Dossier Pneumoslide ES. (2017, octubre). KUPDF.

Recuperado 28 de marzo de 2023, de

https://kupdf.net/download/dossier-pneumoslide-es-

25072012_59dd797a08bbc5a802e65a84_pdf

PNEUMOSLIDE. (s. f.). VIRCELL MICROBIOLOGISTS. Recuperado 24 de marzo de

2023, de https://www.vircell.com/producto/pneumoslide/

NSLIDEM: Kit de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para determinación

simultánea en suero humano de anticuerpos IgM frente a los principales agentes
etiológicos de procesos infecciosos del tracto respiratorio: Legionella pneumophila
serogrupo 1, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Chlamydophila
pneumoniae, adenovirus, virus sincitial respiratorio, influenza A, influenza B y
parainfluenza serotipos 1, 2 y 3.
INTRODUCCIÓN:
Las etiologías de la neumonía atípica son numerosas, pero los microorganismos
que dan lugar a este síndrome con más frecuencia son:
Legionella pneumophila
Legionella pneumophila de la cual el serogrupo 1 es responsable de la mayoría de
las infecciones en humanos, causa neumonía atípica, a menudo con
manifestaciones sistémicas, se presenta mediante la inhalación de la bacteria en
aerosoles de personas infectadas o a partir del medio ambiente, ya que la bacteria
puede crecer en ambientes acuaticos. Es responsable del 10% de los casos de
neumonía. En el diagnóstico serológico de la enfermedad, la técnica de referencia
es la IFI.
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae produce neumonía atípica primaria principalmente en
niños y adolescentes, y que se adquiere por inhalación de la bacteria a partir de
portadores asintomáticos o pacientes convalecientes. Causando fiebre, cefalea,
tos seca o con esputo escaso. La IFI presenta como inconveniente la difícil fijación
de los microorganismos al portaobjetos, problema que se solventa fijando
previamente M. pneumoniae a células.
Coxiella burnetii
La fiebre Q, causada por Coxiella burnetii, es una enfermedad sistémica que
puede producir neumonía atípica, síndrome febril, hepatitis o endocarditis. El test
de IFI es el más sensible y el más indicado para el diagnóstico serológico.
Chlamydophila pneumoniae
Chlamydophila pneumoniae tiene gran capacidad para producir infección
respiratoria, especialmente bronquitis y neumonía, con un periodo de incubación
de promedio de 1 mes. La mayor incidencia se presenta en personas mayores y
se la considera responsable de un 10% de todas las neumonías. La
microinmunofluorescencia es el método más sensible y específico para el
diagnóstico.
Adenovirus
Adenovirus es un patógeno importante del tracto respiratorio que produce cuadros
respiratorios de vías altas, fiebre faringoconjuntival e infecciones respiratorias
bajas.
Virus sincitial respiratorio
El virus sincitial respiratorio (VSR) es el principal agente etiológico de infecciones
del tracto respiratorio en niños menores de 2 años, causando bronquiolitis,
neumonía y bronquitis y que además participa en la exacerbación del asma, da
lugar en invierno a importantes brotes epidémicos en población lactante.
Influenzavirus
Es el agente etiológico de la gripe y puede presentar complicaciones graves en
pacientes con patología de base. En época epidémica el diagnóstico clínico es
difícil, debido a otras enfermedades respiratorias que pueden confundirse y el
diagnóstico serológico es especialmente útil.
Parainfluenza
Parainfluenza 1, 2 y 3 son agentes causales de laringotraqueobronquitis (crup) en
niños de 2-4 años. El serotipo 3 presenta un patrón epidémico y los serotipos 1 y 2
un patrón endémico.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
El método de inmunofluorescencia indirecta está basado en la reacción de los
anticuerpos de la muestra con el antígeno unido a la superficie del portaobjetos.
Los anticuerpos específicos presentes en la muestra reaccionan con el antígeno, y
las inmunoglobulinas no unidas por reacción con el antígeno son eliminadas en el
proceso de lavado. En un paso posterior el complejo antígeno-anticuerpo es
revelado mediante globulina antihumana marcada con fluoresceína, resultando
visible mediante microscopio de fluorescencia.
CONTENIDO DEL KIT:
1 VIRCELL PNEUMOSLIDE SLIDE: 10 portaobjetos de 10 pocillos con los
siguientes antígenos:
1. L. pneumophila serogrupo 1, suspendida en saco vitelino (yolk sac) al 0,5%
para mejorar la adhesión del antígeno y para impedir la agregación de las
bacterias.
2. M. pneumoniae en células McCoy.
3. C. burnetii en fase II, suspendida en saco vitelino (yolk sac) al 0,5% para
mejorar la adhesión del antígeno y para impedir la agregación de las bacterias.
4. C. pneumoniae, cuerpos elementales.
5. Adenovirus en células HEp-2.
6. Virus sincitial respiratorio en células HEp-2.
7. Influenza A en células LLC-MK2.
8. Influenza B en células LLC-MK2.
9. Parainfluenza serotipos 1, 2 y 3 en células LLC-MK2.
10. Control de células.
Todos los antígenos que incluye el portaobjetos son obtenidos en cultivo celular, a
excepción de L. pneumophila. Cada pocillo viral contiene entre un 1-15% de
células infectadas e inactivadas con formaldehído, y células no infectadas fijadas
con acetona.
TOMA DE MUESTRA:
La sangre debe extraerse en condiciones asépticas mediante técnicas de
venipuntura por personal experimentado. Se recomienda el uso de técnicas
estériles o asépticas para evitar la contaminación de la muestra. Los sueros deben
mantenerse refrigerados entre 2 y 8ºC si se van a procesar dentro de los 7 días
siguientes a la toma. Si el procesamiento se va a prolongar deben congelarse a -
20ºC, evitando las congelaciones y descongelaciones innecesarias ya que estas
podrían provocar una disminución del título de las inmunoglobulinas,
especialmente de IgM. No utilizar sueros hiperlipémicos o contaminados. Los
sueros que presenten partículas pueden ser clarificados por centrifugación.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:
1.-Dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente. Permita que los
portaobjetos alcancen la temperatura ambiente antes de abrirlos.
2.-Realizar una dilución 1/2 de los sueros, para ello poner 25 μl de suero en 25 μl
de PBS 2. Los sueros control 3 y 4 no deben ser diluidos.
3.-Tratar los sueros diluidos con el sorbente de IgG 7, poniendo 30 μl de los
sueros a 150 μl de sorbente y agitar vigorosamente. Los sueros control 3 y 4 no
deben ser tratados con sorbente. Los sueros tratados se deben centrifugar para
aclarar el precipitado del suero, el cual interfiere con la prueba.
4.-Poner 15 μl de suero tratado en cada pocillo del portaobjetos 1. Añadir 15 μl de
control positivo 3 sin diluir ni tratar a cada uno de los pocillos de un portaobjetos y
15 μl de control negativo 4 sin diluir ni tratar a cada uno de los pocillos de otro
portaobjetos.
5.-Incubar en cámara húmeda durante 90 minutos a 37ºC.
6.-Enjuagar brevemente el portaobjetos 1 con PBS 2 (evitar verter directamente el
PBS sobre los pocillos). Sumergir el portaobjetos en PBS mientras se agita
suavemente en un agitador, durante 10 minutos. Dar un ligero lavado con agua
destilada.
7.-Dejar que los portaobjetos 1 se sequen.
8.-Añadir 15 μl de solución de anti-IgM humana 5M en cada pocillo. (No requiere
dilución).
9.-Incubar en cámara húmeda durante 30 minutos a 37ºC.
10.-Repetir los pasos 6 y 7.
11.-Añadir una pequeña gota de medio de montaje 6 a cada pocillo y poner el
cubreobjetos.
12.-Examinar en microscopio de fluorescencia a 400x lo más rápidamente posible.
De no ser así, mantener a 2-8ºC en oscuridad durante un máximo de 24 horas,
hasta la observación.
PROTOCOLO DE VALIDACIÓN POR EL USUARIO:
En cada ensayo se deben incluir control positivo y negativo. Su utilización permite
la validación de la prueba y el equipo. El patrón de fluorescencia que debe
observarse será:
Control positivo: Fluorescencia color verde manzana en la totalidad de las
bacterias en los casos de Legionella, Chlamydophila o Coxiella; fluorescencia
verde manzana en la periferia celular en los controles positivos a Mycoplasma;
fluorescencia verde manzana nuclear, citoplasmática y/o periférica en un 1-15%
de las células en los controles positivos a adenovirus, influenza, VSR o
parainfluenza, (el patrón periférico es el más frecuente en sueros débiles; en
parainfluenza y VSR es posible observar sincitios teñidos junto al patrón anterior).
Control negativo: Ausencia de fluorescencia para Legionella, Chlamydophila y
Coxiella y patrón celular rojo para Mycoplasma, adenovirus, influenza A y B, VSR
y parainfluenza.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Una reacción positiva será aquella en la que se observe fluorescencia color verde
manzana en la totalidad de las bacterias en los casos de Legionella,
Chlamydophila o Coxiella; fluorescencia verde manzana en la periferia celular en
los sueros positivos a Mycoplasma; fluorescencia verde manzana nuclear,
citoplasmática y/o periférica en un 1-15% de las células en los sueros positivos a
adenovirus, influenza, VSR o parainfluenza, (el patrón periférico es el más
frecuente en sueros débiles; en parainfluenza y VSR es posible observar sincitios
teñidos junto al patrón anterior).
Una reacción negativa será aquella en la que se observe ausencia de
fluorescencia para Legionella, Chlamydophila y Coxiella y un patrón celular rojo
para Mycoplasma, adenovirus, influenza A y B, VSR y parainfluenza.
La aparición de fluorescencia en la totalidad de las células o en el pocillo 10
implica la presencia de anticuerpos antinucleares o anticelulares y el resultado no
puede ser valorado como positivo, debiéndose aplicar una técnica alternativa. Se
debe confirmar en todos los casos la ausencia de fluorescencia en el pocillo de
células control. Ante un resultado IgM positivo a Legionella es importante
considerar el resultado de la determinación IgG y la sintomatología ya que se han
descrito reacciones cruzadas a otros microorganismos y no existe gran
experiencia en evaluaciones de anticuerpos tipo IgM. Por estas causas
recomendamos que los sueros IgM positivos a 1/12 sean titulados de 1/12 a 1/192,
y sólo títulos mayores o iguales a 1/96 sean considerados como significativos.
Patrones de fluorescencia diferentes a los definidos en el protocolo de validación
no deben ser interpretados como positivos.
PNEUMOSLIDE IgG es más adecuado como test de screening. En enfermedades
con alta prevalencia es posible encontrar varios resultados positivos en una misma
muestra. PNEUMOSLIDE IgM es una técnica muy adecuada debido a su alta
especificidad ya que es positiva no más de tres meses, pero puede mostrar baja
sensibilidad en reinfecciones. El uso simultaneo de PNEUMOSLIDE IgG e IgM es
el ideal para el diagnóstico de infección reciente: PNEUMOSLIDE IgM en la
primera muestra de adultos y en la primera y segunda muestra de niños y
PNEUMOSLIDE IgG en la segunda muestra de adultos.
Los anticuerpos IgG e IgM se comportan de diferente manera durante las
primoinfecciones y las reinfecciones. En una primoinfección las IgG e IgM
aparecen en casi todos los casos (la IgM aparece antes que la IgG). En una
reinfección no aparecen anticuerpos de tipo IgM en todos los casos, siendo la
detección de IgG el único modo de realizar el diagnóstico. En muchas
enfermedades pueden existir títulos altos de IgG durante toda la vida del paciente,
mientras que la IgM, en general, sólo se mantiene en suero durante 2 o 3 meses
después de la enfermedad, y por tanto son un marcador efectivo de infección
reciente.