UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Tema:
“Extracción de Ácidos Nucleicos”
Curso:
Laboratorio de Biología Molecular
Docente:
Dr. Ronald Demetrio Navarro Oviedo
Alumno:
Jorge Juvert Coila Medina
Grupo:
Laboratorio L3-A

Arequipa – Perú
2023

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 PRACTICA N°03
EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
INTRODUCCION
La extracción de ácidos nucleicos es un procedimiento de rutina en los laboratorios de
biología molecular. Consiste en los siguientes pasos: lisis o ruptura de membranas, unión
de perlas magnéticas a ácidos nucleicos, lavados para eliminar proteínas y residuos, y
finalmente elución de ARN/ADN. Una buena extracción de ácidos nucleicos permitira
obtener resultados de amplificación confiables.
OBJETIVOS
• Conocer los principales pasos para la obtención de ADN genómico a partir de una
muestra biológica.
• Obtener ADN genómico de levadura mediante un protocolo rápido de extracción
con fenol y precipitación con etanol.
• Explicar cada una de las etapas del protocolo.
MATERIALES
• Pipetas de vidrio graduadas de 5 mL
estériles
• Incubadora o termostato a 30 °C
• Cultivo de levadura en medio sólido
• Micropipetas y puntas de 200 μL y
1,000 μL estériles
• Microtubos para centrifuga de 1.6
mL, nuevos y estériles
• Rejilla para microtubos
• Buffer STES Fig. 01. Sustancias requeridas para la
• Solución TE experimentación (TE, Acetato de sodio, SDS,
STES)
• Solución de fenol/cloroformo (1/1)
• Etanol absoluto
• Etanol al 70% (v/v)
• Acetato de sodio 3 M pH 5.2
• Centrífuga 6000 RPM refrigerada
• Vórtex
• Hielo/contenedor
• Agua destilada
• Congelador a -20 °C
Fig. 02. Mini
centrifugadora de
6000RPM Fig. 03. vórtex

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METODOLOGIA
Primera se transmitió 1.5mL de una prueba de levadura, ya
preparada anteriormente, con ayuda de una micropipeta de
1,000 μL hacia un microtúbulo de 1.6mL y un duplicado.
Seguidamente las colocamos en la mini centrifugadora de
6000 RPM por aproximadamente 10 min. colocando siempre
las uniones de las tapas de los tubos hacia la parte externa del
rotor.
En segundo lugar, después de que ya haya pasado el tiempo
requerido se sacan las muestras de la centrifugadora, para así
remover el medio de cultivo con ayuda de las micropipetas.
Fig. 04. Muestras luego de
Luego lo resuspendemos el pellet con 300μL de STES y lo centrifugar
colocamos en el vortex por unos 3 minutos para homogenizar.
Posteriormente de agregamos 50μL de SDS al 10%, para
después llevarlo hacia el termostato a 65°C por
aproximadamente 30 min.
Ya pasado ese tiempo sacamos las muestras con cuidado,
para luego agregar 300 μL de fenol: cloroformo a cada uno
de los tubos y procedimos a agitar por inversión
aproximadamente por 3 min. Seguidamente añadimos 200
μl de acetato de sodio a 3M con ayuda de la micropipeta en
cada tubo para luego volver a agitar por inversión por unos
Fig. 05. Termostato con las 2 min y lo dejamos reposar por 15 min en la refrigeradora.
muestras
A continuación, procedimos a centrifugar a 6000rpm
durante 12 min a 4 °C y así recuperar el sobrenadante en un tubo
limpio. Después le adicionamos 1 ml de etanol absoluto frío e
incubamos durante 5 min agitando suavemente el tubo.
Nuevamente centrifugamos a 6000 rpm por 20 min y
descartamos el sobrenadante.
Seguidamente se añadió 500 μl de etanol al 70%.
Centrifugamos de nuevo a 6000 rpm por 10 min, y descartamos
el sobrenadante, dejamos secar el precipitado a temperatura
ambiente invirtiendo los tubos sobre un papel absorbente.
Finalmente disolvemos el DNA en 50 μl de TE, para
posteriormente almacenarlo en el refrigerador a -20C°. Fig. 05. Manejo de la
micropipeta en tubos de
centrifuga.

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RESULTADOS
Después de agregar la solución de TE se pudo observar sustancias en la base de los tubos los
cuales serían el DNA purificado de la levadura.

DISCUSIÓN
Una de las muchas ventajas de utilizar levadura como un modelo de sistema es que
grandes cantidades de bio-macromoléculas, incluyendo los ácidos nucleicos (ADN y
ARN) pueden ser purificadas de las células cultivadas.
Según González & Valenzuela (2003) A diferencia de los genomas de organismos
multicelulares, el genoma de la levadura es muy compacto, dado que el 72% de la
secuencia corresponde a secuencias codificantes. El tamaño promedio de los genes de
levadura es de .45 kb, o 483 codones, y solamente el 3.8% de los ORFs contienen intrones.
COCLUSIONES

• Se logro conocer los principales pasos para la obtención de ADN genómico a

partir de una muestra biológica ya preparada previamente.
• Se obtuvo el DNA genómico de levadura gracias a un protocolo rápido de
extracción con fenol y precipitación con etanol.
• Se dio a conocer cada una de las etapas a seguir del protocolo para una adecuada
extracción del DNA.

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CUESTIONARIO
1. Describir cuál es el objetivo de cada una de las siguientes etapas:
• Lavado de las células
Para la purificación de ADN con el fenol y se lava con etanol al 70% para
eliminar sales y pequeñas moléculas orgánicas que podrían aún estar presentes
en la muestra.
• Adición de STES
Utilizado en cierta medida para el rompimiento de membranas para facilitar la
liberación del DNA y otros componentes.
• Adición de fenol:cloroformo
El cloroformo se mezcla con el fenol para reducir las pérdidas de ARN total
en la interfase y de esta forma aumenta la eficiencia en el proceso de
extracción. El cloroformo desnaturaliza las proteínas, elimina los lípidos y
solubiliza el fenol.
• Precipitación con etanol
Este ayuda a eliminar la capa de solvatación que rodea el ADN, lo que permite
que el ADN se precipite en forma de gránulos.
2. ¿Indique qué papel juega cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de
extracción y purificación?
SDS 10%
El SDS es un compuesto que trabaja interrumpiendo enlaces no covalentes en las
proteínas, desnaturalizándolas, y haciendo las moléculas perder su conformación.
Fenol:cloroformo
Esta combinación se utiliza para la extracción del ARN con los mismos fines que en la
extracción del ADN (formar las fases orgánica y acuosa, desnaturalizar proteínas e
inactivar nucleasas).
Tris-HCl
Es un amortiguador. Los amortiguadores se encargan de mantener el pH en la solución.
Este en específico es una substancia básica. Con esto, se evita que se degrade el DNA y
el RNA en las células.
Buffer TE
Aumenta la estabilidad del ADN en muestras almacenadas a largo plazo o de uso
frecuente, pues inhibe DNasas presentes en la muestra.
Acetato de sodio
Es muy eficaz en la precipitación de ácidos nucleicos y es la sal más versátil porque no
inhibe muchas de las reacciones que a menudo se realizan con los ARN purificados. La
sal neutraliza la carga en el esqueleto del ácido nucleico

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BIBLIOGRAFIA
1. Abyntek (2017). Precipitación de DNA con Etanol vs. Isopropanol. Recuperado de:
https://www.abyntek.com/precipitacion-de-dna-con-etanol-vs-
isopropanol/#:~:text=La%20precipitaci%C3%B3n%20de%20DNA%20con,%C3%
A1cidos%20nucleicos%20en%20soluciones%20acuosas.

2. González, A., & Valenzuela, L. (2003). Saccharomyces cerevisiae. La levadura

Saccharomyces Cerevisiae: un modelo de estudio desde hace mas de cien años. Centro
de Investigación sobre fijación de nitrógeno, Mor Editores: Dra Esperanza Martinez
Romero y Julio César Martinez Romero. UNAM. Cuernavaca, México.

3. Hughes L. (2019). RNA precipitation. Recuperado de:

https://www.protocols.io/view/rna-precipitation-yxmvmx7p6l3p/v1

4. Orfao, A., & Morent, M. (2011). PNT Extracción de ácidos nucleicos. Madrid: Red
Nacional de Biobancos.

5. R. Navarro & B. R. Mestas (s/f). MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA

MOLECULAR