Universidad Nacional de Colombia Bogotá-Colombia

VERIFICACION DE ESPECTROFOTOMETRO UV-VIS, THERMO

SCIENTIFIC 600 EVOLUTION™
Carlos Hernando Tapia Bastidas1
1
Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento
de Química, Laboratorio de Análisis Químico Instrumental.
2
Email de autor: chtapiab@unal.edu.co
26 de mayo de 2023

Resumen
Se realizó la verificación de un equipo de
espectroscopia Uv-Vis, Thermo Scientific 600
Evolution™ para ello se usó celdas de plástico,
vidrio y cuarzo con el objeto de analizar
absorbancias o transmitancias de los materiales y
se determino que las celdas de cuarzo absorben
menor energía y abarcan un rango espectral de
análisis Uv-Vis. Se determina la relación S/N de
323, 96 un error relativo de 0.003 en %T y
desviación estándar de 0,001 en absorbancia y
0,309 %transmitancia. Las pruebas de exactitud y
precisión de longitud de onda muestran error
relativo menor a 0,7 y desviaciones estándar
cercanas a cero. La exactitud y precisión
fotométrica revela valores de errores absolutos de
0,02 y coeficientes de determinación del 97%
asociado a un error relativo de 2,06%
respectivamente a 1 esperado. Se determina que
el equipo se encuentra en condiciones optimas de
trabajo con mediciones a valores esperados y
reproducibilidad en la medida de los datos.
Abstract
The verification of a Uv-Vis spectroscopy
equipment, Thermo Scientific 600 Evolution™,
was carried out for this, plastic, glass and quartz
cells were used in order to analyze absorbances
or transmittances of the materials and it was
determined that the quartz cells absorb less
energy and cover a spectral range of UV-Vis
analysis. The S/N ratio of 323 is determined, 96 a
relative error of 0.003 in %T and a standard
deviation of 0.001 in absorbance and 0.309 %
transmittance. Wavelength accuracy and precision
tests show relative error less than 0.7 and
standard deviations close to zero. The photometric
accuracy and precision reveals absolute error
values of 0.02 and determination coefficients of
97% associated with a relative error of 2.06%
respectively to 1 expected. It is determined that
the equipment is in optimal working conditions with
measurements at expected values and
reproducibility in the measurement of the data.

Palabras clave. Verificación, coeficiente de Key Words. Verification, coefficient of

determinación, absorbancia, transmitancia, error determination, absorbance, transmittance, relative
relativo, precisión, exactitud, regresión lineal. error, precision, accuracy, linear regression.

Objetivo
- Verificar el correcto funcionamiento del espectrofotómetro Uv-Vis ,Thermo Scientific 600 Evolution™
usando valores de referencia según fabricantes mediante análisis de exactitud, precisión, linealidad,
ruido entre otros.
- Conocer las partes, funcionamiento y debido uso del equipo a la hora de realizar la parte
experimental
- Desarrollar habilidad y destreza experimental, afianzando conocimientos teórico-prácticos.

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Equipo
- Espectrofotómetro Uv-Vis ,Thermo Scientific 600 Evolution™,
Materiales
- Celda de plástico
- Celda de vidrio
- Celda de cuarzo
- Celda de holmio
Deben estra certificadas y sus materiales deben ser de alta pureza.
Reactivos
- Solución de Sulfato de cobre (CuSO4) en ácido sulfúrico (H2SO4) al 1%, en diferentes
concentraciones (0.02, 0.04, 0.06, 0.08,0.1, y 0.12)M, la sal debe ser de grado analítico de alta
pureza.
- Blanco ácido sulfúrico (H2SO4) al 1%.
- Agua desionizada
Métodos
Teniendo en cuenta las propiedades de interacción radiación materia para los diferentes análisis
espectrofotométricos en las zonas del ultravioleta y el visible, es indispensable verificar los instrumentos de
medida y sus componentes como: fuentes, monocromador, detectores y señales de medidas. La verificación
de estos equipos se basa en la absorción de la radiación por la materia para poder cuantificar las diferentes
sustancias de forma óptima y con certeza estadística.
Las diferentes ecuaciones que se tienen en cuenta son las siguientes:
Ecuación (1)
I
Transmitancia=T =
I0
Ecuación expresad a de forma porcentual:
Ecuación (2)
I
T ( % )= x 100
I0
*I0 intensidad de radiación entrante
*I intensidad de radiación saliente
La absorbancia es una una medida de a partir de una transformación logarítmica definida por la siguiente
ecuación:
Ecuación (3)

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I
Absorbancia= A=−LogT =log
I0
La absorbancia es una variable directamente proporcional a la concentración y longitud del camino óptico
donde se deposita la muestra y se pude expresar como:
Ecuación (4)
Absornacia= A=ϵ∗b∗c
*ϵ Absortividad M-1cm-1
*b longitud del paso óptico cm
*C concentración M

RESULTADOS
Determinación de señal ruido
Se hace medición en la configuración de %T transmitancia del aire de fondo en un rango espectral de 200nm
a 800nm en intervalos de 0.1nm y una velocidad de barrido de 60nm/min.

Gráfico señal ruido S/N

100.8
100.6
100.4
% Transmitancia

100.2
100
99.8
99.6
99.4
99.2
190 290 390 490 590 690 790
Longitud de onda λnm

Figura 1. Espectro de %Transmitancia en función de longitud de onda nm.

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Grafico señal ruido S/N

101.5

101
Absorbancia 100.5

100

99.5

99

98.5

98
199 299 399 499 599 699 799
Longitud de ondaλ nm

Figura2. Espectro de absorbancia en función longitud de onda

Podemos ver que representa el ruido o línea de fondo, con su promedio podemos determinar la línea base
para realizar distintas mediciones. Se espera que los valores sean mínimos, aunque depende del tipo de
equipo que se use y la calidad del mismo.

Ecuación (5)
Promedio de medida

Ecuación (6)
Desviación estándar

Ecuación (7)
Señal/ruido

S E promedio
=
N SE

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Tabla1. Resultados de análisis señal-Ruido

Descripción %Transmitancia Absorbancia

Promedio 100,010 0,001
SD 0,309 0,001
Max 100,886 0,004
Min 99,218 0,000
(P-P) 1,668 0,004
Error relativo 0,003 0,7103
S/N 323,955 1,408

Como parámetro de aceptación se toma en cuenta la desviación estándar, error relativo en absorbancia y en
transmitancia o S/N es lo mismo que el reciproco del error relativo de la señal [2] depende criterio del
experimentador en este caso tomare error relatico y desviación estándar como criterio de aceptación.
Tabla 2. Resumen de datos de aceptación en la verificación del espectrofotómetro Uv-Vis.

Descripción %T Cumple Absorbancia Cumple

Error relativo de S/N 0,003 si 0,7103 si
SD 0,309 si 0,001 si

*SD desviación estándar

*PMAX pico máximo
*PMIN pico mínimo
*Δ(P-P) diferencia pico máximo y pico mínimo
*ER Error relativo
*S/N Señal ruido

Los errores están por debajo del 1% son aceptables en las diferentes mediciones.

Para garantizar unos resultados confiables en las diferentes mediciones en espectroscopia Uv-Vis, es
necesario identificar las diferentes señales de ruido presentes como fundamentales y no fundamentales entre
ellos tenemos: ruido cuántico de shot o disparo, ruido dominante a bajos niveles de radiación, ruido flicker,
ruido oscuro, perturbaciones del medio [2].
Es una buena forma de aproximar los valores de corrección de fondo y determinar una línea base, aunque se
podría a una sola longitud de onda para que no haya fluctuaciones mayores del parámetro a medir a diferente
longitud de onda [3].

TRANSMITANCIA EN DIFRENTES MATERIALES DE CELDAS

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Materiales de celda y transmitancia

99
89
79
69

% Transmitancia
59
49
39
29
19
9
-1
196 246 296 346 396 446 496 546 596 646 696 746 796
Longitud de onda λnm

plastico vidrio cuarzo

Figura 3. Transmitancia en diferentes materiales de celdas

Idealmente, las cubetas deberían ser completamente transparentes a todas las longitudes de onda, ya que la
absorbancia de la propia cubeta reduce el rango dinámico lineal efectivo para la muestra. Las cubetas más
baratas son de plástico, normalmente acrílico. Estas cubetas no son resistentes a todos los disolventes y
absorben fuertemente por debajo de 300 nm, haciéndolas inadecuadas para medir en esta región. Las
cubetas de vidrio son ligeramente más caras que las de plástico, pero son más duraderas y con el cuidado
apropiado, pueden durar años. El vidrio absorbe por debajo de 320 nm y por tanto, no es adecuado para
medir en este área. Las cubetas de cuarzo fundido son razonablemente transparentes por debajo de 210 nm
ideales para análisis en rango Uv-Vis. Las mejores cubetas son de sílice fundida sintética de alta pureza,
siendo razonablemente transparentes por debajo de 190 nm, aunque no está en la gráfica se hace referencia.
Pese a que cada material es ideal en ciertos rangos analíticos no significa que sean completamente
transparentes y absorben cierto porcentaje menor a 10% de radiación, reportados en algunos documentos,
aunque a niveles mínimos, pero inciden en las medidas.[1] Podemos decir que la transmitancias y
absorbancia son inversamente proporcionales.
DETERMINACION DE EXACTIUD Y PRECISION DE LONGITUD DE ONDA USANDO CELDA DE HOLMIO

Se tiene en cuenta longitudes de onda λnm como referencia y se comparan las longitudes de onda obtenidas
experimentalmente usando una celda de holmio. Los valores de referencia se muestran en la siguiente
imagen.

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EXACTITUD

Figura 4. Longitudes de onda (nm) característicos de referencia usando celda de holmio en %transmitancia[4]

Figura 5. Longitudes de onda (nm) característicos de referencia usando celda de holmio en absorbancia [4]

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Figura 6. Longitudes de onda (nm) característicos de referencia con su incertidumbre usando celda de holmio
[4]

MEDIDA DE %TRANSMITANCIA EN DISTINTOS MATERIALES DE CELDAS

98
88
78
68
% Transmitancia

58
48
38
28
18
8
-2200 300 400 500 600 700 800
Longitud de onda λnm

Holfmio

Figura 7. Espectro de %transmitancia usando celda de holmio [4]

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Tabla 3. Resumen de datos exactitud de medida como criterio error absoluto en longitud de onda

Referencia Medida Error

Pico nm nm %Transmitancia absoluto Cumple
2 279,3 278,7 25,815 0,6 si
3 287,6 287 30,019 0,6 si
4 333,8 333,3 57,076 0,5 si
5 360,8 360,2 7,878 0,6 si
6 385,8 385 253 0,8 si
7 418,5 417,9 49,012 0,6 si
8 453,4 452,7 8,484 0,7 si
9 459,9 459,1 6,318 0,8 si
10 536,4 535,8 40,22 0,6 si
11 637,5 637,3 62,752 0,2 si

Podemos ver que el error absoluto esta por debajo de 1 por lo tanto es razonable que los valores cumplen con
exactitud, además los valores de error absoluto se mantienen a un valor de 0,6 en promedio.

3.9

3.4

2.9

2.4
Absorbancia

1.9

1.4

0.9

0.4

-0.1197 297 397 497 597 697

-0.6
Longitud de onda λnm

Holfmio

Figura 8. Espectro de absorbancia usando celda de holmio fondo aire [4]

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Tabla 4. Resumen de datos en exactitud de medida como criterio error absoluto de longitud de onda

Referencia Medida Error

Pico nm nm Absorbancia absoluto Cumple
2 279,3 279,2 0,551 0,1 si
3 287,6 287,6 0,458 0 si
4 333,8 334,1 0,214 0,3 si
5 360,8 359,9 1,029 0,9 si
6 385,8 386,8 0,155 1 si
7 418,5 419,2 0,259 0,7 si
8 453,4 453,5 1,004 0,1 si
9 459,9 458,8 1,156 1,1 no
10 536,4 537,6 0,34 1,2 no
11 637,5 638,8 0,183 1,3 no

Podemos ver que al comparar las posiciones de longitud de onda de referencia y medidas la mayor parte de
estos valores de los picos se encuentran por debajo de 1 de error absoluto, la variación de la posición del pico
no es significativa y la mayoría de las posiciones de longitudes de onda medida corresponden al valor
esperado la variación será mínima en cuanto a las medidas que hagamos al valor esperado.
PRECISION

Se toman dos picos para comparar 360,8nm y 536,4nm de la tabla de referencia de picos característicos
usando celda de holmio figura 6 y se comparan frente a absorbancia y transmitancia experimentales.

Transmitancia en función longitud

de onda λnm
80
70
% Transmitancia

60
50
40
30
20
10
0
350 355 360 365 370 375
Longitud de onda λnm

Figura 9. Espectro (360,8nm) 5 medidas de %transmitancia usando celda de holmio [4]

Tabla 5. Resumen de datos longitud de onda de 360,8nm criterio de precisión desviación estándar en
%transmitancia

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Referencia Medida
ID nm nm Transmitancia
PICO 5 360,8 360,20 8,01
PICO 5 360,8 360,30 7,96
PICO 5 360,8 360,20 7,69
PICO 5 360,8 360,10 7,80
PICO 5 360,8 360,20 7,84
promedio 360,20
SD 0,07

Absorbancia en función longitud de

onda λnm
1.2

0.8
Absorbancia

0.6

0.4

0.2

0
345 350 355 360 365 370 375 380 385
Longitud de onda λnm

Figura 10. Espectro (360,8) de 5 medidas de absorbancia usando celda de holmio [4]

Tabla 6. Resumen de datos longitud de onda de 360,8nm criterio de precisión desviación estándar en
absorbancia

Referencia Medida
ID nm nm Absorbancia
PICO 5 360,8 360,20 1,11
PICO 5 360,8 360,20 1,10
PICO 5 360,8 360,20 1,11
PICO 5 360,8 360,30 1,10
PICO 5 360,8 360,10 1,11
promedio 360,20
SD 0,07

Tabla 7. Resumen de datos longitud de onda de 536,4nm criterio de precisión desviación estándar en
%transmitancia

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Referencia Medida
ID nm nm %Transmitancia
PICO 10 536,4 535,7 40,05
PICO 10 536,4 535,7 40,06
PICO 10 536,4 535,7 40,01
PICO 10 536,4 535,7 40,02
PICO 10 536,4 535,7 40,01
promedio 535,70
SD 0,00

100
90
80
% Transmitancia

70
60
50
40
30
490 500 510 520 530 540 550 560 570 580
Longitud de onda λnm

Figura 11. Espectro de 5 medidas en %transmitancia usando celda de holmio [4]

Tabla 8. Resumen de datos longitud de onda de 536,4nm criterio de precisión desviación estándar en
Absorbancia

Referencia Medida
ID nm nm Absorbancia
PICO 10 536,4 535,7 0,397
PICO 10 536,4 535,7 0,398
PICO 10 536,4 535,8 0,397
PICO 10 536,4 535,7 0,397
PICO 10 536,4 535,8 0,398
promedio 535,74
SD 0,05

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0.45
0.4
0.35
0.3

Absorbancia
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
490 500 510 520 530 540 550 560 570 580

Longitud de onda λnm

Figura 12. Espectro de 5 medidas en absorbancia usando celda de holmio [4]

Si observamos las desviaciones estándar de las diferentes tablas obtenidas en comparación con sus
referencias pues estas están por debajo de 0,1 lo que indica que la reproducibilidad es buena o aceptable en
las condiciones de medida por lo tanto las variaciones de medidas repetitivas serán constantes.
DETERMINACION DE EXACTITUD Y PRECISION FOTOMETRICA

Se prepara diferentes concentraciones de sulfato de cobre (0.02, 0.04, 0.06, 0.08,0.1, y 0.12)M y se procede a
medir absorbancia a diferentes longitudes de onda (600, 650, 700 y 750)nm y se obtiene la siguiente gráfica.

Curva Cu(SO4)5H2O
1.2
1
Absorbancia

0.8
0.6
0.4
0.2
0
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
-0.2
Longitud de onda λnm

0,02 0,06 0,04

0,08 0,1 0,12

Figura 13. Espectro de medidas de absorbancia usando celda de cuarzo a diferentes longitudes de onda y
concentraciones de sulfato de cobre (Cu(SO4)) en 1% de ácido sulfúrico. (H2SO4).
Podemos ver que la concentración mas baja presenta un corrimiento a longitudes de onda mas grandes de
menor energía, quizá se debe a que la concentración de sulfato de cobre es tan baja y por efecto del acido
genera estos efectos. Se eliminan algunas curvas para pode ajustar los diferentes cálculos y minimizar
errores y variaciones.

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Tabla 9. Resumen de datos absorbancias medidas a diferentes longitudes de onda

Concentración M 600nm 650nm 700nm 750n

m

0,020 0,025 0,066 0,141 0,214

0,040 0,017 0,098 0,253 0,401

0,060 0,020 0,144 0,374 0,594

0,080 0,037 0,185 0,462 0,730

0,100 0,049 0,230 0,566 0,889

0,120 0,066 0,294 0,717 1,131

* los valores por debajo de las diferentes longitudes de onda representan absorbancias
Se realiza un ajuste de curva eliminando los dos primeros espectros de las dos primeras concentraciones más
bajas debido a un corrimiento de banda y de asimetría en las diferentes mediciones y esto nos puede alterar
las demás medidas

Curva Cu(SO4)5H2O
1.2
1
0.8
Absorbancia

0.6
0.4
0.2
0
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
-0.2
Longitud de onda λnm

0,06 0,08 0,1 0,12

Figura 14. Curva ajustada, espectros de absorción usando celda de cuarzo a diferentes longitudes de onda y
concentraciones de sulfato de cobre (Cu (SO4)) en 1% de ácido sulfúrico. (H2SO4).
EXACTITUD FOTOMETRICA

Tabla 10. Resumen de datos a una concentración de sulfato de cobre de 0,08M se lee absorbancias a una
longitud fija de 750nm.

Longitud Absorbancia Absorbancia

equipo Referencia Medida Error
nm Absoluto Cumple
750 0,817 0,8 0,02 si
750 0,817 0,796 0,02 si
750 0,817 0,794 0,02 si

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Promedio 0,817 0,797 0,02 si

*Comparación de absorbancias de referencia y medidas criterio de exactitud error absoluto

PRECISION FOTOMETRICA

Tabla 11. Resumen de datos se mide absorbancias a diferentes longitudes de onda para diferentes
concentraciones de sulfato de cobre (M).

Concentración
M λ600nm λ650nm λ700nm λ750nm
0,060 0,020 0,143 0,372 0,588
0,060 0,020 0,145 0,375 0,597
0,060 0,020 0,145 0,375 0,597
0,080 0,043 0,205 0,507 0,800
0,080 0,043 0,206 0,507 0,796
0,080 0,044 0,208 0,509 0,794
0,100 0,051 0,241 0,592 0,937
0,100 0,051 0,240 0,596 0,937
0,100 0,051 0,242 0,594 0,936
0,120 0,073 0,320 0,778 1,226
0,120 0,074 0,320 0,780 1,230
0,120 0,073 0,321 0,782 1,233
*Los valores debajo de las longitudes de onda de medida corresponden a absorbancias

Figura 15. Curvas a partir de regresión mínimos cuadrados y concentraciones de sulfato de cobre (Cu(SO4))
en 1% de ácido sulfúrico. (H2SO4).

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Figura 16. Obtención de coeficientes de determinación de sulfato de cobre como criterio de precisión a
diferentes concentraciones de (Cu(SO4)) en 1% de ácido sulfúrico. (H2SO4). Valor de referencia 1.
R2 Valor
1 0,9794
2 0,9796
3 0,9791
Promedio 0,9794
%Error Relativo 2,060

CONCLUSIONES

Los resultados que se obtuvieron respecto a la verificación del equipo de espectroscopia Uv-Vis, muestran
que el equipo se encuentra en condiciones óptimas de trabajo, con un mínimo de error que no altera
significativamente los resultados de medida. Se debe tener en cuenta otras fuentes de ruido y variables que
puedan generar un aumento de estos errores sean instrumentales, perturbativas o experimentales. Las
pruebas de exactitud muestran que las diferentes medidas no se alejan significativamente del valor esperado
y en cuanto a las pruebas de precisión indican una alta reproducibilidad de las medidas realizadas con
variaciones mínimas.

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