Universidad Nacional de Colombia Bogotá-Colombia

VERIFICACION DE ESPECTROFOTOMETRO UV-VIS, THERMO SCIENTIFIC 600 EVOLUTION™

Y DETERMINACION DE pKa DEL COMPUESTO AZUL DE BROMOTIMOL (BTB), MEDIANTE
ESPECTROSCOPIA UV-VIS.
Carlos Hernando Tapia Bastidas1
1Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, Colombia, Facultad de Ciencias, Departamento de

Química, Laboratorio de Análisis Químico Instrumental.

2Email de autor: chtapiab@unal.edu.co

14 de junio de 2023

Resumen
Se realizó la verificación de un equipo de espectroscopia Uv-Vis, Thermo Scientific 600 Evolution™.
Se realizaron análisis de señal ruido, exactitud y precisión en la longitud de onda y exactitud y precisión
fotométrica. Se determina la relación señal ruido S/N de 323, 96 un error relativo de 0.003 en % . Se
usó celdas de plástico, vidrio y cuarzo con el objeto de analizar absorbancias de los materiales donde
el cuarzo absorben menor energía y abarcan un rango espectral de análisis Uv-Vis.. Las pruebas de
exactitud y precisión de longitud de onda muestran error relativo menor a 0,7 y desviaciones estándar
cercanas a cero. La exactitud y precisión fotométrica revela valores de errores absolutos de 0,02 y
coeficientes de determinación del 97% asociado a un error relativo de 2,06% relativo a un coeficiente
de determinación de 1 esperado. El equipo se encuentra en condiciones óptimas de trabajo con
variaciones menores al 0,1 respecto a valores esperados y buena reproducibilidad en la medida de
los datos. Se determina pKa de “azul de bromotimol (BTB)” mediante espectroscopia Uv-Vis en un
rango espectral de 200nm a 800nm. Se preparan dos curvas de calibración el pH se mantiene fijo y
se lleva a volumen final de (20 ± 0,04) mL . A pH 13 se usa (1,3,4,5,6,7,9,)mL de stock BTB de
6,406x10-5 M y se obtienen concentraciones de (3.20x10-6, 9.61x10-6, 1.28x10-5, 1.60x10-5,
1.92x10-5, 2.24x10-5, 2.88x10-5 )M color azul, absorben en 615nm y 394nm. En pH 1 se usó
(2,6,9,12,15)mL de stock BTB y se obtienen concentraciones de (6,41x10-6, 1,92x10-5, 2,88x10-5,
3,84x10-5, 4,80x10-5)M color amarillo, absorbe en 433nm. El pH se ajustó con NaOH 1M y HCl 1M a
un volumen (50 ± 0,06) mL de stock BTB de trabajo. Se construye una recta por mínimos cuadrados
absorbancia en función de concentración y se determina coeficientes de absortividad (ε616nm básico
de 39894,7 y ε393nm básico de 8611,1) y medio ácido (ε433nm ácido de 17290,4). Se preparan 4
muestras a pH de 6.7, 6.9, 7.1 y 7.3 color verde con ecuación de Henderson Hasselbach con 10mL
de stock BTB a volumen de (20 ± 0,04) mL ajustando el pH con buffer de K2HPO4 y KH2PO4 y HCl y
NaOH muy diluidos mediante pHmetro. Se gráfica absorbancia en función de longitud de onda, se
determina rango de máximo solapamiento entre 450nm y 550nm. Se construye un modelo lineal por
regresión de mínimos cuadrados, método de adición. Se determina el valor de pKa de 6,94 con un
error relativo de 2,28% respecto al esperado 7,1 punto isobestico a 498nm.
Palabras clave. pKa, concentración, isosbestico, especie, equilibrio, pH, absorción, buffer,
absortividad, espectro, BTB, regresión, verificación, señal ruido, precisión, exactitud.

Objetivo
• Verificar el correcto funcionamiento del espectrofotómetro Uv-Vis ,Thermo Scientific 600 Evolution™ usando
valores de referencia según fabricantes mediante análisis de exactitud, precisión, linealidad, ruido entre
otros.

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• Determinar el pKa de un compuesto comercial usado como indicador de pH, azul de bromotimol (BTB)
mediante espectroscopia UV-VIS, usando método de adición.
Materiales y métodos
Equipo UV-VIS
- Cary 50 Spectrophotometer, versión 3, scan rate 600 nm/s, intervalo de datos 1nm, modo dual beam,
intervalo de medida de 200nm a 800nm, © Agilent Technologies, Inc. 1998 to 2011, Santa Clara, California,
EEUU.
Reactivos
- Solución de Sulfato de cobre (CuSO4) en ácido sulfúrico (H2SO4) al 1%, en diferentes concentraciones (0.02,
0.04, 0.06, 0.08,0.1, y 0.12)M, la sal debe ser de grado analítico de alta pureza.
- Blanco ácido sulfúrico (H2SO4) al 1%.
- Agua desionizada
- - Hidróxido de sodio (NaOH), 0,05M y 1M, preparado a partir de sólido grado analítico, CAS 1310-73-2 -
PanReac AppliChemcompanies, Barcelona (Spain).
- - Ácido clorhídrico 0,01M y 1M, preparado a partir de: EMSURE, ACS ISO, Reag, Ph EUR. Hidrocloric acid
fuming 37%, MERK.
Materiales
- Bureta clase B de teflón kimax de (25 ± 0,05) mL con subdivisión de 0,02 mL
- Pipeta aforada clase A de (1,2,5,10,)mL
- Balón aforado de (20 ± 0,04)mL y (50 ± 0,06)mL
- Celda de plástico, Celda de vidrio, Celda de cuarzo, Celda de holmio
Muestra de análisis
- Indicador de pH, azul de bromotimol (BTB), grado analítico, 0,04% en NaOH al 0,01M.
- Azul de bromotimol indicador ACS,Reag. Ph Eur, Millipore, CAS 76-59-5, MERCK S.A. Av.Carrera 9a No. 101-
67.Piso 5.Edificio NAOS.Officina 501 A 110111 BOGOTA D.C COLOMBIA.

Análisis y resultados
- La verificación de estos equipos se basa en la interacción radiación- materia teniendo en cuenta la ley de
Beer y sus ecuaciones de absorbancia y transmitancia.
Resultados y análisis

Gráfico señal ruido S/N

% Transmitancia

99,2
190 290 390 490 590 690 790
Longitud de onda λnm

Figura 1. Espectro de %Transmitancia en función de longitud de onda nm.

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Podemos ver que representa el ruido o línea de fondo, con su promedio podemos determinar la línea base para
realizar correcciones a las mediciones que hagamos. Se espera que los valores de interferencia sean mínimos lo
cual indica una menor absorbancia o mayor transmitancia.
Tabla1. Resultados de análisis señal-Ruido
Descripción %Transmitancia
Promedio 100,010
SD 0,309
Max 100,886
Min 99,218
(P-P) 1,668
Error relativo 0,003
S/N 323,955
*SD desviación estándar, *PMAX pico máximo, *PMIN pico mínimo, *Δ(P-P) diferencia pico máximo y pico mínimo, *ER Error
relativo, *S/N Señal ruido.

Como parámetro de aceptación se toma en cuenta la desviación estándar o error relativo en % transmitancia ya que
la S/N es lo mismo que el reciproco del error relativo de la señal [2]. Si analizamos por desviación estándar se desvía
de 0,1 que seria el esperado, pero es aceptable y si analizamos el error relativo esta por debajo de 0,01 al esperado
lo cual cumple, aunque puede variar algunos valores según el criterio del experimentador.

Podemos ver en la gráfica siguiente que el mejor material que no absorbe en Uv-Vis es el cuarzo, los demás absorben
en mayor proporción y en la región Uv, por lo cual se debe tener en cuenta en las diferentes mediciones y análisis.
TRANSMITANCIA EN DIFRENTES MATERIALES DE CELDAS

Materiales de celda y transmitancia

99
% Transmitancia

79
59
39
19
-1
196 246 296 346 396 446 496 546 596 646 696 746 796
Longitud de onda λnm

plastico vidrio cuarzo

Figura 2. Transmitancia en diferentes materiales de celdas

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DETERMINACION DE EXACTIUD Y PRECISION DE LONGITUD DE ONDA USANDO CELDA DE HOLMIO

Se tiene en cuenta longitudes de onda λnm como referencias reportadas en literatura y se comparan las longitudes
de onda obtenidas experimentalmente comparando su error absoluto y la desviación estándar usando una celda de
holmio.
MEDIDA DE %TRANSMITANCIA EN DISTINTOS MATERIALES DE CELDAS

98 3,9

78
% Transmitancia

2,9

Absorbancia
58

38 1,9

18 0,9
-2
200 400 600 800 -0,1
197 397 597
Holf… Longitud de onda λnm Holfmio
Longitud de onda λnm

Figura 3. Espectro de %transmitancia (a) usando celda de holmio, Espectro de absorbancia (b) usando celda de
holmio fondo aire [4]
Tabla 2. Resumen de datos, medida de picos y comparación con referencia, como criterio error absoluto en longitud
de onda.
Referencia Medida
Pico nm nm %Transmitancia Error absoluto Cumple
2 279,3 278,7 25,815 0,6 si
3 287,6 287 30,019 0,6 si
4 333,8 333,3 57,076 0,5 si
5 360,8 360,2 7,878 0,6 si
6 385,8 385 253 0,8 si
7 418,5 417,9 49,012 0,6 si
8 453,4 452,7 8,484 0,7 si
9 459,9 459,1 6,318 0,8 si
10 536,4 535,8 40,22 0,6 si
11 637,5 637,3 62,752 0,2 si

Podemos ver que el error absoluto está por debajo de 1 por lo tanto es razonable que los valores son aceptables ya
que su desviación no es significativa, además los valores de error absoluto se mantienen a un valor de 0,6 en
promedio.

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Tabla 3. Resumen de datos para exactitud, comparación de medidas como criterio error absoluto de longitud de
onda en absorbancia.
Referencia Medida
Pico nm nm Absorbancia Error absoluto Cumple
2 279,3 279,2 0,551 0,1 si
3 287,6 287,6 0,458 0 si
4 333,8 334,1 0,214 0,3 si
5 360,8 359,9 1,029 0,9 si
6 385,8 386,8 0,155 1 si
7 418,5 419,2 0,259 0,7 si
8 453,4 453,5 1,004 0,1 si
9 459,9 458,8 1,156 1,1 no
10 536,4 537,6 0,34 1,2 no
11 637,5 638,8 0,183 1,3 no

Podemos ver que al comparar las posiciones de longitud de onda de referencia y medidas la mayor parte de estos
valores de los picos se encuentran por debajo de 1 de error absoluto, la variación de la posición del pico no es
significativa y la mayoría de las posiciones de longitudes de onda medida corresponden al valor esperado la variación
será mínima en cuanto a las medidas que hagamos al valor esperado.
PRECISION
Se toman dos picos para comparar 360,8nm y 536,4nm de la tabla de referencia de picos característicos usando
celda de holmio figura 3 y se comparan frente a absorbancia y transmitancia experimentales.
Tabla 4. Resumen de datos longitud de onda de 360,8nm criterio de precisión desviación estándar en %transmitancia
y absorbancia.
Referencia Medida Referencia Medida
ID nm nm Transmitancia ID nm nm Absorbancia
PICO 5 360,8 360,20 8,01 PICO 5 360,8 360,20 1,11
PICO 5 360,8 360,30 7,96 PICO 5 360,8 360,20 1,10
PICO 5 360,8 360,20 7,69 PICO 5 360,8 360,20 1,11
PICO 5 360,8 360,10 7,80 PICO 5 360,8 360,30 1,10
PICO 5 360,8 360,20 7,84 PICO 5 360,8 360,10 1,11
promedio 360,20
promedio 360,20
SD 0,07 SD 0,07

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Tabla 5. Resumen de datos longitud de onda de 536,4nm criterio de precisión desviación estándar en Absorbancia
y transmitancia.
Referencia Medida Referencia Medida
ID nm nm Absorbancia ID nm nm %Transmitancia
PICO 10 536,4 535,7 0,397 PICO 10 536,4 535,7 40,05
PICO 10 536,4 535,7 0,398 PICO 10 536,4 535,7 40,06
PICO 10 536,4 535,8 0,397 PICO 10 536,4 535,7 40,01
PICO 10 536,4 535,7 0,397 PICO 10 536,4 535,7 40,02
PICO 10 536,4 535,8 0,398
PICO 10 536,4 535,7 40,01
promedio 535,74
promedio 535,70
SD 0,05 SD 0,00

Observamos las desviaciones estándar de las diferentes tablas obtenidas en comparación con sus referencias que
están por debajo de 0,1 lo que indica que la reproducibilidad es buena o aceptable en las condiciones de medida por
lo tanto las variaciones de medidas repetitivas serán constantes lo que indica una buena precisión.
DETERMINACION DE EXACTITUD Y PRECISION FOTOMETRICA
Se prepara diferentes concentraciones de sulfato de cobre (0.02, 0.04, 0.06, 0.08,0.1, y 0.12)M y se procede a medir
absorbancia a diferentes longitudes de onda (600, 650, 700 y 750)nm y se obtiene la siguiente gráfica.
EXACTITUD FOTOMETRICA
Tabla 6. Resumen de datos a una concentración de sulfato de cobre de 0,08M se lee absorbancias a una longitud
fija de 750nm.
Longitud
equipo Absorbancia Absorbancia Error
nm Referencia Medida Absoluto Cumple
750 0,817 0,8 0,02 si
750 0,817 0,796 0,02 si
750 0,817 0,794 0,02 si
Promedio 0,817 0,797 0,02 si
*Comparación de absorbancias de referencia y medidas criterio de exactitud error absoluto
PRECISION FOTOMETRICA
Tabla 7. Resumen de datos se mide absorbancias a diferentes longitudes de onda para diferentes concentraciones
de sulfato de cobre (M).
Concentración
M λ600nm λ650nm λ700nm λ750nm
0,080 0,043 0,205 0,507 0,800
0,080 0,043 0,206 0,507 0,796
0,080 0,044 0,208 0,509 0,794
0,100 0,051 0,241 0,592 0,937
0,100 0,051 0,240 0,596 0,937

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0,100 0,051 0,242 0,594 0,936

0,120 0,073 0,320 0,778 1,226
0,120 0,074 0,320 0,780 1,230
0,120 0,073 0,321 0,782 1,233
*Los valores debajo de las longitudes de onda de medida corresponden a absorbancias

Figura 4. Curvas a partir de regresión mínimos cuadrados y concentraciones de sulfato de cobre (Cu(SO4)) en 1%
de ácido sulfúrico. (H2SO4).
Tabla 8. Obtención de coeficientes de determinación de sulfato de cobre como criterio de precisión a diferentes
concentraciones de (Cu(SO4)) en 1% de ácido sulfúrico. (H2SO4). Valor de referencia 1.
R2 Valor
1 0,9794
2 0,9796
3 0,9791
Promedio 0,9794
%Error Relativo 2,060
CONCLUSIONES
Los resultados que se obtuvieron respecto a la verificación del equipo de espectroscopia Uv-Vis, muestran que el
equipo se encuentra en condiciones óptimas de trabajo, con un mínimo de error que no altera significativamente los
resultados de medida. Se debe tener en cuenta otras fuentes de ruido y variables que puedan generar un aumento
de estos errores sean instrumentales, perturbativas o experimentales. Las pruebas de exactitud muestran que las
diferentes medidas no se alejan significativamente del valor esperado y en cuanto a las pruebas de precisión indican
una alta reproducibilidad de las medidas realizadas con variaciones mínimas.
Metodología determinación de Pka
Cálculo de la concentración de BTB en la solución de NaOH 0,01M.
Determinación de la concentración de BTB
624,38𝑔 −1
4𝑥10−4 𝑔𝐵𝑇𝐵 ∗ ( ) ∗ (1𝑥10−3 𝐿)−1 = 6,406𝑥10−4 𝑀𝐵𝑇𝐵
𝑚𝑜𝑙

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Posteriormente se calcula la absortividad molar de la muestra para preparar las concentraciones adecuadas.
Cálculo de concentración dilución en 100mL.
Ecuación (1)
1mL ∗ 6,406x10−4 𝑀𝐵𝑇𝐵
= 6,406𝑥10−6 𝑀𝐵𝑇𝐵
100𝑚𝐿

absorbancia 0,24

Determinación concentración stock BTB

Ecuación (2)
[5𝑚𝐿 ∗ (6,406𝑥10−4 𝑀𝐵𝑇𝐵 )]
= 6,406𝑥10−5 𝑀𝐵𝑇𝐵
50𝑚𝐿

Stock BTBbásico 6,406x10-5 M

Construcción de una curva de calibración medio básico

Se adiciona a un balón de 50mL un volumen de 5mL de BTB en una solución de NaOH al 0,01M,
Para garantizar un pH de 13 se usa 5mL de solución de NaOH de 1M y se lleva a volumen final de 50mL.

Determinación de la concentración de [OH-] despejando y reemplazando.

Ecuación (3) 𝑝𝐻 = − log[𝐻 + ] 𝑦 𝑝𝑂𝐻 − = − log[𝑂𝐻 − ]

Resultados y discusión
Tabla 9. Determinación de la concentración final de BTB para construir curva de calibración medio básico.
Volumen Concentración Volumen Concentración pH
Stock Stock (M) final final básico
(mL) Stock (mL) Stock (M)
1 6,41x10-5 20 3,20x10-6 11,7
3 6,41x10 -5 20 9,61x10 -6
12,2
4 6,41x10 -5 20 1,28x10 -5
12,3
5 6,41x10 -5 20 1,60x10 -5
12,5
6 6,41x10 -5 20 1,92x10 -5
12,5
7 6,41x10-5 20 2,24x10-5 12,5
9 6,41x10-5 20 2,88x10-5 12,6

La solución stock BTB básica posee un pH promedio de 12,5 en la parte experimental se mantiene el pH fijo este
varia levemente al llevarlos a 20mL de cada balón, aunque no de forma significativa, pero también debemos tener
en cuenta que cuando se trata de concentraciones muy pequeñas los cambios pueden ser significativos en las
especies en equilibrio del BTB.

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Absorcion BTB en medio básico

1,2
1

Absorbancia
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2 330 380 430 480 530 580 630 680
Longitud de onda λnm

1mL 3mL 4mL 5mL 6mL 7mL 9mL

Figura 5. Curvas de absorbancias obtenidas a partir del corrimiento de un espectro entre 200nm a 800nm en
medio básico para BTB. (coloración azul)

En esta grafica nos interesa los picos máximos asociados con las longitudes de onda de: 380nm y 630nm, asociado
al medio básico respectivamente. Hay una mayor absorción de energía en el medio a longitudes de onda de 630nm,
podemos encontrar el equilibrio desplazado hacia especies desprotonadas del BTB y a un cambio de configuración
electrónica del BTB, sus cromóforos absorben cierta cantidad de energía a longitudes de onda aproximadamente de
380nm se observa un incremento de altura de pico mínimo, debido a su complejidad estructural puede tener varios
grupos cromóforos que al ser una molécula con muchas insaturaciones o conjugada y presenta anillos puede
absorber energía en varias longitudes de onda, pero el más característico será para 630nm medio básico.

Ecuación (4) 𝐻𝐴 + 𝑂𝐻 − ↔ 𝐻2 𝑂 + 𝐴− 𝑒𝑥𝑐𝑒𝑠𝑜 𝑂𝐻 −

Construcción curva de calibración medio ácido

Se usa una solución de HCl 1M para preparar las diferentes diluciones con BTB, se construye la curva de calibración
a partir del Stock BTB acido con una concentración de 6,41x10-5MBTB.

Determinación de la concentración de [H+]

Ecuación (5)
1𝑀𝐻𝐶𝑙 ∗ 5𝑚𝐿
= 0,1𝑀𝐻𝐶𝑙
50𝑚𝐿
Ecuación (6)
𝑝𝐻 = − log[0,1𝑀𝐻𝐶𝑙 ] = 1

Con la concentración de iones hidronio [H+] y los volúmenes usados de BTB podemos calcular los diferentes pH de
las diferentes concentraciones de BTB en medio acido.

Stock BTBácido 6,406x10-5 M

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Tabla 10. Determinación de la concentración de BTB para construir curva de calibración medio ácido y determinación
de pH.
Volumen Concentración Volumen Concentración pH
Stock Stock (M) final final ácido
(mL) Stock (mL) Stock (M)
2 6,41x10-5 20 6,41x10-6 2,19
6 6,41x10 -5 20 1,92x10 -5 1,72
9 6,41x10 -5 20 2,88x10 -5 1,54
12 6,41x10 -5 20 3,84x10 -5 1,41
15 6,41x10-5 20 4,80x10-5 1,32

0,9
Absorción BTB en medio ácido
0,7
Absorbancia

0,5

0,3

0,1

-0,1 250 300 350 400 450 500 550 600

Longitud de onda λnm
2mL 6mL 9mL 12mL 15mL

Figura 6. Curva de absorbancia obtenida a partir del corrimiento de un espectro entre 200nm a 800nm en medio
ácido para BTB. (coloración amarilla)

Podemos ver una máxima absorción en longitudes de onda de 450nm, en este caso debido al ambiente acido y la
alta concentraciones de iones hidronio H+ el equilibrio estará desplazado a especies protonadas de la molécula de
BTB, su configuración electrónica también estará sujeta a este ambiente acido, así como su absorción. Vemos que
por encima de longitudes de onda de 600nm no se evidencia absorción.

Ecuación (7) 𝐻 + + 𝐴− ↔ 𝐻𝐴

Absorbancias encontradas para ambiente básico

Tabla 11. Resumen de datos medición de absorbancias medio básico a dos longitudes de onda.

Stock BTB Concentración Absorbancia Absorbancia

(mL) (M) (615nm) (394nm)
1 3,20x10-6 0,121 0,026
3 9,61x10-6 0,376 0,080
4 1,28x10-5 0,518 0,110
5 1,60x10-5 0,631 0,135
6 1,92x10-5 0,762 0,164
7 2,24x10-5 0,887 0,190
9 2,88x10-5 1,147 0,247

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*λ 615nm absorción ambiente básico

*λ 394nm absorción ambiente básico

1,5
Curva medio básico concentración vs
absorbancia
Absorbancia 1
y = 39895x - 0,0043
R² = 0,9998
0,5 y = 8609,5x - 0,0019
R² = 0,9997

0
0 0,0000050,000010,0000150,000020,0000250,000030,000035

Básico Concentración
616nm M 393nm
Básico

Figura 7. Curva de absorbancia en función de la concentración M de BTB, en medio básico.

Determinación de coeficiente de absortividad

Estos coeficientes representan la pendiente de la curva de la gráfica anterior obtenida mediante regresión por
mínimos cuadrados. Se determinan valores de coeficiente de absortividad de:𝜖616𝑛𝑚 = 𝑚 = 39895 y
𝜖393𝑛𝑚 = 𝑚 = 8610. El análisis estadístico se realiza mediante software Excel y se hace correcciones de curva
según sensibilidad.

Tabla 12. Resumen estadístico del modelo lineal a una longitud de onda de 616nm medio básico (a) y 393nm
medio básico (b).

616nm 393nm
básico Coeficientes Error típico básico Coeficientes Error típico
Intercepto Intercepto
(b) -0,00434674 0,00494749 (b) -0,00188127 0,00144534
Pendiente Pendiente
(m) 39894,733 0,27741081 (m) 8609,52168 0,07520365

Tabla 13. Resumen de datos medición de absorbancias medio ácido a una longitud de onda.
Stock BTB Concentración Absorbancia
(mL) (M) (433nm)
2 6,41x10-6 0,105
6 1,92x10 -5 0,331
9 2,88x10 -5 0,497
12 3,84x10 -5 0,663
15 4,80x10 -5 0,824
*λ 433nm absorción ambiente acido
* No presenta absorbancia por encima de longitudes de onda de 600nm

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Las especies BTB prefieren estar en su forma protonada el equilibrio esta desplazada a su forma sin disociar en
medio acido se ven absorbancias máximas a longitudes de onda 433nm a pH ácidos.

Curva BTB medio ácido (433nm)

1 y = 17290x - 0,0033

Absorbancia
R² = 0,9999
0,5

0
0 0,000010,000020,000030,000040,000050,00006
Concentración M

Figura 8. Coeficiente de absorción determinado a partir de absorbancia en función de concentración M de BTB en

medio ácido a longitudes de onda de 433nm.
Coeficiente de absortividad de 𝜖433𝑛𝑚 = 𝑚 = 17290.
Tabla 14. Resumen estadístico del modelo lineal a una longitud de onda de 393nm. Medio ácido

433nm Error
acido Coeficientes típico
Intercepto
(b) -0,00329947 0,00312092
Pendiente
(m) 17290,4086 98,4211207

Preparación de las muestras de BTB a pH: 6.7, 6.9, 7.1, 7.3

Se toma 10mL de BTB y se lleva a volumen final de 20mL, el pH se ajusta a los valores de pH (6.7, 6.9, 7.1, 7.3), se
usa la ecuación de Henderson Hasselbach y finalmente ajustando con un pHmetro usando HCl o NaOH muy diluidos.
Tabla 15. Resumen de datos preparación soluciones ajustadas a pH definidos anteriormente.
Solución pH Volumen Stock Volumen final
Ajustado BTB (mL) (mL)
1 6,7 10 20
2 6,9 10 20
3 7,1 10 20
4 7,3 10 20

Para preparar la solución buffer se emplea fosfato monobásico y fosfato dibásico, pKa del fosfato 7,2. Los
compuestos usados para la preparación del buffer a pH (6.7, 6.9, 7.1, 7.3) ajustable.
Reactivos
KH2PO4 [HA] y K2HPO4 [A-]

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Se debe reemplazar el valor de pH el cual queremos alcanzar en la ecuación de Henderson Hasselbach, teniendo
en cuenta el volumen al cual se va a llevar la solución y la cantidad de fosfato necesaria. Volumen final de 10mL.
Usando esta ecuación, reemplazando la concentración deseada se puede construir el buffer de interés, se debe
tener en cuenta pKa y la concentración a preparar. Iguales concentraciones da un log(1)= 0, entonces pKa=pH, que
en este caso será de 7,2 se puede ajustar el pH agregando HCl para medio acido y NaOH para medio básico usando
un pHmetro o ajustarlo según las concentraciones correspondientes de HA o A -.
Método de aditividad
Teniendo en cuenta que en la mezcla se debe cumplir que la absorbancia resultante será una combinación lineal de
𝜖𝑖 𝑏𝑖 𝑐𝑖 tenemos la ecuación de la mezcla.
Ecuación (8) 𝐴𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = (𝜖𝑏𝑐)𝑎𝑐𝑖𝑑𝑜433𝑛𝑚 + (𝜖𝑏𝑐)𝑏á𝑠𝑖𝑐𝑜 616𝑛𝑚 + (𝜖𝑏𝑐)𝑏𝑎𝑠𝑖𝑐𝑜393𝑛𝑚
A partir de los modelos lineales y las curvas obtenidas por regresión de mínimos cuadrados se obtienen los
coeficientes de absortividad que son las pendientes de estas rectas, la absortividad molar (ϵ), calculadas a partir de
las pendientes de las diferentes curvas en medio ácido o básico, se graficaron usando concentración Molar (M) y
milimolar (mM) , se obtienen los siguientes resultados de las pendientes (m).
Tabla 16. Resumen de datos obtención de coeficientes de absortividad en medio ácido y básico representados en
mM.
Coeficiente de absortividad Valor Concentración
ε616 básico 40,0 mM
ε393 básico 8,6 mM
ε433 ácido 17,3 mM

Curva de absorbancia en funcion de longitud de

onda λnm
Absorbancia

0,4

-0,1 360 460 560 660

Longitud de onda(nm)
6,7 6,9 7,1 7,3 1 13

Figura 9. Gráfica de absorbancia en función de longitud de onda en un rango de 200nm a 800nm a pH 1 , 13, 6.7,
6.9, 7.1 y 7.3.
Podemos ver en esta gráfica que hay absorbancias mayores a pH básicos asociados a BTB desprotonados y menor
absorbancia a pH ácidos especies protonadas. Podemos ver un punto donde se cruzan o interceptan todas las
curvas denominado punto isosbéstico en este punto hay un equilibrio donde las especies desprotonadas será igual
a las protonadas en ese equilibrio vamos a observar un color verde de la suma de la coloración amarillo medio ácido
y azul medio básico como resultado hay una mezcla de especies con diferente coloración esto ocasiona que veamos
la mezcla de los dos colores que será verde. El rango de mayor solapamiento que voy a tomar será de 450nm a
550nm,

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Tabla 17. Resumen de datos obtención de absorbancia en medio ácido y básico, en un rango de valores de 450nm
a 550nm, rango de mayor solapamiento en el punto isosbéstico.
pH 6,7 6,9 7,1 7,3 1 13
λnm Am1 Am2 Am3 Am4 Astdx Astdy
550,014 0,056 0,087 0,127 0,165 0,016 0,328
450,941 0,207 0,224 0,174 0,156 0,305 0,036
*x: HA
*y: A-
*Ami Absorbancia de cada una de las mezclas
*Astdx Absorbancia estándar x (acida)
*Astdy Absorbancia estándar y (básica)

Tabla 18. Resumen de datos, gráfica a partir de la tabla anterior en el rango de longitud de onda desde 550nm hasta
450nm.
pH 6,7 6,9 7,1 7,3
Astdy/Astdx Am1/Astdx Am2/Astdx Am3/Astdx Am4/Astdx
0,145 0,681 0,738 0,576 0,522
0,118 0,678 0,734 0,568 0,509
*solo se muestra dos puntos, pero el rango va desde 550nm a 450nm abarca muchos números.
En la determinación de pendientes a partir de la siguiente ecuación: 𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 donde m es la pendiente y b el
intercepto análogamente se aplica la siguiente ecuación.
𝐴𝑚𝑖 [𝑦]𝑚 𝐴𝑠𝑡𝑑𝑦 [𝑥]𝑚
Ecuación (9) = [𝑦]𝑠𝑡𝑑 ∗ 𝐴𝑠𝑡𝑑𝑥 + [𝑥]𝑠𝑡𝑑
𝐴𝑠𝑡𝑑𝑥
[𝑦]𝑚
Ecuación (10) 𝑚 = 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = [𝑦]𝑠𝑡𝑑
[𝑥]𝑚
Ecuación (11) 𝑏 = 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜 = [𝑥]𝑠𝑡𝑑
A partir de los valores de la pendiente y el intercepto se puede despejar los valores de [y]std y [x]std reemplazando
los valores encontrados.
*x: HA
*y: A-
*Ami Absorbancia de cada una de las mezclas
*Astdx Absorbancia estándar x (acida)
*Astdy Absorbancia estándar y (básica)

Tabla 19. Resumen de datos, pendientes e intercepto obtenidos a partir de las regresiones lineales en el rango de
longitud de onda desde 550nm hasta 450nm.
pH 6,7 6,9 7,1 7,3
m 0,139 0,231 0,362 0,481
b 0,661 0,705 0,525 0,453
[y]std 1,92x10-5
[x]std 1,92x10-5

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*[y]std concentración de la especie HA (acida)

*[x]std Concentración de la especie A- (básico)

Tabla 20. Resumen de datos, concentración de la especie acida[x] y básica [y], y la concentración de [H+] en la
determinación del pKa para un rango de longitud de onda de 450nm hasta 550nm.
pH 6,7 6,9 7,1 7,3
[y] 2,68X10 -6 4,44X10 -6 6,95X10 -6 9,24X10-6
[x] 1,27X10-5 1,36X10-5 1,01X10-5 8,70X10-6
[H+] 2,00X10-7 1,26X10-7 7,94X10-8 5,01X10-8
Ka 9,47X10 -7 3,84X10-7 1,15X10-7 4,72X10-8
pKa 6,02 6,42 6,94 7,33
Error % 15,16 9,64 2,28 3,18

Se determina pKa de 6,94 es el mejor valor y se ajusta con un mínimo error relativo del 2,28% medición comparada
con la reportada en literatura pKa de 7,1 asociada a la solución ajustada a un pH de 7,1.

Conclusiones
Se determinó el pKa del indicador comercial azul de bromotimol (BTB) con un valor de 6,94 con un error relativo
según valores reportados en la literatura del 2,28% lo cual es aceptable y cercano al esperado, teniendo en cuenta
que la propagación de error por las diferentes diluciones y medidas se evidencia que son mínimas. Las
concentraciones de las especies de BTB en medio ácido presento color amarillo debido a su absorción característica
a cierta longitud de onda donde predomina BTB protonada HA y en solución básica presento un color azul debido al
equilibrio se desplaza hacia especies desprotonadas, la configuración electrónica molecular de BTB se ven alteradas
y por ende su forma de absorber energía a la longitud de onda según el medio. En la determinación del pKa se
encontró el punto isosbestico donde las concentraciones de las especies en medio ácido y básico se igualan a
1,92x10-5 M donde pH = pKa, la concentración de las dos especies en este punto de equilibrio dan un color verde
debido a la combinación por absorción a diferentes longitudes de onda además el color de emisión es
complementario al de absorción eso significa que si vemos el color amarillo la molécula de BTB en medio ácido
absorbe a menores longitudes de onda hacia el azul de mayor energía caso contrario si vemos el color azul de la
molécula BTB en medio básico. “La teoría campo ligando y orbital molecular explica que según el tipo de ligando
que interacciona con las moléculas y la configuración electrónica en los orbitales moleculares enlazantes y
antienlzantes, si son de naturaleza donor π o aceptor π van a influenciar en el desdoblamiento energético y por ende
su absorción energética” [5].

Referencias
[1] Amador-Hernández, J., Rojas-Hernández, A. Madaí, E., De La Garza-Rodríguez, M., Velázquez-Manzanares, M. and Medina-Vallejo,
L.F. (2014) New Chemometric Strategies in the Spectrophotometric Determination of pKa. European Journal of Chemistry, 5, 1-5.
http://dx.doi.org/10.5155/eurjchem.5.1.1-5.901
[2] Harris, Daniel. 1991. Quantitative ChemicalAnalysis. 5ta Edicion. Freeman. USA. RubinsonK., Rubinson J. 2001. Análisis
Instrumental.Pearson Educación, S.A. Madrid, págs : 434
[3] Skoog y Holler. (2001) Principios de Análisis Instrumental. McGraw-Hill Interamericana de España, S.A.U. Madrid, España. Capitulo 14.
Página 369 – 370.
[4] Alejandro Beaza. (1998). Espectrometría de luz UV/VIS y Equilibrio químico: Punto Isosbestico. Universidad Nacional de Mexico.
Facultad de Química.
[5] Bra. Fanny Sofía Martínez Osorio.Bra. Irania de los Angeles Pérez Espinoza, Calibración de un Espectrofotómetro UV-Visible y
Evaluación de la Incertidumbre”, UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DENICARAGUA (UNAN-LEÓN), León, Nicaragua, Noviembre
2009.

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