Los métodos espectrofotométricos se basan en la radiación electromagnética

que es la luz, la luz es un ente físico que viaja en 2 campos que es un campo eléctrico

y un campo magnético, entonces el vacio y la luz viajan en estos 2 campos,

en forma perpendicular

la luz es una radiación electromagnética que viaja en el vacio

en 2 planos, un plano magnético y un campo electrico

al viajar esta radiación electromagnética estas describen ciertas propiedades físicas

la distancia entre cresta y cresta entre 2 picos se llama longitud de onda

las que tienen menor longitud de onda son las mas energéticas

y tienen una alta frecuencia

mientras las ondas que tienen mayor longitud de onda que son mayores o que son de

longitud larga tienen una baja frecuencia y una baja energía

animación : es asi como la luz viaja en el espacio el vacio a través de 2 planos

perpendiculares

hay que distinguir ciertas caracteristicas ciertas variables físicas que nos van a permitir

determinar ciertas propiedades de esta luz

vemos 2 partes un pico y un valle

la distancia que existe entre 2 picos de ondas sucesivas se va llamar longitud de onda

existen 2

longitud de onda larga menor fuente energética baja energía baja frecuencia

longitud de onda corta son mas energéticas mayor fuente energética y

tienen una alta frecuencia

la distancia entre cresta y cresta entre 2 picos se llama longitud de onda

frecuencia es el numero de ondas que pasan por un punto imaginario

en determinado tiempo

luz ultravioleta 200 a 400 nanometros

luz visible 400 a 700 nanometros

ultravioleta

infraroja
espectrofometro

. fuente de luz: es una lámpara – debe emitir luz ultra violeta luz visible

. colimador – concentra en haces la radiacion de luz para que lo dirija

hacia el lente lo va captar y lo va dirigir concentrar en puntos para que lo lleve a

un monocromador

. monocromador selecciona una longitud de onda especifica

. selector

Un espectrofotómetro está constituido por una fuente de luz

esta va proporcionar la luz visible luz ultravioleta que queremos

utilizar para medir un constituyente dentro de una muestra problema

luego necesitamos un colimador que nos va concentrar los haces de luz

luego un monocromador y un selector de onda que nos va seleccionar

una longitud de onda especifica

luego esta luz monocromática va incidir

sobre nuestra muestra problema

al incidir esta luz monocromática va ocurrir dos fenomenos fisicos

o bien la solución absorbe una parte de esa luz lo que denominamos absorbancia

y una parte de esa luz es transmitida hacia el otro lado la llamada transmitancia

luego esta información de esta variable física transmitancia y absorbancia

son traducidas a una información numérica.

La mayoría de cálculos se hacen utilizando la absorbancia.

Los equipos automatizados de bioquímica clínica utilizan la absorbancia.

Video

.Fuente de luz

.colimador que va concentrar los haces de luz

.Un dispositivo que me va seleccionar la longitud de onda especifica

que puede ser un Prisma , un monocromador, una rejilla de difracción

luego esta luz seleccionada monocromática va incidir sobre nuestra muestra

va ocurrir 2 fenomenos físicos la absorbancia y la transmitancia

la absorbancia es la porción de luz absorbida por nuestra muestra

y la transmitancia es la luz que al incidir pasa por nuestra muestra atraviesa

nuestra muestra y

luego esa información es traducida en un lector numérico

con el cual se va hacer los cálculos respectivos.

Grafico

Recordar

. La longitud de onda es la distancia que existe entre 2 crestas de ondas sucesivas.

. nanómetros 10 a la - 9

. Nanómetros a metros es 10 a la -9 metros

Curva de espectro de absorción

. grafico

Para que sirve esta curva de

espectro de absorción?

Para determinar

cual es el pico de máxima absorcion

quiere decir que a esa longitud de onda

es donde se ha observado o se observa la

mayor absorbancia de luz

y es ahí en ese pico donde debo hacer la

determinación.

Quiere decir que si tengo una solución

a ese color tiene este comportamiento

entonces yo debo hacer la lectura

a 500 nanómetros.

Cuando ustedes leen una Glucosa colesterol el inserto dice

leer a 505 nanómetros 700 nanómetros porque es el pico de máxima

Absorción es el lugar donde existe la mayor cantidad de absorción

de luz.
Grafico de curva de espectro de absorción de 2 coenzimas

Oxidación a perdido electrones

Reducido a ganado electrones

Nad oxidado tiene un pico

De absorción máximo de 260 nanómetros en su forma oxidada.

Nadh reducido observamos tiene 2 picos de absorción también

Absorbe luz a 260 nanómetros y también absorbe luz a 340 nanómetros

. pregunta

¿Como yo utilizando el procedimiento de espectrofotometría

puedo diferenciar esta forma oxidada y esta forma reducida?

La forma de diferenciar es haciendo la lectura a 340 nanómetros.

A 340 nm solo absorbe el Nadh reducido

Entonces de esa forma yo puedo hacer la diferencia

entre estas 2 coenzimas.

Cuando yo lea a 340 nm

solamente va absorber luz el Nadh reducido.

En resumen la Curva de espectro de absorción

. Me va permitir deducir el pico máximo de absorción de una sustancia de una solución

. Y diferenciar compuestos, compuestos frente al comportamiento a sus diferentes

comportamientos

de absorción de luz

. nos va permitir diferenciar diferentes compuestos.

Ley de Lambert y beer

Relaciona al termino concentración de la solución

La longitud de la cubeta
 [Std ---- 0.250 abs std

[Mp ---- 0.400 abs mp

Mp = [std x abs mp

Abs std

[Mp= 100 x 0.400

0.250

[Mp = 160 mg/dl

Mp = [st x abs mp

Abs st

Factor de calibración (fc)

Mp = absmp x fc

Mp = 0.300 x 400 = 120 mg/dl

Clase 2

Soluciones

Las soluciones se pueden expresar en términos de concentración

La concentración si lo definimos es la cantidad de soluto presente en una solución

Y estas concentraciones pueden expresarse en unidades físicas y químicas

Dentro de las unidades físicas tenemos las denominadas

Concentraciones porcentuales;

Y hay una forma de expresar cuando las concentraciones de soluto son muy pequeñas me
estoy refiriendo a las partes por millón.

Dentro de las unidades químicas tenemos la famosa molaridad y normalidad.

Diluciones aplicamos mucho cuando hacemos una curva de calibración y sale un valor por
fuera de esa curva y entonces hay que hacer una respectiva dilución y luego multiplicar por el
factor de dilución para hallar la concentración real del constituyente que estamos midiendo.

Determinación de hierro

Teníamos la concentraion de 3 estandares, los estadares son luciones que tienen

concentaciones conocidas del analito que vamos a medir y en este caso el ejrcicicio era el
hierro serico.

Y Había un estándar que no tenia nada del analito ósea 0,

cuando mediamos en el espectrofotómetro su respectiva absorbancia esto nos arrojaba 0,

queria decir que el solvente que contenia el hierro serico no absorbe luz a la longitud de onda
que estaba determinando este analito,

por eso no era necesario hacer la resta,

salvo que cuando nosotros midamos este estándar de 0 y obtengamos una absorbancia
entonces ahí hay que restar a los demás estándares inclusive a las absorbancias de las
muestras problemas,

pero en este caso no era necesario hacer tal diferencia como lo habíamos hecho en el ejercicio
numero 1 cuando restamos las absorbancias.

Para realizar nuestra curva de calibración nosotros seleccionábamos todos los datos

En la columna en las

Abscisas o eje x teníamos a las concentraciones

Expresadas en milimoles

Y en el eje y o ordenadas teníamos que tener los valores de absorbancias

Seleccionábamos ambas columnas y buscábamos insertar y aplicábamos el primer grafico de

dispersión
Entonces teníamos que colocar los títulos adecuadamente a los ejes títulos del eje títulos del
grafico líneas de cuadricula

Teníamos que colocar los títulos adecuadamente

En este caso vendría ser el eje de las x

La concentración de hierro serico mM

Y en el otro extremo el eje de las y las absorbancias

Agregar línea de tendencia

Marcábamos que teníamos que tener la ecuación en el grafico además

El valor de R o el coeficiente de determinación.

Salía unos números de la ecuación de la recta donde x 0.0073 representa el valor de la

pendiente

Y el valor de 0.0005 el valor del intercepto

Donde esta recta realizaba la intersección en el eje de las y.

Y este coeficiente de determinación nos indicaba la distancia que existía entre los puntos

Que habíamos obtenido ante esta recta de regresión lineal que es la ideal.

Se dice que es una buena curva cuando el coeficiente de determinación

Se aproxima a la unidad.

Luego que habíamos obtenido

Vamos a poner curva de calibración al título del grafico

Luego, una vez que teníamos nuestra curva de calibración

Había 3 forma de determinar la concentración de nuestras muestras problemas.

1. Es sustituyendo el valor de las absorbancias (eje de las “y”) en esta ecuación

y = 0.0073x + 0.0005
y despejábamos “x”
y obteníamos la respectiva concentración

absorbancias mp
mp 1 -----------0.128
mp 2 -------------0.233
mp 3 ---------------1.25

2 seleccionábamos = tendencia (seleccionábamos los datos de concentraciones;

seleccionábamos todos Los datos de valor de las absorbancias;

y el valor de absorbancia de nuestra muestra problema.) y teníamos el valor de las

concentraciones de nuestras muestras problemas.

Y eso era lo que teníamos que presentar.

3. otra forma de calcular era por la interpolación, es menos exacto

Por ejemplo, tenía un valor de absorbancia (eje de las Y) de 0.128 y por interpolación tenía que
ver en qué parte de la curva de calibración caía ese punto y obtener la concentración de hierro
sérico.

Tendríamos que tener una hoja milimetrada para hacer este cálculo.