrínseco$, interactúa con la horquilla y la
estructura en coigajo, y puede estabilizar el contacto entre ambas.

Cadena molde

3'ri.-¡-i,i Crccccrcccc rr.,*rgQggflr.9w t444141áá444*r,--rr 5'

nNr
-' "'^ s';-:.1-:. ccccTpcccc :-' :-:cGCCraccGG :TTTTTTTTTTT.j-:-'' : 3'

Transcripción
!
&NdÁ 5, Lil;aJ;rw3'
Pares de bases A-U

/
"'r .:,..-i;!?:{l.a't?'l'r"ri:rl.
iYt-1'\ 1"Y7-fT la r-::..Ii--r---- 'l"rI rñal*?'rr"rr
'l:.,.):,.1..'3.;1,).'.)-;l::.1,.1 1!:. ':.":,..\ . ...]",,1,.r.1
DN,A .'il'r:'l"i:'ll'liJ'1"'i"lli''
RNA polimerasa
1-1,.,.1.'11,,1,,,,1.,,1,,.!
Figura 12.5 Terminación en un ter-
minador intrínseco. La presencia de
un palíndromo invertido en ia secuen-
crade DNA determina la formación
de una horquilla en el transcrito.
J {¡l' CapítLrlo 12 Sintesis y pmcesarniento del RNA
.!2.6
Figura Una estructura en colgajo
sobre la superficie de la RNA polime-
rasa podría mediar la terminación. La
horquilla que se forma en el transcrito
Ce RNA cuando se alcanza la región de
terminación esiablece contacto con una
estructura en colgajo de la superfrcie
e*erna de la subunidad B de la RNA
polimerasa, adyacente al punto de sali-
da del canal a través del cual emerge
del complejo el RNA. La parte del poli-
péptido de la subunidad $ que forma
el colgajo está coloreada en azul oscu-
ro, el resto de la subunidad fi en celes-
te, la subunidad p' en rosa y Ia
subunidad p en blanco. Obsérvese que
si bien la estructura de colgajo está ubi-
cado sobre 1a superficie de la polimera-
sa, la región del polipéptido B que
{orma el colgalo está conectada directa-
mente con el sitio acivo, indicado por
el ión magnesio, en magenta, y el sus-
trato nucleósido 5'-trifosfato, en verde.
Por lo tanto, una interacción entre la
horquilla de RNA y ei colgajo podría
afectar la posición de los aminoácidos
dentro del sitio activo, lo que quizá
cause rctura de pares de bases Dl''lA-
RNA, que lleva a la termin¿ción de la
transcripcion. Reimpreso con ¿utoriza
ción de lbulokhonov et ql., Sctence,
292,730-733. Cr 2OOl AAAS.
ñh*
El comple.jo de
I elonoación se atasca
I un ,ñu horquilla
La FIho rompe
los pares de
bases RNA-DNA
Figura 12J Terminación dependiente
de Rho. La Rho es una helicasa que
sigue a la RNA polimerasa a lo largo del
transcrito. Cuando la polimerasa se
atasca en una horquiila, la Rho la alcan-
za, rompe pares de bases RNA-DNA y
libera el transcrito. Obsérvese que el
diagrama es esquemático y no refleja
los tamaños relativos de la Rho ni
de la RNA polimerasa.
Hiato del sitio aciivo
DNA
corriente
abajo
uanal oe q
salida
Colgajo-,
extremo
de la hélice"
Dominio...
del
colgaio
El seg¡:ndo tipo c1e señal de teminación de la transcripción bacteriat"la es
la dependiente de Rlio. Estas señales suelen conservar la caractedstica lror-
quilla de los terminadores intrínsecos, aunque ésta es menos estable y no
hay una selie de A en el molde. La terminación requier:e la actividad de una
protcína denominada Rho, que se Llne al transcrito y se desplaza a 1o lalgo
del RNA hacia la polimerasa. Si esta última sigue sintetizando R}{A, se
mantiene delante de la Rho que la persigue pelo, en la señal de termina-
ción, la polimelasa se atasca (véase iipu'a 12.7). No se ha explicado con
exactitucl el nlotivo -se presufile que la responsable es, de alguna l-nünera,
la horquilla que se fbnna en el RNA- pero el resultado es evidente: la Rho
puede alcanzar a l:r poliraelasa. La Rho es una helicasa, 1o que sig:nifica que
rompe activamente los pares de bases, en este caso entre el molde y el
tlanscrito, lo que determina el fin de la transcripción.
! I t " .¿-*!..,: e.^1.../. Ee
"qá^¡
- lr' @,e'q.--,.
"
¿,Se in{luir cle alg¡una m¿}nera en la elección que tlna polimerasa dete-
puecle
nicl¿rentle continuar la elongación o temrinar la tlansclipcién disociánclo-
se clel molde? La respuesta es sí y óste es el nledio primario cle regulación
de la síntesis (en oposición a la iniciación) de tlanscritos bacterianos,
. :r'
El primelo cle estos plocesos reguladores se clenomina antiterminación'
Esto sucede cuando ia RNA polimerasa ignora ur-la señal de terminación
y continúa elongancio su tr¿inscrito hastá que se alcanza una scgunda
ieñal (figula lZ..S). Representa un mecanismo por el cual uno o nrás de
los genes del extremo de un operón pueden desactirrarse o ¿)cti1'ar-{e
segúir la polin-rer:asa reconozca o no una señal de terminación ubicada
con'iente arriba de esos gencs. La antiterminación está contt'r¡lada por
una proteína antiterminadora, que se une al DNA cerca del comienzcr
del oper:ón y, después, se tlansfiet'e a la RNA polimerasa cuando ósta se
 Síntesis y procesarniento de los RNA bacterianos 3jt?

Siti* de antiterminación
pra¡¡otor Señales de terminación
{a
IL
D¡jA,"*i'**ü@";
:""***:#;-l
*l,
i:.;
-rrff?i'Fl'f
¡ -t-tll.l']
r-:-T
Itii' i:---T
i'
*^--*-.ffi@
',qti..:r,_
;.*""**----*;
I ,

Proteína antiterminadora Figura 12.8 Antiterminación. La pro-

unida al DNA
La proteína antitermina-
dora se une a la RNA
polimerasa e impide
la terminación en
Señal de la señal número 1
teina antiterminadora se une al DNA y
se transfiere a ia RNA polimerasa cuan-
do ésta se desplaza sobre ella, 1o que
después permite que la polimerasa
continúe la transcripción a través de la
señal de terminación nÚmero l, de
manera que se transcribe el segundo
del par de genes de este oPerón.

{esplaza por' hacia la plimera señal de terminació¡. La proteí-

1a t'egiÓn
na ántiteririnaciorá hace que la enzima ignore ia prinera señal de termina-
ción, pL'esumiblernente por cont|auestal las propiedades desestabilizantes
cle ult tet'minaclol'intrínseco o pol'impedir el atascamiento en un tennina-
dor dependiente de Rho.

Si bien no se conocen con claridad ios mecanismos de antileffilinación, se

ha cletall¿rckt la repelcusión que ésta puede ejelcer sobre 1a expresión géni-
ca. sobr:e tock: clulante el ciclo de infección del bacteriófago 1".

Inrrecliatamente después de ingr:esar en uÍ]a célula de E. colí,la RNA poli-

ntel'¿is¿r bacteliana iñicia la transcripción dei genonla )" uniéndose a dos
pl.ünlorores , Pt_ y PB, y si¡tetizando dos mRNA "temptanos inilediato-s",
qr"re ter:minan án'las-posiciones ir.r y /nl (figrr:a 12^9A). El mRNA tffinscri-
til c1e fro a tp 1 coclif ica tlna proteína denominada Clo, una de las princip:r-
les proieín¿ii' reguladoras involucradas en el ciclo de inl'ección )". El
segur-rclo mRNA éspecifica la proteína N, que es un antiterminador. La pro-
teina N y nutR, y se transfiet'e a la
se une al §er-roma )" én los sitios n¿¿lI-
llNA polirrerasa cuanclo ósta pasa. Ahora, la RNA polimet'asa iglola los
tei¡linadores fll y/p1, y prosigr-re la transcripción cort'iente abajo de estos
puntos. Los mRXA-resultantes codific¿rn proteínas "tellplanas demora-
áas" (figura 12.98). Por 1o tanto, la antiiefininación controlada pol la pro-
teína N galantiza que 1as proteínas teinplanas irulediatas y templ¿ul¿ls
clentoraclás se sinteticen en los momentos oportllnos del ciclo de infección
?,". Ulra de las proteínas tempranas clcmoradas, Q, es un segundo antiten¡i-

narlol que contloia el cambio al estadio tardío del ciclo de i¡fección.

iiij ji:t¡llr¡ii:.t--¡t.."ir;,'.¡ ¡l;"i¡':i'tr:'.:i-l,'l';:'

i.:-,:,ll'l.a,t;.t.1;-¡liL::l ;..,1;i::.:,r'i'i;;:t,'li
Los nRNA bacteli¿lirgs 11o presentan ninguna lbrma significativa de
pi'ticesarniento: el tt'anscrito pt:imal'io sintetiz¿rdo por ia RNA polimera-
sa cs, e.t sí misnro, el pRNA maduro, y su traducciÓn suele colnenzal
antes cle que se complete la transct'ipción (figura 12.10). Este acopla-

i
tAl (B)
:

.a
;;."= N cro N cro CIIOP Q
: td@4w't*4@.,,.t.w
t§Wt*,41¡,4lwwri**t Y1
§4 i¡;:=§ffir6¡;;;:§1ry:§:j1-"-: ¡t
t,_. nulL PL PA nutRt,r, t , nutL P, Po nutq I t. t,,

Transcritos .I2.9
]
Transcritos Fipura Antiterminación durante el
"tempranos demorados"
"tempranos inmediatos" ciüo de infección del bacteriófago 7-.
.l

i
 Capítulo 12 Síntesis y procesamiento del R[iA

miento de transcripción y traducción es importante porque pennite apli-

car un tipo especial de control, denominado atenuación, a la regulación
de la síntesis de1 mRNA bacteriano.
RNA polimerass

- La atenuación acrúa fundamentalmente sobre operones que codifican enzi-

mas involucradas en la biosíntesis de aminoácidos, pero tambiÉn se tün&
cen alguncs otros ejernplos. El operón de triptófano de E cofi (sección
DNA 11.3.1) ilustra cómo trabaja. En este operón, se pueden formar dos h*rqui.
llas en la región entre el comienzo del transcrito y el inicio de rrpE. El más
pequeño de estos bucles actúa como una señal de terminación, pero la ho¡-
quilla más grande, que está más próxima el comienzo del transcrito, es más
estable. El bucle más grande se superpone con la horquilla de terminación,
por lo que sólo se puede formar una de las dos horquillas en un momento
dado. Cuál de las horquillas se forma depende de la posición relativa entre
Figura I2.10 En las bacterias, se
suelen acoplar la transcripción la RNA polimerasa y un dbosoma que se une al extremo 5' del transcrito
y la traducción. en cuanto éste se sintetiza para traducir los genes a proteínas (figura
12.11). §i el ribosoma se atasca, de manera que no se mantiene a la par de
la polimemsa, se forma la horquilla más grande y la transcripción continúa"
En cambio, si el ribosoma mantiene el ritmo de la RNA polirnerasa, rompe
la horquilla más grande y se une al RNA que forma parte dei tallo de la hor
quilla.-Cuando esto sucede, se puede formar la horquiila de terminación y
sé detiene la transcripción. Et atascamiento del ribosoma puede deberse a
que, corriente arriba de la señal de terminación, hay un marco de lectura
abierto (ORF) corto que codifica un péptido de 14 aminoácidos, que inclu-
ye dos triptófanos. §i ia concentración de triptófano libre es limitante, el

trpE trpD trpC trPB trPA

Figura t2.Il Atenuación en el ope- nN¡;;'::::*; ..
rón de triptófano.

j'-'li:
i
B$ Horquitta

tr¡
ffi oranoe
5' 3'
1....--l
,,, ",',;r. . :
!1

I
J
o M$g
tf''
§-ih
l
l
! I

Marco de lectura Comienzo Marco de lectura Comienzc

abierlo coño de trpE abierto coñ0 de trpE

Seña1 de ierminacién

Cantidades limitantes Cantidades adecuadas

de triptófano de triptó{ano

RNA polimerasa

il...rl
-,,;,::17:r*--"
Ribosoma

EL RIBOSOMA SE ATASCA EL BIBOSOMA NO SE ATASCA

Se forma una horquilla grande Se forma la señal de terminación
Coniinúa la transcripción Termina la transcripción
 Síntesis y procesamiento de los RNA bacterianos

. ribos*ma se atasca porque intenta sintetizar este péptido, mientras que la

ooiimerasa continúa fabricando su transcrito. Como este transcrito contie-
ne copias de los genes que codifican la biosíntesis de triptófano, su elonga-
. ción continuada encara los requerimientos de la cél¡.lla de este aminoácido.
i Cuando la concentración celular de triptófano alcanza un nivel satisfacto-
., rio,
a:: Y- sistema de atenuación previene la transcrípción adicional
rrv, el del operón
-- --- -r -^ --^
,: de triptófano, porque ahora el ribosoma no se demora mientras fabrica el
péptido corto y, en cambio, mantiene el ritmo de la polimerasa, lo que per-
mite que se fotme la señal de terminación.

El operón de triptófano de E coli es controlado no sólo por atenuación, sino

también por un represor (sección 1 1.3.1). No se sabe con exactitud cómo tra-
baj*n juntas la atenuación y la represión para regular la expresión del ope-
rón, pero se considera que la represión aporta la activación-desactivación
básica y que la atenuación modula el nivel preciso de expresión del gen que
tiene iugar. Otros operones de E. coli, como 1os que participan en la biosín-
l, t"rir de histidina, leucina y treonina, son controlados sólo por atenuación.
Cabe destacar que en algunas bacterias, como Bacillus subtilis, el operón de
triptófano es uno de los que no tienen un sistema represor y, así, es regulado
: por completo por atenuación. En estas bacterias, la atenuación es mediada
no por la velocidad con la que avanza el ribosoma a 1o largo del mRNA, sino
por una proteína de unión al RNA denominada proteÍna de atenuación §ja-
dora de ry RNA (TRAP) que, en presencia de triptófano, se une al mRNA
en la región equivaiente al ORF corlo del transcrito de E. coli (figura 12.12).
La unión de TRAP induce la fomación de la señal de terminación y la fina-
lización de ia transcripción.

l¡,;], ;:,,'':ir:l¡-li:]i t..,1:. :;;;¡"ii¡.:¡.i ¡;-': '.:.\;,r"ia,...:'':.a.,:.: ;-.:.:,:¡:.!i::':: i:1,'tl;.1." ti.

#ll,.:..:Í:]];.*r}|::;.:;.:*¡:;¡":*j¡:',::.::.'.j.:i]]].::.,]1.
Se produce retroceso cuanclo una enzima poiimerasa detenida invierte
su movimiento por una breve distancia a Io largo de la cadena molde de
DI{A (sección 12.1.1). Esto despiaza la molécula de RNA recián sinte-
tizada. cuyo extremo 3' se desprende del molde. Para impedir que la
poiirnerasa se atasque en este punto, se debe escindir la porción des-
pi:endida de la molécula de RNA (figura 12.13). La polimerasa tiene Ia
actividad de escisión de RNA requerida, pero en general esta actividad
no es favorecida y, por ende, es probable que haya atascamiento. Éste es
impedido por un par de factores de escisión del transcrito, denominados
GreA y GreB que, pese a su nombre, no cortan en realidad el RNA, sino
que estimulan a la polimerasa para que ella lo haga. Es probable que las
dos proteínas actúen modificando la posición de uno de dos iones mag-
nesio presentes dentro del sitio activo de la polimerasa.

El esclarecimiento de ia función de GreA y GreB para impedir la detención

de la polimerasa es reciente, y todavía no se ha establecido un vínculo entre
e-rtos factores y algún proceso regulador específico. Sin embalgo, hay
aspectos interesantes de su modo de acción, que sugieren que podrían
acluar como mediadores de señales reguladoras de una u otla ciase. Las
p¡rtes plincipales de las proteínas GreA y GreB son dos hélices a separa-
das por un giro corto (ue contiene un ácido aspártico y un ácido glutámi-
co. Estas dos hélices forman una estructura de tipo aguja que penetra en la
RNA polimerasa a través del canal secundario, que comunica 1a superficie
de la enzima con el sitio activo dentro delcomplejo proteico (figura 12.14).
Se considera que los dos aminoácidos ácidos en la punta de la aguja inter-
actúan con elpar de iones magnesio dentro del sitio activo, io que promue-
ve la escisión del segrnento de RNA desprendido. La estructura de GleA y
GreB es notablemente similal a l¿r de una tercera proteína, denominacla
r50 Capítulo l2 Síntesis y procesarnienlo dei Rl\,iA

Figura 12.12 Regulación del operón (A)

t¿^C
de triptófana de Bacillus subtilis. DNA;" ¡¡
(A) La regulación está centrada en ia
proteína TRAP, que se une a la región
f
líder del transcrito cuando los niveles
de triptófano son adecuados. Cuando
se une, IRAP impide la formación de ffi Horquilla
{
la horquilla grande y, así, permite la ffii
LJ
grande
f
formación de la señal de terminación.
.l2.'l2. nt¡¡ *==**J*&"***"=Í O I
Compárese con la figura (B)
Estructura del complejo TRAP-RNA.
I
t
Comienzo de trpE
TRAP comprende 1l subunidades t
idénticas, cada una compuesta princi- I
palmente por hojas F, que se asocian
para formar una estructura circular de
L-^-- Señal de terminación (
s
B nm de diámetro. 5e ilustran las l'l e
subunidades de TRAP en diferentes Cantidades lim¡tantes Cantidades adecuadas r
colores, cada una con una molécula de triptófano de triptófano
c
de triptófano unida indicada por las
estructuras esféricas de color rojo- I
amarillo-azul. La molécula de RNA se C

ilustra como una estructura esfera-

varilla enrollada alrededor del comple- RNA polimerasa
jo TRAP" Parte (B) reimpresa con
autorización de Antson ef oL, ('1999),
Noture, 441 ,235-242.

v
f
C

NO SE UNE TRAP SE UNE TRAP

Se forma una horquilla grande Se forma la señal de terminación
Continúa la transcripción Termina la transcripción :
E
L
s
q
I,
l(
k
q
c
tr
d

{,J

L
rl

tt
sr
n'
1..
l(l

l*
n:
ri

t"
l)t
 Síntesis y procesamiento de los RNA bacterianos 35!

RNA polirnerasa
Dk:§. que media la respresta restrictiva en E. cali,v otras bacterias. Esta res- I
tft\A -. :Y-:id{i:-t¡ q
Duc-t.r se acriva cuando una bacteria eneucrlu'a condieit¡nes cic ct'ccinlicnto c¡
de¡ricrrt.-s. como bajos niveles de aminoácidos esenciale-s. Pala conserar los
recursos, la bacteria reduce su velocid¿rd de transcripción, en par:ticular 1a sín-
tesis de rRNlA y tR.NA, a alrededor: del 59á dei nivel nor-mal. La activación
cic 1* respuesta restdctiva involucra a ppcpp y pppcpp
(figura 12.15), clos Retroceso
nucl*ótidos inf¡ecuentes denomü-iadr:s alarrnonas, que son sintetizados por I
la pruteína Rel A en respuesta a ia privación de aminoácidos. Las alamonas
tribajan junto con [a DksA para paralizar la transo:ipción. El mecanismo
torla',,ia es tema de especulac,iÓn, pero la similitud entre la estructura de la
DksA y ia de GreA y GreB su¡;iere que la primera, al igual que los factores
de escisión del transcrito, inserta su estlalctula de tipo aguja en el canal , Escisión del FNA

-I
para impedir
secundado de la polir"nerasa y, en virtud del par de aminoácidos ácidos de su el atascamienlo
extl.emg (en este caso, dos ácidos aspárticos), infiuye en la actividad de la '"- '"' ;l¡.,
polin-rerasa a1 interactuar con los iones magnesio esenciales dentro de su sitio
activo. Un modeio leciente otolga a las alarmonas un papel directo en este
proceso al contemplar que ppGpp ingrcsa en el canal, en 1a punta de la aguja
áe DksA y participa en el contacto con 1os iones magnesio.

No se sabe con exactitud qué paso de la transcripción se inhibe durante

la respuesta restrictiva; cierta evidencia apunta a eventos que ocurren Figura 12.13 Prevención del atasca-
dul¿:nte la iniciación del pt'ocesr:, mientras que otros resultados sugieren miento de una RNA polimerasa que
ha retrocedido. El retroceso despren-
que es la pausa de la polimerasa. De todos modos, el punto importante
de un fragmento corto del RNA recién
ás q.,e la función de la DksA en este proceso regulador indica que GreA sintetizadá. Es preciso escindir este
y GreB, que actúan en for:na casi indistinguible de 1a DksA, tambiér-r segmento desprendido para impedir
puecien participar en otIOS mecanismos, aún no descubiertos, de regula- que la polimerasa se atasque.
ción de la síntesis de RNA bacteriano.

13.1.3 ffir*c*smmti*mt* d* §*s ruY'áe **;xeter*mmxs

En 1a sección 1.2.3 aprendimos que la mayot'ía de 1as molóculas de RNA
son sintetizadas como precursores, que deben Ser procesadr¡s antes de
que puedan cumplir sus funciones en la célula. El mRliA bacteriano es
lá única excepción a esta regla: los tt'anscritos iniciales de la mayoría de
los genes bacterianos que codifican proteínas son mRNA funcignales,
que pueden ser traducidos de inmediato (vé¿rse figur:a 12.10). Por e1
contlario, los IRNA y los rRNA bacterianos son tlanscfitos inicialmen-
te colxo pre-RNA, que se vuelven funcionales sólo después de una serie
de evcntos de corte y modificaciones quínicas.
DNA corrienie arriba

l*,, *l-'*¡ri*! {j* i:#;"f# l¡r*¡*l; ¡"í;iil,,'4 ? i;r.'o'. ¡' .;.,'' "-
RNA polimerasa
d*',,. ;t s *;*,r*i:¡,:i*.1 p {í:t,;} {5 {i i* :i
Las bacterias sintctizan tfes rRNA clifelentes, denominados rRl{A 5S,
rRN¡\ 165 y IRNA 23S, cuyos nombres indican el tamaño cle liis nlolé- . DNA
;corriente abajo
culas medido por análisis de sedimentación (véase Nota sobre técnicas
7.1). Los tres genes de estos IRNA estárn ligaclos en una sola unidad de
tlansclipción (que suele estat'presente en rnúltiples copias, siete para ,8.
colí) .¡*, así, el pre-RlrlA contiene copi;ts de 1os tres rllNA. Po| lo tanto,
se rec¡uieren eventos de corte para libelar los rRNA tnacluros. Las ¡:ibo-
nucle¿rsas I1l, P y F practican estos coltes en posiciones especificadas por
las regiones bicatenarias {grmacias pol ap¿ireamiento de bases entre dife-
rentÉs partes del pre-RNA (figura 12-16). Con ulterioridad, los extre- Canal RNA
mos cortaclos son recortados por las activiclacles de exonucleasa de las secundario retrocedido
ribonrrcleasas IVI16, M23 y ivl5 para form¿tr los RlrlA madulos.

Los genes de IRNA se distribuyen po1'los genomas bacterianos, algunos Figura 12.14 lnteracción entre CreB
por sí mismos y algunos como disposiciones en tándelrl, en gniclade-. de y fa RNA polimerasa bacteriana'
352 Capítulo 12 SÍntesis y procesamiento del RNA

Figura 12.15 Estructura de las alar- (A) ppGpp (B) pppGpp

monas ppCpp y pppCpp. Compárese
con las estructuras nucleofdicas
convencionales de la figura 1.4. I
o-I
o-
s'
o- o-
lll5'g5t
o-
-()-P-o-P-o-cHz rl;lry1];:lt

w§ rO-P-O-P -O-P-O-CHz fu&

rl rl LO- l¡ ll ll I _O-- I-
ool N ,,4
I

o o o r j
r \.--..J' l\---l
13' 13'
OH
I

o§ I

I 1

O:P-O- O:P*O-
I I
o o
i J

O:P-O- O:P-O-
I I

o-

transcripción rnulti-tRNA. En algunas bacterias, los genes de IRNA tam-

bién infiitran las unidades de transcripción de rRNA, como en el caso de
E. coli, que tiene uno o dos genes de IRNA entre los genes 165 y 23S de
cada una de sus siete unidades de transcripción de rRNA (véase figura
12.16). Todos los pre-tRNA son procesados de maneras similares, ausque
no idénticas. El ejemplo de la figura 12.17 hace referencia al precursor de
la mo1écula de tRNArvr de E. coli. La secuencia de IRNA dentro de la molé-
cula precursora adopta su estflrctura en hoja de trébol apareada por bases
(véase figura 13.2) y se forman otras dos estructuras en horquilla, una a
cada lado del IRNA. Ei procesamiento comienza con el corte por la ribo-
nucleasa E o F, que forma un nuevo extremo 3' inmediatamente corriente
arriba de una de las horquillas. La ribonucleasa D, que es una exonuclea-
sa, recorta siete nucleótidos de este nuevo extremo 3' y hace una pausa
nrientras la ribonucleasa P efectúa un corte en el inicio de la hoja de trébol,
io que crea el extremo 5' del IRNA maduro. Después, la ribonucleasa D eli-
mina dos nucleótidos más, lo que forma ei extremo 3' de la molécula madu-
ra. Todos los IRNA maduros deben terminar con el trinucleótido
5'-CCA*3'. En el tRNATrr, el CCA terrninal está presente en el pre-RNA y
no es eliminado por Ia ribonucleasa D, pero algunos otros pre-RNA care-
cen de esta secuencia o ésta es eliminada por las ribonucleasas de procesa,
miento. Esto se observa en la mayoría de los pre-tRNA cuyos extremos J'
son creados por una endonucieasa denominada ribonucleasa Z, que prac-
tica un corte adyacente al primer par de bases de la hoja de trébol del IRNA

tRNA

Secuencia Secuencia Secuencia

de rRNA 165 de rFINA 23S de rRNA 55
Pre-rRNA
.,r '.| cf*
tl*

Figura 12.16 Procesamiento del

pre-rRNA en Escherichio colí.
Obsérvese que hay un tRNA ubicado *I
entre las secuencias I65 y 23S de
este pre-rRNA de E colr. Este IRNA es
procesado como se muestra en Ia
w# ffi
rHI\A Ib5 rRNA 23S rFINA 55
figura 12.17.
w'
.,...'
SÍntesis y procesamiento de los RNA bacterianos ¡53

{:.-*Yi Figura 12.17 Procesarniento de un

**
t pre-tRNA de Eschericltis colí. EI ejem-
?--v.¡' pio determina la síntesis de tRNArvr. Se
}!_r{ n¡Yd§du t
YY
;-: ilustra en rojo el corte practicado en
,:" l.
algunos otros pre-tRNA por la RNasa Z.
---¿
'. - -r (."1L}-r','.1ts...t-,,'

3 i: L"-'--) ' ' ,.. .. .....,-,.

t. .,
tI "-,*

>150 nucleótidos
Abreviatura : RNasa, ribonucleasa.

RNasa E/F
RNasa P .-..*

*-eS-41 gw**4-.
&-ffiry 1
Y
E
tilti
*&-*.4 k&,w"e"
v''_%- !
&- t srp
@*&
&*&
&*é,h

,, ,, It
.'. ':.:.:.::.. :

.l ,'t t t'

(r'easc figura 12.17) y, por 1<: tanto, elimina la región que contendría el
,,, CCA tenninal. Cuando el CCA está ausente, éste debe ser añadido por una
,rr'i, o más de las RNA polirnerasas indepenclientes
-'-t'-'--"-'-'- clel molde, como IRNA liry:1'-?:,'i,1:lflosdemodifica-
,t nucleotidiltransferasa.
-,,n!¡ntirlilr.o-"fo,o"o ciones químícas que sufren los
;;:i3.?i;:'i:i,ilü y ettRñA.
, La

, De las distintas nucleasas mencionadas, la ribonucleasa P es de particu- il:lÉ:,:"r§1¿'rT:"fffl!j""'J1".:.1

lar interés, porque las diversas subunidades de esta enzima inoluyen una car. Lá desaminaáón es Ia eliminacrón

ribonucleasa MRP, que trabaja con la iibonucleasa P en el proóesarrrien- da de Ia adenosina' La sustitución de

to cie pre-rRNA euóariontes (sección 12.2.4). Estas enzimas proteína

, RNA híbridas pueden ser vestigios del mundo de RNA, el período ;:Yt:1'#[|:ffiiJ;#fl::?.Í?:',]f"
base ocurre cuando se modifican l¿s
' inicial de la evolución en el que todas las reacciones biológicas giraban posiciones de los átomos en el anillo

l i,..: lr?i¡rl j,. ii;r. ¡ii¡";,,

q;:i:; :::-:.::; t.!,,,: qlo, pa¡a convertir uridina en dihrdrouri-

: u Llrlrmo tipo cle procesamiento que tiene lugar en los pre-RNA es ta trodi- Í;lifl:f:fff""Í:*tj:'§3,'"ñ''
r ficación química de Ios nucleótidos clel tlansclito. Esto se observa tanto en por uno nuevo, como queosina.

METILACIÓN DESAMINACION SUSTITUCIÓN ISOMEFiIZACIÓN SATURACIÓN REEMPLAZO

DE AZUFRE DE BASE DE DOBLE ENLACE DE NUCLEÓTIDO
:- !: t)tt
ll
I! ,
av,
"¡,iH "
t "C ll .r_' ,.,:
r:,; 1.::1
HC!.
'ar I
r;r'
1:
ru- u N'"'FJH.. ' ..;
i t..¡ :

{-}
l
llHsrt
§É¡nffi¡r Jlrlat*14 JíFI*R ]EREA
lre tH E
7-metiiguanosina lnos¡na 4tiouridina Seudouridina Dihidrouridina

Queosina
35¡t Capítulo l2 Sintesis y procesamienlo del RliA

1ospre-rRNAcornoenloSpre-tRNIA.Sehaidentif.icac1ounanrp[1oeSpcC.
tro de cambios químicc;s en cliferentes pre-Ri'r-A: se conocen más de 50
modificaciones distintas en total (figur:a 12.18). La mayoría de ellas ocu-
rren directanlente sobre un nucleótido existente del transcrito, pero se
insertan dos nucleótidos moclificados. queosina y viosina (w1,r:sine), qr.re
co1'tan todo un nucleótido y io reemplazall po1' la versión nlodificada.

Muchos de los nucleótidos infrecuentes fueron identificados por prii:rci'ti

vez en tRNA, clentro de ios cuales." utt.rJiiá?;;;;;áJá;-;;;;;:
t,.¡.l¡iil',,,,¡l:,,

ótídos. Se considera que estas moclificaciones meclian ei reconocimiento ,,,;t...,,.:. ,

cle tRl{A inciivicluales por las enzimas que unen aminoácidos a estas mo1é- l,ii,,iiaii,i.,1.i''

culas (sección 15.1.1), y aument¿rn el espectro de interacciones que pue-

den producirse entre los IRNA y los codones durante la tladucción, lc, que
perrnite que Lin solo IRNA reconozca más de un codón (sección 13.1.2).
Sabemos bastante poco acerca de cómo se llevan a cabo las modificacio-
nes de los IRNA, más a1lá del hecho de que. hay una serie de enzimas que
catalizan estos cambios. Se presume que estas enzimas utilizan caracterís-
ticas específicas de la estructura apareada por sus bases del IRNA para
identificar los nucleótidos por modificar adecuados.

Los RNA ribosómicos son modificaclos cle dos maneras: por agtregado clc glu-
pos metilo ai g:r:po 2'-OH, sobre todo, de los azúcares de los nucleóticlos.5'
pol'conversión de uridina en seudouridina (véase figura 12.18).Se produce
1a misma modificación en la misma posición de todas las copias de un rRi\,iA,
y estas posiciones modificadas sol1, en cierta medida, iguales en difetentes
especies. Se pueden observar, incluso, algunas similitudes de ios patr"ones de
modificación cuando se comparan bacterias y eucariontes, aunque los lRi§A
bactedanos son modificados con menos intensidad que los eucariontes. No
se han cletectado las funciones de las modificaciones, si bien la mayoría tiene
lugar dentro de las paltes de los IRNA que se piensa que son más cruciales
para la actividad cle estas moléculas en los ribosomas (sección 15.2.11. Por
ejemplo, los nucleótidos modificados podrían participar en reacciones catali-
zaclas pol IRNA, como síntesis de enlaces peptídicos. En los euc:lriontes, hay
una compleja maquinaria para moclificar: molóculas cle IRNA (sección
12.2.5), que está alrsente en las bacterias, cuyos rRNA son modificados por
enzimas que reconocen directamente la secuencia o las estmcturas cie las
t'egiones del RNA que contienen los nucleótidos por moclific¿u: A menr-tdo, s.'
n-iodifican dos o más nucleóticlos de la misma región al mismo tiempo' Por
1o tanto, la modificación del rRNA b¿icteriano es simil¿rl a los sistemas clu:

inodificación de IRNA cle bacterias y eucariontes.

l*"r-.1.;l flSesrrnr§ación de lc; fift"& h¿¡ct*r¡i?sl{:}s

Hasta ahora, en este capítulo se ha consicleraclo la síntesis cle lo' li.Nt\'
Su clegraclación es igual de importirnte, soble toclo con t:especto a ltrs
mRNA, cuya presencia o ausencia en l¿r célula determina clué protcínas
serán sintetizadas. La degradación cle mRNA específicr:s poch'ía ser una
firanera poderosa de regular la expresión clel ;¡enoma.

Es posible estimar' la r.,eiociclad de clegraclación cle un mRl'JA

r.,eiocidad cle mRl.JA detetmjnando
detetmjnancto ,,,..ttlltt.¡'l:¡,,,
sr-r semivicla celular. Las estimacione,c muestr¿in que lray
ir;ry cr:nsiclerables
constcterallle§ vart¿r-
v¿lna- ...:l¡i;i....l:llt.i.:li
.iliitii.iiili.ii.¡ijj,.
ciones entre distintr:s organismos y dentro clel mismo organismo. Por 1o gene" ,i.ii};i,...,,,,.,..l.,
lal, el lecambio de mRNA bactedanos es nluy rápiclo, y sus semiüclas rara ¡:,,,,r§;i$,,
u*r.lrrun
vez dut'an más de algpnos ilinutos, 1o que refleja los r'ápidos cambios de ttx
ios ráiiclos los ,.,,6|.,...,,.t1
...6¡¡,l=l.1
pattones de síntesis proteica que pr:eden sobrevenil'eÍl una bactelia en cl'ccl- {fl
iniento activo con un tiempo áe §ener:ación c1e ¿ilredecior c1c 20 miÍIlllos. l-os,,,,ffi|....:,,,,,,,;
mRNA de los eucariontes persisten nrás, cot-l semividas de 10-20 mintltos, en.;¡.,,ffi:ilt,,..t
promedio, en las lev¿rduras y de r.'arias holas en lc¡s mamífelos. :"
."
..,.¡r, ¡i
. iirrr,i*#§§lYrLr:
 Síntesis y procesamiento de los RNA bacterianos tr:¡

t.
.. '. -:, Horquilla de terminación
Estuclios cle bacterias mutantes, cuyos mRir{A tienen semividas prolon-
gadrs. han pc-r'rnitido identiticaí una serie de ribonucleasas y otras enzi- 53'
r¡as Jc degradación de RNA que se con,siciera que participan en la &
{egradaciÓn de1 n:RNA. Estas son: ñl',i;l:l i. Fl'if.:,:':¿
I

* (Niisa E y RNasa Il1, que son endonucleasas que practican cortes I FNasa E o
inremos en las moléculas de RltlA. I HNasa tll

* Rlrasa II, que es una exonucleasa que elimina nucleótidos en direc-

ción 3'-+5'.
x Polinucleótido fosforilasa (PNPasa). que también eiimina nucleóti-
dos c1e manera secuencial desde el extremo 3' de un mRl'{A pero, a
clii'erencia de las nucleasas verdaderas, lequiere fosfato inorgánico
como cosustrato.
En las bacterias, todavía no se ha aislado ninguna enzima capaz de F{F,iasa i!- F}iF***
clegradar RNA en dirección 5'--+3'. Esta ausencia insta a presuponer
qr-re el principal proceso de degradación de los mRNA bacterianos con-
siste en eliminar nucleótidos del extremo 3'. En circunstancias norma-
les, esto no es posible porque la mayoría de los mRNA tienen una
Figura 12.19 Degradación del RNA
estniütura en holquilla cerca del extremo 3', la misn-ia que indujo la bacteriano. La horquilla de termina-
ten:rinación de la transcripción (véanse figuras 12.5 y 12.7). Esta ción bloquea las actividades de exo-
estl'uctura bloquea el progreso de Ia RNasa II y la PNPasa, lo que impi- nucleasa de la RNasa ll y la PNPasa
de que accedan a la parte de codificación del transct'ito (figura 12.19). y, por lo tanto, debe ser eliminada
Por lo tanto, el nlodelo de degr:adación del mRNA comienza con Ia eli- por acción de endonucleasas (RNasa
minación de la región 3' terminal, incluida la hr:rquilla, por una de las E o RNasa lll) antes de que pueda
endonucleasas, Io que expone un nuevo extremo desde el que la RNasa ocurrir la degradación.
II y la PNPasa pueden ingresar er-r la región de codificación y destruir
la actividad funcional del mRNA. También puede participal' la polia-
denil*ción, considerada fundamentalmente una característica de los
nrRldA eucariontes (sección 12.2.1). Desde 1975 se sabe que muchos
transcl'itos bacterianos tienen colas de poli(A) en alguna etapa de su
existencia, pero que estas colas se degradan con lapidez. Por ahora, no
se ha esclal'ecido si ia poliadenilación precede a 1a degradación de un
mRI{A o si se produce en diversas etapas intermedias después de ini-
ciada la degradación.

En 1a célula, la RNasa E y la PNPasa están ubicaclas dentro de un con-

plejo multipl'oteico denominado degradosoma. Otlos componentes del
degradosoma son una RNA helicasa, que se considera que ayuda en la
deguiclación pol desenrollar'la estructura de doble hélice de los tallos de
los tallo-bucles de RNA. En ocasiones, se observa copur"ificación de
fragrrentos de rRNA con el degradosoma, lo que sugiere que el comple-
jo podría palticipar: en 1a degradación tanto de rRNA corno de mRNA.
Sin r:mbargo, todavía no se conoce el papel exacto del degradosoma;
algunos investigadores son escépticos respecto de su existencia leal y
señaian que proteínas que, evidentemente, no palticipan en la degrada-
ción clel mRNA, como Ia enzina cle la glucólisis enolasa, parecen ser
coittponentes del degradosorna, lo que quizás indique que el complejo es
un altefacto producido dtirante la extracción de proteínas de las células
bacterianas. Una brecha más significativa en nuestro cr:nocimiento con-
ciet'ne a la manera como la degladación se dirige específicamente a
mR.l{¡\ individuales. Sabemos que se produce degr:adación específica,
porque la degradación dei mRNA ha sido irnplicada en la regulación de
varios grupos de genes bacterianos, como el operón pup de E. coli, qte
codifica proteínas involucradas en la síntesis de los pili de 1a superficie
celuiar'. Lamer-ltablemente. el ploceso mediante el cual se ejelce este con-
tt'ol sigr.rc sicndo un lnisterio.
 't,-'!-.,§M
t:::::aa .'.

...'
Capítulo l2 Síntesis y procesamiento del Rl"lA

i,

§k.X S§m**s§s y &ptrffisesesx§&erlt* .

.::,:. .

',.::,,
*ieE &NA sa"lcariomte .,

En el nivel más básico. la transcripción es similar en las bacterias y los

eucariontes. La quírnica de la polimerización de1 RNA es idéntica en
todos los tipos de organismo y las tres RNA polimerasas nucleares de 1,.:.'
eucarir:ntes están todas lelacionadas desde el punto de vista estructural
con ia RNA polinlerasa de E. coli, con equivalencia entre sus tres su1:-
unidades más grandes y las subuniclades ü, fl y F' de la enzima bacteria-
na. Los contactos entre la RNA polimerasa I[, el DNA molde y el
transcrito de RNA eucariontes, revelados por cristalografía de rayos X y
estudios de enlaces transvetsales, son similares a ias interacciones des-
critas en 1a transcripción bacteliana (sección 12.1.1); también se sostie-
ne el principio básico de clue 1a transcripción es una competencia paso
a paso entre elongación y terminación.

3?"?"? §á¡rtssis d* m?§ru& eu*§ris§tt* p*r Na ffi§*&

p*§§merase §,
Pese a las simiiitudes de base, los procesos globales de síntesis de mR.NA
en bacterias y eucariontes son bastante distintos. La dil'erencia más llama-
tiva es el glado de procesamiento de los mRNA eucationtes clur¿xrte la
Complejo de preiniciación
transcripción. En las bactedas, ios transcritos de genes que codificarl pro-
teínas no son procesados en absoluto: los transcritos primarios son mRNA
maduros. Pr:r el contrario, todns k:s mRNA eucadontes tienen una caperu-
,:.j;"-q**3§§§#l za (casquete) agregada al extremo 5'; asimismo, la mayoría está poiiadeni-
lada por añadido de una serie de adenosinas al extremo 3'; muchos
Hegión del promotor contienen intrones y, por 1o tanto, sufren corte y empalme; y algunos están
I Despeie
sujetos a edición del RNA. Se ha asignado una función al encapuchamien-
J del promotor
to, pero la razón de la poliadenilación sigue siendo, en gran medida, un
r
misterio. En el caso del corte y empalme, y la edición. podemos reconocet
::t la razón de estos eventos *el pdmero elimina intrones que bloquean la tra'
ducción del mRNA, el último modilica las propiedades de codificación del
RNA polimerasa ll mRNA- pero no sabemos por qué se han desarrollado estos mecanismos.
En primer iugar, ¿por qué los genes tienen intrones? ¿Por qué editar un
I Escape mRNA en lugar de codificar las secuencias cleseadas de DNA?
+ del promotor
Los nRNA eucariontes son procesados mientras se los está sintetizan-
do. La caperuza se añade en cuanto se ha iniciado la transcripción' el
corte y empalme comienza mientras todavía se está f'abricanclo e1 trans-
clito, y la poliaclenilacíón es una parte inherente del mecanismo cle ter-
Ahora, la HNA minación para la RNA polimerasa IL Considerar juntr:s todos estos
oolimerasa ll eventos sería confuso, pues se deben describir demasiados fenót;renr¡s
se dedica a fabricar
un trans6rilo
c.lil'elentes a1 riismo tiempo. Por 1o tanto, diferirenros el estuciio de la
edición del RNA hasta rnás adelante en este mismo capítulo, lo que sig-
nifica que se lo puede tratar junto con formas similares de modificaciórr
químici que se producen durante el procesamiento del IRNA y eltRNAl
Figura '12.2O Despeje del promotor ciedicaremos una sección distinta al corte y empalme, después de haber
y escape del promotor. El despeje estudiado el encapuchamiento, la elongación y la poliadenilaciÓn.
del promotor es la transición del com-
plejo de preiniciación a un complejo
que ha comenzado a sintetizar RNA. {l *r:rr:p*rl-¡r;r:sír:r:i* C* lnss tr*¡:sr:ril*s d* l4,:'.lA p*íím*r*sx ll
EI escape del promotor tierre lugar
cuando la polimerasa se aleja de la
t ¡-ttr!'t in¡rtr:d¡ataÍr)r';)lL' r/e :pl;Éi til lc itlitiact,t¡t
región del promotor y se dedica a La fosforilación deldominio C termin¿rl (CTD) c]e la subunidad mas glrndc
fabricar un transcrito. El dibulo es cle la RNA pr:limerasa II es el paso final de iniciación de la transcripción dc'
esquemático y no prei.ende indicar la gcnes qlle codifican mRNA en los eucaliontes (sección 11.2.3), pL-ro no.cs ,

forma ni Ia composrción de las sub-

unidades del complejo de RNA poli- seguida de inmediato por el conlienzo de la elongación. Existe un á1'e¿r algÜ :
mer¿sa ll que sintetiza el transcrito. gris en nuestl'o conocimiento sobt'e los eventos qrie distinguen el despej e del :':'''l
 Síntesis y procesamiento del RNA eucarionte 557

promofof (prt»notor cleara¡lce). que hace relerenci¿t a ia r¿ursición del com-

plcjo dc pteiniciación a un complejo que ha comenzadt¡ a sintetizar RNA, del
ir.np" del promotor, durante el cual ia polimerasa se aleja de la región del
prorrlotol'y se dcdica a fabricar un transcdto (ñgUra 12.2A). Los efectos
óp"."rus de it¡s factores de elongación negativos y positivos influyen en la
cdpiici.lad de la polimerasa de iniciar la síntesis plocluctiva de RNA; si pre-
dominan los factores negativos, la transcripción se detiene antes de que la
polimerasa se haya desplazado más de 50 nucleótidos respecto del pr-into de
iniciación. Por 1o tanto, el escape del promotor podúa ser un punto de con-
rolimportante, pero todavía no se sabe cómo se aplica ia regulación en esta
etaPa'
, .t,t
': ' El escape del promotor exitoso podría estar relacionado con el encapucha-
miento, que es un evento de procesamiento que se completa antes de que el
ffanscdto alcance 30 nucleótidos de longitud. Ei primer paso del encapucha-
miento consiste en añadir una gxanosina extra al ext¡emo 5' del Rl.lA. En
lugar de ser llevado a cabo por polin-ierización normal del RNA, el encapu-
chamiento implica una reacción entre el trifosfato 5' delnucleótido terminai
y el trifosfato de un nucleótido GTP. Se elimina el fosfaro y del nucieótido (el
fbsfato más extemo), así como los fosfatos F y y del GTP. 1o que crea un enla-
ce 5'-5' (figura 12.21). La reacción es realizada por la enzima guanililtrans-
ferasa. El segundo paso de la reacción de encapuchamiento convierte la

...),..;..::
* FFFN r
I

Guan¡l¡ltransferasa I I

PPN -r
I

Guanina metiltransferasa I I

. r.r, ppNl

:.i..'l
adlci{}?'e, ..
rX\ ^
i.\:/ ! üH.j
-1#
}.]N C ,, ¿:ü O- O- O-
'-"s'rrIs'ffiú

.;::-l Enlace 5'- 5 !i Figura 12.21 Encapuchamiento del

;¡ O OHU
I
mRNA eucarionte. La parte superior
^_ó
v-t v del diagrama muestra, en términcs
I generales, la reacción de encapucha-
o miento. Una molécula de CTP (dibu-
I w" jada como Cppp) reacciona con el
CHz ffikH#
1-O-
L/' -\] l extremo 5' del mRNA para generar un
enlace trifosfato. En el segundo paso
i\__,/r del proceso, la C terminai es metilada
ll*
OOH en el nitrógeno número 7 La pañe
I inferior del diagrama muestra la
o:P-o- estructura química de la caperuza de
I

(J tipo 0, con asteriscos que indican las

posiciones donde podría haber otras
mñNA
I
metilaciones para generar las estructu-
ras de caperuza de tipo 1 y de tipo 2.
358 Capítulo 12 SÍntesis ir prccesamiento del RNA

nueva guanosina terminal en 7-metilgUanosina, por uniÓn de un grr.rpo meti-

lo al nitrógeno número 7 del anillo de purina; esta modilicación es cataliza-
cla por la guanina metiltransferasa. Las dos enzimas de encapuchamiento
estáblecen uniones con el CTD y es posible que sean componentes intúnse-
cos del complejo de RNA polir:rerasa II durante el despeje del promotor'.

La estructura de 7-metilguanosina se denomina caperuza de tipo 0, que

es ia fo¡ma más común en las levaduras. En los eucariontes superir:r¿3
se observan otras modificaciones (véase figura 12.21):
,r Una segunda metilación reemplaza el hidr:ógeno delgrupo 2'-Ol{ del
que ahora es el segundo nucleótido del transcrito. Esto determina
una caperuza de tipo 1.
* Si este segundo nucleótido es una adenosina, el grupo amino unido al
carbono númet'o 6 del anillo de purina también podría ser metilado.
* Podría haber otra metilación 2'-OH en la posición del tercer nucle-
ótido, 1o que da por resultado una caperuza de tipo 2.
Todos ios RNA sintetizados por la RNA polimet'asa II son encapuchados
de una manera u otra. Esto significa que, así como los mRNA, los snllNA
transcdtos por esta enzima también están encapuchados (véase cuadro
l1.i). La cáperuza puede ser importante para exportar los mRNA y los
snRl.{A del núcier: (sección 12.2.7), pero su función mejor definida coLres-
ponde a la traciucción de los pRNA, que se trata en la sección 13.2.2.

-,: :

Como ya se mencionó, los aspectos fundamentales de ]a elongacion.de

los transcritos son iguales en bacterias y eucariontes. La única distingi$¡ ' ¡,11;1
,. r'
importante se refiere a la longitud del transcrito que debe ser.sintetiza- '.::::tt'r,,t:::.::t.,.:.'
do. Los genes bacterianos más largos miden sólo unas pocas kilobases y ,i'li,,liii'.,rriitr,t' .

tacteriana, que tiene una velocidad de polimerizaciÓn de varios cientos

de nucieótidos por minuto. En cambio, la RNA polimerasa I1 puede ir,.11.:lrr,,¡1,¡
invertir horas en transcribir un solo gen, aunque puede trabajar a una ,.:,,;,,:,,.,:,'
velocidad de hasta 2.000 nucleótidos por minuto. Esto se debe a que la ',:,,11.,,i',l.lr::'.
presencia de múltiples intrones en numerosgs genes eucafionte§, (Sec' ii:ai..lii.:li.,r... ,

ZiOn tZ.Z.Z) implióa que se deben copiar longitudes considerat¡les de 'ix",'',...,..'

DNA. Por ejemplo, el pIe-mRNA del gen de distrofina humano tiene ,''rilll.:'r':',','

bilicladdel complejo de transcripción. La RNA polimerasa II por sí misma

:'':,.,":::,',1,';:..,

Cuadro I2.I Ejemplos de factores d'e elongacién para la RNA polimerasa Il de rnamífero

Factor de elongación Función t

TFllF, CSB, ELL, elongina Estos factores suprimen la pausa de la RNA polimerasa ll, que pue.de 't'i
- .

aDarecer cuaádo la enziha úanscribe una región donde se pueden formar

p'ares de bases intracatenarios (p. ej., una horquilla)

TFIIS
lmpide la detención (suspensiÓn completa de la elongaciÓn) t"'r!i

FACT Se considera que modifica la cromatina para ayudar a la elongación -;-

 ii,.

Síntesis y procesamiento del RNA eucarionte

nü puede satislacer estas exigencias: cuando se estudia in vitra ia enzirna

puriiicada, su velocidad de polimerización es de menos de 300 nucleótidos
por minuto, porque Ia enzima reaiiza pausas frecuentes sobre el molde y, a
veces, se detiene por completo. En el núcleo, las pausas y las detenciones
s$n menores del:ido a la acción de una serie de factores de elongación, pro-
teínas que se asocian con la pr:iimerasa después que ésta ha clespejaclo al
prümotor y dejado atrás los factores de transcripción involucrados en la ini-
ciación. En la actualidad, se conocen I J factoles de elongación en las célu-
1as de mamíferos, que cumplen diversas funciones (cuadro 12.1). Los
et'ectos de las mutaciones que alteran ia actividad de alguno de estos facto-
res demuestran su importancia. Por ejemplo. ia desactivación de CSB pro*
voc¿r elsíndrome de Cockayne. una enferrnedad caracterizada pot defectos
de1 desarrollo como retraso mental y una alteración del factor de elonga-
cirin ELL causa leucemia mieloide aguda.

Una segunda diferencia entre la elongación de1 transcrito bacteriano y del

eucarionte es que la RNA polimelasa II, así como las otras polimerasas nucle-
ares eucariontes, deben negociar con los nucleosomas que están unidos al
DNA molde que se está transcribiendo. A primera vista, es difícil imaginar
cóm,¡ la polin-rerasa puede elongar su transcrito a través de una región de
DNA enrollada alrededot de un nucleosoma (véase figura 7 .2).Es probable
que la solución a este problema dependa de los factores de elongación. que
pueden modific¿lr de algrrna manera la estnrctura de la cromatina. En los
manríf'eros, el factor de elongación FACT ha mostr¿ido interactuar con las his-
tonas H2A y FI2B, lo que quizás influya en la posición de los nucleosomas, y
se han demostrado interacciones no tan bien definidas pai'a otros factores. La
levadura tiene un factol, denominado elongador, al que se le ha asignado un
papel en la modificación de la cromatina, porque contiene una subunidad
cün actiüdad cle histona acetiltransferasa, pero no se ha identificadr:, hasta
ahora, un homólogo de este complejo en los mamíferos. Un interrogante inte-
resante es si la prir-nera polimerasa que tt'anscribe un deterninado gen es una
"pionera" con un cr:mplemento especiai de factot'de elongación que abre la
estillctura de la cromatina, y si las series ultedores de transcripciÓn son lle-
vaclas a cabo por complejos de poiimelasa convencionales, que aprovechan
los cambios inducidos por la pionera.

La mayoría de 1os mRNA eucariontes tienen una set'ie de hasta 250 ade-
nosinas en sus extremos 3'. Estas A no están especificadas por e1 DNA
.y sün agregaclas al transclito por una RNA poiimelasa independiente del
molcle, denominacla poli(A) polimerasa. Esta polimerasa no actúa en e1
extr:emo 3' tenninal del tlanscrito, sil-ro en un sitio interno que es degra-
dado pala cl'ear L1n nllevo extremo 5'al que se añac1e la cola c1e poli(A)^

Las características básicas cle la poliadenilación se conocen desde hace

algún tiempo. En los mamíi'elos, la poiiadenilación está dirigida po1'ul1¿r
secuencia de señal en el n-rRNA, casi siempre 5' AAUAAA-3'. Esta
secuencia se locaiiza entre 10 y l0 nucleótidos coniente arriba del sitio de
poliadenilación, que sueie ser inmediatamente posteriol al dinucleótido
5'*CA-3'y es seguiclo de 10 a 20 nucleótidos después por Llna región lica
er-r CU. Tanto la secuencia de la señal poli(A) como la región rica en GU
son sitios cle unión a complejos proteicos de múltiples subunidades, que
son. respectivamente, el factor de especi{icidad de escisión y pr:liadenila-
ción (CFSF) y el factor de estirnulación de escisió¡r (CstF). Fara que haya
poliadenilación, la poli(A) polimerasa y por 1o menos otros dos factot'es
proteicos se deben asocial con el CPSF y el CstF unidos (figurn 12.22).

I
360 Capítulo l2 Síntesis y procesamiento del RNA

Figura 12.?2 Foliadenilación de

5' 3',
Pre-mRNA W AAI-lA¿"q M*Á ffi§§§i3 ür i ffi#&
mRNA eucarionte. El diagrama es
esquemático y no pretende indicar los t Ensamblaje del complejo
tamaños relaiivos, las fon¡as de los l de poliadenilación Proteína de unión
diversos complejos proteicos ni su
poslción precisa, aunque se considera
que el CPSF y el CstF se une n ¿ las
secuencias S'-AAUAAA-3'y ricas en
CU, respectiv¿mente, como se ilustra.
'CU" indica una secuencia rica en CU,
en lugar del dinucleótido 5'*CU-5'.

Poliadenilación
I
l

Estos ofros factores son la proteína de unión a poliadenilato (PADP), que {

ayuda a la poiimerasa a agregar las adenosinas, lo que quizás incida en la I

longitud de la cola de poli{A) sintetizada, y que parece participar en el l

mantenimiento de la cola después de la síntesis. En la levadura, las secuen- (

cias de señal del transcrito son algo diferentes, pero los complejos próteicos {

son semejantes a los de los mamíferos, y se considera que la poliadenilación l

tiane lugar a travás de un mecanismo más o menos similar. I
I

Aiguna rrez se pensó que la poliadenilación era un eyento "postranscripción";

ahora se reconoce que es una parte inherente del mecanismo de terminación
de la transcripcién por la RNA polimerasa IL Se sabe que el CPSF interactúa (

con ei factor TFIID y es reclutado al complejo de la polimerasa durante la i

etapa de iniciación de la transcripcion. Al transcurrir a lo largo del molde con I

la RNA polimerasa If, el CPSF se puede unir a la secuencia de señal de t

poli(A) en cuanto ásta es transcrita, lo que inicia la reacción de poliadenila- {
ción (figura 12.23). Tanta el CPSF como el CstF establecen contactos con el t
CTD de la polimerasa. Se ha señalado que el carácter de estos contactos se i
modifica cuando se localiza la secuencia de señal de poli(A), y que este cam-
bio altera las propiedades del complejo de elongación, de manera que se J
favorece la terminación respecto de la síntesis continuada de RNA. En (
consecuencia, la tmnscripción se detiene poco después de que se transcrj.
be la secuencia de señal de poli(d).
s

t
Figura 12.23 Relación entre polia-
denilación y terminación de la Aunque es posible identificar la peiliadenilación como una pafie inherente
transcripcién por la RI{A polimerasa del proceso de terminación, esto no explica por qué es necesario añadir una
ll. Se ilustra el CP§F unido al comple-
jo de elongación de RNA polimerasa
ll, que está sintetizando RNA. EI CPSF HNA polimerasa ll
se une a la secuencia de señal de
poliadenilación en cuanto es transcri- t-.
to. Esto modifica la interacción entre n¡{q;¡ü-::x#);rr; ¡i
el CPSF y el CTD de Ia RNA polimera- _..--'---
L-,1,.,r,,i1
:.,,',.t',, ,,:.':.:::,,.,1a,::
\;-:r.t,r.,,ti:,:---,..r
L--i
SgCUgnCia dg Sgñal
sa ll, de manera que ahora se favore-
ce la terminación de la transcripción i
I
de poliadenilación
respecto de continuar con la elonga- CPSF I
I
ción. Esta es una representación !

esquemática e ignora la posibilidad de

que CstF pueda ser además un com-
ponente del complejo de elongación.
También rnuestra que el CPSF aban-
dona el complejo para unirse a la
I
señal de poliadenilación, cuando en I
realidad puede mantener su unión a Ahora se favorece
la RNA polimerasa Il durante bl proce- la terminación respecio
so de poliadenilación. de la elongación
 Slnfesis y procesamiento del RNA eucarionte 36r

cola de poii(A) al transcrito, Durante vados años, se I-u buscacio una fun-
ción para la cola de poli(A), pero no se ha hallado ninguna evidencia con-
vincente para ninguna de las diversas sugerencias efectuadas. Estas
sugerencias son una influencia sobre la estabilidad del mRlrlA, que parece
inrprr:trabie porque algunos transcritos estables tienen colas de poli(A)
rllr1y'cortas -v una función en la iniciación de la traducción. Esta irltima pro-
puÉ-st¿l es avalada por la investigzrción que muestra represiÓn de la activ!
dad dc la politA) polimerasa durante los períodr:s del ciclo celular cuando
la síntesis proteica es relalivamente escasa.

No todos los mRNA eucariontes tienen una cola de poli(A) y este dato debe-
rá ser tenido en consideraciór-i al determinar finah¡ente qué función cumple
la poliadenilación. Los mRNA no poliadenilados son un grupo pequeño,
pero que ir-rcluye varios lniembros importantes, sobre todo los rRNA que
especifican ias proteínas histona. Los extremos 3' de estos mRNA no polia-
denilados son creados, al igual que las versiones poliadeniladas, por escisión
de un ttanscrito primario en una posición específica, pero las señales de esci-
sión y Ias proteínas involucladas en el proceso son bastante diferentes.
Parece haber dos señales de escisión dentro del transcrito, la primera de
ellas es una horquilia que se forma corriente abajo de la región de codifica-
ción (filfrra 12.24,\). La horquilla siernpre está formada por 6 pb del tallo
y 4 nucleóticlos del bucle, y esta configuración particular es esencial para la
escisión exitosa, aunque puede vadar la secuencia exacta de nucleótidos de
la estmctura. La segurrda señal es una secuencia de 9 nucleótidos (cr:nsen-
so 5'-C,{4.G¡rtra!{GA-3') ubicada alrededor de 12 nucleótidos corriente
abajo de la horquilla. Esta secuencia se aparea por sus bases con una parte
dei U7-snRNA (figura 12.248), uno de la familia de RNA nucleares peque-
ños, cuyos miemblos participan en diversos aspectos dei procesarniento del
RNA, como el colte y empalme de intrones, según se ver¿i en la siguiente
sección. El apaleamiento es estabilizado por una proteína de unión a la hor-
qr-rilia y el corte se practica cuatro o cinco nucleótidos corriente abajo de
ésta. l'{o se sabe con exactitud cómo se efectúa este corte: todavía nc se ha
identificado ningunei proteína con la actividad necesaria.

ft*gxlx**r: r§* lx s¡¡rl*si: #* rn§§,4 *r¡ l*s *t;*r:ri*nt*s

Cuando se examina la síntesis de los mRNA bacterian<¡s, se observan diver-
sos procesos a través de los cuales se podrÍa controlar la expr:esión del geno-
ma al regular la etapa de elongación-terminación de la transcripción (sección

figura 12.24 Procesamiento de los

extremos 3'de los mRNA de histonas.
(A) Estructura de la región 3' de un
mRNA de histona, que muestra Ia
(B) La escisión involucra a U7-snF|NA horquilla y la secuencia consenso de
9 nucleótidos. (B) La secuencia con-
re senso se aparea por sus bases con
{3{} una corta región del U7-snRNA. La
v*Y
9-? unión es estabilizada por una horqui-
Q- Q Escisión lia-proteína de unión (no ilustrada en
e--q
ó*ó I
t este diagrama) y una proteína no
**¿._:__--- CAA§&&¿üA
á¡ ir rt rÁr. .&6
3' identificada practica el corte en una
é** ,d UUUUUU posicién cuatro o cinco nucleótidos
g'#"'d* -.
U7-snBNA 'tu 5' cr:rriente abajo de la horquilla.
 Capítulo l2 Síntesis y procesamienlo del Rl'iA

12.i.2). En ios eucariontes, ia detección dc mecanismr:s regulaclotes equiv¿-

lentes ha resultado esquiva desde- nuestro punto de li-sta actual, los procesos
de control de 1a transcripción parecen operar casi en foma exclusiva en 1a
etapa de iniciación, conlo se descdbe en la sección 11.32, más que clurante
las fases c1e elongación y tetminación de la síntesis de mRNA.

De todos modos, conesponde nrencional tres posibles mecanismos cic con-

trol^ Prirnero, el factor de elongación de RNA polimerasa ll denoriri:';:'.1';
TFIIS, aunque estl'ucturalmente distinto de las proteínas Gre bactet"ianas
analizadas en la sección 12.1.2, actúa cle manera similar y accede al sitio
activo de la RNA polimerasa II por inserciÓn de una estructura cle tipo
aguja a través de un canal que transcurre desde la superficie del complejo
enzimático. Así, TFIIS, al igual que GreA y GreB, puede reiniciar una RIJA
polimelasa atascada al estimular la escisión del segmento 5' clei transtrito
de RNA desprendido. En la sección 12.1.2, decidimos que, si bier-r todavía
no se ha atribuido ningún proceso regulador espe-cífico a las ploteínas Gre.
es posible que cumplan una función de este tipo y, por extl'apolacióu, esa
conclusión tan-rbién es aplicable a TFIIS.

El segundo posible mecanismo para ia regulacién de la elongación o

la terminación de la síntesis de mR|.lA en los eucariontes gira alrede-
dol del estado de fosforilación del CTD de la RlllA polimerasa Il.
Cabe recorcial que durante el proceso de iniciaciÓn de la transcrip-
ción, la fosforilación de serinas dentro del componente repeticlo del
CTD activa 1a polimerasa y estimula el despeje del promotot (sección
11.2.3). Esto implica que un CTD fosforilado podríer sel esencial para
la síntesis eficiente de RNA. La observación de que el estado de fr¡s-
forilación del CTD no es constante durante todo el proceso c1e trans-
cripción sugiere, por io tanto, que ios cambios de este estado podrían
desempeñar algún papel en la regulación de la transcripción. Se han
identificado varias proteincinasas que fosforilan e1 CTD y se conocen
ai menos tres foslatasas que pueden llevar a cabo l¿i reacción inversa,
eliminando fos{atos de la estructura. Por ende, existe 1a n:aclr"tinat'ia
para ir-rodificat'el estado de fosforilación del CTD durante la elonga'
ción y la terminación, pero h¿ista ahora no se ha descubierto ninguna
relación con ia regulación de ia transcripciÓn.

Por último, cacla vez hay nrás evidencia de que el control cle la poiiarienila'
ción clel mRNA podr'ía ser un mecanismo regUladol importante tn los
eucariontes. Nlucños gene.s eucaliontes tienen más de una secucncia dc
señal poliadenilaciónt esto significa que la tetminaciÓn puede tener lugar ,irr,
c1e ,

en distintas posicir:nes, 1o que da pol resuitaclo mRNA con idéntic¿ls prü' ,,.;;,,;r,,'.;,.
pieclacles de coclificación, pero extremos 5' distintivos. Diferentes tejiclos';i:lt/,,a.a*,
pr."".r. utilizar distintas r*ñui.tcle poliadenilación, lo qr-re sugiere que la ),ll:,l'i,t '¡..S¡
poliadenilación alternativa poclría ser un ¡:recanismo importante pal'a esttt- :,'*;,:.',,:.t;..5
biecer patrones de expresión del genoma específicos c1e tejido.
.,. .., ..
"
Exones
*i::"i:-":{,.,-r]!¡.,";t"¡,.:-]:{..;.;l**{;;,ll:.u."';:r1
lntrones

La existencia de intrones 1-lo se sospechó hasta 1977, cuando se aplicÓ .r,]i¡..rl;:,'l'

Figura 12.25 lntrones. Se muestr¿ l¡
estructura del gen de p-globina huma-
no. fste gen mide 1.423 pares de
bases de largo y coniiene dos intro-
nes, uno de 'l 3l pb y otro de 85"l
pb, que representan, junfos, el 69orb
de la longitud del gen.
pol primera vez secuenciación dei DNA a genes eucariontes y sr advir- ,t$lIi*..,,,
iiO q"e muchos de ellos contenían "secuencias interpuestas'' c1u.- t!p-i .-.., .,..-,
.rr, .lif.r.rtes segmentos ciel Dl{A codificante entre sí (figtrra 12.25t ..., ...
Ahora, r. r""or"toi*n siete tipos distintos de intrones en los eucalionte§'',,',,,,,;;;ift,,,),*',,
y otras fonnas en las arquer:Lacter:ias (cuaclrc 12.2). Dos de estos tipo§' ,ri,:i,.,':i..
ios intrones GU-AG y AU-AC, se encuentran en genes que codificill1",',':',7::3;i.)?.
ploteínas eucadontes y se los trata en esta sección; los otros tipos t*:';,,l:.:. ¡,;'.:..¡l
explican más adelante en csre capítulo. -
,'

iw,
 Síntesis y procesamiento del RNA eucarionte 553

Cuadro 12.2 TiPos de intrón

:ffirJ
'a:!t;,;::.-
ta,,aa?*..:ar'

lntrsnes CU-AC Pre-mRNA nuclear eucarionte

lntrones AU-AC Pre.mRNA nuclear eucarionte
triLlDO I Pre-rRNA nuclear eucarionte, RNA de orgánulos, pocos RNA bacterianos
Crupo tt RNA de orgánulos, algunos RNA procariontes
Crupo lll RNA de orgánulos
lntrones gemelos RNA de orgánulos
lntrones de pre-tRNA Pre-tRNA nuclear eucarionte
Intrones arqueobacterianos Diversos RNA

Se pueden establecer pocas reglas para la distribución de intrones en

genes que codifican proteínas, aparte del hecho de que los intrones son
menüs comunes en los eucariontes inferiores: los 6.000 genes del genoma
de levadura contienen sólo 239 intrones en total, mientras que muchos
genes individuales de mamíferos contienen 50 intrones o más. Cuando se
compala el mismo gen en especies relacionadas, suele hallalse que algu-
nos cie los intrones se iocalizan en posiciones idénticas, pero que cada
especie tiene uno o más intrones únicos. Esto significa que algunos intro-
nes perrnanecen en el lugar durante miliones de años y conservan sus posi-
ciones mientras las especies se diversifican, en tanto que otros aparecen o
desaparecen durante ese mismo período. Estas observaciones tienen
implicaciones para las teorías respecto de la evolución de los genomas
(sección 18.3.2). Sin embargo, el punto importante es que un pre-mRNA
euc¿irionte puede contener muchos intlones, quizá más de 100, que ocu-
pan Llna longitud considerable dei transcrito (cuadro 12.3) y que es pleci-
so rscindirlos y unir los exones en el ol'den correcto antes de que el
transcrito pueda luncional como un mRNA maduro.

i ¡',r .::,rilr.".r: :-' .t,r!....

,'.,ir: t: r::.:''. ,a..it.,t-.;-': r"..,r"r.i::rr"r ..'.

.,

En la vasta mayoría de los intrones de pre-mRNA. k:s plimeros dos

nucleótidos de ia secuer-rcia clel intrón son 5'-GU-3' y los dos últimos,
5'*AC-3'. Por 1o tanto, se los denomina intrones "GU-AG". y todos los
nriembros de esta clase son cortados y empalmados de la misma mane-
ra. Estos motivos conservados se reconocieron poco clespués del descu-
brimiento de los intrones; se presumió, cie inmecliato, qr:e deben ser'
importantes en el proceso de corte y empaime. A medida c¡ue las secuen-

Cuadro 12.3 lntrones de genes humanos

C,pn Longitud (kb) Número de intrones Cantidad del gen ocupada por intrones (o/o)

insulina t,a 2 69
'i Á 2 bt
B-globina
Albúmina sérica 1Q 13 /9
Colágeno tipo Vll 31 117 1')
factor Vlll 1tr
r86 95
Distrofina 2.400 78 98
 '12
¡64 Capítulo Síntesis y procesamiento del RNA

Figura 12.26 Secuencias conservadas 5, Exén lntrón Exón

en intrones de vertebrados. El texto Pre-mRNA: - ¿ffiffi"¡ ";;. "**;"; *-** *i..--;*@qoffi&@ " *j
menciona las secuenci¿s consenso más
largas que rodean los sitios de corte y
ernpalme. Abreviatura: Py, nucleótido
pirimidínico (U o C). 5'-GU-s', 5'-PyPyPyPyPy-3' 5'-AG-3',
§,::r: i.l* ::lr1* y *ll*;rir:re i fli]"i i.lii !i-,1 tÉ:rI:.i:rii.ji::t:i §iais d* **{t*} y *§pelrfi* ñ,

cias de intrones comenzaron a acuntularse en las bases de datos, se

advirtió que los motivos GU*AG eran sóio partes de secuencias consen-
so más largas, que abarcan los sitios de corte y empalme 5'y 5'. Estas
secuencias varían en diferentes tipos c1e eucariontesi en los vertebrados,
se las puede describir coñlo:

sitio de corte y empalrle 5' 5'-AGJGUAAGU-3'

sitio de c0rte y empahne 3' 5'-PyPyPyPyPyPyNCAC.L-3'

En estas desigr-raciones, "Py" es uno de los dos nucleótidos pirirniclínicos

(U o C), "N" es cualquier nucleótido y la ilecha indica el iímite exón,
intrón. E1 sitio de corte y empalme 5' también se conoce conto sitio
donante, y el sitio de corte y enipalme 3', como sitio aceptor.

S*r:r¡*l¡d*#*s d* lcy ríer d* *clr*r tr srr?p{:¡l¡x*

S* l*"s i*fr*r"prs S{J*é#
Los rnotivos de secuencia conservados indic¿rn legiones importantes d.e t',..,,,1:1.,,,,',::,,,:,::..t.,.

los intrones GU-AG, que podría preverse que actú:,rn como scuucnci¿ts
cle reconocimiento para proteínas de unión al RNA ir¡voiucrad¿ls cn el '';:r,:,,:,;1;;,,,,,,1,,,,,,;,,,,

corte y ernpalme, o que desempeñan algún otro papel crucial en el pro-'.: ::;.:t;;;'.',',,,::,:;..,.
ceso. Los primelos intentos pal'a comprendel'el colte y empalme 5s vie"'''.,l,lt ..:i,r,ilirr:

Ataque del oxhidrilo

3J
Pre-mRNA,*;#ffiffii&dffi '.," *;j;*á*. &;tffidi* -*' ffi;ffi-tu,tu
Figura 12.27 Bosquejo del corte y
empalme. El oxhidrilo (OH) unido al
carbono 2'de un nucleótido de ade- ¡
+
nosina denlro de la secuencia del
intrón promueve 1a degradación del
sitio de corte y empalme 51 Esto da .@;ti r¡a,,4rj.rrtiú:.jiaa,,,l\::.¡:!''. :.:'',
..*w§*ee#{4§&44@
origen a la estructur¿ en lazo (lariat),
y, después, el grupo 3'-OH del exón
corriente arriba induce la degradación
del sitio de corte y empalrne 3'. Esto
permite que ios dos exones se liguen,
en tanto que el intrón Iiberado es
desramificado y degradado.
 Síntesis y procesamiento del RNA eucarionte

rofl obstaculizados pol' problemas técnicos (en parriculáÍ, dificultades (A) Salteo de exones
para clesarrollar un sistema de corte y empalme acelular que permitier.a
invcstigar el proceso en detalle), pero durante la dócada de 1990. hubo 123
*.fu;....*4,4t4
una explosión de infr:rmación. Este trabajo mostró que ia vía de corte y a_

empalme se puede dividir en dos pasos (ligura 12.21):

I
¡
' l.a escisión del sitio de corte y empalme 5' se produce por una reac- +
ción de transesterificación promovida por los glupos áxhidrilo uni- ry¡#,l3;@4
13
dos al carbono 2'de un nucleótido de adenosina loóalizado dentro de
la secuencia del intrón. En la levadura, esta adenosina es la última de
la secuencia conservada 5'*UACUAAC-3'" El resultado der ataque {B) Selección del sitio críptico
dc1 oxhidrilo es la degradación de un enlace fosfociiéster en el sitio de de corte y empalme
corte y empalme 5', acompañada por la formación de un nuevo enla- -
12
&.-,"e
ce fosfi:diéster 5'-2', que une el primer nucleótid«: del intrón (ia G 6*ry4Cr&C# .. - *. . áÉá r{¡.g&l
del motivo 5'*GU*3') con la adenosina interna. Esto significa que el : .¡t.
.\
intrón ahora ha fbrmadr: un bucle hacia atrás sobre si mismo para
¡ Sitio críptico
i crear una estructura en lazo (lariat). I
v de corte
Y emPalme
* La escisión del sitio de corte y empalme 5', y la unión de los exones
1
Pañe
de2
obedece a una segunda reacción de transesterificación, pr.omovida i i-*
.@éü4e¡e d'{ffi q

por el grupo 3'-oH unido al extremo del exón corriente alriba. Este
grupo ataca el enlace fbsfodiéster en el sitio de corte y empalme 3',
lir degrada y libera así al intrón como la estructura en lazá loriat),
Figura 12.28 Dos formas aberrantes
qr-re después vuelve a convertirse en RNA lineal y se cleglada. Al
de corte y empalme. (A) En el salteo
mismo tiernpo, el extl'emo i'del exón corriente ardba se uná al extre- de exones, se produce corte y empal-
nro 5' recién formado del exón corriente abajo, lo que completa el me aberrante que determina la párdi-
proceso de corte y ernpalme. da de un exón del mRNA. (B)
Cuando se selecciona un sitio críotico
de corte y empalme, se podría pbrder
En un sentido químico, el corte y empah:re de intlones no representa un parte de un exón del mRNA, como se
g'an desafío para la célula. Es sólo una dr¡ble reacción de tlansesierjficación, ilustra aquí, o, si el sitio criptico reside
no más cornplicada que muchas otras reacciones bioquín.ricas manejadas dentro de un intrón, entonces el
por enzimas individuales. Pero se ha desan'ol1ado una maquinada cornpleja mRNA conservará parte de ese intrón.
pafa ocuparse de ella. La dificultad reside en los probiemas topológicos. Él
priilero es la distancia sustancial que podría haber entre los sitios áe corte
y empalme, quizás unas pocas clecenas de kilobases, lo que represcnta 100
nm o más si el mRNA se encuentra en forma de cadena lineal.-por lo tanto.
se necesita un medio para aproximar los sitios de cr¡r1e y empalme. El segun-
do problema concierre a la selección del sitio de corte y empalme correcto.

§itio de unión a U1-A

Figura 12.29 Estructura de la

UI-snRNP. La Ul-snRNP de mamÍfe-
ros comprende el U l-snRNA de I 55
nucleótidos más diez proteínas. Tres de
estas proteínas (U 1-70K, U 1-A y
U1-C) son específicas para esta snRNP,
§itio de unión a Ul-70K S§ míentras que las otras siete son protei-
-*
ghh-: §1",¡
n¿s Sm halladas en todas las snRNP
flMtrttr¡¡tt "-****v \e
h"esÉ ^ry'\*reÉ rá'ii
involucradas en el corle y empalme.
Como se ilusüa, la U l- snRNP forma
una estructura apareada por sus bases.
Las proteínas U I -7OK y U 1-A se unen
Sitio de unión a Sm a dos de los principales tallo-bucles de
esta estructura apareada por sus bases
y Ul-C se une a través de una interac,
ción proteína-proteína. Las proteinas
Sm se unen al sitio Sm.
356 Capítulo 12 Síniesis y procesamiento del RNA

U2,A.FS
Figura 12.30 Funciones de las
snRNP y proteínas asociadas duran-
Cornplejo
te el corte y empalme. Hay varios de comprornieo
interrogantes sin respuesta acerca de I
la serie de eventos que se producen Uz-snRNP
durante el corte y empalme, y es f-
improbable que el esquema aquí I
mostrado sea totalmente exacto. El &**r*w
---E- Complejo
punto clave es que se considera que preempalrnosoma
las asociaciones entre las snRNP acer-
can mucho las tres partes críticas del Atracción entre U1-§nRNP
y U2-snRNP
intrón: los dos sitios de corte y empal-
me y el punto de ramificación.

- U4lU6-snRNP
U5-§nRNP

Empalmosoma

Todos los sitios de corte y empalme son similares, de manera que si un pre-
mRNA contiene dos o más intrones, existe la posibilidad de que se puedan
unir sitios de corte y empalme incorrectos, Io que determina el salteo de exo
nes, es decir, la pérdida de un exón del mRNA maduro (figura t2.Z8A).
Igual de desafortunada sería la selección de un sitio críptico de ccrte y
empalme, un sitio dentro de un intrón o un exón que presenta similitud de
secuencia con los motivos consenso de los sitios reales de corte y empalme
(figura 12.288). La mayoría de los pre-mRNA tienen sitios crípticos, que
deben set ignorados por el aparato de corte y empalme.

§{.J§ pt#fsíf?#"§ #$#al#d#s s#f?

Los componentes centrales del aparato de corte y empalme páya lo$

intrones GU-AG son los snRNA denominados U1, LJZ, tJ4, U5 y U6,
Éstos son moléculas cortas (de 106 nucleótidos IU6] a iSS nucleétidoe,
[U2] en los vertebrados) que se asocian con proteínas para formar ribor
nucleoproteínas nucleares pequeñas (snRNP) (figura 12.29)" Las.
snRNP, junto con otras proteínas accesorias, se unen al transcrito y fori
man una serie de complejos, ei último de los cuales es el empalmosoma,:
la estructura en cuyo interior se producen las reacciones de corte f
empalme reales. El proceso opera de la siguiente manera (figura lZSAy;
* El complejo de compromiso inicia una actividad de corte y empalme::
Este complejo comprende Ul-snRNP, que se une al sitio de eorte f;.
empalme 5', en parte por apareamiento de bases RNA-RNA, y la§j
factores proteicos SF1, U2AF35 y U2AF65, que establecen contactos{
proteína-RNA con el sitio de rarnificación, el haz de polipirimidina¡{
y el sitio de corte y empaime 3', respectivamente. ,i¿

t-

* El empalmosoma se forma cuando se unen U4lU6-snRNP (una sola.

 SÍntesis y procesamiento del RNA eucarionte

Potenc¡ador de corte Figura 12.31 Modelo alternativo para

SF1 U2AFs Y emPalme exónico el ensamblaje del complejo de com-
promiso. En este modelo, cada comple-
jo de compromiso (uno ilustrado en
naranja, y el otro en rojo) se construye a
través de un exón, Io que determina un¿
estrecha asociación del complejo con un
Proteína SR Proteína §Fl
potenciador o un silenciador de coñe y
\ empalme exónico, y sus protcin¿s SR
co RTE Y EMPALM E"/ unidas. Una vez construidos los comple.
jos sobre exones adyacentes, el corte y
empalme sigue la vía ilusüada en la figu-
§nRNP que contiene dos snRNA) y U5-snRNP al complejo preempalmo- ra 12.30, con la única diferencia de que
scñla. Esto determina otras interacciones que acercan el sitio de corte y el empalmosoma resultante está forma-
empalme 5'al sitio 5'y el punto de ramificación. Ahora, las tres posicio- do por componentes de complejos de
nes claves del intrón están próximas y las dos transesterificaciones se compromiso adyacentes, en lugar de
producen como una reacción ligada, posiblemente catalizada por U6- derivar del único complejo de compro.
snRl'lP, lo que completa el proceso de corte y empalme. miso mostrado en la figura 12.30.

La serie de eventos mostrados en la figura 12.3O na aportan ningún indi-

cio sobre cómo se seleceionan los sitios de corte y empalme correctos, para
' no perder exones durante este proceso e ignorar los sitios crípticos. Aún se
, cofioce poco este aspecto del corte y empalme, pero se ha esclarecido que
una serie de factores de corte y empalme, denominados proteínas SR, son
' importantes en la selección del sitio. Las proteínas SR -llamadaq así por-
,, que sus dominios C terminales contienen una región rica en seri$a (abre-
viatura, S) y arginina (abreviatura, R)- fueron impiicadas por pritnera vez
en el corte y empalme cuando se descubrió que eran compone[rtes del
' empalmosoma. Parecen cumplir varias funciones, como el establecimiento
: de una conexión entre las proteínas Ul-snRNP unida y la U2AF unida del
complejo de compromiso. Quizás, esta sea la clave de su función en la
selección del sitio de corte y empalme, ya que la formación de1 complejo de
!. compromiso es la etapa crítica del proceso de corte y empalme, pues este
evento es el que identifica qué sitios serán ligados.

Las proteínas SR también interactúan con potenciadores de corte y

empalme exónico (ESE), que son secuencias ricas en purinas localiza-
das en las regiones exónicas de un transcrito. Todavía nos encontramos
en una etapa temprana de nuestro conocimiento de los ESE y sus homó-
Iogos, los sileneiadores de corte y empalme exónico (ESS), pero su
importancia en el control del corte y empalme es evidente desde que se
descubrió que varias enfermedades humanas, entre ellas un tipo de dis-
:.

':,.

trofia muscular, son causadas por mutaciones de las secuencias ESE. La

:
ai
locaiización de los ESE y los ESS indica que el ensamblaje del empalmo-
¡
soma está impulsado no sólo por contactos dentro del intrón, sino tam-
bién por interacciones con exones adyacentes. De hecho, es posible que
un complejo de compromiso individual no se ensamble dentro de un
I
intrón como muestra la figura 12.30, sino que primero forrne un puen-
te sobre un exón (figura 12.31). Este modelo es interesante porque pos-
1 tula un medio por el cual el contacto entre un ESE o un ESS y una
ta proteína SR podda influir en el corte y empalme, pero además porque
toma en cuenta la gran disparidad entre la longitud de exones e intrones
L en 1os genes de los vertebrados. Por ejernplo, en el genoma humano, los
I exones miden, en promedio, 145 nucleótidos, en comparación con
3.365 nucleótidos de los intrones. Por lo tanto, el ensamblaje inicial de
i un compiejo de compromiso a través de un exón podría ser una tarea
i
menos difícil que el ensamblaje a través de un intrón mucho más largo.

Debemos considerar un último aspecto de las proteínas SR: la posibilidad

de que un subgrupo de estas proteínas SR, denominado CA§P (proteínas
t-
I
 Capítulo 12 Sintesis y procesamiento dei Rl'iA

Fígura 12.32 Cuando se descubrió el (.4) Vía de corle y empalme único

corte y empalme alternativo, se
comprobó que la presunción de que
cada pre-mRNA sigue una sola vía 123 12s 'a

de corte y empalme era incorrecta. i:: :iffii@,,r,, -,q;W.,: .:.

Pre-mRNA

(B) Coñe y ernpalme alternativo dM

12
**gm.&¡*
-
'l)?
ffiq1@dk
ffi-"r*É*ffi*#*
Pre-mHNA *,d
.d
to
+ *ffib

de tipo sR asociadas con crD) o scAF (factores de tipo sR asociados

I :
con crD), establezcan una conexión física entre eI empalmosoma y el .,i.,.
crD del complejo de transcripción de RNA porim*rurr lI, y así, ;rciúer ,,1,. ,

como eslabón entre la elongación y el procesamiento del transirito. Ai igual

l_
que algunas de las proteínas de poliadeniiación (sección 12.2.1;, cs poslble
que estos factores de corte y empalme se desplacen con la polimcrasá mien-
I
i,,
tras ésta sintetiza el transcrito, y sean depositados en las posicioncs apro-
:
piadas, en sitios de corte y empaime de inirones, tan pronto como éstos san . ',, ,.1;.",.:

transcritos. Estudios de microscopia electrónica han mostrado que la trans- IL:'i

crip^ción y el.corte y empalme son procesos simultáneos; el desiubri,ricnto
i
de factores de corte y empalme que tienen afinidacl por Ia RNA polir.n ,',:'',:1¡":,',:,

sa Il aporta una base bioquímica para esta observación "ro-

i,
,,::$r:.,.,:.:,;,,,

§l r*:rl¿: t¡ *:vtü*lii:* *;jf*¡x*irii.,* *s r*¡:;¡-i¡i *fi l??#a#i;5 #*fi:;j;_¡ rtlr§ .::l'. t,

cuando se descubrieron ios intrones, se imaginó que cada gen sienrpre f
daba origen al mismo mRNA: en otras palabrai, q,r. hubiu uni sola vía de ,.., . ..,,

qorte y empalme para cada transcrito primario (figura 12.32A). En l¿r déca- ,r'.§1',,i
da de 1980, se observó que esta presunciór"r era iricorecta y se mostr.ó
QUe , ,r,,,.-,.,
,,
los transcritos primarios de algunos genes pueclen seguir dós o rrrás r,ías'cie
I
corte y empalme alternativo, lo que permite que un solo transcrito sca pro- i l¿r

cesado en mRNA relacionados, pero diferentes, y por ende, dirija la t'

sis de una serie de proteínas (figura 12.i28)-. El corte y ernpalmc=inr.- :.-,
.;.,.,,,,,9t
alten:rativo es infrecuente en algunós organisrnos (se .orlo."n sóll tres j
ejemplos en s«ccharoffiyces ceret,isíae), pero su prevalencia es mucho t Y.
',,

mayor en los eucariontes superiores. Esto se volvió evidente por primera . . . ,l)
vez cuando se examinó el bon'ador de la secuencia cle Drosophila ,ttelatto-.
: i:
$üye! y se advirtió que las moscas de la f'ruta tienen *"noi genes qile el ,;:,;;..i,, t
helminto microscópico caenorhabclitis eleganr iuJ"t"
"urJ*'ij. 1.r., ]:
 Síntesis y procesamiento del RNA eucar¡onte 169

(.q) C*rte y empaime alternativo específico de sexo del pre-mRNA de sx/ Figura 12.33 Regulación del corte y
234 empalme durante la expresión de
pre-mHi\,H de sx/.jffi;:;ffii;;:;ffimffi1;;l;;;ffiffii; genes involucrados en Ia determina-
ción del sexo en Drosophila. (A) La
I cascada comienza con corte y empal-
r\,lacnosr\ Hembras
me alternativo especifico de sero drl
pre-mRNA de sxl. En los machos, el
M
234 24
ffi
mRNA contiene todos los exones, pero
dblliÉ&§&itu*e¡@¡¡i¡¡B ó,@dqÉ¡reú
esto implica que se produce uil; pro-
Ausencia de síntesis de SXL
I teína truncada, porque el exón 3 con-
tiene un codón de terminación. En las
hembras, se saltea el exón 3, lo que
f
t , Síntesis de SXL
da origen a una proteína SXL funcional,
I
de longitud completa. (B) En las hem-
ll
I
br¿s, SXL bloquea el sitio de corte y
:: (B) SXL induce la selección del sitio críptico de corte y empalme en el pre-mRNA de ira empalme 3' del primer intrón del pre-
! mRNA de tro. U2AF6s es incapaz de
.
12 localizar este s¡tio y, en cambio, dirige
Pre-m RNA de ¿ra .,:r,.W;ü,liü;:{iffi;'-
el corte y empalme a un sitio críptico
del exón 2. Esto da por result¿do un
::
:: Machos Hernbras mRNA que codifica una proteína TRA
a
U2AF65 funcional. En los machos, no hay SXL,
I
U2AF65 ]

de manera que el sitio de corte y

It, 1\2
¡ ;:'e¡é.Á
W.t F@
t}¡e{i_Eró empalme 3' no resulta bloqueado y se
produce un mRNA disfuncional. (C) En
I ¡ los machos,'se saltea el exón 4 del
I
+ ¿ pre-mRNA de dsx. El mRNA resultante
Parte de
codifica una proteína DSX específica de
t¿ l¿
@ ,"¡3M@ machos. En las hembras, la TRA estabi-
ffiüBre
liza la unión de proteínas SR a un
Ausencia de síntesis de TRA
t potenciador del corte y empalme exó-
nico localizado dentro del exón 4, de
Síntesis de TFiA manera que no se saltea este exón,
con la consiguiente síntesls de mRNA
que codifica la proteína DSX especÍfica
de las hembras. Las dos versiones de
(C) THA induce corte y empalme alternativo del pre-mRNA de dsx
I DSX son los determirrantes primarios
t
I
345 de las fisiologías de macho y hembra.
:
rre-mHI\A Oe OSX *mr*&*¡ed- **,&e&tk*!i -
#,i#e
.- &&¡&e¿ El mRNA de dsx en las hembr¿s termi-
na con ei exón 4, pues el intrón entre
los exones 4 y 5 no tiene sitio de corte
itvtdut
r^^L^^iu5 y empalme 5i lo que signrfica que el
exón 5 no se puede ligar al extremo
del exón 4. En su lugar, se reconoce
;:w.,. un sitio de poliadenilación en el exire-
mo del exón 4. Obsérvese que el dia-
I grama es esquemático y que los
I + intrones no están dibujados a escala.
@^e¡e
34
ProtÉína DSX específica de machos .*W*üfi#!e*¡á*&
I
!
¿
Proteína DSX especÍfica de hembras

la rnayor corlplejidaci físic¿r obvia de Drosopltiliz, clue se clebería rel1ejar en

un proteoma más divet'so. La c'xplicación más pr:oberble de la falta de con-
gruencia entl'e la cantidacl de genes clel genoma cle Drosopkilu y el nítme-
rc de proteínas de su plotcoma es que una canticl¿id sustancial de los genes
dan or:igen a múltiples proteínas a través del corte y empalme altemativo.
Apt'oximadanlente al rnislno tiempo cie estas observaciones, se obtuyiet'on
las prirneras secuencias de cromosomas humanos y se reconoció que cn
lugar de tener los 80.000-100.000 genes, como suger'ía el tamaño delpro-
tectna, los seres humanos só1o tenían alrecleclor cle 35.000 genes. Ahnra se
cree qlle por 1o menos el 35otb c1c los genes del genoma humano suflen
3?0 Capítulo 12 Sintesis y procesamiento del RNA
.- & áq . ;- -" , ;§ii ..-i
Figura 12.34 Cen sl¿: humano. El gen
comprende 35 exones mostrados
como secuencias, ocho de los cu¿les
(en verde) son opcionales y aparecen
en distintas combinaciones, en diferen-
tes mRNA de s/o. Hay 8l :40.320 vías
posibles de corte y empalme y, por lo
tanto, 40.320 mRNA posibles, pero se
considera que la cóclea humana sinteti-
za sólo alrededor de 500 de eilos.
Figura 12-55 Transempatrme. El exón
líder de un solo SL RNA se une por
corte y empalme a diversos RNA diana.
.ü-iEA :--&.É-&-.¿_& -s Éi--§§ -s ,.:É__i&ü,r _*e * &:" r* -, & i @* .
corte y empalme alternativo: se ha desechadc por completo el principio "u¡
gen, una proteína", dogma biológico desde la década de 1940.
En la actualidad, se considera que el corte y empalme alternativo es una
innovación crucial en la vía de expresión del genorna. Dos ejemplos bssta-
rán para ilustrar su impofiancia. El primero concieme a 1a deterrninación
del sexo, un aspecto fundamental de la biología de cada organismo y qu€,
en Drasophila, es determinado psr una cascada de corte y empalrne alter-
nativo. El primer gen de esta cascada es sx/, cuyo transcrito contiene un
exón opcional que, al ser cortado y empalmado al que lo precede, da origen
quna versión inactiva de la proteína SXL. En las hembras, la vía de cofte y
em'palme alternativo es tal que este exón es salteado, de manera que se fabri.,
ca SXL funcional (figura 12.33). SXL promueve la selección de un sitio de
corte y empalme críptico en un segundo transcrito, tra, al alejar a U2AI]65
de su sitio de corte y empalme 3' normal y dirigirlo a un segundo sitio más
corriente abajo. La proteína TRA específica de hembras resultante ltlelve a
participar en el corte y empalme altemativo, esta vez por interacción con
proteínas SR, para formar un complejo multifactorial que se une a un ESE
dentro de un exón de un tercer pre-mRNA, dsx, 1o que promueve la seiec-
ción de un sitio de corte y empalme específico de hembras, secundario, §n
este transcrito. Las versiones macho y hembra de las proteínas DSX son los
determinantes primarios del sexo de Drosophila.
El segundo ejernplo de corte y empalme altemativo ilustra la multiplicidad'
de mRNA sintetizados a partir de los transcritos primarios. El gen humano
s/o codifica una proteína de membrana, que regula el ingreso y la salida de
iones potasio de la célula. El gen tiene 35 exones, ocho de los cuales parti-
cipan en eventos de corte y empalme alternativo (figura 12.34). Las vÍas de
corte y empalme altemativos consisten en diferentes combinaciones de los,
ocho exones opcionales, 1o que da lugar a más de 500 mRNA distintos, cada'
uno de los cuales especifica una proteína de membrana con propiedades'
funcionales ligeramente diferentes. Los genes s/¿¡ humanos son áctivos en el
oído interno y establecen las propiedades auditivas de las células ciliadas de
la membrana basal de la cóclea. Diferentes células ciliadas responden a dis.¡
tintas frecuencias de sonido eqrtre 20 Hz y 20.OOO }{z, y sus capacidades
individuales dependen, en palte, de las propiedades de las proteínas §1o. Por:
1o tanto, el corte y ernpalme altemativo de los genes s/o en las células cilia::
dascoclearesdeterxninaelrangoauditivodeiossereshumanos'
Por ahora, no conocemos cómo se regula el corte y empalme alternati-
vo, y no podemos describir eiproceso que detetmina cuálde varias vías
de col1e y empalme sigue un transcrito dado. Se considera que intervie"¡
nen las proteínas SR junto con los ESE y los ESS, pero no se sabe de qué.r
manera controlan la selección dei sitio de corte y empalme. l
:id§ildj¡€L.1:3w1t.;:.a4.#:jj¡!¡. j.:elrpjt:1r::ti§
§wwtftffiyfg§
, :.1
ffid!!r]lry* --
,.@: , ,-s. ts
{%{*i§*iiffiffiiM.:&t& ^;!-
SL RNA
*{,:"i5:4'
Productos transempalrnados
 Sintesis y procesamiento del RNA eucarionte t7I

§i :ii:lse¡:;pxl,m* l,'¡,':r*l¿: *x#f; *i #r' #,-'a' i,'l:. :: ft ^o

t-, ' -.',-;./,-. ..jo t¡ "t¡'¡¡¡i ti, l¡ ffi
§L FiNA mHNA de dos genes
En lo-s ejerrplos de corte v empalme considelados hasta ahola, los dos
exones que se unen están ubicadr:s clentro de1 mismo transcrito. E,n unos
poLos organismos, también se observ¿r corte ¡r empahne entl-e exones per-
tenccientes a diferentes molécu1as de RNA. Esto se denonlina trans-
enrpalrne y se observa en los cloroplastos de algunos vegetales, en *
algunos genes de C. elegttns y en tripanosomas, los protozoos parásitos
de vertebrados que causan la eniermedad del sueño en los seres huma- no expresado
oi"
nos.

Todos los ejemplos de transempalme estucliados hasta aquí son similares en lrmt
ñ
¡G
cuanto a que determinan la unión del mismo segmento líc1er corto a los extre- SL RNA
nros 5' cle cada mienrbro de un par de mRNA (figura 12.35). E1 transcrito
que dona este segmento líder se denomina RNA lídereortádo y empalmado
I
(SI- RNA). En C. elegar¡s, este SL RNA tiene airededor de 100 nucleótidos *l4n¿/¡it¡l!@ -
ñ;*rt**¿iw^*.
de longitud y contiene una secuencia de 22 nucleótidos unida a los extremos
5' de los mRNA diana. L¿i reacción de corte y en-ipalme tiene lugar de una I
nranera muy similar a l¿r ilustrada en el esquema convencional de la figura Gen B
expresado
12.27, aunque como los patrones de corte y empalme son diferentes, se
foln:a una estructura en horquilla en iugar del lazo {larial), La única c,ompli-
cación es que el SL RNA se puede plegar en una estructura apareada por sus
Figura I2.56 Regulación génica por
bases similar a un snRNA y, de acuerdo con algunos modelos de transempal-
transempalme. En el dibujo superioq
me, el SL RNA reemplaza ala Ul-snRNP en el proceso de corte y empaiile. el exón líder es transempalmado al gen
A. En consecuencia, no se expresa el
En C. elegarzs, el transenpalme p1'esenta otro aspecto interesante. Algunos gen B, porque el ribosoma no puede
de los mRNA que participan en el transempalme contienen dos genes que atravesar el hiato entre el extremo del
se transcriben juntos, de cabeza a cola. a partir de un solo promotor. Si gen A y el comienzo del gen B. En el
algrrno de los mRNA de estos dos genes de C. elegarts no es transempalma- dibujo inferior, se obserua transempal-
me al gen B, que ahora se expres¿.
do. entonces sólcl se puede traducil el gen corriente arriba, porque, como
se verá en el capítulo 13, el ribosoma que traduce un mRNA eucarionte se
une a1 extremo 5' de la moiécula y se suele disociar del transcrito cuando
éste alcanza un codón c1e tenninación. Por lo tanto, con un mRNA no col!
tado ni ernpalmado, el gen corriente abajo es inaccesible para el aparato de
traducción. Así, en estos mRNA, el tlansempalme es el proceso que activa
la traducción de1 gen corriente abajo al crear un nuevo extremo 5'al que
se puede unir un ribosoma (figula 12.36).

L*s ír¡¿r*nt:s ,4íJ-&{ s*n :;ix:ílxr*i s l#5 i*twn*s tU-&ü, y:t:t'*

r*q*i*r-*x t;tz *pr;r*t* d* **ri* t/ *{nf}*!§11c di'lrr*;lf*
Uno de los eventos más sorprenclentes de los últimos años ha sido el des-
cubrimientr: de unos pocos intrones de los pre-mRNA eucariontes que
no pertenecen ¿i la categr:úa GU*AG, y tienen diferentes secuencias con-
senso en sus sitios de corte y empalme. Éstos son los intrones AU-AC
que, hasta la fecha, se han identificado en alrededor de 20 genes de orga-
nismos tan diversos como seres hurianos, plantasy Drosophila.

Aclemás de los motivos de secuencia de sus sitios de corte y empalme,

los intrones AU-AC tienen una secuencia conservada (aunque no inva-
riable) en el sitio de ramificación, con ei consenso 5'-UCCUUAAC-3',
y la últinra aclenosina de este motivo es la que participa en la primera
reacción de transesterificación. Esto señala una característica notable de
los intrones AU-AC: su vía de corte y enipalme es muy similar a la de
los intrones GU-AG, pero involucra un grupo diferente de factores de
corte y empalme. Sólo U5-snRNP participa en los mecanismos de corte
y empalme de ambos tipos de intrón. En 1os intrones AU-AC, los pape-
les cle Ul-snRNP y U2-snRNP son desempeñados por U1l/Ul2-snRNP,
712 Capíiulo I2 Sintesis y procesamiento del R\lA

RNA polimerasa I ReblplTTF-l un complejo descubierto con antedoridacl al qr"re nunc¿l se le había asig*
I nado unil función, y se ha aislado, después, una U.latac/U6atac-snRNP
,,**Á** nueva pa1'a compietar el cuadro.

Figura 12.37 Posible esquema para
la terminación de la transcripción
por RN.A polimerasa l.
Las vías de corte y ernpalnre para los tipos "mayor" y "menor" cle inrrlr
no son idénticas. pero muchas de las interacciones entre el transcl'ilo r
las snllNP, y otras proteínas de corte y empalme, son notablementc -uimi-
lares. Esto significa que los intrones AU*AC, en lugar de ser só1,,: r"rna
curiosidad, están resultando útiles para investigar modelos de i:rterac-
ciones que se producen durante el corte y empalme de los intlones
GU*AG. El argurnento es que se puede verificar un¿r interacción previs-
ta entle dos componeÍ]tes del empalmosoma GU-AG observando si es
posible la misma interacción entre los co¡nponentes AU-AC equivalen-
tes. Est«r ya ha aportado información para ayudar a definir una estructu-
ra apareada pol' sus bases formada ent¡e los snRNA U2 y U6 en el
empalmosoma GU-AC.

J:.7"5 5¡ml,es¡s de HftüA t¡..:ne lnn*les en ;c,s eue üits,:les

t ltr! e F ' I i '

Por Io general, sabemos menos acerca de la elongación y la terminación de

los transcritos por las RNA polimerasas I y III, que sobre los procesos equi-
valentes llevados a cabo por la R1\lA polimerasa II. La interacción de la
polimerasa con el molde y el transcrito durante la elongación parece ser
similar con las tres enzimas, lo que r:efleja la r:elacién estructural de las tles
subunidades más grandes de cada RNA polimerasa. Una diferencia es la
velocidad de transcripción: por ejemplo, la RNA polimerasa I es mucho
más lenta que ia RNA polirnerasa II, pues maneja una velocidad de polime-
lización de só1o 20 nucleótidos por minuto, en compamción con hasta
2.000 pol minuto, para la síntesis de nRI'JA. Una segr:ncla diferencia es
que ni los transcritos de RNA polimerasa I ni los transcritos de Rh'i,,\ poli-
merasa lll están encapuchados. Se han aislado diversas proteinas que
podr'ían actuar como factores de elongación para la RNA polimeras;i I r: III,
incluidas SGS I 1z SRS2 de levadura. que codifican dos DNA helicasa.s rela-
cionaclas. I-as mutaciones de los genes de SGSl y SRS2 reducen la trans-
cripción por RNA polimerasa l, así como la replicación del DNA. SGSI es
interesante, porque es horlóloga de un par de proteínas hutnanas qlle son
defectuosas en ios trastornoÉ de crecimiento conocidos como síndromes de
Bloom y de trVerter (sección 5.2.1), pero se desconoce la participación
exacta de SGS 1 y SRS2, y otl'os plesuntos f'actores de elongaciÓn, en la
transcripción por Ias Rl{A polirnerasas I y III.

Las principales diferencias entre las tres RNA polimerasas se obscl'van

al cornparar los procesos cle terminación. El sistema cle pr:liadenilación
para la tenninación por RNA polimerasa II (sección 12.2.1) e.s pr:ivati-
vo de esa enzima y no se describió ningún equivalente para Ias otras do§
llNA polimerasas. l,a terminación de la tlansct'ipción por RNA polime-
lasa I involucra a Llna proteína de unión al DNA-denolninada Reb1p,
cn Succ:harony-ces t:eret,isíae y TTF- l. en ratones- que se une al Dl"lA en
Lrna secuencia de reconocimientr: localizada de 12 a 2A pb colriente
abajo del ptlnto en el que termina la transcripción (ligura 12.37). No se
sabc con exactitud cómo la pt'oteína unida induce ia terminaciÓn, pero
se ha propuesto Lrn niodelo en e1 que la polimerasa se atasca debido al
cfecto bloqueante de Reblp/TTF-'l. Se considera que una segr-rncla pro-
teína, PTRF (f¿rctol de libelación de politrcrasa I y transcritc¡) intlucc lir
clisociac,ión de la poliniel'asa y el transcrito del DNA moldc. Se sabe aLrn
menos sobre la ter:minación por RNA polimet'asa III: se ha irnplic:rcloa
una se rie de aclcnosinas del molde , pero el proceso no involucr¿i ttna hor-
qLrilla )'. pol ende, no es aná1ogo a la terminación en las i:actel'ias'
 Síntesis y procesamiento del RNA eu€arionte

Figura I?.58 Vía de corte y empal-

me del intrón de rRNA de
Tetrohymena.

I
tI
lM -,,ffi

A
: ;#';;t1*r;üw&&§&ffiiñ;rwi§
..,,;ir:w'
"'it,, rRNA cortado y empalmado
It
Forma un círculo,
se degrada

13.?.€ {*r*e y #ffis§}e}rc* s§* pr§-§34trd&

y p ":-tRt;,4 eucEr¡oirtes
En k:s eucariontes, hay cuatro rRNA. Uno de ellos, el rRNA 55, es trans-
crito por la RNA polimerasa III y no es sometido a procesarlliento. Los
tres restantes (los IRNA 5,8S, 18S y 2BS) son transcritos por la RNA
polirnerasa I a partir de una sola unidad y generan un pre-rRNA qtte, al
iguai que los pre-rRlt{A bacterianos, es procesado por corte y recorte ter-
mi¡ral. Se requieren varias nucleasas, incluida la ribonucleasa MRF mul-
tihrncional que, además de procesar el rRNA 5,8S, interviene en l¿t
replicación del DNA mitocondrial y el control del ciclo celular. Hay
genes de IRNA aislados y en unidades de transcripción multigénicas, y
el plocesamiento es mu¡, similar atr obsevvado en las bacterias (véase
figura 12.11). La principal distinción entle el procesan-riento de RNA
funcional en las bacterias y los eucariontes es que los transcritos prima-
rio,s de aigunos IRNA y IRNA eucariontes conticnen intrones. Ninguno
de estos tipos de intr'ón es similar a los intrones GU*AU ni AU-AC de1
pre-mRNA, y, por lo tanto, es necesario algún tiempo para estudiarlos.

l*r :*l¡¡;**i *!r,, l,;:; pt*:-;'{l.i'.iÁ {:i:r.t:ri*¡:i*ti

t;;.¡i*t,.:l-i;íl-.-'.,;:
.tit'.ii}
Los intrones son bastante infrecuentes en los pre-rRNA eucariontes. pero se
conocen unos pocos en eucadontes microbianos como Tetralrymert¿¿. Estos
intrones son miembros de la familia del grtpo I (véase cuadro 12.2) y tam-
)
bién se los encuentra el-l genolxas de uritocondrias y cloroplastos, donde apa-
reren en pre-mRNA y pre-rRNA. Se conocen algunos ejemplos aislados en
bacterias, por ejemplo en un gen de IRNA de la cianobacteria Atzabaenü y en
elgen de timidilato sintasa del bacterjófago T4 de E. coli.
:

La vía de corte y empalme de los intrones del grupo I es similal a la de

los intrones del pre-mRNA, pues se producen dos transestelificaciones.
[.a primera es inducida, no por un nuc]eótido dentro de1 intrón, sino por
un nucleósido o un nucleótido libre, alguno de guanosina o guanosina
mono, di o triibsfato (figura 12.38). El 3'*OH de este cofactor ataca el
enlace fr:sfodióster del sitio de corte 1' empalme 5', y lo degrada, con
transferencia de la G al e,riren.ro 5' del intrón. La segunda transesterifi-
cación involucra el 3'-OH dei extlemo del exón, que ataca e1 enlace fos-
fodiéster del sitio de corte y empalme 3', 1o que causa su degradación,
la unión de los dos exones v la liberación del intr'ón. El intrón liberado
 ,1* Capitulo 12 Sintesis y procesamiento del RNA

Cu¿dro 12.4 Ejemplos de ribozimas

Bescripcién

lntrones autocatalíticos Algunos intrones de los grupos l, ll y lll se cortan y empalman a sí mismos mediante un procesc
autocatalítico. Asimismo, hay cada vez más evidencia de que la vía de corte y empalme de los
intrones CU-AC comprende por lo menos algunos pasos que son catalizados por snRNA

Ribonucleasa P La enzima que crea los extremos 5' de los IRNA bacterianos (véase sección l2.l .3) está formada
por una subunid¿d de RNA y una subunidad proteica; la actividad catalítica reside en el RNA

RNA ribosómico La actividad de peptidiltransferasa requerida para la formación de enlaces peptídicos durante la sín-
tesis proteica (sección 13.2.3) se asocia con elrRNA 23S de la subunidad grande delribosoma

1B¡1¡Phe Presenta degradación autocatalizada en presencia de iones de plomo divalentes

Cenomas virales La replicación de los genomas RNA de algunos virus implica degradación autocatalizada de cadenas
de genomas recién sinletizadas unidas de cabeza a cola. Los ejemplos conesponden a plantas,
viroides y virusoides (sección 9.1 .2), y al virus delta de hepatitis animal. Estos virus forman un grupo
diverso con actividad de autodegradación especificada por distrntas estructuras apareadas por bases
diferentes, incluida una bien estudiada que se asemeja a una c¿beza de martillo (véase figura 9.9)

¡ cu,.ru6¿s¿-u-ffi cu uu ü
^
.. Figura 12.39 Estructura apareada pcr ÁrGGGACuc+
'-
'sus
bases del intrón del rRNA de fx"u "u',.SGAoA-
& trft

Tetrahyrneno. Se muestra la secuen- *.*

t"- t]
cia del intrón en letras mayúscuias, con a-il
los exones en minúscula. Otras interac- U-AAIJ
1t\
ciones pliegan el intrón en una estruc- &"**¿
q-u
tura tridimensional que acerca los das !.-u
sitios de corte y empalme.
t,'A
{}-ü
\."1,
üt-u.
A'
^tJ,, rl]
**
¡-, -u
i,J
A&
A"1L
Lr- q * "{)
rt'''r r rtr tJ
:"!lAC *,!l
!
tr :- .i' *.
-C C'G ü-§
*..¡
r"., i *§-c"; c-c
^u llc
!A LJ- A
,q ll
{J ^§u
A.
¿A
'¿.-r.J A"L'
.A',i
A" u
c.G I A
&"
*né'
§L¡G UC, U'A §-*
*-ü É,-1J
1L-*
1.,'&
l5
l4
n_r
z:-h lJ-Á
ñF
r r, üC t.J i SC ."t4A- .,AA-
c-*-§-A.A'&"U*e*ü"üAÁüA*S.*u*¿,qg**-,¿-**:. §jfle¿CA{iÁ* il
s', !:lltltr tt lt1 ittltlt e -:,1

-.üUCri{Uü.-!A.
"A¿;g¡¿¡¡Au ' r'i: s
".,.y'_ki¡^-i*.t:{l., u
^,r.6tj,_{,L,C,1r.
CUÁ:¡{i«i* 11

U ,li i, : r¡
¡¡L;t-.r,tUCa U A * G A U Áuacnlc-&iri.CS C G C -A tijt.{i:dcUAal{I:*§qr
{

t§..{ Liü &-u I

c"* &-t-, *-* l _l
ü r GC ).s
CC ÜG AU
c.# {i-t
Lr 1"3 {:-ü
A"1".}

u¿P ,i 6- r.i-.qt
U&Y".,? '?
--.* §itic§ 4É **tr"*y *rnpalme q ¡:,Y S t!.N
AU
l:uu ua
r-.rt
ij-A ajl,*s
ü-C {
r;'
ñ ¡4

*t*
 Síntesis y procesamiento del RNA eucarionte 575

iiiliii:liliililt,:fl. es lineai, en lugar del lazo (Larictt) observacio en los intrones de pre-
..:'r.rrr,r.'
mRNA, pero puede sufrir transesterificaciones adicionales, lo que crea
r

Ln característica notabie de la vía de co1'te y empalme de los intrones del

gir¡l...r I es que tiene lugar en ausencia de proteínas y, pol' 1o tanto, es auto-
lo,rilírj.o, el propio RNA tiene actividad enzimática. Éste fue el primer
cicrlplo de una enzima RNA, o ribozima, en seldescubierto a comienzos
cle l.r década dr-' 1980. Al principio, esto causó bastante agitación, per:o
ahora se adüerte que, si bien son infrecuentes, hay varios ejemplos de ribo-
zii-nas (cuadro 12.4). La actividad de autocorte y empalme de los intrones
del gr-Lrpo I reside en la estmctura apareada por sus bases que adopta el
Ri\iA. Esta estructura fue descrita por primera vez en tétminos bidimensio-
nales comparando las secuencias de dif'erentes intrones del gn"ipo I y elabo-
ranclo una disposición de pares de bases común, que podía ser adoptada
por todas las versiones. Esto dio oligen a un modelo que consiste en nueve
regiones principales de bases apareadas (figura 12.39). Más recientemen-
te, sc ha resueito 1a estr.ictura tridimensional por cristaloglafía de r"ayos X.
L¿r ribozima está formada por una parte centr¿il catalítica compuesta pol
dc¡s clominios, que comprenden, cada uno, dos de ias regiones de bases apa-
readas, y las interacciones entre las otras dos partes de la estructura secun-
drria aproximan los sitios de corte y empalme. Si bien esta estructura de
RNA es suficiente para el corte y ernpalme, es posible que. en algunos
intrones, factores proteicos no catalíticos que se unen ¿i la ribozima aumen-
1en su estabilidad. Esto se ha sospechadr: desde hace mucho tiempo en los
intrones del grupo I de genes de orgánuk:s, muchos de los cuales contienen
un n-)arco de lectura abierto que codi{ica una proteína, denouiinada matu-
rñsa, que parece participar en el corte y etnpalme.

''.'.. . ,.' r,'j

Los intrones del RNA de transferencia son relativamente comunes en
tros eucariontes infeliores, pero menos frecuentes en 1os veltebrados:
sólo el 6otb de los genes de IRNA humano contienen intrones. Los
intrones de pre-tRNA eucariontes tienen i4-60 nucleótidos de longi-
tr-rd y se suelen hallar en ia misma posición dei tlanscrito, dentro del
bucle del anticodón, un nucieótido corriente abajo del anticodón pro-
p'iamente dicho. La secuencia de los intrones varía, pero comprende
una región corta complementari¿r clel anticodón y, quizás, uno o dos
nucleótidos adyacentes. E1 apareamiento cle bases entre 1as secuencias
complenrentarias forma un tal1o corto entre dos bucles del pre-tRNA
no cortado ni empalmado (figura 12.4A).

A dif'erencia de otros tipos de intrones de eucariontes, el corte y empal-

lne de los intrones de pre-tRNA no implica transestei:ificaciones. En
cambio, los dos sitios de corte y empalme son cortados pol: una endonu-
cleasa. Esta enzima contiene cuatro subunidades no idénticas, una de las
cuales emplea la estructura del intrón apareada por: sus bases como guía
para identifical' las posiciones correctas en las que se debe cortal el
IINA. Después, dos de 1as otras subunidades de la enzima practican los
cortes corliente arriba y corriente abajo. La escisión deja ur-ra estructu-
ra de fosfato cíclico unida al extremo 3' del exón cor"riente arriba y un
gi'upo oxhiclrilo en el extremo 5'del exón coniente abajo (figura 12.40).
Ei fosfato cíclico es cc¡nvertido en un 3'*OH por tlna fosfodiesterasa y
e1 extremo 5'-Ol{ es conveltido en 5'*P por una cinasa. Estos clos extre-
mos se mantienen cerca por ei aparean:iento de bases natural adoptado
por la secuencia de IR.NA y son ligados por una RNA ligasa. Una sola
proteína aporta las actividades de fbsfodiesterasa, cinasa y ligasa.
 Capítulo 12 Sintesis y procesamiento del RNA

lll¡*s ***s #* i*i,*x

ciiferentes de intrones (véase cuaclro t2;2),Encsrr. capí-
Ill "1!,tipos
tulo,yasedescribierOnCuatIodeeilos:losintronesdelosprc.mRÑA
nucleares de las clases GU-AG y AU-AC, los intrones del grupo I que
se autocortan y empalman, y los intrones de genes de pre-inÑ,q , rl=_
riontes. Para completar el tema, se presentan a continuación los il¡,.rlli"
de las otras cuatro categorías:

Figura 12.4O Corte y empalme del 3'

pre-tRNArYr de Saccharomyces @
s&
cerev§tae. s',,6
{s-s
&.&
§"&
+.S §"#
y
-e.é. e,
e's
¡#gq

&e-e-e-*.
ry
¡$*&

Ribonucteasa
I ':
iJi ¡!tt-1il:ntr- :l:
* t-+l Secuencia :,

de intrones . .-,,.,,

r'*
{b¿&
;a
*a La ribonucleasál'
corta la posición:'
w*s
,.*
§str
*-S'44 -&.á
et-r,*d
w*
&_ e-sq
w
§
ó
v
qf
& j
"e
&
I
ll
il-"::\
J
O*O
.P,
./8*
\ Y '\
I

I -'
i

lui ^ -"-
l

c' to ü§qP: cH, -oH

I Fosfodiesterasa,
cinasa, ligasa 5'

Extremo 2',3'-P ó i:xtremo 5 -uñ

&
s',4§
t;
Y'Y
?'Y
Y'Y
*,&
&tui *s¿ , ó.
{
q- "iTT
*r-e-<f l-*-¡p!t 6- r-++-o- r
§*

\:i.tt.a r'*J a L-'

p.{
tt
ea
itt",
]l-{
 5íntesis y procesamiento del RNA eucarionte ,r7

Los intrones del grUpo II se hallan en los genomas de orgánulos de (A) Metilación por U24-snoFlNA de levadura
hongos y plantas, tanto en los pre-mRNA como en los pre-rRNA y se
conocen unos pocos en los prccariontes. Adoptan una estructura Nucleótido modificado
secundaria característica, y pueden autocortar§e y empalmarse en el
,/ ,.:.:: .l r-

tubo de ensayo, pero son distintos de los intrones del grupo I. La tr,
-t
estructura secundaria es diferente, y el mecanismo de corte y empal- "%.A{}¡: -a! rA o@d

rne está más estrechamente relacionadc con el de los intrones de pre- UEUA UUnU@6*
mRNA: la transesterificación inicial es promovida por el grupo U
*ñ6ñl§A
oxhidrilo de un nucleótido de adencsina interto y el intrón se con- -\ ao¡r ranni¡ rr
vierte en una estructura en lazo {lariat). Estas similitudes han lleva-
J
do a sugerir que los inirones del grupo II y de pre-mRNA pueden
tener un origen evolutivo común (véase sección 18.3.2). Algunos
intrones del grupo II son elementos móviles que se transponen
mediante un proceso notable denominado retroinsercién de intrones (Bi Sínlesis de U 16-snoRNA humano
{retrohoming), durante el cual ei intrón escindido, que por supuesto Gen de la proteína ribosómica L1
es una molécula de RNA monocatenario, se inserta directamente en
el genoma del orgánulo antes de ser copiado en la versión DNA. lntrón 3
rir\rA .--&-ú-aie-.
M,.r.<..'.aff

Los intrones del grupo III también se encuentran en genomas de

r_l

orgánulos, y se autocortan y empalman mediante un mecanisrno muy Secuencia de Ul 6-snoBNA

similar al de los intrones dei grupo II, pero son más pequeños y tie-
§en su propia estructura secundaria distintiva. La similitud con los tI Transcripción
intrones del grupo II vuelve a sugerir una relación evolutiva.
RNA ;":. .;-*";* .* . ^:. .-
Los intrones gemelos son estructutas compuestas formadas por dos
t^
o más intrones del gmpo II o del grupo IIL Los inrones gemelos más I Corte y empalme
simples consisten en un intrón sepultado en otro, pero los más com-
plejos contienen múltiples intrones sepultados. Por lo general, cada
intrón de un intrén gemelo es cortado y empalmado en una secuen-
,4,
cia definida.
Los intrones arqueobacterianos están presentes en los genes de
IRNA y rRNA. Son escindidos por una ribonucleasa similar a la que
participa en el corte y empalme del pre-tRNA eucarionte.

?3"3"S §S*s$i{itxri** qr*ármxxx dx {*s ffifl,i& tr¿;'{#r;*&t*s

Los IRNA y los rRNA eucariontes sufi:en los mismos tipos de modifica-
ción química que las moléculas bacterianas (sección 12.1.3). En los Figura i2.41 Metilación de rRNA por
tRl\'IA, 1as enzimas que ilevan a cabo las modificaciones qr-rímicas pare- un snoRNA. (A) Este ejemplo muestra
la metil¿ción del C en posición 1.436
cen ser dirigicias a los nucleótidos cüt'r'ectos por la estructula apareada
del rRNA 25S de Socchoromyces cerevi-
por sus bases de la mo1écula de IRNA, de manera similar a la que las sroe (equivalente al rRNA 28S de los
endonucleasas que cortan y empalman los intrr:nes de IRNA utilizan veftebrados), dirigida por U24-snoRNA.
como guía ia estructura apareada por sus bases. La situación es bastan- Se destaca la secuencia D del snoRNA.
te cliferente en los IRNA eucariontes. La modificación siempre tiene lugar en
el par de bases alejado cinco posiciones
respecto de la secuencia D. Obsémese
Í"-rl:t l;i'\i§ t:t.;::i¡:r;l*;', -,". 1'-; Jt,i:
.' i. .'¡r {!;í:}i} qJiü::; t:*¡"t: l¡': que la interacción entre rRNA y snoRNA
rv: : ; § i {i r *$* * q u i *t i i¡ ¡¡, r: t¡,:,-'* r i * n t ¡,: :
r:* #*: l':s r íl
implica un par de bases poco frecuente
como C-U, que es permisible entre poli-
lilo es fácil imaginar', sólo por intuición, cómo se puecle garantizar la espe- nucleótidos RNA. (B) Muchos snoRNA
cilicidad de la modificación del rRlrlA. Por ejemplo, el pre-rRNA humano son sintetizados de RNA de intrones,
strfi:e 106 metilaciones y 95 seudouridinilaciones, cada alteración en una como se ilustra aquÍ para el U 16-
posición especificada, sin slnilitudes cle secuencia evidentes que puedan snoRNA humano, que es especificado
sel inferidas con-lo motivos diana para las enzimas modiiicadoras. Para por una secuencia del intrón 3 del gen
entpez¿it; no es sorprendente que el progreso en el conocimiento de la de proteína ribosómica Ll.
nlodificación del IRNA haya sido lento. E1 avance se produjo cuando se
mt'istró que, en los eucadontes, 1os RNA cortos denomin¿rdos snoRNA par-
ticipan en el proceso de modificación. Estas ir:roléculas tienen cle 70 a 100
nu,,:1.'óticlos de lon_eitud y están localizadas en el nucléolo, la regiór-r clentro
del núcler-r donde tiene h-rgar el plocesamiento del rRNA. El descubrimien-
 I
''?@
.t;t: -
:,::.:.::::.

'r
178 Capítulo l2 Siniesis y procesarniento Cel Ri\lA i. .iliri.'.ii.ri

-.:aaaL:.,' .

I l:.:ll:11..:1.
. '

;il;x;§ñc
Edición
5',
Figura 12.42 Edición del mRNA de
la apolipoproteína B humana. La
conversión de una C en una U crea
un codón de terminación, lo que da
por resultado que las células intestina-
les sinteticen una forma acortada de
apolipoproteína
3'. to inicial fue que los snoRNA. por apareanriento de bases c,on la región pe1.-
tinente. señalan las posiciones en las que se debe metilai: el pre-r:RNA. El
t P§)¡ipéptfdo apareamiento de bases invr:lucra só1o unos pocos nucleótidos, no tocla la .illi
dÉ 4.§§§ longitud del snoRl\A, pero estos nucleótidos siempre están ubicados innre-
arñrfi§áütü*§
d* rrálulas diatamente corriente arriba de una secllenL:ia conservada denominad¿
Itsptii*as secuencia D (figura 12.,11A). El par de bases que involr-rcra al nucleótid;¡
que será modificaclo esrá a cinco posiciones de la secuencia D. La hipóte-
sis es que la secuencia D es la seña1 de r.econoq-,imiento para la enzim¡i d*
t [:,::l*i¡lld* metilación, que es didgida, pr:r ende, hacia el nucleótido adecuado.
Después de estos pdmeros descubrimientos referidos a la metilación, se
de'mostró que una familia dil'erente cle snoRl'JA desempeña elmismo papel
de p¡uía en la conversión de uridinas a seudouridinas. Estos snoRNA no tie-
nen secuencias D, pero contienen, aun así, motivos conservados que pockí-
an ser leconocidos por: la enzima modificadora. y cada uno puede establecel.
una interacción específlca por apareamiento de bases col1 su sitio di¡rna, lo
cual determina el nucleóticlo que se¡á modificado.
La irnplicación es que ha;, un snoRNA diferente pala cada posición
modific¿rda de un pre-rRNA, excepto quizá pol unos pocos sitios que
B. están suficienten'rente cerc¿l para sel manejados por un solo snoRNA.
Esto significa que debe haber unos pocos cientos de snoRNA por célu-
la. Alguna vez, esto pareció improbable. porque se podían localizar niu.v
pocos genes de snoRliA, pero ahora parece que sólo una fracción de los
snoRNA se transcribe de estos genes convencionales y que 1a mayoría es
especificada por secuencias dentro de los intrones de otros genes y libe-
lada cortando el intrón después del corte y empalme (figura 12.4113).
*f -,, .-,--¡
.;,1. f

Como los rRNA y los IRNA no son codificantes, las moclific¿iciones qi-ríu-ri-
cas de sus nucleótidcls afectan sólo las características estructulaies y, quizá,
las actividades catalíticas de las molécula-s. Con los mRNA, la situación es
muy difelente: la modificación química tiene la posibilidad de cambi¿lr las
propieciades de coclificación del transcrito. 1o que deten¡ina trna alter'¿lción
ec¡uivalente de las secuencias de aminoácidos de la proteína especiticada.
Esto se denomina edición del RNA. Un ejemplo notable de edición del
RNA con'esponde al mRNA humano para apolipoproteína B. El gen de
esta proteína codifica un polipéptido de 4.563 aminoácidos, denominadcr

Cuadro 12.5 Ejemplos de edición del RNA en los mamíferos

::.::::..:. ::.........at: t: :.1.:.:

ri:..rrlr,. lrii:,i::i,

T§iido,-r'r .'' .'' .,":, ' Kt\A drana ',',,.;Ca:llf:rbiú;,,,,,,,:;,,,',.,;.,,',.,,;'.,,,:,:;

''''i
,

lntestino mRNA de apolipoproteína B C+U Convierte un codón de glutamina

en un codón de terminación
Músculo mRNA de a-galactosidasa U;A Convierte un codón de fenilalanin¿
en un codón de tirosina
Testkulo, tumores mRNA de tumor de Wlms-l U-rC Convierte un codón de leucina en
un codón de prolina
Tumores mRNA de neurofi bromatosis C--+U Convierte un codón de arginina en
tinru 1
un codón de termin¿ción
Linfocitos B mRNA de inmuno§obulinas Diversos Contribuye a generar diversidad de
anticuerpos
Células infectadas por el HIV Transcrito de HIV-l C-+A, C-+U Participa en la regulación del ciclo
de infección por el HIV-1
tnceTalo mRNA del receptor de ácido A-+inosina Múltiples posiciones que llevan a
glutámico cambios de diversos codones
w
5íntesis y procesamiento del RNA eucarionte 3?9

áirülipoproteína 8100, que es sintetizado en los hepatr:citos y secletado al 5*

*'eesiAin{"f-A * 3' Pre-RNA
ton'ente circulatorio, donde transporta iípidos a todo el organismo. Las IC *o@*
tlilli
célr-rles intestinalcs fabrican una proteína relacionada, la apolipoproteína A:GG,-'C'.--^"*
- 5'
{ HNA guía
8"18. Esta proteína tiene sólo 2.15J aminoácidos de lor-rgitud y es sintetiza- J
dr a partir de una versión editada del mRNA de la proteína de longitud
can:p1eta (figura 12.42). En las célul¿rs intestinales, este nRNA es moclifi-
II lnserción der.-
I
cado por desaminación de una citosfura, que es convertida en ul'acilo. Esto
c¡urbia un coclón CAA, que especitica glutamina, por un codón IJAA, que s', s',

c¡tsa detención de la tr¿lducción, io que da origen a una pl'oteína tr::nca- :, 1i,.ai

JGG-CG--=
da. La desaminación depende de una enzima de unión al RNA que, junto 3'*r.'s; 5'
con un grupo de proteínas auxíliares, se une a una secuencia inmediata-
ñeilte corriente abajo de la posición de modificación dentro del mRNA.
Figura I2.43 Función de un RNA
Si bien no es frecuerlte, se observa edición del RNA en una se::ie de orga- guía en la panedición.
nismos difelentes, que comprende una variedad de cambios de ciistintos
nucieótidos (cuadt'o 12.5). Algunos eventos de edición ejercen una reper-
cusión sigr-rilicativa sobre el organismo: en los seres humanos, la edición clel
Rl{;\ es responsable, en parte, de generar'la diversidad de anticuerpos (sr-c-
ciórr 11.2.1). y también se Ia inplicado en elcontrol del ciclo de infección
pcr el HIV-I. Un tipo de edición del RNA de particular interés es ia de-
samin¿rción de la adenosina a inosina, que es llevada a cabr¡ por enzimas
liarnad¿rs adenosina desaminasas que actíran sobre el RNA (ADAR).
r\lgunos de los mRNA diana de estas enzimas son editados de manela
selcctiva en uÍ]a cantidacl limitada de posiciones. En apariencia, estas posi-
ciones son especificadas por segmentos bicatenatios del pre-mRNA, foma-
dcs por apareamiento de bases entre el sitio de modificación y secuencias
cl* intrones adyacentes. Por ejemplo, se observa este tipo de edición duran-
te el procesamientr¡ de los mRNA de receptoles de ácido glutámico de
rnamíteros. Hay evidencia de que la edición por ADAR está estrechalllen-
tc relacionada con la síntesis de I{NA, pues algunos nucleótidos dentro de
intrones son editados (1o qr-re indica que la edición se produce antes de1
coi:tc y empalme de intrones) y la eficiencia de la edición dismintiye si se
iniloducen cambios artificiales en el CTD de la RNA polirner:asa il.

La edición selectiva contl'asta con el seg:ndo tipo de modificación efec-

tr-mda por 1as ADAR, en el que las moléculas diana suft'en clesaminación
e-xtensa. con conversión de más del 5jo/o de las adenosinas del RNA en
inosinas. Hasta ahora, esta hiperedición se observó sobre todo, allnque no
Ellmina*i*n
exclusivamente, en RNA virales y se cor-isidera que es aieatolia; estos RNA de la c*ix
arloptair estlucturas apareaclas por sus bases que, por azar, aotúan como d* i:üil{Ai
sr-lstr¿1tos de las ADAII. De toclos mi¡dos, esto puede tener importancia {¡---¡---
fi-oiulógica en la etiología de enf'elrnedades causadas pol virus editados. El
descubrimiento cle que los RNA virales asociados con infecciones saram-
Desencaouchamiento I
pii:r'ro-sas per-sistentes (a la invelsa cle la versión transitoria más l-rabitual de r'l
¡V
la enl'ermedad) están hipereditados plantea esta posibiiidad. I
I
I
ir
' liJ,a&Aá&ff#ñ"iaedee;e*,ü!&q@*¡(&Á
Los ejemplos anterioles dc edición del RNA son eventos relativanrente sim-
ples que. con excepción de la hipereclición, inducen cambios nucleotídicos
I
en una sola posición o una canticlad linlitada de posiciones de determina- I
v
dos l¡lRl.iA. También sc conocen tipos más corlpleji:s de edición del RNA:
s La panedición implica la inserciórI extensa de nucleótidos en RNA llige*ii*n p*r *x*n*cleasa
á*t,44,*
abl'eviados para producir rnolóculas funciouales. Es mul' fi'ecuente
en las mitoconclrias de los tripanosomas. Muchos c1e los RNA a1lí
transc¡itos son especificados por criptogenes, secllencias qne care-
cen de algunos de Ios nucleóticlos presentes en los RNA madulr"rs. Figura I2.44 Vía de desencapucha-
Los pre-RNA tlanscritos clc estos criptogencs son pl:occsados por rniento dependiente de desadenila-
inselciones múltiple,s cle nucleótidos U en posiciones definidas por ción para Ia degradacién de un
RNA guías, corto;s. Estns sol"r RN,¿\ cortos que se pueden ap¿lrear por mRNA-
,80 Capítulo l2 Sintesis y procesamiento del RllA

sus bases al pre-RNA y que contienen A en las posiciones don$e se

deben insertar U (figura 12.43).
En algunos RNA virales, se produce edieién por inserción menos
extensa. Por ejernplo, el gen de paramixovirus P da origen a no
menos de dos proteínas distintas, debido a la inserción de G en posi-
ciones específicas del rnRNA. Estas inserciones no están especifica-
das por RNA guías, sino que son agregadas por la RNA polimerasa
a medida que se sintetiza el mRNA.
§e obsewa edicién por poliadenilación en numerosos rnRNA mitocon-
driales de animales. Cinco de los mRNA kanssritos del genoma mitocon-
drial humano finalizan con sólo una U o UA, y no con uno de ios codones
de terminación (UAA y UAG del código genético mitocondrial humano).
La poliadenilación convierte la U o UA terrninal en UAAAA..., y así crea
un codón de temrinación. Ésta es só1o una de las varias características que
parecen haberse desarrollado para hacer que los genomas mitocondriales
de los vertebrados sean 1o más pequeños posible.

:l?.?,6 l"*er¡'erXacióc"r d* !cs RllA euc*ri*r¡tes

Los mRNA eucariontes tienen una vida más prolongada que sus homó-
logos bacterianos, con semividas de 10-20 minutos, en promedio, para
el mRNA de levadura, y de varias horas, para el mRNA de rnamíferos.
Dentro de cada célula, las variaciones son casi igual de llamativasr algu-
nos mRNA de levadura tiene semividas de sólo un minuto, mientras
que, para otros, Ia cifra se acerca más a 1os 35 minutos. Estas obsela-
ciones plantean dos interrogantes: ¿Cuáles son los procesos de degrada-
ción del mRNA? Y, ¿cómo se controlan estos procesos?

. ¡ .r,'- ., .'"'r':';' Lt'. Ll', '"':";i ,':?4. c":,:.:11:-.,1:: ('-:J :...1 ;.-. ,'; "."'.' l,t;1
En los eucariontes, la mayor parte de los avances en el conocimientr: de la
degadación delmRNA se han logrado con las levaciuras. Se han identifica-
do por 1o menos cuatro vías. Una de ellas involucra un compiejo ntultipro-
teico denomin¿rdo exosorna, que deg'ada tlanscritos en dirección 3'-»5'y
contiene nucieasas relacionadas con las enzimas del degladosoma bacteria-
no. Es probable que también haya e.rosomas en células de mamíf'eros )', ¿iurt-
que su importancia es evidente, no han sido par:ticularmente bien

(A) La vig¡lancia del mRNA puede localizar codones de terminación incorrect¡s

Codón de terminación
incorrecto Codón de terminación correcto

sll.

iB) lnfluencia de un límite exón-intrón

Codón de lerrninacién corresto

I
5'*lw*wmw*,*ul, w''
:
\
Límite exón-inirón
Jde¡rtif icado 6smü incorrseto
Figura '12.45 Vigilancia de mRNA. Í,§r €¡ sisl*má de vi¡¡ila:rcia
 Síntesis y procesamiento del RNA eucarionte 38t

esrlldiados. su función pu!-d. no ser Ia degraclación del mRNA per se, sino
la cie controlar la poliadenilación y garantizar que los transcritos que cstán
por.abandonar e1 núcleo tengan una cola ae poii(A) adecuada.

se sabe bastante más acerca de los otros dos procesos de degradación del
mRhlA eucarionte. El primero de ellos es el desencapuchamienío dependien-
te de desadenilación (figura 12.44), que es desencádenado por eliminación
de la cola de poli(A), tal vez por degraiución mediad, po. o tal
vez pS_r n9r-a1aa di la proteína de unión al poliadenilato, que"ri,rlcleasas
estabiliza la cola
(sección 12.2.1). La eliminación de la cola de poli(A) es seguida de Ia esci_
sión de la caperuza 5'por la enzima de desencápuchamientá Dcp1p. El de-
sencapuchamiento impide la traducción del mnNe (sección 12.2.2) y, por
ende, termina su üda funcional. Después, el mRNA es sometido a aigástion
rápida por exonucleasas desde su extremo 5'. Es probable que la capácidad
de la Dcplp de acceder a la estrucfura de la cup"t-,:ra, que depencl. á sr r",
de la asociación entre ésta y las proteÍnas que se unen u átu puü iniciar la tra-
ducción, determine si un mRNA dado eJdegradado o no (sección 13.2.2).
Las secuencias denominadas elernentos de inJstabilidad, ubicaáos dentro del
transcrito, también influyen en Ia degradación, por lo menos en algunos
mRl{A de levadura. se ha demostrado-la importancia de estas secuencias en
experimertos que eiiminan artificialmente un elemento, lo que aumenta la
traducción y disminuye la degradación del mRNA.

El segundo sistema de degradación de *RNA eucariontes bien esturliado

se de¡romina degradación del RNA mediada por mutaciones tErminado-
tas.(NMD) o ügilancia del *RNA.-El primeio de estos nombres aporta
un indicio de su función, porque en la tárminología de biología molecular
una §ecuencia terminadora ("sin sentido") es u., ódón de teñninación. La
ryMD provoca la degradación específica de mRNA que tienen un codón
de terminación en una posición incorrecta, ya sea poiqrr. el gen ha sufri-
do una mutación o como resuitado del coite y iniorrecto. se
"*pri**
considera que el codón incorrecto es detectado por,.rr, ,.sistema
de vigilan-
cia" integrado por u1 cgm.plejo de proteína. qr" estudia el mRNA"y, de
3ls*l], llan?la, puedg distinguir enire el codón de terminación corrácto,
localizado al final de la región de codificación del transcrito, y rrrro ubica-
{o ::^.u"? posición errónea (figura 12.45A). Este modelo ptrr,íeu una serie
de dificultades conceptuales, porque no es fácil imaginar cómo podría
dis-
criminar el complejo de vigilancia entre codones de-terrninación correctos
e incorrectos. I-as hipótesis actuales se basan en la demostración
de que el
codón de terminación coruecto es reconociclo como aberrante si el trans-
crito-se manipula genéticamente cre modo que el límite exón-intrón 3'f?qqqeffi,rT-ryTryyfT.rq 5' RNA virfl I
esté S, r,;*L&"{d.¿J*J*Uri-l{.1-X¿ 3' úa tená I ¡o
localizado cordente abajo de este codón de terminacion i).
iiigura 12.45F.).
Por lo tanto, Ias enzimas de vigilancia pueden utilizar los"límites
exón- I
intrón como posiciones de orientación para distinguir.l coáár, de termi- ¿
nación correcto, que suele estar corrjenté abajo deliritimo intrón. Thmbién
se.han propuesto esquemas alternativos, ü. que se da impártancia, no
a la posición del codón de terminación,"r,sino al carácter pieciso de
ffi§ffiwmffiffiK
los
eventos involucrados en la teminación de la traducción, ei
un codón de
tetminación prematuro, respecto de uno que se encuentra en su posición
correcta- cualquiera que sea el mecanismo, la icientificación
I
de un coclón
de terminación iniorrecto induce escisión de la caperura y aegraclacion
por exonucieasas t':t',, sin eliminacióir previa de lá cola
¿e poíl(a), por s'ffis,.l,ilfd,&
proteínas diferentes de las involucradas en el desencapuchamünto
aepen-
diente de la desadenilación. Si bien la NMD está desánaá, ]""¿r*ental- &
mente, a degradar *RNA que han sido alterados por mutación o han
sido
coriados y empalmados de manera incorrecta, hay evidencia
de que esta vía
es responsable de Ia degradación de mRñA normares, pero es pro-
¡1¡,!ien
bable que no de un modo que controle la expresión de
algún gen individual. Figura 12.45 lnterferencia por RNA.
38¡ Capítulo l2 SÍntesis y procesarniento del Rl'lA

Figura I 2.47. La interferencia por RNA Promotor endógeno

Promotor del transgén Gen inserlado
explica por qué los transgenes sonr a -orientac¡ón inversa
veces, inactivos. Para mayor claridad, se
muestra la transcripción del mRNA y el
RNA antisentido de diferentes copias del
transgén insertado. También podrían pro- \ Transcripción ¿/
venrr de un solo transgén que es trans- '.:.;l;;,.;l;.,;,;;,,^'''.;,,l..*,,,:,".l..l@w..]..:.:.l..:..::,:::
crito de su proplo promotor y de un mHNA ""'" antisentido
promotor endógeno. \ t{ /- mRNA
:?TT='ri--"-a'i-i-

RNA bicatenario
I
¿ .
RNA
,,,,

Desencadena la interferencia por

ffisr§É?flwp,lil
]}}§rys§e.!
-,w#
ffif

fi siJ*¡:r:*¡r,.jrfrtr* #*,¡ §;'t'{ s* j*{i,rfifi*L} ñ*r f,'in:*íí? :r.,*r t . ' .;.:

tfi*iJii.\ ¿:i* d*sl¡*i sl ñ¡J.¿ 1.,.¡:'*/ l¡:lxs*r
I

,.,,..... 1..

Las céiulas eucaf iontes emplean los sistemas descritos antes para degra-
darmRNAendógenos,DesdehacevariosañoSSesabequeIoseucarion.
tes también cuentan con otros mecanismos de degradación del RN,-\ quc
protegen a sus células del ataque de RNA extraños, como k:s gt:itümas
devirus'Estepr,oceSo,denominadoa1principiosilenciamienrodeI
RNA,yanoSesfamiliarpOrSunombrealternativodeinterferenciapor
RN.{(oribointerferencia),pueSeSe1mecanismodebaseque1ranutili-
zado los investigadores de genomas como medio de desactivar determi- : .'...
nadoSgeneSpaIaeStudiarSufunÜión(secciÓn5.2.2).

:::::,:1L:.§;:,:,::,::;;;;:;,..:,,. :
I

E,lRNAdianade1silenciamientodebeSerbiCatenario,1oqucexclu1,ca'
los mRNA celuiares pero abarca a los genomas vilales, muchos de los - .',.,'',
cuales son RNA bicatenarios en estado natural o se replican a tr'¿r\'e's dc ,,
ilNA intermecliario bicatenario (sección g.1.2). El RNA bicateirario es.11§l;1.:1..,',,,,,1
RNA rerropresados "i:THili" reconocidoporproteínasdeuniónqueformanunsitioder"rniónpara
+r' d\ *{; 'L,*1 q-: f} una ribonu.l*orá llamacla Dícer, que corta la molécula en RNA interfe, ',,:..lffi,'.'..,.€l,l
LJ' $"J LJ
,", q¡rte porffi ií renteSpequeños(siRNA)de21.28nucleótidosde1ongitutlrligura
& fi+= fl-: Drosha
.4., tr:? X, íi
jq*1T*,$ \_ --* r& 3.$" ;t I
¿ $ {

vilus ya han siclo transcritos? En este cáso, lós efectos nocivos-ilel ütus ' .
Núcleo ya
Jcl haürán comenzado y
rrdulÉ1rt LlJtlltr.tl¿clLll. el ¡1rtrtl\,rdlllttrlItU
y [i1 silenciamiento Lt§I del RNA
¡\1\^ parecería
Lr¡al(;Ltrr r{r l"lrhet
---. - - fta;,tii'lai',-lllltl:1..') ]ir:r,.,,:¡1,,,:rjt:i,..t ..,,.tirir,l:.,d

casaclo en su intento de proteger a la célula del daño" Uno de los descu¡',,,.';'llt.L,.',,,,,,|,:;,,...a,,, .-

brimientos más notabl"i d" lór últimos años ha revelacio una segund:li;6...,"l,.,i
Citoplasma etapa del proceso de interferencia, dirigida específican-lente a los mRFlA,,,,'§§.,,,,rt¡,'...,.',,ü
viráles. Lbs siRNA producidos por degtacláción clel §renün'l¿i viral ;* ,,:.,&i'."'*,,,;.:,
separan en cadenas inclividuale., y A.rpües, una cadena cie cacia si.[l'+ = . .. .,ff
I Corte por Dícer SeapaIeaporsusbasesacualquiermRNAvira1presenteenl¿rcÚ[ula
I
t Las iegicnes bicatenarias fbrmácias son sitios cliana par:a el t'rrsarnbli'rjc.
del complejo de silenciamiento inducido por RNA (RI§C), que inclrty*.r'
una ploieína de unión al RNA cle la familia Argonauta y un:l nucle¿sx',
lltt
?qv* (que puede set', o no, la Argonauta propiamente djcha), quc clegrad;15".
Los miRNA silencian así, silencia al mRNA.
los mRNA endógenos
El trabajo que llevó a la ciesclipción inicial del proceso mclecular clc.ba
de Ia interf'elencia por RNA sCrealizó a finaiesde la década de 1990.*c¡¡r
C. elegans. Descle entonces, se ha observado interferenci¿l por RNA t:x
toclos los eucariontes, con algunas excepciones, como S. rcret'isiaq, 5 §.
interferencia se ha vinculado a cliversos Lventos que involi:cran la derye
Figura I?.48 Vía de interferencia clación clel RNA, pero que antes se consideraba qu" ,'lo estab¿rn.rela¿'"ie
por micro-RNA. nados. Por eiempio, el movimiento de algunos tipos clc e
 Síntesis y procesamiento del RNA eucarionte

BNA diana
rransponible implica un RN¡\ intermediario bicatenario, que puede ser
degradado por un.proceso que ahora se sabe que corresponde a interfe-
§e unen múltiples miRNA
rencia por: RNA. Esta es una manera en que los eucariontes impiden la a la región 3' no traducida
proliiclación al por mayor de transposones dentro de sus genomas. Los
,:":c"i¿ilistas en ingeniería genética también habían sido clesconcertados
por la capacidad de algunos crganismos, sobre todo vegetales, para silen-
ciar nuevos genes que habían sido insertados en sus genomas pol' técni- La degradación elimina
cas cle clonación. En la actualidad, sabemos que este tipo de silenciamientr: la cola de poli(,{.¡
puede tenet' lugar si ei transgén es insertado, por azar, coniente arriba de
un trr'omotor que dirige la síntesis de una copia "antisentido" de RIrIA de
todo e1 gen o paile de é1; después, este RNA se aparea por sus bases con ¡ \
elmRNA de sentido producido a partir del promotor delpropio transgén ¿Fafta de ¿Degradación por vía
iniciación de de desencapuchamienlo
para formar un RNA bicatenario que desencadena la vía de interfelencia
la traducción? depend¡ente de
por RTrJA (figura 12.47). Ahora se sabe que otos I'enómenos en diversos desadenilación?
organismos, denominados de distintas maneras como extinción, cosupre-
sión y silenciamiento génico postranscripción, son diferentes modos de
interferencia por RNA. Figura I2.49 Los sitios diana del
micro-RNA suelen encontrarse en
L*f ;::,:f"*-,ei,,¡ ¡*¡; .' :'' ;: . tj*i {t*Jl;:Í#
{iri}t"{{lr #*,J¡r:- la región 3'no traducida del
mRNA diana.
ii.:' - n'-'i :' - : - ..t * "" .- r

En l::uchos organismos, se ha identificado más de un tipo de proteína

Dícer. Por ejemplo, Drosophila melanogaster tiene dos enzimas Dícer
relacionaclas y Arabidopsis thalianá, cuatro. La multiplicidad de pro-
teínas Dícer con propiedades ligeramente diferentes alerta sobre la
posibilidad de que pueda haber otros procesos de degradación relacio-
nados con la forma de interferencia por RNA comentada antes pero,
quizá. cliferentes. Se descubrió que, en Drosophilc" el segundo tipo de
Dícer trabaja, no con los RNA bicatenarios produciclos a través de ia
vía ilustrada en la figura 12.46, sino con micro-RNA (miRNA), que
son codificados por el genoma de la mosca de la fruta y sintetizados
pol la RNA polimerasa I[. Al principio, ios micro-RNA son sinretiza-
dos como moléculas precursoras denominadas RNA retroplegados,
nombre que indica que estos RNA pueden formal pares de bases intra-
catenarios que originan una o más estructuras en horquilla internas
(figrrra 12.48). Dentro del núcleo, estos RNA retroplegados son corta-
dr:s por la enzima Drosha en horquiilas individuales, que son ttanspor-
taclas hacia el citopiasma. Después, el componente de RNA bicatenado
del tallo estimula la vía de interferencia por RNA y la segunda de las dos
enzimas Dícer de Drosophila degrada la molécula en miRNA, de alre-
dedor de 21 nucleótidos de longitud. Cada miRNA es complementario
de parte de un mRNA celular y, por ende, se aparea con su diana pol
sus bases, lo que estimula el ensamblaje de un complejo de microrri-
bonucleoproteínas (miRNP), que es funcionalmente idéntico al RiSC
y contiene muchas de las mismas proteínas. Éste induce Ia ciegradación
del mRNA. A menudo, el sitio de hibridación del miRNA está presen-
te en la región 3' no traducida del mRNA cliana, a veces en múltiples
copias (figura 12.49). Por 1o tanto, la degradación por: miRNP no alte-
ra 1a región de codificación del mRNA, pero causará el desprendimien-
to de la cola de poli(A). Esto podría interferir en el proceso de
iniciación de la traducción, que involucra la cola de poli(A) (sección
13.2.2), o podría tener por diana al mRNA para la degradación a tra-
vés de la vía de desencapuchamiento dependienre de desadenilación.
Cualquiera que sea el mecanismo preciso, la degradación por miRNP
determina el silenciamiento del mRNA.

El primer sistema de silenciamiento por miRNA en ser caracterizado fue e1

relacionado con ios genes de C. elegans denominados lin-4 y let-7, que codi-
 Capítulo 12 Sintesis y procesamiento del
rHNA
tRNA
mRNA
snRNA
§noRNA
Complejo del poro
Figura I2.5O Los RNA eucariontes
deben ser transportados a través de
Ios complejos del poro nuclear. En
los eucariontes, l:s rRNA, Ios IRNA y
los mRNA son transportados del
núcleo al citoplasma, donde estas
moléculas cumplen sus funciones
celulares. Por lo menos algunos de
los snRNA y los snoRNA también son
transportados al citoplasma, donde
son recubiertos por proteínas antes
de regresar al núcleo para participar
en el procesamiento del RNA. El poro
nuclear no es sólo un orificio en la
membrana nuclear. Contiene un
ensamblaje proteico que consiste en
un anillo incluido en el poro, con
estructuras que irradian tanto al
núcleo corno al citoplasma. Este dia-
grama n0 muestra el complejo del
canal central, una proteína de l2 kDa
que se considera que reside en el
canal que conecta el citoplasma con
el núcleo" Se piensa que la superftcie
del núcleo de una célula animal pr+
senta alrededor de 3.000 poros.
Ri"lA
fican, ambos, RNA retroplegados, que generan miRNA tras la degradación
por DÍcer. una mutación en cualquiera de estos dos genes proyoca defectos
en la üa de desarrollo del helminto, lo que indica que este tipo de degrada-
ción del RNA no es só1o un medio de eiiminar mRNA no deseados o poten-
cialmente nocivos, sino que, en cambio, desempeña un papel fundamental
en ia regulación de la expresión del genoma. Otros estudios de miRNA de
C. elegans, que revelaron que estas moléculas parlicipan en eventos biológi-
ccs tan diversos como la muerte celular, la especificación de tipos neurota-
les y el control del depósito de grasas, avalan aún más este concepto. El
análisis de genomas muestra que la mayoría de los animales pueden sinteti-
zar por 1o menos de 100 a 2AO miRNA diferentes y, quizá, muchos n:ás.
Aunque hasta ahora se han idenrificado muy pocas de las dianas de estos
miRNA, es evidente que el sistema de miRNA está resultando un aspecto de
1a regulación del genoma de amplio alcance y sumamente importante. En el
pasado se consideraba, en gran medida, que la expresión del genoma era
regulada por proteínas; el descubrimiento de que moléculas de RNA podrí-
an tener igual importancia en este aspecto ha determinado un cambio
sustancial en nuestra percepción de cómo se ejerce el control sobre la
composición del proteoma de una célu1a.
??-§"7 ?rmmmpex'** s** &ffiS& *mrxtr* x§* *a c*§§a¡lm e§{er§&x?*e
En una célula de mamífero típica, alrededor del l4a/o del RNA total está pre-
sente en el núcleo. Cerca del SOak de esta fracción nuclear es RNA que está
siendo procesado antes de pasar al citoplasma. El otro 2oo/o es snRNA y
snoRNA, que tienen una participación activa en los eventos de procesamien-
to, y por'lo menos algunas de estas moléculas ya han estado en el citoplas-
ma, donde fueron revestidas con moléculas de proteínas antes de ser
transpofiadas de nuevo al núcleo. En otras palabras, los RNA eucariontes
se mueven continuamente del núcleo al citoplasmay, quizás, a la inversa.
La única manera de que ios RNA abandonen el núcleo o ingresen en él es a
través de alguno de los numerosos complejos de poros nucleares que cubren
la membrana nuclear (figura 12.50). Ahora se piensa que estos compiejr:s de
poros, considerados al principio poco más que un orjficio en la membrana,
son estructums sofisticadas que desempeñan un papel activo en el moümien-
to de moléculas hacia el interior y el exterior del núcleo. Las moiéculas
pequeñas se pueden moyer sin impedimeritos a través de un complejo de
polo, pero los RNA y la mayoría de las proteínas son demasiado gt:andes para
atravesarlos por difusión sin ayuda, y por ende, deben ser transportados a tra-
vás de eilos mediante un proceso dependiente de energía. Como en el caso de
muchos sistemas bioquÍmicos, la energía se obtiene por hidrólisis de uno de
los enlaces fosfato-fosfato de alta energía de un ribonucleótido trifosfato, en
este caso por conversión de GTP en GDP (otros procesos utiiizan
ATP-+ADP). La generación de energía depende de una proteína denomina- (
da Ran y el tra:rsporte requiere proteínas receptoras llamadas carioferinas, o t
exportinas e importinas, según la dirección de su actividad de transporte. I
Hay no menos de 20 carioferinas humanas, cada una responsable del trans- €
porte de una clase diferente de molécuia; mRNA, rRNA, etc. Por ejemplo, se (
ha identificado a Ia exportina-t como la carioferina encargada de expoftar (
IRNA en levaduras y mamíferos. La exportina-t reconoce directamente a los i
I
RNA de transferencia, pero es probable que otros tipos de RNA sean expor-
tados por cariofelinas específicas de proteínas, que reconocen las proteínas C
unidas al RNA, más que al RNA en sí mismo. Esto también parece ser así en I
la importación de snRNA del citoplasma alnúcleo, que utiliza ia importina
B, un componente de una de las vías de proteÍnas de transporte.
La exportación de mRNA es desensadenada por la finalización de la vía de
corte y empalme, posiblemente por acción de la proteína denominada
 Resumen

ri.nlF, r.,r levaduras, y A1y: en los animales. Una vez fuera del núcleo,
l¿rs
,j". ,i.1".uni.nlos que garantizan que los n:RNA sean transportados a los
ii]^,..r apropiaclos de la cé1u1a. N-o se sabe en qué rnedida la ubicación
jlilu..lul.,'cle pt'oteínas se clebe a la traducción c1e un mRl{A en una posi-
l'.- . ..: .c,üca o a[ movir:rientr¡ de la pr:oteína después qr"re ]ra sido sinteti-
1,,¿r. n.,, cs r-ride'nte que por 1o n:enos algtnos mRNA son traducidos en
í"o,,r.* dc.ilnidos, Por ejemplo, los mRNA que codifican proteínas que
,i[.,1 t.. tlansferidas a la mitocondria son traducidos por ribosomas ubi-
],iJo, .,.r la superficie del orgánulo. Se presupone que se fijan "etiquetas de
j1,...¡íirrr".dc l¿r.s pt'oteínas a los rRNA para dirigirlos a sus ubicaciones
lorr.,.,t, cl.,spués que son transportados fuera del núcleo, pero se sabe muy
DoCtr ¿lir'rÜa dc este Prt)Ueso'

r, ,&§§{s§ffi#§3
,., llc,s estr:clios estructurales están comenzando a revelar el carácter preciso
:,,
'r. ,ou ci:ntactos establecidos entre una RNA polimerasa, el DNA molde y
.ll tr¿,nscrito de R|.IA, durante la etapa de elongación de la transcripción.
La RldA polimerasa no sinteLiza su h'anscrito a una velocidad constante.
por el contrario, la síntesis es discontinua, con períodos de elongación
riipicl,r intrernczclados con breves pausas, durante las cuales el sitio acti-
rr; cl; l;i polimerasa sufre un ligero reordenamiento estructulal. Hay dos
riétorios para tenninar los transcriios bacterianos, uno de los cuales
rcquiele la proteína auxiiiar Rho. Las bacterias tienen diversos mecanis-
' ,.:1., mos para regular l¿l terminación, ya sea por lectura a tlavés de señales de
''1"' termiuilción, de manera que se transcriben secuencias con'iente abajo, lo
ii,ii.i,l ii' , quú.s bírsico para la expresión clel genonra )", o detenienclo la transcrip-
,,.,:,,,..1.::..' ción ¿lirtes cle que se transcriba un gen o un operón si no se necesitan ios
,,,,.,,,,,,,",.',.' prodr-lctos génicr:s. Los RNA ribosómicos y de transferencia son sintetiza-
l;,,,,1 . t-los, iniclalmente, como molócr-rlas precursoras, que son procesadas por
,..,'i .., cvelttos c1e colte y recorte para liberar RNA funcioirales. Estos RNA tarn-
li,i ,, ,.'
bién sufi'en rlrodificaciones químicas en divelsas posiciones nucleotídicas.
,.. ' Distintas eirziuas participan en la degradación controlada de los RNA
.i.,.... bactr:ri¿inos. En lr:s eucariontes, los mRNA fabricados por la RNA polime-
,',..',,,,' rasa lI son encapuchados por adición de 7-metilguanosina al extremr: 5'y
, poliadenilados en el extremo 3'por agregado de una serie de nucleótidos
,,;:.:,,,::t:',

:..,.11 de aclenina. Muchos ple-mRNA eucadontes contienen intrones, que son

,i , , , cortados y empahraclos de ios transclitos a través de una vía compleja que
.;;,,'.', ' , involLrcl'¿l a ribonucleoproteínas nucleares pequeñas, que actúan en una
.....,. estl'LrLrtura denominada empalmosonra. Las vías de corte y empalme alter-
;::,: I nativo peimiten que se sintetice más de una proteína de un solo gen, y son
:,' t' imprx'tantes en diversos procesos fisiológicos, colno Ia determinación del
:: ' sexo t:n Drutsophila mefttnogaster. Los pre-rRNA y los pre-tRNA euca-
,:,.:,1:.::,;:'
r'ir:ntes tarnbién pueden contener intrones. Los de los pre-rRNA se auto-
' corran y empalman y, por endc. son ejeraplos de ribczimas. El rRNA
',::,: cuc¿lrionte es nlodificaclo químicalnente pol'un ptoceso en el cual los
' RI"JA nuclcolares pequeños ¿tctúan como guías pari inclicar las posiciones
',,,:.',,.,t,',
': en ias quc se deben ef'ectuar las mocliücaciones. L¿i modificación quíniica
,::.:,' ' del nIRNA es luenos comúu, pero altera la e-qpecificación codificante,
, contü se observa durante la síntesis cle la vet'sión hepática i, la versión
,: il-rtestinal de la apolipoproteína B en los rnamíferos. I-os eucariontes cuen-
tan cr:n diversos rnec¿inisnros rle degladación del RNA, entl-e ellos el pro-
,' ceso llamado silenciarniento del RNA o interferenci:i por RNA, en e1 que
ILl\j;\ intcrl'el'entes pequeños y miclo-IINA degradan y, pol lo tanto, silen-
cian a los Rl'lA virales i¡v¿scrres y los mI{NA tran.scritos a partir de genes
cclulares. cuyos ploductos y¿] r'lü son necesarios.
 ¡ed

h§ffiKffi%§% w
*§
q **qh'"e* § & *' F"% *-'§§ dF\
*3 Y- dre d* ffi
:*rs
ff
qrqh,%*##§ L# ü §§ffi§ §
§§
rfr m* r-atrffi*ffirhffiffi
Mfu*á &d& %*Tfu%*q*#& § §%#
&

?§"1 ?:x*Írip*ri*r ds{ t§}iÁ *n h: sínt*si:

t* rx*rc-
1§.§ §xrtl*ip*ci**"1 d*i rik*s*ma *§* l.*

s;ni¡s; ; Elt rr,:[eirr¡c

I 3.3 Fr*l*r*rxi,*r¡t* r*:tr*lJxi;i*¡:'
Ca l"r; ;'rJ':r -.. i
Dibujar la estructur¿ general de un IRNA y explior cómo permite esta estructura que el IRNA tenga una partici-
I: I].{ ' L .,:r '' J1..',,
l-l .:'jr.: i-lL¡¡,, ,1,¡ 1a .; . ,'
l:) ..''i 1i.."{'1'¡:
;i"l 1....
pacrón unto física como informativa durante la sintesis proteica.

Describir cómo se une un aminoácido a un tRNAn y comentar los procesos que garantizan que se combinen los
pares correctos de aminoácidos y IRNA

Explicar cómo interactúan los codones y los anticodonet y analizar la influencia del ütubeo en esta interacción.

Reseñar las iécnicas que se han aplicado para estudiar la estructura del ribosoma y resumir la información obte
nida de elos estudios.

Detallar el proceso de traducción en bacterias y eucariontes, poniendo el acento en las funoones de los diver-
sos factores de traducción.

Describir la evidencia experimental que ha llevado a la conclusión de que la peptidiltranferasa es un¿ ribozima.

Explicar cómo se regula la traducción y reseñar los eventos infrecuentes, como el cambio de marco de leclura
que puede tener lugar durante la fase de elongación.

Explicar por qué el procesamiento polraducción de las proteínas es un componente importante de la vía de
expresión del genoma, y describir las características clave del plegamiento de las proteÍnas, el procesamiento de
las proteínas por degradación proteolitica y modificación química, y el corte y empalme de las inteinas.

Describir los principales procesos responsables de la degradación proteica en las bacterias y los eucariontes.

El resultado final de la expresión del genr:ma es el proteoma, el conjun-

to de proteínas funcionantes sintetizadas por una célula viva. La identi-
clad y la abundancia relativa de cada proteína de un proteoma representan
un equiiibrio entre la síntesis de nuevas proteínas y 1a degradación de las
existelltes. La modificación quírnica y otros eventos de procesamiento
t¿imbién pueden cambiar las capacidades bioquímicas del proteoma. La
combinación de síntesis, degr:adación y mi¡dificación,/procesamiento le
permite al proteoma satisfacer los requerirrientos cambiantes de la célu-
la y lesponder a los estímuios extemos.

En este capítulo, estudiaremos la síntesis, el procesamiento y la degrada-

ción del pr:oteoma. Para comprender la síntesis proteica, analizaremos pri-
594 Capítulo l3 Síntesls y procesamiento del proiecma
yil§§e,
rlqrdA
*.ta\t.1
tN[JA¿]?
Figura 13.1 Papel adaptador del
IRNA en la traducción. El dibuio
superior muestra la participación fÍsic¿
del IRNA, que forma una unión entre
el polipéptido y el mRNA. El dibuio
inferior muestra el eslabón informati-
vo: eltRNA lleva el aminoácido espe-
cificado por el codón al que se une.
mero ia función de los tRNA en la decodiflcación del código genético ,r,
después, investigaremos los eventos que deteminan la poliinerización de
ar¡inoácidos en polipéptidos, que tiene lugar en el ribosoma. En ocasio-
nes, los eventos ribosómicos se consideran la etapa final de la expresión
del genoma, pero el polipéptido inicialmente sintetizado es inactivo hasta
que ha sido plegado; también puede ser necesario que sufra cortes y modi-
ficación química antes de totrrarse funcionai. Estos eventos de procesa-
miento se estudian en la sección 15.1. Al finaldel capítulo, examinalern;¡
cómo la céluia degrada las proteínas qr.ie ya no requiere.
ci
i.ri B
! *ffinr§irár,.etin;i
q{* 4¿\.}:}."'u !EUer dp1 *§if {A #n i} 5í¡"}tclis
eñ$^-4-re
A;e l/&%"&k¿llWd
*
Los RNA de transferencia desempeñan el papel central en la traducciÓn.
Son las moléculas adaptadoras, cuya existencia fue anticipada por Francis
Crick en 1956, que foman el eslabón entre el rnRNA y el polipéptido que
se está sintetizando. Éste es tanto un eslabón físico,la unión de los IRNA
al mRNA y el polipéptido en crecimiento, conlo un esiabón informativrs,
los IRNA garantizan que el polipéptido sintetizado tenga la secuencia de
aminoácidos que indica, a través del código genético, la secuencia de
nucleótidos del mRNA (figura 13.1). Para saber cómo los IRNA cumplen
esta dobie función, es necesario examinar la aminoacilación, el proceso
por el cual se une el aminoácido correcto a cada IRNA, y el reconocimien-
to codón-anticodón, la interacción entre IRNA y mRNA.
rl
Í -;.. l. I ¡tlliiiiljcrt.llf:Llt/tl.
fijmx**r: s§x xrn§;"lm;*q**§ms x t,*s tffif4&
Las bacterias contienen 30-45 IRNA diferentes, y los eucariontes, has¡a
50 tRNA. Como el código genético designa sólo 20 aminoácidos, esto ''t.,. ' .,,
implica que todos los organismos tienen por 1o menos algunos tRNA de ',,,,,, rr, '
isoaceptación, diferentes IRNA que son específicos para el mismo ami- "1' ,,:
nr:ácido. La terminología utiiizada al describir los tRNA indica la .'spe-
cificidad del aminoácido con un sufijo volado, y se utilizan los núnret'os
1, 2, etc., para distinguir distintos isoaceptadoles; por ejemplo, dos '.''"1""""';"''
tRNA especlficos para glicina se escribirían tRNAclYt y tRNAclr2. ,,a,,,..a.,,,;,,,,,,,,,,,:,'.'
Los IRNA más pequeños miden sólo 74 nucleótidos de longitud y los más
grandes rara vez superan los 90 nucleótidos. Dado que su tamaño es
pequeño y es posible purificar IRNA individuales, fueron de los primelos
ácidos nucleicos en se1' secuenciados por Robert Holley y cols., a1lá por
1965. Las secuencias revelaron una calacterística inesperada: que, además
cle los nucleótidos convencionales del RNA (A. C, G y U), los tRl'J:\ cott-
tienen diversos nucleótidos diferentes, 5-10 en cualquiet IRNA particular,
y se conocen más de 50 modificaciones distintas en total (sección 12.1"3)'
El examen de la pr{mera secuencia de IRNA, g} ip§dAla de Succhututtv'ces
cerevisiae,mostro que la molécula pociía acloptar diyersas estluctur¿ls sL-cun'
darias apareadas po, .r, bases. Deipués c1e secuenciar más IRNA, se volviú
eviclente que todos ellos poclían acloptar Llna estructura palticular. Ésm es la
hoja de trébol (figura 13.2), que tiene las siguientes características:
* El brazo aceptor está forrnado por siete pares de bases entre los exffe-
mos 5' y 3' clá la molécula. El aminoácido ie une al extremo .5' del IRNA'
a la aclenosina c1e la secuencia tetrlinal CCA invariable (sccción 12'l '3)'
 Participación del IRNA en la síntesis de proteínas

Figura 13.2 Estructura en hoja de

trébol de un tRNA. 5e ha dibujado la
estructura en hoja de trébol conven-
cional del tRN& y se han rotr-:lado los
diferentes componentes. Se indican
los nucleótidos invariables (A, C, C,
: I
U, Y, donde Y seudouridina) y los
nucleótidos semiinvariables (abrevia-
turas: R, purina; I
pirimidina). 5e ilus-
tran con puntos más pequeños los
Brazo D nucleótidos opcionales, no presentes
en todos los IRNA. El sistema de
-. @ffi*@@&@ numeración estándar ubica la posición

sm* *#Á&&e I en el extremo 5'y la posición 76

en el extremo 3'; incluye algunos,
aunque no todos los nucleótidos
opcionales. Los nucleótidos invariables
ffi,,,,,,,,
H
F{--3a
y semiinvariables se encuentran en
las posiciones 8, l1 , 14, 15, 18, 19,
Brazo del anticodón § X
tsr-_-t3
Bucle V
21, 24, 32, 33, 37, 48,53, 54, 55,
ffi 56, 57, 58, 50, 61,74,75 y 76. Los
0&
()0 nucleótidos del anticodón están en las
posiciones 34,35 y 36.
#,rr
U
ffi
Anticodón

El brazo D, llamado así por el nucleósido modificado clihidrouridina

ir,,éase figura 12.18), que siempre está presente en esta estructura.

Elbrazo del anticodón contiene el triplete de nucleóticlos denomina-

do anticodón, que se aparea por sus bases con el mRNA durante la .ll

traducción. Bucle TrfC

* El btrcle V contiene 3-5 nucleótidos en los IRNA de clase Io 13-21
I
nucleótidos de los tRNA de clase 2.
* El brazo TYC, clenominado así por'1a secuencia timiclina--ceudotu'icli-
na-citidina, que siempre está presente.
C¿rsi todos los tRl'lA pueden formar la esructura en hoja de trébol;
las principales excepciolres son los tRNA utilizados por las nritocon-
drias de los veltebrados, que son codificados por el genoma mitocon-
dlial y que, a veces, carece de partes de Ia estructura. Un ejemplo es
ei tRNAser nlitocondrial humano, que no tiene un brazo D. Al igual
que la estructur:a secundaria conservada, las identidades de los nucle-
ótidos en algunas posiciones son totalmente invariables (siempre el
mis¡no nucleótido) o seniinvariables (siempre una purina o una piri-
midina), y las posiciones de 1os nr-rcleótidos modificados son casi
sir'rnpIe las mismas.

I\'1r:chas cle las posiciones nucleotídicas invariables son importantes Figura 13.3 Estructura tridimensio-
en la estructura telciaria del IRNA. Estudios por cristaloglafía de nal de un IRNA. Pares de bases adi-
ravos X han m<¡sti'ado que 1os nucleótidos de los bucles D y TYC for- cionales, ilustradas en negro,
man pales de bases que pliegan el tRNA en una estructura compacta, formados sobre todo entre los bucles
en forma de L (figura 13.5). Cada brazo de ia folma L mide alrede- D y TIPC, pliegan la estructura en hoja
clor de 7 nm de largo v 2 nm de diámetlo. con el sitio de unión ai ami- de trébol en esta configuración en
forma de L. Según su secuenci¿, el
noáciclo en el extrémo cle un blazo ,v-' el anticodón en el extremo clel
bucle V t¿mbien podría interactuar
r:tlo. El apareamiento de bases adicional implíca que el apilamiento con el brazo D, como indican las Iíne-
de bases (véase sección 1.1 .2) es casi continuo cle un ertlemo del as negras. EI esquema de color es el
tld¡,lA al otro, lo que otorga estabilidad a la esfuctura. mismo de la figura 13.2.
,9§ Capítulo ll Síntesis y procesamiento del proteoma

+ l¿¡s crn¡n*§fiif§ffÁ srntsftrs¿,§ {rna§ §rñi,1oár¡dcs c los f8lr,{

NH"
I
La unión cle aminoácidr¡s a los tRt\lA -"cat'ga" en la tettrinr:logía cie la bio'
iogía mr:lecular- es la función del grupo de enzimas clenominadas amino'
I

H
Aminoácldo -C-R 1

I
ucil-t§,NA sintetasas. La reacción química qtie detern-iina l¿r aminoacilación
se produce en dos pasos. Primero, se fotma un aminoácido activado por:
reacción entre el aminoírcido y ATP ), clesputls. el aminoácido es tlansfdr-
1

0
1

*r1
clo al extr.emo 5' clel IRNA, con flr¡-uaciÓn de1 eslabÓn entre e1 $'upo
-cooH clel aminoácido y el $upo -OF{ unido a1(figura carbono Z', o 3' de1 ¿r¿ú-
car delúltimo nucleótido, que siempre es una A 13'4)'

Con escasas excepciones, los organismos tienen 20 aminoacil-tRNA sinteta-

sas, una par:a caclá aminoácido. Esto significa que los tRIr{A de isoaceptació¡
son aminoacilados por una sola enzima. Si bien la reacción quinica básica es
la misma para todos los antinoácidos, 1as ?0 aminoacil-tRNA sintetasas pcr-
tenecen a dos grupos distintos, clase I y clase II, que presentan vattas di{eren'
I

*
I

I
cias importa.,t.t érrtr'" ellos (cuadro 1 3.1). En particular, las enzimas de clase
l
1§iq,q I unen el aminoáciclo al gtpo 2'*OH clel nucleótido terminal del ti{h{A,
mientras que las enzir:ras áe clase II unen el aminoácido ai $upo 3'-OH.

Figura I3.4 Anrinoacilación de un
IRNA Se muestra el reSultado de la
aminoacilación por una arninoacil-tRNA
sintetasa de dase ll; elanrinoácido es
unido por su grupo -COOH al 3'-OH
del nucleótido terminal delIRNA. Una
amino¿cil IRNA sintetasa de clase I une
el aminoácido al grupo 2'-AH.
La aminoacilación -se debe llevar a cabo con exactitud: se debe unir e1 ami-
noácido con'ecto al IRNA cot.1ecto para que se cumpian las reglas de1 códi-
go genético dulante la síntesis proteica. En apariencia, una aminoacil-tRNA
iini.turo tiene alta fidelidacl pof su IRNA, como consecuencia de una crlen-
sa interacción eÍltle los clos, que cubre alrededor de 25 nm2 cle supelficie e
involucra el brazo aceptor y el bucle dei anticodón del tItNA, así como
nucleóticlos incliviclualei de los brazos D y TYC. La interacción entre enzi-
ma y aminoáciclo es, por necesic{ad, menos exten§a, pues los ¿rn-rinoárcid'¡s
son mucho más pequeños que los IRNA, y pla¡tea mayores problemas res-
pecto cie la espeiifióiclad pórque varios pares de aminoácidos tienen siniili-
iudes estn:ctuiales, Por lo tanto, de hecho se ploduoen elrores, en una tasa
rnuy baja para la mayoria cle los an]inoáciclos, pe¡o quizá con una frccuen-
ci, de u,-triuminoaciláción cada 80 en caso cle pares diüciles, como isoleuci-
na y valina. La aminoacil-tRNA sintetasa corrige, por sí misina, ia ma1'r:ría
de ios erroles nrecliante un pl'oceso de edición, distinto de la aminoacilación'
que implica diferentes contactos con el IRNA.

Cuadro l3.l Características de las aminoacil-tRru,q sintetasas

Estructura del sitio activo de la enzima Hoja B paralela Hoja F antiparalela

lnteracción con el IRNA Surco menor del brazo acePtor rnayor,o"l,

lurcó ?rr.o,utuo*t-

Orientación del IRNA unido El bucle V no enfrenta a la El bucle V enfrenta a la enzima

enzima

Unión de aminoácidos Al 2'-OH del nucleótido ter- Al extremo 3'-OH de! nucleÓtidó te¡min{¡6
minal delIRNA del IRNA

tnzrmas para Arg, Cys, Cln, Clu, lle, Leu, Ala, Asn, Asp, Cly, His, Lys*, Phe, Pro, Thr; Ser I

Lys*, Met, Trp, Tyr, Val

* La aminoacil-tRNA s¡ntetasa para Iisirra es una enzlma de clase I en algunas arqueobacterias y bacterias, y una enzima de clase ll en todos
los demás organismos.
 Participación del IRNA en la síntesis de proteínas

', l
(")
*,*dfl&#rra,'lffi*'
'xrixtr/r§il\/ iW
¡tq

'u"f§1;?;**r¡-
: i *i
iW ¡ffi-

mrJ'l+.ti;"f@ ;'",q##i ;:
{;Étu --'
Y te.7
q:§r'át",t
l'*

'"q"e*'#
1",'
'-'+ % ffi*"
'{F]L-'i

lrl
tua
"¿#!

J&
.-*d-;l
a*

w
ar*#-a
§#*'-€ i

${, \r,"
"\}5 q* ,3

\#: 1
1¡'é i

'il
I I

l)f-,:
i :
¡
{:rt i_rti
t i
!
: :
,i i,ii ¡
*-* f. {..; l.;l:
tn.
I
'
i'\ -c.: o
t..¿ Ir . ,l ./'
H

Ácido gluiámico Glutarnina Meiionina N-formilmetionina

f"- i
x
¡
I §*l'{ I
1
I
!
t
,2
,1
I ! irrr.1 1

j
J 1 1

' t.j : : -"* (} 1

i j
I
I i
i
l**
I
t"..- .t
Serina Selenocisteína

En la mayr:lía de los organismos, la aminoacilaciÓn se reaiiza nrediante el Figura 15.5 Tipos infrecuentes de
proceso recién descrito, pelo se han documentado algUnos evefitos atípicos' aminoacilación. (A) En algunas bac-
Éstos complenden una serie de casos en los cuales la aminoacil-tRNA sinte- terias, el tRNAcln es aminoacilado con
tasa une ef aminoácido incorrecti: a un IRNA y este aminoácido es transfirr- ácido glutámico que, después, es ccn-
mado, después, en el correcto por una segunda reacción química distinta. vertido en glutarnina por transarnida-
Esto se descubrió en la bacteria Bacilh¿s megaterium durante la síntesis de ción. (B) EItRNA especial usado en la
iniciación de la traducción, en las bac-
glutarnina-tp§§cln (glutamina unida a su tRNA). Esta aminoacilación terias, es aminoacilado con metionina,
áepende de la enzimaiesponsable de la síntesis de ácido glutámico-tRNAclu que después es convertida en A/-for-
y, én prirner tétmino, determina la unión de un ácido glutámico ¿| 1p§dGln milmetidnina. (C) En diversos organis-
(figuia 13.5A). Después, este ácido glutámico es convertido a glutamina por mos, el tRNAsecYs es arninoacilado,
trunsamidaoión catalizada por una segunda enzima. Otras diversas bacterias inicialmente, con serina.
(aunque no Eschericfuia colí) y las arqueobacterias (Archaea) utilizan el
I
mism-o ploceso. Algunas arqueobacterias también recurren a la transamida-
ción pára sintetizar asparagina-1ft§dAsn a partir de ácido aspártico-
1§§§Ásn. En estos dos casos, el aminoácido que es sintetizado por e}
proceso de moclificación es uno de los 20 especificados por el código gené-
 Capítulo 15 Sínlests y procesamiento del proieoma

tico. Asimismo, ha,r, dos ejemplos en ios que la modificaciÓn da origen a uri
aminoácido infrecuente. El primer ejemplo es la conversión de metionir,¿t en
ób ór+
ill:¡l.
N-forrnilmetionina (figura 15.58), que genem el aminoacil-tRNA especial
§;;#
'&#ili'l§ utiiizado en la iniciación de la traducción bacteriana (sección 1j.2.2). El
I
i I
segpndo ejemplo con'esponde a procariontes y eucariontes,.y determina ia
§*i;ilrut!
síritesis cle selenocisteíná, que es especificada de manera dependiente d;l
§;,:.::
contexto por algunos c6dones 5'-UGA-3' (sección 1,3.2). Estos ctCones
.or', ,""on-o.idoipor un 1RN§SeCy'especial, pero no hay ningUl3 amino:uil-
IRNA sintetasa que pueda unir selenocisteína a e§te IRNA. Entot'.r"-.., el
IRNA es aminoaciladó con una serina por la seril-tRNA sintetasa y, después,
Fisura 13.6 lnteracción entre un modificaclo por reemplazo del $upo -oH de la serina por un -seH, para
.üOn y un anticodón. Los números formar selenocisteína (figura 13.5C). Se ha descubierto una segunda reasig-
indican-las posiclones de los nucleÓti- nación de codón dependiente dei contexto, que consiste en el uso ocasional
dos en el IRNA (véase figura 13'2). de 5'*UAG-3'para codificar pirolisina en arqueobacterias (sección 1.5.2).
Esto no implicá }a modificación de un IRNA precargado, sino que hay una
aminoacil-t-RNA específica que une directamente pirrolisina al tRNApLr--s.

n 3.3 "x tmt*ra**§*fi*§ fl*d*¡:*«xticmd*m:

§m *¡sx§mm d* §§?P"t& * r§?§tr!§&
La aminoacilación replesenta el primer nivel de especificidad presenta-
do por un tRNA. El iegundo nivel es la especificidad de.la interacción
entie el anticodón ¿el iRN,q y el mRNA que se está traduciendo. Esta
especificidad garantiza que la síntesis proteica cumpla las reglas del
cOiigo genético (véase figura 1.2O).

En principio, el reconocimiento coilÓn-anticodón es un ploce.co sirnple,

que implica apareamiento de bases entre el anticodón del IRNA y un
ü00,, áel mRNA (figura 13.6)' La especificidad de la aminoacilación
asegura que el tRNAlleve el aminoácido denotado por el codón con el
q,r"''.. uiur"u y el ribosoma controla la topología de la interaccién de
*url.ru ü1quesólo se dispone de un único triplete de_nucieÓtidcs-para
el apareamiénto. Como estor polinucleótidos apareados por sus bases
.or, .i"*pr" antiparaielos y como el mRNA se lee en direcciÓn 5'*;3', el
primer nucleóticlo del codón se aparea con el nucleótido 36 dei IR'NA;
el segunclo, con e1 nucleÓtido 35; y el tercero, con el nucleótido 3'1.

En la práctica, el reconocimiento dei coción se complica por la posibilidad

pro-
cle titubeo (wobblz). Éste es otro de 1os p¡incipios de expresión génica
puestos originalmente por crick, que despuás se comprobó que era correc-
io. Como é1 anticoclón se locaiiiu ".r rr., bucle de RNA, el triplete de
nucleóticlos está un poco curvaclo (véanse figuras 73'2 y 13'3) $ por-lo
iurrio, no se puede alinear de manera completamente uniforme con elcodón'
En consecuencia, se puecle formar ,rl pui.1. bases no cgnvencional-entre
el

tercer nucleóticlo def coclón y e1 primár nucleótido (número 34) de1 antico-
clón. Esto se clenomina 'titubeó". Hay diversos apareamientos posibles,
sobre todo si el nucleótido ile la posiciÓn 34 está modificado. En las bacte-
rias, las clos características principales del titubeo sonr

* Se permiten pares de bases G-U. Esto significa que un antieodón

.oi1, secuencia i'-r rG-5' puede formar pares de bases tantc con
5'-ttC-3'como con 5'-liU-:'. De modo similar, el anticodÓn
3'-t lU-5' puecle formar pares de bases con 5'-f 1A-3' '§

5'-t a G-3'. La oonsecuencia es que en lugar de requerir un IRNA

de
cliferente pala cada coclón, 1os cúatro mieirbros cle una familia
ser
coclones (p, ej., 5'-GCN-5" clue coclifican todos alanina) pueclen
clecodificados por só1o dos IRNA (figura 13.71')'
 Participación del IRNA en la síntesis de proteínas

(A) Apareamiento de bases G-U

*1
.!
.:i---.1
-: 1 :.--.\t
.Í"..¿'
;*"""."-a. .,:--"-*1!
a,]
/I!\--- i.i**t{ - -"* '¿.,'*.,.

Guanina ;' " uracilo

3'-
B,f :F:,.r.' - 5' 3'e l§¡iA¡': § 5'
IL Tf
q;Y
q-
'\* ---cs ,{Y %"
1&l.¡:lr1rf' ".,fl
lii
c .^ ., c-t . { .**, .,
.'-"."-_.".
5'"3'
.,,",,'"q-,
5' 3'
Codones de alanina Codones de alanina

(B) La inosina forma pares de bases con A, C y U

¡-l
r"{ -*l
o---H-r,t
-+/ ,tt
t/\
ü---i-r**si
7\
§t nl*'
t"
" t.
\_ ,? ..
\11 \- '"i
1
.r-*. ,T, ir-,
{
&r*r:ar"-ñ-'í \l
,t-
r'l-t"i ** §t
{ñr¡N i,J
1
N
l\

ru*i '*íl :ll

Citosina
ü
§,"*
*' &-¡¡' \
,rt,l
.l:1
/
:\_ ,.---N
'ñ -H á lJ
'A=ú.,u,
x*¡'
lnosina Uracilo

. La inosina, abreviada I, es una purina modificada (véase figura Figura I3.7 Dos ejemplos de tkubeo
12.18) que puede formar pares de bases con A, C y U. Só1o puede en las bacterias. (A) EI trtubeo que
aparecer en el tRNA, porque el mRNA no e§ modificado de este involucra al par de bases C-U permite
modo. En ocasiones, se utiliza el triplete 5'-UAI-5'eomo ariticodón que la familia de cuatro codones para
en una molécula ale tRNAIle, porque se aparea con 5'-AUA-5', alanina sea decodificada por sólo dos
5'-AUC-3'y 5'-AUU*3' {figura 13.7F), que forma la familia de tres IRNA. Obséruese que eltitubeo que
involucra a C-U también posibilia la
codones para este aminoácido en el código genético estándar.
decodificación exacta de una familia de
El titubeo reduce la cantidad de IRNA requeridos por una célula al per- cuatro codones que especifica dos ami-
noácidos, Por ejemplo, el anücodón
mitir que un IRNA lea dos o, qvizá, tres codones. Por 1o tanto, las bac- 3'-AAC-5' puede decodificar
terias pueden decodificar sus mRNA con taa sólo 50 tRNA. Los 5'-UUC-3' y 5'-UUU-31 que codifican
eucariontes iambién recuüen al titubeo, pero de una manñra restingida. ambos fenilalanina (véase figura 1.20),
El genoma hurnano, que en este aspecto es bastante típico de los euca- y el anticodón 3'-AAU-5' puede deco-
riontes superiores, tiene 48 *RNA. De ellos, está previsto que 16 utili- dificar los otros dos miembros de esta
cen titubeo para decodificar dos codones cada uno, mientras que los familia: 5'-UUA-3'y 5'*UUC-3i que
otros 32 son específicos para un solo triplete (figura 13.8)" Las caracte- codifican leucina. (B) La inosina puede
formar pares de bases con A, C o U, lo
risticas distintivas respecto del titubeo en las bacterias son: que significa que un solo tRNA puede
decodificar los tres codones para isoleu-
* Se emplea titubeo G-U con ocho IRNA pero, en todos los casos, el titu- cina. Las líneas de puntos indican enla-
ces de hidrógeno. Abreviatura: l, inosina.
beo involucra un anticodón con la secuencia 3'-r r G-5'. Parece que los
eucariontes no utilizan la versión altemativa del titubeo G-U, en que ia
400 Capitulo 13 5íntesis y procesamiento del proteoma

Figura I3.8 Utilización prevista del UÜU.';,;.¡,:1L:,,:.1:;;..1:,1;;;;"::;'";,¡,;';:,;¡ UCU ::.UAU, .:iit'$iii;#|§l:# .UG Ui l. )i.^,1.i.titriut*§t
i:f
,

titubeo para la decodificación del UUC ffi:,,r,:r;,,:,,1:,;;¿ UCC ',,:t),t,t:al*;.',,,, i{i UGC.r',',álllll,,:ll:;:ltltt;3i
genoma humano. Se destacan en U UA UCA UAA UGA @
ro
{l::::,:l::':;::':,::::'::::;''",¡;::
rosa pares de codones que se prevé
que serán decodrficados por un solo
UUG t¡,.¡,,:..';:.l,,',,:..¡ UCG UAG UGG 'á|,,:..t¿)il}
IRNA que utrliza titubeo C*U'¿ en CUU CCU - CGU
t,,,t.:.1i.',:li¡t:r..
a:narillo, los pares que se anrci2a qr-,e CUC ¡.\ r'\ f\
UUV CGC
serán decodificados por titubeo que
involucr¿ inosina. Los codones que no
CUA ccA ir..:,§,,,'.. ,..:
CAA CGA
están destac¿dos tienen sus propios CUG CCG'$;;;:l;.:",,:,;;.:¡t.17 CAG u\f \f
tRNA individuales. Las predicciones 'AAU -' - ..tr-'1i:iir,lr;ll
:.:¡XG,$;¡¡'}Ñ,
AUU ACU
están basadas, en gran medrda, en el iffi
examen de l¿s secuencias de los anti- AUC ACC r,rAAC'.:,,,:,,,t;L.fl1,,:;:,',,:,1r,,t1ll., r:.liAG.§,i i
.ii ri{iil.&l/§W
codones de los tRNA, que han sido AUA ACA AAA :,.:,.,tlt#'t,;;"t,t,,:',,;:;:,:, AGA th§r:iffi#
localizados en la secuencia del geno- AUG ACG AAG ',,:;»ta. .j?1 AcG @r],ffiffi
ma humano. El análisis aquí mostrado
implica que hay 45 IRNA en células GUU GCU .,'GAU,,'
humanas: los 15 para los pares de GUC GCC ,r GÁQ.:,r,
titubeo y los 29 lndividuales. De GUA GCA GAA
hecho, hay 48 IRNA. Esto se debe a GUG \.1t/\jl GAG
que tres codones que se piensa que
son decodificados como parte de un .

par de titubeo (5'-AAU-3i 'i;i::.::;i::§r,:,::.ta,§;4'i't

::,:,:,,,1r::rrrr,::.,r,,'r,rfrrirr','§ i.

5'*AUC*3' y 5'-UAU-3') también tie- M

nen sus propios tRNA rndividuales,
T¡tubeo G-U
aunque éstos son poco abundantes.
Titubeo I :,

secuencia clel anticodón es 3'-t tU-5', quizá porque podría clar urigcn :

a un IRNAII. con el anticodón 3'-UAU-5'que lee el codón de mctioni- ,,,:,.

na 5'-AUC-3'(figura 13.9). Por 1o tanto, los eucariontes tienen un
medio de impedir que se produzca este tipo de titubeo.
* Otros ocho IRNA humanos presenian anticodones que contlc-nt'll
inosina (3'-r rI*5'), pero éstos decodifican sólo 5'-+ . C-5' ) ,
5'*lrLi-3'. El apareamiento de bases entre I yA es dóbil, 1o que sig- ',::t::tt:,':::-:..,:;

nifica que los codones 5'-tlA-5' sólo son reconocidos de ülanera . *¡,r,r,:
ineficienteporunanticodón3,*l}[*5,''Paraevitarestaineficicncia,
en todo ejemplo de titubeo que involucra a inosina en el conjunto dc ..

IRNA humano, el codón 5'-r rA-5' es reconocido por un tRi{A dis- 'r,g,.::rrrrr:l

tinto. ObséLvese, sin embargo, que el reconocimiento por un IRNA '.,';,1;":':,,,,'.

distinto no impide que el codón 5'*l tA-3' también sea decoclifisado .,;..;i111;1,1,1.,,it:'.',

por el IRNA que contiene 3'-f tl-5', aunque de manera incllcicnte

Esto no compromete la especificidad clel código genético, porque el , ,,t,,;¡.,,,]
titubeo qr"re involucra ala inosina se limita a las familias de codones en iiiii..:,tll'lr,r':,:::'r'

las que 1os tres tripletes que pueden ser ciecodificados por 3'-l ot-i'
especifican el mismo aminoácido (véase figura 13.8).
,,:i.r,:, ,rr.
Otros sistemas genéticos emplean for:nas más extremas de titubeo. Por ejem- . ',,rriir,'::r,r
3'* rrif iA
'

* 5'
R,# plo, las mitoconddas humanas utilizan sólo 22 tRNA. En algunos de estos ",.';,,,,':: ,.,,,',,,.

IRNA, el nucleótido en 1a posición de titubeo dei anticodón es casi teciundan- :..l:,l:;''

e#
I
"@¡txqtsÉ"
te, porque puede fomar pares de bases con cualquiet nucleótido, lo que posi'
3, Codón
' de isoleucina bilita que los cuatro codones de una familia sean reconocidos por ei mismo ;,:.,,1,:,t;"2;;;,,.,
w**;^* fl. ll.) 6rri.:1r,;...t.r.*¡ Codón. tRNA. Este fenómeno se ha denominado supertitubeo {supenvobble). ''' .. ,1¡,.,,,,::,, :
5, 3, de metionina
,

xm-ru Www*§w&pwx&&m &x§ w&W*&wswe ww &e ,.á

Figura 13.9 Un IRNA con el antico-
dón 3'-UAU-5'podría leer el
*§wkwxáw de prm**áx'xas ,,..:t;Ai¡;;;'
codón de isoleucina 5'-AUA-3', así Una célula de t.
cit¡ contiene alredeclor de 20.ü00 ribosomas, distribuidos ';¡.:r:;..:,.
como el codón de metionin¿. portodoelcitop1asma.Lacélulahumanapromediocontienebastantcstnas
.: iil,rr:;§llirrri:)rriili.,

ill;1á*i!lii: i ''
,l:,:,::::i',1:t;";:::;:,:,",'""'
:.;,1::ii:"i:,,,?i,',1.::,,t',;.

Participación del ribosoma en la sintesis de proteínas j¡0¡

....li..:t....l...l...lt....i.l
(nunca nadie los ha contado a todos), alglncs libres en el citr:plasma y
iiiiiiiilliiilllliiiliilil.li:.l.. otro§
Llnitlos a la suped.icie extem¿i del retícuk: encloplasmático, la red
ililillillllllllillllillli:li:l lrleürbranosa
de tubos y vesículas quc atlaries¿i la célula. Al principio, los
¡rl't!§.,' rihosomas iueron considerados socios pasivos en la síntesis de proteínas,
;',:,1:.':,7,,:'::.';1:';,';;1t';"
siinplemente las estructuras en las que tiene lugar la traducción. A io lar:go
'.,,1..1..1
- dc 1os años, este conceptü ha camt,iadc y, ahcra, se piensa que los riboso-
..';;; ',11,:11:.:;,, nras cumplen dr:s f¡:nciones activas en la síntesis de proteínas:

I Los ribosomas coorilin*n la síntesis proteicit colocando el mRI{A"

:::".:..:,::':'a:'t:,1:):,:,,,t,:,:,,

:'t,-,'1;;.,,'t ios aminoacii-tRiriA v 1os factores proieicos asociad.os en las pcsicio-

'::'t':t,:',,"',',.',,
nescorrectasentresí.
r Los componentes de los ribosomas. incluidos los rRNA, ccttslizr¿rz
por lo menos algunas de las reacciones químicas que ocurren duran-
te la traducción.

Para comprender cómo desempeñan k:s ribosomas estos papeles, estu-

diaremos primero sus car'¿lcterísticas estructurales en bacterias y euca-
riontes, para examinar después el mecanismo detallado de síntesis
prr:teica en estos dos tipos de organismos.

t5"?.1 Estra¡ctsse de lss rih*s#§y!&§

l"luestlo conocimiento sobre la estructura cle los ribosr:mas ha evolucio-
nado cle manera gradual dulante los últimos cincuenta años, a medida
quc se han aplicado técnicas cada vez más potentes para estudiar el pr.o-
bleina. Los ribosomas, denominados al principio "lriicrosomas", se
observaron por primera vez en las clécadas iniciales dei siglo xx conto
partículas pequeñas casi más allá de1 poder de resolución del microsco-
pio óptico. En las décadas de 1940 y 1950, las plimeras microfoto_er:afí-
as electr'ónicas mostralon que los ribosomas bacterianos eran de forma
oval, con dimensiones de 29 x ? 1 run, bastante más pequeños que los
ribosomas euc¿riontes, que varían un poco de tamaño según la especie,
pelo miden, en promeclio, i2 x 22 nm. A mediados de 1a década de
1950. el descubrinliento de que los ribosomas eran los sitios de síntesis
prateica estimuló los intentos de definir con mayor detalle ias estructu-
ras de estas partículas.

::.':::':t,::':':''::' §* ufil¡;d ¿llfrd?rcnfrifug.*ciúrs p$r{l

/?'?*dir l*s tr¡m*ñ*s d* lxs
riiosamas y' suu can', porrenles
:':::.,':;: El avance inicial en el conocimiento cie la estructura detallada del ribo-
rl r :,r §olna no provino cle su observación con ei microscopio electrónico, sino
-'...,,-, dcl análisis de sus componentes por ultracentrifugación (Nota sobre téc-
'::iii.i, nicas 7.1). Los ribosomas intactos tienen coeficiéntes de seclimentación
',:f,:. de B0S en los eucaliontes y de 70 S en las bacterias, y cada uno se puede
,i degladar en componentes más pequeños (figura 1j.10):

',,.i ,.,.
* cada ribosoma está formaclo por clos subunidacles. En los euca-
,1, tiontes, estas subunidades tienen cr:eficientes de sedimentación de
;.. 605 v 40S; en las bacterias, sorl de 50S y 30S. Cabe obseryat que
] .i los cteficientes de sedimentación no son aclitivos, porque depen-
,. ), den de ia forma v de la masa: es perl'ectar-nente aceptable que el
':,::,:;,' ribosoma intacto tenga un valor S inferior a la suma cle sui dc,s
.¡,r'.' subunidades.
'ilr

; .'l * La subunidad grande contiene tres r:RNA en los eucariontes (los

i;'t rRNA 28S, 5,8S y 5S), pero sólo dos en las b¿rcter.ias (l.Rl{A 23S y
";t::;:,' 55). En estas últimas, ef equivalente del rRNA 5,BS eucariort.
.'.:,.'t,, coirtenido dentro clel rRNÁ Z¡S. "rrá
 Capítulo I3 Sintesis y prccesanienlo del proteoma

EUCARIONTES BACTERIAS

80s 70s

t
*!g§?}
5oS
.60s .:r.
,: i:,]a::t (4.718 nucleótidos)
.i::r'.i ,, .-inj.i ", : : (2.g04 nucleótidos)
::l':,:. a r.:,.':, (160 nucleótidos) lfilJA SS (120 nucleótidos)
:;ril:.j.il ill (120 nucleótidos) *
ñ F-¡9[sr":\
Figura 13.'10 Composicién de los 5ü pr*i*i¡a*
ribosomas eucariontes y bacteria-
nos. Los detalles hacen re{erencia a
un riboscma eucarionte 'típico" y al 40s : 30s
ribosoma de Escherichia cali- Las :-l]:: (1.874 nucieótidos) §llA 1S$ (1 .541 nucleótidos)
var'iaciones entre diferentes especies
?1 P'ot,-'inrs
conciernen, sobre todo, a la cantidad ,i,.
f. i¡r,.:,r rrf_l

de proteínas ribosómicas.
La subunidad pequeña contiene un solo rRNA en ambr¡s tipos de ulgr
nismo: un rRNA 1BS en los eucariontes y un rRNA 165 en las bactel'ias'
Ambas subunidades contienen diversas proteínas ribosómicas, cuya can-
tidad se detalla en la figura 11.10. Las proteínas ribosÓmicas de la sub-
unidad peqr-reña se denominan S1, 52, etc.; las de ia subunidad grande
son L1, L2, etc, Sóio hay una de cada una de estas proteínas poi- riboso-
ma, excepto en el caso de L7 y L12, que están presentes como dineros.

l;;r.'*sír*rriil* d* i* ssi¡rrrfurx {i;t* C*l ri**si:,xi:

Una vez que se había descifrado la composición de los ribosomas euca-
riontes y bacterianos, se dirigió la atención ai modo de adaptaciór, ctre los
divelsos rRNA y proteínas entre sí. Las primeras secuencias de IRNA
aportalon información importante; las comparaciones entre ellas cletec-
taron regiones conservadas que se pueden aparear por sus bases para
formar estructuras bidin-rensiónales complejas (figura 13.1 1). Esto sugi-
rió que los rRNA proporcionan un andámiaie dentro clel ribosoma. al
que se unen las pioteínas, una interpretación que subestirna e1 papel
activo de los IIINA en la síntesis proteica pero que, no obstante, lue una
base útil para investigaciones ulteriores.

Gran parte cle la investigaciór-r posterior se ha concentraclo en el liboso- ,.,j.,.,,...

nra bacteliano, que *'ár pequeño que la versión eucarionte y se puede :t't',,,,,*,1'.
obtener en grandes ",cantidades de extractos de células que se haccn crc- ,.,.
cer hasta alta densiclad en cultivos líquidos. Se han empleado divcrsos r":
enfoques técnicos para estudiar el ribosoma bacteriano: :l

**r*,¡*i* §' *Losexperimentosdeproteccióndenucleasas(sección7,1.l\pcrrni-

tenidentificarloscontaCtoSentrerRNAyproteínas
* l,os enlaces transversales proteína-proteína detectan pa1^es o grupos
Figura 13.1i Estructura apareada de proteínas que están ubicados próximos entre sí en el dbosoma'
por sus bases del rRNA l65 de
,l i:::1r,.......r

Escherichia coli. ln esta representa-

* La microscopia electrónica se ha complejizado, 1o que posibilita,,'.'.',r'j),),,1,,,,,',,.
ción, se muestran los pares de bases resolver con mayor cietalle la estructuta global dei ribosolla. Por :;t:l»¡t"!'
estándares (C-C, A-U) como barras; ejemplO, Se ha reCurrido a innOvaCii¡nes COIttO inmunomiCro§C0ple ,,r.;Ñ ,''',t:,,',;::,,:

los puntos indican pares de bas-'s no electrónica, en la que se marcan los ribosomas con anticuel'po: 'iÉ,. 11;,,,,,,,',;.,
estándares (p. ej., C-U). específicos para proteínas ribosómicas individuales antes del estu-'.má
,rli*))..,..
-,i,,.#5L..,.,.*,,:
 Participación del ribosoma en la síntesis de proteínas jt§3

rii.'r, palri lccalizar liis posiciones de estas pi'oteínas en la sr-rpcr:ficie

ricl rlbosoma.
* [,] sondaje con oxhidrilos dirigidos al sitio aprovecha la capacidad
dc los iones Fe(ll) p¿ir¿t genet'ar radicales oxhidrilo, que degr:aclan 1os
eniace -s fosfodiéster del RNA ubicados ¿i 1 nm del sitio de producción
de I raclical. Esta técnica se apiicó para deternrinar' la posición e.\act¿l
etr* 1¿ls proteínas ribosómicas en el riboson:a de E. ¿'i-rli. Por ejer:"rplo.
parii determinar la posición de 55. se marcat'on diferentes aminoáci-
cii:s de e-sta p1'oteína con Fe(li) v se indujeron radicales r:xhidlilos en
ribosolnas reconstituidos. Después, se utilizaron las posiciones en las
que fue degradado el rRNA 165 para inlerir 1a topología del rRNA
en la vecindacl de la proteíira 55 (iigura i3.12).

En los últimos años, ia cristalog:^afía de rayos X (i:lota sobre técnicas I1.1).

que ha pt"r:porcionaclo los conocimientos más interesantes sobre la estl'uctu-
ra c1e los ribosomas, ha corlplementado c¿rda vez más estas técnica-c. Analizar
las cantidades masiv¿is de datos cle difr:acción de rayos X pr:oduciclos por cris-
talcs de un okrjeto tan g¡'ande como un ribosoma es una tarea enol'lrle. sobre
toclo en el nivel necesado pala obtener una estructura suficientemente deta-
llacla pata que apolte infbnnación acel'ca de la m¿inela cotrlo tlabaja ellibo-
Figura 13.12 Posiciones dentro del
son:a. Se ha cumplido este desafío i, se han deducido las estructuras de las rRNA l65 de Éscñerichia coli que
plotr:ínas ribosóinicas tinidas a sus seguentos de IRNA, pam las subunida- establece contactos con Ia proteína
des g¡rancle ¡, pequeña, y para todo el dbosoma bactedano unido a mRNA y ribosómica 5S. La dlstribución de las
tRNA. Además de leveiar l¿i esttuctula del riboson:a (fi§*¡ra 15.15), esta posiciones de contacto (ilustradas en
reciente explosión de inlormación ha repelcutido en gran rnedicla sobre nues- rojo) de esta proteína ribosómica ¿is-
tro conocimiento del proceso cle traducción. iad¿ destaca ei grado de plegamiento
adicional que presenta la estructura
secundaria apareada por bases dei
I ( ,.; ifi{fii*a(l{"}n fl*
l-J q,f1r?{}ll;fi#n rRh,lA dentro de la estructura
triciimension¿l del ribosoma.
'Si bien la estructura ribosómica es sir¡ilar en bacterias y eucariontes, i¿r
mailera de lealizar' la traducción presenta cliferencias en los cios tipos de

Figura 13.13 Ribosoma bacteriano.

La imagen muestra el ribosoma de la
bacteria Thermus thermophilus. La
subunldad pequeña está en Ia parte
superior, con el rRNA I5S en celeste
y las proteínas rlbosómicas de la
subunrdad pequeña en azul oscuro.
Las subunidades grandes de los rRNA
están en gris y las proteínas, en viole-
ta. El área dor¿da es el sitio A (sec-
crón 13.2.3): el punto donde los IRNA
aminoacilados ingresan en el riboso-
ma durante la síntesis proteica. Este
sitio, y la mayor parte de la región
dentro de la cual tiene lugar realmen-
te la síntesis proteica, están localiza-
dos en la hendidura entre las dos
su:unid¿des. Reimpreso con ¿utoriza-
ción de Trends Biochem. Sci., 26,
tulatthews and Pe'ery The nrachine
that decodes the Cenome. SB5-587,
2001, con autorización de Élsevier.
 Capítulo ll Síntesis y procesamiento del proteoma

org¿inismos. L-a más importante de ellas tiene lugar durante la primera

Sitio de unión al ribosoma etap¿1 dela traducción, cuando se ensambla el ribosoma con el mRl'J.1
en una posición corriente arriba del codón dc iniciación.
L

L
Codón de iniciación
53',
3-10 nucleótidos
i;' i;r¡,:i*,-r*r,r,,1 j** *t:;i*rl*s r*q*ir,l-l t-. i,t,, :.ti;,-,r,
f¿, ¡;:j,.; i;J ¡i*¿:;i:r::*
La principal diferencia entre la ir-riciación de la traducción en las bacte-
Figura 15.14 Sitio de unión al ribo- rias y los eucariontes es que, en las primeras, el cornplejo de iniciacii-;it
§oma para la traducción bacteriana.
de la traducción se construye directamente en el codón de iniciación, el
En Escherichio coli, el sitio de unión al
ribosoma tiene la secuencia consenso punto en el que comenzará ia síntesis proteica, mientras que los úlrimos
5'-ACCACCU-3', y está localizado emplean un pl'oceso más indirecto para iocalizar el punto de iniciación,
entre 3 y 10 nucleótidos corriente como Yererlos enseguida.
arriba del codón de iniciación.

Cuando no participan activamente en la síntesis proteica, los ribosornas

se disocian en sus subunidades, que pelxtanecen en el citoplasma y

Cuadro I3.2 Funciones de los factores de iniciación en bacterias v eucariontes

Factor

Bacterias
tF- I lF-l bloquea el sitio A, de
Poco clara; estudios por cristalografía de rayos X muestran que la unión de
manera que su función puede consistir en evitar el ingreso prematuro de tRNA en el sitio A. En
forma alternativa, el lF-1 puede provocar cambios de conformación que preparan a la subunidad
pequeña para la unión a la subunidad grande

tF-2 Dirige al iniciador tRNAMet a su posición correcta en el complejo de iniciación

tF-3 lmpide la reasociación premahJra de las subunidades grande y pequeña del ribosoma

Eucariontes
elF-l Componente del comptejo de preiniciación
elF-lA Componente del complejo de preiniciación
elF-2 Se une gl!,Rryl,"t,inic'rador dentro del compone¡te fomplejo teinario delcám¡tá¡O'ae.:preiniciación;
la fosforilación de elF-2 causa una represión global 'dellartraducción r , :,,,
. .,¡, .:,;r
elF-28 Regenera el complejo elF2-CTP
..i

elF-3 Componente del complejo de preinicíación; establece,iólÍáctó'¿¡re«éión.etf+c'i, ail torma

el eslabón con el complejo de unión a la caperuza
elF-4A Componente del complejo de unión a la caperuza; una helicasa que ayudá alibárrido'iómpiendo

elF-48 Ayuda al barrido, posiblemente por actuar comoi;hellqasa qüe,iompá.páie¡ de,báses intraméleculares
del mRNA
elF-4E Componente del complejo de,unión a la caperuza, quizás.el.componente que establece contacto
directo con la estructura de la capéruzg én el extrer¡ó 5'del.mRñA::,-:: i:.,, '. ,'' ,",
' él
elF-4F El complejo de unión a la caperuza, qúe comp¡ende:,elF-4A;rélF.4E,y.élF-4C¡ que"estabfece '
contacto primario con la estructura de Ia caperula.en:el ertremo 5l del mRNA,,i.,.,,',.r.r:', ".
elF-4C Componente del complejo de unión a la caperuza; forma un puente entre el complejo de unión a l¿
caperuza y elF-3 del complejo de preiniciación. Porlo menos en:algunos.organismos, elF-4C
también se asocia con la cola de poli(A), a través dé lá,proteíná de-unión"a[poliadenilato
lt'
elF-4H En los mamíferos, ayuda al barrido de manera simitarlá'áir+r,' , , ,., r r,, ..,r
,

elh-5 Ayuda a libeiar los otros factores de iniciación al completarse ésta

elF-6 Asociado con la subunidad grande del ribosoma; impide que las subunidades grandes se unan a las
subunidades pequeñas eñ el citoplasma
 Participación del ribosoma en la sÍntesis de proteínas

Cuadro 13.3 Ejemplos de secuencias del sitio de unión al ribosoma en Escherichio cali

Gen '' 'l:riir,,,." Codifica

":j, ,"
r§ecuencia de unién :!!lÍ &&§:6¡§§;el
]] Dl
:tt,
,',', i- r.
al. iibo§omq. r,r'l'i'",r r
$ ii]

Secuenci¿ consenso de E. coti 5,_ACCACCU-3' 3-.l0 ,,,,

Operón de lactosa Enzimas de utilización de lactosa 5,.ACCA-3' 7 .;,

gotL Hexosa-'l -fosfato uridiltransferasa 5,_CCAC-3' b

rplL Proteína ribosómica LIO 5,_ACCAC_3'

aguardan ser utilizadas para uria nueva ronda de traducción. En las bac-
terias, ei proceso se inicia cuando una subunidad pequeña, junto con el
factor de iniciaeión IF-3 (cuadro 13.2) se une al sitio de unión al ribr¡-
soma (denominado también secuencia de Shine-Dalgarno). Éste es un
sitio diana corto, secuencia consenso 5'*AGGAGGU-3' ert E. cali tcua-
dro 13.3), localizado airededor de J:10 nucleótidos coriente ariba del
codón de iniciación, el punto en el que comenzará la traducción (figura
13.14). El sitio de unión al ribosoma es complementario de una región
del extremo 3' del rRNA 165, presente en la subunidad pequeña y se
considera que el apareamiento de bases entre ambos interviene en la
unión de la subunidad pequeña al mRNA.
Siiio de unión
al ribosoma
Cuando la subunidad pequeña del ribosoma se une al sitio de unión al
ribo§oma queda sobre el codón de iniciación (figura 13.15). Por lo
I co¡¿n
I de ¡ntcraclon
general, este codén es 5'-AUG-5', que codifica metionina, aunque, a 5',
1.,,..
veces, se utilizan 5'-GUG-3'y 5'-UUG-5'. El mismo IRNA iniciador
I
puede reconocer los tres codones, los dos últimos por titubeo. Este V
tRNA iniciador es el único que fue aminpacilado con metionina y, des-
pués, modificado por conyersión de la metionina en l{-formilrnetionina
Subunidad
pequeña
I
{véase figura 13.58). La rnodificación une un grupo formilo (-COH) al
grupo amino, lo que implica que sólo el grupo carboxilo de ia metioni- "I,r,;;,":,,..
na iniciadora está libre para participar en la formación de enlaces pep-
tídicos. Esto garantiza que la síntesis del polipéptido pueda proceder
sólo en dirección N--+C. El tRNAMet iniciador es llevado a la subunidad I
r
I

pequeña del ribosoma por un segundo factor de iniciación, IF-2, junto tRNA iniciador *--# h
con una molécula de GTP, que actúa como fuente de energía para el w:
paso final de la iniciación. El grupo formilo pernanece unido hasta que +

la traducción ha avanzado a la fase de elongación, pero.después es eli- **@;Xffi /t

minado del polipéptido en crecimiento, por sí solo o junto con el resto

de la metionina inicial. Cabe orbservar que el tRNAMet iniciador sólo
puede decodificar el codón de iniciación; no puede ingresar en el ribo- ¿
V -
f
soma completo durante la fase de elongación de la traducción, en la que l-.t | ::
los codones internos 5'-AUG-3' sori reconocidos por un tRNAMet dife- /../ \-
\'.
rente, que ño contiene una metionina modificada. La discriminación §uDunl0ad''''._ dfl".
entre estos IRNA parece depender de dos características infrecuentes grande I @ I
de la molécula iniciadora. Primero, a difereacia de todos los demás
tRNA bacterianos que han sido secuenciados, el IRNA iniciador tiene
una serie de tres pares de bases G-C en el brazo de su anticodón que
ayuda a unir este TRNIA a la subunidad pequeña. Segundo, el.nucleóti-
do 5'que, en la mayoría de los IRNA participa en el primer par de bases
del brazo aceptor (véase figura t3"2), no está apareado en el IRNA ini- Figura 13.l5lniciacíón de la tra-
ciador. Esta característica poco habitual actúa corno señal para ia enzi- ducción en Escherichio coli.
ma que convierte la metionina unida en N-formilmetionina y, quizá, Obsérvese que los diferentes compo-
nentes dei complelo,de iniciación no
también impida que el IRNA iniciador ingrese en el ribosoma durante están dibujados a escala. Abreviatura:
la fase de elongación. fM, fu-formilmetionina.
 Capítulo.13 5Íntesis y procesanrienlc del prolecrna

{A) Unión del complejo de preiniciación La fase de iniciación finaliza cuando IF- 1 se une a1 cornplejo de inicia-
al mBNA
ción. lio se conoce ccn claridad la fu¡ción plecisa del IF-1 (véase cua-
6* -" IRNAiniciador
dro 13.», pero puede inducir un cambio de conformación en el
w '
2' 'elF-2 complejo de iniciación. lo que permite 1a uniÓn de 1a subunidad glande
'' ----f-it't'''' "'" '
clel ribosoma. Esta unión requiere energí4, qlle es generada por hidrÓli-
, §ü§unidad .: CoTpleio de sis clel GTP unidr¡ y detern-rina 1a liberación de los factores de iniciaciÚn.
Pequeñg Prelnlclaclon
r§,3.,;,, elF-3

**;xpl*j* de *ni*n

Caperuza r t^
d^ ¡Í -.1".^?-
LÉiPryJ
1^
U¿II

4.t:*@
;llA::;?- elF-+e
elF-4G
Y*',-
elF-48 ".. :
t/'
Complejo de unión a la caPeruza

{B) Barrido

It
''."-'\ elF-48
"
, dB: *-'d
wffidlffi-

'::;::::..A:,.:,:l

§ecuencia
l
consen§o
elF-44 de Kozak

Figura 13.16 lniciación de la traduc-

ción en los eucariontes. (A)
Ensamblale del conrplelo de preinicia-
ción y su unión al mRNA. Para que el
esquema resulte más claro, se han
omitido varias proteinas cuyas funcio-
nes precisas se desconocen. No se
conoce la configuración global del
complejo. (B) El compleio de preini-
ciación barre el mRNA hasta que
alcanza el codón de iniciactón, que es
reconocible porque está locaiizado
dentro de la secuencia consenso de
Kozak. El barrido es ayudado por elF-
4A y elF-48, que se considera que tie-
nen actividad de helicasa. Es probable
que elF-3 permanezca unido al com-
plejo de preiniciación durante el barri-
do, como se muestra aquí. No se ha
esclarecido sr elF-4E y elF-4C tambrén
Permanecen unidos en esta et¿Pa.
Obsérvese que el barrido es un pro-
ceso dependiente de energía que
requiere la hidrólisis de ATP.
Abrevialura: lvr, metionina
 Participación del ilbosoma en la síntesis de proteínas

5"*AUG-3' en los eucariontes, es leconocible porque está contenido (A) Autorregulacién de Ia síntesis
ser de proteínas ribosómicas
en una secuencia consenso corta, 5'-ACCAUCG*5', denominacia
sec*encia consenso de Kozak. L1 I L1
sisd@#s##f d8l¡t.s:1ae d ":
ffi {!1dg*]";Er§;;q*§*§*{.!ti#w§iffilltlwiM§rfui:;
Una vez que el complejo de iniciación está ubicado sobre el codón de inicia- \\\\
ción, se une la subunidad grancle del ribosoma. Como en las bacterias, esto
requiere hidrólisis de GTP e induce la liberación de los factores de iniciación.
El esta etapa pal'ticipan dos últimos factores de iniciación: elF-5, qr"re ayuda
a liberar los ottos factores. y elF-6, que se asocia con la subunidad grande
libre e impide que ésta se una a la subunidad pequeña en el citoplasma.

Ji:;:;;¡*i ;J* l:: i¡**- -:,--. -,.,'.-'- *'.,* s¡;: **¡¡i#*

§}*qu*a l*
El sistema de barrido para Ia iniciación de la traciucción no se aplim a todos t¡"¿Cucsrdn uil¿rirrr
los mRNA eucariontes. Esto fue reconocido por primera vez en los picor-na-
yirus, un $upo de rirus con genoillas RNA que comprende a los poliovin"rs
y 1os rinoürus humanos, estos últimos responsables del resfiio común. Los
tral"lscritos de estos r.'irus no están encapuchados, sino que tienen un sitio (B) Regulación por elementos de
interrro de entrada de ribosomas {intemal ribosome entry site,IRE§) que respuesta al hierro
cumple una función similar al sitio de uníón al ribosoma de las bacterias, aun-
que las secuencias de los IRES y sus posiciones lespecto del codón de inicia- mRNA de ferritina
ción son más vadabies que las velsiones b¿rcterianas. La presencia de IRES
en sus transcritos implica que los picomaüms pueden bloquear la síntesis
proteica en la célu1a huésped desactivando el con"rpleji: de unión a la capem- Proteina de
respuesta t Hierro
za, sin afectar la traducción de sus propios transcritos, aunque esto no es ur-Ia al hierro ¡
palte habitual de la estlategizr de ir-fección de todos los picomavirts.
53 ,"- i- --- :-
,-
k"-,..ri-ü.#d,""j,'.,!*+§f"6ti¡4d"'f*Én a
Cabe destacar que no se necesitan proteínas virales para que un ribosoma
o\
huásped reconozca un IRES. En otras palabras, la célula eucarionte nolmal a&..o \:
#;.;
tiene proteiras u otros factores que le per:niten iniciar la traducción por el
*W#a Traducción
método de IRES. Dada su variabilidad, los IRES son diticiles de identificar
por inspección de secuenci¿rs de DNA, pe1'o se está esclal'eciendo que Llnos
pocos transcri¡os de genes nucleales 1os contienen y que éstos son traduci- Figura '13.17 Regulacién de la inicia-
dos. por 1o menos en algunas circunstancias, a tlavós de sus IRES y no por ción de la traducción específica de
barrido. Los ejemplos son los mRNA cle la proteína de unión a la cadena transcrito. (A) Regulación de la síntesis
de proteínas ribosómicas en las bacte-
pesada de inmunoglobulinas de marníferos y la proteína Antemrapedia de
rias. El operón Ll I de Eschericl'tia mli
Drosophila (sección 14.3.4). Asimismo, hay IRES en varios mRNA cuyos es transcrito a un mRNA que contiene
productos proteicos son tladucidos cuando ia célula se expone a una agre- copias de los genes para las proteínas
sión; por ejemplo, calor, in'adiación o bajas concentraciones de oxígeno. En ribosómicas L1 l y 11. Cuando se han
estas circunstancias, se observa deplesiór-r giobal de la traducción dependien- ocupado los sitios de unión a Ll en las
te de la capet:uza (como se cornenta en la pr'óxima sección). Pol lc"r tanto, la moléculas de rRNA 23S disponibles,
plesencia de IRES en los mRNA de "supelvivencia" permite que éstos pre- Ll se une a la región 5' no traducida
del mRNA" Io que bloquea la iniciación
senten traducción pleferencial cuando se necesitan sus pt'oductos.
ulterior de la traducción. (B)
Regulacién de la síntesis de la proteína
f?*¡:t;!;::i*:; #: l;: inirl*ri;;:t tí* i* ti**:":,-i,¡¡. ferritina en los mamÍferos. La proteína
de respuesta al hierro se une a la
La iniciación de la traducción es un punto de control importante de región 5' no traducida del nrRNA de
la síntesis ploteica, sobre la que se pueden ejelcer dos tipos de regu- ferritina cuando no hay hienq lo que
lación. El primero es la regulación global, que irnplica una alteración impide la síntesis de ferritina.
general del grado de síntesis proteica que tiene iugar: y que afecta en
medida sirnilar a todos los mRi§A traducidos por ei mecanismo de la
J

caperuza. Esto se suele logral por fosforilación del eIF-2, que detel-
mina represión de la iniciación de la traducción ai impedir que elF-2
se una a la mo1écula de GTP que necesita antes de que pueda trans-
portar al IRNA iniciador a la subunidad pequeña del ribosoma. La
fosforilación de elF-2 sobreviene durante aglesiones como choque
tét'mico, cuando disminuye el nivel globai de síntesis proteica y se
pasa a la traducción rnediada por IRES.
408 Capítulo 1l Sintesrs y procesanriento del prolecma

La regulación especí{lca de transcritos implica *""*,r*o. que actúan

sobre un solo transcrito o un pequeño g:r-r1po de transcdtos que codilican pro-
teínas relacionadas. El ejemplo de regulación específica de transcr:itos citado
con n"lás frecuencia cr:rresponde a los operones de los genes de proteínas
rib<¡sómicas de E. coli (figura 13.17A). La región iíder del mRNA transcdtc
a pafik de cada operón contiene una secuencia que actúa como un sitii: rle
unión para una de las proteínas codificadas por el opetón. Cuando esta pro-
teína es sintetizada, se puede unir o bien a su posición en el RNA ribosó;:r!-
co, o bien a la región 1íder del mRNA. Se favorece la unión al rRNA y ésta
tiene lugar si hay rRNA libres en la célula. [Jna vez que todos los rRNA libr:es
se han ensamblado en dbr¡somas, la proteína ribosómica se une a su mR§A,
1o que bloquea la iniciación de la traducción y, así, desactiva la síntesis ulte-
rior de proteínas dbosómicas codificadas por ese mRNA particular Eventos
similares que involucran a otros mRNA garantizan que la síntesis de cada
proteína ribosómica esté coordinada con la cantidad de rRh{A libre de la rf
c,élula. Otras proteínas con capacidad de unión al RNA, como alg¡:nas ami- §
Sitio P Sitio A noacil-tRNA sintetasas, también emplean regulación específica de transcritos l-
de manela similar a las proteínas ribosómicas.
\¿l i ,l
t'
Un segundo ejemplo de regulación específica de transctitos, observada en los r8
j.;rr]d@ 3',
mamíferos, coresponde al mRNA de fenitina, una proteína de depósit* de
hier-ro (figur:a 13.17F*). En ausencia de hielro, la síntesis de ferritina es inhibi-
da por proteínas que se unen a secuencias liamadas elernentos de respuesta al
lngreso de un f hierro, localizadas en ia región líder del mRNA de fer:ritina. Las proteínas uni-
aminoacil-tFlNA + das bloquean al dbosoma cuando éste intenta barer el mRNA para buscar el
en un s¡tio aceptor codón de iniciación. Cuando hay hieno, se desprenden las proteínas de unión
y se traduce el mRNA. Cabe destacar que el mRNA de una proteína rehcio-
É .: &,::.:.
nada --el receptor de transferrina involucrado en la captación de hiero-
también tiene elementos de respuesta al hierro pero, en este caso, el
desprendimiento de las proteínas de unión en presencia de hiero no
induce la traducción del ¡IRNA, sino su degradación. Esto es lógico por-
que, cuando hay hien'o en la célula,1os requedmientos de actividad del rccep-
-*r¿ tor de tr¿rnsfenina son menores, ya que hay menos necesidad de importar Ill
Enlace hien:o del exterior.
Formación de ' ,..,.-. /; peptÍdico l--
t, I
enlace peptídico Asirnismo. la iniciación de la traducción de a1pl.lnos mRNA bacterianos \,1
t
*&j
u:
q@ puede ser regulada por RNA cortos, que se unen a secuencias de reconoci- ii)
miento dentro de los mRNA. Esto no siempre impide la traciucción, pues IU
alg:nos RNA cortos también pueden activar ia lraducción de uno o más de
sus mRl\A cfiana. Por eiemplo. el RNA de E. ct¡lí, denominado OxyS, mide
1 :::- -- 109 nucleóticlos de longitud y regula la traducción de alrededor cle
ti,
,Y 40 mRNA. El peróxido de hiclrógeno y otlos compuestos de oxígeno::eac-
tivos, que pueden provccar daño oxidativo a la célula, activan la síntesis de
OxyS. lJna vez sintetizado, el OxyS activa la traducción dc algunos m§.N4,
Translocación clryos plocluctos a5.r:clan a proteger a la bacteria contra el daño oriclativo'
y desactiva la tladucción de otlos mRNA, cu1,os productos serían perjudi*
ciales en estas circunstancias. Se describieron las estructuras fonnadas
cuanclo Ox-vS y otros RNA cortos, reguladores, se unen a sus mRNA cliana.
pero éstas no aportan ningún dato sustancial respecto de cómo es mediado . .r:

el ploceso regr-rlaclo¿ sobre todo porque las estructttras folmadas con lo-s
*AX¡ que són silenciaclos -q.,", p.esumiblemente, actitan por blcquear el ü¡
Figura 13.18 Elongación de la tra- acceso de la subunidad pequeña del ribr¡soma al mRNA* no plesclltan
ducción. El diagrama muestra los diferencias er.iclentes respecto de las estructuras form¿ldas con los lltL¡-A
eventos que se producen durante un cuya traclucción se activa.
solo ciclo de elongación en
Escherichio col/. Véanse detalles
sobre la traducción en los euc¿riontes \ t-t- . "-"", r-f"rr§¡-1-'!,'Í.- ,1 !" ; l:,-{*¡-:"!
en el texo. Al¡revialuras: fM, N-formil-
metionina; J treonina. Las principales diferencias entre la traducción en bacterias y eucarion-
 Participación del ribosoma en la sintesis de proteínas 4{'9

:,ii.il
i.rlia: Figura 13.19 Sitios irnportantes del
ribosoma. La estructura de ia izquier-
:lr-' da es la subunidad grande del riboso-
ma de Thermus thermophilus; la de
la derecha es la subunidad pequeña.
':,,, Las vistas muestran las dos super{icies
,t.:t.,', que contactan entre sf cuando las
subunidades se ubican juntas para
&r"' formar el ribosoma entero. Se marcan
los sitios A, P y E, y cada uno está
::.:.::.

.,:'1,

:::
ocupado por un IRNA ilustrado en
rojo o naran.la. La parte principal de
ti

cada IRNA está inmersa dentro de la

subunidad grande, y sólo los bucles y
los brazos del anticodón están asocia-
dos con la subunidad pequeña. Las
tes se producen durante la fase de iniciación: los eventos que sobrevie- partes del ribosoma que forman los
nen después que la subunidad grande del ribosoma se asocia con el com- contactos de puenteo importantes
plejo de iniciación son similares en ambos tipos de organismos. Por io entre las dos subunidades están rotu-
Iadas como B 1a, etc. Reimpreso con
tanto, podemos tratarlos juntos, investigando qué sucede en las bacte- auiorización de Yuspov et al., Science,
rias y mencionando las características distintivas de la traducción en los 292,883-896.@2001 AA 5.
eucariontes cuando sea opoi'tuno.

I' " .,""-..i :..- :-. '-- ':.

La unión de la subunidad glande crea dos sitios a los que se pueden unir
los ¿rminoacil-tRNA. El prin'iero de ellos, el sitio peptidilo o sitio P, ya
está ocupaclo pol el TRNAN{et iniciador', cargado con lú-formilmetionina
o l¡retionina, y apaleado pol' sus bases con el codón cle iniciación. El
segundo, el sitio aminoacil o sitio A. cubre el segr-rndo ci:dón en el
marco de lectura abiel'to (figura 13.18). Las estructuras reveladas por'
cristaloglafía de rayos X muestran que estos sitios están ubicados en 1a
caviclad entre las subunidades grande y pequeña de1 ribosoma: la inter
acción coclón-anticodón se asr:cia con la subunidad pequeña y el extre-
mo aminoacil del IRNA, con la subunidad grande (figura 13. 19).

E1 sitio A es ocupado por el aminoacil-tRNA apropiado que, en E. roli, es lle-

vado a la posición por el factor de elongacién EF-14, que garantiza que sólo
los IRNA que ilevan elaminoácido correcto puedan ingresar en el ribosoma,
mientras que los IBNA cargados de manera errónea son rechazados en este

Cuadro I5.4 Factores de elongación para la traducción bacteriana y eucarionte

Bacterias
Er
LI 'Iñ1A Dirige al siguiente IRNA a su posición correcta en el ribosoma
EF-] B Regenera EF-lA después que este úhimo ha liberado la energí.a contenida en su molécula de CTP unida
Ft_ , Medra Ia translocación

Eucariontes
eEF- I Complelo de cuatro subunidades (eEF-ia, eEF-1b, eEF-1d y eEF-1g);dirige al siguiente tRNA a su
posición correcta en el ribosoma
ótrtr a
Media la transloc¿ción

Obsérvese que los factores de elongación bacterianos han sido redenominados recientemente. Las designaciones anter¡ores
eran EFTu, EF-Ts y EF-C para EF-lA, EF-l B y Ef-2.
410 Capiiulo l3 Sint*sis y protesar-niento del prcirorna

pllnto. El EF-1A es un ejempk: de proteína G. 10 que signiiica que se Llne a

una rnolócula de GTP a ia que puede hidrolizal'para iiberar energía' En los
eucariontes, el f'actr:r equivalente se denomina eEF-1, que es un complejo de
cu¿itro subunidades: eEF- 1a, eEF- 1 b, eEFr- I d --v eEF- 1g (cuadro 1 3.4). La pr:i-
mera de éstas existe al menos en dos forrnas: eEF-1al y eEF-1a2. Que -s¡¡
proteínas mu-\'- sirlilares con funciones probablernente equivalentes en dife-
rentos tejidos. Los contactos especílicos entl'e e1 IRNA. el n"rRNA y 1a sub-
unidacl pequeña clel r:Rl§A dentro del sitic-r A gat'antizan que sÓlo se ar:epte 11
tRl§A colt'ecto. Estos contactos pueden discriminar entre una interaccicr¡
codón-anticoclón en la que se han tbrmadr: los tre,s pares de bases y una en
la ha-v uno o más pares incon:ectos. lo que señala que ha5, un IRNA er:'Óneo.
Es probable qr-re ésta sea sólo una parte de una serie de salvaguardas que ase-
guran la ex¿ictitud de1 proceso de traducción.

Cuando el anlinoacil-tRNA ha ingtesado en el sitio A. se forma un enla-

ce pcptíclico entl'e los dos aminoácidos, 1o cual involuct'a a una etlzima
peptidiltransferasa, que libera a1 aminoácido del ¡Q§{i\Iet 1'. después,
lbmra un enlace peptíilico entl'e este amiiroácido y el unido al segunclo
IRNA. I-¿r i'eacción depende de energía y requier:e la hidró1isis del CTP
uniclt¡ a EF-1A (eEF-1 en los eucarionles). Esto clesactiva e1 EF-1A. quc
cs eyect¿ldo d¿l ribo-solna y l'egenel'aclo pot'EF-18. No se ha identif icaclo
un equivalerrte eucalionle de EF-181'' es po-.ibie qlle una de ias suhrtni-
dades de EF-1 tenga activiclad regeneradola.

Ahora, e1 dipéptido cr:rrespondiente ¿i ]s"s primeros dos coclones clel nlarccr

c1e lectura abiertc¡ sc Ltne al IRNA er'¡ el sitio A. El siguiente paso es la frans-
locación (r,.áase fignra 11.18), dumnte la cual el t'ibosonra se dcsplitzli tles
rTucleóticlos pol el libosotna, de ntanet'a que trn nuevo cr:clÓn ingl'es* en el
-sitio A. iisto ciesplaza a1 dipéptido-tR\lr\ a1 sitio P, lo que. a su Yez. desplaza
al IRNA des¿rcilado. En los eucatiot"ttcs, el tRN¡\ clesacil¿rclo es simpletllcnte
el,ectado clel dbosom¿l pelro, en las b¿¡ctelias, es elirnin¿rcio a través de Lllt¿t tcl'
ctr:a posición: el sitio cli salida o sitio E. A1 principio. sc considcraba qtic e.lc
sitio ir:¿r un simple punto de saiicla del dbosonrat ahora se sabe QUr. tit'ile uflil
palticipación importante en garantizar qllc la transloc¿tción ciesplac* al ribrt
,unlo á 1o largo del i¡RNA precis:rmentatres nucleóticlos. lo cual lscgtrra cltrc
el ribosonra mantenga el nlarco cle lectura coll'ecto.

Nunca se ha aislado Lríla proteína

1a actir.idacl c1e peptidiltransfei'¿is¿t
tíclicos dulante la traclucción. En la
falta de éxito, por [o nrenos en las
especilicada por parte clel rRNA
ribozima (sección 12.2.4).

Cuando a p:'ir-rcipios de la clócacla c1e 1980 se detemrinaron por pritnera wr

las cstrtcür:as áparcacl¿rs por bases clel IRNA (véase
\ ----- figura
--c- 1i.l t), nt' 1*
hablaba cle la poiibiliclad áe que una molécula de RNA pudiese t.nel'aÜtl-
 Participación del ribosoma en la síntesis de proteínas {It

tidail cnzimática, 1a-s ritrozinras no se efec-

pllL's los descubdl¡rientos soble
.-¡
tual'on ha-<ta 1982-1986. Por 1o tanto, inicialmente se a-cisinaron funciones
L1 0
sólo estructurales a los RNA del ribosorla y sus con{,¡rmaqiones apar-eadas
por brr.'-s sr' cünsídcralon andamiajes a los que se unían los componentes
i:¡rlrtantL-s d.'l rib¡si¡ma: Ias proteíras. A finales de la década de 1980.
cüu'lürlzaron a surgil prüblL'mas ri-.specio de esta inteÍpletaciÓn. 1'a que
habíl dilicullacles par:a identific¿r la pr:uteína o las proteínas respcnsables
de l¿r actividad catalític¿i centlaldel ribosoma: 1¿r fbrmación de enlaces pep-
tídicos. Para ese entorrces. se había establecido la existencia de ribozinras v
los biologos moleculares cornenzaron ¿t pensar con sel'iedad en la posibili-
dad cie que los l'l?.NA cttmpliesen una función enzimática en la síntesis pt:o-
teica. Fala investigiir esta hipótesis, e¡a necesario iocalizal con plecisión e1
sitio cle actividad de pepticliltransferasa en el ribosoma. A 1o largo de lo,s
añcs. los antibióticc'¡s y otlos inhibidores de la síntesis plcteica han desem- Flgura I3.2ü Localización de una
peñaclo un papel importante en k:s estudir¡s de función de los ribosonras. molécula de CCdA-fosfato-pu romici-
En 199r, se sintetizó un nuevo inhibiCor, denominado CCdA-f'osiato-puro- na dentrc de la subunidad grande
del ribosorna bacteriano. Se muestran
micina, que es un compuesto anáiogo de la estructura inten-r-ledia fi¡rnrada partes de ias proteínas ribosómicas L2,
cu¿irdo di:s anrinoácidr:s se unen por cle¿ición de un enlace peptídico 13, L4 y Ll0. Se indican las distancias
durante la síntesis proteica. La CCdA-fosfato-pulomicina se une estrecha- en nanórnetros entre la molécula de
mellie a1 dbosoma bacteriano 1: clada su estructura, este sitio de r,rnión ciebe CCdAJosfato-puromicina (lustrada
estal justo en le posición donde se fonrlan los enlaces peptídicos en el rilrc- como un punto rojo) y cada proteína.
sollrÍ¡ f'Lrilcionante. En consecuencia. se recun'ió a 1a cristalogratía de rayos
X 1:ala levelar con exactitud el lugar de unión de la CCdA-fosfato-puromi-
cina dentlo de la subunidad gr ande. Su posición es prolunda dentt'o clel
clle::po de la subunicl¿id. estrechamen¡e asociada c<¡n el IRNA 25S de la
subr"r¡ridad g:ande, pero il 1,84 nm de la proteína más cel'cana, L3, 1, algo
mls alejerda dc L2, L-l;* Ll0 (figura 11.2ü). En tóuninos atómicos, l-2 nm
es un¿l clistanci¿t ilasiv¿r. 1o que hace inconcebible quc- la síntesis ciel enlace
peptíc{ico pueda ser catalizada por alguna de estas cuarro proteínas. Por 1o
tanto, 1a posiciórr de CCdA-fo,.fato-pr-u'omicina aporta eüdenci¡r conviu-
cente c1e que la pepfidil transl'elasa es un¿l ribozima.

Ahot'a que se l-ra obteniclo esta evideneia, los investigadores desean cleren-ui-
1')¿ll"con exactitud cómo actúa el esqr,releto de IRNA colr-]o una ribozima en
la forrnación de enlaces peptídicos. A1 pdncipio, se concentró ia atención en
un nucleóticlo c1e adenina, en la pi:sición 2.451 dei rRNA 25S de E. coli, por.
quc esfa adenina tiene plopiedades cie carga infrecuentes en compalación
coi"r otlos nucleótidos. La hipótesis eÍa que una interacción entle esta adeni-
na y una guanina cercana, en la posición 2.447, es la clave de la síntesis pro-
teica. Pero este niodeio ha sidr: cuestionaclo en estudios de mutaciones, que
han rlostrado que. aunque el reemplazo de A2451 pol r-rracilo reduce la velo-
cidacl de síntesis de eniaces pepddicos un 99o,á, tanto A2451 como G2447
pueclen ser t'ee:iplazaclos por otros nucleótidos sin efecto detectable. Pol lo
tanto, se está ciirigiendo la atención a las otlas partes clel rRNA 23S que esrán
locillizadas en la yecindad del sitio ¿rctivo.

{t;:;:i:;ir:: C*l rnr;rc* *l* le;t:¡r* y *trr::; *'-:*ürí}s ir:{r*:x*¡:t*s

Cl. .,.,.;i, 1... t--,'erl,ir,._t,J.l
SL'consiclela que lzi tr¿iclucción directa, coción por coclón, de un mRNA es la
nlanera c-onyencional de sintetizar proteínas. Pero se está descubriendo un¿r
cantidad creciente de eventos c1e ek:n-eación iinfrecuentes. Uno de éstos es el
carntrio de marco de lectura, que se procluce cuando un dbosoma hace un¿r
p¿lusa en el medir¡ de un mRNÍA, retrocede un nucleótido o, con nlenor. fre-
cuencia, ay.tnza un nucleótido, y de.spués continúa la traducción. El resulta-
dt es que los codones leídos después de la pausa no están en contigiiidad con
la serie precedente de codones: residen en un marco de lectura difelente
(figura 13.21A).
412 Capítulg 13 Sinlesis y procesamiento del prctecma
(A) Cambio de nrarco de lectura programado en el mRNA de
{B) Deslizamiento de traducción en el mRNA del operón de lactosa
,..UGUCAAAAAUAAUAAUAACCGGGCAGGCCAUGUCUGCCCGUAUUUCGCGUAAAGGAAAUCCAUUAUGUACUAUUUA..,
ó .*, " a-"-- --- -
(C) Puenteo de traducción en el mRNA del gen 6A de T4
.GAUGGAUAGCCU UCGGGCU,qUCUAUAGAAAUACCUCAUAAU
Figura 13.2 1 Tres eventos in{recuen-
tes de elongación de la traducción
en §scherichia coli. (,A) Cambio de
marco de lectura programado durante
la traducción del mRNA de dnaX.
Durante la síntesis de la subr-rnidad y,
el ribosoma retrocede un nucleótido,
inmediatamente después de una
serie de A. Él ribosoma insert¿ un
ácido glutámico en el polipéptido y,
después, encuentra un codón de ter-
minación. (B) Deslizamiento entre los
genes lacZ y locY del mRNA del ope-
rón de lactosa. (C) EI puenteo duran-
te Ia traducción del mRNA del gen 60
del bacteriófago T4 implica un salto
entre dos codones de glicina. Véanse
las abrevi¿turas de una letra de los
aminoácidos en el cu¿Cro 1.2.
dnaX
.
ACCAAÁGCAAAAÁAGAG UGAACc¿GCAGCc..
4.. a.'
^I
I
f,r^-^-LU uE
lvtal l^ ¡cLLut
t^^¡..-^ d
Deslizamiento
UAAGAGAU UAU UGGAUUAGGC..
Puenteo
Los cambios de marco de lectura espontáneos son aleatolios y pei:judi-
ciales. porque el polipéptido sintetizado después de éstos tiene una
secuencia incorrecta de aminoácidos. Pero no todos los cambios clel
nlarco de lectura son espontáneos: ul-]os pocos mRNA utilizan L1n cam-
bio de rnarco de lectura programado pa1'¿] inducir'¿ll ribosoma a cambiar
cie marco en un punto determin¿rdo del transcritc. El cambio cle nr*rco
de iectura programaclo ocurre en todos los tipos de olganismos. clcscle
bacterias hasta seres h:-imanos, así como clurante la expresión de diver-
sos genorlas virales. Se observa un ejemplo dulante la síntesis de la
DNA polimerasa III en E. coli, la principal enzima involuclacla en l¿t
replicación del DNA (seccjón 15.2.2). Dos de las subunidades cie la
DNA polimerasa III. y y 1, sorl codificaclas po1' u11 solo gen, cln«X. Lrt
sr-rbunidad r es ei producto de 1¿l traducción de longitucl completa dcl
mRNA cle clnoX, mientras que la subunidad r es una versión acort¿icla.
La síntesis cle y implica un cambio de malco c1e lectura en el nreclio del
nrRNA c1e dnuX: el ribosoma encuentl'¿t ur-r coclón de terminación intrle-
diatamente después del cambio de marco de ieciura,\,, por 1o tanto. pro-
duce la versión ytruncacla clel producto cle tladucción. Se ccnsidcra quc
el cambio de marco de lectura es inducido por" tlcs características ilel
nrRNA cle ,/¡¡,¡\':
* Una horquiila, ubicacla inmecliatamenle clespuós de la posielurt tlel
cambio dc, nr¿ll'co de lectura, que atasca al ribosorna.
¡a Una secuenci¿i sir-llilar a un sitio de unión al ribosoma inmediírliulten-
tc corriente ar:¡'iba de la posición del cambio cle ilarco de lcctur'¿1. qttc
se c,onsider¿) qllc se apare¿1 por sus bases cor-l el r:RlrlA l65 (conlci Io
r
fl
hace un sitio de ur:ión ¿ll ribosonra autóntico), 1o que vuclve a pi'ovo-
car atascamiento ciel ribosoma.
r
* El coclón 5'*AAG-".i'en la posición clel cambio c1e marco c1c lc.tut¿r'
La presencia cle un nucleótido rnoclificaclo en la posición de titubcc
 Participación del ribosoma en Ia síntesis de proteínas 4t3

riel tilNAl.vt, que decodifica 5'-AAG-5', si¡¡rilica que la interacción El codón de terminación
c*ción-anticodón es relativamente débil en esta posición, io que posi- ingresa en el sitio A
bilita e1 cambio de marco de lectura.

Un f"enómeno similar *deslizamienta tslippage) de ia traducción- pennite

que un solo ribosoma traduzca un mR|{A que contiene copias de dos o más J

serle: {figura 1i.218). Esto implica, por ejemplo, que un solo ribosoma
-pu..lc
sintetizar las cinco proteínas codificadas por el mRNA transcrito a par-
tir del operón de triptófano de E coli {véase figura B.BB). Cuando el riboso-
tr:-r.: i 1i::j , ir;
ma ¿ilcairza el finalde una serie de codones, libera la proteína que acaba de I
f'abricar, se desliza al siguiente codón de iniciación y comienza a sintetizar la
Factor de liberación
siguiente proteína. Una fon¡a más extrema de deslizamiento es el puenteo
de traducción, en ei que se salta una parte más grande del transcrito, quizás -t
algunas decenas de pares de bases y continúa la elongación de ia proteína ori-
ginal después del evento de puenteo (figura 13.21C). Elpuenteo comienza y
termin¿l o bien en dos codones idénticos o bien en dos codones que pueden
ser traducidos por el mismo IRNA mediante titubeo. Esto sugiere que el salto
es controlado por el IRNA unido alpolipéptido en crecimiento, que barre el
rnLNA a medida que el ribosoma avanza y detiene el puenteo cuando alcan-
za un nuevo codón al que se puede aparear por sus bases. En E. coli, se obser- .:r: ..;l::'i:: fll ll:t..:f *"f
va puenteo de traducción de 44 nucleótidos durante la traducción del rnRNA
dcl gen 60 del bacteriófago T4, que codifica una subunidad de la DNA topoi- Polipéptido completg .-
somerasa. También se han identificado eventos similares en una variedad de
otras bacterias. El puenteo podría determinar que se sinteticen dos proteínas ffi;*¡ I

diferentes a partir de un mRI.{A -una proteína por traducción normal y otra

por puenteo- pero todavía no se sabe si ésta es su función general.

§S"?.{ Yxrx}§s}*e§mu: d* §x *rxc*¿i*x§*§§

La -síntesis de proteínas finaliza cuando se alcanza alguno de los tres codo-
nes de teminación (figura 13.22). Ahora, ingresa en el sitio A no un IRNA,
r-'
sino un factor de liberación proteico (cuadro 15.5). Las bacterias tienen
tres de éstos: RF-1, que l'econoce 1os codones cie tenninación 5'-UAA-3'y
5'*UAG-3'; RF-2, que reconoce los codones de teminación 5'-UAA-3'y
5'-UG.4.-5'; y RF-3, que estimula la liberación de RF-1 y RF-2 de1 riboso-
ma después de la teuninación, en una reaccj.ón que requiere energía obte-
nirla por hidrólisis de GTP. Los eucariontes tienen sólo dos factores de
liberación: eRF-1, que l'econoce los tres coclones de terminación, y eRF-3,
quc poclría desempeñai'e1 mismo papel que RF-3, aunque esto no se ha
probado. La estructura c1e eRF- 1 se ha resuelto por clistaioglafía de rayos
X, que mllestra que la fonrra de est¿r proteína es muy sinlil¿rr a la de un Figura 13.22 Terminación de la traduc-
tRi\fA (figur:i 13.23). Esto llcva a un nroclelo en el que un factor de libera- ción. Se ih-rstra la terminación en
ción simula la estructura de un IRNA 1,, por ende, puede ingresar en el sitio Escherichio colr. Véanse las diferencias
A cuando se alcanza el coclón de temrinación. Si bien este moclelo es inte- en los eucariontes en el texto. El amino-
ácido rotulado con una 'A' es una alani-
res¿u1te, otros estuclios sugieren que e1 factol de liberación adopta una con-
na, Abreviaturas: Rf, factor de liberación;
folrnación diferente cuando está asociaclo con r1n l'ibosoma, que es nlenos RRI factor de reciclado ribosómico"
similar a la forma de un IRNA.

Los factores de liberación ten-¡rinan la traclucción, pero no parecen ser res-

ponsables de la disociación de las subunidades ribosómicas, por lo menos, no
en las bacterias. Ésta es la función de otla proteína denominada factor de
reciclado ribosómico (RRn que, al igual que eRF-l, tiene una estructum
simil¿rr a la del IRNA. Es plobable que el RRF ingrese er-r el sitio P o en el
sitio A 5, "desbloquee" al riirosoma (véase figura 13.22). La disociación
requiere enelgía, qlle es libcrada del GTP por el EF-2, uno de los factores de
eiongacién, y tan,bién exige que el f¿rctor cle iniciación IF--l irnpida que 1as
subunidacles vuelvan a unirse. No se ha identificaclo tin equivalente eucarion-
te del RR.F y ésta pirede ser un¿i de las &-rnciones de eRF-5. Las subunidades
irl{ Capítulo 13 Sintesis y procesamiento del proteoma

Cuadro '13.5 Factores de liberación y de reciclado ribosómico en bacterias y eucariontes

§iü*iitt:'t:"tt:tt:':":; Función
r r:l,rl:ir:I:i::iiiii:liii':i:
I

Bacterias
RF-1 Reconoce los codones de terminación 5'-UAA-3'y 5'-UAC-3'
RF-2 Reconoce los codones de terminación 5'-UAA-3'y 5'-UCA-3'
RF-3 Estimula la disociación de RF-l y RF-2 del ribosoma después de la terminaciÓn
KKI- Factor de liberación ribosómico, responsable de disociar las subunidades ribosómicas una vez
finalizada la traducción

Eucariontes
eRF- I Reconoce el codón de terminación
eRF-3 Pásiblemente estimula la disociación de eRF-1 del'ribosoma tras la terminación; quizá haga que las
subunidades ribosómicas se disocien despúés de la terminación de la traducción

Figura I3.23 La estructura del factor

de liberación eucarionte eRF-'l es
simiiar a la de un IRNA El panel
izquierdo muestra el eRF-l y el panel de
Ia derecha, un IRNA. La parte del eRF-l
que se asemeja al IRNA está destacada
en blanco. El segmento púrpura de eRF-
I interactúa con el segundo factoi de
liberación eucarionte, eRF-3. Reimpreso
de heno! Biochem. Sci., 25, Kisselev
and Buckingham, Transitional termination
Anticodón
comes o{ age, 561-566, 2O00, con
ar-rtorización de Elsevier
',,,/.f ,1;11L:,,;111,,;,,,,,:'

ribosómicas disociadas ingresan en la mezcla citoplasrnática, donde pelma' -.§!t ¡...1,;

necen l-rasta que welven a participar en otra ronda de traducciÓn. ....-...
,ri:;,¡,.t.",, .,,,

}'
t -s
¡¡ *""á.r'
$t ¡ .. rr':
Trr¡d¡rrri4¡¡
truusLLltr{r ci: l¡q,
¡{)J ;¡rrr{tr*nhme
t¡! i']luLU {efiu,:S i;lfChAe¡i
Las descripciones anteriores hacen referencia a eventos que ocurl'el :-. ñ,r ,,.,,,'." .

durante lair:aducción en bacterias y eucariontes. No debeinos ignolar el'"'':":":"'?'"'

segundo grupo de procariontes, las atqueobacterias 1', por io tanto' ,¡l¡,1.ii, '''rrirrr',l
seluiremJs adelante con uÍla breve revisión de 1o que se sabe acerca de ' l'.ll§iii"..r

En la mayoría de los aspectos, ia tladucción en las alqueobacterias se ase' ":::ll!.;,:::t::,::,:,:,::.,,

meja más estrechamente a 1os eventos equivalentes en los eucariontes que ii'l,!§l)ii:ii:
en las bacterias. La única excepclón evidente es que el ribosoma al'queo- -

bacteriano, con un coeficiente de sedimentación de 70S, tiene un tamano':g,#**,t

comparable con el de los ribosomas bacterianos 5', al igual que éstos. cli' ,,.';,; ,,,:,:":,,:':;;
tiene rRNA 23S, 165 y 55. Esta aparente similitud esllusorlia, porque t"t,.:l;)$,,lZlli,li
rRNA arqueobacterianos loman fbman estructuras secundarlas aparcaua5 ttor
secundarias apareadas v."'':§§;:,.r1,,t
§§;.:,r'¡¡.
sus bases que son significativamente cliferentes de las estructuras bactena- .,,,,§S§t::".
nas equivaientes. Lai estructufas de rRNA arqueobacteriano también §on '-r':§':.':.::rr".r'''
clifer:entes cle las versiones euca¡iontes, pero las proteínas ribosómicas aue ,,. *,::.§,:
se unen a los rRNA son homólogas de las proteínas eucarlontes'

Los n:RNA arqueobacterianos están encapuchados y poliacienilaclos"! ;1:;;t'L!!;'";;":';1t::L:t::t:

se consicleru q* lu iniciación de la tr:aclucclón consisie én ut proceso

dc

barriclo similar a1 descrito para los mRI''lA eucariontes. Los IRNA ;

 Proces¡rniento postraducción de las proteínas ¡rt5

Polipéptido@

p¡egamiento Degradación proteolitica Modiflcación química Corie y empalrne de inteínas

§ección Sección Sección Sección
13.3.'l 13.3.2 13.3.3 13.3.4

Y,
* --¡ **_L_ e§&e Figura 13.24 Esquema de los cuatros
l
tipos de eveñto de procesamiento
Nuevo grupo químico Posición de la postraducción. No todos los eventos
inteína eliminada se producen en todos los organismos.

arqurobacterianos presentall algunas características singulares, como ia

ausencia de timidina en el llamado brazo TYC de la hoja de trébol y la
presencia en diversas posiciones de nucleótidos modificados no observa-
dos en las bacterias ni en los eucariontes. La metionina que lleva e1
rRl'iA iniciador no está l{-formiiada, y los factores de iniciación y elon-
gación se asemejan a 1os de las moléculas eucariontes.

§ ffi.§ ffirwsmsmrmammtrx sl"n sgredasee§&ax

tS*: l**
-.t* 7Wd
jr.h ***e*;**-
g#* **tM*4tdh
M& @'ryqhB¡tH*
s
La traducción no es el final de la vía de expresión del genoma. El poli-
pépticlo que emerge del ribosoma es inactivo y, antes de adquirir su
papel funcional en ia célula, debe sufrir al menos el primero de los
siguientes cuatro tipos de procesamiento postraducción (figura 13.24):
* Flegamiento de las proteínas. El polipéptido es inactivo hasta que se
pliega ei1 su estluctura terciaria co|recta.
;u l)egradación proteolítica. Algunas proteínas son procesadas por
eventos de corte llevados a cabo por enzimas denominadas protea-
sas. Estos eventos de corte pr:eden elirrinar segmentos de uno o de
ambos extremos del polipéptido, 1o que da origen a una foma acor-
tada de la proteína, o pueden cortar el polipéptido en una serie de
segmentos cliferentes, todos los cuales, o algunos, son activos.
* Modificación química. Cada arninoácido del polipéptido podría ser
rnodificado por unión de nuevos grupos quírnicos.
* Corte y empalme de inteínas. Las inteínas son secuencias interpuestas en
algunas proteínas, de modc¡ similar a los intrones de los mR\A. Se las
debe eliminar y ligar las exteínas pa1'a que la proteína se vuelva activa.

A menudo, estos distintos tipos de procesamiento tienen lugar jturtos, y el

polipéptido se corta y modifica a.l mismo tiempo que se pliega. Si éste es el
c¿rso, pueden sel necesarios los eventos de corte, modificación o colte y
empalme para que el pr:lipéptido adopte su confornación tridimensional
correcta, porque ésta depende, en parte. de 1a posición relativa de los diver-
sos grupos químicos a 1o largo de la molécuia. Como alternativa, se puede
producir uo evento de corte o una modificación quírnica después que ia
proteína se ha plegado, quizá corllo parte de un mecanismo regulador que
convierte una proteína plegada, pero inactiva, en una forma activa.

V,?§"3"3 tr§xgmx'xi.xxz** *.x &x* prl*i*íá*ffi§

En la sección 1.3.1 examinamos los cuatro niveles de estructura proteica
(primaria, secundaria, telciaria y cuatemaria) y aprendimos que toda la
¡tl6 Capítulo I3 Síntesis y procesamiento del proteoma
Figura 15.25 Desnaturalización y
renaturalización espontánea de una
proteína pequeña. A medida que la
concentración de urea aumenta a 8
M, la proteína se desnaturaliza por
desplegan^iento: disminuye su activi-
dad y aumenta la viscosidad de la
solución. Cuando se elimina la urea
por diálisis, esta pequeña proteína
vuelve a adoptar su conformación ple-
gada. La adividad de la proteína recu-
pera su nivel original y disminuye la
viscosidad de la solución.
ri
f. .j"
*\ -)*
^-..á
\-:!'€K-
YJ
Desplesada , , ::T::lamente
- plegdud
lncorrectamente p¡egada
Figura 13.26 Una proteína incorrecta-
mente plegada podría ser capaz de
volver a plegarse en su conformación
correcta. La flecha negra representa la
vía de plegamiento correcta, que lleva
de la proteína no plegada, a la izquier-
da, a la proteina acfiva, a la derecha. La
flecha roja lleva a una conformación
incorrectamente plegada, pero esta
conformación es inestable, y la proteina
puede presentar un desplegamiento
parcial, regresar a su vía de plegamien-
to correcta y, pcr últirno, alcanzar su
conforn.¡acrón actrva.
*¿
"t
&''*'-%
r -11, i.
§1' 1*
§/ Y t':
{á arye-,
vJ
rj:Ii;1§i*ia i-1;:
Concentracion de urea (M)
información que requiere un polipéptido para plegalse en su estructura tri-
dimensional correcta está contenida dentro de su secuenc,ia de amir"loáci-
dos. Éste es uno de los principios básicos de la bir:logía molecular. For lo
tanto, es necesario analizar su base experimental y considerar cómo se uti-
lizala infonnación contenida en esta secuencia de aminoácidos durante el
proceso de piegamiento de un polipéptido recién traducido.
' , ', ::- .-: ,
.^ * t
', ^ i ....
... ,.; ....
"r;
El concepto de que la secuencia de aminoácidos contiene toda la inior-
o
L mación necesaria para plegar ei polipépticlo en su estructura ttreiaria
** correcta deriva de experimentos llevados a cabc con libonucie¿isa en la
t década de 1960. La ribonucleasa es una proteína pequeña, de sólo 12¿l
aminoácidos de longitud, que contiene cuatro puentes disull'uro !' pre-
senta una estluctura terciaria fortnada, predominantemente, por: hoja [i,
con rnuy poca hélice c¿. Se estudiÓ el pleganiiento de ribonucleas* qut
había sido purificada de páncreas bovino y resuspendida en solución
amortiguadot'a (bulfer). Ei agregado de ul'ea, un compuesto qllc rompe
los enlaces de hidrógeno, deterninó una disminución de ia activi.iacl de
Ia enzima (medida por investigación de su capacidad para cortár'R"l'iA)
y un aunrento de 1a viscosidad de la soluciÓn (figura 13.25),lo que 1ildi" :"
có que la proteína era desnatu ralizadapol clesplegamiento ,l','
na polipeptídica no estructurada. La observación crucial"n";;;¿.'
fue que, al
elirninar la urea por diálisis, la viscosidad disminuía y reaparecía la acti' '
vidad de la enzima, La conclusión es que la proteína se vuelve a plcgar ..,,,.
de manera espontánea cuando se eiimina el agente de desnaturalizacién ¡,'¡
(en este caso, urea). En estos experimentos iniciales. los cuat¡o enlaces ,,,"'
disulfur:o permanecieron intactoi, porque no fueron destruick:s pol l* '
urea, pero se obtur.o el mismo resultado cuando se combinÓ e1 trala-
mientó con urea y el agregado de un agente reductor para t'olll1rer los
enlaces disulfuro: aun isí,*se recuperabá |a activiclacl con ]a renaturali" ':
zación. Esto muestra que ios enlaces disulfi-rro no son cruciales para qu( I
1a proteína vuelva a plegarse, simplemente estabilizan la estructLlla tcr- :
ciaria una vez que ásta ha sido adoptada. ,
EI estudio más detallado de las vías de plegan-riento
ribonucleasa y otras proteínas pequeñas ha llevado a
cripción general del proceso en dos pasos:
 Procesamiento postraducción de las proteínas 417

§ Los molivos esructurales secundarir:s de la cadena polipeptídica se

foLnr¡n al cabo de uncs pocos milisegundos de haber elirlinado el
agf,ntü de desnaturalización. Este paso se acompaña por el colapso
de la proteína en una organización compacta, pel'o no plegada, con
slrs grupüs hicirófobos del lado interno, protegidos del agua.

* Dulante los siguientes segundos o minutos, los motivos estructul'ales

securrlarios interactúan entre sí y, de manera gradual, la estrtctura ter-
cinda toma foma, a menudo a través de una serie de conlbrmaciones
inrelmedias. En otras palabras, la proteína sigue una vía de plegarnien-
to. §in embargo. una proteína puede seguir más de una vía posible
paril alcanzar su estl'uctura piegada correcta. Las vías tami:ién pueden
tenef Ían-las laterales a las que se puede desviar la proteína, lo que
detet'mina una estmctula incorrecta. Si ésta es suficientemente inesta-
ble, puede haber de-splegamiento parcialo completo, lo que otorga a la
proteína una segunda oportunidad de seguir una vía productiva hacia
su confomación con'ecta (figura 13.26).

Durante varios años se supuso en mayor o menor grado, que todas 1as pro-
teínas se plegarían de rnanera espontánea en el tubo de ensayo, pero algu-
nos expet'imentos han mostrado que sólo las proteínas más pequeñas cor-r
estr¡:cturas menos complejas tienen esta capacidad. Dc¡s factores parecen
impedir el plegamiento espontíineo de las proteínas más grandes. El prin-re-
ro es su tendencia a fomar aglegados insolubles cuando se elimina el agen-
te de desnaturalización: los polipéptidos pueden colapsar en redes
entrelazadas cuando intentan proteger sus glupos hidrófobos del agua
dur¿rnte e1 paso uno de la vía de plegamiento general. Esto puede eviiarse en
forma experimental utilizai-rdo una baja dilución de la pr:oteína, pero ésta no
es un¿r r:pción a la que la célu1a pueda recunir para evitar la agregación de
sus proteínas no plegadas, El segundo factor que irnpide el pleganriento es
que una proteína grande tiende a quedar adherida en l'amas later'¿rles no pro-
ductivas de su vía de plegamiento y adopta una fblma intermedia que estár
incol'rectamente plegada, pero qlle es demasiado estable para presentar
algún g'ado significativo de desplegamiento. También se han planteado pre-
ocup:rciones acerc¿i de la relevancia del plegamicnto in vitlo, estudiado con
dbi:nucleasa, respecto del plegamiento de ias proteínas en la célula, ya que
una proteína celular podría comr:llzar a plegalse antes cle haberse completa-
do su síntesis. Si e1 plegamiento inicial se produce sólo cuando se dispr:ne
de palte del polipéptido, podría haber mayor posibilidad de seguir 1'amas
incon'ectas de la vía de plegamiento. Estas diversas considei'aciones instaron
a ir-n'estigar el plegamiento en células viv¿rs.
-i}"
....:.i:;"

§* j::¡l ,:*l¡-:l*s i;.:; :i:r:p',r,i"{:¡j,::: ,f¡t;::lrjr:L..r.i;r*g t:;\,;,-:*::!} r:i ¡i*6rr:,r''';:.:',':':i*

La mayor parte de nuestlo conocimiento actuai sobre el plegamiento cle las
proteínas en la célula se basa en el descubrimiento de proteínas que ayudan '-"''#1:'^-Ribosoma
$*" Polipéptido
a otras a plcgalse. Éstas s" denominan chaperonas (carabinas) moleculares ;##,
y se las ha estudiado con máximo detalle en E. coli. Es evidente que tanto los
Proteínas Hsp70
euc¿uiontes como las arqueobactedas tienen proteínas equivalentes, aunque unidas a regiones
difieren en algunos de los detalies de su mec¿rnisnro de acción.
',1':. -/' hidrófobais

Las chapelonas moleculares puedr,n divicUrse en dos gltlpos:

* Figura 13.27 Sistema de chapero-
L¿rs chaperonas Hsp70, que incluyen las pt'oteínas denominadas nas Hsp70. Las chaperonas Hsp70 se
I{sp70 (codificada por el gen clnaK en E. c'oli y llamada, a veces, plo- unen a regiones hidrófobas de poli-
teína DnaK), Hsp40 (codificada pot tlrtul) v CrpE. péptidos no plegados, incluidos aque-
* Las Ilos que todavia están siendo
chaperoninas, cr-ry¿r principal r'ei'sión es el conrplejo traducidos y mantienen a Ia proteína
GroEL,/GroES presente en las bactel'ias y los eucariontes, y TRiC en una conformación abierta para
hallado sólo en lcs eucarionles. ayudar a su plegamiento.
 '§§"

418 Capítulo 13 Siniesi: / -r!'cts3-rielto Jr :r,ticD,ra

Ftgura IJ.2U LnapefOnln¿

CroEL/CroES. A la izqurerda, una
vlsta clesde a p¿re s'-per'cr. , l la
certchd, ur¿ vi:t¿ drsd': la pafe .aic-
t2 I A oc icr ';: ^ f I nr l¡ n:.'tr
CrcES le la estru«ura es:é
rorn¿ 13
)rClü ^ L' ' ''' - DTlr:,:¿s'Jt,--
>uuullluduc>
PU¡ l

t,cas y se ilus::a er d¡raCo. L,:s cor:-

ponentes Cr,:EL son 1ul proteínas
idénticas dispuestas en dcs anrllos
(ilustraclos en rr:jo y verde), que con-
tienen, cada uno, siete subunid¿des.
La princrpai entrada a Ia cavidad ce¡-
tral es a través de la parte inferior Ce
la estructura mostr¿da a la derecha.
Reimpreso con autorización de Xu e¡
ol., (1997) Ncture,388, 741-750. Las chapetonas ntoleculales no especifican la estructura telciaria de una
proteína, sólo ayr-rda¡ a ésta a hallar sL1 estl'uctllla col'reot¿l. Los dos tipos
de chaperonas 1o hacen de cliferente maflet'¡. La familia Hsp70 se unt a
las regiones hidrófobas de las ploteínas desplegadas. incluiclas proteínÍi"§
que todavía están siendo tladucidas (figur:a 13.27). Mantienen a 1a pr:r:-
teína en una confolmación abielta y ayudan al plegamiento, presumible-
mente por modula¡ la asociación entre las pat:tes dei polipéptido qr-ie
interactúan en la pt'oteína plegacla. Si bien no se conoce con exactitu<lel
'.a.
mecanismo, éste implica la unión y el desprendimiento reiterados de la
proteína I-lsp70, y cada uno cle estos ciclos requiele energía provista por
1a hidrólisis de ATP. La proteína LIsp70, ade¡rás c1e unirse al polipépd-
clo diana, tiene actividad de ATPasa y, pol ende, puede liberar esta ener-
gía. pero sólo puede funcionar de manela eficiente con 1a ayucla cie
Hsp,10 y CrpE. Hsp4ü estimuia la activid¿rd cle ATPasa de FIsp7O y GlpE
elin-rina de1 iomplejo la molécula de ADP (en la que se convielte el ATP
ras 1a liberaciói:r c1e energía). 1o que permite Ia reiniciación de1 ciclo.
Además del plegarniento de las ploteínas, las chapelonas F{sp70 inter-
vienen en otros p.ocesos que exigen protegel las regiones hidr'Ófobas de
las ploteínas, como el tlansporte ¿r trar,és de membranas, la asociáción
de proteínas en contplejos c1e rnirltiples subunirlades y la clesagregae ión
de pi:oteínas que han sidt¡ dañadas por agresión térmica.

Pnlinántil6 Las chapeloninas actúan de rnanera bastante diferente. GroEl- y

I'ti¡¿;,,;}¡r;l].];trlii;l1¡;,i';;,',»{l]:i»; GroES fornran una estructura de mírltiples subunidades, que se pare-
ce a una bala huec¿r con u1'ra caviclad central (figu¡a 13.28). En la cavi-
daci,
- ---, ingresa
__-o_ Llna sola ploteína no plegacla Y emerge plegada. ir'o se
Procesamiento Prccesamienio conoceil mec¿rnis¡ro, pero se sugiel'e que el colnplejr: ClroEI-/GroES
terminal de poliproteína actúa como una jaula que impide que 1a proteína r-ro plegada se ¿lgl'e-
gue a ot1.as p.ot.inur, )i qr" lá "*r-,perficie interna cle la c¿rvidad cambie
Segmento terminal i1e hichófoba a hi<irófiia.- cle rnanel'a que promueve que los aminoác.i-
desechado
-1-.
clos hicllófobos querlen inmersos cleniro áe la proteína. Ésta no es.la
única hipótesis: ótros inyestigadores sostienen que la cavidad desplie-
Proteína activa 3 proteínas activas
ga las pioteínas incorrectamente plegadas y }¿is clevuelr.,e al citoplasnla,
de modo que puedan tenet una seguncla opol'tuniclacl de adoptar sLt
estructura terciaria correcta.
Figura 13.29 Procesamiento de pro-
teínas por degradación proteolítica. Aunclue tanto la fatnilia cle chapelgÍlas Hsp70 co1110 1as cl-raperoni-
A la izquierda, la proteína es procesa- nas GIoEL/GroE,S están presentes en los eucariontes, pa1'ece qLle ' en
da por eliminación del segmento estos organismo-s, ei plegamiento de las proteínas depende prineipal'
N.terminal. En algunas proteinas, tam- mente cle 1a acción áe las proteínas FIsp7O. Es probable qu'- esto
bién hay procesamiento del
C-terminal. A la derecha, se procesa un¿
tail:Ibión sea vá1ido el-I 1a.i bactet'i¿ls, auÍIque las chaperoninas
poliproteína p¿ra que dé origen a tres G¡oEL/GroES pueclen clesenlpeñat'ur-r papel importante en el plega-
proteínas diferentes. No todas las protei- miento cle enzimas nletabólicas v c1e p.oteinai involucradas en la
nas sr-rfren degradación proteolítica. transcripción y la traducción.
 Procesamiento postraducción de las proteínas {19

§iti*§ d* cürlia Figura 13.30 Procesamiento de la

,
ll llt
--r *. -,i s ;
I I J I* I
tr F á F "X
!l A § A p r,&
I
ü ; fi ¿ r L ti'd LT T* : r A L : §
"¡1
I |',. l1 li itr] * *
promelitina, el veneno de abeja.
Las flechas indican los sitios de corte.

3.3"X Pr*e*smr::§exEt* p*r *e§rxdxci**x prm&e*§*t§c*t

La rlegradación proteolítica cumpie dos funciones en el
procesamiento
traducción de las proteínas (figura 13.29):

i Se utiliza para eliminar fragmentos cortos de las regiones tetminales

l.l o C de los polipéptidos, lo que deja una soia molécula acortada que
se pliega en la proteína activa.

Se ernplea para cortar poliproteínas en segmentos, todos los cuales

o algunos son proteínas activas.

Estos elientos son relativamente comunes en los eucariontes, pero

menos frecuentes en las bacterias.

,,1'§cr¡¡*t*cídr d* /*s *xfr*rnfs d# p*lrpdpfidns

,El procesamiento por degradación es común en los polipéptidos secre-
rtadbs, cuyas actividades bioquímicas podrían ser perjudiciales para la
que produce la proteína. Un ejemplo es 1a melitina, la proteína
:::"-" ¿élula
más abundante en ei veneno de abeja y la responsable de provocar lisis
i , , , ' celular tras la inyección por la picadura de abeja a la persona o el ani-
, ,1 mal picado. La melitina lisa las células en las abejas y en otros animales,
.,,.,...,;,1

, por ir: que deiie ser sintetizada, inicialmente, como un precursor inacti-
,. vo. Este precursol la promelitina, tiene 22 aminoácidos adicionales en
,l su extt'emo N. La presecuencia es eliminada por una proteasa extracelu-

§r!ptid*
1.,iiii:y:¿ ¿
..'';;.l.].]ll...:.::.*j@üPreproinsulina Figura '13.3I Procesarniento de la
t preproinsulina.
I
ü*:l* Eliminación del
péptido señal

..... .;,r,;r.:.:rrr.::rr.::: §::l$l¡L¡¡*.§;* Proi nsulina

t Formación de
ir;: lri
+ Puentes disulfuro

I
á
r'l l:l::'ir»e
-ii:,:lr'lll

:a,. ¡
'a,. r.t. ::.
'l::.. 1
:'.lllijy'r,*]1rff]w!i@ !
+I
i
d)::r',i:
I Eliminación de
I la cadena B

i:
::.. rri lnsulina
**** '-*:---....
. " "i ""-""- -
i---*:--
..

tl
 ''ir---]:.Er
i,,. '
.

Capítulo 15 Sír:lesis y prccesamiento del protecma

P roopiomelanocorlin a lar que la corta en las posiciones I 1 , lo que Libcr.¿r ia proteína acti'a dei
veneno. La proteasa no clegrada clentro de Ia secuencia activa. porqLle sll
I modo cle acción consiste en liber¿rr ciipéptidos con la secr-rencia X-\',
donde X es alanina, írcido aspártico o ácido glutámico, e Y es alanin¿l o
ACTt-t fi-LPH prolina: estr:s motivos no aparecen en la secuencia activa (figura 1i.51)).

1,MSH aMSH CLIP

&
1-LPH p-ENDO
*
BMSH ME
Figura 13^32 Procesamiento de la
poliproteína proopiomelanocortina.
Abreviaturas: ACTH, ¿drenocorticotrcfi-
na; CLIP, proteina del lóbulo interme-
dio simrlar ¿ corticotrofina; ENDO,
endorfina; LPH, Iiporrofrna; ME,
metencefalina; MSH, melanotrolln¿.
Se observa un tipo de procesamiento similar con la insuljna, la ploreÍna iiibri,
cader por 1os islotes de Leurgerhans del páncreas de los vertebrados y respún-
sable de contrclar ios niveles de glucemia. La insulina es sintetizada culi:
preproinsulina, que tiene 105 aminoácidos c1e longitud (figura 13.11). L¿i via
de procesamiento implica la eliminación de los pdmeros 24 aminoácidos
para liberar proinsulina. lo que es seguido de otlos dos cortes, que escinden
un segmento central y dejan dos partes actiyas de la proteína, las cadenas A
¡r B, que se unen por creación de dos enlaces clisulfuro para forrlar insulina
madura. El pr:imer segxlento que se debe eliminar. los 24 aminoácidos clel
extremo N, es un péptido señal, una extensión nluy hidrófoba de ¿rminr:áci-
dos que {ija la proteína precursora a una membrana antes del tr¿lnsporte a
travós de la membrana y al exterior r1e la célula. Se suelen hallar péptidos
señales en las proteínas que se unen a r¡ernbranas o las atlavies¿rn, ta1-lto en
los eucadontes como en los procariontes.

§¡* * es s,,:: íss f* p rsf ss 1/fr¡* dc p *l;p rc f*i¡l *s

En los ejernplos de las figuras 13.30 y 13.31, el procesamiento proreoli-
tico determina una sola proteína madura. No siempre esto es así,
Algunas proteínas son sintetizadas al principio como poliproteínas, poli-

Cuadro I3.6 Ejemplos de modificaciones químicas postraducción

1.,..':r:.:.,::iiirii,ri:l

Adición de grupos qulmicos pequeños

Acetilación Lisina Histonas
Metilación Lisina Histonas

Fosforilación Serina, treonina, tirosina Algunas proteínas involucradas en la

tr¿nsducción de señales
Hidroxilacrón Prolina, lisina Colágeno
N-formilación Clicina N-terminal Melitina

Adición de cadenas l¿terales

hidrocarbonadas
Clucosil¿ción ligada a O Serina, treonin¿ Numerosas proteínas de membrana
y proteínas secretadas
Clucosilación ligada a N Asparagina Numerosas proteínas de membrana y proieí-
nas secretadas
Adición de cadenas laterales lipldias
Acilación Serina, treonina, cisteína Numerosas proteínas de membrana

N-miristoilación Clicina N-terminal

Algunas proteincinasas involucradas en l¿
tr¿nsducción de señales
Adición de biotina
Biotinilación Lisina Divers¿s enzimas carboxilasas
 Procesarniento postraducción de las proteínas

*r*
,L,l* §1&{iP i.: Mr** A* M*M¿:f Figura i 3.33 Modificación postraduc-
¡I \t I i I illi
1

H3 A RT KQTA ñK S TGG K A P R KQ L AT K A R K S A P ción de la histona H3 de mamíferos.

Se muestran todas l¿s modificaciones
conocidas que tienen lugar en esta
región. Abreviatur¿s: Ac, acetilactón;
péptidos largos que contienen una serie de proteínas maduras ligadas de
tule, metilación; P, fosforilación.
fianera cabeza-cola. La degradación de la poliproteína libera las proteí-
ll¿rs individuales, que pueden tener funciones muy diferentes entre sí.

Las poliproteínas no son infrecuentes en los eucariontes. Varios tipos de (A) Glucosilación ligada a O
virus que infectan células eucariontes las utilizan como manera de reducir :i r;]
el tamaño de sus genomas: un solo gen de poliproteína con un promotor y
un teminaclor ocupa menos espacio que una serie de genes individuales.
En los vertebrados, las poliproteínas también par:ticipan en la síntesis de
hormonas peptídicas. Por ejemplo, 1a poliproteína llamada proopiomelano- I

cortina, fabricada en Ia hipófisis, contiene por 1o menos diez hormonas o

I

peptídicas diferentes. Éstas son liberadas por degradación proteolítica de la I

I

pcliproteína (figura 13.32), pero no todas pueden ser producidas a ia vez O CH,
debido a la superposición entre secuencias peptídicas individuaies. En cam- ilt
bio, el patrón de degradación exacto difiere en distintas células. llII
-c-c-N-HH
3 3.§.§ Pr*:cesarsxie¡xt* psr rt:$dilásseión qu{r*§cx (B) Glucosilación ligada a N
Los genomas tienen la capacidad de codificar 22 aminaácidos diferentes: 1os
20 especificados por el código genético convencional, selenocisteína 5, (por lo §ie §!e .3i::

menos, en las arqueobacterias) pir:rolisina; estos dos últimos se insertan en

üiii *el U:r:
los polipéptidos por reasignación dependiente del contexto de 5'-UGA-3'y
5'-UAG-3', respectivamente (sección 1.3.2). Este repertorio aumenta de il- ;/'- U: -:\*- -' ,l ,'
manera sustancial por mr:dificación química postraducción de las proteínas, :\
: '". ,/
-

que determina una vasta sede de diferentes tipos de aminoácido. Los tipos i,lrn,.--- _.".
*,4**.
-'"
de modificación más simples se producen en todos los organismos; los más 1..1an""

complejos, sobre todo la glucosilación, son raros en las bacterias.

*l*ld,{*
:

Los tipos más simples de modificación química consisten en añadir un ---

grupo químico pequeñr: (p. ej., un grupo acetilo, metilo o fosfato: cuadr<;
13.6) a una cadena lateral de un arninoácido, o a los glupos amino o car-
l-
NH
boxilo de los arninoácidos terninales de un polipéptido. Se han dr:cu- i
I

mentado más de 150 aminoácidos modificados diferentes en distintas C-0

I

proteínas, cada rnodificación se lleva cabo de manela muy específica y los I

O CH,
mismos aminoácidos son modificados del mismo modo en todas ias copias
cle la proteína. La figura 13.33 ilustra esto para la histona H3. El ejemplo
llt
nos recuerda que la modilicación quími*r suele desempeñar un papel cen- lt
-c-c-N-HH
lt
tral en la determinación de la activiclad bioquímica precisa de la proteína
cliana: en la sección 10.2.1 vimos cómo la acetilación, ia metilación y la
fosforilación c1e las histonas H3, y ctras, ejelcen una influencia inlpoltan- Figura 13.34 Clucosilación. (A)
te en la estructura de la clomatina y, por ende, en la expresión del geno- Clucosil¿ción ligada a O. La estructura
ma. La modificación química cumple varias otras funciones reguladoras; mostrada se halla en diversas gluco-
la fosforilación, en particular, se utiliza para activar muchas proteínas proteínas. Aquí, se la ha dibulado
involucradas en ia transducción de señales (sección 14.1.2). unida a un aminoácido serina, pero
también puede estar ligada a una tre-
onina. (B) Por 1o general, Ia glucosila-
Un tipo de modificación más complejo es la glucosilacién, la unión de crón unida a N determina estructuras
grandes cadena-s laterales hidrocarbonadas a polipéptidos. Hay dos tipos hidrocarbonadas más grandes que las
generales de giucosilación (figura 13.34): observadas en la glucosilación ligada a
O. El dibujo presenta un ejemplo típi-
co de un glucano complejo unido a
l, Glucosilación ligada a O: es 1¿r unión de una caclena lateral hidrocarbo- un aminoácido asparagina.
nada a través del grupo oxhidrilo de un aminoácido serina o treonina. Abreviaturas: Fuc, fucosa; Cal, galacto-
sa; Cal NAc, fu-acetilgalactosamina;
* Glucosilación ligada a N: implica la unión de una cadena lateral hidro- CIcNAc, tu-acetilglucosamina; Man,
carbonada a través del pSupo amino de la cadena lateral de aspalagina. manos¿; Sia, ácido siálico.
 427. Capítulo ll Síntesís y procesamrento de{ prcteoma

lnteína La glucosilación puede deterrninar la unión a la proteína de grandes estruc- 1..... ,,

l
turas que comprenden redes ramificadas de l0-20 unidades hidrocarbona-
das de diversos tipos. Estas cadenas iaterales ayudan a dirigir las proteínas _

a sitios particuiares de células y a determinar la estabilidad de las proteínas

Corte y empalme que circulan por el torrente circuiatorio, Otro tipo de modificación en gran
I
escala implica la unión de lípidos de cadena larga, a menudo a amii:.,-
ácidos serina o cisteína. Este proceso se denomina acilación y se obser..a
en numerosas proteínas que se asocian con membranas. Una modificaciór1
Figura I5.35 Corte y empalme de menos frecuente es la biotinilación, en la que se une una molécula de hjo-
inteínas. tina a una pequeña cantidad de enzimas que catalizan la carboxiiación ile
ácidos orgánicos, como ácido acético y ácido propiónico. :

§3.3"q inxetn*5
El último tipo de procesamiento postraducción que cabe considerar es el
corte y empalme de inteínas, una versión proteica dei corle y empalme de
intrones, más extenso, que se observa en los pre-RNA. Las inteínas son seg-
mentos intemos de proteínas eliminados poco después de la traducción, con
la consiguiente unión de los dos segmentos extemos, o exteínas (figura
13.35). En 1990, se descubrió la primera inteína en S. cerevisiae, y, hasta
ahora, se han confirmado sólo 100 identificaciones. Pese a su escasez, las
inteínas están difundidas en diferentes organismos. La mayoúa cor-responde
a bacterias y arqueobacterias, pero también hay ejemplos en los eucariontes
inferiores. En algunos casos, una sola proteína contiene más de una inteína.

La mayoría de las inteínas tienen alrededor de 150 aminoácidos de longi-

tud y, como los intrones de los pre-mRNA (sección 12.2.2),las secuencias
de las uniones de corte y empaime de ias inteínas tienen cierta similitud
en la mayoría de los ejemplos conocidos. En particula¡ el primer aminoá-
cido de la exteína corriente abajo es cisteína, serina o treonina. Tanlbién
están conservados algunos otros aminoácidos dentro de la secuencia de
inteína. Estos aminoácidos conserwados intervienen en el proceso de corte
y empalme, que es autocatalizado por la propia inteína.

Se han conocido hace poco dos características interesantes de las intei

nas. La primera fue descubierta cuando se determinaron las estr-ucturas :
de dos inteínas mediante cristalografía de rayos X. En algunos aspectos, c

estas estructuras son similares a la de 1a proteína de Drosophila denami- r

I
Gen que contiene ¡nteína v
l
:|:.W
L

el
v
d,
\nscrincion ci
El DNA de ci
la inteína salta Traducción
Figura i3.35 lnsercíón alélica iiW,t
(homing) de inteínas. La célula es
heterocigota para el gen que contiene T
I
inteína: tiene un aleio con la inteína y
un alelo sin la inteína. Tras el corte y
ffi
I Corle Y
] emoalme
empalme de la proteína, la inteina
corta el gen sin inteína en el lugar
Corte por t 'r:"
apropiado. Esto permite que una
la inteina l -
copia de la secuencia de DNA de .ffi
t.$rey4'
lnteína
inteina salte a este gen, lo que lo
convierle en la versión con inteína. Gen sin inteína
 Degradación de las proteínas

nada l-ledgehog, que participa en el desarrollo del patrón de segmenta-

ción del embrión de mosca. }{edgehog es una proteína de autoprocesa-
miento, que se corta a sí misma en dos. La simiiitud estructural con las
inteínas reside en ia parte de la proteína Hedgehog que cataiiza su auto-
degradación. Es posible que la misma estrructura proteica haya evolucio-
nadc dos veces, o que las inteínas y la Hedgehog compartieran un
eslabón común en alguna etapa del pasado evolutivo.

La segunda característica importante es que, en algunas inteínas, el seg-

mentü escindido es una endonucleasa específica de secuencia. La inteí-
na corta el DNA en la secuencia correspondiente al sitio de inserción en
un gen que codifica una versión de la proteína sin inteína de la que deri-
va (figura 13.36). Si la célula también contiene un gen que codifica la
proteína con inteína, la secuencia de DNA para la inteina puede saltar,
entünces, hacia el sitio de corte, lo que convierte a1 gen sin inteína en la
versión con inteína, un proceso denominado inserción alélica (horning)
de inteínas. Se observa el mismo tipo de evento en algunos intrones del
grupo I (sección 12.2.4), que codifican proteínas que dirigen la inser-
ción alélica (homing) de intrones. Es posible que también haya habido
transferencia de inteínas e intrones del grupo I entre células o, incluso,
entre especies. Se considera que éste es un mecanismo por el que se
puede propagar el DNA redundante (sección 18.3).

X§"-3 ffimgrmaámq*F*ww de §ms ffire**áffie§

Los eventos de síntesis y procesamiento de proteínas estudiados hasta
ahora en este capítuio dan origen a proteínas nuevas, activas, que ocu-
pan su lugar en el proteoma de la célula. Estas proteínas o bien reempla-
zan a las existentes que han alcanzado e1 final de su vida de trabajo, o
bien iiportan nuevas funciones proteicas en respuesta a los cambiantes
requerimientos de Ia cé1ula. El concepto de que elproteoma de una célu-
la puede cambiar con el tiempo exige no sólo síntesis de noya de prote-
ínas. sino también ia eliminación de las proteínas cuyas funciones ya no
son necesarias. Esta eliminación debe ser muy selectiva, de modo que
sólo se degraden las proteínas correctas y también debe ser rápida para
coillpensar ios cambios bruscos que sobrevienen en ciertas condiciones,
por ejemplo, durante las transiciones claves en el ciclo ceiular^

Durante muchos años, la degradación proteica fue un tema inescrutable

y sóio en la década de 1990 hubo avances reales en ei conocimiento de **p*rriz:l
la relación entre eventos proteolíticos específicos, y procesos corno el
cicio celular y la diferenciación celulal. Aún en Ia actualidad, nuestro
conocimiento está centrado, en gran medida, en descripcir:nes de las
vías generales de degradación de las proteínas y, ntenos, en la reguiación i 'i il *.1, ¡
de l¿ls vías y los mecanismos empleados para apuntar a proteínas espe-
cífic¿rs. Parece haber una serie de tipos diferentes de vías de degrada-
ción, cuyas interrelaciones todavía no han sido rastreadas. Esto tiene
particular validez en 1as bacterias, que parecen tener una serie de prote-
asas que trabajan juntas en la degladación controlada cle las proteínas.
En los eucariontes, 1a mayor parte de la degradación depende de un solo
sistema que involucra la ubicuitina y el proteasorna.

En 1ü75 se estableció pol primera vez Lin nexo entre ubicuitina y degrada-
ción proteica, cuando se obseryó que esta abundante proteína de 76 ami-
Figura 1 3.37 Proteasoma eucarícnte.
noáciclos participa en reacciones proteolíticas dependientes de energía. en Los componentes proteicos de ias dos
células de conejo. Investigaciones ulteriores identificaron Llna serie de tres caperuzas se ilustran en naranja y rojo,
enzimas que unen moléculas de ubicuitina, aisladas o en cadenas, a amino- y los que forman el cilindro, en azul.
 ,,:,6'
.... :

424 Capítulo 13 5íniesis y procesamienio del protroma

ácidos lisina cle proteínas que son dianas para la degradación. También hay
proteínas similares a la ubicuitina, como SUMO, que actúan de la misma
mallera que la ubicuitina. Que una proteína sea ubicuitinizada o no depen-
de de la presencia o la ausencia de motivos de aminoáciclos que act(ran
como señales de susceptibilidad a la degradacién. Estas señales no han sido
totalmente c¿rracterizadas, pero se considera que hay al menos diez tipos
clife¡entes en S. cerevisiae; por ejemplo:
n N-degron, un elemento de secuencia presente en el extremo N de una
proteína.
r Secuencias PE§T, secuencias intelnas ricas en prolina (P), ácido glu-
támico (E), serina (S) y treonina (T).
Estas secuencias son características perrnanentes de 1as proteínas que las
contienen )', por 1o tanto, no pueden ser "señales de degradación" direc-
tas: si 1o fueran, estas proteínas serían degradadas en cuanto fueran sin-
tetizadas. En cambio, deben detenninal susceptibilidad a la degradación
y, por consiguiente, ia estabilidad general de una proteína en la célula.
Todavía no se sabe con claridad cómo podría relacionarse esto con la
degradación contlolada de determinadas proteínas en rnomentos especí-
ficos; por ejernplo, durante el ciclo celular.

Ei segundo componente de la vía de degradación dependiente de la ubicui-

tina es el proteasoma, la estl-uctura dentro de la cual se deg"r:adan las pro-
tcínas ubicuitinizadas. En los eucariontes, el proteasoma es una gl:an
estructura de múltiples subunidades con un coeficiente de sedimentación
cle 265, que consiste en un ciiindro hueco de 20S y dos "caperuzas" de l95
(figula 13.37). Las arqueobacterias también tienen proteasomas de aproxi-
madamente el misrno tamaño, pel'o son menos complejos; están compues-
tos por múltiples copias de sólo dos proteínas, mientras que los proteasomas
cle los eucariontes contienen 14 tipos diferentes de subunidades ploteicas.
La entrada ¿r la cavidad del proteasoma es angosta y una proteína clebe
estar desplegada para poder ingresar. Es probable que este desplegainiento
tenga lugar mediante un proceso dependiente de energía y, quizá, involucre
estl'ucturas sirnilares a las chapeloninas (sección 13.3.1), pelo con activi-
dad de desplegamiento y no de plegaraiento. Después del desplegauiento,
la proteína puede ingresar en e1 proteasoma dentro_del que se deglada en
pépticlos coltos de 4 a 10 aminoácidos de longitud. Estos r,ruelven a liberar-
se al citoplasma, donde se degradan en aminoácidos individuales, que pue-
den ser reutilizados para la síntesis proteica.

,l?¡:ql¡rrr*:§'!
EI resnltaclo final de la expr:esión del genr:ma es el proteoma, el conjuuto
cle ploteínas funcionantes sintetizaclas por una célula viva. La iclentidad y
la abundancia relativa de cada proteína del proteoma representan un equi-
librio entre la síntesis de nuevas proteínas y la degradación de Ias eristen-
tes. Los RNA de transferencia desempeñan el papel centrai en la síntesis
proteica, ai actuar como moléculas adaptadoras que fotman el eslabórr
f'ísico e informativo entre ei mRNA que se está traduciendo y el polipép'
tido que se está sintetizando. Casi todos los IRNA se pliegan en la misma
estructura apaleada por bases, cuya l'epresentación bidimensional se
clenomina hoja de trébol. El aminoáciclo óon'ecto es unido al extt'eino i'
de un IRNA por una aminoacil-tRhtrA sintetasa. La aminoacijación cs n-ru.v
exacta, porque cada aininoacil-tRNA sintet¿tsa muestra alta fideliclad por
su tRl'{A y aminoácido, y porque
-hayá también hay un mecanismo cie correc-
ción. que velifica quc se unido el aminoácido correcto al IRNA
correcto. Las interaiciones codón-anticoclón gar:antizan que se curnplan
 Resumen

las regias del código genético. §i bien el código tiene 61 tr:ipletes que espe-
cific¿ln aminoácidos, la mayoría de las céiulas tienen una cantidad de
rRi\iA inf'erior a este número. pur:s un solo TRNIA puede leer dos o más
cod.¡:res mediante el ploceso denominado titubeo. Se está investigando
cada vez con más detaile ia estructura del ribosoma mediante dil'ersas téc-
nicas, incluida la cristalografía de rayos X. La iniciación de la rraclucción
en ias bacteljas involucla la subunidad pequeña del ribosoma, que reco-
noce un sitio de unión intemo del mRb.lA, unos pocos nucleótidos corrien-
te an"iba del codón de iniciación. En los eucariontes, sólo unos pocos
r¡l?¡*A tienen sitios de unión inter-nos y el proceso más común consiste en
la unión de la subunidad pequeña del ribosoma al extrenro 5' encapucha-
do del mRNA, -seg;uicla de barlido a 1o largo del mRNA para hal1ar el
cr:clén de iniciación. Se conocen diversos mecanismos pol. los que se
puede regular la iniciación de la traducción, ya sea de manera global o en
transclitos espccílicos. El agregado de la subunidad grande del ribosoma
al complejo de iniciación perntite que comience Ia fase de elongacíón de
la traducción. La actividad central durante Ia elongación es la síntesis de
enlaces peptídicos. La fonrración de enlaces peptídicos es catalizada por 1a
ae,tividad de pepticlilttansferasa que se desarrolla dentl'o de una de las
moléculas de rRlrlA, que actúa corrlo una ribozima. Los eventos de elon-
gar:ión inlrecuentes cot"lsisten en cambios de marco de lectura progr.ama-
dos y puenteo de la traducción, este último hace que ei ribosoma saltee un
sügnlento sustancial del mRNA. La tel'minación de la tladucción involu-
cra proteínas especiales que ingresan en el ribosoma cuando se alcanza un
coclón de ter:-ninacitin. EI polipéptido sintetizado inicialmente debe ser
plegado en su esttuctura terciaria cr:rrecta y, quizá, procesado por degra-
dación proteolítica o modificación química. Algr-rnas proteínas contienen
secuencias intelcaladas denominadas inteínas, que deben ser eliminadas
por corte y erapalme proteico. En ios eucariontes, la clegradación de las
ploieínas implica ubicuitin¿lción de proteiras que son dianas de destluc-
ción, seguida de degr:adación dentro de un pt:oteasoma.
 ffisrSrS§t*d
*p;::,
ü q' ** * I *" .,,. -:; -* *-* * a *
3lhft }-si*l *§S§H *H §§ & §.w§ §§ ,'w áiÉih
s q5¡á x, B e s'r-j
ü.§
ád#*
#1.id**&;* &§ §sd *. -.s -.$ *
-; *§É':k#fl*ü t-w#\6s: i*$s'1XA'48'm $
-r-ͧ*l ;§ §
§ &.SS#
S { ¿le¡ i§ ffi Yr 3 É §s"-.6 6 d**d:h§
§ Fs*",q#$*"ir$ X§ §& *, * *
'k¡ \*e
&e ', *l :t q*§ L'á %*S E"* e fu- ü S §*J'& § § {*#
*e

{¡ry:bi*l tl¡i'r:ii*ri*i dr i: *iiir,,ill*

;^t - -^ ^.

r!i1,..,1"i^
la.¿ L{¡¡¡lJ¡U5 }r(l¡Ilülitlll{} }' )Llrli:i'!l'ii.:

¡ § r¡ ..i
I'x.3 Reguircian de l,: ¿11;uid,rr! del grrrurnn
*iur**t* *§ ef*s*rr**?*

Distinguir entrediferenciación y desarrollo, y reseñar cómo la regulación de la expresión del genoma es

la base de estos dos procesos.

Describir, con ejemplos, las diversas maneras en que los compuestos de señalamiento importados, como
Iactoferrina y hormonas estero¡des, pueden desencadenar cambios transitorios de la actividad del genoma

Explicar en detalle la represión por catabol¡tos en las b¿cterias.

Analizar las diversas vías de transmisión de señales desde los receptores de la superficie celular hasta el genoma.

Describir, con ejemplos, las diversas vías en que se pueden desencadenar cambios permanentes y semi-
permanentes de l¿ actividad del genoma, y distinguir con claridad entre los procesos que implican reorde-
namiento del genoma, los que implican cambios de la estructura de la cromatina y los que involucran
crrcuitos de retroalrmentación.

Anatizar cómo los estudios del crcto de infección lisogénica del bacleriófago tr y de la esporulación en
Bacillus subtilis aportan información básíca pertinente a la diferenci¿ción y el desarrolio-

Explicar por qué Coenorhobditis elegons esun organismo modelo út¡I, y describir cómo se determina el
destino de l¿s células durante el desarrollo de la vulva de C. elegons.

Describir los eventos genéticos que subyacen a la embriogénesis de Drosophilo melanogoster.

Analizar las funciones de los genes homeóticos en D. melonogos¿er, vertebrados y plantas.

Hernos -seguido la ví:r por la cu¿11 la expresión del genonla especilic¿l el

contenido dei proteoma que, a su vez, detel'mina la huella bioquímica cle
ia cólula. Esta huella bir:química no es po1'completo constante en nin-
gún organismo. Aun los organismr:s uniceiulares nrás sirnples pueclen
moclilic¿u'sus proteolnas par¿) tener: en cuenta los cambir:s clel merlio. cie
lnüdo que sus capacidades bioquírlicas estén sienrpre en sintonía con el
¿rporte cle nutrientes di-sponibles y las condiciones fisicoquímicas preva-
lecientes. L¿rs células de los organismos multiceh:lal'es tienen iguzrl capzr-
cidad de respuesta a los cambios clel meclio extracelul¿¡r'; la írnica
diferencia consiste en que 1os principales estímulos conrplenden hornro-
nas y factores cle crecimiento, además de nutt'ientes. Los canrbios /r¿lr¿-
sit¿;ri os que ocurren en la activicl¿id del genom¿r pei:mite n la
remodelacón continlla del proteorna p¿ira satisiacer l¿ls denlancla-s que el
mundo exterior impone a [a cé1ula (figula 14.1). Otros c¿imbios cle la
414 Capíiulo l4 Regulación de l¿ activid¿C dei genoma

acrividad del genoma son perfftut'tefites o, por 1o mc'nos senti¡teruruttatr

/es, y determinan una alteración de la huella bioquímica de la célula que
no es fácil cie revertir. Estos cambios inducen la diferenciación celular.
la aclopción por' la cé1ula clc una fune ión fisiológica especializada. Se
corlocen vías de diflr'enciación en llumerosos organismos unicelulares:
por ejemplo, la producción de esporas por bacterias como Bacil/us, pelo
asociarnos más a menudo diferenciación con olganisnros multicelulal'es.
en los que divelsos tipos de células especializadas (rnás de 250 tipos rn
los seres humanos) se organizan en tejidos y órganos. El ensamblaje rr
estas estl'ucturas multicelulares complejas y del organismo en su totali-
dad exige coordinar las actividades dei genoma en difer:entes células.

Figura 14..l Dos maneras de regula- Transitoria Permanente o

ción de la actividad del genoma. sem¡permanente
Los genes a la izquierda están sujetos
a regulación transitoria, y son actJva-
dos y desactivados en respuesta a
cambios del medio extracelular. Los
genes a la derecha h¿n sufrido un
cambio permanente o semiperma-
nente de su patrón de expresión, lo
que determina que los mismos tres
genes se expresen continuamente.
¡3ffi@1i@*ei@¿¡

.. .. .....i¡...-.,rrr*á...-.,i»;li&,.---.-,.---!*..,@,,.\tjrtij;-tae...t t
íá a§rin"rá¡ .*a* lil*ed*eüi*j**di!@¡ftr *r

Gen activo
**;;r,t:,:;2,;; Gen inactivo
w
Cambios transitorios de la actividad del genoma
; : :;:1
1;;1111:11,1'..1' ;:11 11

,.;:r::' Esta coclclinación implica c¿rn.lbios. t¿tntü tr¿lnsitorios colno pt-r'lrlzl-

. ' lll:" : ii:ill r

:
nenres. y clebe continuar por un período prolong¿ldo durante el de-
. 1' .,.,. , ..
sarroll§ del or:ganismo.
r1

t;,:,,1,,,,;t,t.,,:.::,:;.,.,;,,,,:.,,,,,;,.,

'.rr',,,. llay rrruchos pasos rle las r,ías cle expresión cle genes inciividuales que
, ,¡ , ,,1¡.,
pueden ser l'eguiado§ (cuadro 14.1). En los lugares correspondientes de
ios capítulos 10-13 -qe dielon ejemplos de las funciones biológicas cle
.¡l '., ,l'

., :i il iii

, i. I
difelentes mecanismos reguladores. El objetivo de este capítulo no es
reit.rar estos sistelxas cle contlol específicos de genes, sino explicar
.iiliil.,

cómü se regula la actividad delgenorna en su totalidad. Al hacerlo, debe-

mos recordar qlle 1¿r bioesfera es tan c{ivelsa y la cantidad de genes de
cadr genorna tan grande. que es razonai:le presuponer que cualquier
mecanismo que pudiese haber evolucionado para regular Ia expresión
del genoma probablernente Io haya hecho. Por lo t¿lnto, no es sorpl'en-
dente que podanios menoior-Ittr ejernplos de regulación para cada punto
de 1a vía de expresión del genorla. Pero, estos puntos de control ¿tienen
roch:s la misma in-rportancia p¿tra regular la actividad clei genoma en su
t<¡talidad'7 Nuestra percepción actual es que no. Nuestro conocimient<:
puecle ser imperfecto, ya que está b¿rsado en ia investigación de una can-
ticlad limitada de genes de algunos organismos, pero parece que los con-
troles cr'ít.icos sobi'e la expresión del genoma -la decisión acerca de qué
genes so11 activados y cuáles son desactivados- se ejelcen sobre la inicia-
ción de la transcripción. En la mayoría de los genes, el control ejercido
en pasos ulteriores sirve para modular la expresión, pero no actúa coilro
el determinante primario de que el gen esté activado o no (vóase figula
11.22). Por ende, la mayr:r parte de lo que analizaremos en este capitu-
k-r, ar:nque nc todo, cr:ncierne al control de la actividad clel genoma por
n'Lecanismos que especifican qué genes son transcritos y cuáles pet'ma-
necen silenci¿idos. Encalaremos dos aspectos: cómo sc desencadenan los
carnbios transitorio-. y permanentes de la actiyidad del genoma, y cómo
estos cambios están rclacionados en tiempo y espacio, en las vías de de-
sarrolio.

X #- x tr.wwwW&ww *wmwxs&kwrí'ww &* &m mq*§wi-&m&

lf
ffi::i ffi#ffii}#?'Bm
Los cambios transitorios de la actividad dcl genorna se producen, sobt'e
toclo. en respuest¿i ¿r estílnlllos externos. En los olganismos unicelulares,
los estímuios más iurportantes se relacior-r¿ln oon la disponibilidad de
nutrientes, ya que estas células vi'ner-l en medios variables, en los que las
I
iclentidades y las cantic{¿ides rehtivas de nutrientes se modifican con el
tiernpo. Por 1o t¿rnto, los genomas de los organismos unicelulares cr¡ntie-
nen genes pala la captación ¡i Ia utilización de una serie cie nutrientes. y
los c¿lmbios de disponibilidad de nutrientes son seguidos de cerca pol
,
canrbios c1e la actir,,idad clel genoma, de manera que, en un momento
dartro, sóir: se expl'es¿ln Ios genes necesarios para utilizar los nutrientes
i disponibles. l.a rl:ryorí¿r de las célula-s de los organisn"ios multicelulares
I
viven en meclios rnenos variables. pe1'o rllyo nrantenilniento requiere
coordinación entre las actividades de ciiferentes células. Para estas célu-
las, los principales estímulos externos son hormonas, factr¡t'es cle creci-
miento ,y con:lpuestos relacionados, qr:e transmiten señales dentro clel
olganismo y estimr:lan cambios coorclinados de 1a activiclacl del genoma.

Pala ejerccr un efecto soble la actir.idad del genonra. cl nutriente, 1a hot-

ülona, el factor de crccinricnto u otro cuntpllesto extracelular, que repre-
senta e1 estírrulo externo, clebe influil' en eyentos intracelulares. Puede
I hacerlo de dos maneras (iigula 14.2):
;
..i
 Capítulo 14 Regulacrón de la acli';jd¿d iel genttma

Cuadro 14.1

Paso Ejemplo de regulación

Transcripción
Accesibilidad a los genes Las regiones de control del locus determinan la estructura de la cromatina en
áreas que contienen genes (sección 1O 1.2)
Las modificaciones de histonas influyen en la estructura de Ia cromatina y
.l0.2..l)
determinan qué genes son accesibles (sección
La posición de los nucleosomas controla el acceso de la RNA polimerasa y de los
factores de transcripción a la región del promotor (sección 1A.2.2)
La metilacién del DNA silencia regiones del genoma (seccién 10.3.,l)
lniciación de la transcripción Activadores, represores y otros sistem¿s de control inciden en la iniciación
productiva (sección i 1.3)
Síntesis de RNA Los procariontes recurren a antiterminación y atenuación para controlar la
cantidad y el carácter de transcritos individuales (sección 12.1.2)

Procesamiento del mRl.lA eucarionte

Encapuchamiento Algunos animales utilizan el encapuchamiento como medio de regular la síntesis

proteica durante la maduración del huevo

Poliadenilación Los sitios de poliadenilación alternativos controlan el florecimiento en Arobidopsis

En huevos de Drosophilo, la traducción de mRNA de bicoid se activa tras la

fecundación, por extensión de l¿ cola de poli(A) (sección 14.3 4)
Corte y empalme La selección de sitios de corte y empalme alternativos control¿ la determin¿ción
del sexo en Drosophila (sección 12.2.2)
Modificación química La edición del RNA del mRNA de la apolipoproteína B da origen a versiones
específicas de hígado e intestino de esta proteína (sección 12.2.5)
Degradación del mRNA Los microRNA controlan la muerte celular, la especificación de los tipos
neuronales y el depósito de grasa en Caenorhabditis elegons, así como
muchos diversos procesos en otros eucaríontes (sección 12.2.6)

Síntesis y procesamiento de proteínas

lniciación de la traducción El hierro controla la degradación del mRNA del receptor de transferrina
(sección 13.2.2)
La fosforilación de elF-2 causa una reducción general de la iniciación de la
traducción en los eucariontes (secci ón 13.2.2)
Las proteínas ribosómicas bacterianas controlan su propia síntesis modulando la
unión de los ribosomas a sus mRNA (sección 13.2.2)
En algunos eucariontes, el hierro controla el barrido ribosómico de los mRNA de
ferritina (sección 13.22)
En las bacterias, los RNA pequeños regulan la respuesta a la agresión oxidativ¡
modulando la iniciación de la traducción de diversos mRNA (sección 13.2.2)
rl----L:-)- '' - ' . lt,rrr
Síntesis proteica EI cambio de marco de lectura permite traducir dos subunidades de la DNA
polimerasa lll a partir del gen dnoX de Escherichio coli (sección 13.2.3)
Eventos de corte Las vías de degradación alternativas de poliproteínas originan productos
específicos de tejidos (sección 13.3.2)
Modificación química
 Cambios transítoríos de la activid¡d del genoma 437

Directa, actuando como un.cornpuesto de señarización que es trans-

de -
portado a través de la membraná celular y al interior de la célula. Activación directa
el compuesto
Activación indirecta
transducción de la
-
señalización ingresa señal a través de un
Indirecta, por unión a ün receptor de la superficie celular que trans- en lacélula receptor de la
mite una señal al interior de la célula superficie celular
'.',iii r,,,r,,i:r

....,i La tra¡smisión de señales, por medios dir.ectos o indilectos, es una de

¡,',,,
,,,,,,,..i
r,,.. las principales áreas.de. investigación en biología celular, y
iu u,"""iá" g *.4"""rro,
H J,';;
,'l está dirigida, en particuiar: a su-importancia palz las activiáades bioqui- de la
superficie
,rr,,:, :, r¡icas.anormales que son la base del cáncer. Se han descubierto *.r"ho, 7
.i',,. ej.emplos de transmisión de señales, algunos de importancia general en
,,,i,,,',.,',,,i diversos organismos y otros limitados sóio a algunai
especieslEn la pri-
,rr, ,,,r,,, mera parte de este capítulo estudiamos estas vias de señalamiento.
i.,irl'. .:,:rrr,
.'.',,,t
&
I4 .I ¡r.'?fi;rntsjfil
t ,q I f --.- - ,
¿J* Se,r i.lts p:c: i;tt;)tft¡cicr: deJ
-

Ll,l i I i i,¡ {r u3 i, i.., Li 4: 5ff fl ¿l I 44 ¡"1"1 { * fr i" q} * lt*&e*-^1,,§**

r¡ il L €. e,-r,¡ ü ¡
En el método directo de transmisión de señales, el compuesto extracelu_
lar que representa el estímulo externo atraviesa 1a membrana celular e Figura 14.2 Dos maneras en Ias que
ingresa en la célula. Despu.és-de la importación a la célula, el compues_ un compuesto de señalización
to de señalamiento podría influir en la actividad del g.noá, por una de extracelular puede influir en
tres yías (figura 14.3). eventos intracelulares,

n si es una proteína, podría actuar de la misma manera que alguna de

las diversas proteínas reguradoras estudiadas en los .upítulo.- 10_1i;
por ejemplo, activando o rep,imiendo el ensamblaje ciel complejo de
iniciación de ia transcripción (sección l l.l) o interactuando con un
potenciador o silenciador de corte y empalme (sección 12.2.2).
s Podría incidir directamente en la actividad cle una proteína regulado_
ra existente. un compuesto de señalamiento de esie tipo no necesita
§er, por sí mismo, una proteína: en teoría, podría ser cualquier
tipo
de compuesto.
* Podría influir en ia actividad de una proteína reguladora existente
a
través de uno o más intermediarios, én lugar de-interactuar directa-
mente con ésta.
A continuación, se presentan ejemplos de cada uno de estos modos.

El compuesto de señalizacidn Figura 14.3 Tres maneras en las que

influye directamente
en un factor proteico
un compuesto de señalamiento
extracelular podría influir en la
actividad del genoma después de
Ia importación a la célula.'

fl :'l -" '' *-:-:f-;'it*-:

El compuesto
deseñalizacióñ
- *"*;*no,,of*,*1!ffi&.
.^ **
es un activador o ',&"'y --
T**"'lI
unrepresorde-.v Wv
^ @*".;q-f{!Y
tatranscripción . "_*$'-*H*';"*
-4@; @J'
_:::rr:t:,::i::t:lit*:rr,: - &
%
El compuesto de señalización
influye indÍrectamente
en un factor proteico
458 Capítulo l4 Regulacrón de la ¿ctivrdad del genoma

:'' ": """'"

Si el compuesto de señalización extracelular importado a la célu1a r;{ ulti}
proteína con propiedades adecuadas, ésta podría afectar directamenre ia
actividad de sus genes cliana actuando como un activador o un rcfresor
de alguna etapa de la vía de expresión del genoma. §,sto podría p¿rr"ecer
Llna fbrma clirecta e interesante de regular la actividad delgenom§, perrl
no es Lrn mecanismo común. Laruzón de el1o no es clara, pcro cr pr(
bable que se relaoione, por 1o menos en parte, c<¡n la dificultad d* r1ist.
ñar una proteína que combine las propiedades hidrófobas nece:ilrias
para el transporte eficaz a través de la membrana con las propiedades
hidrófilas requeridas para la migración a través de1 citoplasrna ¿rcuoso
hasta e1 sitio de acción de la proteína en el núcleo o en un ribosoma.
l

El único ejemplo evidente de una molécula de señalización que puede actuar

Concentrac¡ón de cobre en el medio así es la lactofenina, un¿i proteína de mamífero hallada sobre todo en la
leche y, en menor medida, en el torente circulatorio. La lactoferina es un
activador de la transcripción (sección 11.3.2). Su función especítica l,a sidu
Nutricional Tóxico
dificil de delimitar, pero parece desempeñat' un papel en las clefens¿l-u del
t -:),: organismo contra el ataque microbiano. Como su nombre lo sr-rg'iere, li: lac-
tol'enina se puede unir al hien'o y se consider¿r que por lo menos prrrtc c1e su
¡' función protectora surge de su capacidad de reducir los niveles de hierc
II
libre de la leche, 1o que priva a los microbios invasores de este cofactor esen-
9I I

,..,.
cial. Pr:r lo tanto, podúa parecer improbable que la lactofen'ina participe en
_¡&t
.,

-.
la expresión clel genoma pero, desde principios de la década de 1980, su
d sabe que la proteína tiene múitiples capacidades, entre ellas, la de unirse al
Macl p aciivo Acel p activo DNA. Esta propiedad se relacionó con una segunda función de la lactat'emi-
, na -estimulación de las células sanguíneas involucraclas en ia respucstíl
t I
inmunitaria- cuando, en 1992, se observó que esta proteína es caFlad¿i por
CTRl CUPl 1as céiulas inmunitarias, ingt'esa en sus núcleo-. y se une a1 genoma. Ccn ult*-
.. -.@@t-.,.
,s&{¡ry§ü#{it*&d¡ irs*¡&&eaÉ¿4e&irl ricridad. se demostró que ia unión al DNA ela específica de secuencia y que
.TDO
estimulaba la tlanscripción, 1o que confinr-ia que la lactoferrina es un verda'
:.....-1w-:-:--
¡' *{{(*§taa¡x* ', ¡r;:friat&{i*q*eá,
clero activador de esta última.

FfrE1 SODl :
:.,,. :;"...... . .r,'l- ::, 1 .. -: ].. .,'. t{ :,...."' 1.1.t,.':.',;;
rú *¿ryñ{ffirsá¡ ,» ;**i*i.§isi**« r, ..,.."-

¿t
Síntesis de proteÍnas Síntesis de proteínas
Si bien sólo alpunos compuestos de señalizacíónimportados puederr actuar , .
por sí mismos como activadores o rept'esores de la expresión c{el g.nonlil. I
',r),,,,r,,,,,-, ,,:

de captación de cobre
Figura 14.4 Expresión génica regu-
lada por cobre en Sacchoromyces
cerevisiae. La levadur¿ requiere baias
concentraciones de cobre, porque
algunas de sus enzimas (p. ej., cito-
cromo c oxidasa y tirosinasa) son
metaloproteinas que contienen cobre,
pero un exceso de cobre es tóxico
para la célula. Cuando Ios niveles de
cobre son bajos, se activa el factor
proteico Macl p por Ia unión de cobre
y activa la expresión de genes para Ia
captación de cobre. Cuando Jos nive-
lrs de cobre scn demasiado a,tos, se
acti,.¿ u,r segu:do faClor, ¡\ce l P, qu:
activa un conjunto diferente de genes
que codifican proteínas implicadas en
l¿ eliminacion de cobre
de eliminación de cobre
muchos pueden influir directamente en 1a actividad de las proteír:as rcgu' --.
ladoras que ya están presentes en la céiuia. En la sección 1i.3.1 se an¿rliz¡i '':',':¡ii§§,:t:::',,,:'.,.:
un ejemplo de este tipo de regulación al estudiar el oper'ón de lactosa d¿:,',,,,,.,'{,1.,.rrr':,
Escherichia ¿:oli. Este operón responde a los niveles extr¿rcelulares de lilt' "§$1,,,,:,,',,..,,,,,:;,,
tosa, y este compuesto actúa como molécula de señalización cluc itr¡t't'sir.n . j
el célu1a y, tras la ccnversión en su isómero alolactosa, influye en las pt'q,,.'ii$tilt,,,,,,,,,
pieilades de unión al DNA del represor de lactosa y. por lo tanto, detetmt:1¡:.¡¡¡;',;...,L:
'
na si el operón de lactosa es transcrito o no (véase figura 11.24).Illuchos,".,'r':§;i';''
otros operones bacterianos que codifican genes involucrados en la utiiiz¡-,,,t'1fr§r,
ción de azúcares se cont'olan de esta manera,
.'r§;¡i).-,
Asimismo, la interacción clirecta entre una molécula de señ¿rliz¿lción y r:*,,,:l¿11",,""::
¿lctivadof o un represor de la transq:ipción es un meclio común cle regulaf.iFlfilitt,illl..l]
la actividad del genoma en los eucariontes. El sistema de control qtle nrirn- ,,'*,....,,,-,.,,,,,,,1
tiene el contenid'o intracelular cle iones metálicos en un nivel aclccuado tt :...- I
un buen ejemplo. Las céiulas necesitan iones metáiicos; pcr ejemplo. e'rl'rc :
'-
]
y cinc, como cofactores de reacciones bioqr-rímicas, pero estos nt.'irrlcs sull ,,.,..,"....,,,t.,
ióri.o. si se acumulan en la cé1ula po. *r,,.i*o cte ciárto nivel. Pol lo tanto' ;
su captación debe ser controlacla con cuidado, de modo que Ia u-lula con' .i :"

't'':iffit't''''
,::.,.,ffi:;*:.,:t,::
 Cambios transitorios de la actividad del genoma

tergi:i suficientes ionús nletáiicos cuando e1 meclii: carüce dc compuestos Receptor de eslrógenos
il .,,¡:r*t',,,*-@,.......t:.kÉ-;:: ;j'», *)
netálicos, pero que no se aculnule un exceso de ellos cuanclo hay altas con-
ceñtl'aciones en el medio. El sistema de control del cobre de Succhttroftlyces
Receptor de progesterona
cera'isiae iiustra las estrategias empleadas. Esta levadut'a tiene dos activa-
dr:res de la transclipción du'pendientes de cobre: fuIac1p y Acelp. Arnbos wS
acrivaclores se unen a iones de cr:bre ¡'esta unión induce un cambio de con-
furmación que 1e pell-rite al tiictor esrimular la expresiÓn de sus ger-ies cliana Receptor glucocorticoide
{fi;ura 14.4). En el caso de N{ac1p. estos genes diana codifican proteínas l'l
cle captación del cr:bre, mientras que en el caso de Acelp, son genes que
coclifican proteínas, como la superÓrido dismutasa, que intelvienen en la 200 ami¡oácidos
eliminación del cr:bre. El equilibrio controlado por e1 metal entle ias acti-
viclodes de hIaclp,v Ace 1p garantiza que el contenido de cobte de la célu- "$ :: *4#
:".I9*:&ffi*. :ffi. " i
1a se mantetrga dentro cle niveles aceptables.
fl:: -',GB*:iffi, ffi*],,
* Flegión variable
Los activadores de la tlanscripción tarnbién son dian¿ls de las honnonas * Dominio de unión al DNA
esteroides, que son compuestos de señalización que cooldinan un espectl'o Dominio de unión a hormonas
de act'ir."idades fisiológic¿rs en 1as células de los eucariontes superiore-s.
Conlprenden las homonas sexuales (estrógenos, pa1'a ei desarrollo sexual
femenino; andrógenos, para ei desalrollo sexual masculino), y las houno-
nas glucocorticoides y rnineralocorticoides. Los esteloides son hidrófobos. Figura 14.5 Todos los receptores pro-
p,-rr consiguiente, atraviesan con facilidad la memblana celular. Una vez teicos de hormonas esteroides tienen
dentro de la cé1ula, cada honnona se une a un receptor esteroide proteico. estructuras similares. Se comparan tres
receptores proteicos. 5e muestra cada
específico, que suele esiar ubicado en e1 citoplasrna. Después de la unión,
una como un polipéptido desplegado,
el receptor activado migra hacia e1 núcleo, donde se une a un elemento de con los dos domlnios funcionales con-
respuesta horrxonal corriente arriba de un ger: diana. Una vez unido, el seru¿dos allneados. [l dominio de unión
receptor actúa como un activador de la transcripción. Los elementos de al DNA es muy simllar en todos los
resjluesta piira cadareceptor se ubican cot'riente arriba cle 50-100 genes, a receptores esteroides y presenta una
mcnudr.r dentro de potenciaclorc's, por lo que una sola honrrona esteroide identidad de secuenci¿ de aminoácidos
pr-r*de inducir un cambio en Eryan escala de las propiedades bioquímicas de del 5ooio-900/0. El dominio de unión a
hormon¿s (seccrón 11.3.2) está peor
la céiula. Todos los receptores estei'oides son similal'es desde el punto de
conseruado, con identldad de secuencia
vista estr:ctural, no só1o con respecto a sus dominios de unión al DNA, del 200,b-600/0. El dominio de activación
sino también con otras paltes de sus estrucluras proteicas (figlrra 14.5). El reside entre el extremo N y el dorrrlnro
reconocimiento de estas similitudes ha pennitido identilicar una serie de de unión al DNA, pero esta región pre-
receptores esteroides presuntos o huárfanos, cuyas asociaciones hot"monales senta escasa similitud de secuencia en
y funoiones celulares todavía no se conocen. Las similitr-rcles estructut'ales diferentes receptores.
tambión han mostraclo clue un segunclo conjunto de leceptores proteicos,
la snperfarnilia de receptores nucleares, pel'tenece a la misma clase gene- Elemento de respuesta
ral que los receptores estet'oides, aunque las holmonas con Ias que traba- AGAACA nnn TGTTCT Receptor de
jan no son esteroides. Como su nombl'e sugiere. estos receptores están TCTTGT nnn ACAAGA glucocorticoides
ubicados en el núc1eo y no en el citoplasma. Comprenden los recepto-
rcs de vitamina D3, cuyas funciones incluyen el control del desan:ollo AGGTCA nnn TGACCT RECCPTOT dE
óser:, y de tiroxina. quc estirnula la metamorfosis lenacuajo-rana. rCCAGT nnn ACTGGA estrógeno§

Los rcceptores esteroides y nucleales soll dímeros, y cada una de sus sub- AGGTCA nnNnn AGACCA RECCPTOT dE
TCCAGT nnnnn . TCTQGT ácido relinoico
uniciades tielre uno de los declos c1e cinc especiales típicos de este glupo de
ploteínas (r,óase figura 1 1.5i. Cada urio cle estos dedos cle cinc reoonoce
AGGTCA TGACCT Heceptor de
una secuencia de 6 pb de sr-r elemento de respuesta hormonal, a [a cua] se TCCAGT ACTGGA tirosina
unc. En ia mayoúa de los receptol'es esteroides, el pal de secuencias de
6 pb estírn dispuestas corlo una 1'epetición dir:ecta o invertida separada por AGGTCA nnn AGGTCA RECEPIOT dE
un espaciador de 0-4 pb (figura 1¿1.6). Los elementos de t'espuesta pat'a los TCCAGT nnn TCCAGT vitamina D
receptores nucleares son similares. excepto que las secuencias de reconoci-
miento son casi siempre repeticiones clirectas. El espaciador sirve sólo para
galantizar que la distancja entlc las secuencias de reconocimiento sea ade- Figura 14.6 Secuencias de elementos
c¡-lada para la orientación de los declos cle cinc en el receptor proteico. Esto de respuesta típicos de receptores
implica que diferentes receptoi:es proteicos pr-recien tenet' el misnto par de esteroides y nucleares. El receptor de
ácido retinoico es infrecuente, pues las
dedos de cinc, pe1'o l"econocer distintos elen-ientos de respuesta, y que 1a secuencias de 6 pb no sen repeliciones
especificidad se mantiene por la orientación de los dedos y el esi:acianien- exactas y están separadas por más de
to entÍe las secuencias cle reconocinriento. cuatro nucleótidos.
Capítulo l4 Regulación de la activiCaC del genoma

Á,{,;;r,t*:f*:'rpij*si*; ¿:1*:*¡;*jj;*rí*,r ,--:_-. L.!, , ,i r"',,_.*¡:

i*#i¡*:t*¡-::*nar *s lr: *liii,i*l*d **J f**ilií:*
No es necesario que la relación entre una molécula de señalización y las
proteínas reguladoras involucradas en la expresión del genoma se¿l tan
directa como en los ejemplos analizados en la sección anterior.. Las
moléculas de señalización también pueden influir en la actividact r.lel
genoma de manera indirecta a través de uno o más intermediarios. un
ejemplo es el sistema de represión por catabolitos de las bacterias. Ésre
es el medio por el cual los niveles extracelulares e intracelulares cie gli:"
cemia deterrninan si se activan o no los operones para la utilización de
otros azúcares cuando el medio contiene esos azúcares alternativos.

En 1941, lacques N{onod descubrió este fenómeno al mostrar que. si se

suministra a E. cali a a Bacillus subtilis una mezcla de azúcares, estas bac-
terias metabolizan en prlmer término un azúcar y comienzan a utiliz¿lr el
segundo sólo cuando se ha consumido el primero. Monod utilizó una pala-
bra francesa para describir este fenómeno: diat¿xie (diauxia). GlucosJmás
lactosa es una combinación de azúcares que induce una respuesta diáuxi-
ca, y la glucosa se utiiiza antes que la lactosa (figura 14.7A,). Cuanclo se
descifraron los detalles del operón de lactosa hace alrededor de veinte años
(sección 11.3.1), se volvió evidente que la diauxia entre glucosa y lactosa
debe implicar un mecanismo por el cual la presencia de glucosa puecle ccn-
trarrestar el efecto inductivo que la lactosa suele tener sobre su operón. En
presencia de lactosa más glucosa, se desactiva el operón de lactosa, aunque
parte de la lactosa de la mezcla se convierte en alolactosa, que se une al
represor de lactosa, de modo que, en circunstancias normales, se transcri-
biría el operón (figura 14.7l8_).

La explicación de la respuesta diáuxica es que la glucosa actúa como una

molécula de señalización que reprime la expresión del operón de lactosa, así
como otros operones de utilización de azúcares, a través de una influencia
directa sobre la proteína activadora por catabolitos (denominada también
activador cRP). Esta proteína se une a una secuencia de reconocimiento en
diversos sitios del genoma bacteriano y activa la iniciación de la transcripción
en pfomotores coriente abajo, probablernente por interacción con la sub-
unidad s- cle la RNA polimerasa. Esta activación se asocia con la creación dc
una curva pronunciada de 90o en la doble hélice, en la región del sitio de
unión, cuando se une la proteína activadora por catabolitos. La iniciación
prociuctiva de la transcripción en estos promotores depende de la unión de la
proteína activadora por catabolitos: si la proteína está ausente. no se transcri-
ben los genes controlados por el promotor.

La glucosa no interactúa por sí misma con ia proteína activadora por cara-

bolitos, sino que controla el nivel celular del nucleóticlo modificado AMP
cíclico(cAMF;figur.a14.7C).Lohaceporinhibirlaactividaddelaade.
nilciclasa, la enzirna que sintetiza cAMP a partir de ATP. La inhibición es
mediada por una proteína denominada IIAGlc, un componente de un com-
plejo muitiproteico que tlansporta azítcarcs a la bacteria. Cuando se está
transpofiando glucosa a la célula, l{dGlc se desfosforila (se eliminan gru-
posfosfatoadiciona1esañadidosanteSalaproteínapormodificaciórrpos.
traducción). La versión desfosforilada de IIAcl. inhibe la actividad de la
-
adenilciclasa. Esto significa que si los niveles de glucosa son altos, el con- ,,,,., ,,

tenido dacAMP de la célula es bajo. La proteína activadora por cataboli-

tos se puede unir a sus sitios diana sólo en presencia de cAMP; así, cuando '',,:.:::::,,:,:,,::t.'::",:.

hay glucosa ia proteína permanece desprendida y los operones qlre conrro- .l

la están desactivados. En ei caso específico de la diauxia que invoiucra glu- ':.;;;¡.111 ::::.,;,:';,,;',

cosa más lactosa, el efecto indirecto de la glucosa sobre la pr.oteína

activadora por catabolitos intplica que el operón de lactosa se mantienc
-rr i:::::,:.rll:r:i

a. a: aa,t:r&:: : i :::..a.....:
 Cambios transitorios de la actiüdad del genoma *4t

{A} {B)

PRESENCIA DE LACTOSA
El complejo represor-alolactosa
La RNA polimerasa no se Puede unir
se puede unir al oPerador
a¡ promotor -' '..

{,
tt
Represor ¡¡--- Alolactosa
I lr,li;:,-.¡i:¡ de lactosa ,*

(c)
El nivel de glucosa es alto
o-
irl
o- o- El nivel de cAMP es bajo
'o-P-o-P-o*P*o-cH2 i-^2
rltltll ldLL

ooo '' .'.,......-'...,,','i,M

I ¿ rr,t*!"- .'t!!aií@dl
» i
¡ | Ausencia de transcripción

OH OH §att,:,,',.:,ttt.

¡ Adenilciclasa CAP desprendida

vI
-i: 1r -' ..1 a :..1: i:: r. '

3,]ia:. . §#iixsfrffi El nivel de glucosa es bajo

il:
El nivel de cAMP es alto
: :'i . ,il
:i .'.%**{
,.ii l
I

.i:.ii,l:r] ---.- laCZ

*-f;*- * *il -xF
.---W,*. .f¡&§¡
¡ e ¡rq§*{try:ká§ry8ír¡
i
t: cAMP La CAP se une \_
al sitio CAP lranscr¡pcron

Figura 14.7 Represión por catabolitos. (A) Curva de crecimiento diáuxico típi-
co, observada cuando se hace crecer fschertchia coli en un medio que contie-
ne una mezcla de glucosa y lactosa. Durante las primeras horas, las b¿cterias
se dividen de manera exponencial, y utilizan la glucosa como fuente de carbo-
nc y energía. Cuando se consume la glucosa, hay un breve período de retraso
mientras se activan los genes loc, antes de que las bacterias recuperen el creci-
miento exponencial, utilizando ahora lactosa. (B) La glucosa contrarresta al
represor de lactosa. Si hay lactosa, el represor se desprende del operador, y se
deberí¿ transcribir el operón de lactosa, pero éste permanece silenciado si tam-
bién hay glucosa. Véase en la figura 11.248 los detalles sobre el modo de con-
trol de la expresión del operón de l¿ctosa por el represor de lactosa. (C) La
glucosa ejerce su efecto sobre el operón de lactosa y otros genes diana a tra-
vés de l¡Acl., que control¿ la actlvidad de la edenilciclasa y, por ende, regula la
concentración celular de cAMP. La proteína ¿ctiv¿dora por catabolitos (CAP) se
puede"fijar a su sitio de unión al DNA sólo en presencia de cAMP. Si hay gluco-
s¿, ei nivel de cAMP es bajo, de manera que la CAP no se puede unir al DNA y
no activa la RNA polimerasa. Una vez que se ha consumido Ia glucosa, aumen-
ta el nivel cje cAMP, lo que permite que Ia CAP se una al DNA y active la trans-
cripción del operón de lactosa y sus otros genes diana.
 'rE'T-'

Capítulo 14 Regulación de i¡ actruid¿d Jel gencma

Heceptor de la superlicie celr,rlar clesactivaclo, ¿Iunquc ei represcr de laclosa no esté unido ),, por. enc1c, st
fud
#_'=i
F-4 FUÉRA
Membrana celular
con-qllllle plimcro 1a gh:rosa de1 medio. Cuando se agot¿i la glucos:r,
aumdut¿r el nivel cle cAMP y Ia ploteína ¿ictivacloi:a por catabrr:litos se une
W=i
":-
re w DENTHO a sus sili*s di¿ura, incluido el sitio corrienre at'iba del oper.ón cie lactosa v
se activa la transcripción de 1os genes de lactos¿i.

Asinli.rmo. la ploteína ll§clc cur:rple un segunclo papel en ll i'espuc*sL.r

Proleína intiacelular di¿ir"rxica, que no involucla el gcnon:a, pero que cal:e mencior1.11 fl l,-,.,
I
flnes cle complct:ir la exposición. La lbrrna defoslbi.ilada de ilAclc ilr-,p,-
!
+ de la captación de lactosa y i:tros azúcales al inhibir las enzirnas perrlr-
as¿r, que transportan estos azúcares al interior de ia célula; cai:e recordal
Compuesto de señalización extracelular qtre la lactosa perlneasa es codificadapor lrtcY, el segr:ndo gen del ope-

ffi fr*t€ina
f**f*rilada
3
. &'..:.-..
-.ryt6w
Transdr¡cción de señal
Figura l4.B Participación de un recep-
tor de Ia superficie celular en la trans-
ducción de señales. La unión dei
compuesto de señalamiento e*racelular
a la super;,-ie exler¡¿ d.l recept:r pro-
teico causa un cembio de conformación,
que slrele irnplicar dimerizacrón, lo que
determina la actir¡ación de un¿ proteína
irrtmcelr:la¡ por ejemplc mediante fosfo-
ril¿ción. Los eventos que se producen
"cornente abajo" de esta activación pro-
terca iniciai scn diversos, según se descri-
be en ei texto. "P" indica un grupo
fosfatc, PO.2-.
rón de lactosa (r,óas* [igura.§.8A). Por 1o ta1-]to, la presencia de glucosa
ejerce un cloble efecto: se desactivan los opel'ones piila la utilización c1e
otlo-q azúcat'cs y se irnpide la capt:rción de esos azúcares.
3*,1"3 Yrx*$r§lisi*r: de s*&*§*s mm¿*imdm §?.*r fls{*pt*rxx
¿"$m *m §;".i,ry*§{;{i* {ffi§qJ}§r
l\ilumei:osos coinpllestos de señalización extl'acelul¿lrcs son incapaccs de
ingresar en la c,ólula pül'ql1e son demasiaclo hiclr'ól'ilos p¿ir¿t at1'aves¿tf la tleni-
braira lipíclica y la cÉl¡-rla carece de un mecanisn-io cle fi'anspr:r'tc especílico
para su cziplitción. Ilar¿i ini}:ir en [a activiclad clel genollt¿r. estos cotnpucstos
cle señalizaciÓtr sc deben unil a receptorus c1e la supcrficie cel¡-llar, qlte llr,lv¿u1
sus señales a través cle ia nrembrana celular'. Estos leceptores soil i:)roteínas
que abalcan la t::embrairr, con un sitio de uniólr para el comllllesto de seña-
lización en la superticie exten-la. I-a unión del compucsto cle señalización pro-
\roc¿l un c¿lnlbio cle confbrrlación del receptol". A lrenuclc, éste con-sistc eÍt
dir-nel'ización, pues ei c¿u'áere¡'liquidu clc lá meml¡rana celular: posibilita un
glario limitado cle cle:splazamienro lateral c1e las proteínas de meinbl'ana, ki
que penrite que sr:buniclacles cli: clímerr:s se asocien ,v se disocicn el1 lesplles-
ta a la pr,"sencia r:la ausencia rle la señnl extlacelulár (figura 14.8). E} cam- ,i,.,,,....lr':
bii: ctre ci:nfolruación incluce Lrn er.entü bioqui¡rico cientlr-¡ cle la céiula. Por
ejemplo, Ios se¡yncntos intracelulal'es cle r:ruchas l'eceptores plul.-icos titrcn
actilir]ar.l.it,}{]i1-l2sarlel-¡r¡ni,r,:lr-¡ll;-r:llanrlns.r..lirIer.iz1n.l:¡qst¡i¡,,nirle.-!"..c"-
actiliclacl cie cinasa, cle rn¿rnera que cuando se diileriz¿in ias suiruniciades se
f'o-sf-orilan entre sí. E,ste evento bioqr-rímico, ya -cea lbsf'orilación lnutua o algu-

.|4.2
Cuadro Receptores proteicos de la super{icie celular involucrados en la transmisión de señales en las células eucariontes

Tipo de receptor Señales

Activan proteínas C intr¿celulares, que se unen a C.TP Diversas: epinefrina, péptidos

y controlan ¿ctividades broquímicas por conversión (p ej glucagón),'hoimonas prolei-
,
de este CTP en CDP, con liberación de energía ias, óiórantEs, luz

Tirosincinasas Activan proteínas intracelulares por fosforilacién Hormonas (p. e; , insuIna), diversos
de tirosina factores de crecimiento

Asociados con tirosincinasas Similares a receptores tirosincinasas, pero act¡van ind¡- Hormonas, factores de crecimiento
rectamente proteínas intracelulares (p. ej , véase
,, descripción de STAT en el teno) ,

Seri n¿-treon inaci nasas Activa n proteínas i ntracel ula res por fosforilación Hormonas, factores de crecimiento l

de serina o treonina

Canales iénicos Controlan actividades intracelulares por regular el des- Estímulos quimicos (p e1 , ácrdo
plazamiento de iones y otras moiéculaipequeñas glutámico), cargas eléctricas {

hacia el interior y hacia el exterior de las céluias I

 Cambios transitorios de la actividad del genoma

(A) Activación directa de un STAT

n¿l otrtl reacciÓn. repre.tenta el primcr- paso dd la etapa intracelulal'de l¿ r"ía
de trar'¡sducción de señales.
ffiu@
Se han descr,rb'ierto r.arios tipcs dc receptot de la sr:perficie celular (cua-
clrc 1.1.2) y los eventos intracelulares que desencadenall son diversos,
W "w

c{111 ltutTlerosas variaciones sobre c¿ida tema, no todas las cuales

partici- I
1 '.-ffi:z:
-d,. ,r*
D.in c{pr.ríl'icamcnre en la regultción de la actividad del genoila. Tres W . . -:

.:j:'np1os n¡udat'án a reconocer la complejidad del sistema. \

Se desplaza hacia
el núcleo y activa
F*¡:li¿;rrj*r: #r: s*--,{r:i*S r*i1 aJñ S$5¡} ai. l.-u ;, '.'{ :).-. I - I *j Sf;:*ilxl los genes diana
En algr-uros sistemas de transducciÓn de señales, l¿i estimulaciÓn del lecep-
tor clc la ."upedicie celular pol unión del compuestr¡ cle señaliz¿rción extl'a-
celulal'determilra la activación directa de una ploteína que influye en la {B) Activación a través de una JAK
actiridacl clel genoma, Éste es el sistema rrrás simple por e1 cual una seña1
extr¡icelulat'se puecle translbl'rnar en un¿l respuesta genómica.

El sistema clilecto es e1que utilizan r-nuchas citocinas, comr¡ interleucinas e

iirterlelones. que son polipéptidos c1e señalización exti:acelular que contro-
lan el crecimiento y la división ceh:lat'. La unión de estos polipéptidos a slrs
reci:piot'es cle la superficie cclulat"activa un tipo de factor de tlanscr:ipciÓir
denominado STAT (transductor de señal y activildot de la transcripciÓn). Se desplaza hacia
La activación tiene lugar por lbsforilación de un solo aminoácido tirosina el núcleo y activa
en una posición cerc¿lna al extrerno C del polipéptido STAT. Si el receptor los genes diana
d* la supertjcie celular: es un miemirro de la familia tirosincinasa (véase
cuaclro 14,2), puede ¿rctiyarclirectamente eI STAT (figura 14.9A)^ Si es un
receptol asociado con tirosincina-sa, no tíene, entonces, la capacidad de fi¡s- Figura 14.9 Transducción de señales
loriiar por sí mistno un STAT ni nin¡3rna otra proteína iirtracelular, sincr mediante STAT. (A) Si bl receptor es
que actúa a trar,és de intermediarios llam¿rcios cinasas |anus {!AK). La un miembro de la familia tirosincinasa,
u¡rión de la molécula de señalamiento a un receptor: ¿lsoci¿ido con tilosinci- puede activar directamente el SIAT. (B)
Si el receptor es del tipo ¿sociado con
nasa callsa un cambio de confomación dei receptol a menudo por: inducir"
Iirosincinasa, actúa a través de una
climerización. Esto determina que una iAI{ que se asocia con e1 receptot: §e clnas¿ Janr:s (.lAK), que se autofosforila
foslc¡rile a sí misnra y esta autoactivación es seguida de fosibr:ilaciÓn de1 cuando se une la señal extracelular y,
STAT pr:r la ]AI( (figura 14.911). después, activa el STAT. Obsén",ese que
la activación de la JAK suele implicar
I-{¿ista ahora. se han identificado siete STAT en 1os mamífelos. Tles de eilos dimerización; la señal extracelular indu-
*S1'AT 2, 4 y 6* son específicos para sólo una o dos citocinas extracelul¿i- ce la asociacién de dos subunidades,
lo que da origen a l¿ versión de la JAK
l'es. pero los i:tlos son de amplio espectt'o y pueden ser activaclos pol vat'ios
con actividad de fosforilación. La dime-
inter'{'erones e inlel'leucinas diferentes. La discriminación clepencle cie los rización también es fr-rndamental para
reccptores de la sr,rpcrficie celular: un receptol'p¿llticular se une sólo ¿l ttl"l la aclivación de un STAT; la fosforilación
tipo cle citr:cina, y la rna-vor:ía de ias células tienen sÓlo uno o pocos tipos hace que dos STAI no necesariarnente
de receptol de citocinas. Por: lo tanto, cliferentes células t'esponden cie clis- del mismo tipo, formen un dímero.
tintas maneras a la presenc.ia c1e cletetminaclas citocinas, aunque el pt'ocesr: Este dinrero puede actuar como activ¿-
cle señalamiento intemo involucrc sólo una canticlad liiritada de S?\T. dor de la transcripción. "P" indica grupo
fosfato, PO.z*.
Se ira def}:idr: qr-re la secriencia collsenso cle los sitic¡s cle unión al DNA de
L:s STAT es 5'*TTl{¡-64{-3', en gr¿ln n-reciida por estr"rdios que han inves-
tigado STAT pudficaclos respecto de oligonucleóticlos de secuencia cr:noci-
<la. El clominio de unión al DI'JA de la pr:oteína STAT está forrnaclo por tres
hucles que emrrgen de una estructula de hr:ja p en fon:na de ban'il. Este es
un tipo inli:ecuente de dourinio de unión al DNA y no se 1o ha identificado
precisamente en la misma fbnrla en ningiit-t otro tipo cle proteína. aunque
guarcla similitudes con los clon"linios cle unión al DNA cie los activaclores de
la transclipción |,trK-xB y Re1. Estas similitudes se refir-rren sóio a las estruc-
turas terciarias de los dominios de unión al DNA, polque STAT, irll(-rB y
Rel, en conjunto, tienen 1nu)'escasa identidad dc secuencia de anlinoáci-
cics. N¡luchos genes diana son activados pol STAT, pero la lespuesta genó-
n"rica global es modulada polotr'¿ls proteínas que intet';tctú¿rn con los STAT
 Capítulo l4 Feq:-',: c. de ,¿ J:,. 14: lti ge^t-a

Receptor de milógeno e influven en qué genes se activan en deteruinadas circunstancias. Lo.c pro-
cesos ceiulares que median 1os STAT -crecimiento _v división- son, en sí
nlismos, complejils, y es completamente previsible que ios cambios de estos
procesos serán complejos y requelirán remodelaciÓn extensa del proteoma
Unión de Ia señal -v.
por ende, alteraciones en lran escala de 1a actividad del genoma.
I

La simplicidad clel sistema por el que el receptor de 1a supetflcie celuiar

del recepto| activa un STAT, cie manera directa o a través de una JAK asociada con
el receptor, contrasta con 1as formas más prevalecientes de transducción
I Heclutamiento
t de Raf de señales, en las cuales el receptor representa sólo el primer paso de
una selie que ileva, en última instancia, a la activación o la desactivación
de uno o más activadoles o represores de 1¿r transcripciÓn. Se ha dciine-
ado una serie de estas vías en cascada en cli1'erentes orgiinismos. A cr¡n-
tinuación, se consideran las importantes en los mamíferos:
'¡, El sistema de las LÍAP cinasas (proteincinasas activadas por nritóge-
t Transducción
I de la señal nos) (figura 14. 10) responde a numer"os¿'rs señales extracelulares, inch:i-
dos mitógenos: compuestos con efectos similares a 1as citocinasJ pefo
que estimulan de manera específica la clivisión celular. La unión del
compuesto de señalamiento induce la dimerización del receptur dc
mitógeno y la fosforilación mlrtua de las partes intemas de ias dos subu-
niclades (véase figura 14.8). La fosforilación estimula Ia unión alrecep-
tor, de1 lado interno de la membrana, cle diversas proteínas
citoplasmáticas, una de las ci:ales es Raf, una ploteincinasa que se acti-
va cuando se une a la membrana. Raf desencadena una cascada cle reac-
ciones cle fosforilación. Fosforila a Mek, 1o qr:e activa esta proteína. de
manera que, a su vez, ésta fosforila a la MAP cinas¿1. Ahora, la §'iAP
cinasa activacla se desplaza al núcleo, donde activa, también por fosfo-
rilación, una serie de activadores de la transcripción. Tanlbién fosiorila
otra proteincinasa, denominada Rsk. que fosforila y activa un scguncio
grupa de factoles. Este sistema muestl'a flexibilidad adicional por la 't',t,,1.ji.,,,,1...,,:.,,,.,,,

Áw .,a§;:t; pr:sibilidad Oe
pOS1Oi11ü4{} reemplazal Ul'ia
c1e reen-rplazar o I11AS
ul'ia O de la vlil
pt'oteínas Ge
más p1'O1elnas vía üe l¿l§ MAP
de ias ivrAr' ..lt;.:rr,rtr.r.,,
¡.:,,,....r.
ffi cinasas por proteínas relacionadas, con especificidades algo difetentes.
'b y activar así otra serie de activadores. Las célu1as de los vertebracios .1,11i;,,,,:,
ffi
,

4!
emplean la vía de las NIAP cinasas; en otros organismos. -ce col)()cc
Activa Elk-1, Activa
Mi#i{
c-Myc, etc. SRF, etc.
víasequivaIenteS,queutilizanintemec1iariclssinlilaresa1osir1crrtil.ica-
dosenlosmanríferos(véanseejerrrp1osenlassecciorres1.l.].lt
1 4, 1 i ) .
.. .:.. ::.:::,....:.: :::,.,.:...:..t: ::..:..

, . ';,,,;,,:,.,1,.rt,,.,,",',';t,,,,,.;,.

Figura 14. 10 Transducción de seña-
les por la vía de MAP cinasa. "MK"
es la MAP cinasa, y "P" indica un
Ei sisterna Ras gira alrecledor cle las proteínas Ras, tres cle las cuaie-c sú :.,,,,,,:,,,,.'r.tt:,:.'
han detectaclo en céfi-rlas de mamíferos (Il-, K- y N-Ras), y proteír:¿ls "i.ir,'tr'r..'.:,i.l..i,i
similales como Rac y Rho. Estas proteínas par:ticipan en 1a regulaciÓn ":;;,::1L.:,,,1,:,:,:;';)-,;':

grupo fosfato, PO.:-. Elk-1, c-Myc y de1crec.imientoy1adiferenciaciónce1rr1¿lr5,'a1igga1quemuc1rastrll.tltc-

SRF (factor de respuesta sérico) son ínas de esta categoría, pueden provocaÍ cáncer en caso de ser distturcicl- ';;,;,,:.:,,:r:,,:;,,,.t,,;..::,,;,,;.:,,

ejemplos de factores de transcripción nales. Las proteínas de [a familia Ras ro se limitan a los m¿rmíferos; '§ú,.;,§,:,r.,.,,,',,",,
activados al final de Ia vía. conocen ejempios en otros eucariontes, como l¿l mosca de 1a fiut¿r. Estas ,,¡;;;,,
proteíuits son-inrctrnedialias etr las vílts de tt'flnsrlucción de scittrlcs qtt''
se inician uon aurolosibrilación de un rcceptor tilosincinlls¿l cl'] IispLlcs-

conrplejos proteína-ploteína con las GNITP (proteínas liberarli¡res d.e ,,'....,,:i;),,,t:,,::,,,:,,tt:,,,:':,.:..

nucliOti¿oi de granina) y las GAP (proteínas activaóoras de ;.,,,§1f:. .,.

GTPasa), que activan y desactivan 1as Ras, r'espectivamente (figura lt.t:::t'',r:i.r.r.lrl.i.,.:1'

14.11). Por 1o tanto, l¿rs señales extlacelulares pueden activar o clesac-' "'t'':..,,-:-,'r,
tivar la transciucción cle señales mediada por Ras, y la e lección entre ias ...,,,,i:.;,,,';a:,a.1:,',,
dos opciones depende del carácter de la señal y de las concentr¿lciones ,...l,11,,,,,,,,.-:..':,¡¡¡,r,.
celulales relativas de GNRP v GAP activas. Al ser activada. Ras estinru"
"":,,lrt'':,,,:,'t:
 Carnbios transitorios de la actividad del genoma 4it5

1a la actividad de Raf, de rnodo que, en efecto, Ras representa un segun- Receplor tirosincinasa
rir: punto de entrada en la vía de MAP cinasa, aunque es imptobable
que ésta sea la única función de Ras y, quizás, también active proteínas
involucradas en la transducción de seña1es por segundos mensajeros
(como se descdbe en la siguiente sección).
i
.;1..
x El sistema de SAF (proteína activada por estrés) cinasa es inducido ,}
por señales relacionadas con estrés, como radiación ultraüoleta y fac- INACTIVA {---..-+ .:¡,;r 1,. 1 ACTIVA
tores de crecimiento asociados con inflamación. No se describió en
detalle la vía, pero es similar al sistema de MAP cinasa, aunque tiene ..s

por diana un conjunto diferente de activadores de la transcripciÓn. #\, -i Vías de

i&ü. #
!e&¡&Jr segundos
*
mensajeros
Cada uno de los pasos de estas vías en cascada irnpiica una interacción s"
Vía de
física diferente entre dos proteínas, que suele determinar la fosforilación MAP cinasa
del miembro "corriente abajo" del par. La fosforilación activa la proteí-
na corriente abajo, lo que le permite a ésta establecer una conexión con
la siguiente proteína de la cascada. Estas interacciones involucran domi-
nir:s de unión proteína-proteína especiales, como ios denominados SH2 Figura I4.I I Sistema Ras de trans-
y SI-I3, que se unen a dominios receptores de sus proteínas asociadas. duccíón de señales. Abreviaturas:
CAP, proteína activadora de CTPasa;
Los dominios receptores contienen una o más tirosinas, que deben ser CNRq proteína liberadora de nucleó-
fosforiladas para que tenga lugar el acoplamiento. Por 1o tanto, la pro- tidos de guanina. "P" indica un grupo
teína corriente arriba contiene el dominio receptor, cuyo estado de fos- fosfato, PO.z-.
folilación determina si ésta se puede unir a su compañera corriente
abajo y, así, propagar ia señal (figura 14.12).

I';r:s#l'rri*,t ¡:t-' fr{rv*s d* s*g*rl**s ,x*nii:i*r*s

s#*slf§ {?
:-.
Algunas cascadas de transducción de señales no implican la transferen- f
ffia
cia directa de la señal externa ai genoma, sino que utilizan un medio Proteina corriente arriba,
indirecto para influir en la transcripción. Este car'ácter indirecto es pro- W i,-::t:r:::j;l:l
visto por segundos mensajeros, que son compuestos de señalamiento
internos menos específicos que transducen la señal de un receptor de la T
superficie celuiar en varias direcciones, de modr: que diversas activida-
des celulales, no só1o la transcripción, responden a la única señal. ;M
F1]": Se une a la proteína
k*.
w4"
corriente abajo
En 1a sección 14.1.1, comentamos cómo la glucosa modula 1a proteína
I
activadora por catabolitos al influir sobre los niveles de cAMP en las bac- \i?
terias (véase figura 14.7). Los nucleótidos cíclicos también son segundos
mensajeros irnportantes en las células eucariontes. Algunos receptores de
rr
La proteína corriente
la superficie celular tienen actividad de g¡uanililciclasa y, pot'ende, convier- ffi,§lll"l'rrl:l,;,,;
tu abajo es
ten GTP en cGMP, pero la mayoría de los receptores de esta familia actú- Itre
an de manera indirecta influ¡'enclo en la actividacl de ciclasas y deciclasas I
citoplasmáticas. Estas ciciasas y deciclasas determinan los niveles de t r
cGMP y cAMP, que controlan, a su vez,la actividad de diversas enzimas ..;,..,,,117L §l1s¡ q, la proteína
diana. Estas últimas inch:yen la proteincinasa A, que es estimulada por corriente abajo
::i:.,
cAMP. Una de las funciones de la proteincinasa A es fosforilar, y por 1o '''
r¡,t,,t,,t,,,t,,:,¡
pUede activaf a
Lri:rrrirr
tanto activar, un activaclor de la transcripciÓn denominado CREB. Este es la siguiente proteina
de la cascada
ulla de varias proteínas que inciden en la actividad de diversos genes por
interactuar con un segundo actir.adol, p300/CBP, que puede modificar las
proteínas histona y afectar así la estructura de la cromatina y la posiciÓn
c1e los nucleosomas (secciones 1O.2.1y 1O.2.2). Figura 14.12 Esquema de la interac-
ción de proteínas en una cascada
Elp300/CBP, además de ser activado indirectailtente por cANIP, l'espon- de señalamiento. La proteína
de a otro segundo mensajero, el calcio^ La concentración intracelular de corriente arrib¿ es fosfbrilada y, por
ende, puede unirse a su compañera
iones calcio es mucho más baja que ia extracelular, de manera que las
corriente abajo. La unión induce la
proteínas que abren los canales del calcio cle la membt'ana celular per- fosforilación del dominio receptor de
miten el ingreso de iones calcio. Esto puede ser incluciclo por señales la proteína corriente aba1o, lo que
extraceiulares que activan receptol'es tirosinciuasa que, a su vez, activan propaga la señal. "P" indica un gruPo
fosfolipasas que degradan el fosfatidilinositol-'l,5-bifosfato, un compo- fosfato, POrz--.
 Capítulo 14 Regulación de la actividad rlel genoma

Receptcr ti rosincinasa nente lipídico cle la memblana celular interna, en inositol-1,4,5-trifosfa-

to [Ins(1,4,5)P5] y 1.2-diacilglicerol (DAG). E,l Inslt,.l,5)P; abre los
canales del calcio (figur:a 14.13). El Ins(1,4,5)P; y'el DAG son, por sí
n:isn:os, segunclos mensajeros, que pueden desencadenar otras cascadas
c1e transducción de señales. Los activadr:res de la transcripción son sólo
dianas indirect¿rs de las cascadas inducidas tanto por calcio co1lio pür
lípidos, mientras que sus dianas priraarias son otl:as proteír'ras. Por ejeil-
Fosiolipasa
ffiffi pio, el calcio se une a Ia proteína clenominada ca1¡r-lodulina y' la acti:"'a;
t
I
esta proteína regula di.versos tipos de enzima, como proteincinasas.
ATPasas, l<¡sf'atasas y nucleótido ciclasas.
Ptdlns(4,5)Pn
I
I
lns{1 ,4.5)P.
!', j..,,t'::', l,:1,,r.',. 1 ':, ., ::'.:.':) .... '. ,,, :i.1 f ,'
¿Cómo descifraron los biólogos celulares las complejid¿rdes de las r,ías cle
l+\
f, rDAG \
tlansducción de señales? P¿ira responder a esta pÍegunta, examinaremos
algunas de las investigaciones recientes dirigidas a la r,ía de señalamiento
fr
0tras cascadas
Abre los canales
- activada por el factor transformadol de crecimiento-p (TGF-p1, una familia
del calcio .,'''
cle los alrededor de i0 polipóptidos relacionados que cr:ntrolan procesos
mensajeros ;a- ,*{ ., como la división y la diferenciación celulat'en los vertebrados. Los lecepto-
Act¡vación a través *# § .-:.
'' * d; ¿;rn',oári¡ni *x"'fr,\
res de la superficie celular para TCF-p son serina-treonina citasas (véase
cuadro 14-2), que activan diversas proteínas diana dentro de la célula. Falte
del ploceso de trarisducción de señales iniciado por la unión de TGF-B inrc-
lucl'a un conjunto de proteínas denonrinado f'amilia SN'IAD, non:bre que
lesulta de abrer.iar "relacionacla con SNA,11\1{D", en t'efelencia a l¿is p1'ote-
ínas de Drosophiltt melttnogustcr y Cctetrcrltabclitis elegctts, respectivanten-
,l4.13 te, que fueron los primelos miernblos de la familia en ser aisiados.
Figura Inducción del siste-
ma de segundo mensajero calcio.
Abreviaturas; DAC, 1,2-diacilglicerol; A1 plincipio, se descublieron cinco S&{AD en céiulas de vertebraclos.
lns( 1 ,4,5)P3, inositol- 1,4,5-trlfosfa- Cuatro de ellas -Smacl1, Sruacl2, Smad3 y Smad5- se clenominan SfuIAD
to; Ptdlns(4,5)Pr, fosfatidrlinositol-
4,5-bifosfato.
legulaclas por receptores, pues se asocian dilectamente cou el receptor
de la superficie celular. Cada una de estas SMAD es específica para un
tipo clifer:ente de leceptor sei'ina-treonina y, por lo tanto, responde a dis-
tintos miembros c1e la familia TGF-p de compuestos de scñalarniento. La
unión de la seña1 extracelular induce al t'eceptol a fosfodlar su SMAD,
que después se asocia con Smad4, se desplaza al núcleo y. mecliante
Figura 14.14 Conocimiento de la interacciones con proteínas cle unión al DN¡\, activa un conjunto dc
vía de señalización SMAD. (A) genes diana (figura 14.14r\). Pol lo tanto. Snrad4 es un comediado:: que
Bosquejo de la via de señalización. palticipa en la vía de señalamiento cle las otlas cuatro SNIAD. El siste-
Se ilustra la activación de Smadl por
ma SMAD es Lrn segundo ejerrplo de tr"ansducción de señales ooil ul1
un receptor de TCF p. La misma vía
paso entre el receptor y el geiroma, similar a Ia vía S1AT descrita antes.
es aplicable a Smad2, SmadS y
Smad:. (B) Dos modelos de los
efectos inhibitorios de Smad6 (ilus- El descubrimiento de ott'as dos SMAD -números 6 y 7* que no encajan con
lrada e¡r este diagrama) y Smadz. el esquema complicó la interpretación de la vía SMAD. Estas SMAD cilrecen

(A) Vía de señalización SMAD (B) Modelos dei efecto inhibitorio de Smad6 y SmadT

L Smad6 I
L ri
; #.r.-. .l* t*--Ausencia
W t \ t
x{% a-,-
w":::yw de diana
para la señai I
SmadG
Señal bloqueada

Se desplaza al núcleo
y activa los
genes diana
 Cambios perrn¿nentes y senriperrnanentes de la actividad del genoma

clel nrotivo de secuencia de aminoácidos setina-serina-X-serina (donde X es

valina o rnetionina), presente en la región C terrninal de Smacll, Smadl,
Snacl5 y Srnad5, y que es fi:slbrilado por el receptor. Por lo tanto, es eviclen-
te que Smad6 y SmadT no responden directamente a la unión de 1as señales
exn'acelulares ai receptor proteico. ¿Sr:n cr:mediadores similares a Smad.l o
cunrplcn alguna otra función en la transducción de señales por TGF-[3?

Ei primer paso para conocer las funciones de §mad6 y SmadT consistió

en rleterminar el efectr¡ de la sobreexpresión de estas prr:teínas sobre la
üansducción de señales por TGF-$. Se logró [a sobreexpresión uniendo
el gen de Smad6 o SmadT a un promotor fuerte y utiiizando, después, téc-
nicas cle clonación para introducir el gen en células cultivadas. El resulta-
do fue que genes nucieares nortralmente activados por TGF-13 dejaron de
responder a la señal extracelular en las células que sobreexpresaban
Smaci6 o Smad7. Esto dio la primera indicación de que Smad6 y SmadT
ejelcen efectos inhibitorios sobre la vía de TGF-P.

Se luin propuesto dos modelos para expiicar cómo reprimen la vía de TGF-
p las SN{AD inhibitorias, conlo se llaman ahora Smad6 y SmadT (figura
14.148). El primer modelo se basa en la cbservación de que, en extractos
celulares, las proteínas Smad6 y SmadT están asociadas con las partes
intraceluiares de los receptores de la superficie celular. La hipótesis es que
Smad6 y Smad7 inhiben 1a transducción de seña1es al impedir que los
receptol'es activados fosforilen las otras SMAD. Es probable que este
modelo explique los efectos inhibitorios de la sobreexpresión de Smad6 y
SrnadT pero, en l¿rs céiulas normales, puede no haber copias suficientes de
estas proteínas para bloquear: por cor:rpleto los receptores de la superficie
celular. Por lo tanto, se ha propuesto un modelo altemativo, en el cuai 1as
Sl\'lAD inhibitorias se unen a una o míis de las otras SMAD, 1o que las etri-
mina de la vía y, por ende, detiene la transducción de señales. Hay buena
evidencia de que este tipo de interacción explica el efecto inhibitorio de
§mad6 sobre Smad1. Estudios de dos híbridos de levadura (sección 6.2.2)
han mostrado que estas dos SMAD intelactúan y que, tras la unión a
§mad6, Smadi no puede influir en los ¿tctivadores de la transcripción qr-re
nrmralmente estimula, aun después de h¿iber sido fosfolilada por los recep-
tores de la supelficie celular.

Cr:alesquiera que sean los mecanismos de activiclad cle Smac16 y Smad7, el

clescubrimiento de estas SNIAD inhibitorias r-nuestra que la señalización
pol TGF-B a través de la vía Sh'{AD es nrás flexible de 1o que se creyó al
principio. En iugar de ser una Íespuesta de todo o llada, es posible mocli{l-
car la actividad de las §MAD reguladas por receptores a través de los efec-
tr:s inhibitorios cle Smad6 y Srnad7, y se pl'esunte que estas proteínas
responden a señales intracelulares o extracelulares todavía no identificadas
pala modular en fbma adecuada los eI'ectos de la unión de TGF-p.

e,k fl * rffi h i # s sJ ;:'j' t'?i í3 il¿ ft ffi 1 # 3 r- s ffi ff§"$ á p * reffi ffi s"3 € it -
áww ffi* §m mwkíw&&mffi &w$ g*mffiffffiffi
Por definición, los cambios tran"citorios de la actividad del genoma son
fácilmente reversibles; el patrón c1e expresión del genr:ma revierte a su esta-
clo original cuando se elimina el estímulo cxteü1o o se lo reemplaza por un
estímulo opuesto. Por el contlario, los cambios permanentes y semipetrna-
nentes de la actividad del genoma, que son la base de la dif'erenciación celu-
l¿rl deben persistil por períodos prolongados y lo ideal es que se mantengan
aun después de la desaparición del estímulo que los indujo en primer tér-
mino. En consecuencia, pr"evemos que k:s mecanismos re¡¡r:ladores que
 Capítulo l+ Regulación Ce la a«ividad Cel genorna

Células vegetativas :-,,:r;.:,.,.,,..:,1

desencadenan estos carnbios a largo plazo involucrarán otros sistemas, aele-

;
fl', más de la rnodulación de activadores y represoÍes de la transcripción. Esta
expectativa es correcta. Estudiaremos tres i:recanismos:
I Diferenciación I *
TT *
Cambios secundalios al reordenamiento físico del genoma.

¡
Cambios debidcs a la estluctura de la cromatina.
|; * Gametos q rl;' § 'jl:

* Cambios mantenidos pol' circuitos de retroalimentación"

,rlii

---.3'
1.-.-"-
\ *%I
'qe-.
"-" ."s'

"'S'o ]r" ir tr lds,nrr{*r"t;rnri¡.qrl.-:e C::l

*" B*
i:ün11:1^,.-1
La modificación de la estructura física del genoma es Llna manera obvia,
'_:*e_
aunque dr'ástica. de inducir un cambio permanente de la expresión del
I Meiosis genoma. No es un mecanismo regulador común, pero se conocen varios
üI ejemplos importantes.
Cuatro
É § :§ ascosporos
j-¡:, lr.f ¡-:; ':;r i:;:.:r;i*i;:¡¡*¡::l¡.., *; ;'r.:-:; l*l'':,;,1',.;,"*: i:ltii}il #*:*¡:::¡,,:;,;jl .;
;!i 7.t
'\.!,:i::.,,a*- contenidos r-.
,rti*t)1
en un asco -;..'.',-t.:. .- t.. ,,,': . r,- :'
II
¡
f El tipo de apareamiento es el equivalente del sero en las levaduras y o*ros
_]3 microorganismos eucariontes. Como estos organismos se reploducen, sc¡bre
...t::il§...'"rae
todo, por diüsión celular vegetativa, existe la posibilidad de que una pobla-
Germinación, ción, a}dedvar de sólo una o algunas células ancestrales, esté compuesta. en
I7 \I Germinación.
mitos¡s miiosis gran medida o por completo, por un solo tipo de apareamiento y, por ende,
no pueda reproducirse sexuaimente. En Sacclzctromyces cerevisitte y algunas
'.aa.. :L .a. :a :i otms especies, se eüta este problema polque 1as células pueden car-ibial'de
2a::i.. .,: TNuevas células.{ .t.t ..,.u.:
.:,1.

sexo mediante el ploceso denominado car¡rbio del tipo de apareamiento.

vegetarivas

Los dlls tipos de apareamientr: cle §. cerevisiae se denominan a y cr. Cacla

tipo secreta un poiipéptido corto" feromona (12 aminoácidos de longituri ::r,l, ',.,,.,
Figura 14.15 Ciclc vital de la leva- para a y l3 par:a u), que se une a receptores de la superficie de células del ;!:::.''..",:,',
dura Socrñs rümyces cerevisise. tipo de apareamiento opuesto. La unión de la feromona deseneadena una
víadetransduccióndeseñalesdeMAPcinasa(véasefigur:al4.l0),quc
modifica elperfil de expresión del genoma dentro de la célula, lo quc causa '
cambiosmorfo1ógicosyfisiolÓgiCoS§utileSqueconvierten1acélulaenun
gameto capaz de participar en la replr:ducción sexual. Por lo tanto. la m.-z-
cla de dos cepas haploides de tipo de apareamiento opuesto estimula la for- ,,1,1..,.1,,..,,:¡i..
mación de gametos que se fusionan para producir un cigoto ciipioide. .,..':,,,,;.:,,,, l,
Dentlo del cigoto, tiene lugar la meiosis, que da origen a una tétrada cle ',r :,..:.,.?
cuatro ascosporos haploides, contenidos en una estructura denominada l.'lilltr,lr;,;:i.ti.,..,
asco. El asco se abre y libera l<¡s ascosporos, que después se divirlen por ':.:'::::":,,:,:":',:,.t:t::,:.:, '

mitc¡sis para producil nuevas células vegetativas haploides (figura l +. 1 5).

..,.., .. ,,.. .,..,., . aI

El tipo de apaleamiento es especificado por el gen !v'IA|',localiz¿lrlo en el * -' rl' :''''r''."

cromosoma III. Este gen y
tiene dos alelos, NIATa MATa.: una cólula ¿s,;,',,,,,,"1,,',,,',t,'t,,;,',::.

levadura hapioide présenta el tipo cie apareamiento correspondiente at

':z,;'';r.r,'l
alelo que contiene. En otra parte del cromosoma III, hay otros dos gene§ :,,.,,;,::i,t':,.,,:.,:aa.'::,.,,,e

simiiaies a MAT, deni:minaáas HMRcty HNILa (figura j+.tOl. Éstos tie- ',-.:1,..it:*¡':l,i!
nen 1a misma secuencia que h'IATa y MATct, respectivamente, pero ningp- :,::,i:;,r,,' , ,.lf
no se expresa porque corriente arriba de cada uno hay un silenciaclor que ,.,,..:i1,,,,:.::i.*,i, ll
reprime la iniciación de la transcripción. Estos dos genes se denorninrn - '
"casetes de tipo de apareamiento silenciados", Su silenciamiento invilfucril':":'1;,,;;;..,1111,11,,,;:;,i,1,)':;;;\t
las proteínas Sit', varias de las cuales tienen actividad de histona desacett' ,,,,:.,:,.y'..:,'',:,:,;,v.i
i,,:::,l;,i
lasá (secció n 10.2.1), lo que indica que el silenciamientr: implica c,ambios i:''r'',d'
cle la estructura de ia cromatina en la región de IIMRa y ltMLu. ,. ,.t;;;,t:.,,.,".,,lj
' i: !,trt...r'.r.-r..:r..:: :

La HO endonucleasa desencaclena el cambio clel tipo de apat'eatniu-rrt¡r al ., .-. fi

practicaruncortebicatenarioenunasecuenciade24pbtrbicadad.-n
*:
.; .'*
-f-
 Carlbios permanentes y semipermanentes de la actividad del genorna

Figura 14.16 Cambio del tipo de

apareamiento en las levaduras. [n
este ejemplo I¿ célula comienz¿
como tipo de apareamiento ¿. La
I HO endonucleasa
endonucleas¿ HO corta ellacus MATa,
¿
lo que desencadena la conversión del
gen por el locus HMLo". El resuitado
HMLa HMRa
es que el trpo de ap¿re¿rniento cdm-
.,-**;;-,:i-ü -*;... §:a:eÍa:13i@"¡. -- ffi9:"?aa** - -. bia a tipo cro. Véanse los detalles de
%q,****d- Corte bicatenario la base molecular de la conversión de
I
Benes en la sección 17. I .1 .
tI

HMLU MATa
iii;;;tüs*griliü.*i¡ii i *;¡;;

:,ri ii: r ': tro del gen lUAf. Esto permite que se produzca un evento de conr¡ersión
', ,.,.¡ de genes. Examlnamos los detalles de la conversión de genes en la sec-
.1¡';,:; cién 17.t.1: por ahi:ra, todo 1o que nos concielne es que uno de ios
,,..,,.:;,,,:,:,,,:;,1:1:
extlemos 3' libres producidos por la enclonucleasa pueclé ser extendido
',;,:1,,'::,1:;:',1',":,.' por síntesis de DNA, que utiliza uno de los d,¡s casetes silenciados como

i,rrirrrrrrrr
: rrükle (véase figura 14.16). Después, el Di\A recién sintetizado teem-
ll.:¡¡,¡'¡,,.,¡.,¡¡ plaza ai DNA que
se encucntra, en ese momento, en el locus de Má?. El
'::,,¡r,., casete silenciado elegiclo conro molde suele ser el qi:e e.q difer:ente del
::'':::::,:":"':: alelo original de llfAl. de manela que el reemplazo por la cadena l'ecién

,:,'l;;'.,,.,,,,:',,, sintetizada convierte al gen ,'l/AT de NIATa en l,lATa, o viceversa. Esto

:':: prüvoca cambio de1 tipo de apareamiento.

t'|,'
:":',
Los genes,{.{Alcodifican proteínas reguladolas (una en el caso cle LIATr
y dos en el caso de &lA?-cr) qLle interactúan con un acrivador de la trans-
,,i cripción, \,1CN'I1,1o que deterntina qué ccnjunto cle genes son activados
1,,. por este factor. Los productos de 1os genes itfATu en MATa ejercen dife-
': rentcs efectos sobre NICIVIi y, por lo tanto, especifican distintos patro-
1,,, nes de. explesión <1e1 genr:ma específicos de álelos. Estos patrones iie
:iii explesiÓn se mantienen en f-olm¿l semiperrnanente hasta que se produce
otra convelsión del gen A{AT.
,.
,.1:.:'.

I ..'..a ..."..-:,. .,]..;, L, .,j - :.: :,.' l*5j¡{¡,i1.;:..:,::. .,.,. I . (rr..,r1 .'

(r.'": :;"; 1.'i ,-'-**!t:;,*,ii¡?'!*.t ,;'r*{*i}i*lfl al* f*i#l{:.5 I

En ios verteblados, hay clos eieurplos llamativos sobre la utilización de reot'-
denamientos clel DNA pala loglar cambios pennanentes de la actividad de1
genoma" Estos clos ejcrnplos, que son muy sintilares, son responsables cie
gener'¿l]: la diver"sid¿lcl de inmunoglobulinas y receptores c1e células T.

l-.¿is inmuni:globuliiras ¡, 1os receptol'cs cle células T son proteítras r.ela-

cionadas sintetizadas por los lir:f'ocitos Il y T, t'espectiv¿ltxente. Ambos
tipos cle proteínas se unen :r la superficie extet'na cle s¡-rs células y l:rs
inn-runoglobulinas ran:bién se liberan al totr:enre cilculatorio. Las pt.ote-
ínas ayudan a pÍoteger al ol'ganismo coi-ltla la invasión de bacterias,
virus y otr¿ts srlstancias no deseaclas por unión a estos antígenos, como
se los denomina. Durante su vida, un organisnlo está expuesto a un
vasto espectro de antígeno-s, io que significa que el sistema inn"runitario
clcbe poder sintetiz¿rr Lln espectl'o igualmente amplio cle innrunoglobuli-
nas y receptores de células T. De hcclro, ic',s seres huma¡ros pueden labr-i-
car alredcdor de 108 inmunoglob:-rlinas y receptores de células T
diferentes. Pero el genon.ia humano só[o contiene 5,5 x 10+ genes, pol]
li: tanlo, ¿,dc dónde provien*n todas cst¿ts ploteínas?
l
a
aa
45§ Capituio 14 R.egulacrón Ce l¿ acli,;rdad rlel genoma
A*:..iiiiii¡ l1*alrlil !áil§ill¡i
**, L_,:-: :l:. :a ..:.
Figura 14.17 Estructura de las
inmunoglobulinas. Cada inmunoglo-
bulina está compuesta por dos cade-
nas pesadas y dos livianas, unidas por
puentes disuifuro. Cada cadena pesa-
da tiene 446 aminoácidos de longitud
y consiste en una reglón variable
(ilustrada en rosado), que abarca los
aminoácidos 1-108, seguid¿ de una
región constante. Cada cadena liviana
tiene 2.l4 ¿minoácidos, también en
este caso con una región variable N
terminal de 108 aminoácidos. Se for-
man otros puentes disulfuro entre
diferentes parles de cada cadena:
ástos y otras interacciones pliegan la
proteína en un¿ estructura tridimen-
sional más complela.
Cuadro 14.3 Segmentos génicos de inmunoglobulinas en el genoma humano
,,COmROnenter..,,
Cadena pesada
Cadena lligera x lCK
Cadena ligera ),
Algunos números son v¡riabies debiclo ¿ diferencias entre los genotipos humanos No se sabe si todos los segmentos génicos son funcionales:
algurros pueden ser seudogenes.
Par¿l conocer la respuesta, estudiarenlos la estructura de una inmunoglo-
bulina típica. Cada inmunoglobulinzr es un tetrámcro de cllatto poiipép-
ticios ligaclos poi' puentes disulfuro (figura 14.17). Hay clos caden¿ls
"pesadas" largas y cios cadenas "livianas" cort¿ls. Cuando se conlpal':rn
1as secuencias de distint¿rs cadenas pesadas, es eviilente que la variabiii-
dacl entre ellas reside, sobre toclo. en las regione-s |'l telminales cle esto.r
polipéptidos, mientras que las partes C terminales son muy simila¡es o
"const¿lntes" en todas las cadenas pesadas. Lr¡ mismo es váliclo para iar
cadenas iiger:as, excepto que se pueden distinguir dos familias, N y )", coii
diferentes secuencias en sus regiones constantes.
En los genomas de los vertebradc¡s, no hay ningún gen completo para los
polipéptidos pesados y livianos de inmunoglobulinas, sino que estas proteí-
nas son especiiicadas por segmentr¡s de seilec". Los segrnentos para las cade-
nas pesadas se encuentran en el clomosonla 14 y comprenden 1 1 seginentos
génicos de la región constanie (C¡¡), precedidos de 123-129 segmentos géni-
cos Vs, 27 segmentos génicos Dr¡ y 9 segmentos génicos I¡1t estos tles rilti-
'ü§;;:i Cadena pesada mos tipos codifican diferentes versiones de los cornponentes V (variable), D
.üffi, Cadena l¡gera (diverso) y I (de unión) de la parte vari¿ible de la cadena pesada (cuadro
14.3; figur;r 14.18). Todo el locus de la caden¿r pesada se extiende por varios
pares de megabases. Se obsewa un oldenamiento similar en los loci cle las
cadenas ligeras de los crolrlosomas 2 (locus r) y 22 (locus i), con la únicil
diferencia de que las cadenas ligelas no tienen segmentos D (cuadro 14.3).
Durante e1 primer est¿rdio de desarrollo de los linfocitos B, los loci de inn:u-
noglobulinas de su gerlorna sufien reordenamientos. Dentro del locus de la
cadena peszida, estos reordena:mientos ligan uno de los segmentos gónicos
Vs con uno de 1os .segmentos génicos D¡1 1,. clespués, ligan esta cr:mbin¿l'
ción \¡-D con un seginento gér-rico IH (figura 14.19). Estos reordenamien-
tos se producen mediante un tipo infrecuente de reconrbinación, catalizada
por un piir de pl'oteínas denominadas RAGI y RAG2, y las posiciones
doncle se deben producir i¿is leacciones de n:ptr-rra y reunión par:a ligar los
segmentos génicos están malcadas por una sede de secuencias consenso de
8 pb y 9 pb. El resr-rltado es un exón que coniiene elnlarco de lectura abier-
to completo qr-re especifica los segr-nentos V¡1, Ds y Ju de la inmunog'lobu-
lina. Este exón se liga pr:r cofle y empalme a un exón dei segr"nento f,i¡
clllrante el proceso de trarnsuipción, 1o clue crea un rnRNA de la caclena
pesada completa. que puecle ser traclucicló a ,rr-tu ir-urrunoglobulina cs¡ccifi-
ca sólo para ese linfr:cito. U¡ra serie similar cle reordenamientos del DNA
cletei'r:rinan que se construya el exón V-J de la caclena ligera del iintbcito en
el locus r o i,, y Llna vez más el colte y en-rpalme une un exón dei segille11-
to C de la cadena ligera cuando se sintetiza elmRNA.
Pese a su nombre, la región constantc no es idéntica en todas las inmutto-
globulinas. Las pequeñas v¿u'iacionE-s clur- se prodr:cen i:riginan cinr:r"r cla-
Locus
tcH 14 123-129 27 9' ll
2760 5 I
IGL 22 7A-71 0 7-11 7 -11
 Cambios permanentes y semipermanentes de la actividad del genoma 45t

Cromosoma 14 Fígura 14.18 Organización del

locus /6H (cadena pesada) en el
i
cromosoma 14.
123-129 segmentos
del gen V
27 segmentos 1"1 segmentos
100 kb del gen D del gen C

§es de inmunoglobulinas -IgA, IgD, IgE, igG e IgM- cada una con su pro-
pia función especializada en el sistema inmunitario. Al principio, cada lin-
focito B sintetiza una molécula de IgM, cuyo segmento Cs es especificado
por Ia secuencia Cr. que reslde en el extremo 5' del complejo (cluster) del
iegrcnto C¡1. Corno se muestra en la figura 14.19, en estadios ulteriores
de su desar:rollo, la célula inmadura podría sintetizar también algunas pro-
teinas IgD utilizando la segunda secuencia C¡1 del complejo (Cd), con
unión al segmento V-D-] de1 exón para esta secuencia mediante corte y
empalme altelnativo. En etapas uleriores de su vida, cuando han alcanza-
do la madurez, algunos linfocitos B sufren un segundo tipo de cambio de
clase, que causa un cambio completo de1 tipo de inmunoglobulina sinteti-
zada por el iinfocito. Este segundo cambio de clase exige un nuevo evento
de recombinación, que elimina la secuencia Cp y CE junto con la parte del
croinosoma entre esta región y el segmento C¡1, 1o que especifica la clase
de inrnunoglobulina que ahora sintetizará el linfocito. Por ejemplo, para
que el linfocito pase a sintetizar IgG, el tipo más prevalente de inmunoglo-
bulina I'abricada por los linfocitos maduros, Ia eliminación ubicará uno de
los segmentos Cy que especifican la cadena pesada de IgG en el extremo 5'
del complejo (figura 14.2q. Por 1o tanto, el cambio de clase es ur1 segun-
do ejemplo de reordenamiento del genoma que se produce durante el de-
sarrolio de los linfocitos B. El mecanismo es distinto de la unión V-D-|, y el
eyento de recombinación no invoiucra las proteínas RAG.

La diversidad de los receptores de células T se basa en reordenamientos

sinriiares, que ligan los segmentos génicos V D, I y C en dif'erentes combi-
naciones para producir genes específicos de células. Cada receptor com-
prende un par de moléculas B, que son similares a la cadena pesada de las
inmunoglobulinas, y dos moléculas cr, que se asemejan a las cadenas lige-
¡as r de las inmunoglobulinas. Al igual que las inmunoglobulinas, ir:s

::_
ONA §
§
d Reordenarniento del DNA
,f I
g"f
w.
Figura 14.19 Síntesis de una inmu-
DNA
';l§&üií§,&@;;. noglobulina específica. El reordena-
miento del DNA dentro del locus de
Transcripción la cadena pesada liga los segmentos
I V D y J, que son ligados, después, a
un segmento C por corte y empalme
Exón 1 Exón 2 Exón 3
del mRNA. En las células B inmadu-
ras, el exón V-D-J siempre se une al
Corte y empalme alternat¡vo exón C, (exón 2) para producir un
mRNA que especifica una inmunoglo-
bulina de ciase M. En un estadio evo-
1ó
lutivo temprano de la célula B,
también se producen algunas inmu-
';e;;iwx * * ffi§rffi;x*x**x$$x»;;;; noglobulinas D por corte y empalme
I altérnativo que liga el exón V-D-l al
I
+ I
lnmunoglobulina D
exón CE. Ambos tipos de inmunoglo-
bulina se unen a la membrana celular.
lnmunoglobulina M
45? Capitulo 14 Regulación de i¿ actividad del genoma

Figura 14.20 Cambio de clase de ij*ii:i: ,; Cp CE C13 C1'1 .I, C*l tI¡ C^¡2 C14 Ce Crx2
inmunoglobulinas. En este elemplo,
siete segmentos Cp scn eliminados,
lo que ubica al segmento Cy2 al lado Delecion por recombinación
de la región J. Por lo tanto, esta célr:la
I
\J^lz v1+ u€ ucrz
B sintetizará una molécula de inmu-
noglobulina C, que es secretada por
la célula. Los dos segmentos rotula-
dos iy son seudogenes.
receptores de células T quedan incluidos en la mernbran¿r celular. y per:tr.ri-
ten que el linfocito reconozca antígenos extracellll¿ires y responda a ellos.

r, .,'a i_*.:;;l'.:{*1, ü,¿ ;;,; q5:ili{4:jt jrt il - i;y t;fu" ,;;ifl .

En la sección i0.2, se describieron algunos de los efectos que puede
gjercer la estructura de la cromatina sobre la expresión clel genoma.
Estos varían de la moclulación de la iniciación de Ia tr:anscripción en un
promotol individual por: posicionamiento de nucleosomas, al silencia-
niiento de grandes segmentos de DNA encerr¿rdo en una estructura cro-
matínica de orden superior. Este últirno es un medio inlportante para
pl'ovocar cambios a largr: plarzo de la actividad del genorna y está inipli-
cado en una serie de eventos reguladores. Uno de ellos concierne a los
loci de tipo de apareamiento de las levaduras, que ya comentamos en
esta sección: el silenciamiento de los casetes HNIRu y LIhlLa detelnlina-
c1o, sobre todo, por la sepultura de estos loci en cromatina inaccesibie.
en respuesta ¿r la influencia cle sus secuencias silenciadr:ras corriente
arriba. La desactivación de X (sección 10.3.1) también implica la forma-
ción de clonratina inaccesible, en este caso a 1o largo de casi tocla la lon-
gitud de uno de los dos crolnosomas X c1e un nírcleo f'ernenino.

Merece consideralse otro ejemplo dc silencirrnricni...r por crolnatina. Éste

es un sistelna que volvel'emos a encontrar más adelante en este capítulo,
al estr"rdiar los plocesos de clesarrcllo de la mosca de la {i'uta. Concierne a
la farniiia de genes Pol",-comls, formada por" alrededol de i0 genes que
codifican proteínas que se Llnen a secuenci¿rs cle DNA, denoniinaclas eie-
nlentcs de respuesta a Polycomb, e inducen la formación de hetelocroma-
tina, la forma conden-sada cle cromatina que impide [a transcripción cle los
genes que contiene ({igura 14.21). Cacla elemento dle respuesta tir'nc una
longitud apro,rimacla de 10 kb. pcrono p¿n:ece contener sitios de unión¿l
Polycon-rb específicr:s, lo que sugiele que otr¿ls proteínas actú¿in conto
intermediarias en ia unión a Polycornb. LIn cancliclato para este papel dr:
intermecliar"io es la ploteína no Pclycomb clenominada plctcína cle cambio
Dors¿li I (DSP1), qr-re se une a las secuencias 5'*GAAAA-3' presünles crl
la región crntral cle un elemento de respuesta a Polycomb. Las mut¿lcio-
nes cle e-ctas secuencias que impiclcn la unión a DSPl tarrbién irnpiclen el

*ene* h*r¡r:*ti**s

Fígura 14.21 Polycomb m¿ntiene el

silenciamiento de regiones del Proteina Polycomb
genoma de Drosophilq al desenca-
denar la formación de heterocro-
matina. Obsérvese que la unión de la
proteína Polycomb a su elemento de
respuesta es mediada por otras prote-
Toda la región es silenciada
ínas no mostradas en este dibLlio.
 Cambios permanentes y semiperrnanentes de la actividad del genorna 455

reciutamiento de proteínas Polycomb en sistelxas erperimentales.

Cualquiera que sea el mecanismo, el resultado de la unión a Polycomb es
la nucleación de heterocromatina alrededor de proteínas Polycomb, con
propagación ulterior de la heterocromatina a lo iargo clel DNA en cual-
quiel dirccción. por decenas cle kilobases.

Las rrgiones silenciadas contienen genes homeóticos que, como se verá en

la sección 14.3.4, especifican el desarrollo de cada parte del cuerpo de la
mosc¿l. Como sólo una parte del cueryo debe ser especificada en una deter,
minada posición en Ia mosca de la fruta, es importante que una célula expre-
se únicamente ei gen hr:meótico co1'recto. Esto es garantizado por la acción
de Polycomb, que silencia de manera penlanente los genes homeóticos que
deben desactivarse. Sin embargo, las proteínas Polycomb no determinan
qué genes serán silenciados: la expresión de estos genes ya está reprimida
antcs de que las proteínas Polycornb se unan a sus elementos de respuesta.
Por lo tanto, la función de Polycomb es mantener más que desencadenar el
silenciamiento de genes. Un punto importante es que la heterocromatina
inducida por Polycomb es hereditaria: después de la división, las dos nuevas
células conservan la heterocromatina establecida en la céluia madre. Por
consiguiente, este tipo de regulación de actiüdad dei genoma es perrnanen-
te no sólo en una sola célula, sino tambión en un iinaje celular.

Las proteínas trithorax actúan de manera similar a Polycomb, pero ejercen el

efecto contrario: mantienen un estado abierto de la cromatina en 1as regiones
de genes activos y sus dianas comprenden los mismos genes homeóticos que
los que son silenciados, en diferentes partes del cuerpo, por las proteínas
Polycorrb. Los modos de acción de trithorar y Polycomb pueden estar estre-
chanlente relacionados, pues hay evidencia de que las primems se unen a sus
sitios cliana a través de una proteína mediadora, denominada GAGA. que se
une a secuencias dentrr: de elementos de respuesta a Polycomb. Algunas
niut¿rciones anulan la actividad tanto de Polycomb como de trithorax, lo que
inciica que ambos sistemas pueden tener cüponentes comunes.

I é.:"3 ffi*zt¡$xri* r. tx1 Heri:{}r§}* tf:¡.*§ {*trflr§}t**;

'd* r*tr¿¡x?i;ye¿lst**rl*x
';r e

Ei último mecanismo de inducción de cambios a largo plazo de la acti-

viciar{ del genoma que consideraremos implica Ia utilización de un cir-
cuito de retroaliment¿¡ción. En este sistema, una proteína reguladora
activa su propia transu:ipción, de manera que una vez que su gen se ha
activado se expresa en forma continua (figura 14.22). se conocen cliver-
sos ejemplos de este tipo de regulación por retroalimentación:
uu El actiyador de la transcripción MyoD, que participa en el desanollo
muscular, es uno de ios ejemplos mejor conocidos de diferenciación
l celular en los vertebrados. una céh:1a está destinada a convertirse en un
i
t1

t miocito cuanclo comienza a expl:esar el gen m\,ol). El ploducto de la :|r.*n*crip*i*n

Activa su ia¡.._._'_**re*
i transcripción cle este gen es un activaclor de la transcripción que tiene propro gen rl*! **n ¡;lclivxdr:r
, como diana una serie de otros genes que codifican ploteínas específicas
¿«ie&Y,%i*iii.i,,ii¡d;
del múscuio, conto actina y miosina, y que también es indirectamente
re-qponsable de una de las camcterísticas claves de los miocitos: la
¿rusencia de un ciclo celular nonnal, pues est¿ls células están detenidas
en la fase Cl (sección 15.5.1). La proteína NIyoD también se une
\r\-
+
_\.h_
¡ Expresión del gen

corriente arriba de ruyol),lo que garantiza Ia expresión continua de su

propio gen. El resultado de este circuito cle retroali¡nentación positiva 1''1...
Activa los
es que la célula -"isiue sintetizando proteínas especí{iczrs del músculo y genes diana
sigue siendo i.rn miociro. E,l est¿rdo diferenciado es heleditario, ya que la
división celul¿ir se acompaña por: la transmisión de MyoD a las células
hijas, lo que asegura que éstas tan:bión sean miocitos, Figura I4.22 Regulación por retroali-
mentación de la expresión de genes.
 "':1w'

Capítulo 14 Regulación de la activrCad del genoma

e La proteína deformed de Drosophila es una de varias prüteínas codi-

ficadas por genes homeóticos selectores y su funciÓn es especificar 1a
identidad de los segmentos en la mosca de la fruta (secciÓn 14.3.'1).
La proteína deformed (Dfd) es responsable de la identidad de los
segmentos de la cabeza. Para cumplir esta función, Dfd debe §er coll-
tinuamente expresada pr:r las células pertinentes. Esto se 1ogÍa
mediante un sistema de retroalimentaciÓn, con unión de Dfd a un
potenciador ubicado corriente arriba de1 gen Dfcl. La autorregulaciÓn
por retroalimentación también controla la expresión de por 1o menos
algunos genes selectores homeóticos de los vertebrados.

§e"3 ffi*ge,x§mx§*m dx §m mctr*v§dxd *itr*§ ffiffi§?ffi§&ai,

a s {{
;-: r§ p'ft !.:iYr"r r,
u&§¿Mgts§6 u§ { r-{s3á :i
&¡G"rh¿¡ 1':'f\! {}q

La vía de desarollo de un eucarionte multiceiular comienza con un

óvulo fecundado y finaliza con una forma adulta clel organismo. E,n el
ínterin, hay una compleja serie de eventos genéticos, celulares y fisio-
lógicos que se deben producir en el orden adecuado, en las céiulas
correctas y en los momentos oportunos para que la vía culmine de
manera exitosa. En los seres humanos, esta vía de desarrollo determi-
na que un adulto contenga 1015 células diferenciadas en alredeclor de
25O tipos especializados, con coordinaciÓn de la actividad de cada
célula con ia de todas las demás. Procesos de desarrollo de tal com-
plejidad podrían parecef inextricables, aun con los poderosos instru-
mentos de investigación de la biología molecular moderna pero, en
los últimos años, se han hecho avances notables respecto de su cono-
cimiento. La investigación que ha respaldado este plogreso se ha dise-
ñado alrededor de tres principios guías:
,, Debe ser posible describit y comprender los eventos genéticos y bio-
quírnicos sobre los que se basa la diferenciación de tipos celulares
individuales. A su vez, estg significa que debería estar al alc¿lnce el
conocimiento de cómo se construyen tejidos especializados e. inclu-
so, partes corporales complejas.
* Los procesos de señalamiento que coordinan eventos en diferentes
células deben ser pasibles de estudio. En la sección 14.1 vimos que
se están comenzando a describir estos proce§os en el nivel molecular.
,,¡ Debe habel' similitudes y paralelos entre los procesos de desarrollo
en diferentes organismos. lo que refleja orígenes evolutivos conlunes.
Esto signifi"u q"u" se puede obtener infoimación relevante para el
desarrollo humáno a pártir de estudios de organisn-ros modelos elegi"
dos por la relativa simplicidad de sus vías de desarrollo.
La biología del desarrol|: abarca áleas de genética, biología molecu-
lar biología celular, fisiología, bioquínica y biología de sisterna-s.
Estamos interesados sólo en ei papel del genoma en el desarrollo -v, por
1o tanto, no intentarelnos una revisión de amplio espectlo dc la inves-
tigación sobre desarrollo en todos sus aspectos. En cambio, nos con-
centraremos en cuatro sistemas modelos de creciente complejidad
para investigar los tipos de cambio cie actividad del genoma qLre sobrc-
vienen dulante el desarrollo.

; .i"i. i fri
41
{§C}{J *x?, *axtxx§*§*ffi*;'.
 I

Regulación de la actividad del genoma durante el desarrollo

(A) Síntesis de transcritos génicos

largo programa de investigación que, en la actualidad, está revelando la tempranos-¡nmediatos
base genómica del desarrollo de los seres humanos y ctros vertebrados.
Por lo tanto, seguiremos esta misma progresión, de 1o relativamente sim- N ero
¡
ple a lo relativamente complejo.
Ul nrla PE n¿.'fF..tn1
".
En la sección 9.1.1 aprendimos que los bacteriófagos lisogénicos, como 1., Transcritos "tempranos-¡nmed¡atos"
pueden seguir dos vÍas de replicación alterrrativas después de infectar una
célula huésped. Además de la vía lítica, durante la cual se ensarnblan y libe-
ran nuevos fagos de la célula poco después de la infección inicial (después (B) Papel del represor cl
de 45 minutas para l"), estos fagos también pueden cumplir un ciclo liso-
génico caractenzado por la inserción del DNA del fago en el cromosoma Genes cl P"", Genes
huésped. Ei profago integrado pefinanece latente durante muchas genera- i;* sf
tempranos P, -. ,.,....,..,..,,.
PH temPranos
ciones bacterianas hasta que un estímulo químico o fisico vinculado con
l
daño del DNA induce la escisión del genoma L, el rápido ensamblaje de +
fagos y la lisis de la cé1ula huésped (véanse figuras 9.4 y 9.5). tr, Cl

.- --*":ru-fff*
1\ -Hepresof
ñl &arrferí¿Ífug* i" #e&e *f*grr sr?#* lísis o físag*nio -,{i---,
La capacidad de los bacteriófagos como 1, de seguir un cicio de infección r'\
VV
.a
lisogénico plantea tres preguntasr ¿cómo "decide" el fago seguir el ciclo
Estimula Bloquea la
la expresión exPresión de
lítico o lisogénico?, ¿cómo se mantiene la lisogenia? y ¿cómo se induce de cl los genes
al profago a romper la lisogenia? Dada la cantidad considerable de iempranos
c*nocimientos acerca de la expresión del genoma durante la infección i", (C) Papel del represor Cro
es posible dar respuestas muy detalladas y complejas a estas preguntas.
Flepresor Cro
I
DiD
,L IH
I
El primer paso del ciclo de infección lítica es la expresión de los dos .@é4
+
genes fu tempranos-inmediatos, que se denominan N y cro. Éstos son , Prt',
transcritos de dos promotores Ply Pn, respectivamente (figura I4.23A). Ausencia a-O*riU"
La proteína N es el antiterminador que permite que la RNA polimerasa de expresión de los genes
del huésped ignore 1as señales de ter:rninación que encuentra inmediata-
de cl
tempranos

mente corriente abajo de las secuencias de codificación N y cro y trans-

criba los genes tempranos-demorados {véase figura 12.9). Estos genes Figura 14.23 Base genética de la
comprenden cII y cIII, que activan juntos a un tercer promotor Pp¡4, eue elección entre lisis y lisogenia lleva-
determina la transcripción de cl. Este es un gen de suma importancia, da a cabo por el bacteriófago I.
pues codifica la proteína represora X,, el interruptor maestro ciave que
detiene el ciclo lítico y mantiene la lisogenia. El represor cumple esta
fr"rnción uniéndose a los operadores 0¡ y On, adyacentes a Pt_y Pp, res-
peütivamente (figura 14.238). La consecuencia es el silenciamiento de
casi todo el genoma X,, porque Pl y Pn dirigen la transcripción no sólo
de los genes tempranos-inmediatos y tempranos-demorados, sino tam-
bión de los genes tardíos, que codifican las proteínas necesarias para el
ensamblaje de nuevos fagos y la lisis de las células huésped. Uno de los
pocos genes que se mantienen activos es int, que es transcrito a partir
de su propio prornotor. La proteína integrasa codificada por este gen
cataliza la recombinación específica de sitio que inserta el DNA i, en. el
genoma del huésped. La lisogenia persiste durante numerosas divisiones
celulares, porque hay expresión continuada, aunque en bajo nivel, del
gen cI, de manera que la concentración de1 represor cI presente en la
célula siempre es suficiente para mantener desactivados a P¡ y Ps. Esta
expresión continuada de cI se debe a que el represor cI, cuando está
unido a Op, no sólo bloquea la transcripción a partir de P¡1, sino que
también estimula la transcripción de su propio promotor Pp¡4. Por con-
siguiente, el doble papel del represor cI es la clave de 1a lisogenia.

Una vez expresado cI, la proteína represora impide el ingreso en el

ciclo lítico y garantiza que se inicie y se mantenga Ia lisogenia. Pero l"
no siempre ingresa en el ciclo lisogénico: en algunas ocasiones, una
infección provoca la lisis inmediata del huésped. Esto se debe a la
Capítuk: 14 Regulación de la actividad Cel genoma

actividacl del segundo gen temprano-inmediatc, que tanibién codifica

un represor pero, en este caso, Lrno que impide la transcripción de cl
(figura 14.23C). Por 1o tanto, la decisión entre lisis o lisogenia depen-
de del resultado de una carrera entre cl y crc. Si la síntesis dei repre-
soi'cI es más rápida que la de cro, se bloquea la expresión del genorna
¡, sobreviene lisogenia. En cambio, si cro gana la carrera, el represor
Cro bloquea la expresión de cI antes de que se haya sintetizado sufi-
ciente represor cl para silenciar el genoma. E,n consecuencia, el fago
ingresa en el ciclo de infección lítica. La decisiÓn parece ser aleatoli,:
en función de eventos azarosos que detelminan que el represor cl o
cro sea el que se acumula con mayor rapidez en la célula, aunque cier-
tas condiciones ambientaies pueden ejercer alguna infiuencia. Por
ejemplo, el crecimiento en un medio rico despiaza el equilibrio hacia
el ciclo lítico, lal vez porque es beneficioso producir nuevos fagos
cuando las células huésped están proliferando. Este desplazamiento
depende cie la activación de proteasas que degradan ia proteína ¿:11, lo
que reduce la capacidad de 1a combinación cli-clll de activat'14 trans-
cripción del gen replesor cL

Si el bacteriófago ingresa en e1 ciclo lisogénico, este estadr: se mantiene

en tanto el represor cI esté unido a 1,:s operadot'es O¡ y OB. Por lo tanto,
se inducirá el profago si el nivel del represor cl activo desciende por
debajo de cierto punto. Esto puede suceder pol'azar, 1o que detemrin{r
inducción espontánea, o en respuesta a estímulos físicos r: químicos. En
E. cotí, estos estímuios activan un mecanismo protector general, la res'
puesta SOS. Parte de esta Íespuesta consiste en la expresión de un gen
de E. cc¡li, recA, cuyo producto desactiva e1 represor cl escindióndolo
por la mitad. Esto activa la expresión de los genes tempranos, lo que
permite el ingreso dei fago en el ciclo lítico. La desactivación del repre-
sor cl también implica que ya no se estirnuia la transclipción de cl. [o
cuai evita la posibilidad de lestablecer la iisogenia a través de la ¡ínlesis
cle más replesor cI. Por ende, la desactivaciÓn del represol cl determina
la inducción del profago.

¿Qué aprendenros de este sistema modelo?

' Un cambio genético simpie puecle determinar cuá1 de dos vías de de-
sarrollo sigue una célula.
',, Los cambios genéticos pueden consjstir en una combinación de acti-
vación y represión de diferentes promotores.
, E,s posible reprogmmar una vía cle clesatrollo y tlansfelirla a tttta víu
altel"nativa en respuesta a estímulos apropiados.

;..'
El segundo sistema que analizaremos es la fot'maciÓn de esporas por:.la
bactJria BcLcilltts subtilis. Al igual que la lisogenia i., ésta n0 es, c¡r tér-
minos estlictos, una vía de desalrollo sino sÓlo un tipo de difcl'cncia'
ción celular, pero el proceso ilustra clos de los aspectos fundamentales
que deben encararse cuando se estudia el desarr:ollo genuino en orga-
,iir*o, multicelulares: cómo se controlan ios camblÑ ¿e la actividad
del genoma a 1o largo del tiempo y cómo la señalización coordina evcn'
tos que ocurren en diferentes célu1as. Las ventajas de Bacíll¿ls como
sistema nroclelo son que es fácil hacerlo crecer en el laboratorio )' que
se lo puecle e.studiar mediante técnicas genéticas y de biología molecu'
lar', comr: análisis de mutantes y secuenciación de genes'
 Regulación de la actividad del genoma durante el desarrollo ¡I57

Nucleoide Figura 14.24 Esporulación de

Pared
r' celular Eacillus subtilis. La parte superior del
Eaci|Íus diagrama muestra el moCo vegetativo
subt¡l¡s norm¿l de división celular, que implica
Ia formación de un tabique a través
Membrana del centro de la bacteria y da origen a
celulár dos células hijas idénticas. La parte
I
J_ raorque inferior muestra la esporulación, en la
que el tabique se forma cerca de un
extremo de la célula, lo que determi-
DIVISIÓN CELULAR
VEGETATIVA
na una célula madre y un¿ preespora
de diferentes tamaños. Con el tiempo,
la célula madre engloba por completo

"/ \ a ia preespora. Al flnal del proceso, se

libera I¿ espora m¿dur¿, resisrente.

ESPORULACIÓN

,Rl
'.L|

.l;'¡;.,::,;;1,;; :'¡!',:,,,3ii; : ,::.-;¡1..'.¡tt.iar,j*j i,

,*r- l:,:l..l.:t.:.:i ::

a -: :

B«cillus es uno de varios géneros cle bacterias que producen endosporas

en respuesta a condiciones ambientales desl'avorables. Estas esporas son
muy resistentes al malt1'ato físico y químico, y pueden sobrevivir duran-
te déc¿rdas o, incluso, siglos; ios arqueólogos que excavan sitios que con-
tie¡ren restos humanos y animales consideran con mucha seriedad la
posibiliclad de infección pol esporas de carbunco producidos por B.
«nthrucis. La resistencia se debe al carácter especializadr¡ de la cubierta
de la espora, que es irnpermeable a nurnerosas sustanci¿rs químicas y a
calnbir¡s bir:quírnicos dentro de la espora. Io que letras¿l la degradación
del DNA y otros polímeros, y permite que la espora sobreviya'dulante
uir períocto cle latencia prolongado.

En el labc¡ratr¡rio, la pr:ivación de nutrientes suele inciucir la espolulación.

Esto hace que la bacteria abandone su modo vegetativo habitu¿rl de divi-
sión celular, que implica la síntesis de un tabiqr-re (o pared transversal) en
el centlr: de la célula. En su lugar', las células collstruyen un tabique atípi-
co, nrás delgado que elnorr¡al, en un extrelxo de la cé1ula (figura 14.24).
Esto clea dos compartimentos ceiulares, de los cuales el rnás pequeño se
denonúna preespora y el más grande, célula madre. A medida que avanza
la espolulación, la preespora es er:igiobada por completo por la célula
I
I
madre. Ahola, las dos células están dedicadas a vías de diferenciación dis-
1

I.:
tintas, pero coordinadas: la preespora sufre los cambios bioquímicos que le
I

I
 Capitulo l4 Regulación de Ia actividad del genoma

§er,:i*j *etr;i**ilrlsr*$ pemriten entrar en l¿itencia, mientras que l¿t cólu1a madre consffule la
cubierta resistente alrededor cle la espora y, por último, mllere.
t

,:.a;-j¡-r:'i :.:i i; l-::.:.;,. i .],rl.l ;;r:i:"i

e
Ln síntcsis de subunidadcs o'especiales. que cambian le.'spceifieida.l Jcl
ri,e promotor de la RNA polimerasa de Bctcillus controla. en glan n:edida. krs ,r,i
:..:..,
canrbios de actividad del genoma durante la esporulación. Cabe recorcia:. .t:::

que la subunidad o es la parte de la RNA polimer"asa que recono,-c ia

secuencia del promotor bactedano y que el reemplazo de una subunid¿rd o ', ..
por otra con una especificidad de unión al DNA diferente puede deterrni-
nar que se transcriba un conjunto distinto de genes (secciÓn 11.i.1). ,,:';.,,,',
Figura 14.25 Cascada de fosforilación Hemos visto cómo utiliza E. cali este simple sistema de controlell rcspuL.s-
que induce la activación de SpoOA. ta a la agresión témica (véase figura 11.25). Ésta también es la clar.'e dc los
Abreviaturas:4, KinA; B, KinB; C, KinC; cambios de actividad del genoma observados durante la esporulaciór,.
OE SpoOF; OB, SpoOB; O{ SpoOA; P -' ::' ',
indica un grupo fosfato PO.z-. '

Las subuniclacles o convencionales de B. sLútilis se denominan oA v oH. ,:l.',

Estas subunidades se sintetizan en células vegetativas y perrniten quc la
RNA poiimerasa reconozca promotores para todos los genes qur- ncce-
sita transcribir', a fin de mantener el crecimiento y la división celular
normaies, En 1a pl"eespora y Ia célula madre, estas subunidades son
reemplazadas por o.F y oE, respectivalnente, que reconocen secuencias
pron-)otor¿ls diferentes y, por ende, provocan cambios en gran escala de
los patrones de expresión del genoma. Una proteína denominada
SpoOA, presente en las células vegetativas pero en forma inactiva,
cleterrrina el cambio maestro de crecimie-nto vegetativo a formación de
esporas. Esta proteína es activada por fosforilación a través de una c¿is-
cada de proteincinasas que responden a diversas señales extracelulares
que indican la presencia de una agresión ambiental, como la f¿rlur dc
nutrientes. La respuesta inicial depende de tres cinasas, llamadas 1{inA,
KinB y KinC, que se fosforilan ellas mismas y, después, pasan el fosiato
a través de SpoOF y SpoOB a SpoOA (figura 14.25). La SpoOA activa- l r :¡¡¡¡¡¡..

da es un factor de transcripción que regula la expresión de cliversos ',,.,,.,.,,,.r,.,,',

genes transcritos por la RNA poiimerasa vegetativa, por 1o tanlo. cs

reconocidaporlassubunidadeSoAyo,Hcomunes.Lr:sgenesactitados
incluyen los correspondientes a oF y oE, 1o que deterirrina el c.rmbio
L" haciadiferenciaciónapIeeSporaycé1u1an¡adre(figur'al4,26)
_... -,'
fu
* ' -+
"ttt'' á**r+ {
ne
Al principio, tanto ol'como oE están presentes en las clos células en ví¿ls cle ,.'':':''l.']:
¡H
diferenciación. Esto no es exactamente lo deseado, porqlle oF es Ia subuni- .,:"ii.,.,,,,,,',"
Gen de sE Gen de úE dad específica de preespola y, por ende, sólo debe estar activ¿t en esta céh-r' ,,r,iil.ii. ,
',
q!li!''#Ú{94@1"
,e@§* t*@tue, 1a,yo,Eesespecí[icadeIacélu1amadre,Porconsiguiente,sereqr.licl.e
¡r
tt tnedio para activar o clesactivar 1a subunidad apropiada en la célrrla curt'ec- . . t
*-* ta.SeconsideraqueeStose1ogradelasiguierrtemane1,a(figura1-l.27\:
....

wkffi ,'r La subunidad oF se activa al ser liberada de un complejo cün uÍl¿r r,'l':,. .'r..'r,, . c
segunda proteína. SpoIIAB. Esto es controlado por un¿r telcera pt'o- i, '§';,r,,rrr: (
teína, SpollAA que, cuando no está fosfrlllada, también se puedt .'ú;;',, t
Figura 14.26 Participación de SpoOA unir ¿r SpoIIAB e impedir que esta última se una a oF. Si SpoTIAA rro c
en la esporulación de Bscíllus. está fosfot'ilada, entonces oF se desprencle y se activá; cu¿inclc' ,.f:'''r..,. c
SpoOA es fosforilada en respuesta a SpoIIAA está fosforilacla, oF p".*rr,-raaa unicla a SpoIIAB y, pol' ende., " ',''"§.,,,,,',,::.: d
una señal extracelular derivada de es inactiva. En la célula madre. SpoIIAB fbsforila a SpolIr\A r ast.
agresiones ambientales, como muestra nr¿intiene unida e inactiva a oF. Pero en la pleespora, lós intentos de ,.,,;';;,,;,;,,,.',,,.;:;",, q
la figura 14.25- Es un activador de la
transcripción cuyas funciones incluyen
SpollAB de fosforilar a SpolIAA son antagonizados por o-tla protci- .. . l:
-'
la activación de genes de Ias subunid¿- na, SpolIE; y por io tanto, oF se libera y se torn¿l activa. La capact-,,',,,¡¡¡i,1,,,,,,,,,:¡ir':. .'
des oE y oF de l¿ RNA polimerasa. clacl cle SpoiiE-cie antagonizar a SpoIIAd en la preespora, pcru-nr.fl ,,,u,,,,,,,,,,.,,,,
X
Abreviaturas: E, oE; I oF; OA, SpoOA; P la cé1ula madre, deriva del hecho de que l¿is moléculas dc SpollL
indica un grupo fosfato, POrz-. están unidas a I¿r membrana cle la superficie clel tabique. Cc,mc¡ lo':§'t',t,..*
§w'
Regulación de la actividad del genoma durante el desarrollo

preespora es mucho más pequeña que la célula rnadre, pero la super- {A) Aclivación de oF en la preespora
lieie del tabique es similar en ambas, [a concentr-ación de SpoIIE es
. ,#3-
mayor en lii preespora, lc cual permite que antagonice a SpollAB. CELULA MADRE
!e'
* La subunidad oE es activada por degradación proteolítica de una *
#ri!i&f
td,q 9

ploteína precursora. La proteasa que lieva a cabo esta degradación #!l'li:riii t9d
r- -:
w
es la proteína SpollGA, que abarca ei tabique entre la preespora y la
cé1ula madre. El dominio proteasa, que se encuentra dei lado de la célu-
PREESPOBA
la madre dei tabique, es activado pr:r la unión de SpoIIR a un dominio SpollE bloquea
receptor dellado de la pleespora. Este es un típico sistema de transduc- §t
G-id i

ción de señales mediacla por receptor (sección 14.1.2). El gen de +;.

SpollR es uno de aquellos cu-vo promotor es reconocido específicamen-
|
te por oF, de modo que la activación de la proteasa y ia conversión de
i .i. , ..,. r.,

pre-oE en oE activa se produce una vez que se ha iniciado la transcrip-

ción dirigida por oF en ia preespora. l",w
La activación de oF y oE es sólo el comienzo de la historia. En la preespora,
alrededor de una hora después de su activación, oF responde a una señal des-
conocida (quizás, de la célula mad¡e) que provoca un ligelo cambio de la
actividad del genoma en la espora. Este ir-rcluye la transcripción de un gen de
otm subunidad o, oc, que reconoce promotores corriente amiba de genes iB) Activación de uE en la célula madre
cu¡,os productos son necesarios durante etapas uiteriores de la diferenciación Tabique
a esporas. Una de estas proteínas es SpoiVB, que activa otra proteasa unida
Inactiva
al tabique, SpolVF (figura 14.28). Después, esta proteasa activa una segun- d
#i;;::* .4. spollR
da subunidad o de la célula madre, oK, que es codificada por un gen trans-

\r
crito oE, pero es retenida en la célula madre, en una foma inactiva, hasta que I -*-*" ¡¡&¿rma*aÍ*alsú¡
¿ I
se recibe la señal de activación de ia preespol'a. oK dirige la transcripción de
los genes cuyos productos son necesarios durante las etapas tardías de la vía i§
de clif'elenciación a célula madre. Aciiva
rii:.ir.,,
..

P¡r'a lesumir, las características claves de la esporulación de Br¡cill¿¿s son CÉLULA MADRE PBEESPORA
las siguientes:
* La proteína maestra, SpoOA, responde a estímulos externos a través
c1euna cascada de fenómenos de fosforilación, para determinar si se Figura 14"27 Activación de las sub-
debe proclucir el cambio a esporulación y cuándc debe tener lugar. unidades s específicas de preespora
* y células madre durante la esporu-
Una sucesión de subunidades o' de la preespora y de ia cóluia madre lación de Bocillus. (A) En la célula
desencadena cambios dependientes dei tipo de actividacl clel genoma madre, oF es inacliva porque está liga-
en las dos células. da a SpollAB, que fosforila a SpollAA
* e impide que esta última libere a or.
La señaliz¿rción intercelular g¿lrantiza la coordinación de los eventos La activación de oF en la preespora se
que se producen en la pleespora y la célula madre. produce por liberación de su comple-
jo con SpollAB; la concentración de
,É 0 I SpollE unida a la membrana influye
tG4
'sww*r+;,d
L fa5.rd3r., indirectamente en la liberación. (B)
B. st¿btilis es Lln organismo unicelular 1', allnqlle 1a esporulación implica En la célula madre, oE es actlvada por
la cliferenciación coorclinada de dos tipos celulares, apenas se la puecle degradación proteolítica a cargo de
SpollCA, que responde a Ia presencia
considerar comparable con los proc:esos de clesarrollo que ocurren en los
en la preespora de Ia proteína depen-
organismos multicelulares. La espolulación aporta datos sobre las diente de <rF, SpollR. .Ai¡reviatur¿s: AA,
maneras generales en que se podría regular la actividad ciel genoma SpollAA;AB, SpoilAB; E, o'E; F, oF; CA,
durante el desarrollo de un organismo multicelular, pero no indica qué SpollCA; R, SpollR.
eventos específicos soir esperables. Pol' lo tanto, debemos examinar el
desarrollo de un eucarionte multicelular simple.

e. *i*gxrx *Í; ut? {?;üd"".ü d-' '''-'3t. '.'lr: **;*rir:nff rr.:uiti,::*:{r:ír:r

En la clécada de 1960, Sydney Brenner inició la investigación con el
nenratodo microscópico C. elegans (figura 14.29) para utilizarlo corno
un nrodelo simple de desarrollo eucarionte multicelular C. elegans crece
con f¿rcilidad en el laboratorio y tiene un tiempo de genelación breve,
 Capítulo l4 Re3',lar,rr de l¿ ¿.-.;'. d¡d ;';l o., ,,,-¿

Tabique e1 ."
nledido en días, perLl, aun así, conveniente para el aníilisis genérico. Ei
nematodo es tr¿lnsparente en todos los estadios de sti ciclo vital, de
lnactiva
,{ modo que es posible el exanten interno sin rnatarlo. Éste es Lln punto
aily:.,.' $ spoiV§
&14§6!ii
impoltante, porque les ha permitido a k:s inyestigzrdores seguiltodo el
I -^--- ¡d¡,@
proceso de des¿rrrollo del nematoclo en el nivel celular. Se ha graficaclcl
l" I
I cada división celular de la vía desde el huevo fecund¿rdo hasta el netna-
T
+ tr¡clo adulto J- se h¿i iclentiflcado cada punto en que la céiuia adopt¿l Llna
funcién especializada. Además, se ha mapeado la conexión complet¡i dd
las i02 células que forman e1 sistema netvioso del nematodo.
CÉLULA MADBE PREESPOHA
El genoma de C. elegurus es relativamente pequeño, sólo 97 NIb (véase
cuadro 7.2), y se conoce toda la secuencia. El análisis de la secuencia,
Figura 14.28 Activación de sK mediante muchas de las técnicas descrit¿rs en el capítuio 5, está colren-
durante la esporulación de Eocillus. zando a asignar f'unciones a los genes clesconocidos y a establecer víllcu-
Obsérvese que el esquema es muy L:s entre la actividad del genoma y las vías c1e desan'ollo. El objetiyr: cs
similar al procedimiento utilizado para
activar oE (véase figura 1 4.278).
una descripción genática completa dei desarrollo de C. elegar¿s. una
Abreviaturas: C, oc; K, oK; lVB, meta factible de alcanzar en un futuro ncl demasiado lejano.
SpolVB; lVF, SpolilF.
S*f*r,"il¡'¡]*r¡*l rf*,'iir:si;sil r*l*l*¡ rii-..,:,'i:: *-' c.-.'.'¡,:.'i:: #* i;:
d* d. *l*g*ns
l,'¡.¡i'r'*
Una característica clucial que apuntala la utilidad de C. elegctrs como ins-
trumento de investigación es que su desaruoflo es rnás o nrellos invariable:
el patr:ón cle división y diferenciación ceiular es casi el rnismo en toclo indi-
viduo. Esto parece deberse, en glan rnedicia, al señalamiento intelceiular,
que induce a cada céiula a segpir su vía cle difet'enciación aclecuada. Pala
ilustrarlo, estudialernos e1 desarrollo de la l,ulva de C. elegans.

La nrayoría de los nematodos C. elegctts son hermafloclitas, lo que significa

que tienen ór'ganos sexuales masculinos y femeninos. La vulva forrna parte
de1 aparato sexual de 1a her-nbra y es el tubo a tlr¿lyés del cual ingl'esa el espe-
ranratozoide y se ponen los huevos fecundados. La rulya adulta contprende T

22 cóluias. que son la progenie de tles células ancestrales localizadas original- I

nrente en una fila de la superficie itrf'elior del nematodo en desanollo lligura I
14.30). Cada una de estas céiulas ancestrales sigue la vía de difelenciación
que lleva a la producción de células r.r.rlvares. La célu1a central, denominarla r
P6.p, adopta el "destino de célula r,tlvar primaria" y se divide para producir n
§
t¡cho nuevas células. i,as otras dos cólulas -P5.p y I,7,p- siguen e1 "dcstino §
Figura 14.29 Nematodo de célula vulvar secunda::ia" y se clir..iden en siete células cacla una. Dcspués,
Caenorhobditis elegans. La micro- t
fotografía muestra un nematodo her- estas 22 células reorganizan sus posiciones para clear'1a vulva.
mafrodito adulto, de alrededor de
I mm de longitud. La vulva es la Un zispecto crucial del desarrollo de la vrrlr,a es que ésta se clebl' ubicar' .'rl
pequeña proyección locaiizada en la ia posición correcta respecto de la gónacla, la estluctura que contienc los
parte inferior del anlmal, aproximada- óvulos. Si Ia vulva se desarlolla en e1 lugar erróneo, la gónada no recibir'á
mente en el medio. Se pueden ver espeñ-natozoides y los óvu]os nllnca sel'írn fecundados. Una célula intlago-
óvulos dentro del cuerpo del nema-
nadal, denominacla célula ancla, aporta la información posicional rec¡ueri-
todo a ambos lados de la región de
la vulva. Reimpreso con autorización da por: las células progenitoras de ia vulva (figu'a 14.31). Se ha demostradtr
de Kendrew, J. (Ed.), Encyclapaedio la importancia de la célula ancla en experimentos que la destruycn de
.I994
of Molecular Biology. (e §lanera artificial, en embliones de nematodo: en ausencia de la célula
Blackwell Publishing. ancla, no hubo clesarrr:llo yulvar. La implicación es que la célula ¿rncla
 Regulación de la actividad del genorna durante el desarrollo

...... ...ri:iri:::ri,...
Figura 14"30 Divisiones celulares
Céiulas P7.P: i.ii :
ancestrales
r,l:t:llrlrli'ii'l
que deterrninan la producción de
las células vulvares de
Caenorhabditis elega ns. Tres célu-
Divisiones las ancestrales se dividen de una
celulares manera programada p¡ra producir
Células
22 células descendientes que reorga-
vulvares nizan sus posiciones relativas entre sí

\l-/
para construir la vulva.

Vulva

secreta un compuesto de señaianriento extracelular que induce la diferen-

ciación de P5.p, P6.p y P7.p. Este compuesto de señalamiento es la prote-
ína denominada LIN-3, coclificada por el gen lin-3,

¿P*r qué P6.p adopta el destino de célula primaria, mientras que P5.p y
P7.p adoptan los destinos de células secundarias? Hay dos posibilida-
des. La primera es que LIN-5 genere un gradiente de concentración 1',
por 1o tanto, ejerua distintos efectos sobre P6.p, la céh-rla más cercana a
é1, que sobre P5.p y P7.p más distantes, corl-lo muestra la figura 14.31.
La evidencia a favor de esta idea proviene de estudios que muestran que
las células adoptan el destino secundario cuando son expuestas a bajos
niveles de LIN-1. En fbrma alternativa, la señal que dirige a P5.p y P7.p
a sus destinos secundarios podría no provenir directamente de la célula
ancla, sino de P6.p, en forma de un compuesto de señalamiento extrace-
lular diferente cuya síntesis por P6.p se desencadena por la activación de
LIl".¡-3. Esta hipótesis es avalada pol las características anormales pre-
sentadas por ciertos mutantes en los que más de tres células se dedican
al desalrollo de la vulva. En estos mutantes, hay más de una célula pri-
mefia, pero cada una está siempre rodeada de dos células secundarias,
lo que sugiere que, en el nematodo vivo, la adopción del destino de célu-
la secundaria depende de la presencia de una célula primaria adyacente.

Hay otras características instructivas del desalrollo de la vuiva en C. ele-

gctns.La primera es que el proceso de señalamiento que dirige a P6.p a
su destino de célula primaria tiene muchas similitudes con el sistema de
transducción de señales por MAP cinasa de los vertebrados (véase figu-
ra 14.10). El receptor de ia superficie celular par:a LiN-3 es una protein-
cinasa llamada LET-23 que, a1 ser activada pol la unión de LIN-3,

Figura 14.31 Papel postulado de Ia

célula ancla para determinar el des-
tino celular durante el desarrollo de
la vulva en Caenorhabditis elegans.
Se considera que la liberción del com-
Célula ancla puesto de señalamiento LIN-3 por la
célula ancla dirige a P6.p (ilustrada en
rojo), la célula más cercana a la célula
ancla, al destino de célula vulvar pri-
... .1 ..
maria. P5.p y P7.p (ilustradas en ama-
lt

.'.i\.. riilo) están más lejos de la célula

ancla y, por lo tanto, están expuestas
:)l
a una concentración más baja de LIN-
at 3 y se convierlen en células vulvares
secundarias, Como se menciona en el
.,..,,,ii..ir.::i:i;' I l-:, :r:]1i6 texto, hay evidencia de que señales
, rr ,,.ii:lri'l,.tPrirnáriAS$§ii1 de la célula vulvar primaria también
!t,,,ir;:-r:i:t,.,,tl],urlritlriill;ririri:i:riilt'-

influyen en dirigir a las células secun-

darlas a sus destinos.
461 Capitulo 14 Regulación de la aclivldad del genoma

desencadena una serie de teacciones intracelulares que determinan la

activación de una proteína similar a MAP cinasa, que estimula. a su vez,
diversos activadores de la transcripción. Lamentablemente, todavía no
se han delineado los genes diana en las célu1as progenitoras vulvares pri-
marias o secundarias, pero el sistema está abierto a estudio.

Una seguncla característica notable es que, además de la señal de activae ión

proporcionada por ia célula ancla en forna de LIN-3, ias células prog*ni- .'
toras de la vulva también están sujetas a los efectos desactivadores de ui
segundo compuesto de señalamiento secretado por la célula hipodérmica,
una vaina multinuclear que rodea ia mayor parte delcuelpo del nematodo.
Esta señal represora es superada por las señaies positivas que inducen la :

diferenciación de P5.p, P6.p y P7.p, pero impiden la diferenciación no dese- ,,, ,i

ada de tres células adyacentes, P3.p, P4.p y P8.p, cada una de las cuales se ::.
'

dedicaría a1 desarollo de la vulva en caso de disfunción de la señal reple- : ,

sora, por ejemplo, en un nematodo mutante.

En resumen, los conceptos generales que se deben extraer del estudio

dei desarrolio de la vulva en C. elegaís son los siglientes:
En un organismo muiticelular, la información posicional es importan-
Citoplasma Núcleos
i te: se debe desarrollar la estructura correcta en el lugar apropiado.
I

1.30 horas
La dedicación a la diferenciación de una pequeña cantidad de célu-
ias progenitoras puede llevar a 1a construcción de una estruL'tuta
multicelular.
La señaiización intercelular puede utilizar un gradiente de concentra-
ción para inducir diferentes respuestas de células en distintas posi-
ciones respecto de la célula de señalización.
Una célula podría estar sujeta a señalización competitiva, en el cluc una
señal 1e indica que haga una cosa y una segunda señal, 1o contrario.

Embrión sincitial
*I células
_/\
¡''asÉ!::,,?;.,"
.i¡,itii¡:;
Blastodermo celular
*rrsai
*ri*¡r t '
+ lamiento de genes se veía facilitado por'la presencia de cromoso66-s "gigan-
Vá11ra]
Figura 14.32 Desarrollo temprano
del embrión de Drosophila.
lnicialmente, el embrión es un solo
sincitio, que contiene un¿ cantidad
de núcleos que aumenta de manera
gradual. Estos núcleos migran a la
periferia del embrión después de
alrededor de 2 horas y en el térmi-
no de orros 30 minutos, com;enz¿n
a construlrse las célul¿s. El embrión
mide alrededor de 500 pm de Iongi-
tud y 170 pm de diámetro.
q { :
i *" J^;ir r'}^F**...áll
{#l}JU
LJ*-'3e.Jf^ ryC¡
""* :l*xd.^r**A;l-"
lr{I-¡bAUf t¡§{.§ }ttÉi{ág dLlfur{J}¿§r
"..^l*nn**r4*s
E1 último organismo cuyo desarrollo estudiaremos es Drasopltila rueluna'
gaster. Los antecedentes experimentales con la mosca de la fruta sc rctnon'
tan a 1910, cuando Thomas Hunt Molgan la utilizÓ por primera vez como
sistema modelo para la investigación genética. Para Morgan, las ventajas de
2:30 horas Drosophila eran su tamaño pequeño que permitía estudiar g¡andes núme-
5.000 células ros en un solo experimento, sus requerimientos nutricionales mínimos (a
Ias moscas les gustan 1as bananas) y la presencia de variantes ocasionales
con características genéticas fáciles de reconocel:, coll]o color de ojos infre-
cuente, en poblaciones naturales. Morgan no sabía que otras ventails eran
.| F¡:si*r'i*r ,rn genomlpequeño (180 Mb;véase cuadro7.2) y el hecho de que el ais-
tes" en las giándulas saiivales. Éstos están formados por múltiples copias
de 1a misma moiécula de DNA dispuestas una al lado de ia otra, lo que on-
gina patrones de bancieo que se pueden correlacionar con el mapa iisico c1e
cada cromosoina para identificar con precisión ias posiciones de los genes
cleseados. Pelo Mr:rgan sí anticipó que Drosophilct se podría convertir en
un organismo importante para la investigaciÓn sobre desarrollo, ul"l tL'lnl
que 1e interesaba tanto como hoy a nosotros.
La principal contribució n de L) ro sophílo a nuestro conocimiento del desan r:-
l1o ñan siilo los clatos que ha aportaclo sobre la lrlanera como ei emi:rión incli"
ferenciaclo aclquiere informaólOn posicional que, linalmente, detelrnina la
construcción cie partes corporalei complejas en los lugares corectos del
organismo aclulto. En algunos aspectos, Drosophila es bastante atipica en
 Regulacién de la actividad del genoma durante el desarrollo /t§¡

*Énto a su organizact1tt embrionaria (como analizaremos en la siguiente

genéticos que especificangl p,lan corporal de
[..iOrl, pero los mecanismos hurna-
incluidos los
t *or"u son similares a los de otros organismos, seres
p"r lo tanro, Ios conocimientos obtánidos de Drosophilahan dirigido la
*;.
Ñestigación a áreas del desarrollo humano que, durante largo tiempo, se
lill;:,r':Wi' **m fJlil*$
con
lonsidéraron inaccesibles. Para estudiar esta historia, debemos comenzar
t, *f*"tor que tienen lugar en el embrión de Drosophila en desarrollo.

au.,

l*, gr*"** r??sfsrrr*§ esfc&fecsr¡ Srr§d§gñf*5 prsfer§s§ 8r? sl Figura I4.33 Establecimiento del.eje
lW&r;t*r, d* Dr*s*Phila anteroposterior en un embrión de
Drosophilo. El eje anteroposterior es
la característica infrecuente del embrión de Drosophjla en-sus primeros establecido por gradientes de las proteí-
,ñtu¿iou es que no está fotmado por muchas células, como la mayoría
de
nas Bicoid, Nanos, Caudal y Hunchbac(
los organismos, sino por un solo sincitio compuesto por una masa de cito- como se comenta en el texto. En este
.olasmá v múltiples núcleos (figura 14.32). Esta estructura persiste hasta diagrama, los gradientes de concentra-
lue 1¡ iondas iucesivas de divisiónnuclear hayan producido alrededor de cióñ están indicados por las barras de
colores bajo el bosquejo del embrión.
i.SOO nú"l.os: sólo entonces empiezan a aparecer células mononucleares
,individuales alrededor de la parte externa del sincitio, lo que genera la
,:estflJctura denominada blastoder:rno. Antes de haber alcanzado el estadio
:fle blastoderrno, ha comenzado a establecerse la información posicional.

principio, la información posicional que necesita el embrión es una defini-

(anterior) y cuál la deatrás (poste-
:cion ¿e qué ex*emo es la parte del frente
,rior), asi como datos similares le§pecto de superior (dorsal) e inferior
r {ventral). Esta inforrnación es proporcionada
pol gradientes de concentra-
'ció., d" proteínas, que se establecen en el sincitio. La mayoría de estas prote-
ínas no ion sintetizadas pcr genes del embrión, sino que se traducen a partir
,de:nRNA inyectados en el embrión por la madre. Pata 3re-lizar cómo kaba-
jan estos genls de efecto materno, estudiaremos la síntesis de Bicoid, una de
ias «:atro proteínas involucradas en determinar el eje anteroposterior.

El gen bicoid se transcribe en las células nodriza {nurse) matemas, que están
anterior del
'eniontacto con los óvulos y se inyecta el mRNA en el e»rtremo
hueyo no fecr"rndado. La orientación del ówlo en la cámara ovárica define
,esia posición. El rnRNA bicoid pe_rm?n9ce en la región anterior del óvulo,
unido por su región 3'no traducida a1 citoesqueleto de la célula. No se tra-
duce dé inmediato, quizás porque su cola de poli(A) es demasiado corta. Esto
se infiere porque la traducción, que tiene lugar después de la fecundación del
hueyo, eiprecedida por la extensiór de Ia cola de poli(A) a través de los
esfi¡erzos combinadoi de ias proteínas Cortex, Grauzoney Staufen, todas las
cuales son sintetizadas de genes del huevo. Después, la proteÍna Bicoid se
difunde a través del sincitio y gerrera un gradiente de concenkación, máximo
en el extrerno anterior y mínimo en el extremo posterior (figura t4-33).

También participan otros tres productos de genes de efecto materno en

la generaiión déi gradiente anteroposterior: las proteinas Hunchback,
Nanos y Caudal. Todas scn inyectadas como mRNA en la región ante-
rior del huevg no fecundado. Ei mRNA nünos es transportado a la parte
posterior del huevo y se une al citoesqueleto mientras aguarda la traduc-
ción. Los rnRNA hunchbscky caudal se distribuyen de manera uniforme
a tfavés del citoplasma paro, después, sus proteínas establecen gradien-
tes mediante la acción de Bicoid y Nanos:
* Bicoid activa el gen hunchback en los núcleos embrionarios, lo que Figura 14.34 Patrón de segmenta-
complementa al 6RNA huncl**ck en la región anterior y reprime la ción de Drosophilo melonogaster
traducción del mRNA caudal materno. El resultado es uf1 aumento adulta. obsérvese que la cabeza tam-
de concentración de la proteína Hunchback en la región anterior y bién está segmentada, pero el patrón
l una disminución de la de Caudal. no es discerñible con facilidad a partir
I de la morfología de la mosca adulta'
I
 Capítulo 14 Regulación Ce l¿ actividad del gencma

Figura 14.35 Papel de los productos

de los genes gap para conferir CABEZA I róR¿x I tsnobtEtl
información posicional durante el
desarrollo del embrión de
D roso phi I a rn elo nog oster. Se tndica
el gradrente de concentración de
cada producto del gen gap mediante
barras de colores. Se señalan las o¿r-
tes del embrión que da origen a l'as
regiones de la cabeza, el tórax y el Huckebein ffi,,,'
abdomen de la mosca adulta. Tailless ffiW$ffiS2l::,:
Orthodenticle
Empty spiracles lr,l:ffi]
Buttonhead';a:l:W,:t:
Giant
Krüppei
Knlrps

" Nanos reprime la traducción del mRNA hunchback, 1o que contl.ibu-

ye aún más al gradiente anteroposterior de la proteína Hunchback.
El resultado neto es un gradiente de Bicoid y Hunchback, mayor rn el
extremo anterior, y de Nanos y Caudal, mayor en el extremo postel.iot
(véase figura 11.33). El gradiente es complementado por la pr(lreína
Torso, otro producto de genes de efecto materno, que se acumula en lo§
extremos anterior y posterior. Eventos similares determinan un graclien-
te dorsoventral, predominantemente de la proteína denominada l)orsal.

...- -.
.., . ".:,.. ...-- _ .. _",: t..; :.
:.

El plan colporal d. l" *or.u-i¿ri,u, así como el de la larva, se cünstru-

ye ¿i partir de una serie de segmentos, cada uno con un papel estrllr:tu-
ral diferente. Esto se observa con máxima claridad en el tórax, que tiene
tres segmentos, cada uno con un pa1' de patas, y el abdomen, f",rmado
por ocho segmentos, pero también es válido pal'a Ia cabeza, aultquc su
estructura segmentada es menos visible (figura 14.54). Por 1o tauto, cl
objetivo del desarrollo er:rbrionario es la producción cle una larva joven
con el patrón de segmentación correcto. I
¡
Los gradientes establecidos en el embrión por los productos de los genes j
cle efecto materno son el primer estadio en ia folmación del patrón de §

segment:ición. Estos gradientes apartan al intedor: del embrión 1a canti- i ,,.,

r1¿rd básica de información posicional y, ahora, cada punto clel sincitio r

tiene su propia huella química únic¿t, definida por las cantidades lelati- r
las de los diversos ploductos de los genes de efecto m¿lterno. La e-rpre- I
sión de los genes gap vuelve más precisa esta información posir:ional. r
Tres de las proteínas de gradiente anteroposterior -Bicoid, I lunctrrback y
Caucl¿rl- son activadoras de la transcripción que tienen por cliana los
genes gap de los núc1eos, que ahora revisten ei lado interno del rrnbrir¡n
(véase figura 14.32), Las identidades de los genes gap expresados en un
núcleo particlllar dependen de las concentraciones le]atiyas dc las pro-
teínas de gradiente y, por io tanto, de la posición del nírclec¡ en el eje ,

anteroposterior: Algunos genes gap son activados directamenlc por

Bicoid, Hunchback y Caudall por ejemplrs, buttonhead, empty splraclt.s
y artl'tadenticle, que son activados pot' Bicoid. Otros genes gap son actl-
vados de manera indirecta, como elcaso de huckebeiny tailless. quc tc-('
PLrir{-itrlI a
ponden los actiyadores
d riJS LIU la
i:1Ul.lv¿ILIUIgS c1e Li¿iIt§§i lIJL:iOIl que
lal transcripción qUe son
§OIl actii,adeis por
AgalV¿llJu¡ H"1 .-,l,,¡t,¡¡13.r¡¡t¡¡¡t¡l¡¡¡¡1¡¡.¡,
:

Tcrso. También hay efectos represores (p. ej., Bicoid reprime Ia expre' '.,'j§,,tt:,,.t¡::t.¡...,lt
sión de knirps) y los productos de los genes gap regulan su propia expre'1iL;*i,1,$2'::t'
 Regulación de la actividad del genoma durante el desarrollo 465

que !a
sión ile cliversas müneras. Este comptejo interjuego determina
Complejo Aniennapedia (ANT-C)
tfanspoltada ahora por ias concen- Did Scr
in¡r1rmación posicional del embrión, lab
.. ffi'-.M..-.
pb
- -.ffi..1@-r-@-.-:
Antp
ir.aciones rel¿itivas de los productos de los genes
gap, se vuclva más deta- rt ¿¡

ll¿rdr t figLrra l't.;5).

Complejo bitórax (BX-C)
par, esta-
El sig¡iente conjunto de genes que se activa, los genes de regla
básico. La transcripciÓn de_estos gcncs Ubx abdA AbdB
bk.J,,t el patrón de segmentaciÓn
,*up"*d.-o 1as concentraciones relativas de los procluctos de los genes
ouo n tier't" iugar en 1os núcleos qr-re han sido encerr¿lclos en las células.
F"l i" ranro, És pr.rductos de loi genes de regla clel par no se difunden Figura 14.36 Los complejos de genes
que
a través clel sincitio, sino que siguen ubicados dentro de las células Añtennapedia y Bithorax de
lo, .*pr.tun. El lesultado es que , ahora, ei embrión puede considerarse
D rosop h i I o m eiilono g o ster. Ambos
ur3 serie de franjas, cacla una de las cuales consiste en un conjunto de comp§os están localizados en el oo'
células que expresan un cietenninado gen cle regla del pal. Et una nueva mosoma 3 de la mosca de la fruta,
roncla dé actiiación de genes, se activan ir:s genes de polaridad del seg' ANT-C corriente aniba de BX-C. Por lo
mento, 1o que aporta mayor delinición a las franjas al fijar los tainaños general, los genes se dibujan en el
órden mostrádo, aunque esto significa
y las lccaliiaciones precisas cle 1o que. con el tiempo, serán los segmen-
cue son transcritos de derecha a
ios de 1a mosca lalvá1. Gradualmente, hemos convertido ia información iiquierda. El diagrama no refleia las lon-
posicional imprecisa de los gradientes de efecto matefno en un patrón gitudes reales de los genes. Los nom-
c1e segmentación bien definido. 6res completos de los genes son los
siguientes: lab, lobial polps;pb, probo.'
cipedio, Dfd, Deformed; Scr, Sex combs
{c; ¡4*n!.;,lt:,: #* l*: s:g ' - : '-- :: -' li*l*rrci¡:l;#* p;r §***s ráduced; AnW Antennapedia; Uhx,
**r;:*Slic*§ 5§l8rr#r*5 lJltrobitharax; obd\ obdaminol A;
Lrrs genes cle regla clel par y de polaridad del §egmento establecen el AbdB, abdominal B. En Ant-§ los
genes no selectores, zerknüllt y bicoid
patrón de segmentación de1 embriÓn, pelo no determinan las identida-
éstán iocalizados entre pb y Dfd,y fushi
áes de los segmentos indiyiduales. Esto corresponde a los gene§ horne' tararu res\de entre Scr Y AntP.
óticos selectJres, que fuercn los primeros descubiertos en virtud de los
efectos extravaganies que ejercen sus mutaciones sobre el aspecto de la
nrosca aciulta. Por ejemplo, 1a mutaciÓl.:r ttfitenntpsdi« transforma el seg-
mento de la cabeza, que suele ploducir una antena, en uno que crea un¿1
pata, de rlaneta que la mosca mut¿inte tiene un par de patas donde debe-
rí¿rn estar las anienas. Los prirneros -qenetist¿rs estaban fascinados por
e§tos mutantes homeóticos monstruosos y Se recolectaron muchos
durante las primeras dócadas clel siglo rx'

El mapeo genético cle lnutaciones hon-ieóticas ha revelado que los genes

-.e1ectóres s" ag.rrpan en dos grllpos en el cromosoma 5. Estos comple-
jos (c/usier.s) ion el complejo Antennapedia (ANT-C), que contiene
gÉnes involucraclos en la determinaciÓn de los segmentos de la cabeza y
ól tó.u*, y el complejo Bitl-rorax (BX-C). que contiene genes pat'a los seg-
rn3ntos del abdomen (figura 14.36). Algunos otros genes de desarrollo
no selectores" como bir:oíd. tanll:ién están ubicados en ANT'C. Una
car-acterístic¿r i.nteresante cle los colnplejos AIIT:C y BX-C, que todavía
no se conoce, es que el orclen cle los genes col'Iesponde al orden cle los
segrrlentos cle la mosca. el prirner gen de A¡{}C es lttbictl pnlps, qr-re con-
tróla el segmento más anterior cle la mosca, y e1 ú1timo gen de BX-C es
Abdominul-8. que especifica el segmento más posterior.

Carla segmento expresa el gen selector con'ecto, polql-ie la activación de cada

ulo responde a 1a inlbnnación posicional representacla porlas distribuciones
cle los piocluctos cle los genes gap y de los genes de legln del par. Los produc-
tos de iot ge,'res selectoles son, pot'sí mismos, activadoles de la tr¿inscl'ipción.
y contienen, cada uno, una versión homeodominio de la estructtu'a de r-rnión
* pXA hélice-giro-hélice (sección I 1,1.1 ). Cada proclucto cle los genes selec-
tores, quizás junto con un coactil'ador como Exlraclenticle, activ¿l el coniun-
to de genes nácesarios pala ir-riciar el clesau'ollo c1el se¡¡r-nento especificaclo. El
niantJnimiento clel estado diferenciacio es garzintizado' en pal'te, por el ei'ec-
¡t§ú Capitulo l4 Regulación de la actividad Cel gencma

Figura 14.37 Cornparación entre el lab pb Dfd Scr Antp Ubx abdA AbdB
ccrnplejo del gen HOM-C de NU¡VI.U.
Drosophila y los cuatro complejos
(c/usfers) Hox de los vertebrados.
Los colores indican los genes que codi- *-'- .:1i.,, tr'
HoxA.--::re---@.,rc-1:1§,
l#k ffi
. jffi. *-X XÍ - ,-g:-
fican proteínas con estructuras y fun- -
ciones relacionadas. Véanse más
detalles sobre la evolución de lcs conr- H^YH.:-ib¿ &,-;;.ffi:1 á:. r:: :; Ial;l
.l8.2.I -;;
plejos Hox en la sección . El dia-
grama no reflela las longitudes reales
HoxC .. ¡i¡§-,-r:.-"--*,, i-,--,*-jj.-;..**e,-:Y--ffi*-É;tr-*¡L^á._
de los genes. Los nombres de los
genes del complejo HOM-C son los
siguientes: lob, lobial polps; pb, pro- HnYL-...&. ¡4@- --l

boscipeciia; Dfd, Deformed; Scr, Sex -;

co m bs red uced ; Antp, Anten na ped i o,'
Ubx, Ultrobihorax; obdA, obdominal A;
AbdB, abdominol B.
to rcpresor que cada producto de los genes selectores ejerce sobr:e 1¿i expre-
sión de los otros genes selectores y, en parte, por el trabajo de Polycomb que,
como se yio en la sección 14.2.2, construye cromatina inactiva sobre los
genes selectores que no son expresados por una determinada célula.

l*: q=-ncs hanl*ofitur se/eclor*s son ccriL(.t:í'ist cr¡s ¿"r¡¡iyi'r',: :

d :' ¡ á *sarra I r-) eucü r i on!: su o*ric r
I

Los homeodon-iinios de los diversos genes selectores de Drosophílu son

llamativamente similares. Esta observación indujo a los investigadores a
buscal, en la década de 1980, otros genes homeóticos utilizando el
homeodominio cor"no sonda en experimentos de hibridación. Prin:e¡'o, se
investigó ei genoma de Drosopltilct,lo que determinó el aisiar¡icnro de
varir:s genes que contienen homeodominio, nr¡ conocidos ¿lntes. Éstos
no h¿rn resultado ser genes selectores, sino otros tipos de genes quc codi-
fican activ¿rdores cle la transcripciór, que participan en el clesarrollo. Los
ejemplos complenden los genes de regla tlel par eyen-skípped ;- lilshi
tttr(tzLt, y el gen de polar:idad segmentaúa engroiletl.

El inter'ós real surgió cuando se investigaron los genomas de otlos organis-

mos y se adviltió que hay homeodorninios en los genes cle una glun varic"
dad de ailimales, incluidos los seres humanos. Aún más inesperaclo fue el
descubdmiento cle que alglrnos de los genes con homeodorninios rie estos
otros organismos son genes homeóticos selectores olganizaclos en comple-
jos similales a ANT-C y BX-C, y que estr:s genes cumplen funciones equi-
valentes a las de las versiones de 1)rosophilu y especifican la construcción
delplan colporal. Por ejemplo, las mutaciones delgen HctxCB de ratón ori-
ginan un animal con un par dc costillas adicionales debido a la convclsión
de un¿l vértebra lumbar (norrnalnrente, en l¿i zona lumbar) en una vriltcbra
dorsal (cie la qlle nacen l¿ls costillas). Otras mutaciones Hox en anim¿llcs
provocan defolmaciones de ios miembros, corrlo ausencia de un antebrazo
o dedos supeffllltreralios cle ias manos o los pies.
Figura 14,38 Especificación del sis-
tema nervioso del ratón por genes
selectores del complejo (cluster) FM1112r31415 16 t7 18 lr,e!{a esrlnal
HoxB. Se representa esquemática- ffiffiffi8ffi"M '..11a... ..
;tt*§§a.r:!l 'ii:::u.:lt:i
mente el sistema nervioso y se espe-
cifican las posiciones mediante los HoxBl &ffi
genes HoxB individuales (HoxB1-
HoxB9) indicados por las b¿i'ras ver- Hox82
des. Los cümponentes del sistema HoxB3
neryioso son: F. pros:ri:efa'r-., tV,
Hox84
mesencéfalo; ri-r8, rombómeros; y la
médula espinai. Los rombómeros son HoxBS-B W§
segmentos del rombencéfalo observa-
dos durante el desarrollo.
florArM
 Regularión de la actividad del genoma durante el desarrollo {§7

ln la ¿rctualidad, consideramos que los complejos AM-C y BX-C de Verticilo 4:

scnes selectores de Drosophílu son dos partes de un solo complejo, carpelos
ienominado en generaicomplejo de genes hr:meóticos u HOM-C. En los Verticilo 3:
vertebrados, hay cLlatro compleir:s de genes homeóticos, llamack:s estambres

HoxA-HoxD. Cuando se alinean estos cuatro cr:rnplejos entre sí y con

HON,{-C (figura 14.37) se observan similitudes entre los genes en posi-
ciones equivalentes, por 1o qtie es posible rastrear la historia evolutiva
de lc,s complejos de genes homeóticos selectores desde los insectos hasta
los se;'es humanos (véase sección 18.2.1). Al igualque en Drosophila, el
orden de los genes en los complejos de los vertebrados refleja el orden
de las estructuras especificadas por los genes en el plan corporal del
aclulto. Esto se observa con claridad en e1 complejo HoxB del ratón, que Figura I4.39 Las flores se forman
controla el desarrollo del sistcma nervioso (figura 14.38). La conclusión de cuatro verticilos concéntricos.
que hay que lesaltar es que, en este nivel fundamental, los procesos de
des¿lrrollo de las moscas de la fruta y otros eucariontes "simples" son
similares a los procesos que tienen lugar en los seres humanos y otros
organismos "complejos". Ei descubrimiento de que los estudios de las
mo-ccas de la fruta son directamente pertinentes al desarrollo humano
abre vastas perspectivas de futuras posibilidades de investigación.

: . . 1 '*
¿' " :. "
ú-
El poder de Drosopltilct camo un sistema rnodelo de desarrollo se extien-
'de
de aún más allá ios vertebrados. Los procesos de desarrollo de las
plantas son, en la mayoría de los aspectos, muy dil'erentes de los de las
moscas de la fruta y otros animales, pero hay ciertas similitudes genéti-
cas, lo que es suficiente para que el conocimiento obtenido sobre el de-
sarrollo de Drosophílu sea de valor para interpretar investigaciones
simiiares llevadas a cabo con plantas. En par:ticular, el leconocimiento
de que una cantidad limitada de genes homeóticos selectores controlan
el plan corporal de Drc:srsphilu ba llevado a creal un modelo de desaro-
llo c1e plantas que postula c¡ue ia estluctura de ia flor está determinada
por un pec¡ueño núinero de genes homeóticos.

Tr¡das las flores se construyen según líneas similares, cornpuestas por

cuatro velticilos concéntricos, que comprenden un órgano floral dife-
rentc cada uno (figura 14.19). El verticiio externo, número l, contiene
sépalos, que son hojas modificadas que enwrelven y protegen al capullo
clurante los primeros estadios de clesarrollo. El verticilo siguiente, el
núnlero 2, contiene los pétalos distintii,os y dentro de éstos están los ver-
ticilos 3 (estarnbres, los ór'ganos reproductores masculincs) y 4 (carpe-
los, los órganos reproductores femeninos).

La nlayor parte de la investigación soble el desarrollo de las plantas se

lra llevado a cabo canAntirrhirittm {boca de dragón) y Arabidopsis tha-
li«nu, una pequeña algarroba que ha sido adoptada como especie mode-
lo. en parte porque slr genoma es de sólo 125 Mb (véase cuaclro 7.2),
uno de los nrás pequeños cc¡nocidos entre las plantas fanerógamas. Si
:
bicn estas plantas nc paleoen coÍItenel'proteínas con homeodominio, sí
tienen genes que, cuando mutan, proyocan cambios homeóticos en la
I arquitectura fl<xal. como el reemplazo cle sépalos por carpek:s. El análi-
sis de estos mlltantes ha originado el "moclelo ABC", que afilma que hay
tres tipos de genes homeóticr:s -4, B y C- que contrr:lan el desarrollo de
las flc¡res de la siguiente manera:
t,,

',,
* El verticilo 1 está especificado por genes de tipo A: tn Arabidop;s¡s,
t
.!
los ejemplos son upetcl«1 y a¡tetctla2.
l
1
Capítulo. 14 Regulación de Ia activid¿d del genoma

* E,lverticilo 2 está especificado por ios genes A, que actúan de acuer-

do con los genes ll; los ejemplos de estos últimos comprenden üpe-
talaS y pistillata.
* El verticilo 3 está especificado por los genes B más el gen C, ctgctmous.
* El verticilo 4 está especificado por el gen C, que actúa por sí misin*.

Conro se preveía por el trabajo con Drosophila, los productos de 1os

genes homeóticos A, B y C son activadores de la transcripción. Todc:.
excepto la proteína APETALA2, contienen el mismo dominio de unicn al
DNA, ia secuencia MADS, que también se encuentra en otras proteínas
que participan en el desarrollo de las plantas, como SEPALLATAl, 2 y 3,
que trabajan con las proteínas A, B y C para definir la estntctura detallada
de la flor Otros componentes del sistema de desarrr:llo de ias flores com-
prenden por lo menos un gen maestro -denominado floricattlc, en
Antirrhinum, y leafly , en Arabidopsis- que controla el pasaje de crecimien-
to vegetativo a reproductivo, 1o que inicia el desarrollo de las flores e inter-
viene además en el establecimiento del patrón de expresión de los genes
homeóticos. En Arabidopsis, también hay un gen, denorninado aily leuf,
cuyo producto actúa como Polycomb de Drosophikr (sección 14.2.2) y
mantiene el estadio diferenciado de cada célula al reprimir los genes hcme-
óticos que son inactivos en un determinado verticilo.

ft^,-.¡om,.¿t
t"':-3Llta¡crl

Si bien hay muchos pasos dentro de las vías de expresión de genes indi-
viduales en los que se puede ejercer regulación, los mecanismos de con-
trol claves actúan durante la iniciación de la transcripción, Los cambios
transitorios de los patrones cle expresión del genoma sobrevienen, sobre
todo, en respuesta a eslímulos externos que influyen en la transcripción
cie determir-rados genes. Algunos compuestos de señalamiento extracelu-
lares son importados a ia cé1ula e inciden directamente en la transcrip-
ción; por ejemplo, la lactoferrina en los marníf'eros. Las hormonas
esteroides también ingresan en Ia célula, pero influyen en la expresión
del genorna a través de receptores proteicos que actúan como activado-
res de la transcripción. En la r:epresión por catabolitos, en las bacterias,
la glucosa incide en Ia expresión de diversos genes involucrados en la
utilización de azúcares mediante el control indirecto del nivel celular de
AMP cíciico, que influye, a su vez, en la actividad de un activador cle la
transcripción denominado proteína activadora por catabolitos. Otra^s
vías de señalamiento son mediadas por receptores de la superficie celu-
lar, muchos de los cuales fot'm¿rn dín-ieros en respuesta a la señal extra-
celular. 1o que inicia una vía de transducción de señales que lieva al
genorna. Lavía de las NIAP cinasas es uno de estos ejemplos, pero ha¡'
vados otros, como los que involucran a los activadores de la transctrip-
ción denoininados STAT. Algr-rnas vías de transducción de señales utili-
zan segundos mensajelos, colÍlo nucleótidos cíclicos y iones calcio, quc
inlluyen en divel'sas actividades celulares, incluida la explesión del gcno-
n-tu. Lot cambios permanentes y semipermanentes de la expresiÓn del
genoma pueden ser secundarios a reordenamientos del genoma, como se
ábs".u" áurante el cambio de tipo de apareamiento en la levadura y la
generación de diversidacl de inmunoglobulinas y receptores de células T
en los vertebrados. Asimismo, 1os cambios permanentes y semipcrrla-
nentes pueclen ser provocaclos por proteínas colno Polycon-rb de
Drosophila melanogttstel, que induce la formación de heterocror:ralina
en las regiones de u, ..onlotoma que cieben ser silenciaclas. El estuclir'r
de sistenras modelos en ot'ganismos relativamente simples, como bacte-
,-ias, Cctenorhctbclitis elegais y l)rosophila ttelttnogctster, ha facilitadr:

:.&,..
 Resumen

tro conocimiento de la base genética del desarrollo. El ciclo de

'ección lisogénica del bacteriófago I indica las mane.ras como los cam-
genéticos simples pueden determinar cuál de dos vías de desarrollo
se sigue, y estudios sobre la esporulaciónI de Bacillus subtilis han ilustra-
!a 11 I
cómo se pueden producir ca¡nbios de expresión del genoma depen-
-

dientes del tiempo y cómo 1a señalización intercelular puede regular una

vía de diferenciación. Estudios del desarrollo de la vulva de C. elegans
reveiado los mecanismos de determinación del destino celular. La
xía más informativa para la genética del desarrollo ha sido la embriogé-
rpesis de la mosca de la fruta, cuyo estudio ha mostrado cómo se puede
,§specificar un plan corporal complejo mediante patfones controlados de
expresión del genoma. Este trabajo también ha revelado la existencia de
senes homeóticos selectores que controlan procesos de desarrollo no
Iólo .., las moscas, sino también en los vertebrados y en las plantas.
 ${«tr-
:i s
f, .jr ..,§.. }sr!!. ; ,,,,t f .._i i1 €.t t:.. ; *"
ri: .t*-X'q!-r"ii; i:${i§ .i§qh,
.;'.x .tl i]1t,,,,,,,,i::i *, ,ll¡i,ji * ; í .* ,¿
at
,e"",*,,,. # & ,¿ -. irf S &s§i
.;. § §
"F.."_:.-';

li:: i:
_.,Ilt
lli:al:liii i:r .,;f irrrrr':iri' rrr:ilrii,lr: a.i-i,S 131i'' ::1 rr; 1;'::1:.;l' L,i¡ ffi .&_§ &*$ S §,..jll&_,,
S.
k
q,-" * "r .P=- -'n .ffi *treh i-..1{É'-..
d.l' -¿
djB, l'*
¿*.; -- ;La
L..
;- "*.-"r
liÍ.
{
E6 § .!"Il ú'_ r
r." ! ',\ . ¡:- §- -& :
a. b ,,'.* L*" ;
:.§ 5 d'.4- ff i r- §. ; r" -
a **"

:::.:.

Parte 4 - Replicación y evolución de los genomas

vincula la replicación, la mutación y la recombina-
ción con la evolución gradual de los genomas a lo
largo del tiempo. Comienza con un examen detalla-
do de los procesos moleculares responsables de la
replicación de los genomas (capítulo 15), la muta-
ción y la reparación (capítulo 16), y la recombina-
ción (capítulo 17) antes de investigar la forma como
estos procesos han modelado las estructuras y eI
contenido genético de los genomas a través de la
evolución (capítulo 18). Por último, el capítulo 19
describe de qué manera utiliza la fiiogenética mole- ffimwWxreffiw wffi
cular la información evolutiva contenida dentro de
los genomas para investigar cuestiones como la§ *'r'.;i',: ::.i i: r: 4 x \¿:x t*t1i;ñ{i5
relaciones entre los seres humanos y otros prirnates, .. .t..

los orígenes del sida y ias vías migratorias seguidas ffi*. '*
&il d#*%
por el hombre mientras se diseminaba por el piane-
ta desde su lugar de nacirniento en África.
 &*!se §s iex St
ff-# **U n-ru B * #q er .e§B¡r "s", 6%
#of S*1 l* &*Sff u"*§ q#*s §t
*.,""d6
B \$; § ffi*§ ñ ff e "fu§ B
s#
ffiffi * s ffiffiffiffiffiffi%
l

-* r*
:

ii ¡ l. pr,:bler:': t-,p*;,:gitc,
15.2 lircc*se': d,) rt|tr;tJilir
*§.3 &*g*[xci*t"r d* fx r*pli*;i*i*r"l x3e l*s
§*t§1l§§§tHlel
,"t.n*.*i'*,-l* t *, i ee§.efljr3 'E"' lP\ &t {tit
----
TI :,rlPf )#-

Explicar qué significa el problema topológico y cómo lo resuelven las DNA topoisomerasas.

Describir el experimento clave que probó que la replicación del DNA tiene lugar mediante un proceso
semiconservador.

Reseñar los modos de replicación por desplazamiento y por ckculos rodantes del genoma.

Analizar cómo se inicia la replicación en bacterias, levaduras y mamlferos.

Describir las caracterÍsticas ctaves de las DNA polimeras¿s bacterianas y eucariontes.

Explicar por qué las cadenas lider y retrasada de una molécula de DNA deben replicarse mediante proce
sos diferentes

Describir en detalle los eventos que se producen en la horquilla de replicación bacteriana e indicar cómo
difieren de los observados en los eucariontes.

Comentar el conocimiento actu¿l sobre la terminación de la replicación en baqterias y eucariontes.

Explicar cómo mantiene la telomerasa los extremos de una molécula de DNA cromosómico en los euca-
riontes, y reconocer los posibles vínculos entre longitud de los telómeros, senescencia celular y cáncer.

Describir cómo se coordina la replicación del genoma con el ciclo celular.

La función primaria de un genoma es especificar ia huelia bioquímica de Ia

célula en la que reside. Hemos visto que el genoma log1a este objetivo
mediante la expresión coordinada de genes y glllpos de genes, 1o que deter-
mina el mantenimiento de un proteoma, cuyos componentes proteicos indi-
viduales llevan a cabo y regulan las actividades bioquímicas de la célula.
Fara continual desempeñando sus funciones, ei genoma se debe replicar
cada vez que se divide ia célula. Esto implica que se debe copiar todo el
contenido de DNA de la célu1a durante el período opoltuno del ciclo celu-
lar, y las moléculas de DNA resultantes deben distribuirse entre las células
 Capítulo 15 Replicación de los genomas
Doble hélice madre
Dos dobles hélices hijas
Figura 15.1 Replicacíón del DNA,
según predijeron Watson y Crick.
Los polinucleótidos de la doble héli-
ce madre están representados en
negro. Ambos actúan como molde
para la síntesis de nuevas cadenas
de DNA, ilustradas en rojo. Las
secuencias de estas nuevas cadenas
están determinadas por el aparea-
miento de bases con las moléculas
molde. El problema topológico surge
porque nc es posible separar, sim-
plemente, los dos polinucleótidos de
la hélice madre, la hélice debe ser
desenrollada de alguna manera.
''iillllll'
',;;;,:",t,':,
hijas de modn tal que cada una reciba una copia completa del genoma. Hn ,.....l.¡
este capítulo se analiza este proceso eiaborado, que abarca el área de ccn- .',:1,1.);;,,1
tacto entre biología molecular, bioquímica y biología celular.
La replicación del genoma se ha estudiado desde que Watson y Crick
descubrieron la estructura de la doble hélice del DNA, en 1955. Desde
entonces, la investigación ha sido impulsada por tres problemas relacir-
nados, aunque distintos:
* El problema topológico representó la preocupación fundamen¡al
entre 1953 y 1958. Este problema surge de la necesidad de desenro-
ilar la doble héiice para hacer copias de sus dos polinucleótid,:s
(véase figura 15.1). Este tema ocupó el centro de la escena a media-
dos de la década de 1950, porque era ei principal obstáculo con el
que tropezaba la aceptación de la doble hélice como estructura
corecta del DNA; sin embargo, pasó a un plano secundario en 1958,
cuando Matthew Meselson y Franklin Stahl demostraron que, pese a
Ias dificultades percibidas, la replicación del DNA en Escherickia
coli se producía según el método previsto por la estructura de la
doble héiice. El experimento de Meselson-Stahl posibiiitó el avance
de ia investigación de la replicación del genoma, aunque el problerna
topológico en sí mismo no se resolvió hasta principios de Ia dócada
de 1980, cuando se conoció por primera vez el mecanismo de acción
de las DNA topoisomerasas (sección 15.1.2).
* Desde 1958, se ha estudiado intensamente el proceso de replicación.
Durante ia década de i960, se identificaron las enzimas y las pr:ote-
ínas involucradas en la replicación de E. cali, y se delineó su función;
en ios años siguientes, se efectuaron progresos simiiares en el cr:no-
cimiento de los detalles de la replicación del genoma eucarionte. Este
trabajo continúa, y la investigación actual está centrada en temas
como la iniciación de la replicación y los modos de acción precisr:s
de ias proteínas que son activas en las horquilias de replicación.
* La regulación de 1a replicación del genoma, sobre todo en el contex-
to de1 ciclo celular, se ha vuelto el área de investigación predominan-
te en los últimos años. Este trabajo ha mostrado que la iniciación es
el punto de control clave de 1a replicación del genoma y ha comenza-
do a explicar cómo se sincroniza la replicación con el ciclo celular', de
ffranera que se disponga de genomas hijos cuando la célula se divide.
Nuestro estudio de ia replicación del genoma considerará estos tres
temas en el orden enumerado antes.
frá g:rmS§essBa g#p#§#gá{e
r'M§ * S á & § *
a 5.3
En su artículo de l,ilature donde anunciaron el descubrimiento de la
estructura de doble hélice del DNA, Watson y Crick efectuaron una de
las declaraciones más f¿mosas de la biología molecularr
"No hemos dejado de advertir que el apareamiento específico que
hemos postulado sugiere de inmediato un posible mecanismo de
copia del material genético".
El proceso de apareamiento al que se refieren es uno en el cual cada
cadena de la doble hélice actúa como molde para la síntesis c1* una
seg¡:nda cadena complementaria; el resultado final es que 1as dos ciobles
hélices hijas son idénticas a la molécula madre (figura 15.1). El csque-
 El problema topológico

ma está casi implícito en la estructura de la doble héiice, pero plantea

oroblemas, como admitieron §Vatson y Crick en un segUndo artículo
oublicado en Nature sólo un mes despuÉs de comunicar la e§tfuctura.
'Esteartículo describe con más detalle el prcceso de replicación ptopues-
to, p".o señala las dificultades que sulgen de la necesidad de desenrollar
la doble hélice. La más trivial de ellas es la posibilidad de que las molé-
iulas hijas se enreden. Más crítica es la rotación que acompañaría al de-
§enrollamisñto: como hay un giro cada 10 pb de la dobie hélice, la
replicación completa de la moiécula de DNA del cromosoma t humano,
qie tiene 250 Mb de longitud, requeriría 25 millones de rotaciones del
úNA *ro*osómico. Es difíci] imaginar cómo se podría producir esto
dentro del limitado volumen delnúcleo, pero el desenrollamiento de una
molÉcula lineal de DNA cromosómico no es imposible desde el punto de
vista físico. Por el contrario, una molécula bicatenaria circular; por
ejemplo, el genoma de una bacteria o de un bacteriófago (que no tiene
libres), no podría rotar de la manera requerida y, por 1o tanto,
aparentemente no podría replicarse según el e,squema de Watson y
"xtrámos
Crict<. Hallar una respuesta a este problema fue una preocupación
impcrtante de la bioiogía molecular durante la década de 195O.

IS.§.§ Pra¿mbm *Kp*r§§x§*m**§ dw§ s§q*§#me dry §.ffmts*ex

y ürück d* rep§§aaci$m d** ffiW&
AlgUnos biólogos moleculares, sobre todo Max Delbrück, consideraron tan
serio el problema topológico que, al principio, hubo resistencia a aceptar la
doble héüce corno la estflrctura correcta del DNA. La dificultad se relacio-
na con el carácter plectonémico de la doble hélice, que e§ la disposición
topológica que impide que las dos cadenas de una hélice se separen sin de-
senrollarse. Por lo tanto, el problema se resolvería si la doble hélice fuese,
de hecho, paranémiea, porque esto implicaría que las dos cadenas podrían
separarse simplemente por el movimiento lateral de cada una, sin desenro-
llaroiento de la molécula. Se sugirió que ia doble hélice podí1 convertirse
ell §na estructura paranémica por superenrollamiento en la dirección
opuesta al giro de la propia hélice o que, denfro de una molécuia de DNA,
la hélice dextrégira propuesta por'Watson y Crick podría estar "equilibra-
da" por longitudes iguales de una estructura helicoidal levógira' Asimismo,
se consideró la posibiiidad de que la dobie hélice no fuese una hélice, sino
una estructura en cinta laterolateral, idea que revivió, en forma §orpren-
dente a fines de la década de 1970. Todas esias soluciones prop§estas al
problema topológicc fueron rechazadas por una razón u otra, la mayor{a
de,ellas porque exigían alteraciones de la estructura de doble hélice que no
eran compatibles con ios resultados de la difracción de rayos X y otros
datos experimentales concemientes a la estructura del DNA' '

El primer progreso real hacia trna solucién del problema topológico se pro-
dujr: en 1954, cuando Delbrück propuso un modelo de "tttura y reunión"
para separar las cadenas de la doble hélice. En este modelo, las cadenas se
separan no sólo por desenrollamiento de la héiice con rotación asociada de
la molécula, sino por rotura de una de las cadenas, pasaje de la segunda cade-
na a trayés de1 hiato y nueva unión de la primera cadena. De hecho, este
esquema se acerca rnucho a la solución correcta del problema topológico y
es ura de las forrnas en las que trabaja la topoisomerasa (véase figura 15.44)
pero, lamentablemente, Delbrück complicó de manem excesiva el problema
al intentar combinar la rotura y la reunión con la sintesis de DNA que ocu-
rre durante el proceso de replicación real. Esto lo llevó a proponer un mode-
a
lo de replicación del DNA en el que cada poiinucleótido de la molécula hija
i está compuesto, en palte, por DNA parental y, en pafte, por DNA recién sin-
.l
tetizado (figura 15.2A). Este modo dispersivo de replicación contrasta con el
¡t81, Capítulo l5 Replicación de lcs genomas

(A) Dispersiva
*n*tt,!¡i*W{:
,ilt{ttt¡ ttllr
*¿::@l&l<¡@

ffi:m m

(B) ¡iemrconservaoora
Doble hélice madre

lIl lil ttilil iil l litl

ffixmx#trx
É1]ffié¿!+".$4+jÑ
M
ii¡ ¡ri ¡ r,¡!1, ¡iir ir i

(C) Conservadora

tr.rr DNA parental

flsf i DNA nuevo #*lrj@
iiir"¡l.lll'.i lrr ,Ll
Figura 15.2 Tres esquemas posibles
de replicación del DNA. Para que Ia
ilustración resulte más clara, las molé-
culas de DNA están dibujadas como
escaleras y no como hélices.
sistema semiconservador propuesto por Watson y Crick (figura 15.28). Una
tercera posibilidad es que la replicación se¿i por completo conseryadora: una
de las dobles hélices hijas compuesta totalmente por DNA lecién sintetizado,
y la otra. por las dos cadenas parentales (figura 15.2C). Es difícil diseñal
modelos de replicación conservadora, pero cabe imaginar que este tipü de
replicación se podría lleyar a cabo sin desenrollamiento de la hélice madre.

El modelo de rotura y reunión de Delbnick fue importante porque estiinuló

experimentos destin¿rdos a investigar 1os tres modos de replicación del DNA
iiustrados en la figura 15.2. Se habían introclucido hacía poco los isóti:pos
radiactivos en la biología molecular, por Io que se inter-rtó utilizar DNA rnar'-
cado (véase I'Jota sobre técnicas 2^ 1) pala diferenciar el DNA recién sinteti-
zado de los polinucleótidos parentales. Cada modo de repiicación predicc
una distribución diferente del DNA reción sintetiz¿lclo, y por ende delmarca-
dol radiactivo, en las dobles hélices resultantes después de dos o más ciclos
de replicación. Por 1o tanto, el análisis ciel contenido radiactivo de estas n-rolé-
culas detemrinará qué esquema de replicación opera en ]as célul¿ls r,,ivas.
Lamentablemente, fue imposible obtener un resultarlo definido, er1 §il'fln
medida por 1a dilicultad para medir el grado preciso de radiactividad de las
moléculas de DNA y por la complicación del análisis causada pr:r l:r r'ápida
clepyadación del isótopo 32P einpleado cot'lto marcador.

Por úitimo, en 1958 Matthew Meselson y Franklin Stahl lieval'on a cab,-r

el experimento lequerido, pero no con un marcador radiactivo, sinr-¡ con
l,N, el isótopo "pesado" no radiactivr: dei nitrógeno. Así, fue pr-rsible
analizar por centrifugación en gradiente de densidad 1as dobles hélices
r:eplicadas pol centrifugación (véase Nota sobre técnicas 7.1). pr.r.'s utrrt
molécul¿r de DNA marcada con 15N tiene una densidad boyante míts alt¡
que una inolécula no marcada. Meselson y Stahl comenzaron con un cul'
tivo de células de E. coli que habían.."ói,1.,, en un rneclio conliNIj+Cl
y cuyas moléculas de DNA contenían, por lo tanto. nitrógeno pesadr:. §c
transflrieron las cé1ulas a un meclio norinal y se tomaron muestras a lo'c
2A y 4A minutos, lo que corresponcie a una y dos divisiones celulariis,
respectivamente. Se eitrajo elDÑA de cacla muestra y se examin¡iron la:
 El problema topológico

moléculas por centrifugación en gradiente de clensidad ({'igura 15.5A).

Despuós de un ciclo de replicación del DNA, las moléculas hijas sinteti-
zaclas en presencia de nitrógeno normal formal'on una sola banda en el
gradiente de densidad, 1o que indicó que cada dobie hélice estaba cons-
tituida por cantidades iguales de Dl{A recién sintetizado y parental. Este
resultado permitió descartar de inmediato el rrodi: conservador de repli-
cación, pues óste predice que habrá dos bandas tras un ciclo de replica-
cirin (figura 15.58), pe1'o no permite distinguir entre el modelo
dispersivo de Delbrück y el proceso semiconservador favorecido por
Watson y Crick. Sin ernbalgo, la distinción fue posible al examinar las
nloléculas de DNA lesultantes de dos ciclos de replicación. En este caso,

(A) El experimento
Cultivo de E. coli en
medio con lsNH4Cl
",:i
.- DNA parental (1sN)
,.,,,,.. DNA nuevo (14N)
(B) lnterpretación
Dobles hélices madres
Moléculas hijas
Figura 15.3 Experimento de
Transferencia a Meselson-Stahl. (A) El experimento
medio con 14NH4CI llevado a cabo por Meselson y Stahl
............+ consistió en hacer crecer un cultivo de
Escherichio coli en un medio con
l5NH4CI (cloruro de amonio marcado
,1 \ con el isótopo pesado de nitrógeno).
nt1 t lt',
Después, se transfirieron las células a
lil,Jü min lL' mln
L¡Lr_. un medio normal (con ]+NHaCl), y se
I tomaron muestras a los 20 minutos
t vI (una divisién celular) y a los 4O minu-
tos (dos divisiones celulares). Se extra-.
jo DNA de cada muestra y se
,, .,,,.\ divísiones
Extracción d.e DNA,
\ celulares analizaron las moléculas por centrifuga-
¡ en ¡ ción en gradiente de densidad.
+ centrrfugacron
gradiente
+
Pespués de 2O minutos, todo el DNA
I de
- densidad
- - -- contenía cantidades similares de raN y
.,4N_,4N*DNA 15N, pero a los 4O minutos se observa-
;*:'*N-'.N-DNA II,o*-,u**o*o ron dos bandas, una correspondiente
al híbrido r4N-IsN-DNA y la otra a
moléculas de DNA obtenidas utilizando
exclusivamente laN. (B) Se muestra el
resultado previsto del experimento
para cada uno de los tres posibles
Semicon- modos de replicación del DNA EI
Conservadora Dispersiva servadora patrón de bandeo obsenrado a los 2O
minutos permite descartar la replica-
l¡ il cién conseruadora, porque este esque-
$n il il
ma predice que, después de un ciclo
tl ti illt de replicación, habrá dos tipos de
doble hélice: una que contiene l5N y
I t ;§
I otra que contiene sólo lqN. La única
banda de 14N-1sN-DNA que en reali-
ittt éá
dad se observó a los 20 minutos es
rdJ ,jl compatible con la replicación tanto dis-
persiva como semiconservadora, pero
llt :ll
I las dos bandas visualizadas a los 40
minutos son compatibles sólo con la
L*:
I
I
I

Bandas esperadas ,l replicación semiconservadora. La repli-

cación dispersiva continúa generando
moléculas híbridas 14N-1sN después
de dos ciclos de replicación, mientras
t que las moléculas de la segunda gene-
ración filial producidas en este estadio
l. ' ,,.1 por replicación semiconservadora inclu-

r
liloléculas de la segunda generación filial
ur yen dos moléculas compuestas totaL
rl f mente por iaN-DNA.

Bandas esperadas
!t
L-I::"
 Capítulo l5 Replicacrón de los gencmas

el gr:adiente de ciensidad reveló clos bandas de Dl.,iA: ia primera, corres-

pondiente a un híblido compuesto por partes iguales de DNA recién sin-
tetizado y antiguo, y la segunda. correspondiente a moléculas formadas
totalmente por DNA nuevo. Este resultado coincide con el esquema
semiconservaclor, pero es incompatible con la leplicación disper-civa.
pues esta última predice que, después de clos ciclos de replicación, tr:clas
las moiéculas serán híb¡iclos.

.t
I :1 . i -¿ {-435} !.Jlqrl (i.Jy1-¡lltL,,!¡¡t":IE[§{?:} L"i¡l§LAil¡ t^¿tt*
s *lu¡lir:n af ¡:rmb§*m?e t*p#§*6ác<:
Figura 15.4 Modo de acción de una El experimento'de Nleselson-Stái"rt ¿"l,Iroutró que la replicación del DNA
DNA topoisomerasa L Una topoiso- en las células viva-s sigue el esquema semiconservador propuesto por
merasa de tipo I efectúa una muesca
Watson y Crick. e indicó así que la céluia clebe tener una solución pa1'a
en una cadena de una molécula de
DNA, pasa la caden¿ intacta ¿ través de el problema topológico. Los biólogos moleculares no conocieron esta
la muesca y vuelve a sellar el hiato. solución hasta alrededor de veinticinco años después, cuando se carac-
terizaron las actividades de las enzimas DNA topoisomerasas.

Las DNA topoisomerasas son enzimas que llevan a cabo reacciones de

rotura y reunión similales, aunque no idénticas, a las contemplad¿ls por
Delbrück. Se reconocen dos tipos de DNA topoisomerasas (cuadro l5.l):
Las topoisomerasas de tipo I introducen una rotura en un polinucle-
ótido y pasan el segundo polinucleótido a través del hiato que se
fi:rma (figura 15.4). Después, se vuelven a ligar los dos extrenros cle
la cadena lota. E,ste modo de ¿rcción determina que el númelo de
ligaraiento (la canticlad de veces que una cadena cruza la otra en un¿r
molécula circular) se modifique en uno.
Las topoisonlerasas de tipo II rompen ambas c¿idenas de la cloble héli-
ce, lo clue crea un¿r "puerta" a través de ia cual se hace pasar un segun-
do segmento de la hólice. Esto modifica el núirelo cle ligamiento en clos.

Romper un¿) o ambas c¿ldenas del DNA podría parecer trna solución cirás-
tica a1 problema topológico, con 1a posibilidad de que a veces ia topoiso-
rnerasa falle en leunh' una cadena y, por lo tanto, rolnpa de utanera
inaclvertida un croniosoma en dos segmentos. Esta posibilidad se ve tedu-
cida por el modo de acción de est¿ts enzimas. Un extremo de cacla polinu-
cleótido cort¿iclo se une en fbrma covalente a un aminoácido tirosina del
sitio activo de la errzima, lo que garantiza qlle este extrerlo clel polinr,rcleó- a

tido se mantenga estlictamente en el lugar mientr¿rs se está manipulanclo el

extremo o 1os e,rtlemos libres. Las topoisomerasas I y Ii se subdivirien dc
acueldo con la estrlrctlu'a química precisa cle1 ligarniento polinucleótido-
tirosina: con ias enzimas IA y IIA, cl ligarniento involuct'a un glupo foslir-
§
to unido al ertremo 5' libre del polintrcieóticlo cc¡rtadt¡, y con las er¡zjn:as (
IB y IiB, el ligamiento tiene lugar a través cle un grupo 5' fosfato. E-c pro-
bable que las topoisomerasas A y B hayair evolucionado pol separaclo. t
(
Arrrbos tipos están presentes en los euc¿u'iontes, pero las enzimas IB v Illl 'I

son mrly infi'ecuentes en los procariontes.

I
Cuadro I5.I DNA topoisornerasas

. Ir'.:., rr:': i:r|:lrla:a: l]:1:9

t#§ §
Tipo I DNA monocatenario Topoisomerasas ly lll de Escherichia coli; topoisomerasa lll de levadura y
humana; girasa inversa arqueobacteriana; tr rtsomerasa I eucarionte

Tipo ll DNA bicatenario Topoisomerasas ll (DNA girasa) y lV de Escherichia coli;topoisomerasa ll eucarionte

 El problema topológiro 48§

Fígura 15.5 Apertura de la doble

héiice. Durante ia replicación, la
doble hélice es "¿bierta" como con-
secuencia de la accién de DNA
topoisomerasas. Por lo tanto, la hor-
quilla de replicación puede ¿vanz¿r a
lo largo de l¿ molécula sin que la
hálice tenga que rotar.

La DNA topoisomerasa I Avanza la horquilla Continúa la síntesis

efectúa una muesca de replicación de DNA
monocatenaria Por
delante de la horquilla
de replicación

Cabe observar que las DNA topoisomerasas no clesenrollan por sí mismas

la rloble hélice, sino que resuelven el problema topológico contrarrestando
el superenrollamiento que, de 1o contrario, sería introducido en la molécu-
la por la progresión de la horquilla de replicación. El resultado es que se
puede "¿rbrir"' la hélice, con separación lateral de las dr:s cadenas sir-r que la
molécula tenga que rotar (figura 15.5). La replicación no es la única acti-
vidad que se ve complicada por la topología de la dobie hélice, y es cada
vez más evidente que las DNA topoisomerasas desempeñan papeles igual-
mente de importantes durante la transcripciÓn, la recombinación y otros
p1'ocesos que pueden provocar superenrollamiento o subenrollamiento del
DNA. En los eucariontes, las topoisomerasas lorman una parte sustancial
de 1a matriz nuclear, ia red similar a un andamiaje que atraviesa e[ núcieo
(sección 10.1 .1), y son responsables de mantener la estructura de la croma-
tina y clesligar las molécu1as de DNA durante la divisiót, ctcmosómica. La
mayoría de las tr:poisomerasas sólo pueden relajar el DNA, pero aigunas
euzimas procat'iontes, como la DNA girasa bacteriana y la giras:l inversa
arqueobacteriana, pueden llevar a cabo la reacción inversa e introducir
superespirales en las moléculas de DNA.

§ S.X .3 z.§xrexxixrz,xx *x§. ffi:*d* serri{#¡3*tí&'&dí} {

*{" :*plic;cirirr
Si bien no se conoce ninguna excepción al modo semiccusei-vadol de repli-
cación del DNA, hay alg¡unas variaciones de este pl'oceso básico. La copia
dei DNA a travós de una horquilla de replicación, como muestra la figura
i5.1, es ei sistema predominante,5r lo utilizan las moléculas cle DNA cro-
mosómico de los eucariontes y los genom¿ls circulares cle los procat'iontes.
Alg¡:nas moléculas cilculares más pequeñas, colno los genomas mitocon-
driales animales (sección 8.5.2), recurren a un proceso algo diferente cleno-
minado replicación por desplazamiento. En estas moléculas, elpunto en el
que comienza la replicación está marcado por un bucle D, una región de
alrededor de 500 pb donde la dohle hélice se rolnpe pi:r la presencia de una
molécula de RNA apareada por sus bases a una cle 1as cadenas de DNA
(figura 15.6). Esta molócura de RNA actúa como el puntr: inicial para la
síntesis de uno de los polinucleótidos hijos. Este pr:linucleótido es sinteti-
zado por copia continua de una caclena de la hélice, mientras que la segun-

I .: ;.::
 Capítulo I5 Repllcación de los genomas

Heplicación de la
Figura 15.6 Replicación por despla- cadena desplazada
zamiento. El bucle D contiene un¿
molécula de RNA corta, que ceba la -
síntesis de DNA (véase sección
15.2.2). Tras finallzar la síntesis de la Bucle D Cadena desplazada
primera cadena, un segundo cebador
RNA se une a la cadena desplazada
e inicia la replicación de esta
molécula. En este diagrama,
se muestra en rojo el
,r
DNA recién sintetizado.

Finalización de la sintesis
de la primera cadena

Figura I5.7 Replicación por círculos

rodantes.

La síntesis de la cadena "despliega"

una copia lineal del genoma circular

La síntes¡s de la segunda cadena

convierte el genoma lineal
en DNA bicatenario

da cadena es desplazada y copiada con uiteriolidad, después de que se ha

completado la síntesis del primer genoma hijo.

No se conoce con claridad la ventaja de Ia replicación por desplazamien-

to practicada por el DNA mitocondrial animal. En cambio, el tipo espe-
ciai de procesó de desplazamiento denominado replicación por círculos
rodantés es un mecanismo eficiente para la síntesis rápida de mú1tiples
copias de un genoma circular. La replicación por círculos rodantes'
enipleada por á1 bacteriófago )" y dive'"sc>s otros bacter:iófagos, se inici¡
en una muesca practicada én uno de ,os polinucleótidos parentales' Se
extiencle sl s¡¡r'rmo 5' libre generado, 1o que clespiaza *t é"r..*o ,' d*l
polinucleótido. La síntesis continuada de DNA "despliega" una cople
 Proceso de replicación

completa del genorna, y la síntesis adicional determina, con ei tiempo,

una ierie de genomas iigados de cabeza a cola
(figura 1.5.7). Estos geno-
l,las son monocatenarios y lineales, pero pueden c_onvertirse con facili-
áad en moiéculas circulares bicatenarias mediante la síntesis de cadenas
Ioápt*rr..,tarlas, seguida de escisión en los puntos de unión entre los
genomas y disposición en círculo de los segmentos resultantes.

§§"x ffirryewsw d* rePlicaciósx

Como en muchos procesos de ia biología molecular, consideramos de
manera convencional que la repiicación del genoma consta de tres fases:
iniciación, elongación y tetminación:
r iniciación (sección 15.2.1): implica el reconocimiento de la posición
o de las posiciones en una molécula de DNA, donde comenzará la
replicación.
. Elongación (sección 1.5.2.2): hace referencia a los eventos que se
producen en la horquilla de replicación, donde se copian los polinu-
cleótidos parentales.
* Terminación (sección 15.2.3): por lo general, se la conoce sólo en
forma vaga y ocurre cuando la molécula madre se ha leplicado por
completo.

Además de estas tres etapas de la replicación, merece atención otro

tema. Éste se relaciona con una limitación del proceso de replicación
que, de no corregirse, llevaría a que las moléculas de DNA bicatenario
se acortaran cada vez que son copiadas. La solución a este problema,
que concierne a la estructura y la síntesis de los telómeros en los extre-
mos de ios cromosomas (sección 7 .1..2), se analiza en la sección 1'5.2.4'
{A} Fleplicación de un cromosoma
bactériano circular

:
§s"-3,"§ §arác{xq§*m d* $m rep}*exe?q}ffi {§*§ m*m*ffi*
l
La iniciación de la replicación no es un proceso aleatorio y siempre comien-
za en Ia misma posición o las mismas posiciones de una molécula de DNA;
1
estos puntos se denominan orígenes de replicación. Una vez iniciada, pue-
: den surgir dos horquillas de replicación del origen y progtesar en direcciones
opuestas por el DNA: por lo tanto, la replicación es bidileccional en ia mayo-
ría de los genomas (figura 15.8). Un genoma bacteriano circular tiene un solo
odgen de replicación, lo que signi{ica que cada horquilla de replicación copia
varios miles de kilobases de DNA. Esta situación difiere de la observada en
los cromosomas eucariontes, que tienen múltiples orígenes, y cuyas horqui-
llas de replicación progresan por distancias más coltas. Por ejemplo, la leva- {- Dirección de replicación -}
dura Sacchoromyces cerevisicte tiene alrededor de 332 oúgenes. que
colresponden a 1 cada 36 kb de DNA, y los seres humanos tienen alrededor
(B) Fleplicación de un cromosoma
de 20.000 orígenes o 1 cada 150 kb de DNA. eucarionte lineal

l¡:i::ixri** ** *:! **q*fi #* r*pJ¡r*ri*¡: ** *. r::li

:
§abemos muciro más acerca de la iniciación de la replicación en las bacte-
rias que en los eucariontes. El origen de replicación de .0 coli se denomina 35 kb (levadura)
oruC. Por tránsferencia de segmentos de DNA de la región de t¡riC aplásmi 150 kb (seres humanos)
dos que carecen de sus propios orígenes, se ha estimado que el origen de
replicación de E. coli abarca alrededor de 245 pb de DNA. El análisis de la
secuencia de este segmento muastra que contiene dos motivos repetidos cor- Figura 15.8 Replicación bidireccio-
tos: uno de 9 nucleótidos y otro de 15 (figura 15'9A). La repetición de nal de DNA de (A) un cromosoma
üueve nucleótidos, de los cuales cinco copias están dispersas por todo ortC, bacteriano circular y (B) un
es el sitio de unión para una proteína denominada DnaA' Ccn cinco copias cromosoma eucaríonte lineal.
 Capitulo l5 Replicación de los gencrnas
Figura 15.9 Origen de replicación de
Escherichía coli. (A) El origen de repli-
cación de §. coli se denomina orC y
tiene alrededor de 245 pb de longitud.
Contiene tres ccpias de un motivo
repetido de l3 nucleótldos, secuencia
consenso 5'-CATCTNTTNTTTT-3:
donde "l',i" es cualquier nucleótido, y
cinco copias de una repetición de
n :eve nucieótrdos, secuencia consen-
so 5'-rr(A/r)r(A/C) CA (AlC)A-3',
donde (A/T) es A o T y (A/C) es A o
C. Las secuencias de l3 nucleótidos
forman una disposición en tándem de
repeticicnes directas en un extremo
de oriC. Las secuencias de nueve
nucleótidos se distribuyen a través de
oriC: tres unidades forman una serie
de repeticiones directas y dos unida-
des tienen la configuración invertida,
como indican las flechas. Tres de las
repeticiones de nueve nucleótidos
-números 1, 3 y 5, cuando se las
cuenta desde el extremo izquierdo de
oriC como se dibujó aquí* se consi-
deran sitios mayores para la r-rnión de
DnaA; las ot'as dos repeI.iciones son
sitios menores. La estructura general
del origen es similar en todas las bac-
terlas y las secuencias de las repeti-
ciones no varian mucho. (B) Modelo
de la unión de proteínas DnaA a oriC
que provocan la desnaturalización de
l¿ hélice dentro de las secuencias de
13 nucleótidos ricas en AT.
(A) Estructura de oriC
20 pb
l,- .'...j
t- .+ 1- ..t
'i.i
,.,ri.rlri . i
,..'l'
Región desnaturalizada Barril de proteínas DnaA
de la secuencia de unión cabría iinaginat'que cinco copias de DnaA se unen
al origen pero, de hecho, ias proteínas DnaA unidas cooperan con nrolecu-
las libr:es hasta que alrededor de 50 copias se asocian con el origen. La unión
se ploduce sólo cuando el DNA p1'esenta superenroliamiento negativo, que
es la situación nomal para el cr'omosoma de E. cttlí (sección 8.1.1).
El resultado de la unión de DnaA es que la doble hrllice se abre ("se cles-
naturaliza") dentro de la disposición en tándem de tr:es tepeticiones de
13 nucleótidos ricas en AT ubicadas en un extleno de la secuencia oriC
(figura 15.98). Se desconoce el mecanismo exacto, pero la DnaA nt:
parece tener la actividad enziniática necesaria para romper pares de
bases y, en conseclrencia, se presume que la hélice es desnatul'alizada
por fuerzas de torsión introducidas por la unión de las proteínas DnaA,
Un modeio interesante imagina que 1as proteínas DnaA forman una
estructura de tipo barril alrededor de la cual se enlolla la hélice. HU, la
proteína de empaquetamiento de DNA más abundante de E. coli (.sec'
iión 8.1.1), promueve Ia desnaturalización de la hélice.
La desnatutalízación de la hélice desencadena una serie de evcnlos quc
construyen una horquilla de replicación naciente en cada extlemo de la
región abierta. El primer paso es la unión de un complejo de precebado a
c"áu.,r-ro de estas dos poiiciones. Cada cornplejo de precebado corrrprcn-
de, al principio, 12 proteínas, seis copias de DnaB y seis copias de l)naC,
pero DnaC cumple un papel transitolio y se lihrela de1 compleio pcco de.s-
pués que éste sé fonlá, por 1o que es probable que su función sea sólo
colaboral con la unión de DnaB. Esta última es una hetricasa, una enzinra
capaz de romper pares de bases (véase sección 15.2.2). La DnaB col-tllün-
za a aunlentar la iegión monocatenaria dentro del origen, lo qu.' I'crrrlite
que se unan las involucraclas en la fase de eiongación de 1a repli-
iación del "rrinl*,
genoma. E,sto representa el final cle la fase de iniciaciórr de ll
replicación en E. coli, pues la horquilla cle replicación ahora col¡rienz¡ r
progresar aiejándose del origen y se inicia la copia del DNA.
§* *xs;x d**ridr cox *t«rir§xd §rss *,rug*m*s #*
r*p/íc«**t5* en ¡s levnd¿.¡r*
.;gli*'::aal,t:,:t':'":'''
,..1',lW):,.' ;
 Proceso de replicación

Sttccharonryces cera:isiae. Los orígenes así identificados se denomi- (Ai Estructura de un origen de replicación
de la levadura
6¿¡ secuencias de replicación autónoma, o AR§. Un origen de levadura típi
co es nrás corto que el oriC de E. coli v suele tener menos de 200 pb de ó¿ B1

li:ngiturl pei'o, aligual que el origen de E. colí, contiene segmentos definidos

con dilcrentes papeles funcionales, y estos "subdominios" tienen secuencias Secuencia de
reconocrmiento
20 pb
en distintos orígenes (figr¡ra 15.1OA). Se han reconocido cuatro de origen
rios. Dos de ellos -subdominios A y 81- forman la secuencia de
nto de origen, una extensión de alrededor de 40 pb en total, que (B) Desnaturalizaclón de la hélice
el sitio de unión para el comp§o de reconocimiento de origen (arigirt
recognition cornple¿ ORC), un gnlpo de seis proteínas que se unen al ori-
gen {figura 15.108). Si bien se describieron los ORC como versiones de leva-
dura de las proteínas DnaA de E. coli, es probable que esta interyrctación no ABFI Hegión OHC
desnaturalizada
estrictamente correcta, pues los ORC parecen perrnanecer unidos a los
orígcnes de levaduras clurante todo el ciclo celulal:. Es más probable que los
ORC. en lugar de ser proteínas iniciadot'as genuinas, participen en la regula-
ción de la replicación delgenoma y actúen como mediadores entre los orige- Figura l5. l0 Estructura de un ori-
nes de replicación y las señales reguladolas que coordinan la iniciación cle la gen de replicación de levadura. (A)
Estructura de ARSI, una secuencia de
replicación del D]'JA con el ciclo ceiular (sección 15.3.1).
replicación autónoma (ARS) típica,
que actúa como un origen de replica-
Por 1o tanto, debemr:s buscar secuencias con funciones rigurosalnente ción en Saccharomyces cerevs¡ae. Se
eqrrivalentes a las de ariC de E. colí eÍr ota palte de los r:t'ígenes de ieva- muestran las posiciones relalivas de
dula. Esto nos lleva a las otras dos secuencias conservadas en el origen las secuencias funcionales A, B 1, 82 y
de ler.adura típico, los subdominios 82 y 83 (véase figula 15.10A). 83. (B) Se produce desnaturalización
de la hélice dentro del subdominio
Según nuestro c,onocimiento actual estos dos subdominios funcionan de 82 jnducida por el lrgamiento de la
manera sin-ril¿¡r al origen de E. coli. EI subdominio B2 parece corl'espon- proteína de unión a ARS I (ABFI) al
derse con la repetición de 13 nucleótidos del origen de E. coli y es ia subdomjnio 83. Las proteínas del
posición en la cual las dos cadenas de la hélice se separ¿ln por primela complejo de reconocimiento de ori-
vez. Esta desnaturalización es inducida por la fuelza de torsión que gen de replicación (ORC) están uni-
introduce ia fijación cle una proteína de unión aI DNA: el factor de unión das de manera permanente a los
subdominios A y 81.
ARS 1 (ABFI), que se une al subdominio 83 (véase figura 15.108). A1
igual que en E. coli,la desnaturalización de la hélice dentro de un ori-
gen de leplicación de levadura es seguida de la unión al DNA de la heli-
ca-ca y otras enzimas de leplicación, 1o que completa el proceso de
iniciación y peunite que las horquillas de replicación comiencen a pro-
gresal'a Io iargo del DNA, como se descdbe en el sección15.2.2.

#* f:e: sid* f*rl &*ril *d*xf,¡?¡r*r f*s *:rug*ñss d€ r*pfí**rridrl

eff l$§ **rrx:rlsr?f*§ supr,$*r*§
Lc¡s intentos de identificar los orígenes cle replicación en los seres huma-
nos y otros eucariontes superiores han siclo, hasta hace poco, menos exi-
tosos. Las regiones de iniciación (partes del DNA cromosórnico donde
se inicia la replicación) pueden delinearse mediante diversos métodos
bioquínricos; por ejeu-rplo, a1 permitir que se inice la replicación en pre-
senci¿r de nucleótidos marcados, detener después el ploceso, purilicar el
DNA recién sintetizado y determinar las posiciones de las cadenas
nacientes en el genonla. Estos experimentos sugilieron que hay regiones
específicas de los cromosomas cle mamifet'os donde comienza la replica-
ciún, pero algunos investigadores han dudado de si estas regiones con-
tienen r:rígenes de replicación eqr.rivalentes a los de la levadura. Una
hipótesis alternativa es que la replicación es iniciada por est]:ucturas
pt'oteicas ubicadas en posiciones específicas del núcleo, y que las regio-
nes de iniciación de los cronlosorrlas sólo son los segmentos de DNA
cer'oanos a estas estructuras proteicas en la organización tridirnensional
dcl llúc[eo.

L¿rs dudas acerca cle los orígenes de repiicación en los mamíferos aumenta-
l'on po1'que las regiones de iniciación de ios mamíf'eros no confieren capaci-
 Capítulo t5 Replicactón de los genomas

dacl replicativa a plásrnidos con deficiencias de replicación, allnque eslos supe

experiiientos no se consideraron concluyentes, pue§ se reconoció que un ori- ORC
g., d" mamífero podda ser demasiado largo para ser clonado en un plá§mi- la pr
áo o pociría funcionar sÓlo al ser activado por sitios distantes del D.NiA tado¡
cromosómico. Un avance fundamentalha sido demosh'ar que al transtlrir al buen
genolna delmono un segmento cle B kb de una región deiniciaciÓn humana, sión:
éste dirige, atln así, 1a replicaciÓn, pese a su eliminación de cualquier hipcté- L.l\-lu
tica estrirctura proteica áel núc1eo humano. E1 análisis de esta región c1c ini-
ciación transferida mosÍó que hay sitios primarios dentro de la región d¡'nrlt
la iniciación tiene alta frecuencia, rodeados de sitios secundarios, que ahal-
can toda la región de B kb, donde la replicación se inicia con una frecuencia ,:, Una I
más baja. fambi¿n se demostró la presencia de dominios funcionales cleiini- gresa
dos deitro de la región de iniciación al examinar los efectos de las deleciones LALIU

cle partes de la región sobre la eficiencia de la iniciaciÓn de la replicaciÓn' comp

:la sín
La demostración de que el genoma humano contiene, de hecho, orígenes alas
c1e replicación equivalentes a los de las ievaduras plantea la
pregunta de
si los mamíferoslienen un equivalente del ORC de levadura. La respues- tud nr
ta parece ser sí, ya que se han identificado varios genes de eucariontes npcl
if'ere
Dles

Dr
Extremo 5'-P
Figura 15.11 Síntesis de DNA
dápendiente del molde.
o- o-
lrl
o-
la

Comoárese esta reacción con Ia

"o-P-O*P-O-P*o--cH2 pu
lirlll
sintesis de RNA dependiente del ooo Ldt
molde ilustrada en la figura 12.1. col
ció
t5'
I

O:P-O-CHz en
I

o- Qtl'
La
OHH die
Extremo S'OH
o-
lr/
o- U
cu1
col
-o-P-O*P-O-P--
r: lr l.'O nu{
ooo I **M
par
ruñ2^ tW cler
l-o__-l tizt.
ñ ,/t
tr-i
OHH
o-
ll
o-
ntes
.o*P-0*?-0" m¿
OO
Pirofosfato
{3!i;,t ¡'
o-
lll
o- o-
,,..

-o*P--o*P-'o-P-o La i)I1r
rltlll ,irr!íntesi¡
oo ,,:'[n la s
; nan e§1
OH ilgn rtlc
I

O:P-*O- Vr.i2 ;sintetiz

I
o" i: § &Iur
§:-' e LlCi
o H
I
5',
'i,','Est¿
a\-r)- o-cH2 lmo
t,l;' de c
I

base
',,,,. {vé.a
OH
.tit:
 Proceso de replicación {91

S superiores, cl-l,vos ptoductos ploteicos presentan Secuencias similares al

ORC de levadura, y algunas de estas proteínas han podidr: reemplazar a
li,r proteina de levadura equivalente en el ORC de levadur:a. Estos resul-
\ tados indican que ia iniciación de la replicaciÓn en las levaduras es un
I buen modelo de los eventos que ocurren en los mamíferos, una conclu-
sión muy importante para estudios de1 contr"ol de la iniciaciÓn de la repii-
: cación, como se verá en la sección 15.5.

iS";.: F*se cl'x e{*xg**§*n c*e jlx ¡*§\11;;t{lün

e Una vez que se ha iniciado la replicación, la horquiila de replicación pro-
gresa a 1o largo del DNA y participa en la aclividad central de la repli-
S iación del genoma: la síntesis de nuevas cadenas de DNA que son CADENA
complementarias de los polinucleótidos parentales. En e1 nivei químico, LíDER
la síntesis de DNA dependiente del moide (figura 15.1 1) es muy similar
S a 1a síntesis de RNA dependiente del mo1de. que tiene lugar durante la
tlanscripción (compárese con la figura 12.1). Sin embargo, esta simili-
tr:d no debe inducir al error de efectuar una analogía extensa entre trans- Figura 15.12 Complicaciones de la
reólicación del DNA Se deben resol-
S cripción y replicación. La mecánica de los dos procesos es bastante u"'r dot complicaciones cuando se repli-
diférente y la replicación se complica por dos factores que no son apli- ca el DNA bicatenario. Primero, sólo l¿
cables a [a transcripción: cadena líder se puede replicar de
É Durante ia replicación del DNA, se deben copiar ambas cadenas de manera continua por síntesis 5'->3' de
DNA; la replicación de la cadena retra-
la doble hélice. Ésta es una conplicación importante porque, colrlo sada se debe ilevar a cabo en forma
se comentó en la sección 1.1.2, 1as enzimas DNA polimerasas sólo discontinua. Segundo, la iniciación de la
pueden sintetizar DNA en la dirección 5'3'. Esto significa que.una síntesis de DNÁ requiere un cebador.
cadena de la doble hélice madre, denominada cadena líder (cadena Esto es válido tanto para la síntesis de
conductora), puede ser copiada de manera continua, pero la replica- DNA celular, según se muestra aquí,
ción de la cadena retrasada (cadena rezagada) se debe llevar a cabo como para las réacciones de síntesis de
DNA que se practican en el tubo de
en forma cliscontinua, lo que genela una serie de fragmentos cortos
ensayo (sección 2.,l.'I ).
que deben ligarse para producir la cadena hija intacta (figura 15'12).
,,' La segunda complicación sulge porque las DNA polimerasas depen-
dientés del molde no pueden iniciar la síntesis de DNA en una moló-
cula totalmente monocatenal{a: debe haber una región bicatenaria
corta que aporte un extremo 3', al cual la enzima le pueda añadir
nuevos nucleótidos. Esto implica que se necesitan cebadores, tulo
para iniciar la síntesis de la cadena complementaria soble el polinu-
cieótido líder y otro para cada segmento del DNA discontinuo sinte-
tizado sobre la cadena retrasada (figura 15,12).

Antes de tratar estas dos complicacfu:nes, examinalemos las propias

enzimas DNA polimerasas.

1..r.:/¡lt*i'i]1ijjr :..it': !:;..:t-i¡::'ti.-il','.tl!,'¡'. :'

l-.,1¡11
.

La principai reacción química cataiizada por una DNA polirnerasa es l¿l

síntesis 5'3'de un polinucleóticlo DNA, como muestra ltr figura 15.11.
E,n la sección 2.1.1 aprendimos que algunas DNA polimerasas combi-
nan esta función con pof io menos una actividad de exonucle¿)sa, lr: que
.significa que estas enzimas pueden degradar polinucleótidos además de
sintetizarlr:s (véase figwa 2.7):
q N4uchas DNA polimerasas dependientes del molde bacterianas y
eucariontes tienen actividad de 3'-+5' exonucleasa (cuadro 15-2).
Esta actividad le permite a la enzima eliminar nucleótidos dei extre-
mo 3' de la cadena recién sintetizada. Se ia c<lnsidera una actividad
cle ccrrección. cuya función es subsanar el errr:r de apareamiento de
bases ocasional que podría ocurir durante la síntesis de las cadenas
(véase sección 16.1. I ).
¡tg2 Capítulo 15 Replicrir:rr de lc'; genoma,r

Cuadro 15.? DNIA polirterasas involurradas en la replicación de genornas bacterianos y eucariontes

Enz¡mas

DNA polimerasas bacterianas

DNA poiimerasa I I >t Sí Reparación, replicación del DNA
DNA polimerasa lll ror lo menos lu 5í l\o Principal enzima de replicación

DNA polimerasas eucariontes

DNA polimerasa u 4 No No Cebadura durante la replicacién ' ' :i.r:::,rl

DNA polimerasa y ) 5í No Replicación del DNA mitocondrial

DNA polimerasa E 2a3 Sí No Principal enzima de replicació
DNA polimerasa rc I 1 ) Requenda para la unión de proteínas
cohes¡nas que mantienen juntas las
cromátides hermanas hasta Ia anafase
de la drvisión nuclear (sección l5 2 3)

Las bacterlas y los eucariontes tienen otras DNA polimerasas que parlicipan fundamentalmente en la reparación del Di',A
dañado. Estas enzimas comprenden las DNA polimerasas ll, lV y V de Ésche¡iciia cali, y las DNI\ polimerasas tl, e, (, 11. {J y i
,16.2
de euc¿riontes. En la sección se describen los procesos de reparación del DNA.

a La activid¿id cle 5'+l' eronucleasil es rtenos I'recuente, pe1'ü está

presente en algrnas polinterersas cuy¿t función en la repiicaciór; exige
que puedan eliminar por lo ntellos parte cle un polinucieótidi; ,r,,a
uniclo a l* caclena n"rolcle que r:st,l copianclo Ia polirnerasa. Esta acti-
vidacl se utiliza durante el proceso de unión de los ft'agnrentos rlis-
continuos ile IINA sintetizaclos sobre l¡ caclena retlasacla durante l¡
leplicación de1 DNA bacteriano (véase {igur:r 15.18).

La búsqueda de DlifA poiilnera.ras conrenzó a lnediaclos de la déc¡c1¡i d*

1950. en cuanto se advirtió que la síntesis de DllA era la claye c1e la rcpli-
cación cle los genes. Se consicleraba plobable que las bacterias tuyiesen sólo
una única DNA polimerasa -y, cuanclo en 1957 Artl'lur l(on"rberg. aisló la
cnzirna llarnad¿i ahor:a IINA polimerasa l, la pi'esunción gcnet'alizada fur'
quc ésta era la princ,ipal enzima de leplicación. Por 1o tanto, |:e sorplen-
dente descubr"il que la desactivación clel gen polÁ de E. c:ali. euc ctrrlilieir
ls D§iA 1:o1il:'rclitsLr l, no era lctal (las célu1as podían. aun así, replicar sus
gcnomas), sobre todo cual:do sc obtuvo un lesultado sirnilal con la desac-
tivación del gen pol8. quc codilica una seguncla enzirl¿r. DNA polinlerasa
trI, cuya i-uncjón f'unclamental, segúr-r sa.llelnos ahora, es ia repalacion rlcl
DNA clañado lnás que Ia replicación clel genoma (secciór-r 16.2). Recién en
1972 se aisló, fin¿rlment*. la principal poiimclasa cle leplicación ch f,. ¿t/i:
DNA polin:erasa III. l.as DNA pi:limelasas I _v lll participiin en la leplica-
ción del genoma, como se ver¿l en Ia siguienle sección.

Las I)l.lA ptrlimerasas I y II

sorr polipéptidos simples, pero la DIrJA polintt-
rasa lli,
de acuerdr¡ con srl función de enzinla de repliurción pr:incipal. es L¡na r

proteína oe raúitiples
prorerna de suDunlüaües con una nrasa ruolecular
¡Ttulnple§ subunldades n]olecular apri:xi-narla
aproxllrl¿ru¡r de
sl ,,,

c)ilO kDa (cuadrc¡ '15.2). Las tres subunidades principales, que f'on:lan la enzt- ¡ .'1
:::..,::

ma centi'al, se clenominan cr,, e y 0; l;r activiclaá de pblinrerasa es especilirrrdr, t''"t'''

por la subuniclacl u, y la actividacl de l'+5' exonucleasa, por r. F.i'r-r s-' eorltr-
ce cür1 cialiclad la h¡nción cle 0: puede desempeñar un papel excllisir.¿rnte¡tfr'
estluctural en la aploximación cle las otlas clos subunicl¿lcLes cenu'ab§ 3 en el r:'
,
 Proceso de replicación

ensarnblaie de las diversas subunidades accesorias. Estas últimas son t J" T,

xnh¡rs codificad¿rs por el mismo gen, con y sintetizada por un cambio del
;r de lectura durante la raducción (sección 13.2.5); $, qu* actúa como
rr.rjif
.r,i,rr., Jcslizanre" ) sostiene estiecharlcnte e1 contplcjtl polimelasa conlra cl
mol.l;. r h' subunichdcs 6, 6'. X I V.

Los eucadontes tienen no menos de nueve DNA polimerasas que en los

manríferos se distinguen por sufijos griegos (cl, F, y, §, etc.), una elec-
rión de nomenclatura lamentable, pues tienta a la confusión con las
subunidades de ia DNA polinlerasa III de ,E. coli denominadas de mane-
ra icléntica. La principal enzima de replicación es la DNA polirnerasa 6
(cuadlo 13.2), que tiene dos subunidades (tt'es, según algunos investiga-
dores) y tr:abaja junto con una proteína accesoria denominada antígeno
nucle*r de proliferación celular (FCNA), Ei PCNA es e1 equivalenle
funcional de la subunidad p de la DNA polimerasa III de E. coli y sos-
riene estrechamente la enzima contra el molde. La DNA polimerasa a
también cumple una función importante en la síntesis de DNA, pues es
la enzima que ceba 1a replicación en los eucariontes (véase figura
15.ilB). La DNA poiimerasa Y, aunque codificada por un gen nuclear,
es responsable de la replicación del genoma mitocondrial.

Slr¡iirr¡s #lsr*nlitu¡: d* **:#*n#s ¡¡ rl pr**/*,';: x d*! r*ñm#*

La limitación impuesta por la capacidad de las DNA polimelasas de sinte-
tizar polinucleótidos sólo en dirección 5'--+3' indica que la cadena retrasa-
da cie la molécula madre debe copiarse de manera discontintta, como se
inuestra en 1a figura 15.12" La delivación implícita en este modelo -que los
productos iniciales de la replicación de la cadena retlasada son segmentos
polinr"rcleotídicos coltos* se confinnó en 1969, cuando se aislalon pol pri-
mera vez 1os fragmentos de Okazaki, como se los denomina en la actuali-
dad, c1e E. coli. En las bactelias, los fragmentos de Okazaki tienen de 1 .000
a 2.000 nucleótidos de longitud pel'o, en los euc¿iriontes, los fragmentos
equi\¡alentes parecer ser mucho más cortos, quizá de menos de 200 nucle-
óticios de longidud. Esta es una obselvación intelesante, que podría indicar'
que cada ciclo de síntesis discontinua replica eI DNA asociado con un solo
nucleosoma (entre 140 y 150 pb eru:ollaclas alrededor de I:r partícula cen-
tral. más 50-70 pb de DNA ligador:; sección 7.1.1).

La segunda diflcultad ilustrada en la figula 15.12 es la necesidad de un

cebador par:a iniciar 1a síntesis de cada polinucleótido nuevo. No se sabe
con certeza por qué las DNA polimerasas no pueden corlenzar la síntesis
de un molde totalmente monocatenario, pero quizá se telacione con l¿i
actividad de corrección de estas enzinas, que es esencial para la exactitud
de la replicación. Como se clescriJ:e en la sección 16.1.1, un nucleóticlo
insertado de manera incorrecta en e1extremo 3' de una cadena de DNA
en crecimiento y que, por ende, no ha folmado pares de bases con el poli-
nlrcleótido molde puede sel eliminado por la actividad de 5'-+5' exonu-
cleasa de una DNA polimerasa. Esto significa que la actividad de 3'-+5'
exonucieasa debe ser más eficaz que la actividad de 5'-+J' polinterasa
cuando el nucleótido 3' no está apareado por sus bases con eJ molde. La
consecuenoia es que la polin-rerasa puede extendcr un polinucleótido de
Inanera eficiellte sóio si el nucleótido 5' está apareado pol sus bases 1o
ql1e, a su vez. podr'ía ser ia razón por la cual un molde totalmente mono-
catei"lario que, pol definición, carece de un nucleÓtido 5' apaleado por sus
bases no puede ser utilizado por una DNA polimerasa.

Cnalquiera que sea la razón,la cebado es un requisito para la replicación de

DhrA, pero esto no 1'epresenta un ploblema demasido importante. Si bien
 I
1"7..
-l
.,
I

49¡t Capítulo l5 Replicacién de los gencmas

(A) Cebado de la sintesis de DNA (B) Cebado de la síntesis de DNA en

Figura 15.13 Cebado de la síntesis en las bacterias Ios eucariontes
de DNA en (A) bacterias y (B)
eucariontes. En los eucariontes, la Lt l I r.r,.r.r I rr.., I l. r,
primasa forma un complejo con la o-¡¿
Molde de DNA Molde de DNA
DNA polimerasa a, que es represent¿-
d¿ sintetizando el cebador RNA segui-
do de algunos de los primeros Cebador cebador I
nucleótidos de DNA. RNA Primasa RNA DNA nuevo
i I Primasa,
| *-._l ..1. :- DNA polimerasa r,r
ril
J ..11t il, !....!...1. t. r !. .l , Ll I I t.t t I
'''i ffi
a. r l r i r i I ¡ i i r r i r I r r r r , r r ¡ r r r ¡ r r r r r E

I I
DNA nuevo DNA polimerasa lll DNA polimerasa ñ
\ Y-:1 .i
¡;u? mds"r!@ 7,il::f
2,,,i t{til t}t¡ilil liltil"tf i,i .,
\, '/li§

las DNA polimerasas no pueden manejar un molde monocatenario en su

totalidad, las RNA polimerasas no tienen dificultad en este aspecto, así que
los cebadores para la repiicación del DNA están compuestos por RNA. En
las bacterias, los cebadores son sintetizados por una primasa, una RNA poli-
merasa especial no re].acionada con la enzima de tlanscr"ipción; cada ceba-
dor tiene 4-15 nucleótidos de longitud, y la mayoría comienza con la
secuencia 5'-AG-3'. Una vez completado ei cebador,la DNA polimerasa III
prosigue la síntesis de la cadena (figura 15.13A). En los eucariontes,la situa-
ción es algo más compleja, porque Ia primasa está estrechamente unida a la
DNA polimel'asa o y coopera con esta enzima en la síntesis de los primeros
nucleótidos de un nuevo polinucleótido. Esta primasa sintetiza un cebador
cle Rl{A de B-12 nucleótidos y, después, se 1o pasa a la DNA polimerasa u,
que extiende el cebador de RNA añadiéndole alrededor de 20 nucleótidos
de DNA. A menudo, esta extensión de DNA tiene algunos ribonucleótidos
mezclados, pero no se sabe con ciaridad si éstos son incorporados por la
DNA polimerasa cx, o por actividad interr:nitente de Ia primasa. Tias coniple-
tar el cebador de RNA-DNA, la principal enzima replicativa, la DNA poli-
merasa 6, continúa la síntesis de DNA (figura i5.13ts).

En la cadena líder, se requiere una sola cebado dentro del origen de

leplicación porque, una vez cebada, la copia de esta cadena se sintetiza
en forma continua hasta completar la replicación. En la caclena retrasa-
da, la cebado es un pl'oceso reiterado que debe ocunir cadavez que se
inicia un nuevo fi'agmento de Okazaki. En E'. coli, que fabrica fragrnen-

,,1
:
Figura 15.14 Papel de la DnaB heli- '(
casa durante la replicación del
{
DNA en Escherichia coli. DnaB es
una 5'-+3' helicasa y, por lo tanto, i

migra a lo largo de la cadena retrasa- I

I
da rompiendo los pares de bases a DNA topoisomerasa I
I

medida que avanza. Trabala junto con .T

una DNA topoisomerasa para desen- 't
rollar la hélice. Con el fin de evitar
§
confi-rsiones, este dibujo nü muestra
{1
Ia enzima primasa, asociada normal-
mente con la DnaB helicas¿. DnaB helicasa t
 Proceso de replicación

(A) Las SSB se unen a los polinucleótidos

tos de Okazaki de 1.000-2.000 nucleótidos de longitud, se necesitan no apareados
;ilrerledor de 4.0t10 eventos cebadores cada vez que se replica el geno-
n:;i. §n ios eucariontes, los fragmentos de Okazaki son mucho más cor-
to-( y la cebado es un evento altamente repetitivo.

Ah*ra que hemos considerado las complicaciones planteadas por la sínte-

sis riiscontinua de cadenas y el probiema de la cebado, podemos continuar
con el estudio de la combinaciÓn de eventos que ocurren en la horquilla de
replicación durante la fase de elongación de la replicación dei genoma.

En la sección 15.2.1 identific¿rmos la unión de la DnaB helicasa, seguida de

extensión de la región desnaturalizada del origen de replicación, como el
suceso que representa el finai de la fase de iniciación de la replicación en
§,. coli. La división entre iniciación y elongación es en gran medida artiti-
cia1, ya que ambos procesos están coordinados a 1a perfección entre sí. Una
{B) Estructura de RPA, una SSB eucarionte
vez que la helicasa se ha unido al origen para formar el complejo de prece-
bacio, se recluta a la primasa, que forraa el primosoma, que inicia la repli-
cación de la cadena líder. Lo hace sintetizando el cebador de RNA que
necesita la DNA polimerasa III para ccnrenzar a copiar el molde.

La DnaB es ia principal helicasa involucrada en la replicaclón del genoma

de E. coli, pero de ninguna manera es ia única helicasa de esta bacteria: de
hecho, el último recuento reveló que eran once. El tamaño del conjunto
refleja que no sólo se requiere el desenrollarniento del DNA durante 1a
replicación, sino también durante diversos procesos, como transcripción,
recombinación y reparación del DNA. No se ha definido con precisión el
modo de acción de una helicasa típica, pero se considera que estas enzimas
se unen al DNA monocatenario en lugar de al bicatenario y migran a lo
largo del polinucleótido en dirección 5'-+5' o 3'->5', lo que depende de la
especificidad de la helicasa. La rotura de ios pares de bases por la helicasa
requiere enelgía, que es generada por hidr'ólisis de ATP. Según este mode-
1o. una sola DnaB heiicasa podría migrar a lo iargo de la cadena retrasada
(DnaB es una 5'->3'helicasa) abriendo la hélice y generando la horquilla
dc replicación, y ia acción de la DNA topoisomerasa aliviaría la fuerza de
torsión generada por la actividad de desenrollamiento (figura 15.14). Es Figura I5.15 Función de las proteí-
pr:obable que este modelo sea una buena aproximación a lo que sucede en nas de unión al DNA monocatenaric
realidad, aunque no asigna una lunción a las otras dos helicasas de E. coli, (SSB) durante la replicación del
DNA. (A) Las SSB se unen a los poli-
que se piensa que interwienen en la replicación del genoma. Estas dos, PriA
nucleótidos no apareados por bases
y Rep, son 3'-+5' helicasas, y, por ende, sería concebible que complemen- producidos por la acción de la helicasa
ten la actividad de DnaB migrando a lo largo de la cadena líder pero, qui- e impiden que las cadenas formen
zás, desempeñen papeles menores. La participación de Rep en la pares de bases entre sí o sean degra-
rcplicación del DNA se podría limitar, de hecho, al proceso de repiicación dadas por nucleasas específicas de
por cír'culos rodantes utilizado por el bacteriófago ), y otros pocos bacterió- DNA monocatenario. (B) Estructura de
fagos de 0^ coli (sección 15.1.3). la SSB eucarionte denominada RPA La
proteína contiene una estructura de
hoja p, que forma un can¿l al que se
El DNA monocatenario es naturalmente cohesivo y ios dos poiinucleótidos une el DNA (representado en naranja,
separados, generados por la acción de la helicasa, volverían a formar de inme- visto desde el extremo). Reimpreso
cliato pares de bases después del pasaje de la enzima, si se les permitiera. Las con autorización de Bochkarev et al.
cadenas simples también son muy susceptibles al ataque de nucleasas y es (1997), Nature, 385, 176-181.
pi:obabie que se degradaran si no se las protegiera de a1gún modo. Para evi-
tar estos resuLtados no deseados, las proteínas de unión al DNA monocate-
¡rario (SSB) se ligan a los polinucleótidos, lo que impide que éstos se
reasocien o se degraden (figura 15.154). La SSB de E. coli está compuesta
por cuatro subunidades idénticas y es probable que actúe de manera similar
a la de la SSB eucadonte mayot denominada proteína A de replicación
(RPA), encen'ando el polinucleótido en un canal forrnado por una serie de
 Capítulo !5 Repiicación de los gencmas

SSB unidas a 1a cadena una al lado de la otra (figura 15.158). Un segundo

gl1rpo de proteínas, llamadas proteínas mediadoras de la replicación (RMPi,
deter-minan el desprendimiento de 1as SSB, que se debe pr:oducir cuando
llega elcomplejo c1e replicación a copiar las cadenas simples" Al igual que las
Copia de la helicasas, la-s SSB tienen diversas funciones en diferentes procesos que invo-
cadena lÍder -. DnaB helicasa
por DNA lucran el desenrollamiento del DNA.
polimerasa lll ..----- Pilmasa
Despuás que se han replicado 1.000-2.000 nuclcóticlos de la cadena líder:
\ puede comenzar el primer ciclo de síntesis discontinua de cadenas sobr* 1¡
cadena reÚasada. La primasa, que todaúa está asociada con la DnaB heli-
casa en el primosoma, fabr"ica un cebador RNA que, después, es extenclido
por la DNA polimerasa III (figxra 15.16). Éste es el mismr¡ ci:mplejo D§{A
polimerasa III que está sintetizando la copia de la cadena líder, y el comple-
jo cr:mpr:ende, en efecto. dos copias de la polimerasa mantenidas juntas pr:r
un par de subunidades r. No hay dos copias completas de ia pr:limerasa,
pues hay sólo un complejo y simple, que contiene ia subunidad y asociada
con 6, E', X y y. La principai función del complejo y (denominado a veces
"cargador de la pinza") es interactuar con la subunidad B (tu "pinza desli-
zante") de cada mitad de1 complejo y, por io tanto, controlar la unión de la
enzima al molde y su eliminación, una función que se requiere sobre todo
durante la replicación de la cadena retrasada, cuando la enzima se debe unir
y desprender de modo reiterado al comienzo y ai finai de cad¿r fragmento de
Okazaki. Algunos modelos dei complejo DNA polimerasa Iil colocan a las
dos enzimas en orientaciones opuestas para reflejar las diferentes direccio-
Síniesis de una nes en las que tiene lugar la síntesis de DNA, hacia la horquilla de replica-
copia de la cadena ción, en la cadena líder, y alejándose de ella. en la caclena retrasada. Sin
retrasada por DNA
polimerasa lll embargo, es más probable que el par de enzimas enfrenten la misma clirec-
ción y que la cadena retrasada forme un bucle, de modo que la síntesis de
DlrlA pueda seguir en paraielo a medida que avanza el complejo polirner:a-
sa al mismo dtmo que progresa la horquilla de replicación (figura La.17 ).
Figura I5.16 Cebado y síntesis de la
copia de la cadena retrasada duran- La combinación del clímero de DNA polimerasa III y el primosoma, que
te la replicación del DNA en
Escherichia colí. migra a lo largo del DNA parental y lleva a cabo 1a mayoría de las fun-
cir:nes replicativas, se denomina replisoma. Tras su pasaje, se debe com-
pletar e1 proceso de replicación uniendo los fragmentos de Okazaki
individuales. Este no es un acontecimiento trivial, porque un miembro
de cada par de fragmentos de Okazaki adyacentes todavía está unido a
su cebador RNA en el punto donde debería tener lugar el ligamiento
(figura 15.18). El cuadro 15.2 muestra que este cebador no puede ser
eliminado por la DNA polimerasa III, ya que esta enzima carece de la
actir.,idad de 5'->3' exonucleasa requerida. En este punto, la DNA poli-
merasa ill libera la cadena retrasada y su lugar es r:cupado por la DNA
polin-rerasa I, que sí tiene actividad de 5'-+3' exonucleasa y, así, elimina
al cebador y, en genelal. t¿rmbién el comienzo del componente DNA ciel
fragmento de Okazaki, lo que extiende el extremo 3' del tlagnento
adyacente h¿rst¿r la región del molde que está expuesta. Ahora, coljndan
los dos fragmentos de Okazaki y las regiones terminales de ambos están
compuestas por completo de DNA. Todo 1o que resta es que una DNA
ligasa sintetice el enlace fosfodiéster faltante, 1o que liga los dos frag-
mentos y completa la replicación de esta región de la cadena retr¿lsada.

ll * rq u i I f rs d * r*p ! i r* ri r:'n *¿: cr¡ ri * fit* :

,.r.,'¡'Jiio¡,,e: sobr* t,l l¿t¡tc bacte;'ianc
La fase de elongación de la leplicación del genom¿r es similar en bacte-
rias y eucarionfes, aunque cliiieren los detálles. En los eucarir:ntes, la
actividad de la helicasa mantiene el progreso de 1a horquilla de replica-
ción, si bien no se ha establecido cuirl de las varias helicasas eucariontes
 Proceso de replicación

quf han sido identiticadas tiene la responsabilidacl lundnment¿rl cie dc- ñgura 15.i7
senrollar el tllliA d¡:rante la replicac,ión. L¿rs proteínas cli: uniÓn al D|'iA 5' 3'
ti:011ocatenario, de las cuales la RPA es la plincipal en los eucariontes,
ir.:lpiden que 1os polinucleótidos separados se Yueivan a unir.

Camenzamos ¿i hallar características sing¡-rlares clel proceso de replica-

ción eucarionte cuandi: examinamos el métr:do utilizado para cebar ia
sintesis de DI"A. Como se describió, la Dl§A polirnerasa cr eucarionte
cüopera con la enzima prinrasa par.a ubiceu: k:s cebadores RNA-D}iA en
el cómienzr: de la copia de 1a cadc-na líder y en el comienzo de cada frag- 'Y"'

ltlento de Okazaki. Sirr embargo, la DNA polinlel'asa cr- no puede efec-

I
t
::
ruar síntesis de DNA prol:ngada, t¿il vez porque calece del electo Dímero de DNA
polimerasa lll
cstabilizadr:r de una pinza deslizante equivalente a la subunidad p de la t
DNA poiimerasa Ill de E. cr¡li o a la proteína accesot'ia PCI'.IA que ayr"rda +
I

a la OXe polimerasa E eucarionte' Esto implica que, aunque la DNA

polirnerasa cx puede ertender el cebador Rl{A inicial en alr:ededor de 20
nucleóticlos cle DNA, debe ser reemplazada después por la principal
enzima repiicativa, DI'JA polinlel'asa § (véase figura 15.138).

En los eucadontes, las enzimas Di{A polimerasas § que copian las cade-
nas líder.5r retrasada no se asocian en un complejo dimérico equivalente
al formado por la DI''IA polimerasa III durante la replicaciÓr"r en E. coli,
sino que ias dos cropias de la polimelasa pernlanecen separaclas. La fun-
ción éfectuada por el con-rplejo y de ia polimerasa de E. coli *control¿u'
la unión y el desprendimiento de la enzinla de la caclena retrasada-
clepencle de una proteína accesoria de múltiples subunidades denomina-
rla factor de replicación C (RFC).
Copia de la cadena retrasada
Al igual que en E. coli,la flnalización de la síntesis de la cacien¿i retrasada
exige la eliminación del cebador RIIIA de cada lragmento de Okazaki. Parece
no haber DNA polimelasas eucariontes con la actividaci de 5'+3' eronucle-
asa requerida pafa este fin, y por lo tanto, el proceso es ü1u,Y dif'elente del de-s-
crito para las células bacterianas. El par:ticipante central es la "enclonucleas¿¡ figura 15.18
flap", FENI (llamada antes N'1F1), que se asocia con el ccmplejo DNA poli-
met.asa E en el extrcln¡ 5' de un fi:agmento de Okazaki., para degraclar el DNA polimerasa lll
cebaclor clel extt'emo 5' del {ra-*r-rento adyacente. La comprensión exacta cie Fragmento de
cóno sucede esto se complica polque FEIrll iro puede iniciar la degradaciÓn DNA nuevo Okazaki siguiente
ciel cebador; ya que es incapaz de eliminal el ribr:nucieóticlo del extlemo 5'
5.
rlel cebaclor, pucs este ribonucleótido tiene un -qrupo 5'-trifosfato, que blo- 3',
quea la activiclacl c1e FEN1 (figura 15.19). Una posibiiidad es que la mayoría
La DNA polimerasa lll
se detiene cuando
Figura 15.17 Modelo de síntesis paralela de las copias de las cad.e.nas lídery alcanza el
reirasada por un dímero de enzimas DN,A polimerasa lll. 5e considera que la cebador BNA
cadena retiasada forma un bucle a través de su copia de la enzima DNA polime- it:

rasa lll, como se iiustra, de manera que es posrble copiar tanto l¿ cadena líder c
.orno iu cadena retrasada a medida qr:e el dímero se desplaza por la molécula
que está siendo replicada. Los dos componentes del dímero de la DNA polimera- La DNA pclimerasa I

sá Ilt no son idénticos porque sólo hay una copia del compleio y. continúa la síntesis

Figura 15.'18 Serie de eventos involucrados en la unión de-fragrnentos de .i

Oiazaki adyacentes durante la replicación del DNA en Escherichiq coli. La DNA 3',
polimerasa íll carece de actividad de 5'-*¡3' exonucleasa, por lo que dela de fabricar
bNA cuando alcanza el cebador RNA del fragmento de Okazaki siguiente. En este
punto, la síntesis de DNA continú¿ por acciÓn de la DNA polirnerasa l, que si tiene . La DNA ligasa une los
áAividad de 5'-+3' exonucleasa y que trabaja junto con la RNasa H para eliminar el dos fragmentos de DNA
cebador RNA y reemplazarlo por DNA. Por lo general, l¿ DNA polimerasa I también
reemplaza parte del DNA del fragmento de Okazaki antes de desprenderse del
moldb. fstó deja un solo enlace fosfodiéster falt¿nte, que es sintetizado por la
DNA ligasa, lo (ue completa este paso del proceso de replicaclón.
 §"
:l

Capítulo. 15 Replicarién de los geriornas

del componente RltiA del cebador sea eliminada por la R.Nasa H, que puede
degladal la parte RNA de un híbrido RNIA-DNA apareado por bases, percr
no puecle degladar el enlace fosfodiéster entre el último ribonucleótido y el
pdmer desoxiribonucleótido. Pero este ribonucleótido tendrá un 5'*mono-
iosfato en iugar de rur 5'-triflosfato t. por ende, puede ser eliminado por
FENl (figura 15.20A). Este rnodelo tiene 1a desventaja de asigpar un papel
fundamental a la RNasa H, mientras que la evidencia experimental ir-riijca
que las céluias que cal'ecen de esta enzima pueden replicaq aírn así, la cadr.-
na retrasada. Una posibilidad altenativa es que una helicasa rompa los pal*s
de bases que mantienen unidos al cebador y la cadena molde, 1o que posibi-
lita que el cebaclor sea empujado a un lado por ia DNA polin-rerasa 6 a medi-
da que extiende e1 fraglnento de Okazaki adyacente hacia ia región así
expuesta (figura l5.20ll). El colgajo resultante puede sel cortado entonces
por: FElrll, cuya actividad de endonucleasa le penlite degladar ei enlace tbs-
fr,:diéster en el punto de ramiñcación donde la región desplazada se une a la

Figura 15.'l9 La "endonucleasa flap" Grupo 5'{rifosfato r,rr

FEN'l no puede iniciar Ia degrada- i
cién del cebador porque su activi- I
dad es bloqueada por el grupo § -,ñ
¡. il ;i
trifosfato presente en el extremo 5' AN *
del cebador RNA. \3' /
* {§1

C¡-*i¡-ñ-r];!.

{A) Modelo de RNasa H (B) Modelo flap

Figura I5.20 Dos modelos de finali-
zación de la replicación de Ia cade-
na retrasada en los eucariontes. EI Fragmento de Fragmenio de
DNA nuevo (cadena roja) es sintetiza- DNA nuevo Okazaki siguiente DNA nuevo Okazaki siguiente
t;
1....... . i li :

do por la DNA polimerasa §, pero no ..

se muestra esta enzima para que los .,;;;.,,i,,iir,;,,,,,,r,¡,r,,r¡,,, E' 3.

il',' ¡' ¡ i,¡
", ",
rr r
" " "'
i!,--:-::5'

diagramas resulten más ciaros. II I

FENl coda
+ *I en el punlo
La RNasa H elimina e| cebador de ramificación
hasta el último ribonucleótido DNA polimerasa 6
+ helicasa empujan \t. , I,
,:..-
.yi a un lado el cebador i,:,:.,,.. j

,,u-,L,i,lr¿lJ¿,!L,!.! J,1.'iil.,1,!]*i! r.,,!,r!u,,,¡",Lt r,, ! j"ilIffiffiIffil1ñfi§il,j§*i i rtF:]i,ik :..':..':í."...6

!,. _.1

FENl elimina el último

ribonucleótido más I
')r Enlace
parte del DNA fosfodiéster
. faltante
. :..a:.,,:..:@,.,,+
I
ii r'':-i"r;iii'iiii;
*-*+t
.t 11.t,j.,,,,.,i,.i-ii.ii¡.i i i,¡ i i i1,,l .',1,r,r-j,,,, .t iijijiii;i i..i ? i 1 :i.-i.i i_i i ij...r.*,+,:.;,¡r&

La DNA ligasa une La DNA ligasa une

I los dos fragmentos ! los dos fragmentos
I oe o¡lR J de DNA
1-

l!;jr:,j,¡ t !¡' i i i ¡ i t rl i t, t ¡ tt ¡ "', ¡.

 Proceso de replicación

Origen de replicación
parte dei fragmento que toda\iía se encuentr¿i apal'eado por sus bases. Este
esqufma plantea la posibilidad d¡: que sean eliminados tanto el cebador RI"IA
corno todo el DhlA sintetizado en primera instancia por Ia DNA polimerasa
c¿. Esto es interesante porque la DI"IA poiimerasa a no tiene actividad de
con'ección 3'-+5' (véase cuadro 15.2) y, por 1o tanto. sintetiza DNA de una
lrenera relativamente proclive al error. La eliminación de esta región como
parte dei colgajo escindido por FEN 1, seguida de nueva síntesis por la DNA
polimerasa 6 (que tiene actividad de corrección y fabrica así una copia muy
eri¿rcta del molde), impediria que estos etrores se convirtiesen en caracterís-
dcas permanentes de la doble hélice hija.

La diferencia final entre repiicación en bacterias y en eucariontes es que

e-utos últimos no tienen ningún equivalente del replisolna bacteriano. En
cambio, las enzimas y ias proteínas involucradas en 1a replicación for'-
nl¡rn estructuras mensurables dentro del nircleo, cada una de las cuales
contiene cientos o miles de complejos de replicación individuales. Estas
estiructuras son inmóviles debido a uniones con la maffiz nuclear, de
modo que las moléculas de DNA son enhebradas a través de los comple- Figura '15.21 Situación que no se
jos mientras se replican. Las estlucturas se denominan fábricas de repli- permite que ocurra durante la repli-
cación y, de hecho, también pueden ser caracteústicas del proceso de cación del genoma circular de
r:eplicación, por lo menos en algunas bacterias. Escheríchia coÍ. Una de las horqui-
llas de replicación ha sobrepasado el
punto medio. Esto no sucede durante
-:
,. t'
;
. '.ti;:. .: , la replicacién del DNA en Escherichia
coli debido a la acción de las proteí-
Contamos con escasa información directa sobre la leplicación del DNA en
nas Tus (véase figura 15.228)"
las arqueobacterias (Archaea); ia mayor parte de los conocimientos se han
deducido investigando genomas arqueobacterianos para hallar genes y otras
secuencias similares a los componentes del aparato de replicación de bacte-
rias o eucariontes. Los primeros intentos cle localizar orígenes de replicación
en genomas arqueobacterianos buscando n"iotivos de secuencia obseryados
en orígenes bacterianos o eucariontes no fuelon exitosos. Con uiterioridad,
-se identificalon posibles oúgenes de replicación en diversas especies de
ar'queobacterias mediante análisis estadístico de las frecuencias de ios cuatro
nucleótidos en diferentes partes de cada genoma arqueobacteriano, con el
fundamento de que estas frec'uencias podrían mostl'al diferencias significati-
vas a cada lado de un origen, como en el caso de las bacterias. En una espe-
cie, Pyrococctrs ubyssi, un posible origen identificado por análisis de
frecuencia de nucleótidos reside en la región clel genorna que se leplica en pri-
n:er término y, pol lo tanto, puede ser el verdadero odgen de replicación.

Las secuencias de la mayoúa de las proteínas invoiucradas en la fase de elon-

gación de la replicación del genoma arcluer:bacteriano, según se prevé a par-
tir de sus genes, son similares a las velsiones eucafiontes equivalentes" En
particular; las arqueobacterias tienen proteínas que son hornólogas a la RFC
y el PCNA eucariontes. La DNA polimerasa arqueobacteriana es interesante
porque la subunidad que especifica 1a actividad de síntesis de DNA es simi-
lal'a la subunid¿ld eqr:ivalente de la DNA polimerasa 6 eucarionte, mientras
la función de comección es conferidá por una proteína que parece ser homó-
loga a la subunidad e de la DNA polirnerasa III de Esclrcrichia «:li.

;,*"4"3 *#fl§}]§?1*,il1{}-.: .i I, {,:lii;frffi{;*i?

Por 1o general, las horquiilas de replicación siguen a lo largo de genomas line-
ales o alrededor de los circulares sin impedin-rentos, excepto cuando se
encuentra una región que estír siendo transcdta. La síntesis de DNA es alre-
dedol de cinco veces más rápida que la de RNA. por io que ei compiejo de
r:eplicación puede adelantarse con facilidad a una RNA polimerasa, aunque
es probable que esto no suceda: se considera que, en cambio, la horquilla de
 *w!!!{r.-

50{, Capitulo 15 Replicacion de los genomas

(A) Secuencias terminadoras en el genoma

Figura 15.22 Función de las secuen- de E. coli (B) Papel de Tus
cias terminadoras durante la repli-
cación del DNA en fschericáia coli. Origen de replicación Proteínas rr* *il§
(A) Se muestran las posiciones de las
seis secuencias terminadoras en el
genoma de E. colí, y las puntas de
flecha indican la dirección en que una
¡ La horquilla de repl¡cacicn
horquilla de replicación puede pasar ! puede pasar a una
a cada secuencia teminadora. (B) La .f Proteina Tus unida --'
unión de proteínas Tus permite que una dtreccron. . .

una horquilla de replicación pase

cuando ésta se acerca desde una
dirección, pero no desde la otra. El
diagrama muestra una horquilla de
replicación que pasa a la Tus por la §*rr,¡*tci;rl
izquierda, porque la DnaB helicasa rr;,1; t,,lii
tL.-ar¡r
I ... pero es bloqueada por
que está haciendo avanzar la horquilla I una proteÍna Tus
puede romper la Tus cuando se le Región donde quedan "atrapadas" t unida en la otra dirección
aproxima desde esta dirección. las horquillas de replicación V
Después, Ia horquilla es bloqueada ^
por una segunda Tus, porque ésta
enfrent¿ a la horquilla con su
impenetrable pared de cadenas B.

replicación hace una pausa detrás de la RNA polimerasa y prr:sigue sólo

cuando se cr:mpletó ei transcrito.
Por último, la horquilla de replicación alcanza e1 extremo de la mr:lécu-
la o encuentra una segunda hor:quilla que se mueYe en dirección opues-
ta. Lo que sucede a continuación es uno de los aspectos nleno§
conocidos de la replicación del genoma.

-i; r.:)it(,.:.:,;..:'::;,.] -:.',,..,...,.- ,. , '.,1,1.:.i-':- :

.'.. ,,rl ; '..;: t i t:.-',... . j'.

El modo de acción de Tus es bastante infrecuente. Cuando se ufle a tlnil iii

secuencia tenninadora, un proteína Tus permite el pasaje de un;r horqut- '

lla de replicación si ésta se mueve en una dirección, perá bloquea su pr.o: .

gr.uo ,i ia horquilla se mueve en la dirección opuesta aliecledor dcl
genoma. La orientación de la pr:oteína Tus en la doble hélice deternrtnit,
":' ,

:
la direccionalidad. Tus bloquea ei pasaje de la DnaB helicasa, respon§*'
b1e de la progresión de la horquilla de replicación, cuando se rtptorinta
desdeunadirección,porque1ahelicasaseenfrentaConuna..p.'].eo,::
cadenas [} que ,o puid" utrur*rur. Pero cuando se aproxr,ri O*uq: tut..."".t,
otra dirección, la DnaB puede romper la estructura de ta prr:teina 11t:.,t$
ffi; d"' ;;i;;;' ;i
"r"il] ;;;-';;i;"'"","ri,*'.";
á; i; áobre hári'
ce sobre Tus y, así, puede seguir avanzando (figura 15.228).
 Proceso de replicación §lll

I]1:]l
orientación de las secuencias terminadoras y, por ende, de las proteínas
i xánidas, en el genoma de E. coli es tal que ambas horquillas de replica-
3 qsedan atfapadas dentro de una región relativamente corta del lado
g*lo*u opudto al origen (véase figuia 15.224). Esto garantiza que la
I
ánación siempre tenga iugar en la misma posiciÓn o cerca de ésta..No ,,{ITm
sabe con exactitud qué sucede cuando se encuenttan las dos horquillas
Heplicación
del DNA **-\üIffT
n-nTr tra-
áe replicación, pero déspués de este- evento los replisomas se desensam-
blun,^"r, forma espontánea o controlada. El resultado son dos moléculas
interrelacionadas, que son separadas por la topoisomerasa IV'
I
fi Cohesinas
s{:}* É}*r* {?r#rf,* d* l¿: r*r,ry:;x¡vei*¡t #* i* r*p,irr*r:i*'* TTÍTTTTTTTTTTT
jr]§ *lJr{7íi#$f*§
En lcs eucariontes, no se conote ninguna secuencia equivalente a los ter-
r
t
minadores bacterianos ni se han identificado proteínas similares a Tus. 1

,§s bastante posible que las horquillas de replicación se errcuentren en Anafase

I

.oosiciones afuatorias y que la terminación sólo implique ligamient6 de

Itrffit1
I
I

io, .*t."-os de los nuevos polinucleótidos. De hecho, sabemos que los

I

complejos de replicación no se degradan, porque estas fábricas de repli-

caci6n son características perrnanentes del núcleo.
Figura 15.23 Cohesinas. Las proteí-
'En lugar de concentrarse en los eyentos moleculares que tienen lugar cuan- nas cohesinas se unen inmediata-
do seincuentran las horquillas de replicación, se ha dirigido la atención a mente después del pasa.ie de la
horquilla de replicación y mantienen
la difícil pregunta de cómo no se enredan de manera imposible las molécu- juntas las moléculas hijas hasta la
las hijas de DNA producidas en un núcleo eucarionte. Si bien las DNA anafase. Durante ésta, las cohesinas
topoiiomerasas pueden desenredar moléculas de DNA, se suele presupo- se escinden, lo que les permite a los
'.
ner que se reduCe el enredo, de modo de evitar las extensas reacciones de cromosomas replicados separarse
.rotuia y reunión catalizadas por las topoisomerasas (véase figura 15'4)' Se antes de su distribución en los
pr,opusi".on diversos modelos para resolver este problema. Uno de ellos núcleos hijos (véase figura 3.15).
sugiere que un cromosoma eucarionte no está empaquetado al azar en su
territorio nuclear (sección 10.1.1), sino que está ordenado alrededor de
fábricas de replicación, que parecen estar presentes sólo en cantidades iimi-
taclas. Se considera que cada fábrica replica una sola región del DNA, lo
que mantiene a las moléculas hijas en un ordenamiento específico que evita
que se enreden. Ai principio, las dos moléculas hijas son mantenidas jun-
tás por proteínas cohesinas, que se unen inmediatamente después del pasa-
je de la horquilla de replicación mediante un proceso en el que parece
intervenir la DNA polimerasa K, ufia enzima enigmática esencial para la
replicación, pefo cuya única función conocida no requiere, evidentemente,
una actividad de DNA polimerasa. Las cohesinas mantienen la alineación
de las cromátides hermanas hasta la anafase de ia división nuclear; cuando
son escindidas por proteínas de corte, lo que permite 1a separación de los
cromosomas hijos (figura 15.23).

s::q¡§¡á*il3m &x ffi?'é,i& lxwg.má

Antes de abandonar el proceso de replicación, cabe considerar un últi-
mo problema. Éste concierne a los pasos que se deben tomar para evi-
tar: que los extremos de una molécula bicatenaria, lineal, se acorten de
manera gradual durante ciclos sucesivos de replicación dei DNA cromo-
sómico. Este acortamiento podría ocurrir de dos maneras:
* El extremo 3' de la cadena retrasada podría no ser copiado, porque
no se puede cebar el fragmento de Okazaki final, ya que la posición
natural dei sitio de cebado está más allá del final del molde (figura
15.24A). La ausencia de este fragmento de Okazaki implica que la
copia de la cadena retrasada es más corta de 1o que debiera ser. Si la
copia mantiene esta longitud, cuando actúe como polinucleótido
 .,,W

502 Capítulo 15 Replicacrón de ios genomas

parentai en el siguiente ciclo de replicación, la molécula de segunda

generación filial resultante será más corta que Ia molécula parental
original.
* Si e1 cebador para el último fragmento de Okazaki está ubicado en el
extremo 3' de 1a cadena retrasada, de todos modos habrá acol'ta-
miento, aunque de menor grado, porque este cebador RNA terminal
no puede ser convertido en DNA mediante los procesos convencio-
nales de eliminación del cebador (figura 15.248). Esto se debe a qr.re :'
los métodos de eliminación del cebador (ilustrados en la figura 1 5. 1 8
para las bacterias y en ia figura 15.20 para los eucariontes) exigen ..;,-,t,tl..

(A) No se puede cebar el último fragmento de Okazaki

Figura 15.24 Dos razones por las
cuales las moléculas lineales de DNA
Cadena líder Extremo del cromosoma
podrían acortarse tras Ia replicación
a'
ui*
del DNA. En ambos ejemplos,la molé- ñ'§ ,1.

cuia madre se replica de la manera ii'* ry Motécuta madre

habitual. Se fabrica una copia completa _, I ::
5 **
t..

de su cadena líder pero, en (A), la

copia de la cadena retrasada es incom- Cadena retrasada
pleta porque no se fabrica el último I
fragmento de Okazaki. Esto se debe a +I
que los cebadores de los fragmentos
de Okazaki se sintetizan en posiciones
3',?Tffi_ -_ ._s',
-1 r ,l l-L[: l:r,]' '^;: -t "'¡l¡
que se encuentran a alrededor de 20O
pb en la cadena retrasada. Si un frag- Dos moléculas hijas
'i' ¿ i#i.+i§{*¿{d*4{C$.ea 5
- -
mento de Okazaki comienza en una ¡ I illlillllli¡lltillllitlll¡r
posición localizada a menos de 20O pb
del extremo 3'de la cadena retrasada, Replicación
de la copia
no habrá cabida para otro sitio de ceba- de la cadena
do, y no se copia el segmento restante retrasada
de la cadena retrasada. Por lo tanto, la 3'.-- _, _*- ____..-- ,_,-*wpc*r*rys§' Una molécula de
f ? Tr§xffixrry: ¡..i:;.il.j la segunda
molécula hija resultante tiene un seg-
mento protuberante 5'y, al ser replica-
§'-*ry:' generación filial

da, da origen a una molécula de

La molécula se ha acortado
segunda generación filial más corta que
la molécula madre original. En (B), el
últrmo fragmento de Okazaki puede
estar posicionado en el extremo 3' de
la cadena retrasada, pero su cebador (B) El cebador para el último fragmento de Okazaki se encuentra en el extremo 3'
RNA no puede ser convertido en DNA, de la cadena retrasada
porque esto exigiría extender otro frag-
mento de Okazaki ubicado más allá del Cadena lider Extremo del cromosoma
extremo de Ia cadena retrasada. No j'
- Tf
queda claro si se puede conservar un " Molécula madre
cebador RNA terminal durante todo el ¡;
ciclo celular ni si un cebador RNA rete- 3 --
nido puede ser copiado en DNA duran- Cadena retrasada
te un ciclo ulterior de replicación de
DNA. Si el cebador no es conservado ni !
¿
copiado en DNA, una de las molécul¿s
de la segunda generación fillal será más 3', ...... _.. . .. ."....5'
corta que la molécula madre original. ¡,, ¡ r.-rrrrr-ñTñ
...,-& A jJ¿Ll.l¿ll !''l¿i.',;i¿*1.,1 | j-¿-:t¿*r.-.
Dos moléculas hiias
I

-48@@*****J.-
Replicación -,i ¡ il¡ ill l¡i l¡¡ ¡l¡lli li i¡ lli ¡ ! -..
de la copia
de la cadena
retrasada

una molécula de la
segunda generación filial

La molécula se ha acorlado
 Proceso de replicacién

extensión del extremo 3'de un fragmento de Okazaki adyacente, que

FJI
no se puede producir precisamente en el extrsmo de la molácula. *r¡¿ceerrAcccs
tttttit

Urm vez reconocido este problema, se dirigió la atención a los telóme-

ros, las secuencias atípicai de DNA de los áxtremos de los cromosomas ,.: :.;

eucariontes. En la sección 7.1.2 obserwamos que eI DNA telomérico está +

I Sintesis de DNA
compuesto por un tipo de secuencia minisatélite, formada por múltiples
0l'iA r¡;i,r ',

eopias de un motivo repetido corto, S'-TTAGGG-3' en la mayoría de

los eucariontes superiores, y algunos cientos de copias de esta secuencia s', /: l
:TTAcccrrnoocrrlc
sparecen en repeticiones en tándem, en cada extremo de todos los cro- ¡l,lllltit¡

rsosomas. La soiución al problema del acortamiento terminal reside en ,-;'l

i n l-.l{: :-i'-:':',,1. i-, i.-1 ..,.,,
el modo de sintetizar este DNA telomérico.
t-
I lranslocacron
vI
Sl #¡*tÁ f*fsr:m$rie* *$ §iñ§s$§#do p*r"ls erl,rí¡¡:¡*r f*f*¡xer*s*
La mayor parte del DNA telornérico es copiado de manera habitual durante 5',
h*TTRECCTTAGGG? TA*"
la replicación de DNA, pero ésta no es la única forma en que puede si:rteti- Itllt
:

zarse. Para compensar las limitaciones del proceso de replicación, es posible

extender los telómeros por un mecanismo independiente catalizado por la
enzima telomerasa. Ésta es una enzima infrecuente, ya que está formada
tarito pff proteína como por RNA. En la enzima humana, el componente r SÍntesis de

RNA tiene 450 nucleotidos de longitud y contiene cerca de su extremo 5'la

I Drun nr"ro
trr
secuencia 5'-CUAACCCUAAC-3', cuya región central es el complemento r
inverso de la secueircia repeüda del telómero humano 5'--:TTAGGG-3'. Esto 'q*TtRGCGTTAcccf f A**STÍAü
li1:llt¡!:l
perrnite que la telornerasa extienda el DNA telomérico en el extremo 5' de .,..,r,i
i _'' ::, - I- !..'.' !¡1i-:tr i;---_

un polinucleótido mediante el mecanismo de copia ilustrado en la figura

15.25, que utiliza como molde el RNA de la telomerasa pam cada paso de
extensión, mientras que la síntesis de DNA está a cargo del componente pro- Figura 15.25 Extensión del extremo
teico de la enzima, que es una transcriptasa inversa, Las comparaciones entre de un cromosoma humano por la
telomerasa. Se muestra el extremo 5'
las secuencias repetidas de los telómeros y los RNA de telomerasas de otras de una molécula de DNA cromosómico
especies (cuadro 15.3) indican que este modelo es correcto: en todos los humano. La secuencia comprende repe-
organismos investigados, el RNA de la telomerasa cor¡tiene una secuencia ticiones del motivo telomérico humano
que permite fabricar copias del motivo repetido presente en los teiómeros del 5'{TACCC-5i El RNA de la telomer¿-
arganismo. Una caracter{stica interesante es que, en todos los organismos, la sa se aparea por sus bases con el extre'
cadena sintetizada por la telomerasa tiene una preponderancia de nucleóti- mo de la molécula de DNA, que es
extendido una corta distancia; es posible
dos G y, por lo tanto, se la denomina cadena rica en G.
que la longitud de la extensión esté
determinada por la presencia de una
La telomerasa sólo puede sintetizar esta cadena rica en G. No queda claro estructura tallo-bucle en el RNA de la
cómo es extendido el otro polinucleótido -la cadena rica en C*, pero se telomerasa. Después, el RNA de la telo-
presume que cuando la cadena rica en G tiene la longitud suficiente, el merasa se transloca a una nueva posi-
ción de apareamiento de bases algo
complejo primasa-DNA polimerasa ü se une a su extremo e inicia la sín-
más alejada a lo largo del polinucleótido
tesis del Dl.{A complementario en la foma habitual (figura i5.26). Esto DNA y extiende la molécula en algunos
requiere un nuevo cebador RNA, de manera que la cadena rica en C será nucleótidos mál El proceso se puede
más corta que la cadena rica en G, pero el punto importante es que nü §e repetir hasta que el extremo del cromo'
ha reducido la longitud global dei DNA cromosómico. soma se haya extendido lo suficiente.

Cuadro 15.3 Secuencias repetidas de los telómeros y RNA de telomerasas en diversos organismos

xPtlb.,...ltt: Secuencia repetida de los telómeros Secuencia del molde RNA de la telomerasa

Humana 5,*TTACCC_3' 5,_CUAACCCUAAC_3'

Oxytricha 5,-TTTTCCCC_3' 5, -CA AAACCCCAAAACC-3,
Tetrahymeno 5,_TTCCCC_3' 5,_CAACCCCAA_3,

Oxytricho y Tetrohymeno son protozoos de particular utilidad para el estudio Ce los telómeros porque, en ciertos estadios de desarrollo, sus
cromosomas se rompen en pequeños fragmentos, todos los cuales tienen telómeros: por lo fanto, hay muchos telómeros por célula.
 'I!il!!Il

Capítulo 15 Replicación de los genomas

-trm"
Es evidente que la actividad de la telorrerasa debe ser controlada con
sumo cuidado para garantizar que se fabrique una extensión de lon-
. La telomerasa extiende gitud adecuada en cada extremo cromosómico. Las proteínas TRIrl,
*I
el segmento
protuberante 3' que se unen a las secuencias repetidas del telómero, representan una
ñ.
parte de este mecanismo regulador (sección 7.1.2). TRFl induce la
3rra-atr-aaaars ej¡¡¡¡1 ,-

lr lt,llrrrll¡
formación cie una estructura cromatínica plegada que le impide a la
enzima telomerasa acceder al extremo del.cromosoma. A medida que
Cuando se ha sintetizado
el telómero se acorta, disminuye la cantidad de proteínas TRFl uni-
suficiente DNA, se puede das, la estructura de cromatina se abre, lo que permite que 1a telomc"
cebar un nuevo
fragmento de Okazaki
rasa se una al extremo del cromosoma y extienda el telómero. A
medida que e} teiómero se extiende, se vuelven a unir proteínas TRFl;
esto induce a ia cromatina a recuperar su estruotura plegada, de modo
que la telomerasa es excluida nuevamente de1 extremo del cromoso-
ma. En efecto, las proteínas TRFl median un circuito de retrr:alimen-
tación negativa que regula la actividad de la telomerasa en el extremo
de un cromosoma determinado. En las células de mamíferos, la
Figura 15.26 Finalización del proceso estructura cromatínica cerrada puede implicar la formación de un
de extensión en el extremo de un "bucle t", en el que el extremo 3' libre del telómero se incurva hacia
cromosoma. Se considera que, des- atrás, invade la doble hélice y forma pares de bases con su secuencia
pués que la telomerasa ha extendido lo
suficiente el extremo 3' (como muestra
complementaria de ia cadena rica en C (figura 15,27). Esta reacción
la figura 15.25), se ceba y se sintetiza es catalizada por la segunda proteína de unión a telómeros de los
un nuevo fragmento de Okazaki, que seres humanos, TRF2, y puede establizar más un extremo de un crr:-
convierte la extensión 3'en un extremo lrlosolna que no requiere extensión adicional.
completamente bicatenario.

Quizá resulte sorprendente que la telomerasa no sea activa en todas las

células de mamífero. La enzima es funcional en ios primeros estadios
embrionarios pero, después del nacimiento, sólo es activa en las células
reproductoras y las células rnadre. Estas últimas son células progenitoras . ,,r,,ri, ,,r,irr
.

que se dividen en forma continua durante toda la vida de un olganisrno ¡,

producen nuevas células para mantener en estado funcional a ór'ganos l,
teiidos. Los ejemplos mejor estudiados son las células madre henratopor.l
ticasdelamédu1aósea,quegenerannuevaScé1u1assanguíneas'
- .

Las células que carecen de actividad de telomerasa sufren aeorta-

miento cromosómico cada vez que se dividen. Con el tiempo, después ";',:1;';"::lrt:'1,1
de numerosas divisiones celulares, los extremos de1 cronrosonra
podrían estar tan truncados que se pierden genes esenciales, peJ:o e§ "t....,....,,t.....,ll,l
improbable que esto sea una causa importante de los defectos que ',,.. 1:;;!;,,.
pueden presentar las células que carecen de actividad de telcn:erasa. ::1';:1,;::1:;1,;,:,:'.';'.,.,

En calnbio, el factor crucial es 1a necesidad de n-]antener una "cubier' t,,,.,,,..,a.,,.,,..,'.,,.,,,,,.;

ta" proteica sobre el extremo de cada cromosoma pafa protegeu est:s ;.,¡;':"'t":,:,:::':"..,t.'.,,,,

ext1.e1xoSdelosefectcsc1e1asenzimasdereparacióndelDN.\,que
leúnen1osextremoSnocubiertosqueSepl.oducenpor1arOtur3¿teci.
dental de un cromosoma (sección 16.2.4). Las proteínas que lorm¿n ',,ir.l,.,:,,:.1,i,
esta cubierta protectora, colrlo las TRF2 en los seres humanus. rcco-
nocen las repeticiones teloméricas como sus secuencias de unión y, .'§llil,,,,,,,',
, §:'-l1]^l
\liA{:i;t: l por enc1e, notienen ningún punto de unión ciespués de la cleleciÓn dr. ,:ilt,'r:,..,,.tlj:1
i ttlilt
I

i los telómeros. Si estas proteínas están ausentes, la enzimas de tcpara'

:,,.',»Á. T ü ü ü *¿á&,
ciór: pueden efectuar ligamientos inapropiados entre los extremos de '::'':,,;,::;:,,;;f;:'::':',';
r1.

Figura 1 5.27 El "bucle t". El bucle t
se forma cuando el extremo 3' Iibre
del telémero se curva hacia atrás e
invade la doble hélice.
:":''.'W'''"'
cromósomas intactos, J,rt qt-t" acortaáos; es probable que ésta sea ls
callsa subyacente de la alteración del ciclo celular secundaria al accr' '..., .: :r.,,:.:.:.
tanricnttl de It¡s telómelos.
Por 1o tanto, el acortamiento telomérico induce la terminación de ufi,,.','',,',,.,.,,,.{,ti|{1,,,,,'.,'
linaje celular. Durante varios años, ios biólogos han intentacir: vincular i l,.lii§a¡:fi:,l
este proceso con la senescencia celular, un i'enómeno observado od§i',,,ii.37:,:;§i"
 Procesc de replicación

iffi,,-^,-r,'nte en cultivos celulares. Toclos 1os cultivos de células normales .,:.,:):',:a. .,::::
ftd'r"-'
1,,,:,,,,1*l,t ,,,.tit:r{* un períodr: cle vida limitado: después
cle.cierta cantidad c1e divi-
i#lñ..,;;r;,,.ii,iro'"r, 1as células ingresan,en ,1":'X*i."TitiTt.;ii*,,::: División celular
Jl..,.tÍ,;,;;;;;;;'tuur,
pr't:t: '"---r-,.--^ ,.^ p*ro no p,iclen diviclirse
(ligura 15.28). En algunas
..,,: .,.
i::-,1: ;"lulr*. de --^^,-i.r,-..^-
ma:níferr:s, sobre nrrltir¡nq fibroblastos (célu-
-^l-,,.o todo cultivts de fihrnhlastos
rnrl^ lcélu- Culiivo celular \
genomanipulan-
,-- .-.,... l:l'í. l-ii.i. ."nectivo), se puede demorar la senescencia
¡urrL!ru!t telomerasa,itl'li:
que sinieticen E:l:.:jY:i:"T::'
.,' .,
::.i:,.u:it,tr,:tii..r -
lil ir.-
dü
lr,.y,*7:, susieren una
.lJrurou para
las CctLllils P'llr¡ L{us
ciara rálación entre acortamiento de los telómercs y senes-
*rrri1a, pero se ha cuestionado
* ,;l;,:;;;'ri:l,;;trapr:laciÓn la exactitud de1 vínculo' y cualquier
,;,.!l;;,)
de senescencia celular a envejecimiento del organismr:
División
""ry
il¡¡:.ii. l, ;srá p1 agada de dificultades'
r, i.,l;.:,i--,::§iiii,. .'

senescencia' Las células can-

t11''*'t'i..,,
No torla-s las líneas ceiulares presentan
,':,;,.i,*;L,.,.,,üeros*s pu"áa" ái"iclirse a.rltiuo en form¿i continua y su inmr:rtali-
",
datl se consiclera análoga a1 crecimlento
,:,:::'::',:,:,il:ll:,,,):,:,::::,
tumoral en un orgzinismo
"t',',.''',, ilüri". g" varios tipos de cáncer, esta ausencia de senescencia se aso-
.,¡','ilr.:::ir .ir.on actiyación de la tek¡merasa, a veces en un grSdo que.p.ermite
,'.:,t;1:;:;,, *lnr*".r la longitud de los telómeros a través de múltiples divisiones
rt¡r,,l,:,,, celUlares, p"ro i'menUdo
'rr,r,trr, de Una manera qUe hace qUe lOS telómerOS
telome-
rrr,,,,,::. :,1,,,,,. vuelvan más iargos que 1o normal por hiperactividad de 1a
se
:';
',::,1', iasa. No se sabe con claridad si 1a activaciÓn de la telomerasa es una
parece máS prObable lO primerO
:...,;L:,:;:,':.,,,; e6LtSL¡ o ua efeCtO del cáncer, aunqge
,,,rl:,.i:.,.rriil,ri,r porque, por'1o nlenos un tipo de-cáncer,
la disqueratosis congénita'
', . l¡,tll..' i^r"ce ot"d"cer a una mutaciÓn clel gen que especifica el componen-
:l¡,'¡.,.1:l;ll,:,rl;'i ie RNA de la telomerasa humana. La cuestión es crucial pafa com-
',,:1,';;:::;t:':l: pr'..¿". la etiología clel cáncer, pero es menos importante en 31
Las células enveiecen -
,-: lr:,,,rr aspecto terapéutiü, que investiga si ia-telomerasa podría.ser.un
sitio no hay más división celular
,,' ,, ciiana para ia acción áe fármacos diseñados para combatir el cáncer'
' i rr

Un rraiamiento de este tipo poclría ser eficaz aunque la activación

de

: ;;i;;;;;;duciría la senescencia de las células cancel'osas y, por ende, Fisura 15.28 Las células cultivadas
eñvejecen tras mÚltiples divisiones
' , '., iinpediría su proliferación' celulares.

;
Cutndo se comparan las secuencias cle aminirácidos de las subunida-
J.u prot.i"as dá las enzimas telomerasas con las de otras transclipta-
*r,* üu*r.r,s, las mayr:¡es similitucles colr'esp<.:nden a las transcriptasas
¡,,,i.l,,l,¡1,. ;;;;;;;iit"o¿rt por los retroelementos sin LTR, denominados
ir,,r.l',l, retroposolles (sección J 't' L ] ' Ésta es una observaciÓn fascinante
fetf0pOSOll9§ \§trl-('lulI 9.2.1).
CUanClO Se la COnSiClera jUntO COn ia eStIUCtUra infreCUente de
':.:.:a'.',:a:.:,::r.;,.',.
,,,:::',a,ti:'.,,.,'.:,:1,::;, lOS
telómelos l-lo están cOmpuestos pOl'
telómer:os de l)rosoplrik.
:,::r,:;;,,;,;;,,;;r;.',,,,:;
EStr¡s
"";,,:i.;),:': ,loa i*"u"naias repeiiclas cortas observadas
en ia mayor'ía de otros
r
,:r organismos, sino que c,:nsistei-I en disposiciones. e1 tándem de repe-
s
,¡¡¡11¡¡¡

'iil,::.,li:i r ticiones mucho más largas, de 6 o 10 kb de longitud. Estas repeticio-

\
I
. :,iirii,ii,:i'ili,ii,,' nes son aopias de lJngituct completa de dos retroposones- de It,,1
lt:¡¡. .,.,, Dr*sctphil«, relacionaclos c,on LINE,-1 de seres
hunranos, denomina- ,

mantienen estos telómer¡:s. ,i

,:;.,,';;,.,,.,,.,,,,..,d.as Il'eT-A'y TART. No se s¿rbe cÓmo se *
.:'.:',:,::::::::::.:: pero es concebible que el pl'oceso sea anáiogo al reaiizado
por la
::,,,.,),:,',.,,,,,'.,.,:
telotlerasa y qLle transcliptása inversa coclificada pot la's secuencias
ritr,,i,r.:rr,' i '1".1R?"
(He\iA no tiene un gen de tt'anscriptasa inver:sa) copie un RNA
,!:::,,:::::.:.:::..' molcle obtenido por transclipciÓn de los retroposones teloméricos.

Figura 15.29 Ciclo celular. La dura-

'r,.,,,,1'l:.,'1,..,,,,,:,1
gulnridad Cle la nntur a7eza, pelo Í]o Se puede descartar la posibilidad cién de cada fase varía en diferentes
la:',:l::,,,.'.,,..:'.:,
interesante que los telómeros de otros organismcs sean retl'oposones células. Abreviaturas: C1 y C2, fases
c1e
gap (de intervalo); M, mitr:sis;
,.:'t....t clegr.adaclos, .u*o sugieren las similitudes entre transcriptasas inversas
S, fase de síntesis.
1 ,,:,, de telomerasas y retroposones.
 Capítulo 15 Replicacién de los genomas

o ;§.§ ffi*6a,r§.xs§** dm *m sffiñ§*{e{ii*m s$* §q*s

{) fffts:*ffi1 *§ $){tr&reür: f*5
:Q
o
d
En las células eucariontes, la replicación del gen{f,ma está regulada e¡
C dos nivcles:
()
o
C u La replic:rción está coor:dinada con el ciclo celuiar, de manera qll. se
disponga de dos copias del genoma cuándo se divide 1a céluia.
* El proceso de replicación propiamente dicho puede ser detenirla er.r
ciertas circunstancias; por ejemplo, si el DNA está dañado y Cebt
Figura 15.3O Cráfico que muestra Ia
repararse antes de completar la copia.
concentración nuclear de Cdc6p en
diferentes estadios del ciclo celular. Finalizareinos este capítulo estudiando estos mecanismos reguladores,

§S"3-§ fi**rdixxci*r: *** §x yx*fiema{q:x

¿ **{ rrtrnl:rs:*
r
¡l,rii";¡i;nc**i;l*¡r
El concepto cle ciclo celular surgió de estudios de microscopia óptica
ef'ectuados pr:r los primeros biólogos celulares. sus observacic¡nes mos-
traron que las célula-s en división atraviesan ciclos repetidos de mitc¡sis
-el período en el que tiene lugar la división nuclear y celular (véase figu-
ra 3.15)- e interfase, Lln período menos espectacular cuando se puecien
detectar escasos cambios dinámicos con el microscopio óptico. se sabía
que los ctomosomas se dividen durante ia interfase, de maner.¿i que
cuando se identificó el DNA como nlaterial genético, ésta cobró una
nueva in-rportancia como ei período cuando debe tener lugar la replica-
ción del genoma. Esto llevó a reinterpretar e1 ciclo celular corno un pi.o-
ceso de cuatro estadios (figura 15.29), que comprende:
, Mitosis, o fase M, el período de división nuclear y celular..
' Gap i, o fase Gl, un intelvalo en el que tienen iugar la transcripción.
la traducción y otras actividades celulares generales.
* Síntesis, o fase S, en Ia que se replica el genorna.
', Cap 2, o fase G2, un segundo período de intervalo.

Es eüdente la importancia de que la fase s y la fase M estén coordinaclas, de

manela que el genoma se replique por completo, pero sólo una vez, antes de
que se produzca la nlitosis. Los períodos inmediatamente anteriores alingre-
so en la f'ase S y la fase M se consicleran puntos de control del ciclo celular
ciaves, y el ciclo celular se detiene en uno de estos clos purrtos si hay muta-
ción de genes ctrtciales involucrados en el control del cicio celular o si }a célu-
la sufi'e trauma, como daño extenso del DI¡JA. Por lo tanto, 1os intenlos por
conocer cómo se coordina la replicaciór-r de1 genoma con la mitosis .se lran
concentlado en estos dos puntos de control, sobre todo en el punto cle con-
tlol pr:e-S, el peúodo que precede de inrnediato a la r.eplicación.

::- t:¡ t 1' 1 i t:,t 1 !: ::.:: ! :: ; i t: ll i ); a {:: 1:j.i,r¡; f:*l :i : * *i?; s

Estudios de Sctcchttrofttyces cereyisine, sobre todo, han llevacio a un mode-
lo para controlar la cronología de Ia fase S, que postula que la replicación
c1el genoina requiere la construcción de cornplejos prerreplicación (pre.
RC) en los orígenes de replicación, los que son convertidos en pos-RC a
medida que la replicación avance. Un pos-RC no puede iniciar la rcplica-
ción -v, ¿isí, no puede volver a copiar de manela accidental un fragrncnto
dei genoma antes de que se haya producido la mitosis. El ORC, el conr-
plejo de seis proteínas ensamblado en los dominios A y Bl de un origen
 Regulación de la replicación de los genornas eucariontes 50?

,l5.31
Ciclinas mitóticas Figura Puntos de contrbldel
ciclo celular por las ciclinas que
participan en la regulación de la
replicación del genoma.

A I Ciclinas G2
Ciclinas de fase S (s)
\

de levadura (véase figura 15.108). fue uno de los primelos aspirantes a

, pre-RC, aunque es probable que no sea un componente central porque los
ORC están presentes en ios orígenes de replicación en tr:dos los estadios
del ciclo celular. Sin embargo, se considera que el ORC es la "platafonna
de aterrizaje" sobre la que se construye el pre-RC.

Se ha implicado a diversos tipos de proteínas como componentes de1 pre-

RC. l-a primera es Cdc6p, identificada al principio en las levaduras; des-
pués se mostró que tiene homólogos en los eucariontes superiores. La
Cdc6p de levadura es sintetizada al final de G2, cuando la célula entra en
mitosis y se asocia con cÍomatina al comienzo de G1 antes de desaparecer
al final de esta fase, cuando comienza la replicación (figur:a 15.30). La par-
ticipación de Cdc6p en ei pre-RC es sugedda por experimentos que repri-
men su gen y dan por resultado ia ausencia de pre-RC y por otros
erperimentos que inducen sobreproducción de Cdc6p y deter:rninan múl-
tiples repiicaciones del genoma shr mitosis. También hay evidencia bioquí-
mica de una interacción directa entre Cdc6p y ORC de levadura.

Se considera que un segundo componente clei pre-RC es uÍr gr:upo de prote-

ínas denominadas factores de licenciamiento de replicación Vep/icalton
limtstngfactors, RLf). Al igilral que Cdc6p, los primeros ejernplos cle estas
proteínas se identifical'on en levaduras (la familia de proteínas MCM), con
detección ulterior de homólogos en los eucariontes superioles. Los RLF se
unen a la cromatina hacia el final de la fase M y permanecen en el lugar hasta
elcomienzo de la fase S, despué.s de la cual son eliminados gradualmente del
DNA a nledida que éste se replica. Su eliminación puede ser el evento clave
que convierte un pre-RC en un pos-RC e impide, así, la leiniciación de la
replicación en un odgen qur: ya ha dirigido un ciclo de replicación.

f{l':,ri-Jl|iarii,r, ,-';;;¡;,,,":.:,:i'i}r:li,:i{ii'i:i ijr-:' ;j-l'i.l-.:ir-

La identificación de ios componentes de los pre-RC nos pennite ayanzar
algo en el coirocimiento de cómo se inicia 1¿r replicación del genon-ra.
pero deja abiert<¡ el interrogante sobre cómo ésta se coordina con otros
eventos del ciclo celular. El contlol del ciclo celular es un proceso cont-
plejo mediado en gran medida por ptoteincinasas, que fbsforilan y acti-
van enzimas y otras proteínas que cumplen funciones específicas durante
el ciclo celular'. Las mismas proteincinasas están pl'esentes en el núcieo
durante todo ese ciclo, de modo que ellas mismas deben estar sujetas a
control. Este cor1tlol es ejercido, en parte, po1' proteínas denontinadas
cielinas (que varían en abundancia, en diferentes estadios del ciclo celu-
lar); en pal'te, por otr-fls protcincinasas que activan las pr:oteincinasas
dependientes de ciclinas; y, en parte, por proteínas inhibitolias. Aun
 Capítulo l5 Replicación de los genomas

Figura 15.3? Análisis en microma-

trices de Ia descarga del origen en
S. cerev¡sroe.
! ¡ Extracción de DNA,
I -I centrifuoacion en
gradienie de densidad

Gradientes
14N*1sN_DNAr.) ,; _ de densidad
.i
r5N_r5N_DNA-r, §.i *¡l

Hibridación del DttlA replicado en micromalrices

{A) Replicacién del sromosoma Vl .)

Micromai¡ices l
;20 n
(
:9o :' I
"..
=,= JU
l
J i
_q= .¡ antes de comenzar a buscar reguladores del ensamblaje de pre-RC, L
oe 40
podemos anticipar que el sistema de contt'ol será intrincado. c
eá
Se ha vinculado a diversas ciclinas con la activación de la replicación ciel C

genoma y la prevención de que el pre-RC vuelva a ensamblarse una vez f

=^^
E compietada la replicación. Éstas son las ciclinas mitóticás, que al princi- t
0 40 80 120 160 200 240
CoorCenada del cromosoma (kb)
pio se consideró que tenían como función principal activar la mitosis, t:
pero que tanrbién l'eprimen la replicación del genoma. Cuando se b1o- I
quean los efectos de estas ciclinas mediante, por ejemplo. sobreproch:c- F
(E) Heplicación de los cromosomas Xll y XV ción de proteínas que inhiben su actividad, la célula no sólo es incapaz fr
de ingresar en la fase M, sino que presenta también replicación reitera- fl
da dei genoma. Asimismo, hay ciclinas de fase S más específicas, como
Clb5p y Clb6p en S. cerevísiue, cuya clesactivación demora o impicie la
replicación del genoma, y otÍas ciclinas que son activas durante la fase
G2 e impiclen el ensamblaje cle los pre-RC después de la replicación dcl
genoma y antes de la división celular (figura 15.31).

Además de estos sistemas de control dependientes de ciclinas, la replica-

ción del genoma es regulada por una proteincinasa indepencliente de cicli-
nas, CdcTp-Dbfap, hallada en olganismos t¿ln divelsos cot¡o levadui'as y
10 15 20 25 30 35 40 n"lamíferos. No se han identificado las proteínas activadas por esta cinasa,
Tiempo de replicac¡ón pero distintas líneas de evidencia sugieren que sus clianas son tanto RLF
(mínutos después del com¡anzo de la fase S)
como ORC. Cualquiera que sea el mecanismo, la actividad de CdcTp-
Dbf4p es un p1'er:1'equisito pala la replicación y los procesos depeircliet-rtes
;.. ' '-:.':'' :
.,r
"
ss ""u
de ciclinas son insuficientes, por sí mismos, para llevar a la célula ¿r la fase S.

#,4 Cromosoma XV pr
ffi Cromosoma Xll t*.."3"2 {r:rr:tr*i §&u,* *
¡^trx axrr* **y &.x
'cle
Se pr-rcc1e considerar que la regulación de la transición Gl-S es e) prin- cii
cipal pr:oceso de control qr"re incide en la replicación del genol11a, ptro .pi3
no el único. Los eventos éspecíiicos que se produccn clurante i¿i l¿rse 5 '<lu
Figura 15.33 Dinámica de la descar- también están sujetos a regulación. po
ga del origen en S. cerevisroe. (A) har
Crcnología de la descarga del origen a
.. '. j ' .;
.{ ,':"
. : ,'-',ij il.j .: ..
lo l¿i-gc del cromosoma Vl. La flecha
lrd;ca el punto donde comienza la La repiicación no se inicia al mismo tiempo en toclos los orígenes de
r,.p1icarón de este cromosoma y el leplicación ni la "clescarga del origen" es un proccso por cottrplttt' alc-
ci:culo en el eje x es el centrómero. La
atorio. Algunas partes clel gc.noma se replican a pr:incipios dc lir fase )
zcne en blanco es una región del cro-
)' otfos, n,át tntd", con uniiormiclacl clel patrón de replicación rntr*
los
mosoma que no se pudo examinar.
(B) Comparación entre la drnámica de distintos ciclos de división celular. El patrón general es que 1ts genes
replicación de ios cromosomas Xll y )li transcritos de manera activa y los centrómeros se t'eplican a1 conrien-
 Regulación de la replicación de los genomas eucariontes

,,r.;,t§,zo de la l'ase S, y los telómeros y ias regiones no transcritas del geno-

, ,,....,L..lll... rRa 1o hacen más tarde. Por lo tanto, los orígenes de descarga precoz
¡,¡.tr,l'i ;specíficos
',',,,,,:,',,,,,.',,,,,,,,,,1,,.;).,.:,1..'
de tejido y reflejan el patrÓn de expresión del genoma
...llllilllllll¡,t,., qr:* tiene
lugar en una célula particular'
,:,,,...:....,:-.:,.,:a!.

,,,;,;,,:,;,1;;'|,:,1;L§
Al principio, estas características de replicación del genoma se extrapola-
a partir de exámenes de sólo algunos pooos orígenes, pero hace poco
'. ',,.,,,,.,..,: ron
,.,..,r,,11:¡,..1,

se lcs ha complementado con estudios que aplicaron la tecnología de

.,¡:l.,.',,',,,1l],,,, micr"omatrices.
El análisis de micromatrices se basa en la investigación de
la
:1i;:;§;,,:,;,,,:r,,::,,:',,hibridación, así que para utilizar una micromatriz con el fin de seguir el
patrón de leplicación del genoma es preciso diseñar una manera de sepa-
rar DNA no replicado de DNA replicado, para que una fracción o 1a otra
pueda serwir de sonda de hibridación. Por ejemplo, si se obtiene una mues-
',,,1,.:,t:,:,,,1;.i:i:i:,,:.,,,,,,,

tra de DNA replicado de céluias que recién han ingresado en la fase S, se

't,:.t,,:,:rl¡;,,,,,.,.:,,:,,':",,.'

.,,i........, podría empiear este DNA para sondar la micromatriz e identificar los genes
', , que ya se han replicado en este estadio precoz. Una segunda sonda, prepa-
:,t,.....,...,.,

.',:,:ii,li.iiri.ii,.' rada de DNA replicado en una etapa algo más tardia de la fase S, identifi-

',,,,......i.....i' caría el siguiente grupo de genes en ser replicados, etc. En Sacchararuyces

,,:.rr,ri.i.....,i cerevisiae, estas fracciones se obtienen haciendo crecer células en un medio

con nitrógeno pesado, transfiriéndolas a un medio normal y pemitiendo
¡¡,¡il.¡i...1.,¡..¡,¡..,,.¡.,

"'', l,',,...'.. que las células ingresen en la fase S. Después, se extrae el DNA en los
, '' ,:',:'',,',:.: mornentos apropiados de la fase S, se io trata con una endonucleasa de res-
'' " : tricción y se lo fracciona por centrifugación en g::adiente de densidad (figu-
ra 15.32). Se visualizan dos bandas: una formada por fragmentos del

,r: por laN-t5§-DNA y, por ende, derivada de regiones que han presentado
.
.:,r.'..:1t,,,, replicación. Se
purifica la última fracción, se la marca con una sustancia
fluorescente y se la aplica a 1a micromatriz.
',,,,,1:.t;:,,1;t',,11;:"

El análisis es simple, pero muy informativo. En la figura 15.33A se grafica Ia

dinámica de la descarga del origen a lo largo dei cromosoma Vi de levadura
y se identifica una región de la parte media del brazo más corto como el área
donde comienza la replicación de este cromosoma. Como indicaron experi-
mentos anteriores, el centrómero (señalado por el círculo en el eje x de la
figura 15.33A) se replica a principios de ia fase S y los telémeros, al fina1 del
ciclo de replicación. Obsérvese que ambos telómeros se replican en forma
más o menos simultánea. Este dato es válido para todos 1os cromosomas de
levadura, pero no todos ellos completan su ciclo de replicación al mismo
tiempo. Algunos, como los cromosomas XI y XV se replican por completo
al comienzo de ia fase S, mientras que otros, como VIII y IX, no 1o hacen
hasta mucho más tarde. Estas diferencias temporales no están relacionadas
con la longitud del cromosoma, sino que hdican variaciones reales de la ciné-
tica de replicación cromosómica. La figura 15.358 hace hincapié en este
punto almostrar que, 15 minutos después del comienzo cle la fasá S, muchos
de ios orígenes dei cromosoma XV se han activado, mientras que la replica-
ción del crornosoma XII recién se inicia. Ei análisis en micromatrices también
petmite inferir la velocidad de migración de horquillas de replicación indivi-
duales, 1o que otÍayezmuesh:a variabilidad. La velocidad media es de 2,9 kb
pot minuto, pero a§unas hr:rquillas se mueven con mucha mayor rapidez:
hasta l1 kb por minuto en las más activas.
.. i. Está resultando muy difícil saber qué determina el tiempo de descarga
1.,-;'" de un origen No es só1o la secuencia ciel origen, porque
cie replicación.
"',', , la transferencia de un segmento de DNA de su posición normal a otro
.'¡ .r.. sitio del mismo cromosó*, o cie uno diferente puecle determinar un
',:rrr.,:'r,rrrll'rr,: c311tbio del patrón de descarga de or'ígenes contenidos en ese segmento.

-.i,i.:' cromatina y, pol 1o tanto, ser influido por estflicturas como regiones de

.,,;,,,.,,
5t0 Capítulo 15 Replicación de los genornas

control de locus (sección 10.1 ,2), que controlan el empaquetamienta del

DNA. También puede sef importante la posición del origen en el núclec,
pues los orígenes que se tornan activos en períodos similares de la fase
S palecen agrupalse juntos, por lo menos en los mamíl'eros.
SENSORES
' i.
9I
El último aspecto de la regulación de la replicación del genorna quü corl-
sideraremos es la función de los puntos de control que existen dentro de
TRANSDUCTORES la fase S. Éstos fueron identificados por primera vez cuando se nrcstró
I que una de las repuestas de las células de levadura al daño del DNA es
una lentificación y, quizás, una detención completa dei proceso de repli-
EFECTOBES
.;,1:,,,;tt):l: cación de1 genonia. Esto está vincuiado con la activación de genes cuyos
t productos participan en la reparación del DNA (secciÓn 1.6.2).
Flespuesta celular
A1 igual que durante el ingleso en la f'ase S, las cinasas dependientes de cicli-
nas participan en la reguiación de los puntos de control de la fase S. Estas
cinasas responden a señales de las proteínas asociadas con la horquilla de
Figura I5.34 Cascada de eventos repiicación. Al principio, se asignaron funciones de detección de daños a las
que desencadenan la respuesta proteínas de la horquilla de replicación, incluidos el PCNA y la pr:oteína
celular adecuada al daño del DNA.
accesoria RFC, pero es probable que las versiones de estas proteínas involu-
cradas en la síntesis de DNA no cumplan este papel. La versión sensor¿i dr
daño de Ia RFC tiene una composición de subunidades diferente de la RFC
convencionai, y la proteína sensora identificada ai principio como pariente
del PCNA parece ser una proteína diferente por completo (el compleio 9-1-
1), que tiene una estructura similar al PCNA y quizás interactúe con la doble
hélice de manera similar. Cinasas como ATM, ATR, Chkl y Chk2 l:ansdu-
cen las señales de las proteínas sensoras de daño a proteínas efectoras ccmo
Cdc25, que interactúan con las cinasas dependientes de ciclinas para provo-
car la respuesta celular conveniente (figura 15.34). El proceso de replica-
ción se puede detener reprimiendo la clescarga de los orígenes de replicación
que suelen ser activados en estadios tardíos de la fase S o lentificando 1a pro-
glesión de las trorquillas de replicación existentes. Si e1 daño no es excesivo,
se activan los procesos de reparación del DNA (secciÓn 16.2): en foma
altemativa, la célula puede ser derivada a ia vía de muerte celular pro$'ama-
da, denominada apoptosis, pues la muerte de una célula somática aislada
como consecuencia de daño del DNA sueie ser merios peligrosa que penni-
tir que la célula replique su DNA mutado y, quizá, dé origen a un tull1or u
otro crecimiento canceroso. En los mamíferos, ia proteína p53 es un f'actr:r
central en la inducción de la detención del ciclo celular y de la apop¡osis' Se
1a clasifica como proteína supresola de tumores porque, cuando e.q defec-
tuosa, las células Co, g"no*us dañados pueden evitar los puntos de control
de Ia fase S y, tal vez, prolifet'ar como un cáncer. La p53 es una proteína de
unión al DNA específica de ,qecuencia, que activa diversos genes consiclera'
dos directamente responsables de la detención y de la apoptosis, y qlle tam-
bién reprime 1a explesión de ottos genes que deben desactivalse para
favorecer estos procesos.

it*:;*;::*r:
Para cr:ntinuar llevando a cabo su función, el genoma se debe replicar cada
vez que se diüde ia célula. Watson y Cdck señalaron, al anunciar su descu-
brimiento de la estructura del DNA, que el apareatniento de bases específict:
que mantiene juntas las clos cadenas áe la doble hélice representa un r:redio
para la copia exacta de cada polir:rucleótido. Hallaron un modo semiconser"
vador de replicación, en el que cada cadena madre actúa como molde para
la síntesis de una cadena hija complementaria. El experimento de lVleselson-
Stahl mostró que esta intetpretación es conecta, pero aún había problemas
 Resumen 5t¡

oala comprender cómo se separaban las dos cadenas de 1a hélice, sobre todo
,n ntrlcculas circulares, que tienen escasa libertad para rotar. Este problema
.r..r,,r
. ¡* rr:rülrrió a1 descubrir las DNA topoisomerasas. que separan las cadenas de
la cichle hélice por rotura y reunión reiteradas de uno o ambos polinucleóti-
l',,,,,,,,,

,,-, dos. i{o se conocen excepciones al modo semiconselador de replicación,

... i'. L^-, -,^-.-:^.^,-,, ^^.^^^:^1:-^-t
- -,., hay l^ *^-1:,-^^:á.^
,, ,,,,,,i aunelre versiones especializadas, como la replicación por -¡.-^*t^-^*:^-
-,--- desplazamien-
'.;,:,:..,,,,,,.,
tr: y la replicación por círculos rodantes. La iniciación de la replicación del

..,,' tlurts, pero que se conocen con menos claridad en los eucariontes superio-
.. ,,,,,, res. Una vez iniciada la replicación, un par de horquillas de replicación se
,.'i',ii rnueven en direcciones opuestas a 1o largo del DNA. La DNA polimerasa
,'.,,'',,,,,,,,,. sólo puede sintetizar DNA en dirección 5'--+3',lo que implica que, aunque
1';',,' una cadena, denominada cadena líder; puede replicarse de manera continua,
,.
",,,,., la segunda, cadena retrasada, debe ser copiada en segmentos coltos, llama-
':,1" dos fragmentos de Okazaki. La síntesis de DNA debe ser cebada por una
,, ,, ,,.'':,, RIrA polimerasa, la hélice debe desenrollarse y las cadenas deben ser estabi-
: 'r'r'
lizadas por helicasas y proteínas de unión al DNA monocatenario. El com-
,l .. plejo de replicación, denominado replisona en las bacterias, está formado por
i,, la enzima DNA polimerasa junto con proteínas auxiliares, como la pinza des-
'
:,::,,,:,,,:,
lizante, que garantizan que la conexión entre la polimerasa y ei DNA sea
','.:':' segura, pero que la polimerasa se pueda mover a lo largo del DNA. La ter-
minación de la replicación tiene lugar en rcgiones específicas de un cromo-
'' soma bacteriano, pero en áreas no tan bien definidas en ios cromosomas
: eucariontes. Estos requieren procesos especiales para mantener sus exh'e-
:,': Éstos son elongados por la enzima teiomerasa, que tiene una subunidad
. RI'{A, que actúa como molde para la síntesis de nuevas unidades repetidas
,,' . teloméricas. La replicación del genoma debe estar coordinada con e1 ciclo
.' celular. Esto se iogra mediante una combinación de proteínas reguladoras,
muchas de las cuales son activas sólo en detemrinados peúodos de ese ciclo.
E1 ensnimblaje del complejo de prerreplicación en los orígenes de replicación
es un paso cmcial, que está regulado para garantizar que el genoma se repli-
que sólo una vez por ciclo celular. Unavez que la replicación está en prcgre-
so, los puntos de contrcl durante la fase de síntesis responden al daño del
DNA, para detener o terminar la replicación del genoma.
 ¡f
#B .] il * e ¡-l! *rk! dL B á& it§,.@g .:S&§ 48w 5§ §
§HSX; i§ F dFqffi q# ffiS Ai{€E\-e E§
d k H R § * * # s &tq k r § a r sd
§
,r s
-'¡ Y T ru@?-
t s$, r r
BS*'\;,,,,q&, Pd .-.sr": -a.4 Á n*
§ #*;* §-i' &
**rE ;*#*d -,f,: Á
#, §#**W $ + d§\{§**
f,g d i
ffi q* #,*l
H
ffe*ü
§ "**r e,*& fu-#§§§ & "q,& %", . .a*' ;-J# ;;
§
f.lii
l.i'.i

+
, ,r ! {1 r- -l

l
i
I
!

Definir el término "mutación", así como los diversos términos empleados para identificar diferentes
tipos de mutaciones.

Describir, con ejemplos especificos, la forma en que erores espontáneos en la replicación provocan mutaciones.

Dar ejemplos de mutágenos quimicos y físicos, y reseñar las alteraciones que pueden causar a las
moléculas de DNA.

Detallar, con ejemplos específicos, los efectos de las mutaciones sobre las regiones codificante y no codifi-
cante de los genomas.

Describir los posibles efectos de las mutaciones en los organismos multicelulares.

Enumerar y describir los diversos efectos de las mutaciones en los microorganismos.

Analizar la significación biológica de la hipermutación y las mutaciones programadas.

Distinguir entre los diversos tipos de mecanismo de reparación del DNA.

Detallar los eventos moleculares que o€urren durante la reparación directa, la reparación por escisión de
bases y nucleótidos, y la reparación de enores de apareamiento.

Describir cómo se reparan las roturas del DNA monocatenario y bicatenario.

Reseñar cómo se puede sortear el DNA dañado durante la replicación det genoma

Resumir la relación entre reparación del DNA y la enfermedad human¿.

Los genomas son entidades dinámicas que se modifican en el tiempo por

1os efectos acumuiados de alteraciones en pequeña escala de la secuen-
cia causadas por mutacién (sección 16.1). Una mutación es un cambio
en la secuencia nucleotídica de una región corta de un genoma (figura
16.14). Muchas mutaciones son mutaciones puntiformes (denominadas
tambián mutaciones simples o mutaciones de un solo sitio), que reem-
plazan un nucleótido por otro. Las mutaciones puntiformes se dividen
en dos catogorías; transicione§, que son cambios purina-purina o pirimi-
dina-pirimidina {A-+G, G-+A, C-+T o T+C) y transversiofles, que son
 Capítulo l6 fu1ut¡ctones y re¡:ar,rr1ón del DfiA

{A) Mutación Cambi0Spurina-pi1"in1idinaopirimidina-putina(A--+C,A_*T.C-C'

G+T, C-+A. C-+G, T+A r: T +G). Otlas mutaciones surgen por inser- ',,.

-.,.n:]". .."+.*,-r,,.,..;tr;::;;€;;-,.y,,1,-.,.--..-...-- ...

¡ -..--i&
Molécula ción o deleción de uno o algunos pocos nucleótidos
de DNA

- Las mutaciones se deben a ell'ores en la replicación del DNA o a los el*c-

tos lesivos de mutágenos, como agentes químicos y radiación. que leaccio-
nan con el DNA y' moclilican la estrtrctura de nucleótidos individualcs.
Todas las célu1as tienen enzimas de reparación de DNA, que intentan lcdu-
cir el núr¡ero de mutaciones que se producen (sección 16.2). Estas en::i-
lfALALT IAUL]I{ nras tlabajan de dos manelas. Algunas son prell'eplicativas y buscan
a+¿i{Áiéói nucleótidos con estncturas inlrecuentes en e1 DNA, para reemplazarlos
antes cle que tenga lugar la replicaciÓn; otl'as son pr:sreplicatiyas e investi-
Molécula de gan elroles en e1 l)NA recién sintetizado para corregir cualquiel erl'or qu§
'' DNA mutada encuentren (figura 1 6.18). Por lo t¿rnto, una posible definición de nrutación
es L¿ntt deJicierrcio en lct reporación del DN4.

(B) Reparación del DNA

Las mut¿rciones pueden ejercer efectos sr¡stanciales sobÍe la célula
afectada; una mulación de un gen clave posiblemente dé origen a una
II Se corrige e, error
proteína defectuosa, que podría provocar 1a muerte de la céluIa. Otras
a,;':"x*i:;:x:1**l
.--(fAL,ALr lAL(]A... "1
tienen una reperci:sión menos significativa sobre el fenotipo de la célu-
i-';..;..::.::. la y muchas no ejercen ninguna. Como se verá en e1 capítulo 18, tr:clos
;§l§r§*rQ§_L,,1 los eventos que no son letales tienen la posibilidad de contribuir a la
Molécula evolución del geni:ma, pero para que esto suceda deben heredarse
de DNA cuanclo el organismo se reproduce. En un organismo unicelular como
no mutada
una bacteria o una levadura, todas las alter"aciones del genoma que no
son Ietaies o corlegidas son heledadas por las células hijas y se con-
vielten en car¿rcte1'ístic¿rs peu'n&ncntcs del linaje que desciende i'1e 1a
Figura 16.1 Mutación y reparación célula original en la que tuvo lugar la alteración. En un organismo
del DNA. (A) Una mutación es un multicelular, sólo los eventos clue afectan a las células gelminales son
cambio en pequeña escala de la impoltantes para 1a evolución de1 genoma. Los cambios de los geno-
secuencia de nucleótidos Ce una molé-
m¿rs de las células sornáticas no son importantes en el aspecto eloluti-
cul¿ de DNA. Se muestra una mutación
punt forme, ;ero hay varios otros [ipos rro, pero presentalán importancia biológica si provocan un fenotipo
de mutación, como se comenta en el nocir.r.¡ que afecta la salud del organismo.
texto. (B) La reparación del DNA corrige
las mutaciones que surgen por errores
de la replicación y como resultado de Ia
actiudad mutágena. * q"!., d§§q..á&s.¡§&,4q/; 9-; J (r
Debemos consiclerar ios siguientes aspectos respecto cle las lntrtlcio-
nes: cómo surgen, 1os efectos que ejercen sobre ei genoma y sobre el
organisrno en el que resicle el genoma; y si es posible que un¿r célula
aulnente su tasa de mutaciones e induzca mutaciones progr:anradas el
ciertas circunstancias.

I "].á-; Lqi..ti-*i-¡ I,i.j,.i5 ¿]l{r'.cJLc:.. .::

l.as nrutaciones se producen de dos rrlaneras:

,¿ Algunas son ei'r'ofes espontáneos en la leplicitcii-itr quc evarlen la
función de cou'ección de las DIrIA polimerasas, que sintetizan
nucleótidos nuevos en la horquilla de replicación (secciórr I i 2'l)
llstas mutaciones se clenominan errores de apareamiento, porquc
son posiciones donde el nuc,leótido insertado en el polinucicóriclo
lrijo no cc¡incide, por apareamiento de bases, con el nucleótido cir
la posición con'espondiente del DNA molde (figura 16.2A), Si n*
se Lolrige el et'ror cle apareanriento en la cloble hólice hija. rirr,r dc
las nloléculas de ia segunda generación filial producidas cltrt'irnlc Ia
sigllientrrTonda de leplicación clel DNA llevar'á una versión bic¿rt"-
naria, permanente, de la mut¿tción.
 Mutaciones 52t

Ot::as sulgen porque un mutágenr: ira reaccionado cun el Dl'lA pat'eiltal

v ha prr:vr:cado ur-l cambio estructural que incide en la capacidad de apa-
re*¡riento de bases del nr¡cleótidi: alterado. Por 1o genelal, esta altet'ación
¡ri'ccta sók: una caciena cle la doble hélice nladre, c1e manera que só1o una
r1e las moléculas hijas cr:r-rtiene la mut¿rción. pero ésta estará prssentc en
clos cie las moléculas de la segunda generación fiiial produciclas durante
la siguiente ronda de replicación (figura 16.28).

{A) Error de replicación

Figura 16.2 Ejemplos de mutacio-
*e"*TT,&&AA&.
nes. (A) Un error de replicación jndu-
*isÁá:¡üiii. ce un erTor de apareamiento en un¿
ce l¿s dobles hélrces hijas, en este
üAf,TTÁü&S,,q caso un cambio T-+C, porque una de
ü"i$ÁÁjüt*t las A del DNA molde fue mal coprada.
Cuando la propia rnolécula con erro-
§AtlTA*rX.&.&.. res de apareamiento se replica, da ori-
ü"i.§ÁÁiói"ii . gen a una doble hélice con la
secuencia correcta y a una con una
r-' ¡! -? ? secuencia mutad¿. (B) Un mutágeno
ha alterado la estruclura de una A en
r-t*¡,q!L,¡ i ¡ ln{cl*cula rnulaeja
la cadena inferior de l¿ molécula
§i.ür ** ufluu l AUAÁñ.. madre, lo que da el nucleótido X, que
MOLÉCULA
MADRE
re§:ll(§t:i11r *iffiÁistt?.. no forma pares de bases con la T de
i
la otra cadena, de manera que, en
I
.*.¿.i:t "i¿*A,4,{ efecto, se ha creado un error de apa-
rearniento. Cuando la molécula madre
;i"*¡¿lrii'i se replica, X se aparea con C, lo que
MOLÉCULAS -." : 1'. ':'.'. '. '' origina un¿ molécula hija mutada.
"
.,1 t,4
¡ t a¡. 1: -a
Cuando se replica esta molécula hija,
HIJAS
ambas moléculas de la segunda
MOLECULAS DE generación fllial heredan la mutacién.
SEGUNDA
GENERACION FILIAL

) Poslble efecto de un mutágeno

üAü"TYA*AAÁ"
./ r**¿¿Í'**ii.
.üÁcrT&ü&4.&
.titÁÁt****
"d Y ...*,4*?TAü,q.4e,.
. ciüÁÁ-irii.?..
:ata.f!t?^.
i-¡ erii I I lt¡¿ II&
1,f,
l**l*cula r11utád*
i
,
...&e*T*e*k$.t\.,
l..lx*i*riiiril "..üt*Áátáii:¡..
ali*rirCú l,{ll*r:uJi: ¡¡r,iladn
MOLÉCULA
\ r-r r,,...., . !r a1j{-¡:t.i _ .

MADRE *!r;|;ii7 r i Mclécula mutada

MOLÉCULAS ...§ACfCAüAÁ,,4..
HIJAS
"
.."*'i*Áit¿ti'i..
MOLÉCULAS DE
§EGUNDA
GENEHACIÓN FILIAL
 Capítulo.16 Mutaciones y reparación del DNA

Nota ssbre técnicas IO.t Deteccién de mutaciones

Pracedimientas rúpidos paro detectar mutaciones en mo!éculas de DNA
Muchas enfermedades genéticas son causadas por muta- reado por sus bases, en un gel de poliacrilamida o una
ciones punti{ormes que modifican o desactiv¿n un produc- columna de HPLC. Este método determina sihay un encr
to génico, Los métodos para detectar estas mutaciones son de apareamiento, pero no aporta inform¿ción sobre la
importantes en dos contextos. Primero, cuando se identifica ubicación de la mutacrón en el DNA estudiado.
por primera vez el gen causal de una enfermedad genética,
suele ser necesario examinar muchas versiones de ese gen
en diferentes individuos para detectar la mutación o las
r La escisión del heterodúplex en la posición del enor de
apareamiento, seguida de electroforesis en gel localiza-
mutaciones responsables del estado patológico. Segundo,
rá la posición del error. Si el heterodúplex permanece
cuando se ha caracierizado una mutación caus¿nte de
intaclo, no hay error de apareamiento; si éste se escin-
enfermedad, se requieren métodos de detección de alto
de, entonces contiene un error de apareamiento y los
rendimiento para que los médicos puedan examinar
tamaños de los productos de escisión indican la posi
muchas muestras de DN{ con el fin de identificar a los indi-
ción de la mutación en el DNA estudiado. La escisión se
viduos que presentan la mutación y están expuestos a sufrir
lleva a cabo por tratamiento con enzimas o agentes qui-
la enfermedad o transmitirla a sus hijos.
micos que efectúan cortes en regiones monocatenarias
de DNA principalmente bicatenado o con una ribonucle-
Cualquier mutación se puede identificar por secuenciación
asa específica de moléculas monocatenarias, como S l
del DNA, aunque ésta es bastante lenta y seria inapropiada
(véase figura 5.14), si el híbrido se ha formado entre el
para investigar una gran cantidad de muestras. También se
DNA controly una versión RNA del DNA estudiado.
podría emplear tecnología de chips de DNA (Nota sobre
técnicas 3.1), pero ésta todavía no es una opción muy
La mayoría de los métodos de investigación para detect¿r
difundida. Por tales razones, se ha diseñ¿do una serie de
mutaciones específicas aprovechan la capacidad de hibrida-
métodos de "b'aja tecnología" que pueden dividirse en dos
ción de oligonucleótidos p¿ra distinguir entre DNA dianas,
categorías: técnicas de estudio de mutaciones, que no
cuyas secuencias difieren sólo en una posición nucleotídica
requieren información previa acerca de la posición de una
(véase figura 3.8A): En la hibñdacién de oligonucleótidos
mutación, y técnicas de investigación de mutaciones, que
especfficos de alelo (ASO), se investigan muestras de DNA
determinan si hay una mutación específica.
con una sonda oligonucleotídica que se hibrida sólo ¿ la
secuencia mutante (figura T16.2). Este es un procedimien-
La mayoría de las técnicas de estudio de mutaciones impli-
to eficiente, pero innecesariamente largo. Por lo general, las
can análisis del heterodúplex formado entre una sola cade-
muestras de DNA se obtienen por PCR de aislamientos clí-
na del DNA examinado y la cadena complementaria de un
nicos, de modo que una alternativa más rápida consiste en
DNA control, cuya secuencia no está mutada (figura T16.i).
utilizar el oligonucleótido diagnósüco como uno de los ceba-
Si el DNA estudiado contiene una mutación, habrá una sola
dores de la PCR para que la presencia o la ausencia de la
posición con error de apareamiento en el heterodúplex,
mutación en el DIrIA estudiado esté indicada por la síntesis
donde no se ha formado el par de bases. Se puede recurrir
o no de un producto de la PCR.
a diversas técnicas para determinar si existe o no este error
de apareamiento;

¡ Electoforeis o cromatografra llquida de atto rendimiento

(HPLC): permite detectar el error de apareamiento iden- Figura Tl6.2 Hibridación de oligonucleótidos especí-
tificando la diferencia de movilidad del híbrido con error fica de alelos (ASO).
de apareamiento respecto de la de aquel totalmente apa-

Transferencia por puntos-

Muestras puntiformes
de DNA sobre una
Figura T16.1 La hibridación entre cadenas comple- membrana de nailon
mentarias de DNA, una de las cuales contiene una
mutación, dará origen a una molécula bicaienaria Mémbrana
de na¡lon
con un error de apareamíento.
I H¡bridación
J nso
Posición del errorde fi:.:i: ::1::i-ir,i:,:!-l
Autorradiograf ía

DNA que contiene

tffi
DNA control la secuencia mutante

I "¡$5wffii
:J!¡:ri¡i5lsM¡*ll@
;ffi

l:j¡ll&ffi
. .ffi§w
.ffi ffi
 Mutaciones

¿*r: *í¡ü¡*5 ** r*pi;rx¡*,t ss,',' r:x* l¿,*r:i,* C* ,r:;l*¿:i;i?*§ §u,-]'1,'':1,";r-"'

E1 ripareamiento cle bases complementarias, cuando se 1o considera sólo
*nri reacción química, no es muy exacto. Todavía nadie ha diseñado una
lranera cle llevar a cabo la síntesis de DNA dependiente del molde sin 1a
a1,u.la de enzimas, pero si el prr:ceso se pudiese llevar a cabo sólo como
Llna reaccliln qulmlca en un tubc-, de ensayo, es probable que el polinu-
cleótido resultante tuviera mutaciones puntiformes en 5-10 posiciones
cle cacla cien. Esto representa una tasa de error del 5oh-l)oh' que sería
pLrf completo inaceplable durante la replicación del genoma. Por 1o
in,.,ro, tas nXe polimelasas dependientes del molde que llevan a cabo la
replicación del bXe aumentan la exactitud del proceso en varios órde-
neu de magpitud. Esta mejoría ocllrre de dos maneras:
* Una DNA polimerasa opera un proceso de selección de nucleótidos
que aumenta en fonr"ia sustancial |a exactitud de la síntesis de DNA
dependiente del molde (figura 16.3A). Es probable que este ploceso
iie selección actí1e en tres estadios diferentes durante la reacción de {A) Selección de nucleótidos
polimerización, y la discriminación de un ¡uc1eótido incorrecto se ü
AA CC TJ
produce cuando el nucleÓtido se une por primerayez a la DNA poli- rl I #' G^
n-,*.urr, cuando se desplaza al sitio activo de la enzima y cuando se -T' '
une al extremo 3' ciel polinucleótido que se está sintetizando. 'l "3&G"
5' ". *r-*'t*l1'o*rry"ry"i{-&f.ir*n"0"
:, I ¡llillilllllliilli'*.-::¡,,r¡rl E'
* La exactituri de la síntesis de DNA aunlenta aún más si la DNA polin're- J ": r'
...,........-.". .......::.t:a:..,:.::a,.7
ai.r::i:::.:... ;.r' .r,,llll,:ljll§**¡jl
j rasa plesenta actividad de 3'-+5' exonucleasa y, así, puede eliminar un *
I'- " '

nucleótido incorrecto que evade el proceso de selección de nucleótidos y

L

DNA Polimerasa
se une al extremo 3' del polinucleótido nuevo (véase figura 2.78). Esto -.
se denomina corrección (sección 15.2.2), pefo esta denominación indu-
Ce a error, porqlle el proceso no eS un simple mecanismo de verilicación.
{B) "Corrección"
Por el conirario, cada paso de la síntesis de un polinucleótido debe con- -"- "'*-
:
siderarse una competencia entre las tunciones de polimerasa y exonucle-
.
, ^ -,,1
-.^'!e -.^.óé
asa de Ia enzima, que suele ser ganada por ia polimerasa, ya que es más
r !tr¡."wrá&&¡,
:,'íiiii¡J,if¡.Ll.ti(¡it .,1_q.¡rr""rrr q,
J.-€
activa que la excinucleasa, por k: menos cuando e1 nucieótido 3' termi- 'r ryl .,¡
nal está apareado por sus bases al molde. En cambio, la actividad de poli-
merasá es nlenos eficaz si el nucleótido tetminal no ha ibm-rado pares de El último nucleótido eslá
bases, y la consiguiente pausa en 1a polirnerización perraite que pledo- apareado por sus bases
*,C§A L¿ t{:;}-l it'1i; ÉÁ§.á
mine lá activiclad de exonucleasa, de manera que se elimina el nucleóti-
do incon:ecto (véase figura i6.38).
u
at
EstherichitL coli puede sintetizar DNA con un¿l t¿lsa de en:ol de sÓlo 1 ":^I!*Ll"rJ-! L tr,
por 107 acliciones de nucleótidos. Cabe destacar que estos eÍroles no tie-
n*n una distribución uniforme entre las dos moléculas hiias y el produc-
to de la replicación de la caclena retrasada es proclive a presentar una El último nucleótido no está
I tasa de er.ótes 20 veces mayol'qr-re la replicación de la cadena iíder. Esta apareado por sus bases
asimetría poclría indicar que la Dl'{A polimerasa l, que participa sÓlo en ii,:i i::A 1-.§ f ,{ Ü¡,1 l-iÜii¿ai,{
la repiiczrción cle la cadena retrasada (seuuión 11.2.2). presenta un¿l
seleciión de bases .v una capacidad de cot'rección menos eficaces que [;r
:

Dh'lA polimerasa lll, la principal enzima de replicación. Figura 16.3 Mecanismos para Saran-
tizar la exactitud de la replicación
Nlo todos los errores que ocurren clurante la síntesis de DNA son responsa- del DNA. (A) La DNA polimerasa
ir
biliclad de las enzin-ras poLimelasas: en ocasiones, se procluce L1n en:ol aunque selecciona adivamente el nucleótido
la enzima añad¿r el nucleótido "col'recto". el que se apalea por sus bases con correcto para insertar en cada posiciÓn.
el molde. Esto se clebe a que cada ba-*e clel nucleótidt> se puede presentar (B) Esos errores pueden resolverse por
'torrección" sr Ia polimerasa tiene acti-
, COmo uno de doS tautómeros, iSÓmeros estructurales que Se encuentran en
vidad de 3'-.+5' exonucleasa. Si el úiti-
equilibrio ciinámico. Por ejemplo, hay dos tautónleros de timina, las fbrmas mo nucleótido que fue inseftado ha
l
I cita y enal,y cada molécula puede cambiar cle un tautÓmero al otro. El equi- formado pares de bases con el molde,
libl'io muestra un alto sesgo hacia 1a lotma celo. pcro de vez en cuando apa- predomina l¿ ¿ctividad de polimerasa,
rece la versión enol de tilnina en el DIrJA molde, en el preciso nlomento en pero si el último nucleótido no está
que está pasando la horquilla de leplicaciÓn. Esto indr"rci¡á un "e11'or", pol'- ápareado por sus bases, se favorece la
:
.:
que la errsl-timina forrna pares de bases con G.v no con A (figr"rr¿ 16.'l). Se actrvidad de exonucleasa.
 C¿ortulo l6'.1.-t .r.j,:Tc\. re:-¿n.:cr: o-l t\A

Cambio
tautomérica r,- pllede pfoducir el mismo problema con la adenina, pues el ra1'o tautóñte,:o
m....+ iruino de esta base se ¿lpal'ea pleferer-rcialmente con C, J'- con la guanina, cu!'c
..: .. tautómero ei?ol-guanina sc apal'ea cL)n tirnina. Después de la replicación, el
-1- .r:lr'
,l tautómero raro siempre revertirá a su forrna más comiln, 1o que provocn un
'r'' 1 ... f:
enor de apareamiento cn la doble helice irija.
cefo-t¡mina enoltimina Como se alinnó antes, la tasa de eror de la síntesis de DNA en E. co/l es
t
I de 1 en 107. Sin embargo, la tasa de error global de la replicación del genii-
?
ma de E. ct¡li es só1o de 1 cada 1010 a 1 cada 1 01 1, y la n-rejoría respectc d,rr
PAHES DE BASES
coN i: EN la tasa de error de ia polimerasa se debe al sistema c1e reparación de erro-
LUGAR DE ¡, res de apareamiento (sección 16.2.3), que barre el DhlA recién replicado
para detectar posiciones en las que las bases no están apareadas y corregil,
Cambio así, los pocos en'ores que cometen las enzimas de replicación. Esto signifi-
.f
t¿
tautomérico l''
,----...+
I

r:
oa que, en prolnedio, sólo se produce un erl'or de replicación no co1'regido
§r -Ü
¡lli cada 2.000 veces que se copia el genoma de E. coli.
1

'S ,' ,t-

¡Lll
!.i j-*: *¡r*¡*s #* r*.*ll:r:rí**.¡t:rli*i*¡i pi. -i.: .;!! r); - ii ; irr#fii{:i*c*§
arnlno.adenina irnino-adenina _¡ )' ..,-,-,.. I., r" í,'::.-:: ":
I
I I.,lo todos los errores de replicación consisten en nrutaciones puntifon:res.
+
La replicación aberrante también puede hacer que se inserten peqr:eños
PARES DE BASES
coN ir EN números cle nucleóticlos extlas en el polinucleótido que se está sintetizan-
LUGAR DE': do o que no se copien algunos nucleótidc¡s del mo1de. Una inserción o una
deleción dentro de una región codificante podría causar una mutació¡r del
Cambio marco de lectura, que cambia el utilizado para la traducción de la proteí-
tautomérico ,.:: na especificada por el gen (véase figura 16.12). Hay una tendencia a utili-
...-.....+
zar "cambio del marco de lectura" para describir todas las inserciones y
deleciones, pero esto es in.-xacto pucs insertar o eliminar tres nucieótidos,
..9
.a,. l,
o múltiplos de tres, sólo agrega o elimina codones o partes de cr:dones
9 . r.
':.,
i.') :a '., adyacentes, sin incidir en el marco de lectura. Por sllpuesto, también
muchas insel'ciones/deieciones se ploducen fuera de los marcos de lectura
ce¡o-guanina enol-guanina
I
abiertos, dentro de las regiones intergénicas de un genorna.
+
PAFIES DE BASES Las mutaciones por inserción y por deleción pueden afectal' toclas las
CON'I'EN
LUGAR DE paltes del genonla, pr:ro tienen pai'ticlrlar prevalencia cuando e1 llNA
'-,.:
molde contiene secuencias repetidas coltas, como las halladas cn los
nricrosatélites (sección 3.2.2). Esto se debe a que las secuericia"< 1'epeti-
das pueden inducir deslizamiento de la replicación, en la que la cadenit
Figura 16.4 Tautómeros y efectos molcle y su copia cambian sus posiciones lelativas, de manera que partc
sobre el aparearniento de bases. En de1 nrolcle es copiada clos veces o salteada. El result¿rdo es que el nttevo
cada uno de estos tres ejemplos, Ias
dos formas tautoméricas de la base
polinucleótido tiene una c¿intidad mayor o lrenor, r'espectivamente, de
tienen diferentes propiedades de apa- las unid¿rdes lepetidas (figura 16.5). Ésta es la principal razón pol la
reamiento. La citosina también tiene cr-ra1 las secuenci¿is r"nicrosatélites son tan v¿rriables y el deslizamiento de
lautómeros amino e imino. pero la replicación genera, a veces, uila nueva variante de longitud. qttc sc
ambos se aparean con la guanina. suma al con.iunto de alelos ya pl'esentes en la población^

Es probable que el deslizamiento cle la leplicación tanlbién sea lesponsable

de las enfermedades por expansión de repeticiones trinucleotídicas detec-
tadas en los seres humanos en lqrs últilr-ros años. Cacla una de estas enlir-
meclades neurodegenerativas es causada pol'L1na selie rciativÍifllc]rtc- colta
de repeticiones tlinucleotíclicas. que se elongan hasta duplicar o más su
longitud normal. Por ejemplo, el gen IID hr:mano contiene la sccuenci¡
5'-GAG-5' r'epeticla en tándem entre 6 y 35 veces, que codifica una selie
de glutan:rinas en el proclucto ploteico. En la enfennedad de Hr;ntirrgton,
esta repetición se expande a un núnrero de copias cle 36- I 21, k: quc ¿lumeil'
ta la longitucl dcl haz cle poliglutanina y da origen a una proteína clisfr-rn-
cional. Asimisrno, varias otl'as enfermedades humanas son causadas pol'
expansiones de codones de poliglutarnina (cuadro 16.1). Algi-uras enÍ'elrne-
 Mutaciones

daci¿s asociadas con retlaso mental se deben a expansiones trinucleotídicas

en la región líder de un gen, lo que crea un sitio frágil, una posición donde
*s probable que el crortosoma se rompa. También se conocen expansiones
que involucran regiones de intrones y tráiler.

No se sabe con precisión cómo se genei'an las expansiones de tripletes. Ei

ta¡naño de Ia inserción es mucho mayor que el que se produce por el des-
lizsmiento de la replicación norrnal, como e1 observado en las secuencias
...cA0A0ACACA...
Figura 16.5 Deslizamiento de la
...éiciéiéici... replicación. El diagrama muestra la
replicación de un microsatéllte con
..,CACACACACA... repetición CA de cinco unidades. Ha
.éiéiéiáiéi .
habido desllzamiento durante la repli-
cación de la molécula madre, lo que
...CACACACACA-.. inserta una unidad repetida adicional
,/\ . éiéiáiéiéi.. en el polinucieótido recién sintetizado
,/ de una de las moléculas hijas. Cuando
l;Li;c i*prirti* ia ti:: t.i:!l
se replica esta molécula hija, da origen
CACACACACA... r,'l ¡:l t:l
a una molécula de segunda genera-
áiéiéiéiói. . ñosiJli¿ri* {:J*} ai*sirr*r¡ri$nl§ t
I
cién filiai cuyo microsatélite tiene una
*ri i} aeñilrüarcn ,..CACAI,¿,CACACA... unidad más de longitud que el de la
MOLÉCULA \ \i . .éi¿i* iéiáici.. molécula parental original.
MADRE
\ \...cRcRcRCACA...
...óiéiéiéiái ..

MOLÉCULAS -.,CACACACACA...
HIJAS ..éiéiéiéiói ..

MOLÉCULAS
DE SEGUNDA
GENERACIÓN FILIAL

Cuadro 16.1 Ejemplos de

Locus Normal

Expansiones de poliglutamina (todas en regiones codificantes de genes)

HD (cAG)5_3s Enfermedad de Huntington

(cAC)36_r2r
(cAC)e_36 Atrofia muscular espinal y bulbar
AR (cAC)38-52
(cAC)6-3s Atrofia dentadorrúbrica-palidoluisiana
DRPLA (cAC)4e_88
(cAC)6-3e Ataxia espinocerebelosa de tipo I
SCAI (cAC)3s-82
SCA3
(cAC) r 2-40 (cAC)s5_84 Enfermedad de MachadoJoseph

Epansiones de siüos ffigiles (ambas en las regiones llderes no taducjdas de genes)

FRMI (ccc)6 (CCC)6o-más 2i0
s3 I Síndrome del cromosoma X frágil
FRM2 (ccc)6-3s , . (CCC)5r.más 2oo Retraso mental por XE frágil
Otras expansiones (posiciones descritas al pie) 1.., t,,-..:.a: a ,.,.r . r:: _:
DMPK (ct-c)s_:z (CTC)so_¡.ooo Distrofia miotónica
x25 (cAA)z-¡q (CM)¡c-.¿, zoo Ataxia de Friedreich

Las expansiones DMPKy X25 eslán las regiones trárler y de intrones de sus genes, respectivamente, y se considera que afectan
el procesamiento del RÑA. también hay algunas mutaciones causantes de enfermedad que involucran expansiones de secuen-
cias más largas, por ejemplo la epilepsia mioclónica progresiva causada por una expansión de (CCCCCCCCCCCC)2-3 a
(CCCCCCCaCCCC)*;, 12 en la región del Promotor dellocus EPMt.
 .irll§9:

r'il..

5t6 Capítulo l6 Mutaciones y reparación del Dl",A

microsatélites; una vez que la expansión alcanza cierta longitud parece

voiverse susceptible a ntavor expansión en rondas ulteliores de replica-
ción, de manera que 1a enfermedad se torna cada vez más grave en suce-
sivas generaciones. Se ha planteado la posibilidad de que la expiinsión
implique la fomación de horquillas en e1 DNA, sobre la base de la obser-
vación de que sólo se conoce una cantidad limitada de secuencias tr.inu-
cleotídicas que presentan expansión, todas las cuales son ricas en CC r,,
por 1o tanto, podrían formar estructuras secundarias estables. Taml:ión
hay evidencia de que por 1o menos una región de expansión de tripi,:t::,
-para la ataxia de Friedreich- puede formar una estructura de triple héli-
ce. Estudios de expansiones de tripletes similares en la levadura han mos-
trado que éstas son mucho más prevalentes cuando ei gen RAD27 está
desactivado, una obseLvación interesante, ya que este gen es ia versión de
levadura clel gen de FEN1 de los maniíferos, la proteína que participa en
el procesamiento de los fragmentos de Okazaki (sección 15.2.2). Esto
podría indicar que una aberración en la síntesis de la cadena retrasada
causa la expansión de repeticiones trinucleotídicas.

,'.';. ':' ;';C¡'.-''):' : l.' ',.t,'.il; :. -l í-Í:,1 .,'i;j,i O- l '*..,J-1,'].":

r;.,rf.]r"-.a( I i.(¡ -,i¡l

Muchos agentes químicos naturales del arnbiente tienen propiedades murá-

genas y, en los últimos años, éstos han siclo complementados por otros
mutágenos químicos resultantes de la actividad industrial humana. Los
agentes físicos, como la radiación, también son mutágenos. La mayoria de
los organismos están expuestos a concentraciones mayores o mencres de
estos diversos mutágenos, con el cr:nsiguiente daño para sus geilomas.

La definición de "mutágeno" es urt sgente qtLímico o físico que celtstt t?tLttu-

ciones. Esta definición es importante porque distingue a los mutágcnos clc
otros tipos cle agente ¿imbiental que provocan dañi: a las células, p.i'u no ¿l

través de mutaciones (cuadro 16.2). Hay superposiciones entre estas catego-

rías (p. ej., algunos mutágenos también son calcinógenos), pero cada tipo de
agente ejerce un efecto biológico distinto. Asimismo, la de{inición de "mutá-
geno" diferencia entre los mutágenos veldaderos y otros agentes que clañan
el DNA sin provocar mutaciones; por ejemplo, provocando roturas en las
moléculas de DNA. Este tipo de daño puede bloquear la replicación ) caus¿rr
la muerte de ia célul¿r, pero no es una mutación en el sentido estricto del tér-
mino y, por 1o tanto, los agentes causales no son mutágenos.

Los mutágenos causan mutaciones de tres maneras:

*' Algunos actúan como análogos de bases y se ios utiliza errónea-
mente como sustratos cuando se sintetiza DNA nuevo en la hi;rqui- ',,,

lla de replicación.

Cuadro 15.2 Categorías de agente arnbiental que causa daño a las células vivas

Efecto sobre las células vivas

-.Arye.....§
Carcinógeno Causa cáncer (transformación neoplásica de las células eucariontes)
Clastógeno Causa fragmentación de los cromosomas
Mutágeno Causa mutaciones
Oncogén lnduce la formación de tumores
Teratógeno Provoca alteraciones del desarrollo
 Mutaciones 52?

Algunos reaccionan en fomra directa con el Di''trA, 1o que provoca

r,ambios estructurales qlle llevan a la copia errónea de la cadena
$*i3trde cuando se rePlica el Di{A. §stos cambios estructurales son
di.,ersos, como se verá al estudiar cada mutágeno.
Algunos actúan de manera inditecta sobre el DNA. No afectan por sí mis-
mos la estructura del DNA, sino que hacen que la célula sintetice sustan-
cias químicas, cofno peróxidos, que ejercen un efecto mutág*ro directo.

jl espectro de mutágenos es tan vasto que es difícil elaborar una clasifica-

kn iotalmente abarcativa. Por consiguiante restringkernos el estudio a los
,,.,, tipos más comunes. Para los mutágenos químicos, éstos son los sigpientes:
n Análogos de bases: son bases púricas y pirimidínicas que presentan sufi-
ciente similitud con las bases convencionales del DNA pala ser incorpo-
radas a los nucleótidos cuando éstos son sintetizados por la célula.
, f)espués, los atípicos nucleótidos resultantes pueden utilizarse como sus-
tfatos para la síntesis de DNA durante la repiicación del genoma. Por
ejemplo, el 5-bromouracilo (5-bU; figura 16.6A) tiene las mismas pro-
piedades de apareamiento de bases que la timina y los nucleótidos que
contienen esta base pueden ser añadidos al polinucleótido hijo en posi-
ciones opuestas a las A del molde. El efecto mutágeno surge porque el
equilibrio entre los dos tautómeros de 5-bU se desplaza más hacia la
fnrma enolmásfara que en el caso de la timina. Esto significa que duran-
te la siguiente ronda de replicación hay una probabilidad bastante alta de

(A) 5-bromouracilo
Figura 16.6 S-Bromouracilo Y su
.,
efecto mutágeno.
: ;
lil;
,:

*.t' -J, -tt'l

{E) Apareamiento de bases con S-bromouracilo +-

f'l §1 ,§"*-H q.
.+4-7¡j,\
-+l i /
//-----(
l3r ,p 1-l-1{ ,\,
,*: \¡-- + t
\//1
\*.."J *../
'i
(/.l'-tr. Ni !-i-N
\:\r.r*:§,rqrÉ
\,
)* ''-nzúceR.
trl

*
{",í-*\
l

*,J.*¡-l ., -l :¡ -1
t\
l\} )--N-,nzütiln J'i-+/
N-( r:l'."¿
§§&E * - r-*-E
1
'*zúC¡n l-: l,{

Forma celo del Adenina Forma enoi de Guanina

5-bromouracilo 5'bromouracilo

{C) Efecto mutágeno del 5-bromouracilo

r{ A- .t;
*,ÁT¿CTAü. ¿iii'*;,ia
ür¿"i*A'i*.
'::\:;*r¡1,_r ..Ua ¿¡,:4.1
ai,qi*;ic L I lu-r-rL.

-".*& AÜTA§
ü,¿., ,-1;TA{} fLl{lL,
,..t,I
*i"*.r*¿iü
...§A?¿i'rA.;.
. -1-r l rl l la§ i !,r,
52§ CapítuL: l6 &,1ut¿ciones y repareción del L¡lliA

que la polimerasa encllentre enol-5bU que (a1 igual que la eruoi-timina¡

?*' se aparea con G en lugar de aparearse con A (figura 16.611). Esto provo-

Adenina FIC^ i
l--*-o* o
I
ca una nutación puntiforrne (figura 16^6C). La 2-arninopurina actúa clc
manera similar: es un anáiogo de adenina con un amino-tautómero, que
.y ¿- t-J
11"'" -.*,-r"" se aparea con timina, y un imirus-tautómero, que se aparea con citosina:
la forma imino es más común que la ímino-adenina y, por ende, induce
¡ Desaminación transiciones T-C durante la replicación del DNA.
I
ts'
i."j Agentes de desarninación: también causan muraciones puntifot:r:es,
.: Las moléculas de DNA genómico presentan cie¡to grado de desamira-
ción de bases espontánea (eliminación de un grrpo amino), y la tasa cs
Hipoxantina i"ic ii I aumentada por agentes químicos, como ácido nitroso, que desamina
^
\v .- rU, -lf adenina, citosina y guanina (la timina no tiene ningún grupo amino y
".
i§- -,*,f,
l,§ entonces no puede ser desaminada); y bisulfito de sodio, que actúa só1o
i

sobre la citosina. La desaminación de la guanina no es mutágena por-

que la base resuitante, xantina, bloquea la replicación cuando apar.ece
en el polinucleótido molde. La desaminación de la adenina genera hipo-
Figura 16.7 La hipoxantina es una ver-
xantina (figura 16.7), que se aparea con C y no con T, y la desamina-
sión desaminada de la adenina. El
nucleótido que contiene hipoxantina se ción de citosina genera uracilo, que se aparea con A y no con G. Por 1o
denomina inosina (véase figura 12.,l8). tanto, la desaminación de estas dos bases provoca mutaciones puntifor-
mes cuando se copia la cadena molde.
Agentes alquilantes: son un tercer tipo de mutágeno que puede provo-
(A) Bromuro de etidio t:::.-j car mutaciones puntifornes. Los agentes químicos como sulfonatc de
etilmetano (EMS) y dimetilnitrosamina añaden grupos alquilo a los
nucleótidos de las moléculas de DNA, como hacen los agentes de n-reti-
lación como los metilhaluros, que están presentes en la atmósfera, y 1os
;r,",t:t productos de1 metabolismo de los nitritos. El efecto de la alquilación
depende de la posición en la que es modificado el nucleótido y del tip«r
de grupo alquiio añadido. Por ejempio, la metilación suele generar nucle-
ótidos n:odificados con alteración de las propiedades de apareamiento
cle bases y causa así mutaciones puntifomes. Otras alquilaciones b1o-
quean la replicación por fonnar enlaces transversales entl'e las dos cade-
nas de una molécula de DNA o por agregar grandes g¡'lrpos alquilos que
(B) Efecto mutágeno
impiden el progreso del complejo de replicación.
* Agentes intercalantes: por 1o general, se asocian con mutaciones por
inserción. EI mutágeno de este tipo mejor conocido es el bromuro de
etidio, que emite fluorescencia cuando se expone a radiación ultra-
violeta (UV) y, por ende, se 1o utiliza para revelar las posicir:nes cle
Bromuro
de etidio bandas de DNA después de la electroforesis en gel de agaros:r ivéase
Nota sobre técnicas 2.2). EI bromuro de etidio y otros agentes inter-
calantes son molécu1as pianas, que se pueden cleslizar entre pales de
bases de la doble hélice y desenrollarla ligeramente, lo que alrmenla
la distancia entre pares de bases adyacentes (figura 16.S).
.,,.,, , a'.,

Los tipi:s más importantes de mutágenos físicos son:

* La radiación ultravioleta (UY) de 260 nm de longitr"rcl de onda indu-
Figura 16.8 Efecto mutágeno del
bromuro de etidio. (A) El bromuro
de etidio es una molécula plana, de
tipo placa, que se puede lntroducir
entre los pares de bases de la doble
héiice. (B) Se ilustr¿n las moléculas
de bromuro de etidio intercaladas en
l¿ hélice: las moléculas se visualiz¿n
de costado. Obsérvese que la interca-
l¿ción aumenta la dist¿ncia entre
pares de bases adyacenles.
ce dimerización de bases pirimidínicas adyacentes. soble t,¡do si
amb¿rs son timinas (figura 16.9A), lo que origina un dímero de ciclo-
l:utilo. Otras combinaciones de pirimidinas también forman dírne-
los, con un orden de frecuencia decreciente para 5'-CT-3'. 5'-TC*5'
y 5'*CC-5'. Los dímeros de purina son mucho menos comunes. Por
li: general, la dimerización inducida por radiación UV provoca una
mutación por deleción cuando se copia la cadena modificarla. Otro
tipo de fotoproducto inducido por radiación UV es 1a lesió* {6*4),
en la que los carbonos números 4 y 6 de pirimidinas adyacenles for-
man enlaces covalentes (figura 16.98).
 Mutaciones

Figura'l 6.9 Fotoproductos inducidos

{A) Dimero de timina por irradiación UV. Se muestra un
*w segmento de un polinucleótido que
t1
L, --- iu
contiene dos bases timina adyacentes.
(A) Un dímero de timina contiene dos
/1r
enlaces covalentes inducidos por UV
\ 16
H
5'
:-
f:*n
uno que une los carbonos en posición
-!\l *--q-cH.
q 6 y otro que une los carbonos en posi-
{) i b.i: ción 5. (B) La lesión (6-4) impiica la
ú
:t :
l\
, :
j
formación de un enlace covalente
I
entre los carbonos 4 y 6 de
i l"r** nucleótidos adyacentes.
Timina -§ :\ ;O
i-
i^ C;r
-t ,

l\
l-.i tilu

§ l-r
¡l!
u-ia
r*n ffi
'L
-V W
ffi H\ c'-r,
.1-.-....-!¡. Timina :- /''.oH
,..r.j. ffi
ffi_- _-__N
,Iu"
I C:O
ffii./
ffi .'C N
ffi
ffi
,'¡l
,'O
\
H
M;
M -:
Us-, '*r1
ffi
ffi
¡rl
v¡ r.r*-- 1\ '¿
ffi*":
ffi i"i "".¡v '{Ll
y'-'=O
ffi

ffi (B) Fotoproducto (6-4)

ffi
ffi

La radiación ionizante ejelce diversos ef'ectos sobre el DNA, 1o que

depende del tipo de radiación y de su intensidad. Podr'ía provocar
mutaciones puntilonres, pol" inserción o por deleción, así coino for-
mas más graves de d¿rño clel DNA que impiden la replicztción ulteriol
del genoma. Algunos tipos de radiación ionizante actúan directamen-
te sobre el DNA, otras actíran de manera indirecta al estimular la for-
rnación cie moiéculas reactivas, corl1o peróxidos, en 1a célul¿r.
El calor estimula la clegradación inducida por agua de1 enlace §-N-
glucosídico, que une ia base al componente hidrocarbonado del
nr-rcleótido (figura 16.10A). Esto sucede más a menudo con las puri-
nas que con las pirimidinas y orea un sitio AP (apurínico/apirirnidi
nico), o sitio sin bases. El azúcarfosfato que queda es inestable y se
degrada con rapidez, lo que deja un hi¿rtr¡ si la molécula de DNA es
bicatenaria (ligura 16.108). Por lo general. esta reaceiól] no es mutá-
gena, porque las células tienen sistemas eficaces para reparar hiatos
(sección 16.2.2), lo que resulta tr:anquilizadot' cuanclo se considera
que se generan 10.000 sitios AP en cada célula humana por día. Sin
embalgo, los hiatos sí provocan mutaciones en cieltas circunstan-
cias; por ejernplo, en E. coli cu¿lndo se activa la t'espuesta SOS. cuan-
do los hiatos son rellenados con A independientemente cle la identidacl
del nucleótido en la otra cadena (sección 16.2.5).
 Mutaciones 53r

No sinónima Figura 16.11 €fectos de mutaciones

i_ ....1...- :
puntiformes en la región codifican-
ile te de un gen. Se muestran cuatro
efectos diferentes de mut¿c ones
Por ullralectura punlltormes, L¡ rut¿ciÓr, ;or ult-:ler-
i..-.
i t,{ [ura deierr¡,na ql.-re el gen 5¿ extier:C:
más allá del 'final de la secuencia aqui
-..-.....1

leu
+ nrostrada y el corlón de leucina cre¿-
I
,
, do por l¿ mu:¿c;cn es segu.do ce
,
I
AAA : lys. TAT : t;r y ATA: rle. Vé¿s.
I el código genético en la figura 1.20.
'T
f i*3'l
,.-):"-.."._-. . .)l
Á,r.¡i.,1É.T Á
.--*)
I Á 1 é'
ile pro Codon de lerminación

tos sobre l¿r función de codificac,ión del genoma: el gen mutado codi-
lica exactamente la rtisma proteína que el gen no mutado'
Pr.recie plovocar un cambio no sinónirno, en el qlle l¿i mutación alte-
ra el códón cle manera que óste especifica un aminoácido diferente.
Por. lo tanto, Ia proteína codificada por el gen nrutado pl'esenta un
caml¡io cle un solo arlinoácidr:. A nlenuclo, esto n11 ejel'ce ningún
efecto sigprificativo sobre la actividad bioiógica de la proteína, por-
que la máyoría cle las proteínas pueden tolerar por 10 rllenos ¿ilgunos
cambios áe aminoírciár¡s sin e{'ecto reconocible sobre su capacidad
cle funcional en 1¿1 célu1a, pero los carnbios de ciertos aminoácidos,
como k:s clel sitir: activo de una enzima, tienen mayor fepelcusión'
Un cambio no sinónimo se denomina tambiér-r una mutación de sen-
tido erró¡leo.
La mutación puecle oonve1.tir t1n codÓn qtie especillca un anlinoáci-
r1o en un cod¿n cle terminaciÓn. Ésta es una mutación terrninaclora y
cia origen a una protüína acort¿lda, porque la tiaducción clel mIINA
se cletier"re en este nuevo codón de tel'nlinación en lugar cle Continuar
h¿rsta el coclón de terrninaciÓn correcto ubicado más corriente abajo'
El ef'ecto sobre la actividad de ia proteína depencle de la cantidad de
polipépticlo que se pierda: por 1o general, el efectr: es drástico y la
pl'oteína no es fllitcioi-lal.
La mr-rtación podría converti¡un codón de terminación en Llno que
especifica un aminoácicio, ic'r que determina la ultralectufa cle la señal
cle tenrinación, de modo que la ploteína se extiende meciiante una Figura 16.12 Mutaciones Por dele-
cién. En la secuencia superior, haY
serie adicional c1e aminoácidos en sll extlemg C. t-a mayr:ría de las deleción de tres nucleótidos que {or-
ploteínas pr-rerlen toleral extensiones c:ortas Sin que és1as af'ecten su man un solo codón. Esto acorta el
?unción. pero las extensiones más largas podr'ían interferir en el ple- producto proterco result¿nte en un
gamiento de la proteína y rellucir así st1 ¿rctividad. ¿minoácido, pero no afecta el res'o
de su secuencia. En ia secciÓn infe-
rior, se observa deleción de un solo
nucleótido. Esto determina un cambio
!j* r ¡: ;.:l : t j*
l l a t:; t i i'..t ::1 {: tti i 1 a l ::,t.
del marco de lectura, de nrodo que
I
á
se modifican todos los codones
Aiü**;"iiiT¡r,*llÁ'i f rl;lÁTA&AAi,I¿;&-f
:
¿ corriente abajo de la deleciÓn, inclui-
t---::- ii ]:J ..............ri........... ¡

met gly tyr ser ile pro codén de terminación do el codón de terminaciÓn que,
ahora, es leÍdo. Obsérvese que si una
deleción de tres nucleótidos elimina
partes de codones adyacentes, e1
iesultado es más conrplicado que el
'l'I[¡t'1-AA]"4¡!-f &l'¡!1;1 que se muestra aquí. Por elemplo. ll
i,;r-.,''.,,,'," , ,,I..;-..''f
."
,
r ,----
met Sly lys iyr ser ile pro Codón de lerminacion deleción del trinucleólrdo CCA de l¿
secue ncia .".ATCCCCAAATAT..., que
l]*l**i** ** *¡: lr";li**1.14* codifica metgly-1ys-tyr. La nueva
I -...ATCCAATAT...
secuencia es que codi-
¿
if!Í!l l¿ ll*i:e,t!-11§l{',i1131111 i fica met-glu-§r. Se han reemplazado
dos aminoácidos por uno diferente'
met gly asn ile ala phe his lys asn ile
512 Capítulo t6 tulutaciones y reparación del DNA

Figura '16.13 Dos posibles efectos

de mutaciones por deleción en la Promoior .) Deteción de la THANSCRIPCIÓN¡
región corriente arriba de un gen. central secuenciareguladora NOCONTHOLADA

(
Deleción del j
\ promotor central
(

AUSENCIA DE
TRANSCFIPCIC:TI

Las mutaciones poldeleción y por inser:ción también ejercen dif'erenies efec-

tos sobre la capacidad de codificación de los genes (figura 16.12). Si la can-
ticlacl de nucleótidos eliminados o inseltaclos es de tres o múlriplo de tres. ha).
elirnin¿rción o aglegado de uno o más codones, y ia pérdida o la ganacia resul-
tante de aminoácidos ejerce diversos efectos sobre la función de la proteína
codificada. Las deleciones o las insercir:nes de este tipo suelen no tenel ürrn-
secuenci¿ts, pero repercutirán si, por ejemplo, se pierden los aminoácidos del
sitio activo de una enzirna o si una inserción rompe una estructula secunda-
'1
da importante de ia proteína. Por el contrario, si el número de nucleótidos
elirninados o insertados no es tr:es ni múltiplo de tres, sr:breviene un cambic {

del marco de lectura y todos los codones coniente abajo de la mutación son l
l
tomados desde un marco de lectura dif'erente del utilizado pol el gen no '
mutado. Esto suele ejercer un efecto significativo sobre la función de la pro-
teína, porque una mayor o rrlenol par:te del polipéptido mutado tiene un¿r
secuencia totalmente diferente de la del polipéptido normal.

Resulta menos fácil efectuar genelaliz¿iciones soble los efectos de las

mutaciones que tienen lugar fuera de las regiones codificantes del
€{eÍ}oma. Cualquiel sitio de unión a prr:teínas es susceptible a mutacio-
nes puntiformes, por inserción o por deleción, que modifican la iden-
tidad o el posicionanriento relativo de los nucleótidos ir"ivolucrados en
la interacción DNA-proteín¿i. Pr¡r lo tanto, estas mutaciones tienen el
potencial de desactivar pr:onlotores o secuencias leguladoras, con con-
secuencias predecibles para Ia expr:esión de los genes (figura I6.13;
secciones 11.2 y i 1.5). Es concebible que las mutaciones qlle modifi-
can, elilninan o alter¿rn secuencias reconocidas por las proteínas c1e
unión pertiirentes puedan tornal' no funcionales los orígenes de repli-
cación (sección 15.2.1), pero estas posibilidades no están bien docu-
mentadas. Asimismo. ha.v escasa infolmación acerca de la posibie
repercusión soble la explesión génica de nrutaciones que aiectan la
pcrsición de ios nucleoson-ias (sección 1A.2.2).

Se han investigado mejor las mutaciones localizadas en los intrones o

en los límites intrón-exón. En estas regiones, cada nutación puntifot'-
me ser'ír importante si modifica nucleótidos que intervienen en las inter-
¿rcciones RNA-proteína y RNA-RNA que se producen durante cl corte
y empalme de distintos tipos de intrón (secciones 12.2.2 y 12.2.4).?rst
eien:plo, la mutación de G o T en la copia DNA clel sitio de corte !'
enrpaln:e 5' de un intrón GU*AG, o de A o C en cl sitio de coi:te y
empalme 3', altelará el corte y entpalme poi:que ya no se reconocerá el
límite exón-intrón con'ecto. Esto puedc' irr,plicar: que no se elimine eI
intrón del ple-rlRNA, peto es más probable que se utilice como alter-
nativa un sitio cle corte y empalme cr'íptico (véase figura l2.2BB).
También es posible qlle una mutación dentro de un intrón c de un exón
clee Lln nllevo sitio cr:íptico. que es preferido respecto de un sitio de
corte y empalme genuino que no ha niutado. Al¡bos tipos de eventi: tie-
 Mutaciones 553

**
nün ei mismo resultado: la reubicación del sitio de corte y empalme
L4uta*i$n
p*rdirix Ai:sensia ci*
;¡ctivo, 1o que provoca corte y empalrne aberrante. Esto pcdría eliminar ** f***r*n prüdü{:{0
parte de la proteÍna resultante, agregar una nueva extensión de amino-
icidos o inducir un cambio del marco de lectura. \'arias versiones de ia
enlermedad sanguínea §-taiasemia son causadas por mutaciones que Par de @ fr*rXr.rct*
inducen selección de sitics de corte y empalme crípticos durante el pro- cromosoma§ pr*t*lcc
homólogos
cesamiento de los transcritos de l3-giobina.

fi*ef*s C* l*s ff.:-If#fisit35 5r*r* JL:s * ;:.-,: "r:;.i ¡;:* 1..::i*i*r*l

Ahora, analizaremos los efectos indirectos de las mutaciones sobre ios Figura 16.I4 Una mutación de
organismos, comenzando por los eucariontes diploides multicelulares, pérdida de función suele ser
como los seres humanos. E,lprimer problema por considerar es la impor- recesiva, porque hay una versión
tancia relativa de la misma mutación en una célula somática o en una funcional del gen en la segunda
célula germinal. Como las células somáticas no pasan copias de sus copia del cromosoma"
genomas a la siguiente generación, una mutación de una célula somáti-
ca es importante sólo para e1 organismo en el que se produce: no tiene
ninguna posibilidad de repercusión evolutiva. De hecho, la mayoría de
las mutaciones de células somáticas no ejercen ningún efecto significati-
vo, aunque provoquen muerte celular, pues hay muchas otras células
idénticas en el mismo tejido y la pérdida de una célula es irrelevante. La
excepción colresponde a la mutación de una célula somática que origi-
na un funcionamiento anormal y nocivo para el organismo; por ejempio,
la inducción de tumores y otros ef'ectos dei cáncer.

Las mutaciones de las células germinales son más importantes, porque

se pueden transmitir a miembros de la siguiente generación y estarán
presentes en todas las células de cualquier individuo que herecle la
n-rutación. Aún así, la mayoría de las mutaciones, incluidas las siiencio-
sas y muchas de regiones de codificación, no modificarán de manera
significativa el fenotipo del organismo. Las que sí ejercen un efecto se
pueden dividir en dos categorías:
* La pérdida de función es el resultado habitual de una mutación que
reduce o anula la actividad de una proteína. La mayoría de las mutá-
ciones de pérdida de función son recesivas, porque la copia del
segundo cromosolna de un heterocigoto contiene una versión no
mutada del gen, que codifica una proteína por completo funcional
cuya presencia compensa el efecto de la mutación (figula 16'14).
Hay algunas excepciones en los que una mutación de pérdida de fun-
ción es dominante: un ejemplo es la haploinsuficiencia, en la cual el
organismo no puede tolerar ia reducción de alrededor del S}ak de la
actividad de la proteína sufrida por el heterocigoto. Esto explica
algunas enfermedades genéticas humanas, como el síndrome de
Marfan, que se debe a una mutación del gen de la proteína del tejido
conectivo denominada fibrilina.
¡' Las rnutaciones de ganancia de función scn mucho menos conlunes.
La mutación debe ser una que confiera una actividad anormal a una
proteína. Muchas mutaciones de ganancia de función corresponden
a secuencias reguladoras más que a regiones de codificación y, por io
tanto, pueden provocar diversas consecuencias. Por ejemplo, una
mutación podría determinar la expresión de uno o más genes en los
tejidos incorrrectos y estos tejidos ganarían funciones de las que
carecen en condiciones normales. Pot otl"a parte, la mutación podría
inducir sobreexpresión de uno o más genes que participan en el oon-
trol del ciclo celular, lo que causaría una división celular desci:ntro-
lada y, en consecuencia, cáncer. Dado su carácter, 1as mutaciones de
ganancia de función suelen ser dominantes.

.¡6
534 {apítulo i\¡uracicnes v reparación del Dl!A
(A) Auxótrofo de triptófano
Auxótrofo
de triptófano
Medio rnínimo Medío mínimo
+ triptófano
Figura 'l 6.15 Mutante auxótrofo de
triptófano. (A) Se muestran dos cu¡ti-
vos en placas de Petri. Ambos contie-
nen medio mínimo, que aporta sólo los
requerimientos nutricionales básiccs
para el crecimiento bacteriano (nitróge-
no, carbono y fuentes de energia, más
algunas sales). El medio de la izquierda
tiene suplemento de triptófano, pero el
medio de la derecha no. Las bacterias
no mutad¿s, más los auxótrofos de trip-
tófano, pueden crecer en la placa de la
izquierda; lcs ¿uxótrofos crecen porque
ei medio les aporta el triptófano que no
pueden fabricar ellos mismos. Los
auxótrofos de triptófano no pueden cre-
cer en ia placa de la derecha, porque
ésta no contiene triptófano. (B) Para
identifrcar un auxótrofo de triptófano,
primero se hacen crecer las colonias en
la placa de medio mínimo + triptófano
a la placa
y, después, se las transfiere
de medro mínimo por siembra de répli-
cas. Tras la incubación, las colonias apa-
recen en Ia placa de medio mínimo, en
las mismas posiciones relativas que en
la placa que contiene triptófano, excep-
to los auxótrofos de triptófano que no
crecen. Por lo tanto, se pueden identifi-
car estas colonias y aislar muestras de
las bacterias auxótrofas de triptófano de
la placa de medio mínimo + triptófano.
.%§-
,,§:,'" ,
.::..
¡.'
{§} Siembra de réplicas en placas
Bloque
de madera t^^^- t^
Tocar la superficie
superficie
,i
:t-l.,.lj --.'
:Z§ lncubar
'',1.,..l
Colonias en Medio mínimo vglul l|(l : :
medio mínimo medio miril¡'n:
+ triptófano
A veces es difícii evaluar los efectos de las mutaciones sobre los lenotipos
de organismos multicelulares. No todas las mutaciones tlenen una repercu-
sión inmediata: algunas son de comienzo diferido y sólo confieren un feno-
tipo alterado en etapas más tardías de la vida de un individr-ro. Otras
mutaciones presentan ausencia de penetrancia en algunos casos )'nLutc¿i sc
expresan, aunque el individuo tenga una mutación dominante o sea un
homocigoto recesivo. En los seres humanos, estos factores complicln los
intentr:s -ie mapear mutaciones caus¿lntes de enfermedacles por análisis del
árbol geneiilógico (sección 3 .2.4) porque introducen incertidumble ¿lcerca
de qué miembros de una famiiia tienen un alelo mutante.
.§f¡*r:l*s d* Jr: ffiL'l$ril:#*, $ril'r* l*:.' rx;:¡'**{§¡:¡:isr¡;t:s
En microbios como bacterias y levaduras, las mutaciones tambiérr pue-
den describirse corno de pérdida de función o de ganancia de función,
pero en 1os microorganisinos éste no es el esquema de clasificacion habi-
tual ni el más útii. En su lugar, suele intentarse una descripción niás
detallacla del fenotipo sobre la base de las propiedades cle crecimiento
de las células mutadas en divelsos medios de cuitivo. Esto permitr) asig-
nar la mayoría de las mut¿rciones a una de cuatro categorías:
r Los auxótrofos son céh-r1as que sólo cl'ecen cuando se les zrpcrta un
nutriente no requerido por ei organismo no mutado. Por ejemplo. E. coli
suele fabricar su plopio triptófano gracias a las enzimas corlificadas por
los cinco genes del operón de triptófano ({igura B.BB). Si r-rno de estos
genes presenta una mutación que desactiva su producto proteico, 1l cá[u-
la ya no puecle fabricar triptófano y, así, se convierte en un au,rótlofb de
triptófano. No puede soblevivir en un medio que cal:ezca de tliptófanr: y
sólo puede crecer cuando se aporta como nutriente este aminoácidt¡ {lisiu-
ra 16.15), Las bactet-ias no mutadas, que no requieren suplententos adi-
cionales pa1'a su medio de crecimiento, se denominan protólrofi:s.
l
¡ Los mutantes letales condicionales no pueden resistir ciertas conilicio- {
nes de crecimiento: en condiciones pennisivas parecen totalmente nor- {
males, pero cuando se 1os transfiere a condiciones restrictiYas, se
observa el fenotipo mutante. Los rnutantes termosensibles son ejeil-
plos típicos de mutantes letales condicionales. Se comportan como cé1u-
las de tipo silvestle a bajas temperaturas, pero muestran su fenotipct
mulante cuando ia temperatura asciende por encima de ciet'ta unrbral'
que es diferente para cada mutante. Por 1o genet'al, estü se clcLe a c¡ue
la mutación disminuye la estabilidad de una proteína, cle mqrclo que ésta
se despliega y, por ende, se inactiva al subir la temperatura.
" Los mutantes resistentes a inhibidores pueden tolei:ar los cJ:ectos tóxi-
cos de un antibiótico u otro tipo de inhibidor. Hay diversas c:plicaciones
moleculares para este tipo c1é mutante. En algr,rnos c¿lsos, Ia mutacién
moilifica 1a estu:ctura de la proteína que es diana del inhibiclol: rle mane-
 Mutaciones 535

ra que éste ya no puede unii'se a ella e intederir en su funciÓn. Ésta es la f! r*§rssii ri* ix*i**¡l rr: ** plr*i**
h;rse de 1a lesistencia a la estreptomicina en E. cali, que obedece a un t¡:;r al *f*ra,llrt lrilt.&C.}
,é: -
-'r::nbio de estn:ctura de la ploteína ribosómica S 12. Otra pr:sibilidad es &
qi:r*: la mutación modifique las propiedades de una proteína responsable \.,I
g
cl; transportar el inhibidol al interior de la céiula; éste suele ser e1 meca- tacZ
nisnro mediante el cual se adquiere resistencia a ios metales tóxicr:s.
r [,os mstantes reguladores tienen defectos de los plomotores y otras
,.
., ll''"t':tl:t'1.' ExpRestóru
secuencias reg¡:ladoras. Esta categoría incluye rnutantes constituti- i..:iir:.::;.r:rri.:r.r, coNSTITUT|vA
yos, que expresan continuamente genes que, por lo genelal, se acti- DEL OPEHÓN
DE LACTOSA
van y desactivan en diferentes coirdiciones. Por ejempio, una mutación
de la secuencia oper:adora del operón de lactosa (sección 11.3.1) puede
in'rpeclir la unión del represor y, pol ende, determina la expresión per-
filanente del oper'ón cle lactosa, aun en ausencia de ésta, cuando L:s Figura 16.16 Efecto de una rnutación
genes cleber'ían estar desactivados (tigura 16.16). constitutiva en el operón de lactosa.
La secuencia del operador ha sido alt*.
Aclerlás de estas cuatro categorías, muchas mutaciones son lctales y pro- rada por una mutación y el represor de
vocan la muerte de la célula ntlltante, mientras que otras no ejercen ningún lactosa ya no se puede unir a éste. El
resultado es que el operón de lactosa
efecto. Estas últinlas son menos comunes en los microorganismos que en
es transcrito en fon¡a continua, aun
los eucariontes supeliores, ya que la mayoría de los genomas microbianos cuando no hav lactosa en el medio.
son relativamente compactos, con escaso DNA no codiflcante. Las muta- Esta no es h única manera en la que
ciones también pueden ser filtrantes, lo que significa que se expresa una puede surgir un mutante lac constituti-
lonna menos extrema del fenotipo mutante. Por ejemplo, una versión fil- vo. Por ejemplo, la mutación podría
tránte clel¿luxótrofo de triptófano ilustrado en la figura 16.15 crecería con afectar al gen que codifica el represor
lentitucl en un medio mínimo, en lugar de no crecer en absoluto. de lactosa, Io que cambia la estructura
terciaria de la proteína represora de
manera que su motivo de unión al Dl{A
? S" § .3 §":? p*rra; lxtm *i * ¡t bi $3€3s; h;,'§x§;cd * *
§
se modifica y ya no puede reconocer la
secuencia operadora, aunque esta últi-
rvzw*mc§*x *s pf*§rffi §§t***§ ma n0 esté mutada. Véanse más deta-
lles sobre el represor de lactosa y su
¿,Es posible que las células utilicen en fonna positiva las mutaciones, ya sea
aumentando la tasa de aparición de mutaciones en sus genomas o dirigiendo efecto regulador sobre la expresión del
operón de lactosa en la figura i 1.24.
las rlutaciones a genes específicos? A primera vista, podría parecer que
ambos tipos de evento contradicen el saber aceptado de que las irrutaciones
son ¿lleatorias. La aleatoriedad de las mutaciones es un concepto importante
en biología, porque es un requisito delconcepto dalwiniano de la evolución,
que sostiene que los cambir:s de las caracteristicas de un individuo se produ-
cen por azar y no son influiclos por el medio en el que se ubica el organismo.
Pol el contrario, la teoúa de la evolución de Lamarck, que los biólogos recha-
zaron irace más de un siglo, afirma que los organismos adquieren cambios
que les perrrriten adaptar:se a su medio. E,[ concepto darwiniano requiere que
las lnutaciones sean aleatoúas, mientlas que la evolución lamarckiana exige
que las mutaciones sobrevengan en respllesta al medio.
Figura 16.17 Hiperrnutación del
segmento génico V de un gen de
inmunoglobulina intacto. Véase la
La laipermutacién y las mutaciones programadas son dos fenórnenos descripción de los eventos que llevan
que, ír prinera vista, parecen contradecil el concepto de que las muta- al ensamblaje de un gen de
ciones son aleatorias. inmunoglobulina en la figura 14.19.

Hipermutación

Mutaciones de los
segmentos V

M.:'
516 Capítulo l6 Nluiacicr,es 7 'eparacic: dc' D\;

(A) Hipermutación por reparación incorrecta j-,: i¡,..**,.;;:#l**rr:)ü :r. #*i:* # f r*it'1-i§ {:¡l-i:ri?l,:lf.?
de errores de apareamiento
-- l: :-- -, . ', r-i'
,'.. " 1 ],

1-- -'1
.,,GACTAGGAC,..
;;:; uL
:;+^
-..L tuA lu-.- La hipermutación se produce cuando una céiula petmite que aumente la ta-ra
de producción de mutaciones en su genoma. Se conocen varios ejemplcs de
hipermutación; uno de ellos fomra parte del mecanismo empleado por algu-
nos vertebrados, incluidos los seres humanos, para generar una serie diversa
Fleparación normal Hipermulación de proteínas inmunoglobulinas. Ya consideramos este f'enómeno en la sec-
ción 14.2. 1, cuando examinamos los reordenamientos de1 genoma que dettr-
...LrAL, lALtr(f,AL.,. ,,.(fAL/ I - (l(,AU. minan la unión de los segmentos V D, I y C de los genes de las cade:ras
. .¿ióÁióóió . . óiéÁ:óóié. pesada y 1iüana de inmunoglobulinas (véase figura 14.19). La hipermutación
i

Error de 1., i -r' :.;i:l de los segmentos génicos V tras e1 ensamblaje del gen de inmunoglobulina
apareamiento intacto produce diversidad adicionai (fip¡ura 16.17) y la tasa de mutación de
corregido
estos segmentos es de 6-7 órdenes de magnitud mayor que la tasa de muta-
(B) Hipermutación por conversión ción basal presentada por el resto del genoma.
de citosina en uracilo
...GATACAGCA,..
óiÁióróéi . Se desconoce el mecanismo preciso de hipermutación del segmento
génico V y se han propuesto varios modelos en función de Ia evidencia
II Citosina desaminada a uracilo
experimental existente. Al principio, se consideró que la mayor tasa de
mutación se debía al comportamiento infrecuente del sistema de repara-
,,.GAfA..JAGCA.,,
ción de en'ores de apareamiento que, en condiciones normales, corrige
...ci¿icicci... los ertores de replicación (véase sección 16.2.3). En todas las clemás
¡ Uracilo escindido, que deja posiciones del genoma, la reparaclón de errores de apareamiento cord-
5rlro AP
t
._ un sitlo AP ge los errores de replicación buscando pares de bases erróneos y reem-
plazanclo el nucleótido de ia cadena hija, que es la recién sintetizarla y la
Yili^lYYl 1 Replicación que contiene el error. Se consideraba que, en los segmentos génicos V,
...CTATGTCGT-.. \
\ el sistena de reparación carnbia el nucleótido de 1a cadena madre, 1o que
-.GAf A . AGCA-, estabiliza la mutación en lugar de corregirla (figura 16.18A). Más
recientemente, se ha mostrado que se requieren dos enzimas -una cito-
sina desaminasa y una uracil-DNA glucosilasa- para ia hipermutación
de1 segmento V. Esto ha llevado a sugerir que 1a hipermutación es pro-
vocada por la conversión de alggnas bases citosina en uracilos (por la
desarrinasa), seguida de escisión de los uracilos (por 1a glucosilasa) para
crear sitios AP (figura 16.188). Esto es similar a los primeros pasos del
proceso de reparación pol escisión de bases (sección 16.2.2), que escin-
de un utacilo resultante de la acción de un mutágeno de desaminación
Figura 1§.18 Dos esquernas mediante una uracil-DNA glucosilasa. En la reparación por escisión de
alternativos de hipermutación del
segmentos génicos V
bases, el sitio AP es llenado después por la DNA polimerasa B, para res-
de inmunoglobulinas" tabiecer 1a secuencia original pero, en la hipermutación, no se reparan
los sitios AP. Esto signilica que, durante la siguiente ronda de replica-
ción, se podría colocar cualquiera de k:s cuatro nucleótidos en la cade-
na hija frente a cada sitio AF: una T en el ejemplo ilustradr: en la ligura
16. 1BB. Después, una nueva ronda de replicación estabiliza la mutación.

1,..:::t {r:i!ít:i:i;:r¡t:", í:{,:;:lti:{l:t:':t:ii;:;; ¡.tr:r*{rjtl {¡r{J$,r l'#

j
.,. i,

Un aparente aumento de la tasa de inutación secundario a modificacioni:s del

proceso norrnal de reparación del DNA no contradice el dogma respecto cie
l¿r aleatoriedad de las mutaciones. Por e1 contrario, son mucho más dificiles
de explicar comunicaciones que datan de 1988, que sugieren que E. coli
puede dirigir mutaciones hacia genes cuya alteración seria ventajosa en las
condiciones ambientales que está hallando 1a bacteria.

En I943, Luria y Delbrück demostraron la aleatoriedad de las mutacir:nes en

las bacterias. Hicieron crecer una serie de cultivos cle E. coli en clif'ercntes
frascos y, después, agregaron bacteriófagos T1 a cada uno. Los fagos destlu-
yeron a la mayoría cie las bacterias, pero alg¡Lrnos mutantes resistentcs a Tl
 Mutaciones 537

Tiempo (h) Figura 16.19 Mutaciones aleatorias

0 y programad¿s. A l¿ izqrierda, se
muestran los result¿dos cbtenidos por
CULTIVO 1 Luria y Delbrück. Dur¿nte el creci-
miento de los cultivos de §. ¡:r:li, se
,: Mutación precoz
producen mut¿ciones que confieren
resistencia al bacteriófago T I de
*I manera aleatoria en diversos momen-
tos, lo que significa que cada cultivo
.,, Ai tiene una cantidad diferente de célu-
las resistentes cuando se agregan los
¿
I culrvo z
fagos. Por lo tanto, se observan
números variables de colonias cuando
: ,; o Mutación más tardía se siembran las bacterias en un
medio sóiido. A la derech¿, se mues-
ll CULTIVO 3 CULTIVO 4
tra el resultado que se habría obteni-
do si se hubieran producido
mutaciones programadas. En este
][
caso, l¿s bacterias resistentes a Tl
$ . &!i"r!;i adquieren sus mutaciones en res-
puesta a la exposición a los fagos Y
8$
I I
¿
cada placa tiene, por lo tanto, una
cantidad similar de colonias.
- ,.,t ,;, . .d EE+-.,.,,,,,,,rr# rtl:tq,. :llllii
':... @

MUTACIONESALEATOBIAS MUTACIONESPROGRAMADAS
Número variable de colonias lgual número de colon¡as
en diferenles cultivos en cada cultivo

puclieron sobrevivir. Éstos fuelon identificados sembrando muestras de cada

iultivo, poco después de la infección pol T1, en agal si las mutaciones que
inclucen resistencia a T1 se produjer¿ln de modo aleatorio en los cultiYos
¿]ntes de agregar los bacteriófagos, cada cultivo contendría una cantidad dife-
rellte de mutantes lesistentes, que dependería de 1a precocidad con que sur-
gió la primera célu1a mutante durante el período de crecimiento (figura
.1 6. 19). Las aparecidas pt'ecozmente -qe dividirían muchas veces y darían ori-
gen a una gran canticlad de progenie resistente en el cultivo al final del perí-
óclo de crecimiento, mientras que 1as surgidas en etapas más tardías datían
ot.igen a sólo ¿)lgunos descenclientes. Por 1o tanto, ciertos ctltrtivos contendd-
an muchas células resistentes a T1 ;i otl'os, sólo pocas. En fotma altertativa,
si las bacterias resistentes suÍgiel'an pol mutación pfogramada sólo ai agle-
gar ei f¿lgo T1, todos los cultivos tendrían cantidades similares de mutantes.
Luda y Delbnick observaron que cad¿l uno de sus cultivos contenía un núme-
lo clistinto cle bacterias resistentes a T1, por'1o qr"re concluyefon que las muta-
ciones ocun'í¿xl cle manera aleatot'ia y no en respuesta al fago T1.

Los estuclir:s de una cepa de E. coli que tiene una mutaciÓn teminadora de
su gen lctcZ sugsríeron por pritnela vez la posibilidad de que |a validez de
la conclusión cle Luria y Delbnick sobt'e las mutaciones cle esta bacteri¿l no
sea universal. La presencia del codón cle tenlin¿lción en lctcZ implica que
estas células son incapaces de sintetizar enzimas $-galactosidasas funciona-
les \,, así, no pueclen utiliz¿ir lactos¿l como fuente c1e carbono y enefgía: por
ende, son auxótrofos de lactosa. Esto no es necesariamente una situación
.l pemanel-lte, porque un¿l céluia podria sufrir una mutacjón que vuelva a
convertir el codón de terminaciÓn en uno que especifica un arninoácido.
Est«:s nuevos mutantes podrían fabricar p-galactosiclasa -y aprovechar cual-
quier lactosa clisponible. Seg"rn los t'esultados de Luria y Delbrück. estas
. irutaciones deber'ían ptoclucirse al azar ¡' no deberían estar iniluidas por la
pl'esenci¿l de lactosa en el medio. Pero se ha demo-§trado que, cuando se
siembran ¿ruxótrofos de lactosa en un medio mínimo que contiene lactosa
como único azúcar -cil'cunstancias que exigen que las bactelias deban
 Capítulo l6 ,t'iulacicnes y reparar-ión del Dl.lA

llllriar a protótrofos de lacros¿r para sobr*.ivir:- el nún:ero de plotótr:rL'i;s

cle lactosa qlie ap¿rrece es sigyrificativamente superii:r' a1 previsto si 1lr-t
nut;rciones f'uesen ¿lleatorias. En oras palahras, algrrnils células presentñ&
r:ruLacir:nes plogramadas ¡, adquie::en e1 can-rbio especílico de la secuenciii
cle Dli:\ necesado para resisril ia presión selectiva.

Estos erpet'imentos sugirieron que 1as bacterias pueden progl'a1lt¿rr mura¿ii:,-

nes cle acuerdo con ias presitlnes selectir¡as a las que son expuestas. Dichc c.,
otra m¿lnet:a, el meclio puede afectar de modo dii'ecto el fenotipo del or.g;uti:.
nro, como sugirió Lal:rarck, en lugar cle operar a trayés de los procesos ¿:lrü-
torios postulados por Darwin. Dadas las implicaciones tan radicales, nu es
sotplendente que los experimenti:s se hayan debatir-lo con detenimiento y se
haya intentado cietectar delictos de diseñr: o explicaciones altematit as dr los
lesultados. Vailaciones clel sistema experimental lucZ han indicaclo quc los
resultados originales son aulénticos y s.: desclibieron eyentos similares en
otras becterias. Se están investigandr: modelos basados en ar;rplificación
gónica en lugal cle mutación selectir.a; también se ha dir:igido la atención a -}¿t
posible patticipación de eventos cle recombinación, conto transposición de
elementos de inserción, en ia gener:ación de mutaciones ploglamadas.

§% -E §i^*&&66.,!Ú4 dai §a*t.n

§ t¡€t §J¡raf4
En vista de los miles de eventos lesivr:s que sufren los genomas toclos los
días, unidos a los errores que ocurten dur¿rnte la replicación del genoma,
es esencial que las células cuünten con sistemas cle repai:ación eficicntes.
Sin éstos, un genoma no podr:ía ntantener sus lunciones celulales básicas
durante más de algunas horas antes cle que sus genes fundamentales sean
desactivacios por: daño del DNA. De modo similar', los linajes celulares acu-
mularían ei'rol'es c1e replicación en una tasa tal que sus gl:nolnas se tü:ra-
rían disfr.rncionales después de pocas divisioires celulares.
La nrayoría de las céiulas tienen cuatro categoúas difei'entes de sistenra
de leparación dei DNA (figura 16.2$:
,g Los sisternas de reparación directa (sección 16.2.1), como su noir-
bre sugiere, actúan directamente sobrc los nucleótidos dañarlos l
vuclven a rrstablecer ia estructura original cle cada uno.
(A) Heparación directa
Figura I6.20 Cuatro categorías del
sistema de reparación del DNA. f'T1:,*r,,r,,rhY
; i ¡ l: l,¡ i'. i i i ri l!lf¡ili¡il:1il

a.1t:\:.ratJ...)

(B) Reparación por escisron

tt¡r¡rttIl¡¡rti
t!ttl,t¡lttlttl

f",i*.*!*ótid* Segmento DNA

d*¡:xCr: escindldo resintetizado

(C) Reparación de errores de apareamiento

.#
l,ittrti,:iilli + lllt¡{¡¡ }¡ti ffif11"fff r rii'f
t.........-- .i
Segmento DNA
escindido resintetizadü

{D) Unión por el exiremo no homólogo

Hoture bicatenaria
 fieparación del DNA

L;r reparación por escisión i sección 1b.2.2) consiste en la escisión c1e ! ,, . .-. -. -....

L1n segmento del polinucleótido que conriene un sitio dañado, segui- l

,,ii¡ de nlleva síntesis de 1a secuencia nucleotídica corr"ecta por una .r.l ¡ t.l; r ¡ I I I t I I I i i I I I I ¡: ¡ I I I r

i.)IA polinlerasa. I
I
¿
La reparación de errores de apareamiento isección 16.2.3) cor.r.ige
elfüres c1c replicación, lambién en este c¿iso pol" escisión de una I ' \ *DNAligasa
cxtensión del DNA ntonocarenario que contiene e1 nucleótido erró- ffi
III¡IIIIIII III,IIIIIIIIII¡.I
n*ü )i pol' reparración ulterior clel hiatr: resuitante.
I
I
* La unión por el extremo no homólogo (sección 16.2.4) se utiliza ¿
para repal'ar rotul'as bicatenarias.
ril r¡il rtril r;rt{t i tllil il tl
Se repara la muesca
La ma-voría de los olganismos, si no todos, también tienen sistc-mets que
les penniten replicar regiones dañadas de su genorna sin reparaoión pre-
via. Estos sistemas se examinan en la sección 16.2.5 y en la sección
16.2.6 se estudian las enfermedades humanas secundarias a defectos de Figura 16.21 Reparación de una
los procesos de reparación del Dl\A. muesca por DNA ligasa.

I6 :. i Los sistemas d* reperfrc¡ón direcre refilenan

t?"11:t5{AS V CSrrip*n ril{tr¡fi¿:s tim$S *-
#*
;;d¿$¡*i¿** * -"1;; - il.í-?t¡ojü;-
La m;ryoda dc los tipos de daño dei DNA que son causaclos por mutáge-
nos químicos o físicos (sección 16.1.1 ) sólo se pueden reparar por escisión
del nucleótido dañado, se¡uida de resíntesis de una nueva ertensión de
DlrlA, co1l]o se muestra en la figura 16.208. Sólo algn:nos pocos tipos cle
nucleótido dañado pueden ser pasibles de reparación directa:
¿ Las muescas pueden ser leparaclas por una DN¿\ ligasa si todo Io que
ha sucedido es la rotura de un enlace fosfodiéstel', sin daño cle ios
glupos 5' foslato ni i' oxhidrilo cie los nucleótidos a ui-to y otro ladr:
de la muesca (figura 16.21). A lnenudo. éste es el caso cle l¿rs illues-
cas secundarias a los efectos de r.acliación ionizante.
* Algunas folmas de daño por atrquilación son clir.ectamenre r.ever-si-
bles por enzimas que transfieren el grupo alquilo de un nucleótido a
sus propias cadenas polipeptídicas. Muchos organismos diferentes
tienen enzimas con esta capacidad; por ejempio, la enzima Ada de
E. calí, que p¿trticipa en un proceso de adaptación que puede activar.
csta bacteria en respuesta al daño del DNA. Ada elirnina los grupos
alquilo unidos a los grupo-s oxígeno en las posiciones 4 de timina y 6
de guanir-ra y tar:rbién puede reparar enlaces fosfodiéster que han
sicio metilados. otras enzimas de reparación de la alquilación presen-
tan especificidades mírs restlingidas, por ejemplo la LGMT humana
( o5-rnetilguanina-DNA ne tiltransferasa) que,
cornü sugiere stl rlom-
bre, sólo elimina grupos alquilo de la posición 6 de guanina.
e Los dílneros de ciclol¡utilo son repalados por un sistema directo
dependiente cle 1a luz clenon"rinado fotorreactivación. En E. coli, el
proceso implica la enzima DNA fotoliasa (llamada con il]ayo1.
conección desoxirribodipirirnidina fotoliasa). AI ser estimulada por-
luz con una longitud de onda de 500 a 500 nnr, la enzima se une a
riímeros de ciclobutilo y los vuclve a conveltir en los nucleótidos
monomér'icos originales. La fcltorreactivación es un tipo de repara-
ción difundida, pet'o no uniyersal; se la ha detectado en muchas bac-
terias, aunque no en todas, y tan:rbién en algunos eucariontes, incluidos
ciertos vertebraclos, pero estir ausente en los seres lrumanos y ot1.os
m¿lnlíf'eros placentarios. un tipo similal de fotorreactivación irrplica
a la (6-4) fotoproducto fotoliasa, que repara las lesic¡r-res (6-4). Ni E.
 "Y'
Capítulo.te tulutaciones y reparación del DltiA

(.4) Elirninacién de una base dañada por DNA glucosilasa

Figura 16.22 Reparación Por esci-
sién de bases. (A) Escisrón de un '---L.l-12 ffi
*f**
nucieótrdo dañado por una DNA I ^
glucosilasa. (B) Esquer:'¿ de la ví¿
-e reparación por escisión de bases. \1
l-- "__l
,r !).**.
-'--'"
En el texto, se ciescr,ber. !É:s cnes
I
(-./
r "'r v'
o
alternativas de la ví4. I

O:P-O-CH, {*"¿.^;:"! glucosilasa

O:P-O,CH¿
" 'l
DNA I
o'r)i\__-Jr
tt-u-i
d
^_
_O*
i\---l
tt 1l I

U o
l-
I

O:P-O-CH¿ :r-u-uñ, r h" :4"M

§,'i&ftdl
I
,rol
o ^-
't-]
i\ ,/1
'

(B) Bosquejo de la vía

mn-i-rrrrn'Tñ, TTTnTTT-n-rn

\ AP endonucleasa. posiblemente con

\ una fosfodiesterasa
\ 2¡
Tq*"mn-fr,nT, fll]-fnnn-ff
\ DNA Polimerasa +
\ otlR iigas,
\
ll¡lllllllllllllrrlili¡r::li

coli ni los seles humanos Cuentan Con esta enzima, pelo estíl p1'csen-
te en oti'os cliversos o1'ganismos.

; S"3.x .W,xpr,rxxa*xxz p
x *s*axxtstz
I-os tipos directos de rever:sión del daño comentados antes son impor-
tantes, pero fofman un componente muy menol: de 1os mecanismos clc
reparación del DNA de |a mayoría de 1os organismos. Este puntü es
ilustrado pof la secuencia del genoma humano, qllis parece contellel
sók: un gen qr-re codifica una proteína invcluci:ada en ia repat'ación
di|ecta (el gen lt'tcilt1), pel'o que tiene no rnenos c1e 40 gene;c pal:¿r
componentes cle 1¿rs vías de reparación por escisión. Estas vías pelt*-
llecen a clos categofias:
,:a La reparación por escisiótr de bases ii-nplica la eliminación cle una
base nucleotícliia clañacla, la escisión cle un fiagmento breve del poli-
nucleótirlo alrededor clel sitio AP ¿rsí creaclo y la nueva sínte-cis a
ca1'g0 de una DNA Polimcrasa.
."b La reparación por escisión de nucleóticlos es similar a la re para-
ción por: escisión cle bases. pet:o no es pl'ecedida cle la eliminación
cle una base dañada y puede actu¿lr sobre zonas cle DI\'IA que pre-
sentan claño míis stlstancial'

Examinal'etllos, a su tu1'no, cacia una c1e csta-s vías.

 Rryaración delDNA s¡tl

Cuadro 16.3 Ejemplos de DI\A glucosilasas humanas

DNA glucosilasa

MBD4 Uracilo
MPC Etenoadenina, hipoxantina, 3-metiladenina
NTH 1 Citosina glicol, dihidroumcilo, formamidopirimidina, timina glicol
OCCI Formamidopirimidiná, 8-oxo§uanina
SMUCI Uracilo
TDC Etenocitásina, uracilo
UNC Uracilo, 5-hidroxiuracilo

i-l ürii;i*:-; rJ* *i:;;; i"r's#r# s;r;rtir)i t¡:*: #¡: ¡;i,r,ll*ia#i:s d,:,i*i*:
La escisión de bases es el menos complejo de los diversos mecanismos de
reparación que iinplican la eliminación de uno o más nucleótidos, seguida de
Itl¡-;cl**tid* dsñad*,
nueva síntesis de DNA para cenar el hiato resultante. Se la utiliza para repa- q*e sáus§ $lslcrsisn d* ia hólice
rar muchos nucleótidos moditicados, cuyas bases han sufiido daño relativa-
mente menor secundario a, por ejernplo. agentes alquilantes o radiación
ionizante (sección 16.1.1). El proceso es iniciado por una DNA glucosilasa
que degrada el enlace p-N-glucosídico entre una base dañada y e1 componen- I Unión del recortador
te hidrocarbonado del nucleótido (figura 16.22A). Cada DNA glucosilasa
I uvrRe

tiene una especificidad limitada (cuadro 16.3), deterrninada por el espectro

c1e nucleótidos dañados que pueden ser reparados por la r,ia de escisión de
bases en una célula. La mayoría de los organismos pueden manejar bases de-
s¿lminadas, como uracilo (citosina desaminada) e hipoxantina (adenina de- r Partida de UvrA
saminada); productos de oxidación, como 5-hidloxicitosina y timina glico1; y I union de uvrc
bases metiladas, como 3-metiladenina, 7-metilguanina y 2-rnetilcitosina.
Otras DNA glucosilasas eliminan bases nomrales como parte del sistema de
reparación de errores de apareamierrto (sección 16.2.3). Se considera que la
mayoría de las DNA glucosilasas que interwienen en la reparación por esci-
¡ Escisión del segmento
sión de bases se difunden a 1o iargo del surco menor cle la doble hélice de I lcortes por UvrÉ y UvrC).
Dl'lA para buscar nucleótidos dañados, pero algunas pueden estar asociadas I eliminación de la por
cadena
cc,n las enzimas de repiicación.
I simple escindida la
{ oNÁ heticasa il
UvrB puentea el hiato
Una DIIJA glucosilasa elimina una base dañada "lanzando" la estmctura fuera 5' \--: 3'
cie la doble hé1ice y, después, desprendiéndola del polinucleótido. Esto crea
un sitio AP, o sitio sin base, que es convertido en un hiato de un solo nucle-
ótido en el segundo paso de la vía de reparación (figura 16.22F-). Este paso ¡ DNA polimerasa I +
se puede llevar a cabo de diversas maneras. El método convencionai utiliza I DNA ligasa
una AP endonucleasa, como 1a exonucleasa III o la endonucleasa IV de
E. coli, o APEI de los seres humanos, que cort¿l el enlace fosfodiéster del lado
5' del sitio AP. Algunas AP endonucieasas también pueden eliminar el azú-
cat'del sitio AP que es todo 1o que queda del nucleótido clañado, pero otras
carecen de esla capaciclad y, por 1o tairto, trabajan junto con una fosfodieste-
Figura 16.23 Reparación por escisión
rasa independlente. Una r.ía altemativa para convet'tir el sitio AP en un hiato de nucleótidos de parche corto en
aprovecha ia actividad de endonucleasa que tienen algunas DNA glucosila- Escherichia coli. Se muestr¿ la distor-
sas, que pueden practicar un corte del lado 3'del sitio Al probablemente al sión de la hélice por el nucleótido daña-
n"¡ismo tiernpo en que se elimina la base dañada, lo que es seguido, también do, porque se considera que ésta es una
en este caso. de ia eliminación del azúcar por una fbsfodiesterasa. de las señales de reconocimiento para el
recortador UvrAB, que inicia el proceso
de parche corto. Véanse en el texto los
El hiato dejaclo por el único nucieótido es rellenado pol una DlrlA poli- detalles de los eventos que se producen
merasa mediante apareamiento de bases con la base no dañada de la otra durante la vía de reparación.
cadena de la molécula de DNA, para garantizar que se inserte el nucle- Abreviaturas: A, UvrA; B, UvrB; C UvrC.
 Capítulo l6 tulutaciones y reparación Cel DhlA

ótido correcto. En E. coli, el hiato es llenado por 1a DliA polimerasa I1',

en ios rnamíferos, por la DNA polimerasa P (véase cuadro 15.2). La
levadula parece ser atípica en cuanto emplea la principal enzima de
replicación, DNA polimerasa 6, para este propósito. Después de rellenar
el hiato, el enlace fosfodiéster linal es sintetizado por una DNA ligasa.

L: :-pc:;.::io:s p:r [-t:,iiü,-l C:,:";;';¿i',-: '> s- uf --,-'i-i'-. -- ': '

-:ac ¡ncq ..xl.,n ini

I"r-"., (i j dAn,-.
La reparación por escisión de nucleótidos tiene una especificidad mucho má:
amplia que el sistema de escisión de bases y puede manejar fotmas más extre-
mas de daño, como enlaces transversales intracatenados y modi{lcación de
bases por unién de grupos químicos gpandes. Asimismo, puede corregir
dímeros de ciclobutilo mediante un proceso de reparación "o§cura", siempre
que esos olgernismos no presenten un sisterna de fotorreactivación (como los
seres humanos) con un medio de reparar este tipo de daño.

En la reparación por escisión de nucleótidos, se escinde un segmenlo de

DNA monocatenario que contiene el nucleótido o los nucleótidos daña-
dos y se lo reemplaza por Dl{A nuevo. Por 1o tanto, el proceso es simi-
lar a la reparación por escisión de bases, excepto que no es precedido
por eliminación selectiva de bases y se corta una extensión más larga del
polinucleótido. El ejemplo mejor estudiado de reparación por escisiÓn
de nucleótidos es el proceso de parche corto de E, coli,llamado así por
que Ia región del polinucleótido escindidr¡ y "emparchado" despuás es
bastante co1'to, en general de 12 nucleótidos de longitud'
Nucfe*tido tlxll**o,
1116 r*llsá di*t*rsi$n *e la háli** La reparación de palche colto es iniciada por un complejo multienzimáti-
co clenominado UyTABC endonucleasa, a Yeces tar¡rbién llamado "escinu-
I

llllif,fl¡-r::-¡ *',-rrrftl1-ñfl
.-:::-*:Lgr:Ll ' *'
,ill:irr"'
Región ,/
desnatwalizada'
I Escisión de la
l región dañada
' abajo del nucleótido dañado y la UvrC efectúa el segundo corte en el octa-
I DNA polimerasa +
t oNR ligasa
T}]i111 TTIrmTff].nTfT ir', T]l-l-fl*f 1 i j
Figura I6.24 Bosquejo de los even-
tos que participan en la reparación
por escisión de nucleótidos en los
eucariontes. Las endonucleasas que
eliminan la región dañada practican
cortes específicamente en la unión
entre regiones monocat?narias y bica-
ten¿ri¿s de una molécula de DNA. Por
lo tanto, se considera que el DNA se
desnaturaliza a uno y otro l¿do del
nucleótido dañado, como muestra el
diagrama, quizá como resultado de la
actividad de helicasa de TFllH.
cleasa". En 1a prirnera etapa de1 proceso, un recortador que comprende dos
proteínas UwA y una copia de UvrB se une al DNA en el sitio dañado' No
se sabe cómo se reconoce el sitio, pero la arnplia especificidad del proceso
indica que no se detecta en forma directa cada tipo de daño y que el com-
plejo debe buscar un atribr-rto.más general de daño del Dl'{A, como la dis-
torsión de la doble hélice. UvrA quizá sea la parte del complejr: más
involucrada en la localización del daño, pues se disocia una vez que se ha
encontradr¡ el sitio y ya no participa en el proceso de leparaciÓn. La parti-
da de UvrA permite que se una UvlC (figura 16.2i),1o que forrna un clím,:-
ro de Uvrl3C que I'ecorta el polinucleótido a ambos lados clel sitio clañ*cit¡.
La UvrB practica el primer corte en e1 quinto enlace fosfodiéster corrienl*
vo enlace fosfodiéster corriente ari-iba, 1o que determina una escisión c1e 12
nucleótidos, allnque hay cierta variabilidad, sobre todo en el sitio de corte
de UvrB. Después, Ia DNA heiicasa II elimina el segmento escindiclo, en
general como utr oligonucleótido intacto, presumiblemente desprendiéndo-
1o al romper los pares de bases que 1o unen a la segunda cadena. En esta
etapa, también se desprende UvrC, pero UwB se mantiene en el lugar.y
puántea el hiato generado por 1a esciiión. Se considera que la [JvrB unida
ie impide a la re§ón r,-tot o"at"t aria expuesta fomar pares de base-' con sí
misn-la, aunque la función de UvrB podría ser impedir el daño de esta cade-
na o, quizá, dirigir la DNA polimerasa al sitio que debe repararse. Cr:mo
en la ráparación por escisión de bases, la DIJA polimerasa I rellena e1 hiater
y la DNA ligasa sintetiza el último enlace fosfodiéster.
E. coli tanrbién cuenta coÍI Lrn sistema c1e reparación por escisión de nucleó-
tidos de parche largo en el que intenienen proteínas Uvq pero difiere en que
el fragmÁnto de DNA escindido puede ser de hasta 2 kb de longitud. No se
ha estudiado tan bien la reparación de parche Iargo ni 5e conoce en dctalle et
 Reparación del DNA

proecso, pero sc prcsume que actúa en fürmas más extensas de dañ<¡, quizás t-t
LI
MOLÉCULA MADRE
,.r regiones donde han sido mr:dificados glnpos de nucleótidos más que l--t
.rl Totaimente metilada
rr*clu,ótidos individuales. En los eucariontes. el proceso de reparación por trI
LI
F-t
csei-cién de nucleótidos también se denomina "de parche largo", pero deter- >l--l{ ---. *,t6*l; *"i*ar!:,
-
mina el reemplazo de sólo 24-29 nucleétidos de Dl.lA. De hecho, no hay nin- 'Fl.
gtin sistema "de parche cofio" en los eucariontes y la denominación "de Fi
EI
parche iargo" se utiliza para distinggil el proceso de la reparación por esci- LI
sión de bases. El sistema es más complejo que en E. colí y las enzimas perti-
L¡
I:t
>Fl<
neí}{es no parecen ser homólogas de las proteínas Uw: En los seres humanos,
pañicipan no menos de 16 proteínas y el corte corriente abajo se practica en FJ

la nrisma posición que en E. aslí -el quinto enlace fosfodiéster- pero con un
colte con'iente ariba más distante, que da por resultaclo una escisión más
larga. Ambos cortes son practicados por endonucleasas que atacan DNA
monocatenario, especí{rcamente en su unión con una región bicatenaria, 1o /\
que pennite presumil que, antes de que se efectúen ios cories. una helicasa
ha desnaturalizadr: ei Dl'lA alrededor del sitio dañado (figura 16.24). Esta FI
trI FI
trI
MOLÉCULAS HIJAS
El DNA nuevo todavía
acdlidad depende, por lo menos en parte, de TFIIH, uno de los componen- rt rt
r.i tt no está metilado
tes del complejo de iniciación RNA polimerasa II (véase cuadro 11.5). Al
pr:incipio, se presupuso que TFIIH sólo desempeñaba un doble papel en la ,EI EI.
LI

l.t-l
L*I

L-l{
célula y que funcionaba de modo independiente tanto en la transcripción t-l
FI
L-l
FI
como en la reparación; ahora se considera que hay un vínculo más directo Ft
F¡ ts¡
F'I
entre ambos procesos. Este concepto es avalado por el descubrimiento de la t
i-- t--
rt
L-¡
tlL-i I

'tciI
reparación acoplada a la transcripción, que repara algunas fbrmas de daño
de las cadenas rnolde de genes que están sometidos a transcripción activa. E1
hl*
flFI

tl
primer tipo de reparación acoplada a la transcripción descubierto fue una F]

versión modificada de [a escisión de nucleótidos, pero ahora se sabe que la

reparación por escisión de bases también está acoplada con 1a transcripción.
Estos descubrimientos no implican que no se repalen las legiones no trans-
critas del genoma. Si bien los procesos de reparación por escisión de bases
prctegen de daño a todo el genoma, es completamente lógico que existan L-I LI
MOLÉCULAS HIJAS
mecanisrnos especiales para r.lir:igir los procesos a los genes que están siendo rt r.l Tolalmente meiiladas
transcritos. Las cadenas molde de estos genes contienen la infomración bio-
lógica del genon-la y mantener su integridad clebe ser la máxima prioridad de
FI
r¡
*Flr
FI
rt
los sistemas de repalación.
nFI"
}Fl<
¡ El{
l--t l-t
Ft l-l
I #.?.3 Íteparaci*ys *x §ms ern*r'8§ {§# áaper*¿}§3?x*xxt*: rl ri
{#rr*{{**rN c§* *§r*{*§ d* r,mp§§**r,a*'xa pr"-1,{ } fl{
Cada uno de ios sistemas de reparación que hemos estudiado hasta Fl
F]
["-l
F¡
ahr:ra -reparación directa, por escisión de bases y por escisión de nucie-
ótidos- reconoce el daño del DNA causado por mutágenos y actúa sobre
éste. Esto signilica que buscan estructrlras químicas anolmales, collü
nuoieótidos modificados, dín:eros de ciclobutilo y enlaces transvelsales Figura 16.?5 La metilación del DNA
intracatenarios. Sin embargo, r'ro pueden corregir eltores de aparea- recién sintetizado en Escherichio coli
miento secundalios a erol'es en 1a replicación, porque el nucleótido ma1 no se produce de inmediato des-
pués de la replicación, lo que repre*
apareado no presenta ninguna aiteración sólo es una A, C. G o T que ha senta una ventána de oportunidad
sido insertada en la posición errónea. Como estos nucleótidos son exac- para que las proteínas de reparación
tamente i¡¡:ales a cualquier otro nucleótido, el sistema cle reparación de de errores de apareamiento reco:
errores de apareamiento que corige errores de repiicación no debe nozcan las cadenas hijas y corrijan
detectar el nucleótido mai apareado en sí mismo, sino la ausencia de los errores de replicacién.
pares de bases entre las cadenas madre e hija. Una vez hallado uñ error
dc apareamiento, el sistema de reparación escinde parte clel polinucleó-
tido hijo y rellena el hiato, en forma similar a la observada en la repara-
ción por escisión de bases y de nucleótidos.

El esquema comentadr: no responde a una pregunta importante. La

reparación debe efectuarse en el polinucleótido hijo porque la cadena
recién sintetizada es la que presenta el error: el polinucleótido parental
§{¡t Capítulo l6 Mutacicnes y r-eparación del Di\A

',i 'i; ifr'i"e lñ"r#f rli: ic ' ] ..lr:uñá -'.il

i:
tiene la s¿cuencia comecta. ¿Cómo sabe el sistema de reparación cuál es :

3',
cadacadena?EnE,coli,larespuestaesquelacadenahijaestír,ene-it3
5',
etapa, hipometilada ), por 1o tanto, puede distinguirse del polinucl:'.rti-
Unión de MutH clo parental, que presenta un complemento completo de grupos metilo.
y MutS
El DN.A de E. ¿'oli es metilado por la actividad de la DNA adenina meti-
lasa (Dam), que convierte adeninas en 6-metiladeninas, en 1a secuencia
§ii t:§ 5'-GATC-3', y'1, nN,+. citosina metilasa (Dcrn), que c,:nvierte citosin:s
en 5-metilcitosinas, en 5'*CCAGG-3'y 5'-CCTGG-3" E,stas metilacio- ,..,,
rUutt-l corta el DNA nes no son mutágenas y los nucleótidos modificados tienen las misme¡ ',:..."
I propiedades de apareamiento de bases que las versiones no modificada¡. lil,,i¡¡.,
l

Hay un fetraso entre la replicación y la metilación del DNA de la cade- ,l",rrrr

. -". .r-... t=..-*-- na hijal es durante esta ventana de oportunidad que el sistema de repa- '''::::':
ililtiiiiillillt,
&
IililLrlllIilllr ración bare el Dl"{A para detectar errores de apareamiento y efectúa las .,., :
- Desprendimiento y
correccionesnecesariasen1acadenahijahipometi1ada(figura16.2;}'
I eliminación de
I la cadena
E. coli tiene por lo menos tres sistemas de reparación de errores de
apareamiento, denominados "de parche largo", "de parche colto" y
"de parche muy corto", nombres que indican las iongitudes relativas
cle los segrnentos escinclidos y resinterizados de DNA. El sistema de
parche largo reemplaza hasta una kilobase o más de DNA y requiere
1as proteínas N{utH, i\{utl- y MutS, así como la DNA helicasa II, quc
mencionamos durante la reparación pol escisión de nucleótidos.
MutS reconoce el error de apareamiento y Mutl-{ distingue las dos
r DNA oolimerasa I
cadenas pol unión a secuencias no metiladas 5'-GATC-3' (figura
J' + oNÁ tigasa 16.26). No se conoce con claridad la función de MutL, pero podr:ía
coordinar las actividades de las otras dos proteínas, cie manera que
I t!l ti trttlt ttlt I !,¡ ltt ¡I,¡ tt¡,¡r MutH se una a 5'-GATC-5'no metilada sólo en la vecindad de sitios
de errc¡res de apareatliento reconociclos por MutS. Después de la
unión, NIutH corta e1 enlace fosfodiéster inmediatamente corriente
arriba de la G en la secuencia de metilación y la DNA helicasa Itr des-
Figura 16.26 Reparación de erro- prende la cadena simple. No parece haber una enzima que corte la
res de apareamiento de parche
largo en Escherichia cali.
cadena corriente abajo dei error de apareamiento; en cambic, la
Abreviaturas: H, MutH; S, MutS. región monocatenaria desprenciida es degladada por.' una exonucleasa
que sigue a la helicasa y supera el sitio del error de apareatniento.
Después, el hiato es rellenado por la DNA polimerasa I y la DNA liga-
sa. Se considera que se producen eventos similares durante la repara-
ción de parche corto y de pat'che muy corto de erroles de apareamiento;
la difer"encia reside en las especificidades de las proteínas que feconocrn
estos errores. El sistema de parche cotto, que detet'mina la escisiílrl de
un segmento de menos de 10 nucieótidos de longitud, conrienza üüiltl-
clo MutY leconoce un erl'ol' cle apareamiento A*G o A*C, y el siste-
ma de reparación muv colto corrige erroles de apaleauliento C*T.
que son reconocidos por la endonucleasa Vsr'

Los eucariontes tienen homólogos de las proteínas MutS y N{ut1- de

-ffi rt¡¡ f'ñ-rT-rñ'm-r1-Í-T-
¡Lilt{rriltt!trtttt rtlrr E. colí, y es probabie que sus procesos de reparación de errores de apa-
reamiento aitúen de manera siruilar. La única diferencia es la ausencia
+
I Proteínas PAHPl de un hornólogo de NIutH, li: que sugiere que ia rnetilación podría no
.¡' ser el mátodó empleado para distinguir entre los polinucleótidos
'iilil.i i; parental y filial. La n.retilaclón ha sido implicada en Ia repat'aciÓn de
¡ Reparación erro.*u cle apareamiento en céiulas de. mamíferos, pero el DliA de
tI algunos eucariontes, incluidas moscas cle la fruta y levaduras, no pre-
rfnllfrll.].ñT senta metilación extensa. Por lo tanto, se piensa que esto-c organismos
Trn-rTTrfi-n TT ; ; ; 1 ;,Al
deben recurrir a un méti¡do difelente para identificar la cadena hija'
Las posibilidades son una asocjaciÓn entle Ias enzimas de reparación
y el conrplejo de replicación, de inoclo que la reparziciÓn esté acr:plada
Figura 15.27 Reparación de una lon la sintésis ¿e bNa o el emplet, de p.ot"ínas cle unión al DNA
ruptura monocatenaria. monocatenalio que marquen 1a cadena madre.
 Reparación del DNA

(A) Proceso de reparación mediante unió¡ por. {B} Estructura del cornple.io Ku-DNA Figura 16.28 Unión por el extremo
er ¿xt:emo no homólogo
no homólogo (NHEI) en seres
§otura blcatenaria
humanos. (A) Proceso de reparación.
',f;::".ñ En la NHEJ, pafticipan también otras
i l¡l
prote.ínas no mostradas en rr Jiagra
I Unión de pr61si¡¿5 [<u m¿. Estas son l¿s proteincintsas ATl,1
¿ y ATR (sección 15.3.2), cuya funcién
Proteínas Ku principal puede ser señalar a l¿ célu1a
que se ha producido una rotura bic¿-
:r: ffimr-, tenaria y que el ciclo celular deberá
detenerse hasta reparar la rotura. 5i la
célula ingres¿ en mitosis con un cro-
froceso de reparación
I mosoma roto, se perderá parte de
ese cromosoma, porque sólo uno de
ios fragmentos contendrá un centró-
mero y los centrómeros son esencia-
DNA-PK";-*S les para la distribución de los
§
cromosomas en los núcleos hijos
&
durante la anafase (véase figura
3.15). (B) Estructura de un complejo
XHCC4 Ku-DNA. A la izqurerda, se presenta la
l vista desde arriba del extremo roto de
fI
la doble hélice de DNA, y a la dere-
'- ]'ffir*rrfi1*ñ*rfi'rm'r - -
cha, la vista lateral, con el extremo
DNA reparado
roto de la molécula de DNA a la
izquierda. Ku es un heterodímero
compuesto por las subunid¿des Ku70
y Ku8O, los números indican la masa
I&"?"s $?*parxa§** eÍ* r*Ca*r;§s de 3 mru.q molecular en kDa. Ku70 es de color
rojo y Ku 80, de color amarillo" La
Un¿ rotul'a monocatcnalia en una molécula cle DNA bicatenario, como la molécula de DNA se ilustra en gris.
pror.,ocada por :llgunos tipos de dañr: oxidativo, no plantea un problema Reimpreso con autorización de Walker
critico a Ia cé1ula, pues la cloble hélice conserva su integridad global. La et al. (2aO1) Noture, 412,607-614.
cadena sirnple expuesta es revestida por proteínas PARP1, que protegen de
roturas a la cadena intacta e impiden que ésta participe en eventos de
recon:binación no deseados. Despuós, la rotura es rellenada por las enzi-
mas que intervienen en las vías dó reparación por escisión (figura 16.27).

Una lotura bicatenaria es más seria, porque esto convielte ia dr¡ble héli-
ce original en dos fi'agmentos independientes, que deben reunirse de
nuevo pai:a repararla. Los dos extremos rotos deben ser plotegidos de
d*g-r'adación adicioi-1al, que podría ptovocar la apalición de una nluta-
cirin por deleción en el punto de rotura reparado. Asimismo, los proce-
sr'rs dc leparación deben gal'antizar la unión de los extremos correctos:
si hay dos cromosomas rotos en el núcleo, se deben reunir los pares
apropiados para restablecer 1as estructuras originales. Estudios experi-
mentales de células de ratón incilcan que es difícil lograr este resultado
y tlue si dos cron]osomas se l'ompelt, es relativanrente frecuente la repa-
ración en'ónea, que crea eslructulas híbridas. ¡\un cuanclo haya un solo
crümosorna roto, todayía existe la posibilidad de que se pueda confun-
dir un extrer:no natulal de un cromosoma con una rotura y se practique
una rep¿i1'ación incorrecta. Se conooe este tipo de error, pese a la presen-
ci¿l cle proteínas especiales de unión a telómetos, que marc¿tn los extre-
mos natr1l'ales de los cromosotras (secciótt 7 .1.2).

Las roturas bicatenadas se cleben a Ia exposición a ladiación ionizantc y

algunos mtrtágenos químicos; tambión pueden sobrevenir durante la
replicilción del DNA. La niayoría de los organismos, si no todos, cuen-
tan con dos vías distintas de reparación de roturas bicatenalias. La pri-
tnera implica r"ecombinación hornóloga, y pospondremo§, por'1o tanto,
nuestl'o exalrien hasta después de haber estudiado la vía bírsica de
recombinaciór:r homóloga en el capítulo 17. E.l segundo sistema se deno-
 Capítulo l6 tu'lui¡ciones y rep,ri¿ción ilel Dl.:A
.-'.-r:--:-§':'::'-'
j@aa¡¡J¡¡&Tffi,@
¡ i,,,r,rJ(j r'l l t¡ _ 1_L!l.r,..,.r ',,.J, | | r \-¡
:i.,ri:ltti
i,. :i::t:ir.
.,-q'.."*,*".., , ,,J' ,..i:r.
I i I i i i.i i i i i i i i
Errores de replicación..
f f ,f I I f r f ú1r r ¡.i rr s+
f.1ry+-dr:tr*"r4.4!iry*ry'I
Figura 16.29 Respuesta SOS de
Escherichía coli.
DNA polimerasa
mina unión por el extre§ro no homólogo {frorrhornologous end-joing,
ll I
NHE|. Estudios de líneas de cólulas humanas mutantes, que han per,
üritido iclenti{lcar v¿irios conjuntos de genes que participan en e1 prr.:ce-
DNA mclde so, han estimulado el avance en el conocirniento cle 1a hlHEl. Estos genes
muy daiiado
especifican un complejo proteico de múltiples componentes. que dirige
I lniciación de la una DNA ligasa hacia la rotura (figura 16.28A). El complejo compren-
I respr.:esta SOS de dos copi¿rs de la proteína Ku, un¿l de las cuales se une a c¿td¿t extre-
DNA polimerasa V
mo del DNA roto. Las proteínas Ku sók: se pueden unir a extrcmor
cortados, no a ias regiones internas cle una molécula de DNA, porrlul
ésta debe encajar primero en un bucle k:rmado por la a-sociación de la:
dos subunidades que componen cacla proteína Ku (figura 16.2c38). La,c
Proleínas RecA proteínas Ku inclividuales tienen afinidad entle sí, io que significa que
los dos extl'emos rotos de la molócuia cie D|.íA son aproximaclos. Ku se
I Síntesis de DNA une al DNA en asociación con la ploteincinasa DNA-PK¡5, que acriva
I Proclive a error
una tel'cera proteína, XRCC4, que interactúa con la DI"IA ligasa IV de
r¡-ramíferos y dirige a esta ploteína de reparación a la rotura bicatenada.
\ Al principio, se pensó que la NHEJ estaba limitada a 1os e¡-rcariontes.
r¡ r +
r¡ *n,
("
-&útsú pero búsquedas en bases de datos de proteínas han revelado hr:mólogos
,t
"-_-,--_:::::;;./ bacterianos de las proteínas I(u de mamíferos 1, estuclios experirnentiiles
han indicado que éstas ¿ictúan iunto con ligasas bacterianas en una yer-
sión simplificada clel ploceso de reparación cle 1'oturas bicatenarias.
?fr"?"§ Pe***tea: d*§ s§*** d*3 ffi*'*& **srms*te §x
r*pli ca ci i.!r'r tlel genon:*
Si una región del genor-na ha sufriclo daño extenso. es concebib,le que k:s
procesos de leparación se ve¿rn clesbordados. Entonces, la célula enfren-
t¿r tlna clura opción: morir o intentar replicar la región dañada, ar:nquó
esta replicación pueda ser proclive ¿r et:rores y originar molécr"rlas hijas
nrutadas, Ante esta instanci¿r, las células de E. rcli siempre eiigen la
segunda opción e inducen uno de 1os vados proceclirnientos de erlergcn'
cia para puentear sitios de claño inpoltante.
r::sp.;*ií¡: 5*§ t:5 tlti{; ¡:t*;!id::
l.,r: i* . q.,,,.;'".;r t } i. i'tt r:úpi;.';,,'
{i;{jrJ'J *l q*n*x:;: *st,; {§r:fr{}*;:
El niejol estudiado c1e estos pl'ocesos c1e puenteo forma parte de la respues-
ta §O§, que posibilita que una célu1a de l::. coli replique su DNA, aunqur
los polinucleótidos molde contengan sitios AP o dimeros cie ciclobutik¡'r'
otros fbtoproductos resultantes cle la exposición ¿r mutágenos quínriccs o
racliación UV 1o cual, en concliciones nr:rmales, bk:quearía o pol1o nlenos
demolar'ía el complejo de rcplicación. El plrenteo de estos sitios erige la
construcción de un mutasorna, que colxprende el complejo Unluü'rC
iclenomin:rdo tanlbión DNA polimerasa Y un lecortador fbtrnado por cl,:s
proteínas UmuD' y ul"l¿] copia de UmuC) y varias copias de la proteína
§"ecA. Esta última es, funclamentallnente. una pt'oteína de unión a1 DNA
monocatenario que desenrpeñ;r nufflerosos papeles en la leparacior ¡ h
lecombjnación del DNA. En este sistema de puenteo, IlecA reyiste las
-que
cadr-nas pclinr"rclcotídicas clañadas. io permite qr-re el complejo
{JnruI}'rC desplace a la DNA polimerasa lil y que la síntesis cle Dfi¡l
sea pi:oclive a errc)res. hasta que se ha superado ia región dañacla y la DNA
polimerasa III pueda retornal'el proceso (figura 16.29)"
Además de actuar como una proteína cle unión al DNA monocat.rr¡t'it'
c¡ue {avot'ece e1 proceso de puenteo clel mutasoñ.ra, RecA cumple una
seguncla función como activadola c1e la respuesta SOS gener:al. Señales
químicas (todavía no identi{icadas) que indican la presencia cle ciaño
w'
''
l'r'',,

Reparación del DN,{

,i.
:t -

extenso del D|,iA estimuian esta proteína. En respr"resta, RecA degrada,

*n fbrma directa o indirecta, una serie de proteínas diana, entre
a

'l
ellas
Un:uD, que es convertida por la degradación en su forma activa UmuD'
e inlcia el proceso de reparación del mutasoma. RecA también degrada
... una proteína represora, denominada LexA, lo que activa o aumenta la
exi:resión de una serie de genes habitualmente reprimidos por LexA,
que incluyen el propio gen recA (esto aumenta 50 veces la síntesis de
ItecA) y varios otros genes, cuyos productos participan en las vías de
,l.r
reparación dei DNA. Asimismo, RecA degrada el represor cl del bacte-
rióIago I, de manera que si hay un profago I integrado al genoma, éste
puede escindirse y abandonar la célula comprometida (secciÓn 14.5.1).
:

Se considera que la lespuesta SOS es, sobre todo, la mejor probabilidad

i
final de 1a bacteria de r:eplicar su DNA )', polende, sobrevivir en condi-
ciones adversas. Sin embar:go, el precio de 1a supervivencia es una mayor
tasa de mutación, porque el mulasoma no repal'a el daño, sólo permite
la replicación de una región dañada de un polinucleótido. Cuando
) encuentra una posicién dañada en el DNA molde, ia polimerasa selec-
ciona un nucleótido de manera más o menos aleatoria, aunque con cier-
ta pre{erencia por colocar una A frente a un sitio AP: en efecto, aumenta
. la tasa de emor del proceso de replicación. Se ha sugeridr: que el propó-
sito de la respuesta SOS es esta tasa de mutación más alta, y que la
li
mutación es, de alguna folma, una respuesta ventajosa al daño del DNA,
pero esta idea sigue siendo controvertida.

Durante algún tiempo, se pensó que la respuesta SOS era el írnico proceso
de puenteo del dano en las bacterias pero, en la actualidad, reconocemos que
por 1o menos otras dos polimerasas de E. coli actúan de manera similal aun-
que con diferentes lipos de daño. Estas son 1a DNA polimerasa II, que puede
puentear nucleóiidos unidos a agentes químicos mutágenos como A-2-aceti-
laminofluoreno, y la DNA polimerasa IV (denominada también DinB), que
puede prr:segrrir la replicación a través de una región de DNA molde donde
los dos polinucleótidos parentales se alinean en forma errónea. También se
clescubrieron Dl'lA polimerasas de puenteo en céiulas eucadontes. Éstas son
las DNA polimerasas e y I, que pueden puentear dímeros de ciciobutilo, y
tras DNA polimerasas r y (, que trabajan juntas para continuar la replicación
a través de fotoproductos y sitios AP.

l *"3"& §-*s d*$*¿:*q:s d* §m repxrmcá*ra de§ mP,§& §&m le

lhxse d« erxferm:*dmq§*s §ru¡xwmn*s, {üsx?& e§ e¿&raeer
La cantidad y la glavedad de las enfermedades humanas hereditadas que han
sicio ünculadas con defectos de alguno de los procesos de reparación desta-
can la importancia de Ia reparación del DNA. Una de las enfermedades de
este tipo mejol calactedzadas es la xerodermia pigmentaria, que se debe a
una mutación de ai¡¡rno de los varios genes de las proteínas que participan
en la reparación por escisión de nucleótidos. La escisión de nucleótidos es la
única manera en la que las cólulas humanas pueden reparar dímeros de ciclo-
butilo y otros fotoproductos; por io tanto, no sotprende que 1os síntomas de
xerodennia piglentaria consistan en hipersensibilidad a la radiación UV; los
pacientes sufien más mutaciones que las habituales a1 exponerse a ia luz solar
y, a menudo, presentan cáncer cie piel. La tricotiodistrofia también es causa-
da por defectos de la reparación por: escisión de nucleótidos, pero es un
trastorno más complejo que, aunque no irnplica cáncer, suele provo-
car problemas de piel y del sistema nervioso.

Ciertas enfermedades se han vinculado con def'ectos del componente aco-

pladr: con la transcripción de la reparación por escisión de nucleótidos: son
 -}K":'
'r' ,l

CapÍtulo l6 l\¡1ut¿riones ,¡ reparación del DNA

los cánceres cle mama y ovarlo, en los que el gen BRCrl 1 que confiere sL¡\-
ceptibiliclad a éstos codifica una proteína irlplicada, por 1o mencs de man¿:- ,'
ra indirecta, en la reparación acoplada con la transcripción, y ei síndrome ,,,, .'
de Cockalne, una enfermedad compleja manifestada por trastomos del cte- ' ' ,,,
cimiento y neurológicos. Tambión se ha identificado una deficiencia de la ,1,','
reparación aci:plada con la transcripción en seres humanos que pl'esentan
el síndrome de susceptibilidad al cáncer colorectal hereditario sin polipo- ',,',,
sis, aunque esta enfermedad se identificó, en primera instancia, conlo un ',.'1,
defecto de la reparación de errores de apzrreamiento. La ataxia-telangi*cte :,. 1

sia, cuyos síntomas incluyen sensibilidad a la radiación ionizante, obed*ce .,,';:,.

a defectos del gen ATX, que participa en el proceso de detección de daños. ,.'
Otras enfermedades que se asocian con una alteración de la reparación del
DNA s<in los síndromes de Bloom y de Wemer, causados por 1a desactiva- ''.-,1
ción de una DNA helicasa que puede participff en 1a NHEJ; la anemia de , ,,.,
Fanconi, que confiere sensibilidad a agentes químicos que causan eniaces , :
transversales en ei DNA, pero cuya base bioquírnica todavía no se conucr';
y la ataxia espinocerebelosa, que se debe a delectos de la vía utilizada para
reparar roturas monocatenarias.

!'1^-...-^-

Una mutación es un cambio en la secuencia de nucleótidos de una

molécula de DNA, ya sea una Inutación puntiforme que afecta sÓlo a
un nucleótido, o una inserción o una deleción de uno o más nucleÓti-
dos adyacentes. Las mutaciones pueden deberse a errores producidos
durante ia replicación del DI{A, aunque las D}rlA polimerasas tienen
procesos de selección de nucleótidos y actividades de correcciÓn que
mantienen un alto grado de exactitud. Sin embargo, es posible ev¿rdir
estos mecanismos de control si el molde coirtiene una versión tauto-
mérica infrecuente de un nucleótido. Un segundo tipo de error de
replicación. denominado deslizamiento, puede provocar mutaciones
por inserción o por deleción. También muchos tipos diferentlrs de
agentes químicos o físicos pueden causar mutaciones. Algunos com-
puestos ¿tctúan como análogos de bases y producir mutaciones al ser
confundidos con nucleótidos genuinos por la maquinaria de replica-
ción. Los agentes de desaminación y alquilantes atacan en forma
clirecta ias moléculas de DNA, y los agentes intercalantes, como el
bromulo de etidio, se deslizan entre pares de bases, 1o que pl:o\¡o.ü
inserciones y deleciones cuando la hélice se replica. La radiaciÓr llY
induce Ia dimerización de nucleótidos adyacentes, y la t'adiaciÓn ltni-
zante y el calor prorrocan diversos tipos de c1año. Dentro de un gen,
una mutación puntiforme podría no ejercer ningúr-r efecto sobre ias
propiedades de codificación, debido a la redundancia del cécligo
genético, pero algunas mutaciones modific¿irán el significado de un
óoción, cle manera que éste especifica un aminoácido diferente o, qui-
zás, un coclón cle términación' Las inserciones 3' las deleciones podrí-
an cambiar el marco de lectura. 1o que lleva a Ia terminación premzitura
o a la ulttalectura del codón de telrtinación correcto. Cualquiers de
estas alteraciones podría provocar una mutación de pérdida de funcién
y algunos podrí;rr-r causar una mutación de ganancia de función' que
poribl.rr.trte lleve al cáncer. En las bacterias, una mutaciÓn podría dar
origen a un auxótrofo, una célula que necesita un suplemento cie cre-
cimientr¡:ro requerido pol el tipo silvestl'e, o a un mutante que presen-
te resistencia a un antibiótico u otro inhibidor. Se está debatiendo con
vehemencia la posiblliclad dc que las células puedan aumel-It¿ir su tasa
cle mutación en ciertas circunstancias o ploglamal mutacione'c el"l res-
puesta a cambios ambientales. Todas las células cuentan con procesos
de reparación del DNA, quc pelmiten corregil muchas mutaciones'
 Resurnen

Los sistemas de reparación directa son infrecuentes, perc los poco§

que se conocan corrigen algunos tipos de daño de bases, incluida la eii-
r*,inación de dímeros de nucleótidbs inducidos por radiación uy Los
procesos de reparación por escisión consisten ea Ia eliminación de un
segrnento de un polinucleótido que contiene un sitio dañado, seguida
de nueva síntesis de la secuencia nucleotídica correcta por una bNa
polimerasa. La reparación de elTores de apareamiento iambién corri-
ge los errores de replicación por escisión de una extensión del DNA
moriocatenario que contiene la mutación y reparación del hiato resul-
tarte. La unión por el extremo no homólogo se utiliza para reparar
roturas bicatenarias. Asirnismo, hay procesos para puentear sitiós de
DNA dañado durante la replicación, muchos de los cuales actúan
como un sistema de emergencia para rescatar un genoma que ha sufri-
do una mutación intensa.
 w'?}'.
S á *r"v éq -dq
,l! §
e"-*€,wq .16§\ s *.Éitil
ú*
s &
§r
de.
to{$*u$
&i:-\*\* { B$s§§}*tr.1 n$§ #6}fl1
q ;x H§"-dH. gt,"§s.,*& q-. - &

17. 1 §*rxrnblr:xri** i:*m*i*6*

l?"Í ñ*¿*xbiru*{;¿}: ü§*ü{ifieé *!* r}ti¿:
.l?,3
Tr**tp*sici**

..:-- I**-
-^''-'ta(::i ;;-;

Describir y distinguir los diversos modelos de recombinación homóloga.

Explicar en detalle la vía RecBCD de recombinación homóloga en Escherichio coli.

Resumir las características claves de las vías RecE y RecF de E col, y mencionar los nombres y las funcio-
nes de las proteínas eucariontes que se considera que participan en la recombinación homóloga.

Describir cómo se usa la recombinación homóloga para reparar roturas del DNA.

Explicar en detalle la función de la recombinación especÍfica de sitio en el ciclo de infección lisogénica del
bacteriófago I, y comentar por qué es ¡mportante para crear cultivos genéticamente modificados.

ilusfar los modelos de Shapiro de fansposición conservadora y replicativa de un transposón de DNA.

Describir Ia via de transposición de un retroelemento LTR.

Analizar en forma sucinta las posibles vías por las cuales las células reducen los efectos nocivos de la
lransposición.

&.ecombinación es el térmirro original empleado por los genetistas para

desclibir el resultado clel entl'ecruzamiento entre pares de cromosornas
homólogos durante la nreiosis. E1 entrecruzan"iiento da por resultado dos
u'omosomas hijos que tienen diferentes combinaciones de alelos que sus
cromosomas progenitores (sección 3.2.3). En la década de 1960, se pro-
pusielon modelos para 1os eventos moleculales cle base del ent¡ecruza-
nliento, y se advirtió que una p¿rrte clave cle la recombinación molecular
es la Íotut'a y ulterior rellnión de las moléculas de DNA. En la actu¿rli-
dac1, los biólogos utilizan "recollbinación" para referirse a diversos pro-
cesos que implican rotllra y rellnión de polinucleótidos. Por ejemplo:
* Recombinacién homótroga, clenolninada tarnbién reccmbinación gene-
ral (o gerreralizada), que se produce entre segmentos de molóculas de
DNA que compaíten homología de secuencia extensa. Estos segnren-
§55 Capítulo 17 Recombinación

-l7. (A) Fecombinacrón horóloga

Figura tipos de eventos
1 Tres
Entre diferentes moléculas Dentro de una scla
de recombinación.
molécula

'* ":, Cromosomas homólogos

\
*
+

(B) Recombinación especílica de sitio

Ftegión corta de homología

I.
)

./ " '-"

I
?I
;w@*$i]1j3*g.:W !s,,-,'.ri;r..1aw

{C) Transposición
Transposón
:

i ...

Replicativa Conservadora

tos podrían estar presentes en difet'entes ctomosomas, o ser clos par-

tes de un solo croñtosoma (figur:a 17.1A). La recombiÍlacióil hr¡n:r''
loga es t'espollsable del entlectuzamiento durante la meiosis r. ;ri
pr:incipio, frre estudiada en este contexto; ahora considet'ailos QrJil 5li
función celular primaria es la reparación del DNA.
* Recornllinación específica de sitio, que tiene lugar entre nlolécula§
de flNA con sólo regiones cottas de similitud de secuencia, quizás.
únicalnente de algunos pocos pal'es de bases (figu{a L7.lll). Es rcs'
ponsable de ia iriserción de genomas de fagos, colrlo el de )"- ell cl'o-
rrlosolxas bacterianos.
* Transposición, que determina la transferencia de un segmento
DNA de lma posicién del genoma a otra (figura 17.1C).

Otros ciiversos eventos que hemos estucliado, cono el cambio clel tipo
cle apareaniento en las lévacluras (véase figur:a 14.16) y la constl'r:cciÓn
de glnes ile inmunoglobulinas (véase figuia 14.19), también son resul-
tados de la recornbinación.

De no mecliar la t'ecombinación, los genortaS serían estructul'as rq'latii'a-

mentc estátic¿rs, que sufrirían muy poJut camtios. La acumulacién gladuai
cle mutaciones durante ur"r período prolongado pxlvocada moclificaciones
 Recombinación homóloga 55?

en pequeña escala de la secuencia nucl¿otídica del genolna,

pero ni; habría
i.*,t.u"t,r.ución más extensa, qlre es la función ctre 1a recombinaciÓn, ¡-' e1
porcncial evoluti\,o del genorna estaría muy limitado'

X K §
§?mqmcffi fu§xryms*&rx &xmxxx*§ *5n
El estudio de la recombinación homÓloga ha plantead<¡ dos desafíos signi-
ficativos a los biólogos n"roleculares, ninguno de los cuales ha sido supela-
clo por completo. El prinrero ha consistido en describir la serie de
inteiacciones, que implican rotura y reunión de polinucleótidos, que ocu-
ren durante la recombinaciÓn. En la secciÓn 17.1.1 se describe en los
modelos de recombinación hornóloga derivados de este ryabajo. El segun-
do se relaciona con el hecho de que la recoinbinación es un proceso celu-
lar rlue, al igual que otros procesos celulares que involucran a1 DNA (p.
ej., tr.anscripción y replicación), es ilevado a cabo y reg¡r:lado por enzimas
y otnut proteínas. Estudios bioquímicos han revelado una serie de vías de
iecor:rbinación relacionadas, que se leseñan en la sección 17 .1.?. La inves-
tigación de estas vías perrnitió adveltir que 1a recombinación homóloga es
libase de varios tipos importantes de reparación del DNA y que esta fun-
ción de reparación es probablemente más importante para la cé1ula (sobre
todo par:a las células bacterianas) que ia capacidad que aporta la recombi-
nación homóloga pala e1 entrecfuzamiento entre cronlosomas. En la sec-
ción 17.1.5 se analizan estos procesos de reparación.

§?.3 ":§ &,***$*i*s d*

r*c*;xhi¿:mri*st §-:*rll:*§*6x
En las décadas de 1960 y 1970, Robin Holiiday, Matthew Meselson y sus
colegas lograron muchos avances importantes en ei ccnocimiento de 1a
recrrmbinición homóloga. Este tr:abajo dio por resultado diversos mode-
los que mostraban cómo la rotura y la reunión de moléculas de DNA podí-
:
an permitir ei intercambio de segmentos cromosómicos que se sabe que
tiene lugar durante el entrecruzamiento. Por 1o tanto, comenzalemos el
ii

:
estudio áe la recombinación homóloga examinando estos modelos.

, á'f:**l*s § ¡: l l * !i i # *l' )' d*

-§r¡#*iru'*
Íri t:.i:: l, r: r
drt ."i{i}¡,{* ix*t!*x **,:;*l*;:
f-stos rrodelos describen la recombinación entre dos moléculas bicatena-
rias, homólogas, con secuencias idénticas o casi idénticas. Su característi-
ea fundamental es la fbrmación de un heterodúplex por intelcambio de
segmentos pr:linucleotídicos entle las dos moléculas homólogas (fiSUIa
11.». Al principio, el hetelociúplex es estabilizado por apareamiento de
b¿rses entré cada cadena t¡ansferida y los polinucleÓtidos intactos de las
moléculas receptoras; este apareamiento es posible por 1a similitud de
secuencia entrJambas moléculas. Con ulterioridad, la DNA ligasa sella los
hiatos, lo que clea una estructura de Holliday. Esta estructul"a es dinárni-
ca: la migráción de las ramas da por resultado un intercambio de segmen-
tos más largos cle DNA si las dr¡s hélices rotan en la misma dirección.

La separación, o resolución, de la estructura de Holliday para volver a

formar moléculas bicatenarias individuales se ptoduce por escisión a
través del punto de ramificación. Ésta es la clave de todo el proceso, por-
que el corte Se puede efectuar en una u otra de dos orientaciones, como
se deduce al exáminar la configuración tridimensional, o forma chi (1),
cle la estructuta de Holiiday (véase figuta 17 .2). Estos dos cr:rtes dan
lugar a resultados muy diferentes. Si el corte se practica de izquierda a
dei'echa a través de la forma chi, corno ilustra la figura 17 .2, toda lo que
558 Capítulo 17 Recombinación

Figura 17.2 Modelo de Holliday de

Dos moléculas
recombinación homóloga. h¡mÁlnna<.- EI intercambio de nucleótidos
¡f
dCDNA ,,TTTTTTTTTJ establece el heterodúplex

nrun tioasa
I
Estructura de Holliday

Forma chi
#
&

Flesolución Resolución
horizontal vert¡cal

lntercambio recíproco :

de cadenas ,:

,,r,, b
*:1....:!@
.' r-rii+
t¡l¡llt¡¡¡¡¡tlr
dt!

sucede es que se transfiere entre las dos molécuias un segmento corto

dei polinucleótido, correspondiente a la distancia migrada por la l'ama
de ia estructura de Holliday. Por el contraf io. un cot'te de art'ibe-nb¿ljir
determina un intercambio recíproco de cadenas, con tt'ansferenfiii ilc
DNA bicatenado entre las dos moléculas, de modo que el extremü d.
una molécula es intercambiado por el extremo cle la otra molécula. Ésta
es la transferencia de DNA observada en el entrecruzamiento.

Hasta ahora, hemos ignorado un aspecto de este modelo: la manera corlo

las dos moléculas bicatenarias interactúan al comienzo del proceso pari: for-
mar el heterodúplex. En el esquelna original de Holliday', las dos moléculas
se alineaban entre sí y aparecían muescas monocatenadas en posiciones
equiyalentes de cada hélice. Esto generaba extremos monocatenarios libres,
que poclían ser intercambiados. 1o que creaba el heterodúplex (figura
17 .34). Esta característica del modelo fue criticada porque no se pr:clía pto-
poner ningún mecanisil-]o que garantizal'a que las muescas aparecerían pre-
cisamente en la misma posición en cada molécula. La modificación de
Meselson-Radding postula un esquema más satisfactorio en el cual aparece
una muesca monocatenaria sólo en una de las dobies hélices, y el extrenlo
libre generado "invade" la cloble hélice intacta en la posición homd:loga y
despiaza una de sus cadenas, 1o que forma un bucle D (fi$lra \7.38). La
escisión ultedol de la cadena desplazada en la unión entre sus regiones
monocatenaria y de apareamiento de bases procluce e1 hetelodúples.
 Recombinación homóloga

0rig¡nal (B) Mod¡f¡cación de Meselson-Radding

.ie¡ l,l"o*to Figura I7.5 Dos esquemas de ínicia-
ción de la recombiñación homólo-
Muesca en ga. (A) lniciación según describe el
sola ----*--____.}
una
modelo original de recombinación
;§áu¡¡al*¡t*s molécula TTTTTTTTTTTT1Tn-m-fT
homóloga. (B) Modificación de
lntercambio Meselson-Radding, que propone una
de cadenas I lnvasión de
t la cadena serie más posible de eventos para la
formación del heterodúplex.

Bucie D
r Formación del
I heterodúplex
GAMETOS
. r.. !..1 r...¡.. t

irel {pd: a

á.;3

Y
CIGOTO
.:: iii!:
explicar cómo podía producirse el entrecruzamiento durante la meiosis,
,.., ,, i.,,tl¡.':

¡¡¡,¡,¡¡,;§§,.k: cual motivó la creación de esquemas alternativos. En particular', se

íre i':

r:...''.,¡§.' consideró que el modelo de Holliday no podía explicar la conversión de M ,;l

,,,,.,i.,.lr,. genes, un fenómeno descrito por primera vez en levaduras y hongos,
qr'
,ffi
a
'i't,,..t,.:,.pera que ahora se sabe que ocurre
en muchos eucariontes. En las ieva-
. .:....,.........:..:
,,,i;,,..,,,.1,.,,,,',;.duras,
la rll
fusión ue
de un
LIII par
par- de
ue gametos
gal¡lero§ produce
pr0uuse un cigoto,
crg()to, que CIa
da orlgen
origen
Ausencia de /
conversión de genes
\ onversión
t ./
un asco que contiene cuatro esporas haploides, cuyos genotipos pue- lde genes
,,,.,,,;,1',,,í,,,,,12',,n

,¡...,:1,:' ds¡ ser determinados de manera individual (véase figura 14.15). En cir- )
.],..i.i.]1.],§t*.: cunstancias normales, si los gametos tienen diferentes alelos en un locus -
.rlii:l'''r:'|l:1t,,
).'..,.Y:i;tt;,dado, dos de ias esporas presentarán un genotipo y dos, el otro, pero í -.:,
,, 4a@
,*ste palrón de segregación 2:2 previsto es reemplazado, a veces, por una
',,:,:,',tt::.:.'|,::,:i:":',1::,.',,
l l ,rll
,,:

,....§,telación 3:1 inesperada (ligura 17.4). Esto se denomina conversión de '' ,,¿:¿¡:¡r.,.§i'

:,::,'.,: genes porque la relación

',:,:,,::.:,:.:,
só1o puede explicarse por la "conversión" de §"-

qT;
;t/ .. .,:i "li,..
; §no de los alelos de un tipo en otro, presumiblemente por recombina-
.1111,:';'i:,':,, 1,
l,t @,rl
i¡iji..§:i:.i:.:,i ción durante la meiosis que tiene lugar tras la fusión de ios gametos.
iiiili ii,iiiiiii¡i:iii:ia::i
t"a,,,,. ,,',${

l1'..111lll.,ftniudelo de rotura bicatenaria (doubte strand break, D§B) proporcio- J:'::/ "q
.l:i:§ls!,t,, fte una oportunidad para que haya ll !r
conversión de genes durante la a,^l; ,:§
t,.,,,,-".".'"._
§!A#
{'*r:ombinaciÓn. Según este modelo, la recombinación homóloga no se 'qd
.lntcta con una muesca monocatenaria, conto en el esquema de Meselson-
,,,t,.,r,,,.,t:t',:,.:.,,1,,.,',.tt
a.,,:.:,,,.::1r,.::,:

l':,..i.li.,. Radding, sino con un corte bicatenario que rompe en dos fi:agmentos lit '\
{g
,,,,,1¡$,lf{¡¡, uno de los componentes de la recombinación (figura 17.5). Después de1
,A-
...,.,r1...§..r.,....:
corte bicatenario, una cadena de cada mitad de Ia mr:lécula está acorta-
-E 9-o,po,'lo que cada extremo tiene ahora un segmento protuberante 3'.
e-., uno de estos segmentos inyade Ia molécula de DNA hornóloga de modo
'',. f.,i.,,r si¡ni1ar al conteirplado en el esquema de Meselson-Radding,"lo que crea
,..........$;-:l. una unión
de Hoiliclay qr" pn"d" miglar a 1o largo del helerodúplex si
,, la caclena invasora L"i"rrdia* por.,iu DNA poñmerasa. Pala cómple-
iii..)ig$i' tar el heterr:dúplex,".la otra cadena rota (la que no participa en la unión Figura 17.4 Conversión de genes.
Un gameto contiene el alelo 4 y el
i ,.. de Holliday) también se extiende. Cabe obsárvar qr.r" u*Lur síntesis de otrol el alelo o. Éstos se fusionán
'n DNa lmpiican la extensión de cadenas del comptnente que sufrió ei para producir un cigoto que da origen
,,ffi,,,.'.corte bicatenario y utilizan como molde las regiones equivalentes del a cuatro esporas hapioides, todas
,,.:,'3,.::'r, componente no cortado. Esta es la base cle la conversión de genes, pues contenidas en un solo asco. Por lo
,':.'.,:-;,'.1,,;:,,, significa que los segmentos polinucleotídicos eiiminaclos del iomponen-
general, dos de las esporas tendrán
Ie cortado han sido reemplazados por copias del DNA del componente el alelo A y dos, el alelo o, pero si
.,,,,.rr..$1,..'.'
sobreviene conversión de genes, se
\o cortado. Tt'as el ligamiento, el heterodúplex resultante tiene un par
,.;,;,:,,.;;:.,,1¡;,1',.,,,,|

:'ffi':..de estructulas de Hoñiday que pueden resoiuerse cle distintas *u."iu.t modificará la relación. posiblemente a
3A:1o, como se rnuestra aquí.
 Capítulo l7 Recombinación

Ccrte bicaienario algunas causan conversión de genes y otras determinan un interciimbio

¡t
recíproco de caclenas convencional. En la figura 17.5 se ilustra un ejem-
plo que incluce la canversión de genes.
fT-f]-TT1-ñ f-ñ-rrrrrff
a En ia actuaiidad, se considera que el modelo DSB es pol1o menos una
I La exonucieasa recorta aproximación celcana a la manera en que opera la recombinación hornó-
.f las caoenas cortadas loga en todos los organismos, aunque al principio se lo propuso corno
*9qrf_fry*r§i1ryffi mecanismo para explicar la conversión de genes en 1as ievaduras. La
CJCJ aceptación de e-ste model¡ otedece a dos razones. Primero, en 1989 se
descubrié que, clurante la nleiosis, 1os clolfrosonlas sufren una tasa cle
Ioturas bicatenarias de 100 a 1.000 veces supelior a la observada en
I lnvasión de la cadena
células vegetativas. La impiicación de que la formación de lotulas bica-
¿
tenarias es una palte inhelente de la meiosis favorece con clarid¿id el
moclelo de DSB respecto de los esquemas en 1os que la recombinación
se inicia con una o más muescas monocatenarias. El segundo factor que
llevó a aceptar ese modek: fue el reconocinriento de que la recombina-
Extensión de la cadena
I ción homóloga interviene en la repalación del DNA y, específicamente,
es 1'esponsable de reparar las roturas bicatenarias que se producen como
aberraciones clurante el proceso cle replicación. Los modelos de Holliday
y de Meselson-Radding no explican este aspecto de ia recombinación
homóloga, mientras que la reparación de roturas bicatenarias está implí-
La liOasa une los hiaios cita en el modelo DSB. En 1a sección 11.1.3 se vuelve a considerar el
I
papel de la recombinación homóloga en la reparación del DNA.
Heterodúplex
con dos uniones
cle Holliday
á;. r.l, ú..]¡üqL¡Í¡Ti!{a de ia re{ofnbli-r**ién geomélog*
I Escisión de las La recombinación homóioga tiene lugar en tocios los organismos pero, conro
I uniones de Holliday
en muchos aspectos de la biología molecular, el progreso inicial en el conoci-
A nrientc del mecanismo del proceso en la célula se efectuó en E. culí. Estudios
'ffi?"i
;,iJ.¿ f . 1, J.r_1..u;;¿;,.1..1.;*ij. cie mutaciones han identificado diversos genes de E. calí que, cuando sr. cle-
a
¿ s¿rctivan, provocan defectos de la recombin¿ición homóloga. lo que indica que
I l rli l rl r: l rrr! ! rl I I
sus plocluctos protei«:s p¿rl'ticip.rn de algrna manera en el proceso. Se des-
cribieron tles sistemas cle i:ecombinación: Ias úas RecBCD, RecE r RecF. de
¡ Reparación de errores
de apareamiento (nrismatchr las cuales la RecBCD parece sel ia más impoi'tante en las bacterias.
I
&.
.r,i r .f),;, i'.rh,'riri 'i,ir.:li
,*:*--,w,-,,,,,
¡1 En la ví¿r RecBCD, la lecombinación es mediada por la enzirna RecBCD
: ", LJ-1.:__j-_:-: -l-.:---: ql1e, conlo inclica su nombre, estír compuest¿t por tres proteínas clifer*nIrs.
^ IJos de e1l:rs -RecB _v RecD- soir helicasas. Para iniciar la reconibirl.¡qiq,i:
horló1ogzr. una ci:pia rle la er:zirra RecBCD se une a los extr:emos librcs ct;
un oromosorn¿l en una lotLlfa bicatenaria. El DNA es desel:roilad<l ciesde
Figura 17.5 Modelo de recombina- cada extremo por lii acción de RecB, que se de,splaza a io lalgo de una cade-
ción honrók:ga pür rotura bicatena- n¿i en dirección 3'-+5', y de RecD, que se despl;rza en dilección 5'*+3' pol
ria. Este modelo explica cómo pr:ede
la oti:a cadcrna. La ploteína RecB, aciemás cie sel una helicasa, tiene activi-
tener lugar la ccn';ersión de genes.
clacl ile J'*+5' exonucleasa y, así, deglada progresivamente Ja cadena por la
que se desplaza: aquella con el extl'elro 5'lible (figura 17.6).

Il"ecllCD pl'ogl'esa a 1o lalgo c1e la r¡olécula de DNA a una r,-elociclad clc

airededot'cle 1 kb pol se¡¡rncto hasta que alcanza 1a plimera copia cle la
secuencia consenso c1e ocho nucleótidos 5"-GCTGGTGG*3' denominada
sitio chi quc ap¿rrecc, en promedio, una vez cada 6 kb en el DI'{A de E. colí.
En el sitio chi, cambia la conformación cle RecBCD, de modo que se cle-
sacopla la helicasa RecD y la velociclad de progrcsiói-r clel cornplejo
RecllCD sc lcduce a cerca c1e Ia mitad. Irlo se sabe con exactituci io quc
suceclc :.r continuación pero, según e1 n:oclclo más reciente, el cambio de
conlonn¿lción cle la errrilna también recluce, o anula pol completo, la acti-
viriad cle i'-+5'err¡r:ucle¿rsa de Rec,R; ahola, esta próteína ef'ectíratur solo
 Recombinación homóioga

ccrrte endonucleolítico en la otra cadena de la n-rolócula cle DNÍA, en un¿l Progresión de ñecBCD a lo largo de
una molécula de Dl'.lA
p*sición cercana al sitio chi (vúase figtra 17.6). Cualquiera que sea el
r'r:ccanismo pr"cciso, el resultado es que la enzima RecBCD crea una molé- §iil* r¡, RecBCD
cula bicatenaria con L1n segmento plotuberante 5', exactamente conlo con- J

ter:rplal:a el modelo DSB (véase segundo panel de la fig¡:ra 17.5). 5',

o.n'".:::.u *u'
El siguiente paso es el establecimiento cle1 heterodúplex. Esta etapa es media- I
c1a por la proteír-ra RecA, que fonna un filamento de DNA revestido de pro-
5'
t*ína. que puede i¡rvadir: la doble hé1ice intacta y formar el bucle D ([igur:a tt¡¡r.I,.¡
r.r--**a--*-ref* rr' ¡.r,&!B¡ r::#*,,
I
4&&J 5
t 7.7). En la formación de1 bucie D hay un intennecliario: la estructura tríplex
(véase tercel panel cle la figura 17.5), una hélice de DNA tricatenarii: en la I Cambio de actividad
cual el polinucleótido invasor reside dentro de1 surco mayor cle la hélice intac-
I en un sitio chi

ta y fonna enl¿rces cle hiclrógeno con los pares de bases que encuentra. 5 l::1, rI : ;lI¡tI ltlFff*r3'
La migración de las ramas es catalizacla por las proteín¿)s RuvA y RuvB, clue
se unen alpunto de ramificación del hetelodúp1ex fonnado por invasión clel
segxrento protuberante 5' a la molécula asociada. Estudi<¡s por crismlogra-
fía de rayos X sugieren qlle cuatro copias de RuvA se unen directamente a
la lama y forrnan un núcleo al que se unen dos ar-ii11os de RuvB (cada uno
compllersto por ocho proteínas), uno a cacla iado (figura 17.8). La estructu-
ra l'esultante podría actllar conlo un "motol'mo1ecular", que rot¿l las hé]ices
cie ia manera requedda p¿ira que e1 punto cle ramificación se mueva. L¿t
Figura 17.6 Vía de RecBCD de
rnip¡ación de las ramas no p¿11'ece ser un pl'oceso aleatorio, sino que se detie- recombinacíón hornólcga en f. coÍ.
ne en lbmra preferencial en la secuencia 5'-(A/T)T&G/C)-3' (donde Estos eventos son responsables del
iA/T), etc., cienot¿r que cualquiera de ios clos nucleótidns puede ocupatl la prirner paso del modelo de recom-
posición indicada). Esta secuencia es frecuente en el genoma de E culi, por binación homóloga por rotura bica-
1oque se presume que la migriición no siempre se cletiene en el pdmer lugar tenaria presentado en la figr:ra 17.5.
del mr:tivr: que es alcanzado. Cuando ha finalizadc la rnigración de las
ramas, el complejo RecBCD se desprende y es reemplazado por dos pr:oteí-
nas RuvC (vóase figura 17.8). que llevan a cabo la escisión que resuelve la
esararctura cle HoliidaSi Los cr:r'tes se practican entre la segunda T y los corn-
ponentes (C/C) de la secuenci¿r de reconocimiento.

Cabe obscrvar qlle la descr:ipción previa rio asigna ninguna función ple-
cisa a ia pri:teíira RecC en la recombinación homóloga por la vía
RecBCD. De hecho, RecC es b¿istante enigrnática, plles su secuencia de
¿rrnin<¡ácidos no es similar a la cle ninguna ot1'¿l pl'oteína sintetizada por
§. t:oli. Estuclios lecientes pol clistalogra{ia de rayos X han revelado que a
ia estructura terci¿u'ia de RecC se asemeja a la de la iamilia SIrl de las
hclicasas. RecC no contienen los aminoácidr:s que son básicos para la
activid¡rd clc helic¿is¿r, aunque la regiór-r eqr,rivalente cie la proteín¿i RecC
establcce contacto, aun así, con la molí:cula cle l)lrlA. Parece improba- -
ry |
Union de RecA
ble que RecC tenga algr"rna activiclad dc hclicasa lesidual y, por 1o tanto, -'¡
no ayucla a RecB y RecD ¿ desenrr:liar la cloble hólice. pero Lrna posibi-
liciad es que RccC ha-va ;idquirirlo una función cle barriclo y sea lespon- t
'' ll,,lllrlli¡il¡¡llltrtrr!rl :¡l

sabie cle iclentific¿lr el sitio chi -v clesencarlenar ¿isí el cambio de ;ffi

conformación cie RecBCD que lieva a la l'or¡n¿rción clel heter:oclúpiex.
I lnvasión de la cadena
¿
ütrxs víxs rlt r*türnl§früd*n hr:r**l*ry* *n ñ. e*li
Los rnutantes c1e E. t:oli que c¿u:ccen de componentcs del sistenl¿r
RecBCD ¡:ueden, aún así, píesentar t'ecombinación honlóiog¿l, aunque
con menor eficacia. Esto se debe a que la bactcria tiene no menos de
otl'as dos vías de leconrbinación homóioga. clenominadas RecE y RecF.
lin ias cólulas nclnales de 11. coli,la mayol'parte de Ia l'ecombinación
hornóloga tienc lugar a tlavós c1e Ii.ecBCD pcro, si esta ví¿l está desacti- Figura 17.7 ?articipación de la pra-
teína RecA en la formacién del
vada por mutación, el sisterl¿r RecE puecle cncarg¿Il'se del ploceso, para
bucle D durante la recombinación
ser lecmplazaclcl pol ltecF cuanclo lLecE es de.t¿tctivaclc¡. homóloga en E. coli.
 Capítulo 17 Reccmbinación

Ligamiento a la unión Migración de las ramas Resolucíón

T
§--
t--4"t
: lr:
Í,
&*§
n,",^ la,\.:
. ! d,
ryi
-#*
;; "t

á §:'
§
d
Lt §

qdnñ,. :,,tt, )i §
...,..¡¡i

Figura 17.8 Papel de las proteínas
Ruv en la recombinación homólo-
ga, en E. coli. La migración de las
ramas es induclda por una estructura
que comprende cuatro copias de
RuvA ligadas a la unión de Holliday,
con un anilio RuvB a cada l¿do. Una
vez que se ha desprendido RuvAB,
dos proteinas RuvC se ligan a la unión
y la orientación de su unión determi-
na la dirección de los cortes que
resuelven la estructura'.
I{an comenzacla a conocerse los detalles de la vía RecF y el mecanisn-io
general parece ser simiiar al descrito para RecBCD. La actividad de heli-
casa de la vía RecF depende de RecQ y el extremo 5'de la cadena es eli-
minado pol Reci, lo que deja un segmento protuberante 3' que es
rcvestido por proteínas RecA a través de las acciones combinadas dr-.
RecF, Recl, RecO, RecQ y RecR. Los componentes de las vías RecBCI)
y RecF son bastante intercambiables entre sí y se r:onsidera que sisten-las
híbridos operan en algunos mutantes que carecen de uno u otros com-
poÍrentes de los procesos convencionales. Siir embargo, hay diferencias,
pues sólo la vía RecBCD inicia la recombinación en los sitios chi disper-
sos por el genoma de E. coli y sólo RecF puede inducir recombinación
entre L1n par de p1ásmidos. RecF tanlbién es la vía prirnaria responsable
de la repalación por recombinación de hiatos monocatenarios secunda-
rios a la replicaciór-r de1 DNA intensamente dañado (sección 17.1.3i. La
vía RecE está mucho menos estudiada, pero las indicaciones son quü
presenta considerable superposición con el sistema RecF, y que Rec),
RecO, RecQ y la propia RecF parecen ser comunes a amtas vías.

Ademírs de las vadantes RecBCD, RecE y RecF, cuyas {'unciones son f'or-
nrar la estructura heterodúple x, E. coli tiene medios alternativos para Lruü-
plir cl paso de migración de las ramas. Los inutantes que carecen de RuvA
o de RuvB pueden, de todos modos. llevar a cabo la recombinación homó-
Hiato Ioga. porque una helicasa. llamada RecG, tarlbién puede ef'ectuar le i!r:,
monocatenari¿¡ ción de RuvAB. Aún no se sabe con claridad si RuvAB v RecG .son :'-,ic
intercambiables o si sol"l específicas para difer:e1'rtes casos de recontirina-
ción. Los mutantes RuvC también tienen capacidad de recombinacién
l-romóloga, 1o que sugiere quc E. coli cuenta con otras proteinas -cu¡,a iden-
I Transferencia
tiilad se desconoce- que pueden resolver las estructuras de Hollida¡:
tr oe otiR

: -r ,-'- l'r.J..:1.; ,..r;.1 .', j,'l l,l-,., :';' ,' ; r'.,.,',r",. .',i,-.:
Se cr:nsidera que el modelo de recombinación homók:ga pol rotura bica-
tenalia es vá1iclo para todos los orgarnisntos, 11o só1o para E. coli; recuér-
I Nueva síntesis dese c¡ue se lo diseñó al principio para explicar la conversión de ger:es
{ oe DNR donado
en Sctccltctrorilyc€s ceret,isíue (sección 17.1.1). Lo-. eventos bioquímicos
de base del proceso parecen sel similat'es en todos los organismos. y se
han identificado dir.elsas ploteínas de lel,adura que cumplen funciones
equivalentes a las obselvadas dulante la vía RecllCD de E. coli. En par
ticuiar. dos proteínas de levadula, RAD51 y DMCl, son homólogas de
RccA de E. coli- Si bien se sospechan las funciones especí{'icas de
Figura 17.9 Reparación de hiato
RAD51 y DMCl, se piensa que tlabajan juntas en nunterosos eycittos
monscatenario por la vía RecF de recombinación homóloga. E,sta conclusión surge porque lc¡s mutantes
de f. co/¡. que cal'ecen de una u otra proteína presentan {'cnotip«:s similal'es y
 Recombinacién homóloga

alrrb¿ls prateínils se encut:ntl'í]n juntas en las misn:as li:calizaciones den- 5',

tro cle núcleos en meiosis. Intcresa clestacar que ha¡,'alredeclor de lü0 .J

rilrlros calientes de reconlbin¿rcién en e1 genoma de §. cereyisi«e lsec-

ción 3.2.3), lo que sugiere que pr:dría haber secuenc:ias equivalentes a 1'
los sitios chi de E. coli, aunqlre con una lrecuencia rnás baja: una cacia 3'
40 kb, en el genor:ra de las levadurns, en cornparirción coft una cada 6
kb en E. coli. También se .onocen proteínas hornók:gas a RAD31 y
DhiCl en vados otros eucariontes. incluidos los seres humanos. La cadena hija
ha terminado

un aspecto desconcertanre de la lecombinación homóloga en los euca-

¡ir:ntes ha sido el mec¿inismo de resolución de ias estructuras cle
Holliclay porque, durante nuchos años, se han buscado proteínas homó-
logas a RuvC cle E. coli, pel'o no se las h¿r encontrado. De hecho. RuvC
no es universal en todas las bacterias y algunas especies parecen utilizar , lnversión áe la

un tipo de nucleasa totalmente diferente para resolver las estructuras cle vI horquilla de
replicación
Holliday. En ias arqueobacter:ias (Archaea), se considera que la función
eqrrivalente está a cargo de la proteína Hjc, que no tiene homología de
secuencia con Ruvc, pero se ha mostrado, mediante pruebas bioquími-
cas, que se une a ias estructuras de Ho11iday. Se han identificado yarias
proteínas eucariontes que presentan similitud estructural con Hjc. como
¡ Copiado de la cadena
RAD51c de s. cerevisict¿, que es un mienibro cie la familia multigénica I ni¡a no dañada
RAD51, y NIusS1 de los seres humanos. Asimismo, se han propuesto
modelos pat'a resolver las estructuras de Hollida¡, mediante una iombi-
nación de actividad de helicasa y topoisomerasa que indican que, quizá,
nr: se requielan equivalentes directos de RuvC en todos los eucariontes.

In3.§ &ec*e¡'¡fu¡rle{i*§x h*rn*§mge y r*p*rxsi*m des ffiM&

La ¿ltención dirigida por los genetistas ai entlecruzamiento comü carac-
terística básica de la reploducción sexual sesgó sin cluda los primeros
est¡-rclios de recombinación homóloga hacia eventi:s obseryados clurante
1a meiosis. cuando se examinaron por primela vez n-lut¿intes cle E. coli
con defectos de componentes de la vía RectlcD y otl'as vías cle recom-
binación y se observó que mostraban deliciencias en la r.epar.ación clel Se ha puenteado el daño
D¡iA, se voivió evidente una función alternativ¿r cle Ia reiombinación
horrróloga. En la aclualidad, se cr:nsidera que su principai fr-rnción es la
reparación posreplicativa y que sr.i papel en el entrecruzamiento es de Figura 17.10 Un polinucleótido
importancia secundaria en la mayoría cle las células. hijo terminado puede ser
rescatado por inversión de la
horquilla de replicación.
f-a reparación posreplicativa tiene lugiir: cuando apal.ecen roluras en las molé-
culas dc DNA hijas collo consecuenci¡r c1e abrerraciones en el proceso cle
replicación. una de estas aben'aciones puecie sobrcvenii'cr-i¿Lndo ki nraquina-
r:ia de replicación está intentanclo copiar Lrn seErlnenro del genoma muy áaña-
':.
do, en particular regiones con prevalencia de dímeros cle ciclabutilo. Cuanclo
,1.

:, ,'

se encuelltra uno de estos dílneros no es posible copiar la cadena molde y 1a

,
:, DltlA polimerasa simplemente salta a la región no cl¿iñada más ceicana,
a
clcnfe reinicia el proceso de replicación. El resultaclo es que uno cle los poli-
ni"rcieótidos hijos tieire un hiato (figura i7.9). Un nroclo pr:sible de reparal
este hi¿rto es mediante un eyento dc recambinación que transfiere el segmen-
to equivalente de Di{A del polinucleótido progenitor presenre en la seg¡.incla
I
doble hélice hija. una Dñ{A polimelasa rellena el hiaio, que a}rora p."-
"rtá
sente er"I ia segunda doble hólice. utiliz¿indo como nrolcle el polinucleOiiclo
hijo no clañado dentro de esta hélice. En E. ct¡li, este tipo cle r.ep:rración cle
hiato monocatenario utiliza la ví¿r de recombinación ReiF.

si no se puede puenteal'el sitio dañado. el polinucleótic{c hijo presenra-

rá terminación, en lugar de un hiato (figura 17.10). Hay varias §taneras
posibles de reparal este hiatr¡. uria es que la horquilla de replicación se
 ''5drz
t,
j

Capítulo 17 Recombinación

atasque y' se invierta por una breve distancia, de manera que se forme
3'
5'
un dúplex entre los polinucleótidos hijos. Después, el polinucleÓticlo
incor:rpleto es extendido por una DNA polimerasa, que emplea coillo
lii:rr.r molde la cadena hija no dañada. Fntonces, 1a horquilla cle replicación
¡ Colapsa la horquilla vuelve a avanzar por un ploceso equivalente a1 paso c1e migraciÓn de las
I de rePr¡666;6n
ramas de la recombinación hornóloga. En consecuencia, se puentea el
ffi
;L;q- t,rr ¡r,¡¡ i:'¡
sitio dañado y la replicación puede proseguir.
-.",je;rrl¡r¡

?*:.!'?-.^*l.Yr.
l,lrlr!l¡¡¡t Se produce una aberración más gra\re L'uando uno de los polinucleÓtidos
! lnvasión de
progenitores que se está replicando contiene una muesca monocatcl:¿i-
I la cadena ria. En este caso, el proceso de replicación deterrnina una rotura bicate-
naria en una de las dr:bles hélices hijas y la horquilla de replicación se
pierde (figura 17 .11). La rotura puede repararse mediante una forma de
recr:mbinación horr-róloga entre el extremo roto y la segunda l-nolécula,
no dañada. E,n el esquema de la ligura 17.11, el polinucleótido hijo *s
¡ Migración de extendido en la rotura bicatenaria por una reacción de intercambio de
J las ramas cadenas que pennite utilizar como molde la otra cadena madre. Después,
1a miggación de las r:an'ias, seguida de la resolución de la estl'uctura de
Ho1liday, restablece la horquiila de replicación.

. Resolución de
*I d.
la estructura §K3 ffi*,rxxsxh§xxxx&&m *sp**$$)§m .d* siti*
Holli,iru
l-a recombinación no exige como prerrequisito una región de hr:mología
IIfTIT¡JITITNTh extensa: el proceso también se puede iniciar entre dos moléculas de
- \-rrrrrrrrr-rñ-t tlrlllttitttlr
--:"Y.?.,:-..:a.ri-;:i*f]
t r a ¡ ¡ r t t.).i..t t., t | | t, I DNA que tengan en común sÓlo secuencias muy cortas. Esto se denomi-
na recombinación específ ica de sitii: y se la ha estudi¿ldo nlucho debiclo
Se restablece la horquilla de replicación al papel que desernpeña durante el ciclo de inf'ección del bacteliófago tr.

Figura 17.11 Mecanisr¡o de recupe- .Á

t T.?.1 Ín',tr*g,;:';,;{{,.1 #;: :}; ..: !(*t1{}rrn§ };3x #. 'r*lí
ración de una horquilla de replica- 'h'as inyectar su DNA a una célu1a de E. c<;lí, el bacteriófago )" puede seguir
ción colapsada mediante dos vías de infección (sección 14.3. 1). Un¿i de eilas, la vía lítica, detet:lina
recombinación homóloga.
la rápida síntesis de proteínas de la cubierta tr, combinada con la replica-
ción del genoma 1", 1o que pl'ovoca la lluerte de la bactet:ia y la libet'ación
cie nuevos f'agos en allededor de 45 n:inuti:s de la infecciÓn inicial. For el
contrario, si el fago sigue la vía lisogénica, no aparecen cie inmediato ntle-
vos fagos. I.a bacteria se divide con norlnalidad, posiblemente dul'ante
muchas divisiones celulares, con e1 fago en una fbrma latente denomini;tl;t
plofago. Con el tienipo, quizír corno consecuencia de daño del Lf\A rr
algún otlo estínrulo, el fago se tol:na activo otl:a vez.

f-)urante la fase lisogénica, el genoma L se integra al cron-iosoma de

E. colí. Por 1o tanto, se replica caclavez que se copia el DNA de E' cttli
v pasa a las células hijas conro si fuese una parte convencional del geno-
ini ¿e la bacteria. La integlación se procluce por recombinación especí-
fica de sitio entre los sitios de unión a (ttt, attP en el genotnaT"y uttP, en
el clomosoma de E. coli. Cada uno de estos sitios de unión tiene. en el
""-GCTTTTTTATACT{§,. .*.,;- *:
centro, una secuencia central idéntica de 15 pb denominada 0 tfigura
'- aGAn¿cÁnrnrcÁii- -" 17 .l», flanqueada por secuencias varial¡les, llamadas B y B', en el geno-
ma bactedano, y P y P', en el DNA del fago. B y B' son bastante.rortas'
- sólo c1e ,1 pb cclá una, 1o que significa que cttB ctbre únicamente fi pb
Figura 17.12 Secuencia central de de DI'{A, pero P y P' son mucho más largas y toda la secuencia ttttP abar'
los sitios att presentes en el bacte,
riófago i y en el cromosoma de ca nrás de 250 pb. Las mutaciones cle la secuencia central inducen siem-
E. coli. La líne¿ roja indica el corte pre riesactivación del sitio tttt,por* 1o que éste ya r:o puede participár en
escalonado practicado en cada sltio la recombinación, pet:r: las mutaciones de las secuencias flancltreutrtes
olt durante la integración y la escisión tienen una consecuencia n-Ienos grave y sólo disminuyen la eficit-rrcia tlu'
del genonra del fago. la recombinación. Si attl], el sitio de unión en el genoma de E. ¿:o/i, es
 Recombinación específica de sitio

Figura 17.13 lntegración del genoma

del bacteriófago I en el DNA cromo-
sómico de f. coli. El DNA ), y de
§. co/i contiene una copia del sitio oq
cada una de las cuales consiste en una
secuencia central idéntica denomin¿da
"O" flanqueada por secuencias P y P'
(para el sitio off del fago) o B y B'
(sitio útr bacteriano). La recombinación
entre las regiones O integra el genoma
)" al DNA bacteriano.
DNA bacteriano

desactivado, el DI.ilA 7" se puede insertar en sitios secundarios, que com-

pal'ten aiguna similitud de secuencia con el locus ¿//B genuino. Si se está
utilizando un sitio secundalio, se reduce mucho la frecuencia de lisoge-
nia y es posible que la lrecuencia de integración sea inferior alA,O17o de
la obseruada en céluias de E. coli no mutadas.

Como esta recombinación tiene lugar entre dos molécuias circulares, ei

resultado es la fornación de un círcul¡ más grande: en otras palablas, el
DNA I se integra al genoma bacteriano (figula 17 .13). EI evento de recom-
binación es catalizado por una topoisomerasa de tipo I especializada (sec-
ción 15.1.2) denoninada integrasa, un miembro de la famiiia de
recombinasas presentes en bacterias, arqueobacterias y levaduras. Hay no
menos de cuatro sitios de unión para integtasa dentro de attP y por 1o
lnenos tres sitios para una segunda ploteína, ei factor de integración del
huésped, o IHF. Estas proteínas, juntas, revisten el sitio de unión del fago.
Después, 1a integl'asa efectúa un cot'te bicatenario escalonado en posicio-
nes equivalentes de los sitios att y )" bacterianos. Entonces, se intercambian
los dos segmentos protuberantes monocatenarios corlos entre las molécu-
las de DNA, lo que crea una unión de Holiiday que rnigra algunos pares de
bases por el hetelodúplex antes de su escisión. Siempre que se practique er-r
la orientación apropiada, esta escisión resuelve la estructura de Holliday de
una manera tal que el DNA i" se inserta en el genoma de E. coli.

I-a integración crea versiones híbridas de los sitios de unión, que ahora se
llaman «/fR (que tiene ia estructura BOP') y attl (cuya estn-rctura es
POB'). Una segunda recombinación específica de sitio entre los dos sitios
(ttt, contenidos ahora en la misma molécula, revielte el proceso original y
libera el DNA l Esta recombinaciórr también es cataiizada por la integra-
sa pero junto con una enzilna denominada "escisionasa", codificada por el
gen i, xis, en lugar de con IHF. Es probable que las funciones de Xis e IHF
en la escisión y la integración, r'espectivamente, sean bastante diferentes, y
no se debe considerar que las dos proteínas desempeñan papeles equivalen-
tes en ambos procesos. El punto clave es que la combinación cle integrasa
y escisionasa perrnite acercar los sitios attR y ctttL para iniciar ia recombi-
nación intramolecular que escinde el genoma 1". Ti'as la escisión, el genoma
l. reg'esa al nrodo lítico de infección y dirige la sfirtesis de nuevos fagos.

j,."-.? I *. , í¡,r *": ,¡;rl.r; ,-.;r:',:jii -.; (i ,: '.,1r,-, :§ t; ;'*

x9
¡.;3erJs; p.;,.:: .1\ 1;r';;¿t{-{6d1 {: }C.¡!L".j
Los procesos responsables de la integración y la escisión del genoma ), son
bastante típicr:s de las estrategias utilizadas por los fagos para establecer liso-
566 Capítulo 17 Recombinación

Gen Cre genia, aunque, en algunos lbgos, los eventos moleculares son menos comple-
jos que los obseryados en 1". Por ejemplo, la integración y la escisión del geno
rna del bacteriófago P1 requieren una sola enzima, la recombinasa Cre, qus
reconoce sitios diana de 54 pb, denominados /ox8 y loxP, que son idénticos
entre sí y no están flanqueados por secuencias equivalentes a B, B', etc.

La simplicidad del sistema Pl ha perrnitido utilizarlo e.n proyectos de inge-

niería genética en los cuales la ¡ecombinación específica de sitio es un lequi-
sito. Ha aparecido una aplicación importante en la tecnología empleada pire
Escisión de kanR la genemción de cultivos genéticamente modificados. Una de las principak:
I áreas de preocupación que surge del debate sobre las plantas con modifica-
ciones genéticas es la posibilidad de efectos nocivos de los genes marcado-
res usados con vectores de clonacién vegetales. La mayoda de 1os vectores
vegetales llevan una copia del gen de resistencia a la kanamicina (véase figu-
ra 2.27), que pemite identificat a las plantas transformadas durante el pro-
Figura 17.14 Utilización de la ceso de clonación. El gen kanR es de origen bacteriano y codifica ia enzima
recombinasa Cre en ingeniería neomicina fosfotransferasa IL Este gen y su producto enzimático están pre-
genética vegetal. La expresión del
sentes en todas las células de una planta genornanipulada. Pruebas en mode-
gen C7e determina la escisión del gen
áonn del DNA vegetal. 1os animales han disipado el temor de que la neomicina fosfotransi'erasa
pudiera ser tóxica para los seres humanos, pero todavía preocupa que el gen
kanR contenido en un alimento genéticamente modificado pueda incorpo-
rarse a las bacterias del intestino humano y las tome resistentes a la kana-
micina y a los antibióticos relacionados, o que el gen kanR pueda pasar a
otros organisrros del medio, lo que quizá provoque daño en el ecosistema.

Los temores en relación con el uso de kanRy otros genes marcadores han ins-
tado a l<¡s biotecnólogos a diseñar maneras de eliminar estos genes del DNA
vegetal después que se ha verificado el evento de transfotmación. Una de las
estrategias utiliza la recombinasa Cre. Para empiear este sistema, se translbr-
ma planta con dos yectores de clonación: el primero lleva el gen que se
1a
agrega a la planta junto con su gen marcador seleccionablekanR rodeado por
las secuencias diana lox; el segundo 11eva el gen de recombinasa Cre. Después
de la transformación, la expresión del gen Cre detemina, por lo tanto, la esci-
sión del gen kanR del DNA vegetal (figura 17 .14).

La transposición no es un tipo de recombinación, sino un procesü {lttr l

suele utilizar recombinación, cuyo lesultado final es la transfetenci* iie

un se€trnento de DNA de una posición del genoma a ora. Una cat'irut;'
rística típica de la transposición es que el segmento transferido está flan-
DNA cromosómico
queado por un par de repeticir:nes directas cortas (figura 17.15). qLtc st'
:

.¡
. - \.-.. i:;,,@@4...
-r-
;--*-.'---ejd.@¿
....,....
forman durante el proceso de transposición.
"|i..' )¡t. r. -.-.:, r1

En la sección 9.2, examinamos los diversos tipos de elementos transpo-

'-L,llrlr-i l''CTGG*i
.il nibles conocidos en eucariontes y procariontes y descubrimos que podi-
Hepeticiones an dividirse, en tétminos generales, en tres categorías sobre 1a base de
d¡rectas su mecanismo de transposición:
* Transposones de DNA que se transponen en forma replicativa: el . lt-', 1

transpr:són original se mantiene en el lugar y ¿lparece un¿l rtueva

Figura IZl5 Secuencias repetidas
:

copia en otra parte del genoma (figura 17.16).

directas cortas flanquean a ele-
mentos transponibles integrados. a Transposones de DNA que se transponen de modo conservador: el
Este transposón particular está flan- tr.ansposónor:iginalsedesplazaaunnuev0sitiomedianteunpr0Ce.
queado por la repetición tetranucleo- so cle "corte y pegaclo".
tídic¿ 5'*CTCC-3'. Otros "E*,
transposones tienen secuencias * Retloelementos, toclos los cuales se tl'ansponen replicativamente a
repetidas directas diferentes. través de un RNA intermedialio. '.,:::|1'{#jr;)))
 Transposicién 567

Figura 1 7.1 6 Transposición replicati-

va y conservadora. Los transposones
de DNA utillz¿n la via replicativa o
Replicativa Conservadora conservadora (algunos pueden usar
ambas). Los retroelementcr -(e trans-
ponen replicativamente a tr¡r.¡és de un
RN]A intermediario.

Ahora. examinatemos los eventos de recombinación re_qponsab,les de

cada uno de estos tres tipos de tlansposición.

§ ?.§.§ Yrm;tsp*siei*:it r*;:?i*a*ivt y t#r:§*rv*{§*r*

s;, tr.:rstltSom*5 dr Üli,l,

l\ k: largo de los años, se han propuestodiversos modelt-is de transposición
rcplicativa y conselvadora de transposones de DNA, pero la mayor'ía con-
.siste en modilicaciones de un esquelna original delineado por Shapiro en
1979. Según este modeio, la transposición replicativa de un elemento bac-
te:'iano, como un tlansposón de tipo Tn3 o un fago transponible (sección
9.2.2), es iniciada por una o más endonucleasas, que practican cortes mono-
ciltenarios a cada lado del transposón y en el sitio diana donde se insertalá
la nueva copia del elemento (figura 17,17). En el sitio diana, li:s dos co$es
están separados por algunos pares de bases, de modo que la molécula bica-
tenalia escindida presenta segmeÍitos protuberantes 5' cortos.

El ligamiento de estos seglnentos protuberantes 5'a los extremos i' libres a

c¿rda lado del ü:ansposón crea una molécula híbrida en la cual k:s dos DNA
odginales -el que contiene el transposón y el que contiene el sitio diana- son
ligados por el elemento tansponible flanqueado por un par de estructuras
siililares a horquillas de replicación. En éstas, la síntesis de DNA copia el
elemento transponible y convierte al híbrido inicial en un cointegrado, en el
qr"re los dos DNA originales todavía están ligados. La recombinación homó-
loga entle ias dos copias del transpi-rsón desacopla el cointeppado, lo que
§epara eI DNA original (con su copia del transposón todar,ía en el lugar) de
ia molécula diana, que ahora contiene una copia del transposón. Por L:
tanto, ha habido transposición replicativa.

Una modificación del proceso recién desclito cambia ei modo c1e trans-
¡:osición de replicatiya a conservadora (véase figura 17 .17). En lugar de
llcvar a cabo la síntesis de DNA, la estructura híbrida se vuelve ¿l coi'l-
vertir en dos moléculas de DNA separ:adas practicanclo, simplemente,
muescas monocatenar:ias adicionales a cada lado de1 transposón. Esto
corta el transposón cle su molécula original y lo "pega" al DNA diana.

' ; \ I !i/úilrtl{¡'r, lr{l: 'l i:¡:t-'¡l;;!¡It''1rl!}\

e

Desde la pelspectiva humana, ios retroelenrentos más importantes son los

retrovilus, que incluyen el virus cle la inmunodeficiencia humana que
causa sida y otros diversos tipos vilulentos. La mayor parte de 1o que se
sabe acelca de la retrotransposición hace referencia específica a retrovi-
rus, aunque se considera que otros 1'etroelementos, como los retrotrans-
posones de las familias Tv"l/copict y Tr-3/gy1:sy, se transponen por
mecanismos similares. Estos no implican recombinación, pero serán con-
siderados aquí por razones prácticas.

E1 pdmer paso de la retrotransposición es la síntesis de una copia Rl{A del

retroelemento insertado (figura 17.18). La repetición tenninal larga (LIR) en
el extremo 5' del elemento contiene un¿l secuencia T,{14., que actúa como
promotor de la transcripción por RNA polimerasa tl (sección 11.2.2).
568 CapÍtulo 17 Reccmbinacrcn

Algunos retroelementos tanrbién tisnen secuensias potenciadoras (sección

11.3), que se considera que regulan el grado de transcripción que tiene lugar.
La transcripción continúa a travás de toda 1a longitud del elemento, hasta una
secuencia de poliadenilación (sección 12.2.1) en la LTR 3'.

Ahora, el transcrito actúa como molde paru la sÍntesis de DNA depen-

diente de RNA, catalizada por una enzirna transcriptasa inversa codifi-
cada por parte del gettpol del retroelemerto (véase figura 9.14). Como
esto es síntesis de DNA, se requiere un cebador (seccién 15.2.2) y, al
igual que durante la replicación del genoma, el cebador está compuesto
por RNA y no por DNA. Durante la repllcación del genoma, el cebador
es sintetiza da de novo por una enzirna polimerasa (véase figura 1 5 . 1 3),
pero los retroelementos fio codifican RI.{A polimerasas y, por lo tanto,
no pueden fabricar cebadores de esta manera. En cambio, utilizan una

Figura '17.17 Modelo del proceso

que determina Ia transposición Transposón
replicativa y conservadora.

I Co.tu. monocatenarios
+
ffi
'1 { §Jq
\ is-__, - ___--*<g
\i]-BA@.,--Y

L¡samiento
I

Síntesis de DNA en las

horquillas de replicación¡y' Cortes adicionales
\

Recombinación
+I
Ligamiento
homóloga

TRANSPosrcróN RrpLlcerrvR TFIANSPOSICIÓN CON§EBVADORA

 Transposición

cie 1as mc¡lécula-s deIRNA c1e la célu1a ccmo cebador; el tRNA elegido
clepencle del retroelenlento: la familia 7!1/copia de elementos siempre
cnrplea 1ft§§vlet, pero otros retroelementos usan tRNA diferentes.

E1 cebador de tRlilA se hibrida a un sitio dentrc de la LTR 5' (véase figura

t 7. 1S). A primela vista, éste parece ser un iugar extraño como sitio cebador:
pries signi{ica que la síntesis de DNA es dirigida lejos de la región central del
r.tr.oelemento y, por ende, da por resultado sólo una copia corta de patle de
1s LI R 5'. De hecho, cuando la copia de DNA se ha extendido hasta el final
clc la LTR, se dep¡rada una parte de1 molde de RIr{A y el segnrento protube-

s'.LTR 3'-LTR
. Retroelemento
¡¿Á¡a¡¡!*i§.*¿!¡ -. integrado
Figura 17.I8 Replicación del RNA y
del DNA durante la transposición de
I Transcrioción
un retroelemento. El diagrama mues-
¡ tra cómo un retroelemento integrado
::.i.i...:.r'.r':::_:::rrf:r.r'r'rrr.r.:rrr"t,,-.,,,,'..,.,.,-,.,1t..',
i,.a,coPiadeRNA
5í-,:.;:1l.il:i,:i.ri es copiado en una versión libre de
r Cebado por tRNA de la síntesis de DNA bicatenario. El primer paso consis-
ta primeia cadena te en la síntesis de una copia RNA, que
I
es convertida, después, en DNA bicate-
nario mediante una serie de eventos
RU5 que implican dos cambios de molde,
t Degradación terminal del FNA

, -"-;
¡ como se comenta en el texto.

Et tl(
I
I
Pr¡mer cambio de molde
!

RU5
¡ Continuación de la
t síntesis de cadenas
', :::r :1.: : :l:t.::il:.iit1:rt:::a,r:.).:.1:)::t..\
tt:.t t|t,t

La RNasa H degrada la mayo.

parte cie la caáena de RNÁ
-./

z/*ffi:r
ir-- n -u.o-¡')
tl,[u:¡ uu UiJ
\- \ -:::::::-a
fsñr\r,tü5E-ul
usil iL ur \
\
{r Cebado de la síntesis
de la segunda cadena .,n,".['t?'LT:"Jo::j: \
U3R
.,:§i1
u3R N u5
usilU u5
\ segunoo cambio de molcle

\
U3R U5
*---#"#*& U3R
U3R
Continuación de la sínles
de la segunda cadena
 57N! Capítuio 17 Recambin¿dún

Hetroetemento rante cle D|"rA que es prodllcido se vueh/e a hibriciar: a ia LTI1 i' de1 ru:rloe-
lenrento que, al ser una r€pet¡ciót't temrinal larga, tiene la misma secuüncifl
DNA que 1a LIR 5' y, así, puecle lbmrar pares de bases con 1:r copia DNA. ¡srtra,
cromosómico
Ia síntesis cle Dl{A continíra a 1o largo del molde de RNIA y desplaza, ,linal-
nrente, al cebador de IRNA. Cabe obsewar que el resultaclo es ur.xr copin
¡ Acriv¡dad DlllA de toclo el molde, incluido el sitir: de cebadc¡: el cambio clel molcb es,
I de integrasa
en efecto, la estrategia que emplea el retroelemenro para resolver.el pr*hle-
ma del "acort¿lmiento tenninal", el misnro ploblema que los DNA crolnosú-
tlrmrna dos
.Áa nricc'rs erlcaran a trayés de la síntesis del telólnero (sección 15.2.4).
n ucleótidos
c5'
La finalización de la síntesis de la pliurera cadena de DNA produce un
Corte escalonado
J,. u híbddo DNA-RNA. El RNIA sufre degtadación parcial pol Lrna cr-rzirna
iiliii,,]! ltll¡t R|.lasa H, codificada por otr¿r parte clei gen pol.El RNA que no es clegla-
dado, en general sólo un fi:agmento aisiado uniclo a una secuencia poli-
I lnserción del pur"ínica corta adyacente a ia LTR 3', ceba la síntesis de la seguncla
+ retroelemento cadena de DNA, también ,:1l este caso por transcriptasa inver.sii, que
puede actuaf corlo una DNA polimerasa dependiente tailto de RNA
Se pierden los sesñentos
protuberanles del retroelemento conlo de DNA. Al igual que la primera londa de síntesis de DNA, ia sín-
.*;.i;fua -....:........::i..;:u,,-.:; tesis de la segunda cadena genera, en primer término, una copia I)N;\
. , -r, I ,i ,l¿j.,,! ]-ll ,..:",1,,,..:..t.:s,i.,i,,*;:"*l§f-ry ,
" sólo de la LTR, peril ul-l segundo cambio de mr:lde, al otro extremo dr
la nlolécula, permite extender la copia DNA hasta sr"r lorrgitucl complc-
netleno del hiato
I ta. Esto crea un molde para la ertcnsión adicional de la pr:in:cla cacle¡ra
de DNA, c1e tnanera que el DNA bicatenario resultante es una copia
conrpletil de la región interna del retroelentento más 1¿rs dos UII{.
,,1'ti¡ltl
lbdo lt¡ qltc testa es insertar la nueva copia del letloelellento en el grnorna.
.las sccLenc!as
§e *an dupli*a**
prttuijerantes
Al principio, se considelaba qr-re Ia inserción em aleatoria, pero ahora pll.ece
que, .si bien no se utiliza ninp¡rna secuencia paúicular como sitio diana, la
integración ocurre en ciertas posiciones pref'er:enciales. La inserción iuplica
la eliminación cle clos nucleótidos cie los extrernos 5'del letroelenrento bica-
Figura 17. 19 lntegración de la ver-
sión de DNA bicatenarío de un tenario por la enzima integl'asa (codiilcada por orra pai'te de pot). La integla-
retroelemento en el genoma hués- sa tanrbién cfectúa L1n corte escalonado en ei DNA genómico, de uror]o quc
ped. La integr¿6ie¡ Cel retroelement: tanto el retloelemento como el sitio de intcgración tienen ahola seglrentos
determina una repetición directa tetra- ptotuherantes 5' (figura 17.19). Estos segraentos podrían no tener secuen-
nucieotídic¿ ¿ cada lado cle ia secuen- cias conrplenrentarias pcro, aún así, parecen interactuar de alguna forma, por
ci¿ rnsert¿da. En Ios retrovirus, esl3
1o que el letroeleinel-rto se inserta en el DNA genómico. La inter¿icción plo-
etapa de la vía de transposición
requiere tanto integrasa corno Ia pro- voca la pér'dicla de los segmentos protuberantes del letroelemento y el lelle-
teincinasa DNA-PK¡1 y las proteínas no de los hiatr¡s que queclan, lo qr-re signilica que el sitio de integrar:iór: si:
Ku, que también participan en la cluplica elt L1n par de repeticiones clirectas, una a cada iaclo del retrocirl:rtn-
NHEJ (sección 16.2.4). to insefiaclo.

f 71"3 *"ur¡r:¡E¡ r*dr.¿{*_1* }*s ri§t";1.r., fil *ie}cl* cr+t"ru,:

dm §;e txmramp,xxáq&xxy
l,a transposición puede ejercel efrectos nocivos sobre un genoma. E-stos
efectos superan la obvia alteración de la actividad génica que sobt.even-
drá si un elemento tl'anspolrible ocupa una nLrcva posiciór-r que leside
dentro de la r:egión de codificación de un gen. Algr:nos elemenr:s, sobrc
todo los retlotl'ansposones, contienen secuenci¿rs promototas ). pot..l-r-
ciador'¿rs capaces de rn<¡ciificar los pati:ones cle expresión de genes arl¡'a-
centr:s, y la transposición sucle inrplicar la creación de roturas bicaten¿idas :
..t.t
que, coino virnos en ia sección 16.2.4, pueclen provocar efectos n-lu_y püla t.-::::: ,':...
jucliciales soble la integt'idad de un genoma. Lzrs repeticiones clispe rsas,
de las cualcs pol lo illenos algunas son móviles, l.epresentan casi l¡ ..1. . ,.,
:

ntitad de cada genoma cle nralnífero y una fi'¿tccióu sustanci¿tlmerltc

1nayol' de algunos genomas vegetales. Por 1o tanto, cabría esper¿lr quc
estos genomas y otros hayan desal'lollaclo mecanisnlos para lin:itar cl ''t"'."
,.:., :

uroyilniento de sus elementos transponibles. ..'.:

.:., .:::. ::a:llt-,..

 Resumen 5?¡

Un n:cdo de evitar la tlansposición, tanto dc transpr:sones cli: Djrir\

{onir: de retlocleülentos, podría ser la metilación cle sus secuencias de
l]\3' ya que la metilación es ün nledii: habitual de silencial regiones
gcnomicas (sección 10.i.1). f)e hecho, muchas secuencias de eiementos
irar-rsponibles están hipermetiladas -909á de 1as citosinas metiladas dt'I
gcilürra hun'iano están ubicadas en las secuencias repetidas dispersas*
pcro ha sido difícil obtenel evidencia experimental qr-re vincule esta
nretilación con la supresión c1e 1a transposición. I-{ace poco, se ha mos-
r;ado que mutantes de la plantn Ar*biclopsis thuli*na, que tienen siste-
tur¿is cle metiiación deficientes, presentan un gr:ado cle transposición
m¿l].or: que el norrlal, pel'o no toclos ios tipos de tl'ansposón del genoma
vesetal podrían presentar esta transposición exacerbada. Se están lle-
v¡nclo a cabo nueyos trabajos para invcstigar e1 papel c1e i¿r metiiación
en ,.\rubiclo¡;sis -y extenclcr los estuciios a otros tipos cle organi-srnos.

ffi**l¡rw*r:t
Al principio, se utilizó la recombinación para ciescribil el result¿rdo de1
entrecruzalliento entre pares cle crornosomas homólogos durante la
mriosis. Ahora, este términi¡ también se empiea pala referirse a 1os
eyentos moleculares que son la base de este proceso. Se prodr-rce recom-
binación homóloga entre segrnentos clc molécr,rlas c1e Dl'lA que compar-
t.n una amplia hornología de secuencia. Los modelos iniciales de
l'ecoml-linaciór: lronlóloga consideraban que el prcceso de recombina-
cién se iniciaba c{ln muescas qLle ap¿}recían en Lrn¿¡ o en ambas molécu-
las bicatenarias; ahola se piensa que el punto inicial es ult¿t rotura
bicatenaria de un¿r de estas molóculas. E,i intercambio de cadenas forma
Llna estructula heterodúp1er, que es resuelta por ciegradación, 1o que
cluizá determina ei intercarnbio de segmei:tos dc DNA o la conversión
dc genes. Esdterichi* ¿:oli tjene, colno mínimo, tres vías moleculares
cl* recombinación homóloga. La que se l-ia estudiado en rl¿ryo1'deta11e,
l¿i vía RecBCD, implica el desenlollamiento de uno c1e los colxponen-
tcs de 1a l'econlbinación por L1n par cle helicasas, qlle se unen ¿i la rotu-
ra t¡icatenalia y progresan a lo lalgo de la molécula. En la secuencia de
reconocimiento clenonrinada sitio chi, el complejo RecBCD inicia e1
intel'cambio cle cadenas y la pt'oteína RecA deserlpeña r:n papel cen-
tral en 1a tlansferencia dc la cadena invasol:a a 1a cloble hélice intacta.
l.l rniglación de las ralri¿is clentro del heteroclúplex y 1a resolución cle
l¿r estructula soÍl catalizadas por las proteínas Ruv. Las vías RecE y
ltecF operan de manel'¿ls similal'es ;,- 1os tl'es sistemas de recotnbina-
ción compal'ten una selie cle proteínas. Se conocen pi'oteínas cquii'a-
lentes en ios eucariontes. La reconrbinación lromóloga es responsable
cle 1a leparación posreplicativa de roturas del DNA. La lecombinación
específica de sitio no requiele legiones de hontolcgía extensa entre las
nrolóculas asociadas. Este tipo de recombinación es t'esponsable de la
inserción de genomas cle bactel'iófagos, coitlo el genoma ),, en el clo-
lnosonla bacteriano hLrésped. La integraclón del gen.Jlna )" en DF{A de
L. coli se produce por recombinación entrc un pal de sercuenci¿rs de 15
pb conteniclas dentlo de sitios de unión rnás lalgos. La integración
requiere la integrasa coclificada por el genom¿r i' y el factot' de integra-
ción de1 hr-résped de §. roii. La escisión necesita ia integliis:r y una pro-
teína escisionasa. Los transposones de DNA se tr¿tnspoi"Ien por
recornbinación. El proceso puede ser replicatiyo o conservador; los
clos tipos se prociucen por una serie de eventos descritos en primet' tér-
mino por Shapiro en 1979. Los letroelelrentos se transponen a través
de un IINA ir:terinecliario. qlre es transcl'ito de ia copia madre del
transposón. Después r1e sel'copiado etr DNA bic¿itenario, el retloele-
rnentc) se reinserta en el clol.¡rosoma huésped.
 ff**Éef§4 a *
q*1fg*":fl*
3.*e
* #&tr
e6*qff
ffi$ §f,Br-B
:@ffrÉ1
#"§#-§ §f,&q
d*Li§"1 e&"ékequp§ § \*du" §L,#*J
*'-S F%fr % ^4"*1h. &dlb''e$¡ '*\ d*
&_?F*§E Idl §§ # Ed,*§Sh,^
;i4a &É¡ ; B q+B# § s ffi §ñr) hid'
s§

§§"1 t**xm*s: l*s priírl*r*§ dí*x:rs*i§ mí{li**el

d4:na(

l? 3 ,\ t;uis:riii¡ d* rucocs qeilcS

ileg*pNes tJ: í.., s-{ {tff;.';,:; i; ql*L,,::;: s}, &}\J*§

'' I
d}: l:i {::¡,.r,;,¿ hunraitft los t"li:i¡rros r¡,'tcc
-".,]t ,"-,.- ,t.. ...¿"".
Explicar por qué los biólogos consideran que los primeros genomas eran de RNA.

Describir los eventos que se considera que h¿n llevado a las primeras células a adoptar catalizadores
proteicos y genomas de DNA.

Distinguir las diversas maneras en las que los genomas pueden adquirir nuevos genes.

Dar ejemplos que ilustren el papel de la duplicación de genes en la evolución de las famili¿s multigénicas

Analizar la evidencia de duplicaciones de todo el genoma en las hilorias evolutivas de Soccharomyces

cerevisioe, Arobidopsis tholiona y seres humanos.

Describir la repercusión que han ejercido las duplicaciones de segmentos sobre la evolución reciente del
genoma humano.

Explicar por qué pueden surgir nuevos genes por duplicación de dominios y reordenamiento de dominios.

Evaluar la probable repercusión de la transferencia lateral de genes sobre la evolución del genoma en
bacterias y en eucariontes.

Reseñar cómo pueden haber influido los elementos transponibles en la evolución del genoma.

Definir y evaluar las hipótesis de "intrones tempranos" e "intrones tardíos".

Enumerar las diferencias entre los genomas humano y de chimpancé, y anatizar cómo genomas tan slmi-
lares pueden dar origen a atributos biológicos t¿n diferentes.

La mutación y la recombinación aportan al genoma los medios para eyo-

lucionar, pero aprendemos muy poco sobre las historias evolutivas de los
genomas estudiando estos eventos sólo en las céluias vivas. Por el con-
trario, debemos combinar nuestro conocimiento de mutación y recom-
binación con comparaciones entre los genomas de distintos organismos
para inferir los patrones de evolución de los genomas que han tenido
lugar. Es evidente que este enfoque es impreciso e incierto pero, como
l/eremos, se basa en una cantidad soryrendentemente gfande de datos
concluyentes, y podemos confiar, de modo razonable, en que el cuadro
que surja no estará demasiado lejos, por lo menos en térrninos genera-
les, de la verdad.
 '1airy
.ia:

ii.
il

Capítulo l8 Evolución de los genornas ii

ta,
En e-.te capítul,: invcstigareuos la evolución ios Efenomas desciü lo.s
c1*
orígenes de los sistem¿is bioquímicc-s hast¿t el presente. E-stuciiare¡:ros l¿ls
icleas respec¡o clel rnundo de RI\A, antes c1e la aparición c1c las prim*xis
moléculas de DhiA y examinaremos cómo los genomas c1e DNA han icio
aumentanclo su cr:mplejidad. Por'ú1timo, en la sección i8.4, compar¿rrt-
mr:s el genoma humano con el genom¿i ciel chimpancé piira identi{iclr
los cambios evolutivos ocurlidos durante 1o,c últimos cinco nlilli¡nes 11*
años 5,'qr-re cleben, de alguna maner¿i, conveltiri:os en [o que somos.

§ ffi"§ &*§?*§§:§es:
§ar*a
¡'uJ ffi;y'áxasps'daq
83ts 4¡r4s{ kd d**x
'
g:rx§ll m§§§&ffi*s g§* m&qps
Los cosn'iólogos consid¿ran que el universo comenzó hace alrededor de
14.000 nrillones de años con la gigantesca "explosiÓn primordial" cieno-
minada Big Bang. Los modelos m¿itemáticos sugieren qlle, después de
unq:s 4.000 millones cle años, las galaxias comenzaton a forlrarse a par-
tir de las nubes de gas emiticlas pol el Big l}ang y que, dentro de nues-
tra plopia galaxia, la nebulosa solar se condensó para lormar el Sol y sus
planetas hace 4.600 millones de años (figura 18.1). La Tierla prinritiva
estaba cubierta de agua y los primeros sistemas bioquírnicos aparecielon
en este vasto océano planetario, mientr¿ls que la vida celular estaba bien
establecida para el tiempo en que contenzaron a surgir 1as masas de tie-
rra. hace alrecledor de 3.500 millones cle años. Pero la vida celular fue
una etapa relativamente tardía de la evolución bioquíntica y fue pr:ecerli-
da por: ei surgimiento cle polinucleótidos capaces de autoreplicarse : los

Figura '18.I Orígenes del universo,

las galaxias, el sisterna solar y la
vida celular.

Años atrás
(miles de millones)

&
:M ^-, .Át
Ual *= Primeras células
?i?§tu
 Cenomas: los primeros diez mil millones de años 579

progenitores de los prirneros genornas. Debeinos ir:riciar nuestro estudio

dr la evolución de ios genomas pür estos sistemas precelulares.

TS.t"§ *rigxre*x q** §*s §*fi*rsss

Sr' considela que los primeros océanos tenían un¿i composiciÓn salina
sjmilar a la de los actuales, pel'o la atmósf'era de la Tierra y, por ende, los
gi.rses disueltos en los océanos, eran muy diferentes. El contenido de oxi
gcno de la atmósfera se mantuvo muy bajo hasta que se desarlolló ia
fr:tosíntesis, y es probable que, al pr:incipio, los gases más abundantes
fueran metano y amoníaco. Experimentos que intentaron recrear las
condiciones de la antigua atmósfera han mostrado que descargas eléctri-
cls sobre una mezcla de metano-amoníaco detenr:inan la síntesis quími-
ca de diversos aminoácidos, como aianina, glicina, valina y varios de los
orrr:s hailados en las proteiras. También se forman ácido cianhídr:ico y
{brmaldehído, que participan en otras reacciones para dar origen a otros
aininoácidos, así como pur:inas, pirimidinas y, con menos abundancia,
azúcares. Por 1o t¿into, al menos algunos de los componentes básicos de
las bion-roléculas se podrían haber acumulado en la antigpa quimiósfera.

pri*;*r'¿;: sisl*;l¡::." i;;*,;xir::ia*-i *r.-{.'j'-.' , ,i -; ,r,',..: :n iifu't

i;.:.:;
La polimerización de los componentes básicos de biomoléculas se
podría habel producido en los océanos o podría haber sido pron:rovida
por la condensación y ei secado reiterados de gotitas de agua en las
nubes. En fbnna aitelnativa, la polimerización podría haber tenido lugar
soble superficies sóiidas, quizás aprovechando monómeros inmoviliza-
clos sobre paltícu1as de ar:cilla o en fumarolas hidrotermales. No es nece-
salio preocuparse por el mecanismo preciso: lo impr:rtante es clue es
posible concebir plocesos pu1'amente geoquímicos que podrían inducir
1¡ síntesis de biomoléculas poliméric¿rs similares a las haliadas en los sis-
lernas vivos. Debemos preoüupalnos por ios pasos siguientes. Hay que
jr de una colección aleatolia de biomolécuias a un ensamblaje oldenado
que presenta, por ltr rnenos, algunas de los pi:opiedades bioquímicas que
asr¡ciamos con la vida. E,stos pasos nunca se han reproclucicio en el con-
texto expefimental; por ende. nuestras ideas se basan sobre tod«¡ en la
especulación. ateniperada por cierto grado de simulación cotlputariza-
rla. Un problema es que las especulaciones son ilimitadasr porque el océ-
ano global podría haber contenido fu¡s1¿ lgltl biomoléculas por litro y
podemos permitir que transculran 1.000 millones de años para que se
procluzcan los acontecimiento-c necesarios. Esto significa que no es posi-
ble descartar de entracla r-ri siquiera los escenarios más improbables.

,41 principio, ei apareirte requisito de que 1os polinucleótidos y los polipép-

ridos cleben trabajal' en equipo para producil un sistema biológico con
capacidad de autorrept'oducción detuvo el pr"ogreso del conocirniento
sobre 1os or'ígenes de la vida. Esto se debe a qlls se necesitan proteínas para
c.ataltzar reacciones bioquímicas, aunque no puedan lleval' a cabo su pro-
pia ar:torrepiicació:r. Los polinr"rcieótidos pueden especificar la síntesis de
proteínas y autorreplicarse, pcro se consiclet'aba qllc r'lo podían efectuar'
ninguna de estas dos acciones sin la ayud:i de las pri:teínas. Parecía que el
: sistema bioquímico tendría que surgil fbrnado pol completo de la cr:lec-
ción aleatoria de biomoléculas, porque cualqr"riel estadio internedio no
poclría pelpetuarse. El principal avance llego a mediaclos de la década de
a

:
I980, cuando se clescublió que el RNA puerle tener actividacl catalítica.

Las ribozimas conocidas eu la acttialidad realizatr tres tipos de reacción

bic;química:
'I

Capítulo 18 Evolución de li:s gencrnas
-4.
'?_
Molécula de
HNA primqrdial f;.,.
Nueva copia complementaria
Figura 18.2 Copia de moléculas de
RNA en el mundo de RNA inicial.
Antes de la evolución de las RNA poli-
merasas, los ribonucleótrdos que se
asociaban con el molde de RNA ten-
drían que haber presentado polimeri-
zacirin espontane¿. Este proceso
habría sido inexacto y se habrían
generado muchas secuencias de RNA.
*§t§1'
. ti il.
Autoclegradación, como la observacla en ios intrones de 1os gtupo.r l,
il "v Ill, con capacidad de autocorte y empalme, y en algunos gen§-
mas virales (cuadro 12.4 y sección 12.2.4).
Degradación de otros RNIA. como la llevada a cabo por, entle otras.
la RNasa P (cuadro 12.1y sección 12.1.5).
* La síntesis de enlaces peptídicos, efectuada por e[ componenle rRi\'lA
del ribosoma (sección 13.2.3).
En ei tubo de ensayo, las mo1écul¿is sintéticas de RNA pa1'ticipan en otras
reacciones importantes desde el punto de vista biológico, como la síntesis
de ribonucleótidos, la síntesis y copia de moléculas de RNA, y la transfe-
rencia de un aminoácido ligado al RNA a un segundo aminoácido que
forma un dipéptido, de un modo análogo al papel del IRI{A en la síntesis
plt-iteica. El descubrimiento de estas propiedades catalíticas resolvió el
dilema polinucleótido-polipéptidr: al mostrar que 1os primeros sistemas
bioquírnicos pcdrían haber estado basacios por compieto en el RNA.
En los últimos años, han tomado for:na las ideas acerca del mundo cle RNA.
Ahora, consideramos que las moléculas de RlslA se replicaron, al principio,
en fornra lenta y azarosa, actuando sóio cotno n-ioides para la unión de nucle-
ótidos complementarios, que se pollmerizaron espontáneamente (ligiura
18.2). Este proceso de replicación habda siclo muy inexacto, de manera que
se habl'ían generado divelsas secuencias de RNA, 1o que con el tiet:po lleva-
ría a una o más con propiedades nacientes c1e ribozima, capaces de dir:igil su
pr:opia autorreplicación más exacta. Es posible que operara alguna fottra de
selección natural. de modo que empezaron a predominar ios sistemas de
replicación más eficientes, como se ha ntostlado que ocurre en los sistemas
experirnentales. Una mayor exactituci en la replicación habria permitido a los
RNA aumentar: su longitud sin perder su especi§cidad de secuencia, 1o que
apofta el potencial para propiedades c¿rtaiíticas más complejas, que quizá cul-
minaran en estructuras tan complicadas como lc¡s intrones del gupo I (véase
lignra 12.39) -v los RNA ribosóniicos (véase figuur 13.1 1) actuale.s.
Llamar "genornas" a los prirleros llNA es un poco descabellado, pero el
térrnino protogeüoma resulta interesante para desct'ibil esas moléculas
que se auton:eplical:an y podían dirigir reacciones bioquímicas simples.
Estas reacciones podrían haber incl¡.rido un metabolismo energótico
basado, al igual que hoy. en la liberación de energía libr:e por hiclróli:¡is
de k:s enlaces fosfato*fbsfato de los rii:onucleótidos ATP y GTI] -v l¡r:
re¿rcciones se podrían haber conpartimentado dentro de meirlbrilnas
lipídicas para for:nal las primei:as estl'ucturas cle tipo celular. E.s dificil
iniaginar cónro se poclrían haber {ormaclo lípidos cle cadena larga no
r¿rmific¿ldos por reacciones químicas o catalizadas por ribozimas pero'
una yez presentes en concentraciones suficientes, se podr'ían haber ens¿1111-
blado de moclo espontáneo en membran¿rs, encapslllanclo quizás uno o
más protclgenomas y aportando a los Rl.trA un r¡edio cerrado en el que
puciieran realizar reacciones bioqr:íuricas más controlaclas.
t**s prím*rtrs §*fi{it"n#s d* #f,¡&
¿Cómo evcluc,ionó el mundo de IL§lA al mundo de DNA? Es pri:bable que
e1 pr"imer c¿rmbio importante fuese el clesanallo de enzimas proteicas, que
complcmentaron y con el tiempo leemplazalon la mayor'ía de las ¿lctividacles
catalíticas de l¿is libozimas. Ha-v varias pl"eguntas no respondidas respccto rle
este est¿rclio de evolución bioqr-rinic¿I, como la razón por la cual, en primer
lugzrr, se produio la r'ansición de RNA a proteína. Al principio, rie prrsupllso
quc los 20 ¿lminoácidos cle los polipéptidos apor"tabitn a las proteínas lxíiyor
 Cenomas: lcs prlmeros die¿ mil millones de años 58t

{§,} Una ribozima que también es
una molecula codificante
{ts) Una ribozirna que sintetiza moiéculas Figura 18.3 Dos escenarios para la
codificantes
evolución del primer RNA codifican-
Hibonucleótidos te. Una ribozima pcdría haber evclu-
: on¿do para ejerce r un¿ Ccble
función calalitica y de cod'{'. 1-,.ir il;
o podría haber sintetizadr: una molé-
cule de codificación (B). En ambos
**'"-\ ejemplcs, se rnuestran los ¿minoáci-
Ribozima RNA codificante dos unidos ¿ la moiécula codificante ¡
tr¿vés de RNA pequeños, adaptado-
t\! res: los presuntos progenitores
de los IRNA actuales.
ft"itr?j§1't

r,ariabiiidad química que los cuatro ribonucleótidos de1 RNA, 1o que pelmi-
tia a las enzimas proteicas catalizar un espectro más amplio de reacciones
bioquímicas, pero esta explicación ha perdiclo atractivo a medida que se han
demostrado cada vez nrás reacciones cataiizaclas por ribozimas en el tubo de
ensayo. Una sugerencia más reciente es que la catálisis mediada por protei
iras e-§ más eficiente, debido a la flexibilidad inherente de los polipéptidos ple-
gados en comparación con la mayor dgidez de los RNA apareados por bases.
Ou:a opción es qlle encerar a los protogenomas de RNA dentro de vesícuias
r-,on nlembranas podúa habel instado aldesanollo de las pdmeras proteínas,
pol'que las moléculas de R|'lA son hidrófilas y se les debe dar una cr:bierta
hidrófoba, por ejemplo por unión a moléculas peptídicas, antes de que pue-
dan atraversar una lnembrana o inte¡3'arse a ella.

La tlansición a catálisis mediada por proteínas exigió un cambio radical cle

la función de los protogenornas de RI'IA. En iugar de tener 1a responsabili-
ilad directa de las reacciones bioquimicas c1e las primeras estructures de
ripo celular', los protogenomas se volvieron mo1écuias codificantes cuyo
principal papel era especifical la síntesis de 1as proteínas catalítica.c. F,lo se
sabe si las propias libozimas se convirtiel'cn en moléculas codiflcantes o si
ias ribozimas sintetizalon nroléculas codificantes. aunque las teoías más
conr.incentes ¿lcerca de los olígenes de la síntesis proteica y el código gené- Desr:xi rrlilt¡ñ Lrcleóiidos
tico sugieren que es más probable que la última altemativa sea la con"ecta Reducción t.
(ligura 18.3). Cualquiela que haya siclo el mecanisrno, el resultado fue la Y*t ?
situación palaclójica en la cuai los pr:otogenomas de llNA abandonaron su
papel como enzirnas, para el que eran buenos, y adquilieron una función
cle coclificación, para la qr-re estaban peol aclaptados debiclo a la inestabili-
Transcripción
rlad lel¿rtiva clel enlace fbsfociiéster del RNA (sección 1.2.1). Una transfe- inversa
rencia de la función de coc{ificación al DNA r:rás estable parece casi
inevitable y no hal:i:ía siclo dillcil -le lograr pol reclucción cie los lib<;nucle-
ótidos ¿r desr:.ril'ribcrnucleótidos, que después poch'ían sel polimerizados en
copias de los protogenomas de RNA mecliante una reacción catalizada por' K
una transcfiptasa invelsa (figula 18.,1). Es probable que el reemplazo de
k
§r
uracilo por su delivado metilado ürnina confi¡'iese aún mayor estabilidad al f?l,lA *cdilic*n1*
polinucleóticlo DNA, y 1a aclopción de Dl',lA bicatenalio co¡no molécul¿r de
coclificación fr"re inclucicla, casi sin dr-rda, por' la po"ribilidad de reparal el
daño clel DIJA copiando 1¿r otra caden¿l (secciones 16.2.2y 16.2.1.
Frimera molécula
Según esta perspectiva, los plimeros genomas de DNA estaban forma- de DllA codificante
cios pol mucha-" moléculas separadas, cada una de las cuales especifica-
ba una sola proteína )¡, pol lo t¿lnto, equivalía a un -solo gen. La unión de
estos gcnes en 1os plimelos cl'cnro§o1lÍls, que podría habel comenzado Figura 18.4 Conversión de una molé-
antes cie l¿r tansición a DiriA. habría mejorado la eficiencia de la cli-ctri- cula de RNA codificante en el proge-
bución de genes durante la clivisión celular, pues es más fácil organizar nitor del primer genorna de DNA.
 I

,
..))):.::..::::.:

'18
Capítulo Evciución de los genomas ;;.,..a,.,;..

'
': .l:
... ....':?l:,,,.,....

la distribución equitativa de algunos crornosomas grandes que la de

muchos genes separados. Como en el caso de la mayoría de ios estadios
de la evolución de los primeros genomas, se han propuesto varios nleca-
nismos por los cuales 1os genes podrían haberse unido.

;t; r;r;;;., ..0.r,*entales y los mocielos computarizados son

corlectos, es probable que los primeros estadios de evolución bioqirírni,
ca hayan tenido lugar muchas veces en paralelo en los océanos r.: 1;,
atmósfera de la Tierra primordial. Por lo tanto, es bastante posible que
la "yida" surgiera en más de una ocasión, aunque todos los organisrros
actuales parecen derivar de un solo origen. Este origen único está indi-
cado por la notable similitud entre los mecanismos moleculares biológi-
cos y bioquímicos básicos de las células bacterianas, arqueobacterianas
y eucariontes. Para tomar sólo un ejemplo, no parece haber ninguna
razón biológica o química obvia por la cual cualquier triplete particular
de nucleótidos deba codificar un aminoácido determinado, pero el códi-
go genético, si bien no es universal, es casi el mismo en todos los crga-
nismos que han sido estudiados. Si estos organismos derivaran de más
de un origen, anticiparíamos dos o más códigos muy diferentes.

Si son posibles múltiples oúgenes, pero ia vida modema deriva de uno solo,
¿en qué estadio comenzó a predominar un solo sistema bioquímico? Esta
pregunta no puede responderse con precisión, pero el escenario más proba-
ble es que el sistema predominante fuese ei primero en clesatrollar los
medios para sintetizar enzimas proteicas y, por 1o tanto, probablemente tam-
bién el primero en adoptar un genoma de DNA. El mayor potencial catalí-
tico y la replicación más exacta confericlos por las enzimas proteicas y los
genomas de DNA habrían otorgado a estas células una ventaja significativa
respecto de aquellas que todavía contenían protogenomas de RNA. I-as
células de DNA-RNA-proteínas se habrían multiplicado más rápidamente,
1o que les pemitió ganar la competencia por nutrtentes a las células de RNA
que, a corto plazo, se habrán convertido también en alimentr¡.
I

NH
t-
¿Son posibles formas de vida basadas en moléculas infomativas distintas
\
\/ rl@ee de DNA y RNA? No es imposible que el RNA fuese precedido de alguna
f'J-\ otra molécula infonaativa en el período muy temprano de evolución l.'ir-
r.b
.)
química. En particular, una versión piranosil de RNA, en la que el ¿:tú;lr
VNH adopta una estructura algo diferente, podria ser una mejor opción {uc r-:i
II w
A'i-{ "l{J RNA habitual para un protogenoma inicial, porque las moléculas ap¿lrea-
\-
\/ ,,--(
-/§4e)*i*i4
das por bases que forrna son más estables. Lo mismo es válido para e1 ácido
,/\ N I
nucleico peptídico (PNA), un análogo de polinucleótido en el que el esque'
U leto de azúcar-fosfato es reemplazado por enlaces amida (figura 18.5). Se
o-), ñH
han sintetizado PNA en el tubo de ensayo y se ha mostrado que fot:rran
pares cle bases con polinucleótidos nornaies. Sin embargo, no hay ningu-
\r,/
| ffi
r *G, i:'*
\/@
na indicación de que la probabiiidad de desarrollarse en la mezcla prebié-
N ---( tica fuese más alta para el piranosil RNA o el PNA que para el RNA.
\\
)
fo
o--'\
3§:"A .r&e'$e; ull,s:x&&xa &x
maxxw,*% Wwffiffi%
Si bien la infotmación de fósiles muy antiguos es difícil de interpretar', hay
Figura 18.5 Una extensión corta de evidencia razonablemente convincente de que hace 3.500 millones d* años
un ácido nucleico peptídico. Un
ácido nucleico peptídico tiene un los sistemas bioquímicos habían evolucionado a células de aspectr: sinrilar
esqueleto amida en lugar de la al cle las bacteriai moclemas. No es posible decir a partir cle lós fósi1es qué
estructura azúcar-fosfato hallada en clases cle genomas tenían estas prirneras células .eáles pelo, en f'unción de
un ácido nucleico convencional. la sección-precedente, podeinol inferjr que estaban co*puestos por DNA
.

.
Adquisición de nuevos genes
a

Figura 18.6 La evclución de la vida.

Prirneras células eucarionies

¡;&:,,, i:.,,&,:,:',1'§¡::11:1,§;,, ;,$," ¡'§"r1 Algas multicelulares

REVOLUCIÓN CÁMBRICA

Años alrás
(millones)

bicatenario y consistían en un pequeño número de cromosoraas, quizá sók:

uno, cada uno con muchos genes relacionados.

Si seguimos el registro fósil hacia adelante en el tiempo, observamos la

primera evidencia de células eucariontes -estructuras que se asemejan a
algas unicelulares- hace alrededol de 1.400 millones de años atrás (figu-
ra IB.6) y de algas multicelulares hace unos 900 millones de años. Los
animales multicelulares aparecieron alrededor de 640 millones de años
atlás, aunque hay madrigueras eni-qmáticas que sugieren que vivían ani-
males antes de esta época. La Revolución cámbrica, cuando proliferaron
numerosas formas nuevas de vida inverteblada, se proclujo hace 530
millones de años y finalizó con ia desaparición de muchas de las folmas
nuevas en una extinción masi\¡a 500 millc¡nes de años atr'ás. Descle
entonces, la evolución ha continuado a ritmo acelerado y con diversifi-
cación creciente: los primeros insectos. animales y plantas terrestres se
establecieron hace 350 rnillones cle años, los clinos¿rurios habían estado
y habían desaparecido al final dei Cretáceo, hace 65 millones de años, y
los primet'os hominoides apareciercn sólo 4,5 millones de años atrás.

La evolución morfológica se acompañó por la evolución del genoma. Es

pelig:oso equiparar evolución con "progreso", pero es innegable que, a
medida que se asciende por el árbol evolut:ivo, -ce observan genomas cada
vez más compiejos. Una indicación de esta «:mplejidad es la cantidad de
genes, que varía de menos de 1.000, en algunas bacterias, a 30.000-40.000

!
§81t Capítulc 1B Evclución de los genomas

en los vertebrados corno los seres humanos. Es probable qr-ie dentro de

cada linaje -por ejemplo, dentrr: de las bacterias- los cambios de la canti-
dad de genes l-rayan sido graduales, con la adquisición de nuevos genes
equilibrada, por lo menos en parte. por la pérdida de otros exi-ctentes.
También cabe recordar que las vías evolutivas de algunos organismos han
in-rplicado ttna clisntintLción más que un aumento de la car"rtidad de genes,
lo que l1eva a los genomas mínimos óe Llycoplasmü y otras especies parii-
sitas (sección 8.2.2). Sin embargo, los cambios g:'aduales dentro de hs
iinajes fueron malcados por no menos de dos períodos de transición, curn-
do aparecieron nuevos organismos con gran aumerito de la cantidad i1e
genes. Una de estas transiciones acompañó la llegada de los prinleros euca-
riontes hace alrededor de 1.400 millones de años; es probable que estas
células contuviesen por lo nlenos 10.000 genes (el mínimo en 1os eucarion-
tes modemos) en con-rparación con los 5.000 o menos típicos de los prüca-
riontes. La segunda transición se asoció con la liegada de k:s primeros
vertebrados poco después del final del Cámbrico; éstos probablemente
tuviesen no n-renos de 30.000 genes, como los veltebrados modernos.

Hay dos maneras fundamentaies en las que un genoma podt'ía adquirir

nuevOs genes:
s Duplicando algunos o todos los genes existentes en el genoma.
* Adquiriendo genes de otras especies.

Ambos eventos han sido importantes en la evoluciÓn del genorna. colrlo

se verá en las dos secciones siguientes.

3*"k"1 &;*qu§sia?*m d*
r:q¡*ry*s §*ir**s f*r
n" ;t:+i"''i€. ri* #*ln§í¡';rriám
En 1970, l;" prop,-r* por pdmera vez una ftrnción básica cle la duplicación
de genes en la evolución del genollla. E1 resultado inicial de la duplicación de
genes selá dos genes idénticos. Lin-iitaciones selectivas garantizarán que uno
de estos genes coriselve su secuencia nucleotídica odginal, o alguna muy
similar, de manela que pueda continuar aportando la función proteica cum-
plida r:dginalmente por: la copia única del gen antes de que tur"iera lugar la
duplicación. Es posibie que el segundo gen esté sometido a las misrnas lir¡ri-
taciones selectivas, sobre todo si el aumento de la velociclad de síntcsis clul
producto génico, factible por la duplicaciór-r, le confiere al organismi: un
beneficio (figura 18.7). Sin enrbargo, es más fi:ecuente que 1a segunda copia
no otor€fre ningún beneficio y, por 1o tanto, no esté sujeta a 1as mismas pre-
siones selectivas y acumule así mutaciones aleatorias. La evidencia ntuestra
que la mayotía de los genes nuevos que sul€en pol dupiicación adquieren

Figura 18.7 Tres escenarios para el ,¡A*e*trMd&&¡¡at

resultado de la duplicaciÓn de un gen. : Duplicación de un gen

.,:,,,,:@:,..-:.. w,r "i .

t§d%Érñ@e**g|ryk@t

Presión selectiva sobre ambos genes Presión selectiva sobre sólo uno de los genes

,,,.,,..4W--.-.@... ., @Flq ..
tá@weeww&e1 tÁ--@W''

Los genes se Una copia se degrada Ura c*pia *,1qr:i*rr

mantienen similares r lrlr nt taTíl l: lll,:..;:t",
 Adquisición de nuevcs genes

ñLitaciones pcrjudiciales que los desactivan. de rnodo que se ci:nvierten en

scurlogenes; e1 eramen de los seudogenes existentes indica que las mutacio-
nes de desactivación más comunes son mutaciones clel marco de lectura y ter-
minadoras, que se producen dentro cie la región codificante clel gen. Pelo, en
ocasiones, las nlutaciones podrían no desactivar el gen, sino inducir una
nlleva función génica útil para el organismo (véase figur:a 18.7).

Considerarenos prir:ielo la eyidencia de duplicaciones pasadas de genes

ci:ntenida en las secuencias de los genorxas actuales pala estudiar des-
pués los mecanismos que posibilitan la duplicación de los genes.

lar! s**J*.üri*s d* f*s ,s::**r¡;*:;

,i "..".."
i:¡*rf*n *.yi'.:üi;l *:*i;i;i.,:
i--- c,,J:,,¡ -,^;{-^'"1,/"-"-" L.- 't.; "'..,> i"' ' -:r,:,r,

El e*amer, ,-,-,á, ,o*".o cle lu ,"cti"ncia c1e un genoma aporta arlplia evi-
dencia de que muchos genes han surgidr: por eventos de duplicación. La
importancia del primer escenario ilustrado en la figura 18.7, donde la
nlayor concentración del producto génico resuitante de la duplicación de
un gen es beneficiosa y estabiliza la duplicación, es ayalada por los nume-
rosos ejernplos de lamilias rnr"rltigénicas formadas por genes con secuencias
idúnticas o casi idénticas. Los principales ejernplos son los genes de rRNA,
cuyo núnrero de copias val'íil de dos en hlycoplasma genitalitLrn a 500 o
Figura 18.8 Evolución de la superfa-
ruás en Xeno¡:us laevis, con casi la misma secuencia en todas ias copias. Se
milia de los genes globina de los
presume que estas r-r-rúltipies copias c1e genes idénticos reflejan ia necesidad seres humanos. Los miembos de la
de -sintetizal con lapidez rRNA en ciertos estadios de1 ciclo celular. Cabe superfamilia se encuentran ahora en
cbselvar que la existencia de estas familias multigénicas indica no sólo que diferentes cromosomas. El gen de neu-
ha l-rabido duplicaciones de genes en e1 pasado, sino también que debe roglobina está en el cromosoma 14;
haber un mecanismo molecular que garantice que los miembros de una el de citogiobina, en el cromosoma 17;
y el de mioglobina, en el crornosoma
I¿rmiiia consel'ven su identidad a 1o largo de 1a evolución. Esto se denon:i-
22. El complejo de u-globrna se
na evolución concertada. Si una copia de la familia adquiere una llutación
encuentra en el cromosoma 16 y el
vcntajosa, es posible que la nlut¿rción sL'pt'opague por toda la lanrilia hasta complejo de B-globina, en el cromoso-
que todos los miembl'os ia plesenten. La lranel'a más plobable cle loglarlo ma I l. Ma, hace millones de años.

Globina ancestral
-800 Ma

-550 l\¡la

-500 Ma
-450 Ma

ñ *200 Ma

§&
f\ -15O Ma

§!
,dI
.{fl
{ -"{
§I
Ez a2 e1 u!
,-. ----ffii@._..-..-.
rá -'¿*!ritr8r*¡**r ¡r,.'..J*..
-
,Y.-..e -..

i
:
i\.Jeuroglobína Citoglobina Mioglobina a-Globina p-Globina
 lz
,:
: ::..:t::ta.:a.:.:
: :.::a.

5§6 Capítulo IB Evolución de los genomas . .. :::..:..,:,::::.... .

.,i.:"'
:.:l.t'':t,:
es por conversión de genes que, cornü se describe en la sección 17.1.1'
puede determinar que la secuencia de una copia de un gen sea reemplaza-
da por toda ia secuencia, o parte de ella, de una segunda copia. Por lo tarito,
múltiples eventos de conversión de genes podrían mantener la identidad
entre las secuencias de cada miembro de una famiiia multigénica, sobre
todo si esos miembros están dispuestos en tándem.

El tercer escenario de la figura 18.7 da por resultado la acumulacién d*

mutaciones en el gen duplicado, que le otorgan una función nueva y útil.
También en este easo, las familias multigénicas aportan muchas indica-
ciones de que estos eventos han sido frecuentes en el pasado. Ya hernos
señalado que las duplicaciones de genes en las familias de genes de glo-
bina llevaron a la evolución de nuevas proteínas globinas utilizadas por
el organismo en diferentes estadios del desarrollo (véase figura 7.19).
Observamos que todos los genes de globina, tanto los tipos cr como p,
tienen secuencias nucleotídicas relacionadas y, por lo tanto, forman
parte de una superfamilia que incluye genes que especifican diversas
otras proteínas que, como las globinas de la sángre, pueden unirse a
moléculas de oxígeno. A partir de los grados de sirnilitud presentados
por pares de genes de la superfamilia es posible deducir el patrón de
duplicaciones de genes que dio origen a los genes actuales y aplicando
el reloj molecular (seeción 19.2.2) a los datos, es posible estimar hace
cuántos millones de años tuvo lugar cada duplicación. Estos anáiisis
indican que una duplicación de alrededor de BO0 millones de años atrás
Figura I8.9 Evolución de los genes dio origen a un par de genes ancestrales, uno de los cuales evolucionó al
de p-globina de los mamíferos.
'l gen mod"*o dá la proteína cerebral neuroglobina y el otro dio origen a
Reimpreso de Cenomics, Vol. 3,
Tagle et ol.,'The B-globin gene todos los demás rniembros de la superfamilia (figura 18.8). Hace alrede:
cluster ...',741-76A, 1992, con dor de 250 milloaes de años hubo una segunda duplicación en Ia vía que
autorización de Elsevier. ileva a las globinas sanguíneas; uno de los productos formados fue un

Marsupiales
Ancestro
terio L. t..t:t: .- Proto-p

Ancestro
euterio
rh f5
Pérdida de r¡ Pérdida de'y; Conversión de ñ por B; Pérdida de n;
conversión de 6 por p; desaciivación de r¡; conversión de E por B;
desactivación de § duplicación de 1 desactivación de 6
'.-@'
,.-''']
I ,1,§
I Duplicación y
v
I desactivación de 6 Conejo

. - -iútL-L**- ü -á¡¡¡i€-t - ¡ry&& ¡ ¡

;;:W&§;;W;i
Ser humano r13
ZarigüeYa

: ::, ..: rlrph2 rfBh3 p1 p2

Ratón

Cabra
 Adquisición de nuevos genes 5§7

qen que, mediante otra duplicación, dio oligen a la mioglobina. que es Complejo (cluste) Aox
rA-W:,L_-
ictiva en elmúsculo y a ia citoglobina, que está presente en muchos teji-
i-|-r.:, pero cuya función todavía se desconoce. Los linajes proto-ü y I

pruto*B se dividieron por Lrna duplicación que se produjo hace Duolicación Mosca
450 r¡illones de años y las cluplicaciones dentro de las familias de los I
genes de u- y p-globina tuvieron lugar durante los úlrimos 200 millones
de años. Dentro de este marco temporai rnás reciente, es posible dedu- .-@-¡
cir no sóio el patrón de duplicación del gen, sino también algunos de los Anfioxo
cambios más detallados producidos dentro de cada gen. Por ende, se It' Duolicación
han inf'erido los eventos que llevaron a los diversos grupos de genes de *
B- globina presentes en diferentes mamíferos (figura 18.9).

Observamos patrones de evoiución similares cuando comparamos las

secuencias de otros genes. Por ejemplo, los genes de tripsina y quimio-
i¡ü[Wiiñ§t§§&§ü&&ü;!J*i Vertebrados
tripsina están relacionados por un gen ancestrai común, que se duplicó
hace ahededor de 1.500 millones de años. Ahola, ambos codifican pro- I Duplicación,
teasas que intervienen en la degradación proteica, en el aparato digesti- I p¿lo¡oa de un complejo

vo de los vertebrados: la tripsina cofia otras proteínas en aminoácidos

arginina y lisina, y ia quimiotripsinei, en fenilaianinas, triptóf'anos y tiro- ir:ii%:i
sinas. Por io tanto, la evr:lución de los genomas ha generado dos funcio-
nes proteicas complementarias donde, originahnente, había só1o una. l:t.llli:

Do¡ac áa a la+a
¡¡r'li;Aa
Otr:o ejemplo llamativo de evolución de genes por duplicación correspon- (actinopterigios)
de a los genes homeóticos selectores, ios genes de desan'olla clave respon-
sables de especificar los planes corporales de l<¡s animales. Como se
ccmenta en la sección 14.3.4, Drosophila tiene un solo compleja (cluster)
de genes homeóticos selectores, denorninado HON{-C, que consiste en Figura 18..l0 Evolución del com-
plejo (ciusfer) génico Hox de mos-
ocho genes, cada uno de k:s cuaies contiene una secuencia de horneodomi- cas a peces de aletas radiadas
nio que codifica un motivo de unión al DNA del producto proteico (véase (actinopterigios).
figura 14.37). Se considera que estos ocho genes, así como ott'os genes de
hr¡meoclominio de Drosopltila, han surgido mediante una serie de dupii-
caciones, que comenzaror\ con un gen ancestral que existió hace alrede-
dur de 1.000 millones de ¿iños. Las iunciones de 1os genes modernos,
cada uno de los cuales especifica 1a identidad de un segmento difelente
de la mosca de la fruta, ofrecen una visión atractiva cle cómo ia duplica-
ción de genes y la divergencia de secuencias podrían haber sido, en este
caso, ios procesos de base responsables del aumento de la complejidaci
nrolfológica de ia serie cle organismos clel árbol evolutivo de Drosophilct.
§i se sube más en el árbol evolutivo, se obselva que los vertebrados tie-
üen cuatlo complejos génicos Hox (véase figr"rra 14.37), cada uno de 1os
cuales es una copia reconocible del cornplejo cle Drosophilu, ton simili-
tudes de secuencia enlre 1os genes que ocupan posiciones equivalentes.
La implicación es que, en el linaje de los vertebrados, hubo dos duplica-
ciones, no de cada gen Hox, sino de todo el complejo (figura 18.10). No
se han asignado funciones a toclos 1os genes Hox de los vedebrados, pero
creemos que ias velsiones adicionaies presentes en ellos están relaciona-
das con la mayor complejidad de su plan corporal. Dos obsel'vaciones
avalan esta conclusión. El anfioxo, un invertebrado que presenta algunas
características primitivas de k:s vertebi'ados, tiene dos complejos Hox,
que es 1o que cabría esperat de un "protoveÍtebrado" primitivo. Los
peces de aleta ladiada (actinopterigios), quizás el glupo más diverso de
vertebrados con un vasto espectro de variaciones clil'erentes de1 pian cor-
polal básico, tienen siete complejos Hox.

p*drí*r: §}{*r/*{{}{ I d:;pIirr:r:ir¡,: r:l* §!¡r3üí

!-3i,,,*rsr::; ¡)r*{¿?s*.r
t{ay varios mecanismos posibles de duplicación de un segmento corto de
una molécula de DNA, que posiblemente contenga un gen o un peque-
ño grupo de genes. Por ejemplo:
 Capítulo iB Evo{urión de lcs gencrras
{A) Enlrecruzamienio
5*c**¡:*:r:* rrli]r1iC:i3 homólogos
: ¿ ;&trr,reñ»*liM{i¡*§@1:l:::1k]¡!¡llll#;G
, r s&s*&:ie4§@á,§iii&.§iñrirja;
Duplicación
{B) lntercambio desigual entre cromátides
hermanas
té1@i4,rá:
'** ti.
d
,:, r---**Wn**--.
iC) Durante la replicación del DNA
Horquilla
replicación
de
. . *& *eíE¡Íl&*S-"
""../
-.'---1i
LpJ - J: SÉ**É¿
Fígura 18.11 Modelos de duplica-
ción de genes por (A) entrecruza-
miento desigual entre cromosomas
homólogos, (B) intercambio de-
sigual entre cromátides hermanas y
(C) durante la replicación de un
genoma bacteriano. En cada caso,
se produce recombinación entre dos
copias diferenteq de una secuenci.-l
repetida corta, lo que lleva a la dupli-
cación de la secuencia entre las reoe-
ticiones. El entrecruzamiento desipr:al
y el intercanrbio desigual entre crómá-
tides herm¿rras son, bá,icamente,
iguai:s, exceptf qrre el primero riene
lugar entre crométides de un par de
cro-rojonras honrólogos y el segun-
do, enlre c.o;ná:ide: de ,;n solo cro,
mosorna. En (C), la recombinación se
realiza entre dos doble hr:lices hijas
que recién han sido sintetizadas por
replicación del DNA.
Entrecr.- zamientü desigual. que es un evento de recombinación ini-
ciado por s.cuencias nllcleotidicas similal"es que no se encuentran en
lugar"es idénticos de un par de cron-iosomas horaólogos. Como mue§-
desigual par de tra la i'igura 18.11A. el lesuitado clel enrrecruzamientc desigual
cromosomas puede ser la duplir:ación de un segrnento de D§A en uno dc los pro-
duclus tle l'cecnlbinrciún.
,/l
{¡ I
I Intercarnbio desigual entre cromátides hennanas. que reconoce tl
I
misnro nlecanismo que el entrecruzamiento desigual, perr: inr-olucrl
un par de clr:nlátides de un solo cromosoma (figura 1B^l lB).
Amplificación del DNA, que a veces se utiliza en este contexto para
referirse a 1a dr-rplicación de segmentos de DhlA de bacterias y oti:os
! ;
i,
organismos haploides; las ciupliczrciones surgen por recornbinación
dc'sigual entle i¿ls dos rnoléculas de DNA hijas de una bulbuja de
replicación (figura 1S. 1 1 C).
Deslizamiento de la replicación (véase figura 16.5), que puecle cleter-
minar la duplicación de segmentos cortos, como secuencias microsa-
tr,liites. Es concebible qr-re este proceso pueda duplicar una regiórr lo
suficientemente gtrande para contener todo un gen, aunque esto es
improbable en la práctica.
i
C¿ida uno de los cu¿rtrü pr'ocesos enurneradi¡s lleva a cluplicaciones en
I tánclenr: aquellas en las que los dos segmentos duplicados son adyacen-
+
tes entre sí en el genorna^ Este es el patrón observado en muchas fami-
lias rnultigénicas, conriJ la f'amilia del gen de cr.-globina en el cl.olnosonla
16 hullano ¡, la familia de p-globina en el c¡o¡losoma 11, pe'ono es i¿r
única posibilidaci. Lc¡s miembros cle la {'amilia no siempre están cobca-
lizarlos: por ejemplo, en el genom¿l humano, hay tles genes funcionali--s
pai:a la enzilna metabólica alclolasa, cada unr: en un cromosom¿l c1iÍ'e-
Horquilla
de replicación rente. Estits copias podr"í;rn h¿rbel estado presentes, alguna vez, cürno
. una clisposición en tándem y haberse dispersado como parte de rcorsla-
\.
nizaciones en gran escala ciel genorna, pero también es posible qi,ie las
localizaciones distantes sean una consecuencia del proceso de cl-r¡r1ica-
v
I ción. Éste sería el casc si Ia duplicación se pr:oclujese por l'etrotranspo-
sición, de una ñl¿lner¿l sirnilar a la que se consiclera que llevó a la
fbrmación de seudogenes procesados (véase f-igura 7.2O). Un seudogén
procesado surge cuando la copia del mRNA de un gen es converlirla cn
cDN¡\ y reinsertada en el genoma. La estr.uctura resultante es ul.l s;li-
dogén polque cal'ece de una secuencia prorrotora que no se hailr *rr ,ri
mR.NA. Es concebible que el seudogén se pueda inser.tar al lado rl,:l
pl'omotoi' c1e un gen existente y, así, se torne actiyo al r.alerse cle lstc
pron-lotor pala su propio uso. Los dr:plicados de genes que sulgcn cle
este modo se denominan retrogenes y, tambión en estc c¿tso, se cor-lo-
cen numeLosos ejernpios en dit'erentes genoma-^ (en el gcnoma l':unranr:.
la versión específica testicular del gen de la pir:uvato deshiclrogenesa es
un retrogén). Una cal'acter'ística distintiva de un rettogén es que carccc
de los intrones contenidos en la copia madre del gen, pues éstos no
están presentes en el mllNA. Hace poco, se ha advertido que tan':l:ién
se pueclen labricat' copias completas cie genes, incluidos no sólo los
intrones sino también algunas o toclas las secuencias pr"omotoras, por'
tlanscripción inyersa. Esto puede suceder cuando el itNA que es solrre-
tido a transclipción inversa no es un mlLNA, sino una copia antisenti-
do de1 gen f'abricacla por transcripción del polinucleóticlo "equivocaclo"
(figr-rra 18.12). Estanros comenzando a observar que los RNA antiscn-
ticlo no son infl'ecuentes y que, dc hechi¡, pueden de-sempeñar algún
papcl cn la rcgulación cle los gcncs, quizii con un rnodo r1e acción sil¡ri-
lar ¿ri de lc¡s miclr¡-RNA (sección 12.2.6). Si se convierte en cDl\A, un ..
1,..
RNA antisentido pr:diía apot'rar un duplicado génico funcional, cle lon- ,
j
 Adquisición de nuevos genes 589

D.¡ a¡,r¿¡ ó'^ñ^tr,r Figura 18.12 Una copia RNA antisenti-

I do de un gen conservará los íntrones
4 €'
del gen. A la izquierda, el gen es
transcrito desde su pron-,rotor conven-
cional para generar un pre-mRNA
cuyo intrón es eliminado por corte y
empalme. A la derecha, se sintetiza
5'ii:*1¿;"1:ffi;'3', RNA antisentrdo a partir de un promo-
t^ Corte y empalme {, Ausenc¡a de corte tor corriente abajo. Este RNA no se
I
II S y empalme coúa y empalma, porque las secuen-
* A$n ¡.M,& jM " '.
*--- clas de sus límites exón-intrón no son
,* . * . --ad¿jk§aeáldidte;
las convencionales reconocidas por el
empalmosoma (sección 12.2.2) -

gitud conrpleta, para inserción en el genoÍla, en una posición que

podría estar distante de Ia copia original.

I:r*::,;** *s S#§i*J* l* #*plrr*ri*n d*f #*ñ*'"??# rs{??ñi*i#

Los procesos descritos dan origen a duplicaciones de DNA relativamente
cortas, quizá de algunas decenas de kilob¿rses de longitud. ¿,Es posible que
ha,va cluplicaciones i:rás grandes? Parece improbable que la duplicación de
crorrlosomas enteros haya desenrpeñado algún papel importante en la evolu-
ció¡r del E{enoma, porque sabemos que la duplicación de clomosomas huma-
nos indil'iduales, que crean una célula con tres copias de un clornosoma y
dos copias de todos los demás (condición denominada trisornía), es letai o
prol¡oca una enfermedad genética, col.no el síndrome de Down, y se hait
obseryado efectos nocivr:s similares en mutantes trisÓmicos de Drosophilu
genelados de manera artificial. Es probable que el aumento resultante de la
canúdad de copias de algunos genes, pel'o no de offos, induzca un desequili-
bric de los productos génicos y una alteración de 1a bioquímica celulat".

INTERFASE

11^
.§*eww g;t&e
I
vI
¡:9@&u.''B
..o4"
É'rya'
PROFASE r ,|ffi {:#
'{
%-- *S

MEIOSIS NORMAL MEIOSIS ABERRANTE

Los gametos son haploides Los gametos son diploides

*e'u
o¡#.
- §-§' *ffc%, Figura 18.13 Base de Ia autopoliploi-
§§
lw¡i
ea
i {**¡n-,&
'i re é PROFASE II
*' E dización. A la izquierda, se muestran,
iiX e*¡&{eee d J #
%§ Aé ili en forma abreviada, los eventos nor-
males durante la meiosis (compárese
-"ie**d§
con la figura 3.,l6). A la derecha,
/\ { '!r {\,\ sobrevino una aberración entre la pro-
*--.q*n .,...]]#i- fase I y la profase ll, y los pares de
-*#*&* rd\-) n r.**ra
".#*, _&_ ,tA.
q,#
§** §,
,:,
.fl1df.{
*1P
cromosomas homólogos no se han
*.t#*B§
§&. §.
&#* {@@
§ lll
:t*# !f
fl*roo*$
LtramelO§1"emry
§ts&,if {
§*9
Y eery. separado en diferentes núcleos. Los
S&,Á §.*&d s gametos resultantes serán diploides
&edu@ e!{pedeP .l%*#' t!&e&f
en lugar de haploides.
590 Capítulo i8 Evolución de los genomas
¡,i"*§
Gamero Orproroe\1
I
- caso una célula tetraploide cuyo núcieo contiene cuatro copias de cacla cro-
)$
.l' dresee*
ii «qe***
''l;. ,,::ll"l'
Célula triploide
t
vI
homólogos forman
......i:,.i.,;)ri...
.i.......:../
(lP*w x*./
-
PFTOFASE I
Figura '18"14 Los autopoliploides no
pueden reproducirse en forma exito-
sa con sus progenitores. La fusión de
un gameto diploide producido por la
meiosis aberrante ilustrada en la figura
i8.13 con un gameto haploide produ-
cido por meiosis normal genera un
núcleo triploide, es decir, que tiene tres
copias de cada cromosoma homólogo.
Durante la profase I de la rneiosis
siguiente, dos de estos crornosomas
homólogos formarán un bivalente,
pero el tercero no tendrá compañero.
Esto ahera la segregación de cromoso-
mas durante la anafase (véase figura
3..l5) y, por lo general, impide que la
meiosis llegue a una conclusión exito-
sa. Esto implica que n0 se producen
gametos y que el organismo triploide
es estéril. Obsérvese que el bivalente
se podría haber formado entre dos
cualesquiera de los tres cromosomas
homólogos, no sólo entre el par mos-
trado en el diagrama.
Los efectos nocivos de la trisomía no implican que se deba descartar la dupli-
cación de toda la serie de cromosomas de un núcleo. Puede haber duplica.
ción de1 genoma si un er:ror durante la meiosis cletermina la producción de
gametos diploides en lugar de haploides (figura 18,13). Si dos g¿rmetos
Gameto haploide diploides se fusionan, el resultado ser'á un tipo de autopoliploidía, en este
:.
mosoma. La autopoliploidía, al igual que otros casos de poliploidía (secrión
'lr 18.2.2) no es infrecuente, sobre todo entre las plantas. A menudo, los auto-
.lll' polipioides son viables porque cada cromosoma tiene todavía un compi"rñel'r
homólogo y, por 1o tanto, puede fcrrmar un bivalente durante Ia meiosis. §str;
permite 1a reproducción exitosa de un autopoliploide, pero en general irnpi-
de que se reproduzcan con el organismo original del que derivó. Esto se clebe
Dos cromosomas
a que un cmzamiento entre, por ejemplo, un tetraploide y un diploide datía
r:rigen a descendientes triploides, que no se podrían reproducir debido a que
r, unbivalente
una serie completa de sus cromosomas careceúa de compañeros homólogos
(figura 18.14). Por 1o tanto, la autopoliploidía es un mecanismo que puede
inducir la especiación, dado que un par de especies se suele definir como dos
organismos que no pueden reproducirse entre sí. De hecho, se ha observ'ado
La tercera copia la generación de nuevas especies vegetales por autopoliploidía, en especiai
no tiene homólogo por Hugo de Vries, uno de ios redescubridores de los experimenti:s de
Mendel. Durante su trabajo con la hierüa del asno, Oenothera lamsrckianu,
de Vries aisló una versión tetraploide de esta planta normalmente diploide,
qtre denominó Oenathera gigas. La autopoliploidía es menos común en los
animales, sobre todo en aquellos con dos sexos distintos, debido quizás a los
problemas que surgen si un núcleo tiene rnás de un par de cromosomas
sexuales. Sin embargo, no es imposible, y por lo menos un mamífero, la üz-
cacha colorada de 1a Argentina, tiene un genoma tetraploide.
i - ': ::
' r.' ., :-;. :-.. ..'; -'.'. . :. - :i:.ti'; r ..,'
.,,,,'-,,."....,,,.'.
I-a autopoliploidía no induce de manera directa un aumento del nunte-
ro de genes, porque el producto inicial es un organismo que sólo tiene
copias adicionales de cada gen, más que algún gen nuevo. No obstante,
aporta e\ potenciul para un aumento, ya que ios genes adicionales no -con
esenciales pala ei funcionamiento de la célu1a y, pol' lo tanto, pueden
presentar cainbios por mutaciones sin afectar la viabilidad del organis-
mo. Recordando esti:, ¿hay alguna evidencia de que la duplicación ,l*
todo el genoma haya sido importante en la adquisición en gran esc¿1¡ d*
-qenes
nuevos dur¿rnte 1a historia evolutiva de los genomas actual*si'
A partir de 1o que sabemos sobre la manera como cambian los genomas con
el tiempo, podiiiimos anticipar que será bastante dificil obtener evidencia
sobre la duplicaoión de todr¡ el genoma. Muchas de ias copias adicionales dc
genes resultantes de la duplicación del genoma se degladarjan hasta el punto
de ya no ser visibles en ia secuencia clel DNA. Se identificarían 1os genes que
son conselvados porque su función dr"rplicada es útil para el organismo o por-
que han adquirido nuevas funciones, pero sería difícil distinguir si han surgi-
ck, por dupiicación de todo el genoma o por duplicación de segmentos rnucho
más pequeños. Para señalar una duplicación del genoma sería necesario
hallar glandes gTLrpos duplicados de genes, con el mismo orden de genes_en
ainbos gmpos. En qué medida set"án todavía üsibles estos gnipos dr"rplicado-i
clel genómá dependirá de la frecuencia con la que los episádios de recombi-
nación pasados hayan desplazado los genes a nuevas posiciones.
Para investigar evidencia de ciuplicaciones pasaclas en el gettonla .ilc
Succhnrornyces cerevisiue, se lievaron a cabo análisis de homología (sccclon
5,2,1) y se investigó cada gen de levadr.rra lespecto de todos los demás geires i, l, l:i i'.
: :,: :, : :::,tt :, ):.:..:
: :
..- ..::,.:tt:.,: ,
... tr,.,&i.il..:l
 Adquisición de nuevos genes §9r

dc levadura. Para ser ci:nsiderados descendientes de un eventü de duplica- Cromosoma Vll ma XVi

*ión, dos genes debían tener una identidad de no menos del25atb al compa-
r¡r' i:ls secuencias de aminoácidos previstas de sus productr:s proteicos. Se
idcntificaron así alrededor de 800 pares de genes; 376 de elios pudieron ser
ubicados en 55 grupos duplicados, cada uno de los cuales cr:ntenía por lo
menos tres genes en el mismo orden (figura 18.15), quizá con otros genes
dispersos entre el1os, y los gn:pos cubrían, juntos, la mitad del genoma. Estos
$upas podrían haber surgido por duplicación de segmentos y no de todo el
l
g¿noma. pero si éste fuese el caso, se podúa haber anticipado que algunos de
los genes habrían sido duplicados más de una vez. Por lo tanto, el hecho de
qu* hubiese sólo dos copias de cada gen, y nunca tres o cuatro, avaló el con-
cepto de que las copias surgieron por duplicación del todo ei genoma. Esta
J
posibiiidad se volüó más cierta cuando se obtuüeron secuencias completas
del genoma de ottas especies de levadura. Las compalaciones entre los geno-
mas de Saccharomyces cera,isicte, Khryveromj,ces lactis y Ashbya gossypii
han sidr¡ particulamente informativas. Estas tres especies compartieron un
ancestro común que üvió hace más de 100 millones de años, antes del even-
to de duplicación del genoma inferjdo por el análisis de homología. Si, de
heclro, la duplicación hubiese tenido lugar en el linaje que condujo a S. cere-
visicte, cabría anticipar que esta especie tendría copias duplicadas de muchr:s Figura 18.15 Ejemplo de un grupo
genes presentes como singuletes en los genomas de K. lactis y A. gossypii. duplicado de genes del genoma de
E*cto es así, y este nuevo análisis sugiere que alrededor del 10oá de los genes
5. cerevísioe. Cada uno de los tres
pares de genes que están indicados
del genoma moderno de §. czreuisiae denvande una dupiicación de todo el presenta alta homología de secuencia.
genoma que se produjo hace menos de 100 millones de años. Este grupo y otros duplicados aportan
evidencia de duplicación de un geno-
Se han efectuado trabajos equivalentes con otros genomas; e1 cuadro que ma hace sólo menos de lo0 millones
de años en el linaje de 5. cerevrsioe.
. tanie frecuente en ia evolución de muchos g1'upos de organismos. Por ejem-
p1o, comparaciones entre 1a secuencia del genoma de Arabiclopsis thaliana
' y segmentos de genomas de otras plantas sugieren que el ancestro del geno-
nra de A. thuliana sufrió cuatro rondas de duplicación entre 100 y
20CI millones de años atrás. El genoma humano y los genomas de otros
" mamíferos también contienen tantos duplicados de genes que se considera
' que este linaje ha plesentado por 1o menos una duplicación de todo el geno-
rna hace 350-600 miliones de años.

i" .i,¡bl,,.l ttit rÍi:,:. r;.- *1'.r,rt!i: ¡}írr},}t"S r-r iS ,}=,-j,,0¡n(¡-. úr¡
,1{:, 1.1:.,{td.l¡t
1. #i ü*ff#rff# ¡x¡x¿v,-:* f rJ? #früs SIfi:*ifi{:s
'.,;,,; bi bien en el linaje humano la duplicación más reciente de todo el genoma

?:
::11,i:
Centrómero
iffiM§a wlMw ffi#:*sit¡ w re *ww:..,...
Figura I8.16 Duplicaciones de seg-
rnentos en el brazo largo del cromo-
*""-d* & s ¡q@
soma 22 humano. El diagrama
representa las 34 Mb del brazo largo dei
cromosoma 22 como una serie líneas
I3
12r horizontales delgadas, cada una repre'
11.2 ^: senta I Mb de la secuencia de DNA,
1 1 .1 -:,.:.,., que transcurre desde el centrómero, en
11.1:.:::7
11.2 la parte superio; hasta el telómero, en la
12.1 parte inferior. Este análisis se basó en el
ltrFl#d borrador del genoma humano que con-
12.3 *
1D { tenia I I hiatos en esta región, mostra-
¡onffi dos como barras negras. Los recuadros
13.2 -' I
rosados, que componen el 3,9olo de las
34 Mb, son secuencias que están dupli-
cadas dentro de este brazo del cromoso-
ma y los recuadros azules (6,4olo del
Telómero total) son duplicaciones de regiones de
otros cromosomas.
a

t)

,
592 Capítulo 18 Evoiución de los genomas

tuvo lugar hace un tiempo considerable, el genoma humano no ha estado

inactivo en el período transcurrido. De hecho. es cierto 1o contrario: una sor-
presa apofiada por la sec,uencia del genorna humano ha sido advertir que ha
habido duplicación extensa y frecuente de segmentos coftos del genoma en
e1 pasado relativamente reciente. Esto se ih"rstra en la figura 18.16, que repre-
senta los eventos de duplicación inleridos pam los últimos 35 millones de
años de evolución del brazo largo del cromosoma 2? humano. Como *n el
estudio de la levadura ya comentado, estas duplicaciones se han identificadcr
comparando diferentes partes del genoma, en este caso para detectar regi*-
nes de más de 1 kb de longitud que presenten similitud de la secuencia nucle.
otídica del 90oó o más alta. Este análisis ignora las secuencias repeticlas
dispersas y, por ende, localiza regiones que es probable que sean producto de
eventos de duplicación bastante recientes. Casi 200 segmentos, que represen-
tan más del loah de esta región de 34 Mb del genoma humano, palecen
haber surgido por: duplicaciones que se produjeron dentro de los últimos
55 millones de años. NIás de 10O de estos segmentos son duplicados de
secuencias presentes en otros cl'omosomas; y ei resto soll duplicados con
ambas copias localizadas dentro de este brazo.

El patrón de duplicaciones en el brazo largo del cromosoma 22 es bastante

típico del genoma humano en su totalidad. Cada duplicación vaúa de 1 a
400 kb de k:ngitud, y hay un sesgo definido hacia las áreas adyacentes a los
centrómeros, con duplicaciones relativamente escasas en las regiones n:ás
distales de cada brazo cromosómico. Al considerar el tamaño de estas
ciuplicaciones de segmentos, debemos recordar que el gen humano pro-
medio tiene 20-25 kb de longitud, y que los genes están dispersos de mane-
ra escasa por todo el genoma. Cuando se examinan las secuencias de las
duplicaciones de segmentos surge que pocos de estos eventos de duplicación
detenninan la duplicación de genes enteros, pero que varios involucran par-
tes de genes, y que algunas de estas duplicaciones llevan a ubicar exones
coniente arriba de un gen al lado de exones corriente abajo de un segundo
gen. Algunas de estas nuevas combinaciones son transcritas. pero no se sabe
con claridad si los t'ranscritos son fi:ncionales. Por lo tanto, no se conoce con
certeza el potencial evolutivo de las duplicaciones de segmentos. Dr todos
modos, queda claro que la reconlbinación entre un pff de duplicaciones
intlacromosómicas puede detenainar ia deleción de la región en*e las clupli-
caciones, y que deleciones provocadas de esta manera pueden causax una
enf'ermedad genética. Un ejemplo es el síndrome de Charcot-Marie-lbr;th,
que se maniiiesta a los 5-15 años delnacimiento y que se caracteriza pi:r h
degeneración del sistema nerüoso perifédco, 1o cual provoca debilidad v iliil'
cultad para caminar. El síndrome se debe ¿l la recombinación entre un p*r cle
duplicaciones de segmentos de 24 kb en ei cromosoma 17 humano, que eli-
mina un segmento de 1,5 Mb del genoma. La pérdida de los genes conleni-
dos en este segrxento causa la enfermedad.

Lr¡ *v*lt;ríú¡: *r.: l*s r¡***:nr¡s trsrnbi*n irngsfir* *l

..."¡."",..1 .¡: ',;;,;.'¡,1,.,. rJr .,'1..11r,.6 q: !, ){ j,Xli5
El rango de tamaños observado para las duplicaciones de seg¡nentos del
Figura 18.17 Cada dominio estruc- genoma humano plantea la posibilidad de que los eventos de duplicaciÓn
tural es una unidad individual de ilustlados er-l ia iigura 18.1 1 pudieran, además de dar origen a nuevas copias
una cadena polipeptídica y es codi- de gencs, c¿rusar alteraciones clentro de ios genes existentes. Esta scría <¡tra
ficado por una serie contigua de
nucleótidos. En este ejemplo simplifi-
t'
cado, cad¿ estructura secundaria del
polipéptido se considera un dominio
estructural individual. En realidad, la
mayoría de los dominios estructurales
¡llt
CüCf} - u-a7
consisten en dos o más unldades ,j *-'i.-*t
estructurales secundarias.
 Adquísición de nuevos genes

{A} Duplicación de Cominics Figura 18.18 Creación de nuevos

genes por (A) duplicación de domi-
@.,'#G.@ nias y (B) reordenamiento de
rll
¡¿¿
dominios.

: , ' "., { l. r'¡ ,; ! lr r'r'.. *-

*I Duplicacion oel segmenro genico B

ffi e#;sffi....rGs*ffi!!{i:§ffi* *,
i¡*;*ff:
rlll
ülr¡¡:ii: A ..,,..,., [i*rri¡:r* ñ.].-; §*rrjrrr: §.r, .,,,r,,,, I]c¡:;¡lr: il ,.,,,,,.,.

(B) fieordenamiento de dominios

.#vffiffi.@.
.......__.-G

rtl
J.¿¿
rl
It
tt
,.,,.,§*r::uuü A -,,.,.,, **n:¡nr* § ll.,,,..t].,,**¡¡lrir: Ü:',-,. : -,*.".. .\ . lc;'.¡r',: r

\ I
:;ü ;,

,.,i,,..r.
lll
[i*r:] rni* §. r,i.,,,,,,,i ñsrp;'llü *..,'1,t,::.. §r{xiñ;41 Y,iilli i i i

nranera en ia que se podrían desarrollar nuevas funciones ptoteicas. Esto es

posible porque la rr-rayorí:r de l¿rs proteínas están fonradas por clominios
estructuuilcs, cada uno de los cuales compren.le Lln segmento de l¿r c¿lden¿l
palipeptídica ): pol erlcle, es codificadr: pot una setie contigu¿r de nucleÓti-
cl:s (figura 18.17). Ei reordenamiento cle se$nentos génicos que codific¿in
donrinio-. podría dar por resultado nllevas funcioncs de las ploteínas:
* La duplicación de dominios tendría lr-rgal cuanclo el segnrento gónico
codifica un donrinio estructur'¿il es duplicaclo pol'entloclalzamiento
qr-re
clesiguatr, desiizamiento de la replicación o alpillno de los otros métoclos
que hemos considerado para lar duplicación de secuencias cle DNA
{liglra l8.1BA). La duplicación podría detenlhar la repetición dei Polipéptido colágeno
dominio estmctural en la proteína, que podría ser ventajosa polr sí ',
misma. pol ejen'rplo a1 l.olvel'mírs estable a la proteína. Asii¡ismo, el
: ;*" --"
W -4É&* .tlg *-6;;,;;L '"@-.-..o'ul,
dominio duplicaclo podr:ía cambiar cr:n el tiempo por mutación de su
secuencia codificante, lo qr"te originai'ía una estfl-tctura modificacla
capaz de confelir una nueva actividad a 1;r proteína. Cabe obseruar que
la duplicaciór¡ cie clonlinios hace que elgen se alargue. La elong;rción de
§*v*ue**,0-****ory"rkyrys1ff f 1l
los genes p¿]rece ser una consecuencia genelal de la evolución dc los
gcnoln¿ls: los genes de l<¡s eucaliontes superiores son más iitt'gos, en
pr:omedio, que los de los organismos infeliores. Figura 18.19 El polipéptido colágeno
de tipo I r12 tiene una secuencia repe-
u §1 reordenamiento de dominios se plorlucirí¿¡ cuanclo -qeglnentos que titiva descrita como CIy-X-Y" Cada ter-
coditican dominios estructri'ales de genes lotalmente difet'entes se cer aminoácido es giicina, X suele ser
unen pal¿r lormar un¿r nlieva secuencia de coclific¿rción, que especifi- prolina e Y es, a menudo, hidroxiprolina
ca rlna ploteína híblida o mos¿rico. que tendría una nueva combina- (Hyp). La hidroxiprolina es sintetizada
por una modifrcación postraducción de
ción cle caractel'ísticas estructr-rales y poch'í;r aportal'a la célula una la prol,.ra (stcción 133.3). tl polrpéptrdcr
función biocl:-rímica Ímev¿r por completo (figut'a 18.1813). colágeno tiene una conformación heli-
coidal, pero ¡¡ás extendida
La necesidacl de qr-re lcs segrlentos génicos pertinentes estón separados, cle que la u-hélice convencicn¿I.
594 Capítuio 18 Evolución de los genomas

Figura 18.2O Estructura modular Módulo de dedo

del gen del activadcr tisular del
plasrrrinógeno.
Estructura
I
I I

I -/-/
Aciivador tisular :;.&
'11
'",ffi,,.' .
del plasminógeno
I

I
..:; Factor de crecim¡ento epidérmico

Dominio del factor de crecimiento

modo que puedan redisponerse y reordenarse, está irnplícita en estos

modelos de duplicación y reoldenamiento de dominios. Este requisito ha
iievado a la interesante sugerencia de que los exones podrÍan codificar los
dominios estl-ucturales. En algunas proteínas, la duplicación o el reordena-
miento de exones parece haber determinado, de hecho, las estrr:cturas
observaclas en la actualidad. Un ejemplo es ei gen de colágeno de tipo I a2
cle los vertebrados, que codifica una de las tres cadenas polipeptídicas del
colágeno. Cada uno de los tres polipáptidos de colágeno tiene una secuen-
cia altamente repetitiva compuesta por repeticiones del tripéptido glici-
na-X-Y donde X suele ser prolina e Y hidroxiprolina (figura 18.19). El
gen de tipo t cr2 de poilo está dividiclo en 52 exones, 42 de los ctiales
cubren la parte del gen que codificzi las lepeticiones glicina-X-Y. Denro
de esta región, cada exón codifica una selie completa de repeticiones tri-
peptídicas. La cantidad de repeticiones por exón varía, pero es de 5 (en
5 exones),6 (23 exones), 11 (5 exones), i2 (8 exor-res) o 18 (1 exón). Es
eüdente que este gen podr'ía habel evolucionado por duplicación de exo-
nes, que determinó la repetición de los dominios estructurales.

El reordenamiento de dominios está ejemplificado por el activador tisular

del plasminógeno (TPA), una proteína hallada en la sangre de los vertehra-
dos que participa en la lespuesta de coaguiación de la sangre. El gcn ,.L,,
TPA tiene cuatlo exones, cada uno de los cuales codifica un dr:nliniu
estructulal diferente (figura 18.20). El exón corriente aniba codifica un
módulo "dedo" que le perrnite a Ia pr:oteína TPA unil'se a la fibrina, una
proteína fibrosa hallada en los coágulos sanguíneos y que activa al TPA.
Este exón parece derivar de una segunda ploteína de unión a la fibrina, la
fibronectina, y está ausente del gen de una proteína relacionada, la uroci-
nasa, que no es activada por la fibrina. El segundo exón de TPA especilic.a
un dominio de factor de crecimiento que, en apariencia, se ha obtenido del
gen del factor de crecimiento epidérmico y que pr"rede permitir que eI TPA
estimule Ia proliferación celular. Los dos últimos exones codifican estnrc-
turas "kringle" quc utlliza el TPA para unirse a coágulos de fibrina: estos
exones kdngle provienen del gen de plasminógeno.

El colágeno de tipo I y el TPA representan buenos ejenrplos de la evolución

de los genes pero, lamentablemente, los vínculos clar:os que presentan r:ntre
dominios estructurales y exones son excepcionales y rara vez se obselwan en
otros genes. Muchos otl'os genes parecen haber evolucionaclo por duplica-
ción y reordenauriento de segr:rentos, aunque, en éstos, los dominios estrtlc-
turales son codificados por segmentos génicos que no coinciden con exones
 Adquisición de nuevos genes §95

!,@e6@4:.-.. -.. -..-''rññ

ii@!ffi§*á***e¡¡ rdratÍli4ddf¿;;:nr ¡§*;¡;¡ia*ry¡****¡liie¡¡ r¡*i;*¡$i¿@ery{ryóed¡ Figura 18.21 Los MULE suelen conte-
Proleína similar a Proteina Presunta proteína Presunta proteína ner segmentos de genes capturados
üLrblerta de espora hipotética repet¡da tetratricopéptido relacionada con de los cromosomas huéspedes. Ei
¡a patogenia diagrcma muestra cinco.1fu1ULE adya-
centes del cromosoma de arroz. Los
¡lliri.,;,r',ü]i]i,illl¡,:i,f,Ilii*,,isffiii:i1li,t§sffi.. . ,..--.. ",*.*.. ,
segmentos coloreados son exones de
1Kb genes, y los segmentos grises entre los
.,&&; fxón ;ffi: lntrón ñ;¿;; §ecuencia MULE
exofles y adyacentes a ellos son inlro-
nes. Las banas grises finas en los ex'tre-
mos de las estructuras son las
repeticiones invertidas terminales de los
individuales y, ni siquiela, con $upos de exones. Aun así, hay duplicación y
iransposones MULE. Se presentan las
leordenamiento cle dominios, pero se pl'esume que de una manela nlenos identidades de los segmentos génicos
precisa, y muchos de los genes reordenados no presentan ninguna función cuando se las conoce.
útil. Pese a ser aleatorio, es evidente que el ptoceso funciona, como inclica,
entre otros ejemplos, la cantidad de proteínas que compa¡ten 1os mismos
motivr¡s de unión al DNA (sección 1 1.1 .1). Es probable que vatios de estos
r"notivos evolucionaran de nova en nás de una ocasión, pero es obvio que, en
¡nuchos casos, 1a secuencia nucleotídica que codifica el motivo ha sido trans-
lcrida de una variedad de genes diferentes.

Un posible mecanismo para lnover segmentos génicos por el genoma es la

: asociación con elementos n'ansponibles. En ocasiones, la transposición de un
elemento LINE-I (sección 9.2.1) detemnina que un ft'agmento cofto dei
DlrlA adyacente sea transferido junto con el transposÓn, un proceso denomi-
:
nadr¡ transducción 3', pues el segmento transferido se localiza en el extlemo
j' del eiemento. A veces, se encuentran elementos LINE-I en intrones, de
ülanel'¿r que es concebible que la transducción 3' pueda mover exones
ci:rriente abajo a nuevos sitios ciel genoma. El movimiei-lto de exones y otros
$egrnentos génicos también podría depender de los transposones de DNA
denomilrados elementos transponibles similares a Mutrttor (MULE), que se
encuentran en muchos eucariontes, pero son especialmente comunes en las
plantas. A menudo, los MULE contienen segmentos de genes captulados del
genorna huósped dentro de su secuencia de DNA (figura 18.21). Por lo tanto,
1il transposición de un IVIULE ntueve los segmentos capturados a una nueva
ubicación. Los fuIULE pueden reunir segmentos de cliferentes genes mientras
viaj:rn pol el genoma, 1o que ensami:la nuevos genes híbridos en su leconi-
dr:. Así, los MULE aportan un modo interesante cle impulsar la evolución de
.los genes, pero aún hay varias preguntas no responclidas acerca de su reper-
cr,rsión. En par:ticulal, todavía nc¡ se s¿rbe con ciaridad con qué frecuencia pue-
clen escapar ios segmentos génicos de k:s MULE.

?&,á.3 &#qwáxáe a&xz *x

esw*v*§ mesi*§ &x *kras *§Wr.*&*%
111 segundo rnecanismo posible por: el que un gr:notna puede adquirir:
nuevos genes consistc en obtenerlos de otras especies. Las ci:mparacio-
nes de secuenci¿rs dc genomas bactel'ianos y alqueobacterianos sugieren
que la transferencia lateral de genes ha sido un hecho impot'tante en la
evnlución de ios genomas procaliontes (sección 8.2.3). Los genotnas de
1;r mayoría de las bacteri¿ls y las arqueobacterias contienen por lo lrlenos
algunos cientos de kilobases de DNA. que representan clecenas de genes,
que parecen haber siclo aclquilidos de un segundo pt'ocarionte.

I-os genes se pueclen tlansfedr entre pl'ocariontes por varios mecatrismos,

pero es difícil asegurar la irr"rportancia de esos llrocesos para modelar los
genomas dc estos organismos. Pol ejemplo, la conjr"rgación (sección 3.2.4)
irerraite que los plásn"riclos se desplaccn entre bacterias, lo que suele determi-
nar 1a aclquisic,ión cle nuevas f,unr:ianes génicas por los rrceptores. En el con-
texto cotidiano, la transferencia cle plásn"riclos es importante porc¡ue es el
medio por el cual ios gencs de resistenci¿l a los antibióricos, corlo clorant'eni-
 ::!!r,'
:t...
'18
Capítulo Evolucién de los genomas irl
.:.:

col, kanamicina y estl'eptomicina, se propagan a través de poblaciones bacte- :'

"1",...

rianas y atraviesan baneras de especies, pero su importancia evolutiva es

cuestionabie. Es verdad que los genes transferidr:s por conjugación se pu*-
clen integrar al genoma de la bacteria receptora, pero los genes suelen scl'lle-
vados por transposones compuestos (véase figura 9.178), lo que signilir:r que
la integración es revelsible 1: así, podría no causar un cambio permiinente del
genoma. Es más probable que un segundo p1'oceso para la tmnsferenci* de
DNA entre procariontes, la lansfotmación (sección 3.2.4), haya influirio e,¡
Ia evolución de los genomas. Só1o algunas bacterjas, a saber, mie¡nbros d* 1,..-.
géneros Bacilhs, Pseudornctnas y StreptococcLts, cuentan con mecanirílos
eficaces para la captación de DNA del rnedio cilcundante, pero es probable
que este procesrtr no sea importante cuando nos referimos a una escala de
tiempo evolutiva. Resulta de ma.vor importancia el hecho de que pueda haber
flujo de genes pol translomación entre cualquier par: de procaliontcs, no
sólo entre los estrechamente relacion¿idos (como en el caso de la conjuga-
ción), 1o que podúa explicar las transfelencias que parecen habel tenido
lugar entre los genomas bacterianos y arqueobacterianos (sección 8.2.3).

Las plantas pueden adquirir nuevos genes polpoliploidización. \a henros

visto cómo la autopoliploidización puede determinar la duplicación dcl
genoma en las plantas (véase figura 18. i 3). También es frecuente la alopo.
liploidía, que resulta de la reproducción entre dos especies dilerent¿s y,
como la autopoliploidía, puede dar oligen a un híblido üable. Por 1o gene-
ral, las dos especies que forman el alopoliploide están estrechamente lela-
cionadas y tienen muchos genes en común, pero cada progenitor tendrá
algunos genes nuevos o, pol Io menos, alelos distintivos de genes compar-
tidos. Por ejemplo, el trigo harinero, Triticum uestivwn, es un hexaploirle
que surgió por alopoliploidización entre el trigo duro cultivaclo, T'. turgí-
clum, qut es un tetraploide, y una variedad silveslre diploide, Aegilops
squtrrras{t. El núcleo de la variedad silvestre contenía alelos nuevos para los
genes de glutenina de alto peso moleculal que, al combinarse con los ¿ile-
ios de glutenina ya presentes en el trigo dur:o, determinaron las plopieda-
des superiol'es para fabricar pan plesentadas por los trigos hexaploiclc.s. Prir
1o tanto, la aiopoliploidización puede consideralse una combinación de
duplicación del genorna y transf-erencia de genes entre especies.

En los animales, las bai:relas entl'e especies son menos fáciles de cruzar
y es dilícil lrallar evidencia clara de transf'erencia latelal cle genm de
cualquier clase. Valios genes eucaliontes tienen características ¿lsoci*11..¡:
con seclrenci;is arqueobactelianas o bacterianas pero, en h,rgar' ¡1¡ 5'r¡"ir1
lesult¿ido de la transferencia lateral de genes, se considera que sst¿ls
similitudes se deben al mantenirliento de la evolución paralela durante
rnillones de años. La mayoría de las p1'opuestas cle transferencia cle genes
entre especies animales se centran en rett'ovirus y elementcs transponi-
bles. La tr¿inslerencia de letlovirus entre especies animales está bien
demostrada, así como su capacidad de transportar genes animales enlre
inciividuos de la misma especie, 1o que sugiele que podrían ser posiblcs
mediadores de la transferencia lateral de genes. Lo mismo podría set'
válido para elementos transponibles como los elementos P, que se sabe
que se propagan de una especie de Drosopltilu a otra, y mtrriner, que
también han mostrado transferirse entre especies de Drosophila 3,' que
pueden haber cluzaclo de otras especies a los seres humanos.

' i-r lE li@-! f'l m h bh,Li{i***&n ne q;vqr3t¡L&E*Frq

*n,^á.r-1á*
_ ;,*{ ;/ÉBg4 g&u 4-tá\-Áá§á4-E¿}raÉ"- td
á

-J,-* iiu.:-c {c3ffi e3ffi *x §

l-lasta ahora. hemos concentrado la atención en la evolución clel componen-
te codificante del genoma. Corno el DNA codificante repl€senta sólo el 1.5'¡á
 DNA no codificante y evolucÍón de los genomas

delgenoma humano, nuestra perspectiva de evolución del genoma sería mu_v

incompleta si no dedicá1amos a1gún tiempo a considerar el DNA no codifi-
crnte. La presencia de extensas cantidades de DNA no codificante en los
genomas eucariontes desconcierta a ios evc¡lucionistas moleculares. ¿Por qué
se tolera este DNA en apariencia superfluo? Una posibilidad es que el DNA
no codificante cumpla una función que todada no se ha identificado ¡i en
consecuencia, deba ser mantenido porque sin éi la célula no sería viable. Ni¡
es tan difícil identificar posibles funciones como se podría imaginar. En varios
lugares de capítulos anteriores se ha destacado la importancia de la estructu-
ra de la cromatina, como ia unión de cromatina a sitios intranucleares. Es
posible que parte del componente no codificante de un genoma participe en
estos aspectos de su organización. En forrna altemativa, el DNA no codifi-
cante podúa tener una función de contlol de amplio espectro. hasta ahor-a no
descubierla por los biólogos moieculares. Una ú1tima posibilidad es que el
DNA no c«:dificante no cumpla ninguna función, pero que sea tolerado por
ei genoma debido a que no hay presión selectiva para eliminarlo. Si este con-
cepto es cortecto, ia posesión de DNA no codificante no representa una ven-
taja ni una desventaja y éste sólo se propaga junto con el DNIA codificante.
De acuerdo con esta hipótesis, el DNA no codificante podria ser simplemen-
te DNA "redundante" o parasitario.

Se puede decir poco acerca de la evolución de gran paüe del componente

no codificante de un genoma. Imaginamos que hubo duplicaciones y otros
reordenamientos mediante recombinación y desiizamiento de la replicación,
y que las secuencias divergieron por acumulación de mutaciones, libres de
las fuerzas selectivas restrictivas que actúan sobre las regiones funcionales
del genorna. Si bien se reconoce que algunas partes del DNA nr: codifican-
te, pol'ejemplo las regiones reguiadoras corriente arriba de k¡s genes, cum-
plen funciones importantes, todo 1o que puede decirse de muchas otras
partes del DNA no codificante es que éste evoluciona de manel'a aparente-
mente aieatoria. Pelo esta aleatoriedad no se aplica a todos los componen-
tes del DNA no codificante. En particular, los elemenos transponibles y los
intrones presentan interesantes historias evolutivas y tienen importancia
general en Ia evolución de los genomas.

i,*,3"3 Wlxr*zxmkqss tr'**s;3*ffi$fu§es \{ *v*ál,áüa¿:ffi {3* §**

- Lttuitlii t,

l-os elementos transponibles ejercen diversos efectos sobre la evolución

del genoma en su conjunto. El más significativo es la capacidad de los
transposones de iniciar eventos de recombinación que inducen reordena-
mientos del genoma. Esto no guarda ninguna relación con la actividad de
transposición de estos elementos; sólo está ünculado con el hecho de que
cliferentes copias del mismo elemento tienen secuencias similares ),, por
ende, pueden iniciar la recombinación entre dos partes del mismo cromo- a,rFtecombinación1
soma o entre diferentes cromosomas (figura 18.22). En muchos casos, el
reordenamiento resuitante será nocivo porque se eliminarán genes impor- Transposón 1 Transposón 2
tantes, pero se han documentado algunos casos en los que el resu]tado ha
sido beneficioso. Se considera que la recombinación entre un par de ele-
I Deleción de
I un segmento
mentos LINE-1 (sección 9.2.1), hace ah'ededor de 55 millones de añc¡s, es entre transposones
la causa de la duplicación del gen de B-globina, que dio origen a los miem-
bros G1y Ay de esta familia de genes (véase figura 18.9).

El movimiento de los transposones de un sitio a otra también puede repercu-

Figura 18.22 La recombinación
tir en la evolución del genoma. En la sección 18.2.1 se mencionó la posible entre pares de secuencias repeti-
relocalización de segmentos génicos durante la tlansposición de elementos das, como transposones, puede
LINE y MULE. Asimisrno, la ttansposición se ha asociado con alteración de causar la deleción de segmentos
los patrones de erpresión de genes. Por: ejemplo, el desplazamiento de un del genoma.

598 Capítulo 18 Evolución de los genomas
Figura 18.23 La inserción de un
transposón en la región corriente
arriba de un gen podría afectar la
capacidad de las proteínas de unión
al DNA para activar la transcripción.
Genes cortos
Genoma inicial
ttlll
Itltr
\t//
Proteína de
múltiples
subunidades
I
J Proteína de una
sola subunidad
Wr con múltiples
dominios
I lntrones
Gen discontinuo único
Figura 18.24 "Teoría exóníca de Ios
genes". Los genes cortos de los prime-
ros genomas probablemente codifica-
ban polipéptidos de un solo dominio,
que deben de haber tenido que asociar-
se para formar proteínas de múltiples
subunidades y producir un¿ enz¡ma
efectiva. l\,{ás tarde, la síntesis de est¿
enzima se podría haber tornado más
eficiente por unión de los genes cortos
en un único gen discontinuo, que ccdifi-
caba una proteína de una sola subuni-
dad y múltiples dominios.
'?T1
Activación
Proteína de unión ai
Secuencias reguladoras
corriente arriba
Ausencia de activación
-
.,: , : 'i:
transposón a un nuevo sitio inmediatamente col'riente arriba de un gen
podría afectar la eficacia de las proteínas de unión ai DNA, que están uniclas
a secuencias reguladoras coniente aniba para activar §u transcripción (figu-
ra 18.2i). La presencia de promotores o potenciadores dentro del transpo-
són también podia incidir en ia transcripción al someter al gen adyacente a
un régimen regulador totalmente nuevo. El gen S/p de ratón, que codifica una
proteína involucrada en la respuesta inmunitaria, representa un ejemplo inte-
resante de la expresión de genes dirigida por transposones. La especilicidad
tisular de S/p depende de un potenciador iocalizado dentro de un retrotmns-
posón adyacente. También hay ejemplos en que 1a inserción de un ttanspo-
són en un gen ha provocado una alteración del patrón de corte y empalme.
§§"S.? #r{gex"axru d* l*s
áx"xtr*n*s
Desde que se descubrieron los intrones en la década de 1970, se ha '
debatidosobresusorígenes.HaypocascontroversiaSaCercadelostipos
de los grupos I, II y III (véase cuadro 12.2), porque se suele aceptar quc
todos estos intrones con capacidad de autocorte y empalme evoluciona-
ron en el mundo de RNA y han sobrevivido desde entonces sin sufril'
demasiadas modificaciones. En cambio, hay problemas respecto d¡l ori-
gen de los intrones GU-AG, que se encuentran en grandes carltidades 'l,l
en los genomas nucleares eucariontes.
?;fr*¡:*g t¡: rr: t: r r: r: * s " * " fri l: {* t}*s l*¡d1*: "l
,.,.,...,.
" :,> t;!.,:,'{4,5.-5 (r|j!..' t {-rJJ jJ.rli'-'¿ i
Hubo áir"ruu, de propuestas s<¡bte el origen cle los intrones CU*AG ptr, ;1;,;,,,,:
en general, se considera que el debate gira en tomo a dos hipÓtesiS ofrüüsli.s.
¡a La hipótesis de los "intrones tempranos" postula que los intrones
son muy antiguos y que se están perdiendo, en forrra gr:rdual, de los
genomas eucariontes.
,a La hipótesis de los "intrones tardíos" postula que los intrones son
reiativamente recientes y que se están acumulando, de manera gfa-
dual, en los genomas eucariontes.
FIay varios moclelos diferentes para carla hipótesis. En el caso d.' los
"intrones tempranos", el modelo más convincente es el denominado tam- '..,. 1,,,'.':
bién "teoría de los genes", que sostiene que los intrones se for- :,".1:,,1,,,,;,',,:::¡::i
maron cuando Se Constfuyeron los primeros genonlas de DNA, polo l.l.lii.l lrlrl
"iór1iau
clespués clel fin clel mundo cle RNA. Estos geno*as habrían contenido :,,,',,..,,tl,1,,,,',,.',:
*uihor genes cortos, cacla unr: derivaclo cieuna sola moiécula de RNA 1.1:¡,r':
codificanie y especificador de un polipéptido rnuy pequeño, quizás un ',',:,,,,,, ,,
solo clominio esttuctural. Es probable que estos polipóptidos tuvieran ,.;:'::1:1,.,L'',;,,,
que asocialse en prr:teínas más grancles, de múltiples dominios, para pro- ,y
' :;:;"::,,:, .' ,t .,
",t',. .,
'.. t.:,'.;i::.,',t':::l
 DNA no codificante y evolución de los genomas

Gen ancestral Figura 18.25 Una predicción de la

hipótesis de los "intrones tempra-
nos" es que las posiciones de los
intrones en genes homólogos
deben ser similares en organismos
no relacionados, porque todos los
genes descienden de un gen que
contiene un intrón ancestral,

;-*W-'{3ffi'-",
Genes modernos - en organismos no relacionados
I

clucir enzimas corl mecanislnos catalíticos específicos y eficientes (figura

18.24). Para ayudar a la síntesis de una enzima de múltiples dominios,
habría sido beneficioso que los polipéptidos individuaies de la enzima se
unieran en una sola ploteína, como se observa en la actualidad. Se con-
sidela que esto se logró cortando y empalmando juntos los transcritos de
los minigenes pertinentes, un pÍoceso en el que colabr:ró el reot'dena-
miento del genoma, de manera que grupos de minigenes que especifica-
b¿rn las diferentes partes de cada proteína de raúltiples dominios tuvieran
posiciones cercanas entre sí. En oti'as palabras, los minigenes se convir-
ticron en exones y las secuencias de I)NA entre ellos, en intrones.

Según la teoría exónica de ios genes y otras hipótesis de los "intrones templ'a-
nos", todos los genomas originales tenían intrones. Pero sabemos que hay
ausencia de intrones GU*AG en los genomas bactel'ianos, por 1o tanto, si
estas hipótesis son correctas, debemos presuponer que, po1'alguna razón, se
perdieron intrones-del genoma ancestral bacteriano en un estadio temprano
de su evoiución. Este es un obstáculo, porque es difícil concebir cómo se
pr:dria perder un gran número de intrr:nes de un genoma sin el desgo de alte-
rar muchas lunciones génicas. Si hay alg¡Lrna imprecisión en ia eliminación de
un intrón de un gen, se pelderá una parte de la región codificante o soble-
vendrá una mutación del marco de lectura. 1o que puede lleval, en uno u otro
caso, a la desactivación del gen. La hipótesis de los "intrones tardíos" evita
este prcblema proponienclo que, al principio, ningún gen contenía intrones y
que estas estillcturas invadieron el genoma nucleal eucarionte templ'ano y,
clespués, proliferaron hasta la cantidad observada hoy. Las similitudes entre
las vías de corte y empalme de ios intrc'rnes GU-AG y del gmpo II (sección
12.2.4) sugieren que los invasores que dieron origen a los primelos bien
pt-rdr'ían haber sido secucrrcias dcl grupo II quc escaparon de genomas dc
orgánulos. Sin embar:go, la similitud entre los intrones GU*AG y de1 grupo
I1 no pi:ueba el concepto de "introncs tardíos", porque es igr-ral de posible
crear un modelo de "intro¡-les telrpranos", cliferente de la ter¡ría exónica de
1os genes, en el cual secuencias del grupo li den origen a los intrones
CU*AG, pero en un estadio nrlly precoz de la evolución de ios genomas.

i-,:: t:¡lrj*r,t;.i* r:*t::xl {}i} {{::{li:.* tiir};;;-;::,, r-; .

Una de las razones por: las cuales el debate respecto del origen de los intro-
nes GU-AG ha continuado dur¿rnte más c1e veinliciitco 25 años es que ha
sido difícil hallar evidei-rcia que av¿rle una t1 otra hipótesis, y clue la obtenida
suele ser ambigua. Una predicción de la hipótesis de los "intrones tempranos"
es que debería habe;: una estrecha sirnilitud entre las posiciones de los inti:o-
nes de genes homólogos c1e organisrnos no relacionados. porque toclos estos
genes descienden de un gen ancestral que contit:ne intron*s ({igl'a 18.25).
5e obtuvo un aval inicial para los "intlones temptanos" cuando se demostró
que esto era así en el caso de cu¿rtlo intrones de genes animales y vegetalcs
 600 Capílulo lB Evoiucíón de los genomas

Exones Gen de globina para triosafosfato isomerasa. Sin embargo, al examinar una mayor canticlad
de vertebrados de especies, se volvió más difícil intelpretar las posiciones de los intrones de
r/***4l-\ry.w.á:
',{ este gen: parecía que se habían perdido intrones en algunos linajes, pel.u se
§
{{
e§ á
habían ganado en otros. Este panorama se adapta tanto a los "intrones tcm-
Dominio 1 * Dominio 4 pranos" como a los "intrones tardíos", pues ambas hipotésis tienen en cllen-
Dominios 2 y 3 ta la pérclida, la ganancia o el reposicionamiento de intrones por er.enros tle
recombinación en linajes indiüduales. Cuando se examinan muchos genes cn
numerosos organismos, el cuadro generai es que la cantidad de intrones ha
Fígura 18.26 Un gen de globina de
aumentado de manera gradual durante la evolución de 1os genomas ani¡n:,.
los vertebrados que muestra la rela- les, lo que se esgdme como evidencia a favor de los "intrones tardíos", pes-,
ción entre los tres exones y los cua- al hecho de que los genomas mitocondriales animales no contienen intrones
tro dominios de la proteína globina. del grrrpo II, que podrían complemental los intrones nucleares existentes por
invasiones reiteradas. Por lo tanto, el número de intrones debe haber aunlen- 'l
tado por eventos de recombinación.

Un enfoque altemativo ha sido intentar correlacionar los exones con domi-

nios estmclurales proteicos, ya que la hipótesis de los "intrones tempranos',
predice que sería eüdente un vínculo de este tipo, aun si se tienen en cuen-
ta los efectos de confusión de la evolución desde que los minigenes primi-
tivos fueron ensamblados en los primeros genes reales. Tambián en este
caso, la primera evidencia obtenida avaló los "intrones tempranos". Un
estudio de las proteínas globinas de los vertebrados concluyó que cada una
de éstas está formada por cuatro dominios estructurales, el primero cones-
pondiente al exón 1 del gen de globina; el segundo y el tercero, al exón 2;
y el cuarto, al exón 3 (figura 13.26). La predicción de que debe haber genes
de globina con otro intrón que divide el segundo y el tercer dominio resul-
tó correcta cuando se mostró que el gen de la leghemoglobina de la soja
tenía un intrón en la posición exacta prevista. Lamentablemente, a medida
que se secuenciaron más genes de globina se descubrieron más intlones:
más de diez en total, cuyas posiciones no corresponden, en la mayoría de
los casos, a uniones entre dominios.

Por 1o tanto, los genes de globina cumplen con el principio general que sur-
gió de nuestro debate sobre reordenamienti: de dominios (sección 18.2.1):
que, la mayoúa de las veces, no hay vínculos claros entre los exones de los
genes y 1os dominios esfi.l-icturales de 1as proteínas. Pero, ¿es correcta lrues-
tra definición de "dominio estructural"? Un dominio estructural dentro c1e

una proteína puede sirnplemente no coresponderse con un grupo dc ertrrrr

turas secundarias corno hélices a y hojas B. Una interpretación más ¡*lil
podría ser que un dominio estructural es un segmento polipeptídico r:u-tr:t
aminoácidos están separados por menos de una determinada distancia en la

Auslralapithecus
afarensis ("Lucy") w I

I
tI

au st
Otros
ra lo p itecin os
Australopithecus
africanus W H
ñ

ffi
ffi
§ffi r'..

_*qwñ
Figura 18.27 Un posible esquema de
la evolución de los ser€s humanos
a Homo
:
habitis ryffiH1;gkd ffi
ii'1
,,.,,,,,,.,,,4

,,,
,.,
modernos a partir de ancestros aus-
tralopitecinos. Hay muchas controver- Homo erectus
sias en esta área de investipación v se .i . ::::.::.
'

han propuesto diversas hipétesis rls-

. - ::'
pec'to de las relaciones evolutivas entre
distintos fósiles. Ma, millón de años. Homa sapiens .]'
,¡i,¡,.,:,
' . ;:iai..
 EI genoma humano: los últimos cinco millones de años 60!

estl{ctula terciaria cle la proteína. Se ha sugerido que, cuando se adopta esta

r{*irnición, hay una rnejr:r correlación entre dominio estructulal y exones.

§S.* ffi§ gx*t*rmm §xmx'mffiffi§*:

§*s ax§á§sa§#§ fiü§€** sfi?§§xfix*s d* mffis¡s
Aunque la Fristoria evolutiva de los seres humanos es controvertida, se
sucle aceptar que nuestro pariente más cercano entre los pdn-rates es el
chimpancé y que el ancestl'o más reciente que compartimos con el chin-r-
pancé vivió hace 4,6-5 millones de añr:s. Desde la división, ei linaje huma-
no ha abarcado dos géneros -Austrulopithecus y Llorno* y una serie de
especies, no todas las cuales perteneciet'on a la línea directa de ascenden-
cia del Homo sctpíens (figura 18.27). El resultado somos nosotros. una
especie nueva que tiene lo que son, por lo menos desde nuestra perspecti-
va, atributos biológicos importantes que nos diferencian mucho del resto
de los animales. Entonces, ¿.qué tan diferentes son los cirimpancés?

En 1o que concier:re a nuestros genomas, la respuesta es 1,73oh, que es el

g¡ado de disirnilitud de las secuencias nucleotídicas entre seres humar:<¡s
y chimpancés. De hecho, cuanclo se compalan los genomas del ser hurna-
no y delchimpancé es mucho más fácil hallar similitudes que diferencias.
El grado de identidad de las secuencias nucleotídicas dentro del DNA
ct¡clificante es mayor clel 98,59á, y el29olo de los genes del genoma huma-
ni; codifican proteínas cuyas secllencias de aminr:ácidos son idénticas a las
secuencias de sus homólogas en 1os chirnpancés. Aun en las regiones no
codificantes de ios genomas humano y de chinpancé, la identidad nucleoti
dica lara vez es inf'ei'ior al 97 o,'b. El orden de los genes es casi igual en los dos
g,ünonlas y los cromosomas tienen aspectos muy similares. En este nivel, la
dilerencia más sustancial es que el cromosoma 2 hunano consiste en dos cro-
mosomas distintos en ios chirnpancés (figura 18.28), de manera que óstos, al
igr.ral que otrc¡s simios, tienen 24 pares de cromosomas, mientras que los
seres humanos tjenen sólo 23 pares. Las secuenci¿ts de DNA alfoide ptesen-
1es en 1os centrómelos humanos (sección 7 .1 .2) son bastante diferentes de las
secuencias equivalentes cle los cromosolrlas dei chimpancé y de1 gorila, y los
elenrentos Alu (secciór'r 9.2.1) son i:rás prevalentes en e1 genonta hur-nano,
pclo es prc.rbable qlle estas caracteristicas nos digan más ac:erca cle la evolu-
ción del DNA lepetitivo qr-re acel'ca c1e las dil'erencias entre seres humanos y
ehii:rpancés.

{-as comparaciones de los genom¿}s humano y de chimpancé tampoco han

rcvelado carnbios de genes individuales que podrían, de algún mr:clo ser c1a-
\¡cs para los atdbutos especiales cle los seres humaui:s. Los anáiisis destina-
clos a revelar 1cs genes que han cstaclo bajo selección positir.a en el linaje
humano iran detectado varias asociaciones con degradación de aminoácidos,
lo clue está a la paÍ cür la mayor pr:oporción cle carne consunlicla por los seres
hurnanos en colnparación con los chirnpancés. Los genes quc p1'otegen con-
tra enfenledacles humanas, corno tubelculosis y paluclismo, también han
siclc sujetos a selección positiva. Pero este tipo de análisis no ha descubierto
J
i
rringún gen con fulrciones clar¿is en el clesarrr¡lk: cerebt'al o neut'onal. L¿t
:
l
:
,.

Ser humano
l
:
I
§ &&"ffitr :Ti-: ffi§ffi% hq áff w,w,,§ww&ww wwffiww ffiw ww .,,

, Chimpancé Figura 18.28 El cromosoma 2

w 2# w
.:.

l-lumano es una fusión de dos

:
§ &miwffi wwwlww crornosornas que son
,
,
ffiffi;;iffi,,;:,;i.,§;ffi,Wffi'1 ffi ffiffi independientes en lcs chímpancés.
 iTW
'''','i.":t'll '':

60? Capítulo l8 [volución de li:s genomas

íurica diferencia sustancial de la e-stralctul¿l génica es que los seres humanos

carecen de un segmento de 92 pb del gen para ácido A-glucolil-neuraminici¡
hidroxilasa yt por ende, no pueden sintetizar la fbrma hidroxilada del áciilo
rV-glucolil-neuramínico, que está presente en la supe.r'ficie de aigunas células
de chinrpancé. Esto puedc ejutccr un efecto sobt'c la capacidad de ingr"so crr
la célula de ciertos patógenos ¡, es posible que pueda influir en aigpni:s tipos
de interacciones celulares, pero no se considera que la diferenci¿l sea partir:u-
lamrente significativa. Otros dos genes que son funcionales en lo"q chimpan-
cés parecen haber sido desactivacios por mutaciones puntifomes en el
genoma humano: uno de el1os codiflca un receptor de células T y ei otro, una
proteína quelatina del pelo, pero es improbable que alguno de estos cambios
haya tenido una repercusión sustancial s<¡bre la evolución humana. En cual-
quier caso, pal'ece imposible que las características especiales de los seres
humanos puedan haber sr-rrg-ido como consecueilcia de una desactivación
il¡nocfux$) génica. Por el c,ontral-io. debemos hallar genes cuyas actividarles
se hayan inodificado en lugar de habelse perdiclo. En este aspecto. se ha cen-
trado considerabie interés en elgen del factor cle transcripciÓn FOXP2, pues
cief'ectos de esta proteína provocan la discapacidaci hum¿rna deilominada
disartria, caracterizada por la dificultad pala afiicuiar el lenguaje. Por cr:nsi-
guiente. este gen podría ser la base de la capacidad humana del lenguaje. De
hecho, hay dos arnilroácidos diferentes entre los genes de FOXP2 de seres
humanos y chimpancés, 1o que sugiele que este gen ha sufrido un canrbiir
relativamente leciente, pero el vínculo dit'ectr: entre estas diferencias de ami-
noácidos y la capacidad lingüística hum¿rna es esquivo.

Ahora es evidente que muchas de las diferencias claves, si no todas, entre

seres humanos y chlmpancés lesiden, probablcmente, no en los propios
genomas, sino en la manera como éstos se explesan. Por 1o tanto, la aten-
ción se está desplazando de los genomas a ios transcriptomas y los prote-
omas, y estos estudi,¡s están comenzanclo a sugerir que el patrÓn de
expr:esión del genoma en el cerebro ha sufi'ido cambios sigprificativos en el
iir-raje humano desde la divergencia de seres humani:s y chimpancás. Por
supuesto, esto es precisamente lo que cal:ría espel'ar, pues e§ evidente quc
nuestl'os cereblos son 1o que nos distingue de los chimpancés y de otros
animales. La pregunta fundamental, que todavía no ha siclo responciida, es
si las identidades de ios genes sometidos a regulación positiva o negativa
en el cerebro l-¡umano aportan algún tipo de información.

Se consiclera qlie ios plimeros nr-rcleótidos que se desarrollaron hace v¿ltios

miles dc rnillones de años estaban fotrr-^ aclos pot' RNA y no poÍ DNA. Es pro-
babie que estas moléculas de RNA combinaran una capacidad de autorrcpli-
cación con cierta actividad enzimática y qlle su inciusión en cubieltas
lipíclicas simples diera origen a los progenitot'es cie las prinreras cé1ula-s.
Celtos expedrlentos han sugerido qr-re 1os RNA catalíticos podr{an construir
péptidos cortos, con algunas de las funciones enzi:ráticas de las tibozimas'
l"óbablerrlente, el DNA se desan'olló coll1o Llna versiÓn más estal:le de los
trx'otogenoillas de RNA. Durante la evolución, hubo por 1o menos dos perio-
clos en los que surgieron genornas rlás con"rplejos, en cada caso con m¿¡)'or
c¿rntidad de gelres. Se sabe que la duplicaciór'r de genes es un evento impor-
t¿lnte que puede deter:rninat'que un genoma adquiera nueYos genes. La super-
familia del gen de globina suryió mediante una sede de duplicaciones génicas,
cuyo patróñ -v cronologÍa se pueden inferir comparando las secuencias de los
genes de globina existentes en la actualidad. Los evelltos de duplicaciÓn tam"
irién hu,"t1"niclo una participación inlportantc rlurante la evoiución cle los
genes homeóticos seleitores, que especifican el plan cotporal de los eucation-
tes. Asin-rismo, es posible dupiicar genomas entel'os, y se considel'a qL1. esto
 Resumen

ha sucedido en los linajes que llevarcn a sa¿r/z¿rrüi??-rc€s ceret'isiue. a

.Arubidopsis tlruliunq ¡', tamb,ién, a los vertebrados. Hubo con regularidad
duplicaciones más pequeña.s, d* algunas decenas de kilobases, en la evolu-
ción reciente del genoma humano. Aigunas de ell¿is detemrinarcn nuevas
cornbinaciones de exones v es eüdente que alglnos genes sulgierün por
duplicación o por reorclenan-liento de dominios proteicos codificados por
e,\or-les individuales. Los exones ta¡rbién pueden seltranspor:tados alrededor
de un genoma mediante la unión a elementos tlansponibles. La transfelencia
lrteral de genes pemrite adquirir genes cle otras especies. E,sto ha sido un
hecho habitu¿ll en la evolución de k:s gencmas procariontes, pero es mucho
lnenos fi'ecuente en los eucariontes, excepto quizás en plantas, que pueden
for¡-Lar nuevos poliploides por fusión de germetos de especies relacionadas.
No se conr:ce con claliclad el r:rigen de los intr.ones; hay er,.idencia que avala
t:into la lripótesis de los "ir-ltlones tempranos" que sugiele que los pdmeros
gellomas tenían intrones que se están perdiel-rdo de ntanera gr.adual como la
de los "intlones tardíi:s", que propone que ha habidr: un aumento gradr-ral del
nirinero de intrones. H¿rce cinco millones de años divergieron los linajes del
ser humano y del chimpancé. Los genomas de los ser.es humanos y de 1os
chimpancés todavía presentan un 98,396 de identidad de secuenci¿rs nucleo-
tídicas. y muchos genes dan odgcn a productos p1'oteicos idénticos. Está
t'esultando dilicil identitjcar las características específicas del genoma que nos
h¿ice humanos; ahora se piensa que las diferencias más in'iportantes entre
seres humanos y chimpancÉs podrían no ser los propios genoillas, sino la
manera como éstos se expl'esan.
 b:q § 13 {pñ wr * ,- :: Éf
§ gtrq*SÉ*:'*, 4 Y&*, &&k"q*S
.!ek,$e

§ ili
&§
*"T "\ sFqe S jÉ-\. *tr T f. ?i .*e
s.i §tr iuff**,s j I j,""iIlgl
§ & §-,.Y3k*i* q,.,d "r"¿¡

i.. .,: . " .¿-i.:. .: l. l,' ...^1.'...:

illüinali:::i
l'¡. ? il r:*t*ri: lrj *l *il ;":il: r:i*t l* q*¡:,: ir ;
f i

i,*,..- j."ja -.--: n5.!,1

-1-, i::t
iJ{}':}at i-"t¡'i.r1

{}H irJ
*"i ¡rlliti_ll
{ -. t.- -" ,

Describir las caracterÍsticas claves de un árbol filogenético y distinguir entre árboles inferidos, árboles
verdaderos, árboles de genes y árboles de especies.

Explicar cómo se obtienen los datos con los que se puede reconstruir un árbol a partrr de una alinea-
ción múltiple de secuencias de DNA.

Reseñar Ia base de los métodos del vecino más próximo y de máxima parsimonia para la reconstrucción
de los árboles.

Describir cómo se evalúa la exactitud de un árbol.

Analizar, con ejemplos, las apticaciones y las limitaciones de los relojes moleculares.

Explicar por qué un árbol convencional no puede describir las relaciones evolutivas de algunas
secuencias de DNA, y comentar cómo se utilizan redes para superar estos problemas.

Dar ejemplos sobre el uso de árboles filogenéticos en estudios sobre evolución humana y evolución de
Ios virus de la inmunodeficiencia humana y simiana.

Reseñar cómo se estudian los genes de las poblaciones.

Describir cómo se está utilrzando la filogenética molecular para estudiar los orígenes de los seres huma-
nos modernos y sus migraciones hacia Europa y el Nuevo Mundo.

Si los genolnas evolucionan por acufirulación gradual de rnutaciones, el

grado de diferenci¿r de la secuencia nucleotídica entre un par de geno-
mas debeda indical hace cuánto esos dos genomas conlpaftieron un
ancestro común. Cabría esperar que dos geÍ]omas que diver:gieron en el
pasado reciente presenten fiienos diferencias que un pal' de genornas
cuyo ancestro conlún es más aritiguo. Esto signific¿l que la cornpalación
de tres o rnás genoma;c permitiúa descifrar l¿is relaciones evoiutivas
entle ellos. Estos son los objetivos de la filogenética rnolecular.
610 Capitulo l9 Filogenética molecul¿r
Ci¡DA
Especies modernas
Ancesiro
Figura 19.1 El árbol de la vida. En
parte inferior del "tronco" del árbol, se
encuentra una especie ancestral. A
medida que transcurre el tiempo, evolu-
cionan nuevas especies a partir de otras
previas, de manera que el árbol se rami-
fica en forma reiterada hasta llegar a la
época actual, en la que hay muchas
especies que descienden del ancestro.
§&"X ffi* §m c§as§$§smr!óm a §x $§$mg*ax&€§*m
:tttt:tt:;'
mm§*cax§ev
'1:::tt:t:a
La filogenética molecular antecede en varias clécadas a la secuenciación
l rl:
del DNA. Deriva del método tradicional de clasilicar los organismos de
HI acuerdo con sus similitudes y difcrencias, como lo hizo por priinela vez
dc Linneo de manera integral en el siglo xvttt. Este botánico sueco, que fr:*
&d un seguidor de la sistemática y no un evolucionista, tenía como objeti,rt:
rcalizar una clasificación lógica de todos los organismos conocidos, ptl*i
IH
Bi consideraba que ésta revelaría el gran plan aplicado por el Creador: el
ü Systema I'laturue. No <¡bstante, sin darse cuenta, sentó las bases de los
esquemas evolutivos ulleriores al dividir los organistnos en series jerár-
quicas de categorías taxonómicas, que cr:menzaban por el reino y pro-
gresaban a través del filo la clase, el orden, la f'amilia y el género hasta
I liegar a la especie. Los natulalistas de los siglos xvltl y xtx asemeialon
esta jerarquía a un "árboi de la vida" (figura 19.1), analogía que fue
adoptada por Darwin en El orígert cle kts es¡;ecies {T'he origin of species}
como medio de describi¡ los antecedentes evolutivos interconectados de
la los organismos vivos. Por lo tanto, el esquema de clasificación diseñado
por Linneo se reinterpretó como una filogenia, que indica no sólo las
similitudes entre las especies, sino también sus relaciones evolutivas.
§§.§"? *ríg*xr*s de §m fil*ger:r*:tle,m rsse>§rcag§ar
Cualquiera que sea el objetivo: elaborar una clasificación o inferir una f-ilo-
genia, los datos pertinentes se obtienen por examen de los caracteres varia-
bles de los organismos comparados. Al principio, estos caracteres consistían
en características morfológicas. pero se introdujeron datos moleculares en
una etapa sorprendentemerite temprana. En 1904, Nuttall utilizó pruebas
inmunológicas para deducir las relaciones entre diversos animales; uno cle
sus objetivos era ubicar a los seres humanos en su posición evolutiva ccrrec-
ta respecto de otros pr"imates, Lrn tema que retomaremos en la secciÓn
19.3.1. El trabajo de Nuttall mostró que se pueden utilizar datos molecula-
res en filogenética, pero este enfoque no se adoptó de manera amplia hasta
fines de la dácada c1e 19501 la demora se debió, en ga¿rn medida" a limitacio-
nes técnicas, pero también, en parte, a que la clasificación y la lilogenética
debieron sufi'ir sus propios cambios evolutivos ¿tntes de que se pudiet'a reco-
nocer por completo el valor de los datos moleculares.
L;: {**étí** y n,:: c{r;dísti*: r*qxí*{** q{{}r1$*s s*ri*s #* d*f*s
Estos carnbios comenzaron en 1957 con la introducción de la fenética. Lrn
nuevo método filogenético que cuestionaba el concepto prevaleciente de clue
las clasificaciones debían basalse en comp¿rraciones entre una cantidad limi-
tada de calacteres que los taxonomistas consideraban importantes por una u
otra lazón. Los fenetistas argumentaban que las clasificaciones debían abal-
car la mayor cantidad posible de car¿icteres valiables, que se puntuaban en
fonna nuniéric¿r y se analizaban mediante métodos matemáticos rigurosos.
I-a introducción cle ia fenética fue seguida diez años más tarcle por otro
enfoque filogenético, denominado cladística, que también clestaca la
necesidad de glandes series cle datos. pero difiere de la fenÉtica en que
no otol'ga igual importanci¿r a todos los caracteres. E,l argumento es que,
para infer:ir el orclen de rarnificación de una filogenia, es necesario dis-
tinguir los caracteres quc apol'tan una buena inciicación de relaciones
evolutivas de otros c¿iracteres que podríar"r inducir a erl'or:. En aparien*
cia, esto poclría retrotraernos al enfoque plefenético, pero la cladístic¿
es mucho menos subjetiva: en lugar de presumir qué caracteues son
"importantes", exige definir la importancia evolutiva de c¿rda cal'ácter.
 De ia clasificación a la filogenética molecuiar 6l I

En particular, se minimizan los errores del patrón de ramificacién den-

tro de una filogenia reconociendo dos tipos de datos anómalos:
,:
* Efolución convergente, u homoplasia, que tiene lugar cuando el
rnisrno estado de carácter evoluciona en dos linajes diferentes. Por
ejemplo, tanto las aves como los murciélagos tienen alas, pero estos
últimos tienen una relación más estrecha con ios mamíferos sin alas
que con las aves (figura 19.2A). El estado de carácter "posesión de
. alas" induce a emor en el contexto de la filogenia de los vertebrados.

s,, Estados de carácter ancestrales, que deben ser distinguidos de los esta-
dos de carácter derivados. Un estado de carácter ancestral (o plesio-
morfo) es uno presente en un ancestro común remoto de un grupo de
organismos; por ejemplo, cinco dedos dei pie en los vertebrados. Un
estado de carácter derivado (o apomorfo) es uno que evolucionó a par-
tir del estado ancestral de un ancestro común más reciente y, por lo
tanto, se lo observa sólo en un subgrupo de especies del g:rrpo estudia-
do. Entre los vertebrados, la presencia de un solo dedo del pie, como en
los caballos rnoderrros, es un estaúc de carácter dedvado (figuta
19.28). Si no advertimos esto, podríamos consluir en qse los seres
humanos están más relacionados con las lagartijas, que tienen cinco
dedos del pie como nosotros, qse con los caballos.

§s posrb/e abtener grand*sserres ds dofos estudionda

lcs ca¡"srte res malecu lsres
La fenética y la cladística han tenido una relación incómoda en los últi-
mos cuarenta años. La mayoría de los biólogos evolucionistas actuales
favorecen a la cladística, aunque un enfoque cladístico estricto arroja
algunos resultados que, en apariencia, contradicen la intuición: un ejem-
plo notable es la conclusién de que los pájaros no deben tener su propia
clase (aves), sino que se los debe incluir entre los reptiles. Pe«> ambas
metodologías comparten la necesidad de contar con grandes series de
datos matemáticos como material básico para reconstruir las filogenias.
La dificultad de obtener series de datos de este tipo cuando se emplean
caracteres morfológicos fue una de las principales fuerzas que impulsa-
ron el desplazamiento gradual alempleo de datos moleculares, que ofre- Figura I 9.2 Anomalías filogenéticas.
cen tres ventajas respecto de otros tipos de información filogenética: (A) Que las aves y los murciélagos
tengan alas es un ejemplo de evolu-
* Cuando se utilizan datos moleculares, un solo experimento puede ción convergente. (B) El único dedo
aportar información sobre muchos caracteres diferentes: por del pie de los caballos es un estado
ejemplo, en una secuencia de DNA, cada posición nucleotídica es de c¿rácter derivado.

(A) (B)
ru
§

r- §

Í -*-re &

ii;:jf1¡*

,..,.. ,*" *ryi.}1**ir:#

,-.t::t. dl#lt 1s
* "-, r\.:
Al¡c Ausencia de alas AIas 5 dedos del pie 1 dedo del pie dadac
vevvv
dal
ee!
nio
Frv

611 Capítulo 19 Filcgenéirca molecular
- üly - &ie - 1lc - L*; -Asp -Ar1-
,t,f ?;iT ?.,]r__?-
GGAGCCA I ACA : AG,.\-
- GG,AGC,\ ATTT;TG AT /,,GA -
rt¡lll
-GlX-,&1* -
il* -Fh*-A:p-4r1"
Figura 19.3 El DNA aporta má5
información filogenética que Ia pro-
teína. Las dos secuencias de DNA
difieren en tres posiciones, pero las
secuenclas de aminoácidos, en Llna
.ola po:;cir-.r. [:i.s posiciones cst.:n
-ceñaladas por puntos azules. Por 1o
tanto, dos de las sustituciones de
nucleétidos son sinónimas y una e5
no sinónima (váase figura 16.11).
.-:!*ql,t.
:'
un car'ácter con cu¿]trc estados de carácter: A. C, G :' T. Por' 1o
tanto, se pueden generar grandes series cle datos moleculares ccn
1'elativa rapiclez.
* Los estados de calácter molecular no dejan lugar a dud¿rs: A, C, G 1'T
son fáciles cle reconocer y no es posible confundir un nucteótido ccn
otro. Al¡1rnos cal'acteres morfológicos, colrlo los basados en ia forma r1e
una estructura, a veces no son tan fáciles de ciistingr.rir debido a super-
posiciones entre diferentes estados de carácter.
* Es fácii cünvertir datos moleculares a fbrma numérica y. por eniie,
son pasibles de análisis matemático y estadístico.
Las secuencias de nioléculas de proteína y DNA aportan ios datos n-iás
clerallados e inequívocos pala la filogenética moleculaf, per:o las técnicas
de secuenciación de proteínas no se difundieron hasta fines de la déca-
cla de i960, y la secuenciación rápida de DNA no se desarrolló hasta
10 años después. Por 1o tanto, los primeros estudios dependían. en gl'un
medida, de evaluaciones indirectas de variaciones de DNA o proteic:is,
que lecurrían a uno de tres métodos:
* Los datos inmunológicos, como los obtenidos por Nuttall, implican
determin¿rciones del gr ado de reactivid¿icl cruzada obsei-v'ada cuando un
anticuerpo específico para una proteína de un organismo se mezcla con
la misma prr:teína de un organismo diferente. Cabe recordar que en la
sección l4.2.1aplendimos que los anticuerpos o inmunoglobulinas son
proteínas que ayudan a protegel al organismo contra la invasión de h¿rc-
terias, virus y otÍas susiancias no deseadas mecliante la unión a estos
"antígenos". Asimismo, las proteínas actúan como antígenos, de mane-
ra que si se inyecta [3-globina humana. por ejempio a un conejo. éste
fabrica un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína. El anti
cuelpo también presentará r'eacción cruzada con 1as S-globinas cle otrrls
vertebrados. pol'que éstas tienen estfucturas similales a la versión
h:-nlana. El graclo de reactividad cruzada depende del grado de simili-
tud con Ia proleína humana de la §-globina investigada, 1o que aporta
Ios datos de semejanza empleadr¡s en el análisis filogenético.
* La electrofr:resis c1e proteínas se utiliza para comparar las plopie-
dacies electroforéticas y, pol encle, el grado cle similitucl de proteí-
nas de diferentes organismos. Est¿r técnica ha resultado útil prrlr
comparar especies estrechamente relacionadas y variaciones r:1lr',
rniembros de una sola especie.
* Los datos clc l:ihridacióir DNA-DNA se obtienen pcr hibriciación de
lnuestr¿ls cle DNA de los dos organismos corrlparaclos. Se desnalura-
liza;r 5, se inezclan las muestras cle DNA. cle manera qllc se f'orr:ren
moléculas hibliclas. I-¿r estabilidacl de e.stas moiéculas depende de1
grado cle sin"iilitud entre las secnencias nucleotídicas cle ios dos D|{A,
y se rnide cletenlinanclo la temperatura cle fusión (véasc figura 5.8):
ést¿i es más alt¿i en un híbrido estable qlle en uno nlenos estah¡le . Las
temperatllr'as cle fusión obtenidas con DNA de diferentes piires dc
organismos ¿'rpol'tan los datos utilizaclos en el análisis filogenótico.
Hacia fines cle los años i960, estos métoclos inclirectos habíar"r sido ccmple-
mcirtados por un creciente nírmero de estudios cle secuencias cle proteínzts
y clurantc la dácada de 1980, comenzó la práctica en gr¿ln esc,ala cle 1¿r filo-
genética basacla en DhiA. En 1¿r actualiclad, todar,ía se utiliz¿ur secr.rencjas
proteica,s en alg¡unos contextüs. pelo ahola e1 DNA se h¿l convertidi:, pot'
mucho, en la molécula estudiada pledor:rinantc. Esto se debe sobre toclo ¿t
que aporta más int"or:nación f-ilogenética que la proteína, pues las -sccllen-
§
Reconstrución de árboles filogenéticcs basada en DNA 615
,

cias nucleotídicas cle un par de genes homóli:gos contienen ntayot infomra- (A) Un árbol no enraizado
ción que 1as secuencias de aminoácidos de las proteínas correspondientes,
va que las mutaciones que provocan carnbios sinónimos modifican 1a . Ramas
secuencia de DNA, pero no ¿ifectan la secuencia de aminc¡ácicii:s (figura
n'r.t
19.5). Asimismo. se puede obtener información totalmente nueya por aná- ,,,,'
... ',,
..:,r'
\,..
Nodos
externos
,r' '...,
fisis de la secuencia de DNA debido a que es posible examin¿rr la variabiii- * Nodos il
dad de las regiones codificante y no codificante del genoma. La facilidad internos
con que se pueden prepai'ar n-luestras de DNA para análisis de secuencia
por PCR (sección 2.3) es otra razón fundamental del predominio del aná-
lisis de DNA en ia filogenética molecular moderrra.
{B} Arboles enraizados
Además de las secuencias de Dlr{A, la filogenética molecular emplezr
marcadores de DNA como RFLP, SSLP y SNP (sección 3.2.2), en parti- C
culal para estudio-s intraespecíficos, col]to los orientados a conocer las
'-t ¿"/
nrigraciones cle poblaciones hum¿rnas pr:ehistóricas (sección 19.3.2).
ó,/
^'f
*-**--*-d.
l,{ás adelante en este capítulo se consideran diversos ejemplos sobre el ¿'2 U\

uso de secuencias y marcadores de DNA en filogenética molecular, pelo

*
ñ

primero es necesario estudiar con más detalle la metodología aplicada

en esta área de investigación de los genomas.
*..
t't -.ü
YB "4"

ffi"X ffiesmerum&s-ax«e§*sx dw a&rfum§wm

:§ S$$mmms:x{&*á«ws \./ ^ t
t""- ''
......'
t:i

\ ,/^
áxxxsmx§m *§s ffiru&
El objetivo de la mayoría de 1os estudios filogenéticos es reconstruir el
v
I
i/'
j

i c
patrón arbóreo que desclibe las relaciones evolutivas entre los organis- a

mos estucliados, Antes de exarrinar la metodología empleada debemos

observar más de cerca un árbol típico para familiarizarnos con la termi- ¡l
tt
nología básica aplicada en el análisis fiicger-rético. ñ**-¡¡\)-U
\,/
1

"§*.?.? {aexcá*ríst!r,:s r!*ur.s iJ* :l*s ¿&rh.*§*s J

1

aiir:gen¿i:ticns bas* C{-}s e;i ffi i{d

En la figura 19.4A se muestra un á¡:bol filogenético típico. Este átbol
podría haber sido reconstluido a partir de cualquier tipo cle clatos com-
parativos pero. colno estamos interesados en las secuencias de DNA.
presumirei:-ros que nluestra l¿is lelaciones enlle cltatlo genes homólogos,
clenominadosA, B, C y- D. La topotrogía de este árboi comprende cuatro i
uudos externo§, cada uno de los cuales representa uno de los cuatro I
1

genes que hernos comparado, y dos nudos internos, que corresponden

a genes ancestrales. La longitucl de 1as ranras indica cl glado de diferen-
ci¿l entre los genes replesentaclos por ios ilndos. Est.- se c¿rlcuia cuando
se comparan las secuencias, conto se comenta en l¿i sección 1g.2.2. Figura i 9.4 Árboles filogenéticos.
(A) Arbol no enr¿izado con cudtro
nodos externos. (B) Se pueden dibu-
Iln la figura 19.4A se ütllestra un árbr:lno enraizado. Io que significa que éste jar los cinco árboles enraizados a par-
es sólo una ilustración de las relacicnes entre A, Ij, C y Il, y nada nos dice tir del árbol no enraizado mostrado en
acerca de la serie de eventos el'olutivos qr:e llevalon a estos genes. I-{ay cinco la parte A. Las posiciones de las raíces
r.ías evolutivas posibles, cada una representada por Lln árbol enraizado clis- estén indicadas por los números en el
tinto, conro muestr¿i la figura ll9.4B. Pala clistinguir enrre ellos, e} aná1isis bosquejo del árbol no enraizado.
filogenético clebe incluir por kr meüos un grupo externo de referencia, qtre
es un gen homólogo que sabemcs que está menos estrech¿lnlente lelaciona-
c1o con A, B, C y D que estos cuatxo genes entre sí. El g.r-rpo externo de refe-
rencia permite localizar la raíz del árboi e icier-ltificar }a r,ía evolutir,.a con'ecta.
Los critelios empleaclos al elegir un gfi:po extel'no cle rcferencia dependen
mucho del tipo de análisis que se esté rcalizando^ Pt¡r ejemplo, sr-rpongamüs
que 1os cuatro genes homólogos de nuestl"o ár'bol prol.ienen cle ser.hum¿rno,
chimpancé, gor:ila y orangután. Pcdríamos empleal entünces conlo €il1rpo
extemo de leferencia el gen homólogo de otro pdmate, como el manclril, que
6t4 Capítulo 19 Filogenética molecular

sabemos por eyidencia paleontológica que se ramificó del linaje que lleva a
seres humanos, chimpancés, goriias y orangutanes antes de la época del
, Ser humano ancestro común de esas cuatro especies (figura 19.5).

El árbol {ilogenético constn:ido de genes de primates presenta un patrón

§!!i}i.e clerelaciones relativamente simple. La mayoria de los árboles son más com-
§#
##;il
Chimpancé
plejos y necesitamos términos para distinguir los tipos de relación observa-
"\ dos (figura 19.6). Se dice que dos o más secuencias son monofilétims si
derivan de una sola secuencia de DII{A ancestral común. Un grupo rl*
Iri,.:§ffi Gorila secuencias monofiléticas se denomina clado si comprende todas las sec.ueli-
cias incluidas en el análisis que descienden de ia secuencia ancestral en la
raíz del clado. Si el grrrpo excluye algunos miembros del clado, ese glrpo
Oransután es parafilético. En cambio, si dos o más secuencias de DNA derivan de
ffi diferentes secuencias ancestrales, se dice que ese grupo es polifilético.
'1tli§ai. r*.
§:;*1; 11'.',r..
MaAdril Nos referimos al árbol enraizado que obtenemos por análisis filogenético
como un árbol inferido. Esto destaca que representa la serie de eventos :a:

evolutivos que se infieren de los datos analizados, y quizá no sea igual a1

árbol verdadero, que representa ia serie real de eventos producidos. En
Figura 19.5 Utilización de un grupo ocasiones, es posible estar bastante confiado en que el árbol inferido es el
externo de referencia para enraizar un árbol verdadero, pero la mayoría de los análisis de datos filogenéticos son
árbolfilogenético. Se enraiza el árbol proclives a dudas que, probablemente, deterninen que el árbol inferido
de genes de ser humano, chimpancé, difiera en algunos aspectos del árbol verdadero. En la sección 19.2.2 se
gorila y orangután con un gen de man-
investigan los diversos métodos utilizados para asig¡ar grados de conlian-
dril, poque sabemos, a partir del registro
de fósiles, que los mandriles se dividie- za al patrón de ramificación de un árboi inferido y, más adelante en este
ron del linaje primate antes de la época capítulo, se analizan algunas de las controversias surgidas como conse-
del ancestro común de las otr¿s cuatro cuencia del carácter impreciso del análisis filogenético.
especies. Véase más información sobre
análisis filogenético de seres humanos y
otros primates en la sección I9.3. i . lr! rlrl,*l*s s* r:¡*l;l-i ¡l;3 si.]/l i¡:,-¡*J*-: * i*l *¡i*/¡*; ri; * ,,"
El árbol mostrado en la figura 19.5 representa un tipo común de proyecto de
filogenética molecular cuyo objetivo es utilizar un árbol de genes, reconsttui-
do de comparaciones entre las secuencias de genes ortólogos (ios derivados
Figura 19.6 Filogenia de los mamífe- de la misma secuencia ancestral), para inferir la historia evolutiva de la espe-
ros, que ilustra los términos claves
empleados para describir diferentes
tipos de relación observados en los
Canguro
árboles filogenéticos. Se utiliza el can-
guro como grupo externo de referencia. cabras
Los números corresponden a los tiem- 29_ Ovejas,
Ganado vacuno
t-65
r Llr
pos de divergencia estimados para los
Iinajes indicados, en millones de años. Cerdos
B5
Los seres humanos y los chimpancés
Caballos
son monofiléticos, porque compaften un I
ancestro común que vivió hace 4,5-5 7r5 I- Perros
millones de años. Los seres humanos, r-45
Gatos
los chimpancés, los gorilas y los orangu-
tanes forman un clado, pues todos deri- Conejos
van de un solo ancestro común que
vivió hace 13 millones de años. El grupo Hatas
indicado es parafilético, porque excluye a Batones
ovejas y cabras, que comparten el
mismo ancestro común que los otros
miembros de este grupo. Los cerdos y
los caballos son polifiléticos, ya que tie-
nen diferentes ancestros comunes. En el
t-
Ír-
Monos del Nuevo Mundo
(p. ej., tití)

Monos del Viejo Mundo

(p. ej., macacos)
caso de los cerdos, este ancestro vivió
l-25
hace 65 millones de años y también dio
origen a ovejas, cabras y ganado vacuno;
LT
13
Orangután
Gorila
en el caso de los caballos, el ancestro 7
Lr chimPancé
data de 75 millones de años atrás y ll-
5L r:,r.: :i-,

también dio origen a gatos y perros. Ser humano

 Reconstrución de árboles filogenéticos basada en Dl.iA 6t5

{A} Árbol de genes {B) Árbol cie especies Figura I9-7 Diferencia entre un árbol
r¿rt' I
de genes y un árbol de especies.
,i /'
0e
EvenlOS --d{ Eventos de
mulac)ory--/rt" \",
\/\\ \ ..*\
,/\ \
\t'\ \GenB
\\ \ \\
\\\\
\\\\
q\ \\
\\ \ Genc \\ §*pxr:i* *
\
\\ \\
\ §** t)
cie de la que se obtuvieron los genes. La presunción es que el árbol de genes,
basado en datos moleculares con todas sus ventajas, ser'á una representación
n1ás exacta y menos ambigua del árbol de especies que la obtenida por com-
paraciones morfblógicas. A menudo. esta presunción es correcta, aunque no
irnplica que el árbol de genes sea igtal a|árbol de especies. Para que fuera
así, los nudos intemos de los árboles de genes y de especies tendrÍan que ser
precisamente equivalentes. Por 1o general, no 1o son porque:
{ Un nudo interno de un árbol de genes representa ia divergencia de
un gen ancestral en dos alelos con diferentes secuencias de DNA:
e.sto se produce por mutación (figura 19.7A).
. Un nudo interrro de un árboi de especies representa un evento de
especiación (figura 19.7F-): esto sucede porque la población de espe-
cies ancestrales se dividió en dos grupos que no pueden reproducir-
se entre sí, a menudo porque quedaron geográficamente aislados.

El punto importante es que no es esperable que estos dos eventos -muta-

;ión y especiación* oclrrran al mismo tiempo. Por ejempli:, el eyento de
mutación podría preceder a la especiación. Esto implicaría, para empezar,
que ambos alelos del gen están presentes en la pobiación no dividida de la
especie ancestral (figura 19.8). Cuanclo se produce 1a división de la pobla-
ción, es probable que ambos alelos todavía estén presentes en cada uno de
1os dos glupos resuitantes. Ti'as la división, las nuevas pobiaciones evolu-
cionan de manera independiente. Una posibilidad es que los resultados de
la deriva genética aleatsria (secciór"r 19.3.2) induzcan la pérdida de un
a1elo en una población y que se pierda el otro en la otra población. Esto
establece los dos linajes genéticos distintos que infelimos pol'aná1isis filo-
genético de las secuencias génicas presentes en la especie modema que
resulta de ia evolución continuada cle las dos poblaciones.

¿Cóuro afectan estas consideraciones la equivalencia de los árboles de genes y

de especies? Hay diversas irnplicaciones. dos de las cuales son las siguientes:
+ Si se utiliza un reloi molecular (sección 19.2.2) para establecer el
momento de 1a divergencia de los genes, no se puede suponer que
éste también sea el momento de1 evento de especiación. Si el nudo
datado es antiguo, por ejemplo de hace 50 millones de años o más,
quizá no se advierta el error. Pero si el evento de especiación es rela-
tivamente reciente, colno cuando se comparan primates, podría
haber una difelencia significativa entre la fecha de divergencia de los
genes y la del evento de especiación. Figura 19.8 La mutacién podría pre-
,, ceder a la especiación, lo que
Si el prinrer evento de especiación es seguido con t'apiclez de un segundo determina un tiempo incorrecto
evento cie especiación en una cle las dos poblaciones lesult¿intes, el orclen para un evento de especiación si se
de ramificación del árbol de genes poclría ser diferente del obser-vado en utiliza un reloj molecular
5I§ Capítulo 19 Filogenétita molecuiar

Figura 19.9 Un árbol de genes

puede tener un orden de ramifica-
ción dlferente de un árbol de espe- ,rr* &§ilte*¡*fr
cies. En este ejemplo, el gen ha
presentado dos mutaciones en la
especie ancestral: la primera mutación 4* l!.§uta*i**
dio origen al aleio "rojo", y la segunda,
al alelo "azul'1 La denva genética alea-
toria asociada con los dos eventos de
especiación ulieriores determina la
aparición del linale de alelo verde en
la especie A, el linale de alelo ¿zul en
la especie B y el linaje de alelo rojo
en la especie C. La filogenética mole- Especiación ..-.4
cular basad¿ en las secuencias géni-
cas reveiará que la división verde-rojo
se produjo antes que la divisién rojo-
azul, lo que originó el árbol de genes
ilustrado a la derecha. Sin embargo, el
árbol de especies real es diferente,
como se muestra a la izquierda.

ü x
Á. ,rr I -¡o er ¡¡¡r ioe &r**{ ri* gen*s

el ár'bolde rspecies. Esto puede suceder si los genes de la especie moder-

na derivan de alelos que ya habían aparecido antes del primero de los dos
eventos de especiación, como se ilustra en la figura 19.9.

3§.3"3 Wxq"*taxkr{a{{,#a: cÍe §*s ;*a'hm§*s

En esta sección, consideraremos cómo se lleva a cabo la reconstruct!Ó;r
de los árboles con secuencias de DNA y nos concentraremos en lü§ 1)11:1-
trc pasos principales de1 procedimiento:
* Alineación de las secuencias de DNA y obtención de los datos com-
parativos que se empiearán para reconstruir el árbol.
* Conversión de los datos comparativos en un árbol reconstruido.
* Evaluación de la exactitud de1 árbol reconstruido.
* Uso de un reloj molecular para asignar fechas a Ios puntos de rami-
ficación del árbol.

i,r luil¡:r*rí,i:x d* f*; r*tu*:;r:¡*:; ¡:'r r:. ."-"-:-,;: -:.":...:;i:t *'{ ¿'s*¡:;¡*i
:..,,"-.',' .;; 1.,. i.r'.;"':.', íi, ,i .':..' -..',.u
Los datos utilizados en la reconstrucciÓn de un árbol filogenético basa-
da en DNA se obtienen por comparación de secuencias nucleotídicas'
E,stas comparaciones se ef'ectúan alineando las secuencias, de lrlanel'a
que se pueclan puntuar 1as cliferencias nucleotídicas. Ésta es la partt'cl'u-
.liul .1.'to.1a ia empi:esa porque, si la alineación es incorrecta, e} árbol
resultante sin duda no será el árbol vercladero.
 Recrnstrución de árboles filogenéticos basada en DIriA 6t?

(Ai Alineación simple de secuencias

El prir::cr ploblema por considerat es si las secuen¡i¿1;r {ue se están ali-
n:nndo son homó1ogas. Si lo son, deben derivar, por definición, de una AGCAA TGGCCAGACAATAATG
sce uencia ancestral comiln (-sección 5.2.1) y. por ende, hay una base sóli- AGCTATGGACAGACATTAATG
<ia para el estudio fiir:genético. Si no son homólogu,.. rro comparten un
ancestl'o común. El análisis filogenético hallará un ancestro común por-
qr-rr los métodos aplicados para la reconstrucción de árbr:les siempre {B) Aiineación de secuencias más dificil
gei")eran un árbol de alguna desclipción, aunque los datos sean por com-
GACGACCATAGACCAGCATAG
pleto erróneos, pero el árbol resultante no tendrá ninguna impcrtancia GACTACCATAGA. CTGCAAAG
biclógica. Con algunas secuencias de DNA -por ejernplo, los genes de
p-globina de diferentes vertebrados- no es difícil estar seguro de que las
GACGACCATAGACCAGCATAG
secuencias comparadas son homólogas, pero esto no siempre es así, y GACf ACCATAGACT - GCAAAG
uno de los errores más comunes que surge durante el análisis filogenéti-
co es la inclusión inadvertida de una secuencia no homóloga.
Posibles posiciones de la indel
Una vez establecido que las dos secuencias de DNA son homólogas, el
siguiente paso es alineallas para podel compalar nucleótidos homólogos.
E,r: algunos pai'es de secuencias, éste es un ejercicio triüal (figura 1 9.10A),
Figura l9. lO Alineación de secuen-
pero no t¡s tan fácil si las secuencias son relativainente disímiies o han cias. (A) Es fácil alinear visualmente
divergido por acumulación de inserciones y deleciones, así como de rnuta- dos secuencias que no han presenta-
ciones puntiformes. No es posible distinguir inserciones y deleciones entre do un gran grado de divergencia. (B)
sí cuanclo se corllparaÍl parcs de secuencias, de manera que nüs relerirnos Alineación más complicada en la que
a e1las como indeles. Coiocal las iildeies en sus posiciones collectas suelr no es posible determinar la posición
ser la parte más difícil de la alineación de secuenci¿rs (figura 19.108). correcta de una indel. Si se cometen
errores al ubicar las indeles en una
alineación múltiple, es improbable
Algunos pares de secuencias pueden aiinearse de manera confiable en forma que el árbol reconstruido por análisis
visual; para p¿lres rnás complejos, Ia alineación podda ser posible por el méto- filogenétrco sea correcto. En este dia-
clo de la matriz de puntos (figura 19.1i). Las dos secuencias se escriben en gram¿, Ios asteriscos rojos indican
1os ejes x e y de un gláfico, y ir:s puntos ubicados en los c-uadlados del papel nucleótidos que son iguales en
del gráñco en las pr:siciones con'esponden a nucleótidos idónticos de las dos ambas secuencias.
secuencias. La alineación está indicada por una sede diagonal de puntos, inte-
rrr:nrpicla por cuadraclos iruecos donde las secuencias tienen diferencias nucle-
olídicas, y cambii: de una columna a otra en los lugares dr:¡nde ha5, indeles.

T¿rmbién se han diseñado enfoques matemáticos más rigr-rrosos para la ali-

neación de secuencias. El primero de el1os es el enfoqr.re de similitud, que
apunta a maximizar la cantidad de nucleótidos cornparables: los que son
icléniicos en las dos secuencias. El enfoque complementario es el método
AGACATT TAGACC AAGCAT AG CCAT
de Ia clistancia, en el que el objetivo es reducir Ia cantidad de en'ores cle A
(j
aparezimiento. A menudo, ambos procedimientos iclentificar'án la misma A
C
alineación coilo la mejor. Por 1o general, la comparación involucra más de A
T
sirlo dr:s secuencias, lo que siglilica que se requiere una alineación mtilti- T
T ¡lu1*.1án
ple. Rara vcz, esto se puede re¿ilizar de manera eficaz cor-r lápiz y papel, de T -'' §urrtiiürrte
modo que, en todos ios pasos de un análisis filogenético, se utiliza un pro- A o\¡
\a.
gmnla computar"izado. Pal'¿r alineaciones raúltiples, la elección pleferida c ,aa
ao.
A
sueie ser el paqucte de softr,vare para análisis filogenético, Clustal, que se A .\¡!r
" inrl*l'
dcscl'ibe junto con otros en la l.,iota sobre técnicas 19.1 . A
*...
T
A
G
U
{::;r:t,r:rsl{ fr *t, t::; t:l::i:;s ;:!* ¡:i¡:t*i::i*;: *l; t"¡x ***l ii{r:rs*ri:tí:¡: A
T
Una vez alineadas ci¡n exactitud las secuencias, se puede intentar
rcconstl'uir el árbol filogenético. Hasta la fecha, nadie ha diseñado un
método ped'ecto para la reconstrucción cle árboles )'se Lrtilizan diversos
ploceclimientos. Si bien se han efectuaclo pruebas comparativas con Figura 19.11 Técnica de la matriz de
datos artificiales para los que se descoiroce el árbol verdadero" no han puntos para la alineación de secuen-
identificado que algún método sea rnejor que cualquiera clc los otlos. cias. Se destaca la a{ineacién correcta
porque forma una diagonal de puntos
continuos, que se intenumpe en las
l-a principal clistinción entre los nlétodos de constmcció¡: de árboles es la mutaciones puntlformes y cambia a una
¡.nanera como la alineación rnúltiple cle secuenci¿ls se conüerte en detos diagonal diferente en caso de indeles.
I
§t8 CapÍtulo 19 Fiiogenética molecular

ilota sobre tÉcnicas I9.I Análisis filogenético

Poqruetes de software pora canstrucción de árboles filogenéticos

Pocas series de secuencias de DNA son lo bastante sim-
ples para ser convertidas en árboles filogenéticos en
forma manual" Casi toda la investigación en esta área se
reaiiza mediante ordenadores y cualquiera de los diversos
paquetes de software diseñados especÍficamente para
uno u otro de los pasos de la reconstrucción de árboles"
Uno de los paquetes más fáciles de usar y más afamados
es CIustal, creado en
'l988 y que ha sido objeto de varias
actualiz¿ciones. Clustal es, sobre todo, un programa para
llevar a cabo alineaciones múltiples de secuencias de pro-
teína o DNA, lo que puede realizar de manera muy eficaz
siempre que las secuencias comparadas no contengan
extensos motivos repetidos internos. Por lo general, se lo
utiliza junto con NJplot, un programa simple para recons-
trucción de árboles mediante el método del vecino más
próximo. Una ventaja importante de Clustal y de NJplot es
que no requieren grandes cantidades de memoria en el
ordenador y, por lo tanto, pueden utilizarse en PC u orde-
nadores Madntosh de poca capacidad.
Los paquetes de software más completos permiten que
el investigador elija entre diversos métodos de recons-
trucción de árboles y que lleve a cabo tipos más comple-
jos de análisis filogenético. Los más usados son PAUP y
PHYLIP. Se suele considerar que los programas PAUP son
Ios más exactos y pueden manejar series de datos relati-
vamente grandes. PHYLIP tiene la ventaja de incluir una
serie de herramientas de software a las que no es fácil
acceder desde otras fuentes. Otros paquetes difundidos
son PAML, MacClade y HENNlC86.

numéricos que pueden ser analizados matemáticamente para reconstruil el

árbo1. El enfoque más simpie es converlir la información de la secuencia en
una matriz de distancia, que es sólo un cuadro que muestra ias distancias
evolutivas entre todos los pares de secuencias de la serie de datos (figura
19.12). La distancia evolutiva se caicula a partil'de la cantidad cle dife¡encias
de nucleótidos entre un par de secuencias y se utiliza para establecer las lon-
gitudes de las ram¿is qile conectan estas dos secuencias en el árbol reconstrui-
do. En el ejemplo ilustrado en la figura 19.12, Ia distancia evolutiva se
expresa como el nirmero de diferencias de nucleótidos por sitio nucleotídico
para cada par de secuencias. Por ejemplo, las secuencias 1 y 2 tienen 20
nucleótidos de iongitud y presentan cuatro diferencias, lo que conesponde a
una distancia evr¡lutiva de 4/2O = 0,2. Cabe obseruar que este análisis presu-
pone que no hay sustituciones múltiples (denominadas también e¡¿entos
múltiples). La sustitución múltiple tiene lugar cuando un solo sitio sufrc dos
o más cambios (p. ej., ia secuencia ancestral ...ATGT... da origen a ck:s
secuencias modemas: ...AGGT... y ...AQGT...). Hay sólo un nucleóticl* d,:
cliferencia entle las dos secuencias modemas, pelro hubo dos snstitucit-r¡.re¡
nucleotídicas. Si no se reconoce este evento múltiple, se subesti:t-t:¡r¡ rL
manera significativa [a distancia evolutiva entle ambas secuencias. C]cxr ellin
de evitar este problema, las matrices de clistancia para análisis fi.logenótico se
suelen constn:ir aplicando métodos matemílticos que incluyen dispositit'os
estadísticos pala estimar el gracio de sustitución mírltiple que ha tenido lugar

El método del vecino más próximo es un procedimiento clestacaclo pitt'a

construir árboles que aplica el enfoque de rratriz de distancia. Pala ini-
ciar la reconstrucciOn, ie supone pri**.o que hay sólo un nudo inte rncr
a partir del cual .se irradian las ramas que ilevan a todas las secuencias

Alineación múhiple Matriz de distancia

AGGCCAAGCCA TAGC TGTC C 0.20 o05 015

Figura '19.12 Una matriz de distan-
I

cia simple. La matriz rnuestra la dis- AGGCAAAGA CAT A CCTGACC ¿- o.15 o'05

tancia evolutiva entre cada par de 3 AGGCCAAGACATAGC TGTCC 3 - 0.10

secuencias de Ia alineación. 4 AGG C AAAGACA TACCTGTCC /

 Reconstrución de árboles filogenáticos ba:ada en DNA 6:9

{A) Punto inicial para el métcdo del vecino

de Di.iA en un patrón en forma de estrella (figura 19.13). En términos más cercano
rr.*lutivos, esto es casi imposible, pero el patrón es sólo un punto de
p.,,lida. A continuación, se elige al azar un par de secuencias, se 1as e1i-
minri dc la estrella I se las une a un segundo nudo interno conectado por
uni:.i rama al cent¡o de la estrella. Después, se utiliza la matriz de distan-
cia para calcular la longitud total de 1a rama de este nuevo "árbol".
Luego, se reubican las secuencias en sus posiciones originales, se une
orro par al segundo nudo interno y se vueive a c¿llcular la longitud total
:rl'r.',
de la rama. Se repite esta oper¿lción hasta que se han examinado todos
los pares posibles, lo que pernlite identificar Ia combinación que da e1
árbol con la longitud total de la rama más corta. Este par de secuencias
,' seriiir vecinas en el árboi final; en el ínterin, se las combina en una sola
uniclad, 1o que crea una nueva estrella con una rama menos que la ori-
ginal. Ahora, se repite todo el proceso de selección de pares y cálculo de (B) Eliminación de dos secuencias
a la longitud del árbol, de manera cie identificar un segundo par de la estrella
secuencias vecinas, y se [o vuelve a repetir para locaiizar un tercer par,
y a-tí sucesivamente. El resultado es un árbol reconstruido completo.

La ventaja del método delvecino más próximo es que el manejo de datos es

t,' bastante fácil de efectuar, en g1'an medida porque se ha reducido a su fonna
más simple e1 contenido de información de la aiineación múltiple. La des-
ventaja es que se pierde parte de ia infbnnación, en particular la concemien-
i te a ias identidades de ios nucleótidos ancestrales y derivados (equivalentes
: a estados de carácter ancestrales y derivados, definidos en la sección 19.1.1)
en cada posición c1e 1¿r alineación múltiple. Elmétodo de rnáxima parsimo-
I
nia tiene en cuenta esta infoirlación y la utiliza para recrear la set'ie de cam-
, bios nucleotídicos que tienen la mayor probabilidad de haber generado e1
patrón de variación revelado por ia alineación múltiple. En su origen, parsi- Figura I9.15 Manipulaciones lleva-
mc*ia era un tér:-¡rino filosófico que alir:naba que, al decidir entle varias das a cabo al utilizar el método del
hipótesis concurrentes, se debe dar preferencia a ia qr:e implica la menot' vecino más cercano para Ia recons-
canticlad c1e presunciones complejas. En filogenética molecular, parsimonia trucción del árbol.
es un enfoque qtie decicle entre distintas topologíns de árboles identificando
la c¡ue representa la vía evolutiva más corta, que es aquelia que requiere la
menor cantidad de cambios nucleotíclicos para llegar de la secuencia ances-
t,

tral, en la r-aiz del árbol, a todas ias secuencias actuales que se han compa-
l

a
rarlo. Por lo tanto, los árboles se constfl-ryen en forma aleatoria, y se calcul¿r
:
la c¿rntidad de cambios nucleotídicos que implica hasta que se han examina-
drr todas las topologías posibles y se ha identificado la que requiere la menor
I
;itnticlad de pasos. Esto se presenta como el árbol inierido más probable.

Ei lnétoclo dc máxima palsiraonia es míis lig¡:r'oso en su enfoque clue el

máloclo del vecino rnás cercano, pero este auilento de rigor sin duda
amplía el grado de manejo de datos necesalio. Hay un p«:blema significa-
tivo, pues la cantidad de árboles posibles que debcn ser investigados
aumenta con rapidez a nredida que se añaden secuencias a la serie c1e
datos. Con sólo cinco secuencias, hay únicamente 15 írrboles no enraiz¿t-
dos posibles, pt:l'o con diez scc,uencias. hay 2.O27.025 árboles no enraiz¿t-
dos, y con 50 secuencias, la cantidaci supel'a el núnrero de átomos del
univelso. Aun con un ordenador de alta velocidacl, no es posible vclilicar
toc'los estos árrboles en un tiernpo razonable, si es que fuera posible, de
moclo que, a menudo, no se puede efectuar un análisis completo por el
: rnétodo de máxima parsimonia. Lo mismo es váiido para muchos c1e los
olros métodos rnás complejos de reconstrucción cie árboles.
a

,
i* {:íü,;tí!.1:{! t!,: r,r, *rí":'. , i:,-t.-i)*'-: tt; -i .
§.v;';,tt-:t';:!,;l: r/r.:
, Sin ducla, las limitaciones de 1os mótoclos utilizados pala la reconstruc-
ri

i
.l
ci&-r lilogenética plantean intcrr"ogantes sobre la veracidad de los iu'bo-
 Capítulo l9 FtiogenÉiica moieculer

. i, Ir' .:.:l.:la il
A TAGCCA T AG CAACCT les lesultantes. se han diseñado pruebas estaclísticas de la exactitud cle
A TA CCCA TGACAACGA Alineación un árboi reconstruido, pero éstas son siempre complejas, parque uir
A TACCCATAGCAACCA
A TAGCCATAGCAA CGA
múlt¡ple real árbol es geornétrico y no numérico, y la exáctituci de una po.ti d. tu
A TCCCCA TAGCAACC T topr:logía puede ser mayor o menor que la exactituci de las otras partes.
.I .-. .l¡;,:i;:..--_.1
i._

. ..'....':: El rnétodo habitual para asignar límites de confianza a diferenres purl-

TAGACGTC
TACGCCAC tos de ramificación dentro de un árbol es llevar a cabo u, unálisis
TACACCAC Nuevaaiineación
bootstrap (análisis de remuestreo). para hacerlo, se necesita una
TAGACGAC
T
I AUAUU
^ ^ ^ ^^-^ ¡ U segunda alineación n-rúltiple que sea cliferente, per:o equivalente, a lil
alineación reai. Esta nueva alineación se construye tomando, al azar,
columnas de Ia alineación real, col¡o se iiustra enla figura 19.14. por
1o tanto, la nueva alineacíón comprende secuencias q.r. ro, diferen-
Figura 19.I4 Construcción de una
nueva alineación múltiple para ana, tes de las originales, pero tienen un patrón de variábilidacl similar:.
lfiy por remuestreo (6ootstrop) un Esto significa que cuando se emplea la nueva alineación para la t
árbol filogenético. La nueva alineación reconstrucción del árbol no sólo se reproduce el análisis originil, sino
se construye tomando columnas al que se debe obtener el mismo ál'bol.
azar de la alineación real. Obsérvese
que la misma columna puede ser
En la práctica, se crean 1.000 alineaciones nuevas, cle modo que se
muestreada más de una vez.
l'econstruyen 1.000 árboles replicados. Después, se debe asignar r"rn
valor bootstrap a cacla nudo interno del árbol or-iginal, el cual ,,áp.*.*n-
1a el número de veces que se reprodujo el patr-ón cle rarnificación obser-
vado en ese nodo, en los íirboles replicados. si el valor bootstrttp cs
mayor de 700/1.000, es posible asignar un grado de confianza razona-
ble a la topología de ese nudo interno particular.

Lt::; r;:f::j*s,t*l¿,¡:*j*r*"r p*,.*;l*r *sfu,.::*¡. rl lx*:¡* #*

r/i l.*:,.; :.* ír* ¿j* .*.*¿. ; *,1 r¡*: *;: r*sf¡* jcj
cuando se lleva a cabo un análisis filogenético, el objetivo fundameirral
es inferir el patrón de relaciones evolutivas entre las jecuencias cle DNA
que se estárn comparando. La topología del árbol reconstruido revela
estas lelaciones. A menudo, tambión hay ur-r objetivo secundario; cietel.-
minar cuándo divergieron las secuencias ancestrlales para clar las secllen-
cias modernas. Esta información es interesante en el contexto cle la
evolución de los genomas, como descubrimos cuando observallos los
antecedentes evolutivos de los genes de globina humana (véase ligur.a
1B.B). En ocasiones, la inforrnación es aún más interesante cuancl,¡ es
posible equiparar un irrbol de genes con un árbol de especies, porqüi
ahora las épocas en las que divelgielon las secuencias ancestr¿il-,r¡ re
aproximan a las fechas de los eventos de especiación.

Para asignal f'echas a los puntos de ramificación de un árbol filogenático,

es necesario utilizar un reloj moiecular. La hipótesis del reloj molecular.,
propuesta a principios de la década de 1g60, afirrna que las sustitllcionrs
nucleotídicas (o sustituciones de ailinoácidos si se están comparando
secuencias de proteínas) se producen a una velocidad constanle. Esto
irnplica que se puede usar el grado de dif'erencia entre dos secucncias
pala asignar una fecha al momento de divergencia respecto de su secuen-
cia ancestral. sin embargo, para poder hacerlo, el reioj molecular.clebe
estal' calibrado, de manera de saber cuántas sustituciones nucleotíclicas
espelar pol millón de años. Por lo general, la calibración se logla por
referencia al registro de fósiles. Por ejemplo, los fósiles sugieren que el
ancestl'o común más reciente de ]os seres humanos v de los oransutanes
vivielon hace 15 rrillones dc años. Por 1o tanto, para calibrar!l leloj
rnolecular hnrnano, se comparan las secuencias dé DNA humano y de
orangután a fin cle detemrinar la cantidad de sustitusiones nucieoríclicas
que tuvo lugar y, después. se divide esta cifra por i 3 multiplicaclo pot 2,
para obtener una tasa de sustitución por mil1ón de años (fEura I 9.15).
 Reconstrución de árboles filogenéticos basada en DNA 6?1

Ser humano
Alguna vez se pensó que podía haber un reloj molecular universal, aplicable
a todos ios genes de todos los organismos. Ahora, advertimos que los relojes
moleéulares son diferentes en distintos organismos y son variables aun den-
tro de un solo organismo. Las diferencias entre organismos podrían ser el
resultado de los tianpos de generación, porque es posible que la velocidad Orangután
de acumulación de elrüres de replicación del DNA sea más alta en una espe-
cie con un tiempo de generación breve que en una con un tiempo de genera-
ción más largo. Es probable que esto explique la observación de que los 13 millones de años
rcedores tienen un re§ rnolecular más rápido que los primates. Dentro de
un solo genomar las variaciones son las siguientes: Número de sustituciones : x
* Las sustituciones no sinónimas ocul?en a menor velocidad que las Número por linaje = 2¡
sinónirnas. Esto se debe a que una mutacién que determina un cambio Número por linaje por y
de la secuencia de aminoácidos de una proteína podría ser perjudicial millón de años
2x'13
para el organismo, de modo que los procesos de selección natural
reducen la acumulación de mutaciones no sinónimas en la población.
Esto implica que, cuando se comparan las secuencias génicas de dos
especies, suele haber menos sustituciones no sinónimas que sinónimas. Figura 19.I5 Calibración del reloj
molecular humano. Se determina la
* El reloj molecular para genes mitoeondriales es más rápido que para cantidad de sustituciones para un par
genes del genoma nuclear. Esto se debe, probabiemente, a que las de genes homólogos de ser humano
rnitocondrias carecen de muchos de los sistemas de reparación de y orangután: llame "x" a este número.
DNA que operan en los genes nucleares. Por lo tanto, la cantidad de sustitucio-
nes por linaje es x/2,y la cantidad por
*' Los relojes molecuiares parecen haber aumentado su velocidad en los millón de años es x/(2 x 13).
últimos 1-2 millones de años. Se considera que esto es un artefacto que
quizá se deba a la persistencia durante este período de rnutaciones
cuyo efecto perjudicial sólo es ligero y, por 1o tanto, son eliminadas con
relativa lentitud por selección natural. La aparente aceleración implica
que podrían surgir inexactitudes si un reloj moiecuiar es calibrado res-
pecto de eventos relativamente antiguos en el registro de fósiles y, des-
pués, se lo usa para asignar fechas a eyentos más recientes.

Pese a estas compiicaciones, los relojes moleculares se han convertido en un

adyuvante de glan valor para la reconstmcción de árboles, como se verá en
la sección 19.3 al tratar algunos proyectos de filogenética molecular típicos.

.:'.. ...
..'....: .-.,' :1:

i¡|r:i¡.:i:, l*::*¡¡*.; ;:Í,:r' .- . - - . .,; - -'.).-.,'*:; #l ¡);'v1.4

La construcción convencional de árboles presume que es posible descri-
bir la relación entre un gl'upo de secuencias de DNA mediante un sim-
ple patrón de ramificación. Esta presunción no siempre es con:ecta. Por
ejemplo, si un grupo de secuencias se puede recornbinal, se podrían
generar nuevas secuencias que conlparten características, y de hecho
son descendientes, de pares de secuencias ancestraies que ocupan posi-

{A) Problemas relacionados iB) Problemas cuando todavía existen

con recombinación secuencias ancestrales Figura 19.16 Dos problemas que
w complican la construcción
convencional de árboles.
sñis
§§
:,, r,l'i',.:r

w
!K?
 ":?K
:.

i.

622 Capítu1o l9 Filogenétlca molecular

ciones distantes en un árbol filogenético convencional (figura 19.1*A).

Figura 19..17 Análisis filogenético por
construcción de una red. El panei (A)
muestra una a|neación múltiple a partir
de Ia cual se construye la red, y los
puntos indican identidad con la secuen-
cia l. (B) La red se construye de la
siguiente manera. (i) Se utiliza como
punto inicial la secuencia 1. (ii) La
secuencia 2 difiere de l¿ secuencia I
en cuatro posiciones, y se la vincula a la
secuencia 1 por una línea de Ia red.
(iii) La secuencia 3 difiere de la
secuencia I en una posición, que es
diferente de cualquiera de las de la
secuencia 2. Par lo tanto, la secuencia
3 se vincula directamente con la
secuencia 1. (iv) La secuencia 4 com-
parte con la secuencia 3 la sustitución
CT en la posición 1 1, pero tiene otra
sustitución en la posición 2. Por ende,
se extiende la línea que lleva a la
secuencia 3 y se coloca la secuencia 4
en su extremo. (v) La secuencia 5 tiene
una sustitución respecto de la secuen-
cia 1, que es una sustitución única no
vista hasta ahora. Por lo tanto, la
secuencia 5 se vincul¿ directamente
con la secuencia 1. (vi) De modo simi-
Si se incluyen en el árbol los productos de recombinación, el patrón de
ramificación dicótomo comienza a degradarse y se vuelve difícil distin-
guir ias relaciones. Este es un problema particular cuando se intentan
determinar las relaciones evolutivas entre los miembros de una familia
multigénica, pues estas secuencias residen en un solo genoma, quizá
como una disposición en tándem, y, por L: tanto, es posible que ia
recombinación entre ellas haya tenido lugar en el pasado. La construc-
ción convencional de árboles también es inapropiada si todavía exist*¡r
secuencias ancestrales, representadas por nudos internos (ligur-r
19.168). Esto rara vez es un problema cuando los genes comparados
provienen de diferentes especies, pues los nudos internos ahora repre-
sentan secuencias que estaban presentes en especies ancestrales ya ex§Í]-
guidas, pero es muy relevante cuando las secuencias comparadas son
tomadas de una sola población con una historia evolutiva corta. Este
problema suele surgir en estudios sobre Ia evolución humana reciente.
Una solución a este problema es emplear una red en lugar de un árbo1 para
ilustrar las relaciones evolutivas entre las secuencias eraminadas (figura
19.17). Una red pernite identificar secuencias ancestrales que todalía
existen (como la secuencia i de la figura 1.9.17) y es evidente que ilustra
su relación con las secuencias que descienden de ellas. También se puedr:n
identificar secuencias extinguidas (o que existen en la población, per.o no
están presentes en la serie de datos). El retículo de la red, como el que vin-
cula las secuencias 1,3,7 y 8 de la figura 19.17, tiene particular interés
porque indica secuencias que han surgido por recombinación o por mllta-
ciones paralelas (homoplasia) en diferentes linajes.
Las redes simples se pueden construir en forma manual, pero sus topo-
(A) 1510152025303540
I GCATTACTTTCGGTAGCGCGGAAAGGCGACGGGACTTAIA
2 ..c....c...........c.......A
3
4
q

lar, la secuencia 6 presenta tres sustitu- 6

ciones únicas y se la vincula 7
directamente con la secuencia 1. (vii) 8
La secuencia 7 tiene dos diferencias
con Ia secuencia 1, y una de ellas es la
CT en la posición I I observada en las (B)
secuenci¿s 3 y 4. Así, la secuenci¿ 7 se
conedra directamente con la secuencia
(i) (ii) (i¡i) (iv) (v)
5. En esta paüe de la red, la línea entre ffi
las secuencias 1 y 3 representa la susti- §::l::lY,l§
?-:- : r'
tución en la posición 1 1, que es la sus-
l -'s 1 H::l
&
titución en la posición 2 entre las §:§
secuencias 3 y 4, y la sustitución en la )@h \;..L;"4\ §;i]ñ!
posición 24 entre las secuencias 3 y 7. Ftnd \
(viíi) La secuencia 8 compafte la susti-
\;,-f \
- §*/
tución AC con la secuencia 7 en la
posición 24 y presenta una sustitución
unica, no observad¿ en ninguna (vi)
# (vii) (viii)
secuencia previa, en la posición 9. Por
lo tanto, la secuencia B debe formar rs; t
§"1-7
una rama que sale de un¿ linea entre &
las secuenci¿s 1 y 7. Esla rama crea un
,(, .-/-ir"ffi*ffii6i
"nodo vacío", ilustrado como un punto
pequeño, que representa una secuen-
,!# * :.zu\
:ü\
;,l}Y -\dryh
cia no presente en la serie de datos,
quizá porque está ertinta. W
 Aplicaciones de la filogenética molecular

bgías se vuelven pronto complejas a medida que se añaden secuencias

{l'§ura 19.18), sobre todo si se incluyen todas sus posibles interrelacio-
nes" Por 1o tanto, se han elaborad,¡ algoritmos para reducir la compleji-
c'lad de una red, sin perder la información filogenética. Estos
ccnrprenden métodos de poda {pnming) que asignan ponderaciones a
las diversas vías entre pares de secuencias y elirninan los vínculos que
tienen menos probabilidad de representar relaciones verdaderas.

§§-§ &gx§§emw§xx§§&s de §re $§§mg*xxt$&§*mxwm$*maa§mr

La filogenética molecular ha crecido en jerarquía desde comienzos de la
década de 1990 debido, en gran parte, al desarrollo de métodos más rigu-
rosos para construir árboles, combinado con la explosión de infotmacióu
sobre secuencias de DNA obtenida, primero, por análisis mediante PCR y,
en forma más reciente, por proyectos de genomas. La aplicación exitosa
de la reconstrucción de árboles y otras técnicas filogenéticas a algunos de Figura 19.18 Una red completa. Esta
los problemas más desconcertantes de la biología también ha incrementa- red se ha construido a partlr de secuen-
do la importancia de ia filogenética molecular. En esta última sección, cias de rRNA 55 de Beta vulgoris spp.
estudiaremos algunos de estos éxitos. moritimo. Los círculos grises son
secuencias de plantas que crecen alre-
dedor de Poole Harbour, RU, y los
§S.3"3 §§*mp§ms d*§ a¡sm d* *rha:§*x §i§m6*n*&*&c*r círculos huecos son plantas de cimas
de acantilados unos pocos kilómetros
Primero, consideraremos dos proyectos que iiustran las diversas fflane- hacia el sur. La red se construyó a partir
ras en que se está empleando la reconstrucción convencional de árboles de una alineación de secuencias de
'I
en la biología molecular moderna. 10 x 289 pb. Al principio, l¿ red conte-
nía 6.808 vínculos, pero éstos se redu-
leron a ios 655 aquí mostrados
.; i.i:.'- ':'.'.-; ¿-'"'l'.'i ,','- '-'-;,.;v-;:.i'. ¡ .. "'."'..;,ri,''-, '...,.;.' . "-'', mediante poda, como se comenta en
i:ifi{t* 5*{*S f;*¡x*¡: " ¡ i;i:',i,i , .*"i' ..5
'.' el texto. Red cortesía de Sarah Dyer.

Darwin fue el primer biólogo en especular sobre las relaciones evr:lutivas

entre seles humanos y otros primates. Su concepto -que los seres humanos
están estrechamente relacionados con e1 chimpancé. el gorila y el nrangu-
¡án- resultó controvertido cuando se lo propuso por primera vez y f'ue de-
sestimado, aun por los evolucionistas, en las siguientes décadas. De hecho,
los biólogos se encontraban entre los rnás ardientes defensores de la idea
antropocéntrica de nuestro lugar en el mundo animal.

r\ partir de estudios de fósiies, 1os paleontólogos habían llegado a Ia con-

clusión, antes de 1960, que chimpancés y gorilas eran nuestros parientes
más cercanos, pero que la relación era distante, pues la división que llevó
a seres humanos, por un lado, y a chirapancés y gorilas, por el otro, tuvo
lugar hace 15 millones de años. Los plimeros datos moleculares detallados,
obtenidos por estudios inmunológicos en la década de 1960, confirmarc¡n
que seres humanos, chimpancés y gorilas forrnan, de hecho, un solo clado,
pero sugideron que la reiación es mucho más cercana, ya que un reloj
molecr:lar indica que esta división se pr:odujo hace sólo 5 millones de años.
Éste fue uno de 1os primeros intentos de aplicar un reloj molecular a datos
filogenéticos, y el resultado fue tratado con cielta sospecha, lo que resulta-
ba bastante natu¡al. En realidad, se inició un áspero debate entre paleontó-
k:gos, que creían en la diüsión antig'ua indicada por la eüdencia obtenida
de fósiles, y biólogos, que confiaban más en la fecha reciente sugerida por
los datos moleculares. Por irltimo. los biólogos tnolecul¿rres "ganaron" este
debate y su concepto cle que la división sobrevino hace alrededor de 5
millones de años logró aceptaciÓn general.

A medida que aumentaba la obtención de dati:s moleculares, se hicieron evi-

dentes las dificultades p:'ira establecer e1 patrÓn exacto de eventos evolutivos
 Capítulo 19 Fiiogenétira molecular
(A) Datos de DNA milocondrial
Figura 1 9. 1 9 Diferentes interpretacio-
nes de las relaciones evolutivas entre
seres humanos, chimpancés y gorilas.
Abreviatura: Ma, millón de años,
(B) Datos de hibridación DN,A-DNA {C) Series de datos moleculares combinados
f! 1--. ü {t:
§er numano Ser humano
Chimpancé Chimpancé
Gorila Gorila
que diferenciaron set'es humanos, chimpancés y gorilas. Las comparaciones
de los genomas mitocondriales de las tres especies por mapeo de restricción
(sección 3.3.1) y secuenciaciór-r del DNA sugirieron que el chimpancé y ei
gorila estaban más estrechamente relacionados entre sí que con 1os set'es
humanos (fig¡:ra 19.19A), mienfras que los datos de hibridación DNA-DNA
avalaron una relación más estrecha entt'e seres humanos y chimpancés ({igu-
ra 19.198). La razón de estos resultados contradictorios es la esffecha silni-
litud entre las secuencias de DNA de las tres especies, pues las diferencias son
inferiores aI3a/o aun en las regiones más divergentes de los genonlas (sección
18.4). Esto dificulta establecer relaciones inequívocas.
La solución del probiema ha sido comparar tantos genes diferentes como sea
posible y tomar como diana los loci que se prevé que presentarán el mayor
grado de disimilitucl. En 1997, se habían obtenido 14 series de datos mole-
culares diferentes, incluidas secuencias de loci variables como seudogenes y
secuencias no codificantes. El análisis de estas series de datos confirmó que
el chimpancé es el pariente más cercano de los seres humanos, y que nues-
tros linajes divelgieron hace 4,6-5 miliones de años. El gorila es un primo
algo más distante; su linaje se separó delde seres humanos-chimpancés entre
0,3 millón y 2,8 milk:nes de años antes (figura 19.19C).
.!
i*.i-i-r¿iI¡;L.:1 rJ j:i .'1t\!\;
La epiclemia mundial de sÍndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida)
ha incidido en la vida de todos. EI sida es causado pol ei virus de la inmu-
nodeficiencia humana 1 (HIV-1), un retrovirus (sección 9.1.2) que inf'ecta
células involucradas en ia respuesta inmunitaria. Después de la demostra-
ción a principios de 1a década de 1980 de que eI HIV-1 era responsable clel
sida, se especuló con rapidez acerca del origen de la enfermedad. La uspr-
culación giraba ahededor del descubrimiento de virus de inmunodefici*n-
cia similares en primates, colxo cirimpancé, macaco (sooly mangubtyi,
mandril y diversos rnonos. Estos viius de Ia inmunodeficiencia simi¿rna
(SIV) no son patógenos en sus huóspedes habituales, pero se consideró que
si alguno se había transferido a sel'es hunanos, podrÍa haber adquirido
nuevas propiedades dentlo de esta nueva especie, como la capacidad cle
p1'ovocar enfermedad y diseminarse rápidamente por la población.
Los genomas de los retrovirus acumulan mutaciones con relativa rapidez,
dado que la transcriptasa inversa, la enzima que copia el genoma de RNA
contenido en la partícula viral en una versión DNA que se integr.a algenoma
huésped (véase sección 9.1.2), carece de una actividad de corrección eficien-
te (sección 15.2.2) y, por ende, tiende a cometel' en'ores cuando lleva a cabo
Ia síntesis de DNA dependiente de RNA. Esto implica que el reloj molecular
avanza rápido en los retrovirus y que genomas que divergieron en forma bas-
tal-ite leciente presentan suficiente disimilitud nucleotídica para llevar a cabo
un análisis filogenético. Aunque el período evolutivo en el que estamos intu--
resados es infedor a 100 años, los genomas de HIV y SIV contienen su{lcien-
tes datos para inferir su relación mediante análisis filogenético.
 Aplicaciones de la filogenética nrolecular

[lpunto inicial filogenético es el R]rlA extraíclo dc partícr-r-

par¿r esre análisis
las virales. Por lo tanto, se emplea RI-PCR (r'éase Nota sob¡e tócnicas 5'l)
p¿ira con\rertir el RI§A en una copia DI{A y amplifical despr"iés el DltjA, de
rranera de obtenel cantidades suficientes para la secuenciación de nucleóti-
clos. La comparación entre secuencias de DNA del virus ha dado por resul-
tack¡ el ár'bol recr:nsturido mostraclo en [a fip¡ura 19.20. Este árbol presenta
varias características interesantes. Primero, indica que clistintas muestras de
}-tiv- I tienen secuencias liget'amente ciiierentes y que 1as muestfas en conjun-
io fonrran un complejo estrecho, casi un patrón en forma de estrella, que irta-
clia de un extretlo de1 álbolno enraizado. Esta topología en estrella implica
que la epiderr-ria mundial de sicla comenzó con una canticlad muy pequeña de
vims, quizá sólo uno. que se ha diserrinado y diversificado desde que inge-
só en iá población humana. El pariente más próximo del HlV-1 entre los pri-
Lt\/ 11{
mates es el SIV de k:s chimpancés, y la irnplicación es que este vilus saltó la
banera de especie entre chimpancés y seres humanos e inició la epidemia de
sida. Sin embargo, esta epidemia no comenzó de inmediato: una rama inin-
tenumpida, relativamente larga, une elcentro de irradiación de HiV-1 con el Figura 19.20 Árbol filogenético
nudo intemo que lleva a Ia secuencia de SIV pertinente, 1o que sugiere que, reconstruido a partir de secuencias
después de la transmisión a seres humanos, el HIV-1 atravesÓ un período de genomas de HIV y SlV. La epide-
mia de sida se debe al virus de la
latente en el que se mantuvo limitado a una pequeña parte de ia población
inmunodeficiencia tipo HiV-'1 M. ZR59
humana, presumibiemente en África, antes de corrtenzal su rápida disemina- está ubicada cerca de la raíz del
ción a otros lugares delmundo. Otros SIV de primates no gpardan una rela- patrón similar a una estrella formado
ción tan estrecha con el HIV- 1, pero uno. el SIV del macaco, se agnpa en ei por los genomas de este tipo.
árbol con el segundo vims de la ir¡lunodeficiencia humana: HIV-2. En apii-
r"iencia, l¿i transferencia del HIV-2 a la población humana fue independiente
de la del HI\Ll y a partir de un huésped simiano diferente. EI HIV-2 también
puede p1'ovocalsida, per:o hasta ahora no hay una epidemia global.

En 1998, se efectuó un agregado interesante al ár'bol Hlv/sIV cuando se

secuenció el RNA de una cepa de HIV-1 aislada en 1959 en un hombre afri-
cano. El RNA estaba muy fragmentaclo y sólo se pudo obtener una secuen-
cia corta de DI{A, pero que fue suficiente pzrra ubicarla en el árbol
filogenético (véase figura 19.20). Est¿i secuenci¿r, denominacla 2R59, se une
a1 árbol mediante una t:¿lnla corta clue elnefge cerca del ce1-lt1'0 de in'adiación
del HIV-I. La posición indica que la secuencia ZR59 lepl'esenta una c1e las
plimeras versiones clel t{lV- I y muestla que lzr diseminación global detr virus
ya est¿rba en progreso en 1959. Un análisis más tardío y más completo de
secuencias de HIV- 1 sugirió que la diseminación comenzó en el períoclo entre
1 9 I 5 y 1 94 1, con una estirrración óptima de 1 93 1 . La pr:ecisión de esta fech¿i

les ha permiticlo a lo-s epidemióiogos comenzar a investigar' las condiciones

históricas y sociales que pocL"ían haber causado la epidemia cle sida.

',, ! .' i,;"r.:i,"',¡{¿l i't1 : ,':a*{ f t.riüt} iflo.rr"lt;r,¡'lrl p;r.-.}

q:i q:xtgá*|r* *f* §x y*rx?*ax'?-*.rt;r* Txtstusmrxr:
Ahora, dirigirenios lruestt'a atención a la apliczición de la filogenética
molecular a estudios intraespecílicos: el estudio de la historia evolutiva
cle miembros de 1a misma especie. Podríamos elegir cualquiera de varios
oi'ganismos diferentes para ilustrar los enfoques y las aplicaciones de los
estudios intraespecíficos, pero muchos consideran que Homo sopíens es
i el organisnro más interesante, de manela que investigaremos cÓmo se
está utilizando la fitogenética molecular par;r deducir los ot'ígenes de los
seres humanos modelnos y los patrones geogrirficos de sus mig:'aciones
recientes en e1 Viejo y el Nuevo Munclo.
:

i:;t, :;:,:;
!:::,,1::l.ilt.¡ {i,i,; ' :- ' f:l'.:l
En cr-ralquiel apiicación c1e fiiogeneltica molecular, los genes elegidos
pala e1 aná1isis cleben nlostral' valiabilidad en los otganismos estudia-
626 Capítulo l9 Filogenética molecular

(É
.(,)
dos. si no hay va¡iabiiidad. no se obtiene ninguna información filo-gené-
.o tica. Esto plantea un problema para los estudios intr:aespecíficos, porque
{§
,g
() los organismos comparados son miembros de la misnla especie yl por:1o
C
f
tanto, cr:mparten un gran grado de similitud genética, aunque la especie
O
o se haya dividido en poblaciones que sólo se mezclan entle sí de manera
intermitente. E,sto significa que ias secuencias de DI'{A que se utilizan en
el análisis filogenótico deben ser las más variables de las que se dispcn-
ga. En los seres humanos, hay tres posibilidades principales.
Generaciones
* Genes multialélicos, como los miembros de la familia HLA (secr:irin
3.2.1), que existen en numerosas fomas de secuencias dif'erentes.
Figura 19.21 Efectos de la deriva * Microsatélites, que no evolucionan por mutación, sino por desliza-
genética sobre la frecuencia alélica. miento de la replicaoión (sección 16.1.1). Las células no parecen
El gráfico muestra los resultados de tener ningún mecanismo de reparación para revertir los efectos del
simulaciones de las frecuencias de un
par de alelos a lo largo de 100 gene-
deslizamiento de la replicación, de manera que se generan nuevos
raciones, para poblaciones que contie- alelos de microsatélites con relativa frecuencia.
nen 20 o 1.000 individuos. En ambas * DNA mitocondrial, que como se mencionó en la sección 19.2.2, &culrlu-
poblaciones, un alelo finalmente se
la sustituciones nucleotídicas con relativa rapidez, porque las mitocor-r-
vuelve fijo y el otro se pierde, pero el
tiempo que esto demanda depende drias carecen de muchos de los sistemas de repar:ación que enlentecen el
mr-rcho del tamaño de la población. reloj molecular en el núcleo humano. Las variantes de DNA mitocair-
Adaptado de M. Jobling et ol., Human drial presentes en una sr:la especie se denominan haplogrupos.
Evolutionory Cenetics.
cabe destacar que 1o crucial para la aplicación de estos loci en el análisis
filogenético no es el potencial de cambio, sino la coexistencia de diferen-
tes alelos o haploglupos de cada locus en el conjunto de la población. For
lo tanto, los loci son polimorfos, y la infonnación concerniente a las rela-
ciones entre diferentes individuos se puede obtener comparando las qom-
binaciones de alelos o de haplogrupos de esos individuos. En una
población. aparecen nuevos alelos o haplogrupos porque se producen
nlutaciones en las células leproductoras de organismos individuales. C¿rda
alelo presenta su pr:opia frecuencia alélica, que se moclifica con el tiempo
c<.rmo lesultado de la selección natural y la deriva genética aleatoria. La
selección natural obedece a diferencias de aptitud (la capacidad de un
organismo para sobrevivir y repr:oducirse) que, seg¡:n Darwin, deteminan
la "presel'vación de variaciones favorables y el rechazo de variaciones lesi-
vas". Por lo tanto, la selección natural disminuye las fiecuencias alélicas
que reducen Ia aptitud de un organismo y aumenta la frecuencia alélica
que la mejora. En lealidad, pocos alelos nuevos surgidos en una población
ejercen una repercusión significativa sobre la aptitud, de manera qr.re }.i
mayoría no es afectada por la selección natulal pero, aur-r así, sus ficLutr;-
cias cambian por deriva genética aleatoria causada pol el carácter arb.itr¿r-
rio dei nacimiento, Ia rnuerte y la r:eproducción (fi.qur.a 19.21).

Ya sea debidc¡ a la selección natur¿il o a la deriva genética aleatoria. un

alelo puede comenzar a predominar en una población y, con el tiempo,
alc¿rnzar una frecuencia del loac'k. Ahora, este alelo se ha vuelto fijo.
Moclelos matemáticos predicen que, a 1o largo del tiempo, diferentes ale-
los se tornan fijos en una pobiación. lo que determina una sede de sus-
tituciones de genes. Si una especie se divide en dos poblaciones que por
lo genei:al no se cruz¿rn entre sí, sus frec,uencias alélicas se modificarán
cle diferente mod«¡, pol lo que después de algunas decenas de gener.acio-
nes alnbas tendrán oaracterísticas genéticas distintivas. Finalmente se
producen dil,ersas sustituciones de genes en las dos poblaciones pelo,
aun antes de que suceda esto, es posible distinguirlas pol las diferencias
de l¿rs frecuencias alélicas. se pueden emplear estas diferencias para
establecer la iecha en la que se dividió la población y determinar si una
r: ambas poblaciones presentaron un cuello de botella, un período en el
cual ei tamaño de la población sufrió una reducción sustancial.
 Aplicaciones de la filogenética molecular

l.)ir:;*i;;: *l l*:; ii.],'r¡.t ril,|,':;:;:,ll't.l i::,;rs,.r.r ': -

. . ' ,::{i ;: :::.:,
Se estima con rálzü11¿]ble certeza que el ori,§en cle los seles hun-i¿inos
re-side en Álrica, pues t:s ahí clonde se han enconlrado los fósiles pr-e-
irumanos rnás anriguo-q. La evidcncia paieontoiógica revela que los
horr-iínidos salielcn por primera vez c1e África hace más de un miilón
rle año-s, pero éstos no eran seres humanils n:odernr:-.,. sino Llnil espe-
cie pr:eviá clenonlinacla Horruo erectLLs (figur:a 19.22). Éstos fueron los
prirrrelos hominiclos que se dispersetron en térrrinos geográficos )', co11
el tien-rpo, se expandieron por todo e1 Viejo Nluncio.

Los eventos que siguieron a la dispersión de florn<: erectus sc¡n contro-

vertidos. A par:tir cie comparaciones que utilizaron cráneos y huesr:s de
fósiles, k:s paleontólogos an'ibaron a la conclusión qr-re poblaciones de
Ílomrs erectLts que se localizaron en distint¿is p¿rrtes del Viejo &{undo
dieron oligen a las poblaciones humanas modernas de esas regiones pol
Llll proceso liamado ev<¡lución multirregional (figura 19.2JA). Los seres
humanos de clistintas regiones geográficas se pueden haber reproducido
enire sí, en cierto grado, perc estas ciiversas pi:bl:rciones permanecieron
sepa::adas, en gl'an medida, durante toda su historia evolutiva.

l-as primeras cluclas acerca de la hipótesis multirregional fueron plelnte-

adas por reinterpt'etaciones de la evidencia fósil y. despuós, fuelon l1eva-
das a un pllr-]to crítico cuando, en 1987, se publicó un árbol filogenético §
reconstruido de datos cle RFLP mitocondrialcs obtenidos cle 147 seres
humanos que representaban poblaciones de todas partes del r¡undo. El
árbol (figura 19.24) confirmó que los ancestl'os de los seles humanos
n:oclelnos vivielon en Áfj:ica, pero sugirió que toclavía estaban ahí hace
¿rlrededor: cle 200.000 años. La aplicaciór-r del reloj molecul¿rr mitoc<¡n-
rlrial al árboi pet'rnitió inlerir clue el Dl\lA mitoci:ndriai ancestral, del
que descienden todos los DNA mitoconclriales modernos, existía ltace
140.000-290.000 ¿rños. El árboi reveló c¡r-ic- e-stc gc11olrrr mitocondrial
esr¿lba localizaclo en ¡ifrica, r1e ir-ianela clue la petson¿t qr:e io pr:seía, lii
a-sí ilamada Eva mitccondri;ll (ciebía set'ruujer porque cl Dt\A mitccotl-
rL'ial sólo se herecl¿¡ pr:r' r''ía matetrta) clet'e haber sido afi'ic¿rr-ra.

El descubr:in.:iento cle Eva n:itoooi"rch'ial llevó a posfular un 11l1evo escenat'io

par;i el r-rligen de 1cs seles humanos modernos. En lugar de cvolucionar en
paralelo por toclo el rnnnd<¡, corno sugel{a la hipótesis uultirrcgional, la
salicla de África alirn-ia qtte { {o*trs supiens -*e originó en Afi"ica y que, cles-
puás, miernbros de esta especie se tt'asladaron al resto del Viejo l!'lundo
entre i 00.000 y 50.00ü años atrás y clespiazat'otr a los descenclientes cle
L[omo erectLLs qlle encontraron (véase ligura 19.2]ll).

Sin d¡"rda, un c¿imbio cle pensamietlto tan laclical no dejó de ser cuestio-
Figura I9.22 Esqueleto de un
naclo. Ci:ando otl¿¡s f ilogcnetistas iriclieculai:es exanlinalon los datos cle Homo erectus adolescente de sexo
RFLP se volvió evidenle quc el análisis ci:mputarizado oliginal había masculino. Este espécimen, denonri-
sidci imperfecto y qLle se pociían leconstruil varios árboles bastante dife- nado también "niño de Nariokotome",
l'entes a partir c1e los c1at,:s. algunos cie los cuales no tenían raíz en Áfti- tiene alrededor de un 1,6 mrliones de
ca. Est¿rs crÍticas f ueron contlarle stildas por selics cie datos de años y fue hallado cerca del lago
secuencias de DNA mitocondt'ial más detallad¿rs, la mavoría de 1as cua- Turkana, Kenia. lmagen coftesía de la
Biblioteca, American Museum of
ies son compatibles co1'l un origen ati'icano relativamente recic'ntc r. así.
N¿lural History.
avalan la hipótesis de la s¿ilida de Africa, en lugar de la de evolución
multirregional. Estudios del cromosotna 1', que sugiercn que "e1 clomo-
soma Y Áaarr" tarnbién viyió en África hace alrecleclor cle 200.000 años,
¿rpot'tan un conrplerrenlo inieresante cie "Eva mitocondrial". Por supttc-c-
to, estos Eva y Adán no er¿ln equivalentes a lo.s perscnajes bríblicos y no
elan. de ningún nloclo, los írnicos sr:jetos vivos en esa época: sólo eran
los individuos que llevabirn el DFIA nitoconclrial v ios ct'omosomas Y
 .

628 Capítulo t9 Filogenética molecular

Flgura I9.23
ancestrales que dieron origen a toclos los DIIJA mitocondriaies y los cro-
(A) Evolución multirregional mosomas Y que existen en la actuaiidad. El punro irnportante es que
estos DNA ancestrales todar,'ía estaban en Alrica mucho despr.rés de la
!&omo erectus
dispelsión de Llorno er€cttts por Eurasia.
I
Ár¡¡;*¿ Los estudios de DNA mitocondrial y de cronlosornas Y palecen .lportar:
I
evidencia finre que av¿rla la teoría de 1a salida de África. Pero l-ran rur,gi.lo
lr::1|¡¡ Ái:lil-,i1 i.i§],,l cornplicaciones del exanlen de genes nucleares distintos de los cttr-rrenlciot
lll
Homo Homo Homo
en el crornosoma Y. Por ejemplo, las secuencias de B-gk:bina dan una fecha
rnuy zrnterior, 800.000 años atrás, para eiancestro comírn, y estudios de un
sapiens sapiens sapiens gen del cronlosoma x, PDHAI, ubican la secuencia ancestlal hace
ltl
Seres humanos modernos
1.900.000 años. En la actualidad, los antropólogos moleculares están deba-
tiendo la significación de estos resulrados. Se aguardan con ansiedacl más
sel'ies de datos y, es de esperar, aig;r:na clase de síntesis relevanre.

(B) Hipótesis de la salida de África

Hama erectus
I Los hombres de l'ieandertal sor-r homínidos extinros que viüelon en Europa
Á¡,*i*.1
1Ma
entre 500.000 ii 30.000 años atrás tfigula 19.25). Descendían de poblacio-
nes de Homo €rectLts que abaudollal'oll África hace alredeclor cle un rnillón
t j-jqilt:{ ¡1:i I.¡,
de añr:s y, de acuerdo con la hipótesis de la salida de África, fueron clespla-
I
I I I
I
zados cuando los seres humanos moderios alcanzaron Europa hace unos
{,I Homo
sapiens
dr' 50.000 años. Por lo tanto, una predicción c1e la hipótesis de la salida de
l
África es que no hay continuiclad genética entre los úollbres de N-eandertal
0,1 tu1a
y los seles humanos n-iodertos que viven en Europa en la actualidad.
T.eniendo en cuenta que el último hombre de Neandertai murió hace
Seres humanos modernos
50.000 años. ¿hay alguna manel'a de investigar.esta hipótesis?

E1 DNA antiguo lla ploporcir:naclo la respuesta. Descle hace algunos

años se sabe que ias moléculas DNA pueden sobrevivir a la muertc
c1e
del organisnlo que las contiene, y que son recuperables siglos y quizá
Figura I9.24 ililenios más tarde como fragmentos col'tos, degladados, pr.eservadás en
huesos y otros restos biológicos. Nunc¿i hay mucl-ro DNAantiguo en un
espécimen, quizá no n-iás de algunos pocos cientos de genonras en u11
gl'amo de hueso. pero eso no debe preocllpar, porque siempre es posible
lecun:ir a PCR para amplificar estas cantidades diminutas a cantidades
más grandes de las que pueden obtenerse secuencias de DNA.

El estudio de DNA antieuo ha estado plagado de controversi¿rs clurante los

úhimos quince años. A principios de la década de 1990 se publicaron rnuchas
courunicaciones sobre detección de DhiA humano anti€uo en hues¡¡s y otl.o,s
especínrenes arqueológicos, pe1'o a menudo resultó que al ser amplificacio pcx:
PCR no era DNA antiguo, sino DNA modemo conlarrinante dejado en ei
África
" AStd
Australia Figura 19.23 Dos hipótesis que compiten sobre los orígenes de los seres
a Nueva Guinea
. Europa numanos mooernos.

Figura 1.9.24.Árbol filogenético reconstruido a partir de datos de RFLp mito-

condriales obtenidos de 147 seres humanos modernos. se infiere que el DsjA
mitocondriaI ancestral ha existido en África, debido a la división del árbol entre ]os
siete genomas mitocondriales africanos modernos ubicados por debajo de ra
secuencia ancestral y todos los demás genomas por encima'de ésta. Como esta
rama inferior es exclusivamente afric¿na, se deduce que el ancestro también lc
era" Las barras de la escala en la parte inferior indican divergencia de secuenci¿s
a partir de las cuales, utilizando el reloj molecular mitocondiial, es posrble asignar
1..-.. ¡, I 1_J L.r..*], I : fechas a. los puntos de ramificación del árbol. El reloj sugiere que ia secuencrá
0 0,2 0,4 0,6 0.6 0,4 0,2 0
ancestral exístió entre 140.000 y 290.000 años atrái. Réimpreso con autorización
Divergencia de secuencias (1r) Oivergencia de secuencjas (?.;)
de Cann et ol. (1997), Noture, 325:3i-35.
@r,-
,, .. .:.,r.

t:) .
Aplicaciones de la filogenética molecular 6tg
:a,:::r

.t ::

Figura I9.25 Cráneo de un varón

I de Neandertal de 4o a 50 años. El
i.,, espécimen tiene alrededor de 50.0ü0
años y fue hallado en La Chapelle-
aux-Saints, Francia. lmagen cortesia de
lohn ReaderlScience Photo Lrbrary.

cspócimen por e1 arqueólogo que lo excayó o por el biólogo molecular que

1l*r.'ó a cabo la extracción del DNA. Debido al éxito mundial de la película
lurttssic Pcrrk se comunicaron hallazgos de DNA en insectos presewados en
íirnbar e, incluso, en huesos de dinosaudos, pero ahora se duda de todas estas
afinrraciones. Muchos biólogos comenzaron a prcguntarse si en realidad exis-
tía cl DNA antiguo, perc poco a poco se volvió evidente que, si el trabajo se
r:lcctúa con extrelro cuiclaclo, a veces es posible extraer DNA antiguo, autén-
iico, de especímenes de hast¿r 50.00ü años de edad, ur-ra antigüedad suficien- Neandertal
tc para incluir algunos huesos de neandertales.

Se consideró que el primer: espécimen de neandertal seleccionado para

estudio tenía de 30.000 a I00.000 añr:s de antigüedad. La extracción de
Dl'lA se llevó a cabo en un fragmento óseo que pesaba alrededor de
400 mg, y se aplicó una técnica denominada PCR cuantitativa para deter-
nrinar si había moiéculas de DNA y, de ser así, cuántas. Los resultados indi- Seres humanos
modernos
caron que el fragJmento óseo contenía alrededor de 1.500 copias del
genoma mitocondrial del neandeltal, sulicientes para sugerir que valía la
pena intentar el análisis de secuencias. Por lo tanto, se dirigieron las PCil.
a lo que se prevía que sería la parte niás variable del genoma mitoconch'ial
del neandertai. Como se preveía que el DNA se rompería en frag¡mentos
muy cortos, se construyó una secuencia en secciones practicando nueve
PCR solapadas, ninguna de las cuales amplilicó más de 170 pb de DNA,
pero que. junias. dieron una lor:rgitud global de 377 pb. Figura I9.26 Relaciones entre hom-
bres de Neandertal y seres huma-
nos modernos, según se deduce de
Después, -qe constrryó un árbol filogenético pal'a conlp¿irar la secuencia obte- la secuencia de DNA antiguo obte-
nida del hueso del neandertal con las secuencias de seis haplogrr:pos de DI.'IA nida de un hueso de neandertal.
630 Capítulo l9 Filcgenética rnolecular t' ,,'a ,

l"l'
''i, li i

rnitocondrial de seres humanos modemos (figura 19.26). La secuencia del i ,1i

i

neandertal se ubicó en una rama propia, concectada alaruíz del árbol, pel1: .
sin unión directa con ninguna de ias secuenci¿rs humanas modemas. A con- ,' ',,'t
'

tinuación, se placticó una enolrne alineaciÓn rnúltiple para compal'al' la

Secuencia clel neandertal con 99.1 secuencias de Se¡eS humanos moderrros. '' 'r:,
Las diferencias fueron llamativas. La secuencia del neandertal diferia de las '',',.',,
': ''iii
secuencias modemas en un promedio de 27,2 * 2,2 posiciones nucleotidicas.
mienfras que las Secuencias modemas, que provenían de todO el mundü, nO ,,,.,..',,

sóio cle Eurr:pa, diferían entte sí únicamente en B t 3,1 posiciones. Se obtu

vieron resultádos similares cuando se examinó ei DNA mitocondrial ric ur,
segundo esglleleto de neandertal. El grado de diferencia entle el DNA del ,.,,'
neánclertal y el europeo modemo es incompatible con el concepto de que los
europeos modemos descienden de hombres de neandertal y avala con.fit"lne- ,,r ,,:,r,
za l;hipótesis de la salida de África. Sin embargo, los defensores de la ev<¡-
:t'.,,,';,,,;,

lución multinegional no están convencidos y ei debate sobre los orígenes de i,,,

los seres humanos modemos continúa.

d-*s pr:lr*,':*s ## ffiJ5¡re:{ii}§*s sl*§ l:l***lt$s r*:;¿: §$ri.'*''

, ;,:::;c,: <.)lj { .ii:ti.'.'.rii;..:,.,,
Cualquiera que haya sido la vía eyolutiva, había seres humano,s moder-
llos en la mayor puit" d" Europa hace 40.000 años. Esto es evidente por
los registros fÓsiles y arqueológicos. Ei siguiente aspecto controveltido
c1e la frehistoria humanl se refiere a si estas poblaciones fueron despla-
zadas alrededor cle 30.000 años más tarde por otIOS seles hunranos que
migraron hacia Europa desde Oriente Próximo.

El ir-iterrogante se centra en e[ proce§o pol el cual se propagó la_ agl'icul-

tufa en Europa. La transición de la caza y la recolección a la l¿ibranza
tuvo lugar en Oriente Próximo hace 9.000-10.000 años, cuando los pri-
met:os áld.ur,to* neolíticos comenzar a cultivar cereales, como trigo y
cebada.Despt-résdesuestablecinrientoenorientePrÓximo,1aagr,ieLrl.
tura se extenclió a Asia, Europa y Norte de África. La bírsqued¿t de cvi-
clenoi¿l c{e agricultura en sitios arqueológicos, por ejemplo restos de
plar-rtas cultivaclas o de implementos de labranza, ha permitirlo l'astleal
i;r erpansión agrícola pot É.rtopu a 1o lalgo de dos rutas: una aheclcclol
cle 1a costa hasta Italiá y España, y la segunda a través de los valles del
Rin y el Danubio hasta el I'Jorte cle Europa (figura 19.27).

7
Figura 19.27 Propagación de la -.,4.,1i

agricultura de Oriente Próximo a -.1:.1:4.:..¡.. .. ::t11.,

Europa. La zona de color verde oscu-
r,: es la "Media luna fértil'| la región
de Orlente Próximo donde muchos
de los cereales acluales -trigo, ceba-
da, etc.- crecían en forma silvestre y
donde se considera que estas plantas
[ueron cultivadas por primera vez.
 Aplicaciones de la filogenética molecular 65t

¿Cómo se difundió la agr{cultura? La explicación más simple es

qte los
granjeros emigraron de una pa*e de Europa a otÍa, llevando con ellos sus
imphmentos, animales y cereales, y desplazaron a las comunidades abor{-
genes preagrícolas presentes en Europa en esa época. Ai principic, los
genetistas avalaron este modelo de ola de avance, debido a los resultados
de un análisis err gran escala de las frecuencias alélicas de 95 genes nucle-
ares en poblaciones de toda Europa. La construcción convencional de
árboles no permite analizar de ningrrna manefa significativa una serie de
datos tan grande y compleja, por 1o que ésta debe ser examinada mediante
métodos estadísticos avanzados, basados más en la biología poblacionai
que en la filogenética, Un procedimiento de este tipo es el *nálisis de com'
ponentes principales, que intenta identificar, en una serie de datos, patro-
nes que corresponden a una distribución geográfica irregulat de alelos, que
quizás indique un movimiento poblacional pasado. El patrón más llamati- Figura 19.28 Cradación genética a
vo dentro de la serie de datos europea, que es responsable de alrededor del través de la Europa moderna.
28ola de la variación genética total, es una gradación de frecuencias alélicas
a través de Europa (figura 19.28). Este patrÓn implica que hubo una migra-
ción poblacional de Oriente Próximo al Noreste de Europa o en la direc-
ción cpuesta. Corno 1o primero coincide con la expansión de la agricultura,
como reveló el regisffo arqueológico, se considerÓ que e§te primer compo-
nente principal avalaba con firmeza el modelo de ola de avance.

Si bien el análisis parecía convincente, se plantearon dos cúticas. La primera

fue que los datos no indicaban cuándo tuvo lugar la m*igración inferida, de
maüera que el vínculo entre el primer componente principal y la expansión
de la agricultura se basaba sólo en el patrón de gradación alélica, no en nin-
grxra evidencia complementaria reiacionada con el período en el que se ini-
ció esta gradación. La segunda crítica surgió debido a los resultados de un
segundo estudio de poblaciones humanas europeas, que incluyó una ümen-
sión temporal. Este estudio investigó ios haplogrupos de DNA mitocondrial
de 821 individuos de diversas poblaciones de Europa. No confirrnó la grada-
ción de frecuencias alélicas detectada en la serie de datos de DNA nuclear y,
en cambio, sugirió que las poblaciones europeas habían pernanecido rela§-
vamente estáticas durante los últimos 20.000 años. Un refinamiento de este
trabajo llevó a descubrir que, en la población europea modema, predominan
once haplogrupos de DNA rnitocondrial, los cuales son un subgrupo de los
alrededor de 100 que se conocen en el mundo (figura 19.29), La mayoúa de
ellos están asociados con determinadas regiones geográficas, y se puede efec-
tuar un análisis estadístico detailado de sus distribuciones y relaciones para
inferir sus épocas de origen que, en el caso de los haplogrupos europeos, se
considera que indican la fecha en Ia que cada uno ingresó en Europa (figura
1 9. 50). El haplogrupo más antiguo, denominado U, apareció por prirnera vez

en Europa hace alrededor de 50.O00 años,lo que coincide con el período en

que, según el registro arqueológico, los primeros seres humanos modemos
ilegaron al continente cuando las capas de hielo se retiraron hacia el Norte al
final de la última glaciación mayor. Los haplogrupos más jóvenes, JyT1, que
a los 9.000 años de antigüedad podrían corresponder a los orÍgenes de la
agricultura, están presentes sólo en el 8,5olo de la población europea moder-
na, lo que sugiere que la expansión de la agricultura en Europa no fue la enor-
rne ola de avance indicada por el estudio de los componentes principales. Por
el contrario, ahora se piensa que la agricultura fue llevada a Europa por un
grupo más pequeño de "pioneros" que se mezclaron con las comtrnidades
preagrícolas existentes, en lugar de desplazarlas.

&$§gr**i*r.,r:§ k{.§rv}üfitis prehisfri rircs kxr§s *§ N*xv* fr§¿**d*

Por último, examinaremcs el grupo de controversias por completo dife-
rentes que rodean las hipótesis respecto de los patrones de migración
6t2 (apítulo l9 Filogenética molecular

Figura 19.29 Haplogrupos de DNA
mitocondrial humano. La red mues-
tra las relaciones entre los principales
haplogrupos mitocondrialei de la
población humana actu¿I. La codifi-
cación en color indica la región geo-
gráfica dentro de la que es más
frecuente cada haplogrupo.
humana que lleyaron al plimer ingreso en ei Nuevo Mundo. No hay evi-
dencia de la diseminación de Homo erectus por las Amér'icas, de moda
que se presume que los seres humanos no ingresaron en el Nuevo
t\{undo hasta después que el Homo súpiens moderno había evoluciona-
do en Asia o migrado a este continente. El estrecho de Bering entre Asia
y l{orteamér'ica es bastante superficial y, si el nivel dei mar descendiera
50 metros, sería posible caminar de un continente a otro. Se consider.a
que este puente de tierra de Bering fue la ruta que siguieron los prime-
ros seres humanos para llegar al Nuevo &{undo.

El mar se encontraba 5ü metros o más por debajo de su nivel actual duran-

te la mayor parte de la última Era Glacial, entre 60.000 y 1 1.000 años

€,1:eanuertat

Eva mitocondrial

#1t#*
África

v"fr¿ Eurasia oriental

t'ir'l:,: Eurasia
occidental

;""1;t:';111::'
Sur de Asia

ru
§ América
w--7
atLt'::::tt Australasia
w
 Aplicaciones de la filogenética molecular 6¡3

Orígen de la agricultura Figura 19.30 Los once haplotipos

mitocondriales europeos pri ncipa-
les. Se muestra el tiempo de origen
calculado para cada haplotlpo; las par-
tes llenas y huecas de cada barra indi-
can dlferentes grados de confianza.
Los porcentajes hacen referencia a las
proporciones de población europea
ll-r:;-t. I -..
moderna con cada haplotipo. Todos
r:-W-:: los hapk:tipos, excepto j y Tl, ingresa-
*:4,ü ri :*-§w-- ron en Europa antes del origen de la
agricultura, hace 9.000-l 0"0OO años.
;:C.i'.1
i I :¡1:1;i

10,000 20,000 30,000 40,000 50,000

Años antes de la época actual

¿1¡¡3.s, pero la t'uta habría sido inffansitable durante la mayoría de este perí-
orlo clebido a l¿r acumulación cle hielo no en el puente cle tien'a, sino en las
zol'l¿rs que ahora corresponden a Aiaska y el Noroeste de Canadá.

Asimismo, 1as legiones libles de glaciares de América del Norte habúan

estado heladas durante una p1'opotción importante de este período, con
purcos animales de c¿iza y mu),poca mader¿i para hacer fuego para 1os emi-
grantes. Pelo durante un breve lapso hace ak'ededor de 12.000 años, el
puente de tierra de Bering estuvo abierto en una époc,a en que el clima se
estab'a calentando y los glaciares estaban retrocediencio, de modo que había
un corredor sin hielo que llevaba de Beringia a 1a par.te cenh:al de
l.lcrteamérica (fig;ra 19.31). Estas consideraciones, junto con la ausencia
cle eyidencia arqueológica de seres hun-ianos en Noneamérica hace más de
1l.5Ll0 años, llevó a adoptar "hace alrededol de 12.000 años" como fecha
del ingreso inicial de k:s seres humanos en elNuevo M¡-indo. Algunos datos
reeientes de ocupación hurnana hace más de 1 1.500 años han instado a cier-
ta l'econsicleración, pero todavía se suele sllponer que se produjo una niigra-
ciór"i poblacional sustancial a Norteamérica, de 1a que desciencien todos los
abodgenes nolteamerjcanos n"ioderr:os, hace alrededor cle 12.000 años.

,.üué infr:mación apolta la filogenética moiecular'? Los priurcros estr-rdios

di: interés se llevaron a cabo ¿r fines de la década de 1980. con daros de
ItlrLP mitocr:ndriales; inclicalon qr:e l,:s aborígenes norteamericanos des-
cienden cle ancestros asiáticos e identilicaron cuatlo haplogrupos mitocon-
clriales ciistil-:tos. cienominados A, B, C y D, entre la población en su
conjunto. Estudios lirrgüísticos ya han m<¡straclo que las lenguas americ¿l-
nas se pueclen dividil en tres grlrpos clifeleirtes, 1o que sngicre qr-re los abo-
t'ígenes nortearnericanos modernos de scienden de tres grupos de
individuos, cada uno cle los cuales hablaba r:n iclioma disfinto. La inferen-
cia a partir de los datos moleculares c1e que. cle hecho, puede liabel habido
cl1¿)tro poblaciones ¿lncestrales no despeltó demasiada inquietucl, En I99l .
se obtuvo la primeui serie cle datos interesante de secuencias de DNA mito-
Figura 19.31 Posible ruta de rnigra-
condrial, lo que penlitió 1a aplicación rip¡rrosa de un reloj molecular'. Éste ción de seres humanos hacia el
indicó qr-re las rnigraciones a Norte¿lmérica -se prociujerr:n entre 15.000 y Nuevo Mundo. Durante un breve
B.ü00 años atrás, lo cual es compatibie cor-r la evidencia arqueológica cle ,12.000
período, hace ¿lrededor de
que no había seres hr.unanos en el cc¡ntinente hace niás de 1 i.500 ai1os. añcs, el puente de tierra de Bering
esluvo ¿bieno ¿l mismo tiernpo que
E-rtos primero-c análisis filogenóticos confin¡aron la evidencia complcmenta- el corredor sin hielo hacia Ia parte
central de Norteamérica. Las zonas de
t'ia aportada por estuciios alqueológicos ¡, linp$ísticos, <t pot. lo nlcr-ros no fr-re,
color vcrde oscrrro tnuesir¿n regiones
ron clernasiado cliscr:rclantes cr:n ésta. Sin embargo, otros ciatos moleculares que fueron tierra expuesta, pero que,
que se l-ian obteniclc¡ desde 1992 i-ran tencliclo a confiuldir el tema, en lugar ¿hora, están bajo el nivel del mar.
634 Capítulo t9 Filogenélica rnolecular

cle esclarecerlo. Por ejemplo, dif'erentes series de datos han proporcionado

divelsas estimaciones de la cantidad de mig'aciones a I'iorteairérica. Un aná-
lisis muy completo, basado en DIr,iA mitocondrial, señaló sók: una migracióp
y sugirió que ésta tuvo iugar de 25.000 a 2ü.000 afros atrás, mucho antes de
la Iecha tradicional asignada al período de migración. Los primeros estudios
de cromosomas Y establecieron una fecha de hace alrededor de 22.:üü añr:s
al "abr:rigen norteamericano Adán", el poltador del clomosoma Y ancestml
de la mayoría, si no de todos, los cromr¡somas Y de los aborí-qeites norteante-
ricanos modemos. Todaúa ha¡, un encendido debate soble estos resultarl*r.
Algunos antropólogos moleculares aceptan Ia inrplicación de que los ser*
humanos se establecieron en l.-lolteamérica hace unos 20.000 años, mucho
antes de 1o que indica la eüdencia arqueológica y genética previa. Otl'os con-
sideran que los datos genéticos, en su conjunto, son compatibles con dos
migraciones: una cle 20.000 a 15.000 airos atrárs, que corltpi:ende los cuall.rr
haplognrpos, seg¡uida de una seguncla migraciórr sustancial en un período
más reciente, que involucra los mismos haplog:upos y determina una mocli-
ficación de las distribuciones geogr:áficas de estos haplogrupos e1.)
Nolteamér'ica.

{:¡..-"".^^*
r".:.]'t;llilCl,|
La filogenética rnoieculal utiliza información molecular pala infelir'las l'ela-
ciones evolutivas entl'e genes y enti'e organismos. Desde hace muchos añns.
se ha empleado información molecular, como datos inmunológicos, patronL.s
de electr:oforesis cle ploteínas y ctatos de hibddación DNA-Dh{A. en filogené-
tica. pero hoy en día la mayoría de 1as comparaciones se hacen enrre sL-clren-
cias de DNA- Prinrero, se alinean $upos de secuencias v se identifican los
poiimorfismos, Esta infonnación es convertida en datos numéricos, cr:mo
una matriz de distancia, que puede ser analizada ntatemáticamente p:rla
reconstruir un árbol que muesh? las relaciones evolutivas entle las secucn- ,

cias. Hay varios rnétodos de reconstmcción de árboles, como vecino míis ¡r'ó-
xii-no y máxima parsimonia, qr:e aplican dit'erentes enfoques pala iduntiiicar
elárüol más probable para una deteiminada serie de datos. Algunos dc. cstos
métodos dependen mucho de ordenadot:es, y una limitación imporlante es lt
vasta cantidad de meuroria clel ordenador requerida pala el exarnerl rigult-rso
de una alineación. En ocasiones, es posible aplicar un r:eloj molecular a un
ár'bol para asignerr una fecha a un punto de ramiticación, pero la velouidad
clel reloj molecular no es la misma pala todos ios organismos, ni siquiel¿1 llara
parte de un genoma, por 1o que hay que tener cuidaclo a fin de eürar cllr" .'r
Al;pnas series de ciatos filogenóticos, como las secuenc:ias de iniembrr:: i.li:
una farnilia multigénica que se pueclen recombinar entre sí, no puc{iLr \ü
representadas por un árbol convencional, perr: sí por uner led. La filogenéti-
ca molecular ha lesue]to problemas de larga data lespecto de las relaclones
evolutivas entre 1os printates y está aportando infor:nación valiosa sob::e la
evolución del lillY y, por in1'erencia, sobre la historia de Ia epiden-ria clc sida. i
Tarnbién se la ha aplicado ¿r estudios de ia prehistol'ia humana. Mediantc la
compat'ación de secuencias mitocondriales y del cromosoma Y, se ha deduci- '

do que toclos lus seres lrunranos lllc¡dclnos clcsciendel.l dL. L¡na pob-lacióri que
vivióel.rÁfuicahircea1rededorde200.000años,yqueernigódeÁfiicalrace
100.000-50.000 años y desplazó a los descendientes de Homo ¿r¿ú'lrus cllr(
vir,ían por todo el Viejo Mundo en esa época. Estudios de DNA presenado
cle fósiles han r¡rr:strad«: que los europeos moclernosno descienden cn lbnna
directa de los hornbres de Neairdertal. La intl'oducción de la agricultrrr¿r cn
Europa coincide con L1n desplazamiento relativanlel-lte en pequeña escala de .

seres humairos desde Odente Pr'ó,rinlo, no clc una migración en pp'an escaia
seggida del desplazamiento de los cazadores-r'ecolectores abor'ígen..s. corlo
se pensó en un principio. Los seles humanos ingl'esaron en e1 Nuevo l{undo
desde Asia durante la ú1tima Era Glacial a tlavés de un puente de tierra ubl- .,,
caclo clonde ¿lhora se encuentt'a el eslrecho de Bering.