Desarrollo y Evaluación de Un Producto Bioestimulante

PROYECTO FONDEF DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
INFORME FINAL
TITULO DEL PROYECTO: DESARROLLO Y EVALUACIóN DE UN PRODUCTO BIOESTIMULANTE EN

BASE A COMPUESTOS NATURALES QUE POTENCIEN L A RESPUESTA INMUNOLóGICA DE LA
ABEJA APIS MELLIFERA PARA EL CONTROL DE NOSEMA CERANAE.
CÓDIGO DEL PROYECTO: CA13I10140
FECHA DE EMISION: 29/01/2016
FIRMA DEL (DE LA) DIRECTOR(A) DEL PROYECTO

XIMENA ANDREA ARANEDA DURAN
I. Acta De Término Del Proyecto
1.1 Identificación del proyecto

DESARROLLO Y EVALUACIóN DE UN PRODUCTO BIOESTIMULANTE
EN BASE A COMPUESTOS NATURALES QUE POTENCIEN L A
TITULO DEL PROYECTO
RESPUESTA INMUNOLóGICA DE LA ABEJA APIS MELLIFERA PARA EL
CONTROL DE NOSEMA CERANAE.
CÓDIGO FONDEF CA13I10140
DIRECTOR(A) DEL
XIMENA ANDREA ARANEDA DURAN
PROYECTO
INSTITUCIÓN(ES)
UNIVERSIDAD CATOLICA DE TEMUCO
BENEFICIARIA(S)
EMPRESA Y OTRAS
AGROCOMERCIAL RIOVERDE
ENTIDADES ASOCIADAS
1.2 Ejecución del proyecto
FECHA DE TOMA DE RAZON
POR LA CONTRALORÍA 05/12/2013
GENERAL DE LA REPÚBLICA
DURACIÓN CONTRACTUAL 24
FECHA EFECTIVA DE INICIO 05/12/2013
FECHA EFECTIVA DE
04/12/2015
TÉRMINO
DURACIÓN EFECTIVA 24
1.3 Plan de Continuidad
Nombre Institución Beneficiaria Nombre Representante Legal Firma
UNIVERSIDAD CATOLICA DE ALIRO SAMUEL BORQUEZ
Firma Electrónica
TEMUCO RAMIREZ
1.4 Tabla de Conformidad
Nombre Institución Empresa u Otra
Nombre Representante Legal Documento conformidad
Entidad Socia
AGROCOMERCIAL RIOVERDE Si
II. Informe Ejecutivo
2.1 Resumen Ejecutivo
Versión en Castellano
La investigación fue centrada en evaluar la respuesta inmune de la abeja Apis mellifera afectada con el
patógeno Nosema ceranae bajo condiciones de tratamientos con compuestos naturales con actividad
biológica. Como solución se evaluaron compuestos naturales donde fueron seleccionados dos extractos
acuosos y posteriormente fue formulado un prototipo que puede ser utilizado a través de un jarabe
azucarado de normal uso en alimentación apícola. Los beneficios son contar con la alternativa de un
producto inocuo que contribuya a mejorar los parámetros inmunológicos de la abeja y que esto permita una
producción de miel libre de residuos químicos que ponen en peligro el mercado apícola El producto
formulado esta en procesos de patentamiento en función de su composición y características. Entre los
atributos del producto se encuentran poseer una baja humedad al ser liofilizado lo cual es ventajoso pues es
estable y de fácil transporte. El producto fue evaluado midiendo longevidad de las abejas tratadas junto con
variables inmunológicas de expresión génica enzimáticas y de péptidos antimicrobianos siendo positiva su
respuesta al comparar con abejas enfermas por Nosema ceranae.
Versión en Ingles
The object of the research was to assess the immune response of bees (Apis mellifera) affected with the
pathogen Nosema ceranae when treated with natural compounds which present biological activity. Natural
compounds were assessed in solution. Two aqueous extracts were selected and subsequently a prototype
was formulated which could be administered in a sugar syrup normally used for feeding bees. These
innocuous products are beneficial because they help to improve the bees' immunological parameters, while
the honey produced is free of chemical residua which would be a threat to the apiculture products market.
The product formulated is currently being patented on the basis of its composition and characteristics. One of
its advantages is that it has low humidity when lyophilised, making it stable and easy to transport. The
product was assessed by measuring the longevity of the treated bees and the immunological variables of
enzymatic gene expression and anti-microbial peptides. The response was found to be positive when
compared to sick bees infected with Nosema ceranae.
2.2 Cuadro De Sintesis de Resultados y Objetivos
Objetivos Generales
Nombre Objetivo OBJETIVO GENERAL
Evaluar el estado inmunológico de la abeja Apis mellifera frente al estimulo
de productos naturales como mecanismo para enfrentar el patógeno
Descripción
Nosema ceranae para obtener un prototipo de suplemento alimenticio
funcional.
Objetivos Específicos
Nombre Objetivo OBJETIVO ESPECIFICO 1
Consiste en definir cuáles serán las moléculas con actividad biológica
Descripción
usadas como potenciales estimulantes del sistema inmune de la abeja
Serán evaluadas todas aquellas moléculas o sustancias activas en una
Descripción dieta de abejas adultas. Se mediran diversos parámetros de inmunidad
individual y social del insecto
Se pretende formular un producto a nivel de prototipo que pueda ser
Descripción suministrado a las abejas y genera un efecto potenciador del sistema
inmune
RESULTADO
Tipo Resultado de Producción
Nombre alimento bioestimulante a nivel de prototipo
Descripción Corresponde a un producto liofilizado en forma de polvo seco grisáceo soluble en
solución de azúcar. El producto es un bioestimulante de la abeja que contiene
sustancias naturales para mejorar su sistema inmunológico frente a problemas
sanitarios como Nosema ceranae. Actualmente para enfrentar este patógeno se
utiliza un antibiótico llamado fumagilina el cual está prohibido en el mercado
europeo cuando se encuentra presente en mieles. Los beneficios son contar con
la alternativa de un producto inocuo que contribuya a mejorar los parámetros
inmunológicos de la abeja y que esto permita una producción de miel libre de
residuos químicos que ponen en peligro el mercado apícola.
En el proyecto se evaluaron 8 aceites esenciales y 7 extractos acuosos de

plantas a nivel de laboratorio. De estos se hizo una preselección donde
finalmente se seleccionaron 2 extractos para la elaboración de un prototipo
bioestimulante. Para la elaboración del producto se optó por la alternativa de un
liofilizado, ya que permite una conservación estable y se facilita la aplicación en
los tratamientos, dado que se diluye fácilmente en agua. Estos extractos fueron
seleccionados por sus resultados inmunológicos de expresión génica, actividad
Descripción del Logro
enzimática, recuento de hemocitos y mediciones de longevidad de las abejas. En
los ensayos de expresión génica (polifenoloxidasa, glucosa oxidasa y péptidos
antimicrobianos) se pudo observar que el producto bioestimulante aumentó los
niveles de expresión génica con respecto a las abejas sanas y/o enfermas sin el
bioestimulante, lo que resultó interesante, ya que al estar las abejas enfermas
(ataque de patógeno Nosema ceranae u otro), estos parámetros inmunológicos
se ven fuertemente suprimidos.
Referencia Bibliográfica
RESULTADO
Tipo Resultado de Producción Científica (Ex "Otros")
Nombre Presentacion de Poster XI Congreso Latinoamericano de Apicultura
Descripción Presentación de Poster XI Congreso Latinoamericano de Apicultura, FILAPI-2014
El titulo del trabajo es: Efecto de dos aceites esenciales sobre el desarrollo de
Nosema ceranae en abejas Apis mellifera bajo condiciones de laboratorio. Este
trabajo fue presentado al XI congreso Latinoamericano de Apicultura 2014
FILAPI en Puerto Iguazú, Argentina el día 5 de septiembre de 2014. en formato
Descripción del Logro Poster. Los resultados apuntan a verificar el efecto de 2 aceites esenciales en
función de la cantidad de esporas de Nosena que disminuyen cuando se aplican
los tratamiento. Se observó una disminución en la cantidad de esporas por
abejas en los tratamientos de aceite al final de la evaluación, se uso aceite de
hinojo y poleo.
Araneda, X., Morales, D., Martínez, M., Neira, M., Cuevas, A., y Flores, R. 2014.
Efecto de dos aceites esenciales sobre el desarrollo de Nosema ceranae en
Referencia Bibliográfica abejas (Apis mellifera) bajo condiciones de laboratorio. In XI Congreso
Latinoamericano de Apicultura 2014. 03 al 06 de septiembre de 2014. Puerto
Iguazú, Misiones, Argentina. p. 132-133.
RESULTADO DE PRODUCCIóN
Categoría Cantidad Comprometida Cantidad Lograda
Producto 1 1
RESULTADO DE PRODUCCIóN CIENTíFICA (EX "OTROS")

Categoría Cantidad Comprometida Cantidad Lograda
Evento 1 1
2.3 Informe financiero a la fecha de término
Montos
Gastos
Comprometidos
Monto Girado financiados por
según Convenio %
por Fondef fuente de
por fuente de
financiamiento
financiamiento
79,07
FONDEF 108.769.000 108.769.000 105.464.691
%
Institución(es) Beneficiaria(s)
20,93
UNIVERSIDAD CATOLICA DE TEMUCO 30.981.000 No Aplica 27.922.780
%
Empresas y otras Entidades Asociadas 0 No Aplica 0%
Totales 139.750.000 108.769.000 133.387.471 100 %
Monto por Reintegrar 3.304.309

Monto Reintegrado a FONDEF (0)
Costo Final del Proyecto 133.387.471
2.4 Autoevaluación de la Ejecución del Proyecto
El(la) Representante Institucional de cada Institución Beneficiara

El desarrollo logrado por el Proyecto CA13I10140 denominado “Desarrollo y evaluación de un producto
bioestimulante en base a compuestos naturales que potencien la respuesta inmunológica de la abeja Apis
mellifera, para el control de Nosema ceranae. El producto desarrollado ha demostrado una efectiva
respuesta al patógeno Nosema ceranae bajo condiciones de tratamientos con compuestos naturales con
actividad biológica. El proyecto ha permitido obtener una innovación de productos a nivel de desarrollo de un
prototipo bioestimulante con propiedades inmunológicas con el conocimiento de la composición nutricional y
funcional de los compuestos naturales que lo constituyen. El proyecto contribuirá con nuevas informaciones
y conocimientos en ciencia básica y aplicada que vendrán en benéfico del rubro apícola nacional e
internacional, contribuyendo al desarrollo de una apicultura más inocua, sustentable y competitiva. En este
contexto, el desarrollo del proyecto contribuirá con nueva información y conocimiento relacionado con el
control del patógeno en función de la condición inmunológica de la abeja y aportará a una línea de
investigación emergente en A. mellifera, nutrición apícola e inmunología. Uno de los elementos más
destacables en el desarrollo del proyecto, a nivel Institucional, ha sido la posibilidad de constituir líneas con
potencial de desarrollo en torno a la apicultura lo que se ve reflejado en la generación de sinergias entre
investigadores de ámbitos disciplinares que se articulan en torno a una oportunidad de aplicación viable y
que permite mejorar la productividad de la apicultura por medio de un producto con alto nivel de innovación.
Desde el punto de vista de la organización e integración con las entidades interesadas , la gestión y el
trabajo efectivo y cercano del Director de Proyecto, Dra. Ximena Araneda y su equipo de trabajo, han
permitido generar sinergias positivas con diferentes stakeholders vinculados a la temática desarrollada que
se compone de pequeños productores, instituciones gremiales como Apinovena y laboratorios
farmacéuticos, lo que se proyecta en un trabajo de largo aliento que permitirá impactar en el desarrollo de la
actividad productiva a nivel regional y nacional. La institución, hace evidente la calidad del proyecto, de sus
resultados, del equipo de trabajo y en especial de su Director, tanto en el desarrollo técnico como en las
proyecciones e impactos generados a partir de los desarrollos del mismo.
El(la) Director(a) del proyecto

El impacto económico y social a partir del producto a formular es consistente con la propuesta y el escenario
actual sobre la necesidad de buscar nuevas alternativas sustentables en el control de patologías y
amenazas sanitarias que afectan la inmunidad de la abeja melífera. La ejecución del proyecto fondef abren
nuevas líneas de investigación como estudios de nutrición, sanidad, genética apícola asociada a la
inmunidad, así como estudios de patógenos, enfermedades, químicos y factores ambientales que están
afectado la condición del insecto. Todo esto mediante la investigación aplicada y el uso de herramientas
moleculares que permiten evaluar diversas variables desde la expresión génica hasta el comportamiento a
fin de definir los mejores manejos técnicos y productivos que lleven a una mejor potenciación de la
producción apícola. A partir de esta iniciativa también se abren nuevas alternativas para la entrega de
servicios como identificación del patógenos mediante técnicas moleculares, análisis o medición de la
condición inmunológica de la abeja, correlación de la condición inmune y patologías presentes, etc.
2.5 Propuesta de Continuidad de la(s) Institucion(es) Beneficiaria(s)
Para la continuidad de desarrollo de esta línea de investigación que permita una consolidación a corto plazo
y que facilite proyectarla en un horizonte temporal más amplio, es en primer término una comprensión por
parte de la institución que este ámbito de investigación aplicado en torno a la actividad productiva apícola es
un sector clave para la región y el país no sólo por el número de productores vinculados a ella, sino también
por las brechas de productividad que se detectan, la necesidad de generación de conocimiento que sea
transferible a los productores y por el conjunto de externalidades positivas que genera la actividad por su
relación con otros sectores convergentes como es la fruticultura y agricultura. Para la materialización de
esto, hoy la institución puede perfilar un conjunto de capital humano avanzado miembro del equipo de
investigación y profesionales que se ha incoporado y le dan sustentabilidad a esta línea de investigación,
como también la mantención de equipamiento e infraestructura para el trabajo científico que permita seguir
arrojando información tanto de está problemática particular que afecta a la apicultura como de otras áreas de
interés investigativo que faciliten la generación de valor para esta actividad económica. Esto a su vez es
potenciado por una vinculación con el medio público y privado ligado a esta actividad que facilita la
identificación de problemas que necesitan la generación de respuestas científicas con alto valor innovativo y
permita el mejoramiento de la productividad del sector. Agregar que con las capacidades instaladas tanto a
nivel humano, tecnológico como de infraestructura permite la institución de proveer de profesionales
formados en esta línea de investigación a la región y el país puesto que se ha desarrollado un interés por
ella en alumnos de pregrado. Como se ha mencionado anteriormente, el equipamiento adquirido y la
infraestructura asociada al proyecto permitirán dar continuidad a esta y otras líneas de investigación anexas,
las que se cincuncriben administrativamente a la Facultad de Recursos Naturales, ámbito institucional de
mayor productividad científica. En este sentido se espera en el horizonte temporal 2016 – 2018 darle uso y
aumentar su capacidad de generación de información cientifica tanto a nivel de ciencia basica como
aplicada. A partir de la postulación en el año 2016 que de continuidad a esta iniciativa al concurso Fondef
Tecnológico, lo que se sustenta en los resultados científicos y de propiedad intelectual obtenido por el
equipo de investigación. Por su parte se espera poder disminuir brechas de información hacia los
productores en torno al patógeno nosema cerenae por medio de la generación de bienes publicos de la
competitividad, linea de financiamiento de CORFO que espera generar productos tangibles de uso publico
que mejore la capacidad de crecimiento de sectores economicos. Por su parte por la generación de vinculos
con instituciones públicas y privadas que fueron resultado de la ejecución de esta y otras iniciativas y le dan
sustento aplicado a esta línea de investigación, buscará potenciarse por medio de poner a disposición un
conjunto de servicios a los productores y laboratorios que quieran desarrollar, validar y/o analizar
información para el mejoramiento de su productividad o el desarrollo de nuevos productos, lo que se ve
facilitado por el estado de equipamiento con el que hoy se cuenta a partir del aporte hecho por esa iniciativa.
En Chile, no existen productos farmacéuticos de uso veterinario registrados por el Servicio Agrícola y
Ganadero (SAG) para el control del patógeno, ya que está prohibido el uso de la fumagilina, antibiótico de
elección frente a la nosemosis, cuya aplicación está restringida en aquellas épocas en las que hay flujo de
néctar, pues puede depositarse en la miel y generar cuadros de alergias y resistencia al antibiótico en los
consumidores. Por lo cual el bioestimulante desarrollado a etapa de prototipo puede convertirse a mediano
plazo tras la etapa de empaquetamiento y validación comercial, en una alternativa y solución parcial a la
problemática presentada. A nivel internacional se están presentados productos nuevos, sin embargo, no hay
antecedentes científicos que garanticen su real eficiencia o eficacia en el control del patógeno y menos aún
sobre el impacto en el sistema inmune de la abeja. A la fecha no existen variaciones respecto de la solución
original, se mantiene vigente el impacto económico y social para el producto a elaborar. El negocio
productivo está dado por la venta inicial del bioestimulante a centros apícolas en la IX región del país, con
proyecciones a corto y mediano plazo de expandirse a la totalidad del mercado nacional. El valor agregado
de este producto en relación a la oferta actual está dado principalmente por el producto elaborado,
considerando un proceso de captación innovador con un amplio control de una serie de variables tanto
ambientales como productivas, que permitirán obtener finalmente un producto de calidad que cumpla con los
requerimientos que el mercado demanda. En base a esta oportunidad de mercado detectada y al inicio de
protección industrial efectuado por medio de la presentación de una patente a INAPI, lo que a nivel
institucional se fortalecer por el apoyo brindado por la Dirección de Innovación y Transferencia Tecnológica,
esta unidad ha generado un conjunto de información comecial, caracterización del mercado potencial,
oportunidades y socios estratégicos al cual transferir la tecnológia. Lo que ha permitido formalizar este
resultado como parte del portafolio de tecnologías de la institución. Los aspectos anteriormente relevados
dan cuenta de que el resultado tecnológico obtenido por el equipo de investigación dada las propias
características del fondo el cual financió su desarrollo, el producto desarrollado, las características del
equipo de investigación y la oportunida de mercado detectada para su transferencia ponen como objetivo
para la institución esta tarea lo que debe venir acompañado del empaquetamiento de este desarrollo y que
será posible tanto por la vinculación con una institución o empresa mandante, el apalancamiento de recursos
para esta tarea y la disposición de la institución frente a esta materia lo que busca reflejarse en un horizonte
temporal de 3 años. La generación de la tecnología desarrollada fue analizada por una institución experta en
propiedad intelectual para verificar su capacidad de apropiabilidad por parte de la institución que
respondiese a los criterios de novedad, nivel inventivo y uso industrial estos aspectos fueron determinados
como positivos, lo cual permitió la generación de una solicitud de patente por parte de la institución en su
calidad de entidad beneficiaria (ajustandose a las bases del concurso). Hoy la institución se compromete a
continuar con el proceso de inscripción por medio de un monitoreo interno de entidades capacitadas para
ello como tambien de la respuesta a las instancias administrativas que surgan en su proceso de inscripción.
Lo cual en paralelo buscará ser transferido y permita realizar proceso efectivo de generación de
conocimiento que sea aplicado a la sociedad y el mercado. Este aspecto de transferencia de conocimiento
es un compromiso institucional que se ha profundizado en la búsqueda de transformar a la institución en una
entidad de educación superior compleja. La distribución de los resultados de investigación se ve
determinado por el reglamento 47/05 que determina las rentas y beneficios generados por el licenciamiento
de la tecnológia lo cual da un marco formal transparente a la búsqueda de sustentabilidad generado por el
desarrollo de conocimiento científico.
III. Informe De Gestión
3.1 Objetivos
3.1.1 Objetivo(s) General(es)
Nombre Objetivo OBJETIVO GENERAL
Evaluar el estado inmunológico de la abeja Apis mellifera frente al estimulo
de productos naturales como mecanismo para enfrentar el patógeno
Descripción
Nosema ceranae para obtener un prototipo de suplemento alimenticio
funcional.
3.1.2 Objetivos Específicos

Consiste en definir cuáles serán las moléculas con actividad biológica
Descripción
usadas como potenciales estimulantes del sistema inmune de la abeja
Serán evaluadas todas aquellas moléculas o sustancias activas en una
Descripción dieta de abejas adultas. Se mediran diversos parámetros de inmunidad
individual y social del insecto
Se pretende formular un producto a nivel de prototipo que pueda ser
Descripción suministrado a las abejas y genera un efecto potenciador del sistema
inmune
3.2 Resultados
RESULTADO
Tipo Resultado de Producción
Nombre alimento bioestimulante a nivel de prototipo
Descripción Corresponde a un producto liofilizado en forma de polvo seco grisáceo soluble en
residuos químicos que ponen en peligro el mercado apícola.
Corresponde a un producto liofilizado en forma de polvo seco grisáceo soluble en
residuos químicos que ponen en peligro el mercado apícola. Para el desarrollo
del producto bioestimulante se seleccionaron los extractos de ortiga y maqui para
la formulación, mezclados con quitosano, azúcar y un antioxidante. Para ello se
disolvieron 1 g de quitosano en 60 mL de agua más 1 ml de ácido acético glacial,
adicionando primero el agua desionizada y luego el ácido. Posteriormente, se
procedió a calentar la solución a 70 C adicionando muy lentamente el quitosano
para que no se formen grumos. Luego se deja agitando hasta disolución
completa, si al cabo de dos horas no está disuelta la solución se debe adicionar
0,2 mL más del ácido. Una vez disuelto se dejó enfriar. A continuación, se midió
el volumen final de la mezcla y se calculó el porcentaje en peso del producto en
esta solución. La solución final se dividió en dos partes iguales en volumen. En el
caso de los extractos se pesaron 0,3 g de cada uno (ortiga y maqui, previamente
liofilizados) de forma independiente y se disolvieron en 20 mL de agua
desionizada por separado. Paralelamente, se disolvieron 2 g de sacarosa en 40
mL de agua y se adicionó 0,1 g de ácido ascórbico a la solución y se agitó hasta
Descripción del Logro
disolución total. Luego se dividió la solución en dos partes. Para la preparación
de la formulación se mezclaron 20 mL de solución de extracto de ortiga y maqui
(cada uno por separado) con 20 mL de la solución de azúcar y antioxidante.
Posteriormente, se agitó esta solución hasta que se observó una mezcla
homogénea. Después se adicionó gota a gota y con agitación vigorosa todo el
volumen de la solución de quitosano que correspondió aproximadamente a 30-35
mL para cada una de las soluciones por separado, observándose la aparición de
una turbidez en la mezcla. Luego se dividió en dos partes iguales cada
formulación de extracto, donde una parte se centrifugó y la otra no. Ambas se
colocaron a liofilizar por un periodo de 4 días. Posteriormente, se sacó el
producto liofilizado y ambos productos (extracto de maqui y ortiga) se mezclaron
en proporciones iguales (1:1) en un frasco de vidrio donde fueron
homogenizados y así obtener el bioestimulante en formato de polvo liofilizado.
Las características físico químicas del bioestimulante fueron 13% de humedad y
3,22% de cenizas. Luego, el biostimulante se disolvió en una solución de
sacarosa, pesando 0,003 g de bioestimulante disueltos en 10 mL de solución de
sacarosa al 50, hasta su posterior utilización. El producto formulado esta en
procesos de patentamiento en función de su composición y características. Entre
los atributos del producto se encuentran poseer una baja humedad al ser
liofilizado lo cual es ventajoso pues es estable y de fácil transporte. El producto
fue evaluado midiendo la longevidad de las abejas tratadas, la expresión génica
de variables inmunológicas enzimática y péptidos antimicrobianos siendo positiva
su respuesta al comparar con abejas enfermas por Nosema ceranae.
RESULTADO
Tipo Resultado de Producción Científica (Ex "Otros")
Nombre Presentacion de Poster XI Congreso Latinoamericano de Apicultura
Descripción Presentación de Poster XI Congreso Latinoamericano de Apicultura, FILAPI-2014
el titulo del trabajo es: Efecto de dos aceites esenciales sobre el desarrollo de
Nosema ceranae en abejas Apis mellifera bajo condiciones de laboratorio. Este
trabajo fue presentado al XI congreso Latinoamericano de Apicultura 2014
FILAPI en Puerto Iguazú, Argentina el día 5 de septiembre de 2014. en formato
Descripción del Logro Poster. Los resultados apuntan a verificar el efecto de 2 aceites esenciales en
función de la cantidad de esporas de Nosena que disminuyen cuando se aplican
los tratamiento. Se observó una disminución en la cantidad de esporas por
abejas en los tratamientos de aceite al final de la evaluación, se uso aceite de
hinojo y poleo.
3.3 Gestión del Proyecto
3.3.1 Plazos efectivamente utilizados v/s plazos considerados inicialmente
los plazos utilizados son los señalados en a propuesta inicial
3.3.2 Gastos Ejecutados vs. Presupuesto inicial

los gastos ejecutados fueron los mismo gastos presupuestados. aun esta pendiente un saldo aprobado para
el seminario de cierre de proyecto en el mes de marzo 2016
3.3.3 Participación de las instituciones y Empresas

NO APLICA
3.3.5 Participación de las instituciones y Empresas

El(la) Representante Institucional de cada Institución Beneficiara
La ejecución del Proyecto FONDEF CA13I10140 denominado “Desarrollo y evaluación de un producto
bioestimulante en base a compuestos naturales que potencien la respuesta inmunológica de la abeja Apis
mellifera, para el control de Nosema ceranae”, tuvo como objetivo desarrollar un producto que abarcase el
problema de Nosema ceranae, agente causante de una enfermedad que ha sido identificada recientemente
en Chile y que preocupa al mundo científico siendo considerada una amenaza para la apicultura mundial. El
estado del arte sobre este problema nos señala que las respuestas se han focalizado en el reconocimiento y
descripción de este parásito. Por lo cual este proyecto buscó desarrollar un bioestimulante que contuviera
potenciadores del crecimiento (prebióticos), aceites esenciales, ácidos grasos EPA/DHA, glúcanos. Todos
inmunoestimulantes que puedan ser utilizados a través de dietas causando un efecto beneficioso en la abeja
melífera mejorando su respuesta inmune. De lo cual se obtuvo un producto En este contexto, la Universidad
Católica de Temuco destaca los logros obtenidos por el proyecto, en especial en la línea de investigación
agropecuaria y el desarrollo de una innovación de productos que pone en valor las capacidades
institucionales y que ha profundizado para la Facultad de Recursos Naturales el ámbito de la apicultura,
consolidando esta línea al interior de la institución. Lo que se ratifica en la generación de un resultado
apropiable industrialmente por parte de la UC Temuco como entidad beneficiaria de la iniciativa, generación
de publicaciones en el área y capital humano avanzado vinculado a ella. Por su parte se destaca la
formación de capacidades al haberse vinculado a ella un conjunto no menor de estudiantes de pregrado los
que formaron parte del equipo de investigación. Esta consolidación ha permitido al equipo de investigación
adjudicar un proyecto FIA. También se destaca su relación con el entorno, donde la Directora del Proyecto
Dra. Ximena Araneda se ha transformado en una referente nacional en la material lo cual le ha permitido
formar parte de la Mesa Apicola Nacional que hoy discute la futura Ley Apícola. Como iniciativas científicas y
de transferencia tecnológica ligadas a este proyecto se destaca 1 publicación ISI de alto impacto, 3 tesistas
de pregrado la Carrera de Agronomía: Andrés García, Carlos Inzunza, Daniela Nuñez, una presentación de
poster en congreso internacional un seminario de sanidad apícola realizado en la UCT y una solicitud de
Patente presentada en Chile frente a INAPI. Conclusión: La Institución considera a este proyecto como una
iniciativa científica con proyección en investigación por los resultados obtenidos y se compromete en
mantener y difundir sus líneas de investigación; monitorear la protección de sus resultados; facilitar su
proceso de transferencia tecnológica a instituciones interesadas; potenciar el uso y mantención del
equipamiento e infraestructura instalada, con miras a generar nuevas investigaciones en el área desarrollada
que se materializará en el presente año 2016 en la presentación al concurso FONDEF Investigación
Tecnológica.
El(la) Director(a) del proyecto
El proyecto contribuirá con nuevas informaciones y conocimientos en ciencia básica y aplicada que vendrán
en benéfico del rubro apícola contribuyendo al desarrollo de una apicultura más inocua, sustentable y
competitiva. En el desarrollo de la propuesta se presentaron dificultades para la realización de algunas
metodologías inicialmente: glucosa oxidasa, fenol oxidasa: para ambos caso se procedió a buscar
mecanismos de corrección mediante la aplicación de análisis de expresión génica que venían a sumar
información relevante. También se observó que metodologías iniciales como la determinación de cuerpos
graso no resultaban ser confiables, toda vez que esta determinación considera la grasa total del cuerpo de la
abeja la cual puede estar asociada a la producción de cera, grasas cuticulares y otras. Y no necesariamente
estar correlacionada con el tamaño e importancia de los cuerpos grasos. Se detectó como dificultad la
problemática para concretar la traída de expertos internacionales hasta nuestro país como asesores en la
temática propuesta. Se realizaron las invitaciones y contactos correspondiente, solo concretando la traída
del Dr. Ernesto Guzmán Novoa, destacado investigador apícola, director del centro de investigación apícola
de la Universidad de Guelph, Canadá. El Dr. Guzmán Novoa desarrolla entre otros trabajos, investigaciones
en productos que pueden estimular el sistema inmune y nutraceuticos para el control de Nosema y estudian
la expresión de genes del sistema inmune. Cabe señalar la importancia de contar con apoyo y vinculación
internación en estas y otras temáticas de investigación aplicada. Se debe gestionar la traída de expertos o
buscar la posibilidad de realizar capacitación del equipo técnico o investigadores en un centro de referencia
que permita la rápida adopción de competencia y la vinculación necesaria. Los resultados del proyecto
permiten señalar que es factible traducirlos en conocimientos para el mundo científico junto con entregar una
propuesta consistente en un producto desarrollado a partir de sustancias naturales que aporten al sistema
inmunológico individual de A. mellifera como un potenciado de la inmunidad de la abeja. Los resultado abren
nuevas líneas de investigación tales como la investigación aplicada mediante el usos de herramientas
moleculares donde es posible estudiar la variabilidad genética del patógeno asociado a diferentes ambientes
, latitudes, manejos etc, como una estrategia que ayude a entender su comportamiento y potencial control
También abre nuevas alternativas para la entrega de servicios como identificación del patógeno Nosema
mediante técnicas moleculares, análisis o medición de la condición inmunológica de la abeja, correlación de
la condición inmune y patologías presentes, etc. Si bien con mucha rapidez se puede encontrar la
publicación de nuevas investigaciones con temáticas similares, la generación de numerosas patentes e
incluso la comercialización de nuevos productos para el control de patógeno siguiendo los principios de la
presente propuesta, cabe señalar que la investigación propuesta es la línea correcta de investigación y
conduce a un producto competitivo que podrá ayudar a mejorar en la condición inmune de la abeja.
IV. Informe CT y Económico Social
4.1 Negocios Tecnológicos y Productivos
4.2.1 Síntesis de las actividades realizadas en Transferencia no existen acciones de transferencia

propiamente tal. La empresa asociada inicialmente al proyecto no presenta interés en la tecnología
desarrollada pues es diferente a su línea de trabajo. Sin embargo existen una nueva empresa que manifiesta
interés, consorcio apícola, con la cual no existe un vínculo formal dentro del proyecto pero que podría ser un
socio futuro de transferencia.
4.3 Impactos Producidos Y Esperados
4.3.1 Impactos económicos-sociales
Entre los impactos económicos sociales se logra dar nuevos servicios a apicultores de la región de La
Araucanía, quienes mostraron un gran interes con la patología de Nosema ceranae tales como: Se realizó el
primer Seminario Apícola de la Provincia de Malleco Angol 2015, cuya presentación se realizó el día 12 de
junio de 2015 en la localidad de Angol y Renaico, Región de La Araucanía con la charla: “Importancia de
Nosema ceranae Fries en Chile y el mundo”. Se realizó una capacitación dirigida a los apicultores de la
Municipalidad de Victoria el día 21 de agosto del 2015, desarrollada en el Laboratorio de Sanidad Apícola de
la Universidad Católica de Temuco. En esta oportunidad se enseñó a los apicultores identificar esporas de
Nosema spp. bajo microscopio, junto con indicaciones de su manejo y control. Hubo gran interes por parte
del Seremi de Agricultura de la Región de La Araucanía en detectar la presencia de la enfermedad de
Nosemosis en la región, por lo que solicitó el servicio de detección de Nosema a la Universidad y la toma de
muestras de abejas a todos los Prodesal de la región (32 comunas), servicio que aún se está prestando.
4.3.2 Impactos científicos-tecnológicos

Entre los impactos científicos tecnológicos logrados en el proyecto se pueden mencionar: Se logró obtener
una publicación científica sobre el patógeno Nosema ceranae y los métodos de control de esta enfermedad
en la revista ISI Archivos de Medicina Veterinaria titulada: Distribution, epidemiological characteristics and
control methods of the pathogen Nosema ceranae Fries in honey bees Apis mellifera L. (Hymenoptera,
Apidae), publicada el año 2015 volumen 47, número 2, páginas 129-138. Parte de los resultados se dieron a
conocer en el XI Congreso Latinoamericano de Apicultura FILAPI 2014, Puerto Iguazú, provincia de
Misiones, República Argentina. En presentación como expositor con poster titulado: Efecto de dos aceites
esenciales sobre el desarrollo de Nosema ceranae en abejas (Apis mellifera) bajo condiciones de
laboratorio. Se desarrollaron 4 tesis de pregrados con la participación de estudiantes de Agronomía en el
desarrollo de los diferntes ensayos del proyecto, tituladas: tesis 1 "Determinación de DL50 en abejas (Apis
mellifera) con extractos acuosos liofilizados de plantas arbustivas y herbáceas para futuro control de
nosemosis (Nosema ceranae)" (terminada 2014); tesis 2 “Uso de aceites esenciales de plantas como control
alternativo en las principales enfermedades apicolas” (terminada 2015); tesis 3 "Efectos de uso de extracto
acuoso de maqui (Aristotelia chilensis), y aceites escenciales de tomillo (Thymus vulgaris M.) y boldo
(Peumus boldus M.) sobre la condición inmunológica de la abeja (Apis melliera mellifera L.) parasitada por
Nosema ceranae" (en espera del examen); tesis 4 “Evaluación de 6 extractos acuosos de plantas sobre el
número de hemocitos, palatabilidad y viabilidad de Apis mellifera frente a la infección de Nosema ceranae”
(etapa en escrito final con ensayos terminados). Se organizó el Seminario Internacional: Sanidad Apícola
2015, con el objetivo de dar a conocer los avances de resultados del proyecto, donde se contó con
expositores internacionales y nacionales. La actividad se llevaró a cabo el día viernes 28 de agosto a las
10:00 h en el Salón Auditórium del Edificio Cincuentenario ubicado en el Campus San Juan Pablo II, de la
Universidad Católica de Temuco. En esta actividad participó el Dr. Ernesto Guzmán-Novoa, Director del
Centro de Investigación Apícola de la Universidad de Guelph, Canadá, con su charla: “Mejoramiento
genético apícola, importancia y desafíos en el control de patologías apícolas”. También se contó con la
participación de la Dra. Marta Rodríguez Sanhueza, Empresa BioBichos, Chillán, con la charla: “Detección e
identificación de virus de la abeja de miel (Apis mellifera) en Chile y su asociación con otras patologías
apícolas”. Y con la participación del Dr. Ramon Rebolledo Ranz, Académico e investigador de la Universidad
de La Frontera, Temuco, con la charla: “Importancia y control de chaqueta amarilla (Vespula germanica) en
la apicultura del sur de Chile. Finalmente la Dra. Ximena Araneda presentó los Avances del proyecto:
“Evaluación y formulación de un producto bioestimulante en base a compuestos naturales que potencian la
respuesta inmunológica de la abeja Apis mellifera para el control de Nosema ceranae". Se logró asistir a una
capacitación en la Universidad Austral de Chile, con el objetivo de implementar la técnica de extracción y
conteo de hemocitos. Se logró adoptar nuevas tecnologías moleculares en el desarrollo del proyecto, como
la expresión génica de la actividad fenoloxidasa y glucosa oxidasa. Se solicitó un estudio de patentamiento
con el objetivo de buscar y detectar todo los documentos que se relacionen con el área tecnológica de
interés, junto con analizar comparativamente la tecnología de interés de forma de determinar si cumple los
requisitos de patentabilidad: novedad, actividad inventiva y aplicación industrial. Estudio terminado, patente
solicitada.
4.3.3 Impactos Institucionales

Entre los impactos institucionales se puede destacar la creación de una nueva línea de prestación de
servicios por parte del Laboratorio de Sanidad de la Escuela de Agronomía de la Universidad Católica de
Temuco, donde a partir del año 2015 se comenzaron a recibir muestras de abejas de las 32 comunas de la
región para realizar análisis de patologías, principalmente detección de Nosema sp., a partir de análisis
convencional (visualización y conteo de esporas de Nosema sp. en cámara de Neubauer a través de
microscopia) y mediante técnicas de PCR para determinar la presencia de N. apis o N. ceranae a través del
ADN . También quedó montada la técnica inmunológica para el conteo de hemocitos y expresión génica de
la glucosa oxidasa y polifenol oxidasa, las cuales actualmente están siendo utilizadas para diferentes tesis
de investigación. Por lo tanto, quedaron competencias instaladas para la realización de cursos y diplomados
a futuros, debido al gran interés presentado por muchos apicultores de la región, para la detección y control
de N. ceranae.
4.3.4 Impactos Ambientales

El proyecto no generó impactos negativos, al contrario, al utilizar aceites y extractos naturales de plantas no
causó contaminación ni daño a las abejas. Además, se realizó la trazabilidad de la colecta de las plantas
utilizadas, así como también en la preparación del producto. El bioestimulante es 100% natural, sin
productos químicos que causen daño a las abejas (con la realización de sus respectivos DL50), por lo que
es una alternativa al único control químico que presenta la enfermedad de nosemosis (antibiótico
Fumagilina), y que actualmente está prohibido en Europa debido a la contaminación que provoca en la
colmena y en la miel. Además, este bioestimulante es un estimulador del sistema inmune, por lo que al tener
abejas más sanas se reducen las aplicaciones de productos químicos (contaminantes) frente a las diferentes
patologías que afectan a Apis mellifera.
4.3.5 Impactos Regionales

El impacto producido por el proyecto, está vinculado completamente a las diferentes regiones del país que
quieran la prestación de servicios para la detección de Nosema ceranae, al quedar implementada la técnica
por detección convencional y por PCR. Hasta el momento la prestación de servicio se ha realizado para
apicultores de toda la Región de La Araucanía, debido a la preocupación de la sanidad de las abejas por
parte del Seremi de Agricultura de esta región y también se han recibido muestras de la Región del Bio Bio
para la detección de Nosema ceranae. Por lo tanto Entre otros impactos regionales que se generarán, está
la realización de cursos de capacitación a los apicultores e integrantes de los distintos PRODESAL, al
mantener el contacto con el Seremi de Agricultura de la Región de la Araucanía y su interés en la sanidad de
las abejas. Mediante esto los interesados podrán identificar los síntomas en campo y conocer las técnicas
utilizadas en laboratorio para la detección de la enfermedad y otras patologías apícolas, y posteriormente
poder aplicar los tratamientos preventivos de esta patología. Por lo tanto, este impacto es replicable en todas
las regiones del país.
V. Anexos
3/12/2015 Solicitud de Patente
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9
Providencia
Patente
Título: Uso de extractos naturales bioestimulantes para abejas Apis mellifera
Resumen:
Producto consiste en formulación a base de extractos naturales con efecto bioestimulante útil para
potenciar la respuesta inmune de la abeja Apis mellifera afectada por patógeno Nosema ceranae, donde el
compuesto natural es seleccionado desde el grupo consistente de extracto de maqui, ortiga, canelo, limón,
orégano,quillay,romero,alcachofa,aloe vera,matico; aceites de boldo,ciprés,eucaliptus,hinojo,menta,poleo,
romero, tomillo, principalmente maqui, ortiga; quillay, limón, matico, romero, y/o eucaliptus
Dibujo Resumen:
http://ion.inapi.cl:8080/Patente/SolicitudPatente.aspx 1/2
3/12/2015 Solicitud de Patente
Documentos Acompañados
Hoja Técnica: 41.Hoja Tecnica.pdf
Resumen: Resumen.pdf
Memoria: MEMORIA.pdf
Pliego: REIVINDICACIONES.pdf
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Dibujo Resumen: Untitled.jpg
Poder
N° Poder: 58802
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“NO APLICA POR TRATARSE DE UN PROYECTO DEL
CONCURSO CIENCIA APLICADA, PROGRAMA IDeA”
ANEXOS
ANEXO 1: METODOLOGÍAS INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
ANEXO 2: TRAZABILIDAD EXTRACTOS NATURALES
ANEXO 3: RESULTADOS
ANEXO 4: LITERATURA CITADA
ANEXO 5: TESIS
ANEXO 6: PLOTER CONGRESO FILAPI

ANEXO 1 METODOLOGIAS INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
Metodología Objetivo específico 1: Seleccionar y caracterizar los compuestos naturales con

mayor potencial inmunológico
Obtención de muestras de abejas

Para determinar la presencia y distribución de N. ceranae en abejas de la Región de La Araucanía, se
realizará un recorrido en las comunas de las dos provincias de la región, durante la temporada verano,
otoño de 2014. Para realizar una estimación adecuada del tamaño muestral se utilizó la fórmula descrita
por Duffau (1999), donde se determinó muestrear un total de 202 colmenas en la región.
2
N • Z • p (1-p)
n=
2 2
d • (N-1) + Z • p (1-p)
En donde:
n: es el tamaño de la muestra,
N: la población total,
Z: el valor de z para el nivel de confianza (1- alfa),
p: la proporción esperada en la población,
d: la precisión absoluta.
Los individuos de Apis mellifera serán colectados y transportados al Laboratorio de Bromatología de la

Universidad Católica de Temuco y almacenadas hasta su análisis (Rodríguez et al., 2012).
Posteriormente, se diagnosticará la presencia de Nosema spp. en las muestras colectadas de toda la
región según metodología propuesta por OIE (2008) mediante el recuento de esporas en donde el
abdomen de 20 abejas obreras será eliminado y depositado en morteros para ser molidos suavemente,
luego se agregarán 5 mL de agua destilada, mezclando los abdomen triturados durante 120 segundos.
Posteriormente, se tomarán 15 µL de macerado y se depositarán en un portaobjeto para ser observados
en el microscopio.
Para visualizar las esporas presentes de Nosema spp. en la preparación de abejas maceradas se usará
un microscopio de campo usando ampliación de 400 X suficiente para poder observar las esporas, ya
que el uso de fase de microscopía óptica de contraste facilita la distinción de esporas de microsporidios
de levadura u otras partículas (Fries et al., 2013). Cada muestra será leída en el campo visual tres veces
para obtener un promedio y después serán clasificadas en categorías dependiendo del número de
esporas (Cuadro 1).
Cuadro 1. Clasificación según categoría.

Categoría N° de esporos
X: escasa cantidad 1-10
XX: regular cantidad 11-50
XXX: abundante cantidad 51-100
XXXX: muy abundante cantidad Mayor a 100
Determinación de Nosema ceranae mediante PCR
Extracción de ADN mediante protocolo de Paolocci et al. (1999)

El ADN genómico de cada muestra fue extraído desde suspensiones intestinales usando el protocolo
descrito por Paolocci et al. (1999) con algunas modificaciones. Brevemente se procedió a la incubación
de 100 µL de esta suspensión en 300 µL de buffer de lisis (200 mM de Tris HCl, pH 7,5; 250 mM NaCl ;
25 mM EDTA; 0,5% SDS) a 65°C durante 30 minutos para la disolución del tejido. Posterior a la
incubación fue mezclado en vortex y centrifugado por 10 minutos a 10.000 rpm. Para la precipitación del
ADN se utilizó isopropanol agregando 300 µL a cada tubo e incubando a -20°C durante 8 horas para
luego ser centrifugado a 10.000 rpm durante 5 minutos. Luego se eliminó el sobrenadante del tubo
quedando en el fondo un pellet al que se le agregó 300 µL de etanol para lavarlo, se centrifugó a 10.000
rpm por 5 minutos, posteriormente se eliminó el etanol y se le añadió 50 µL de agua desionizada para
hidratarlo. Se almacenó a 4°C por toda la noche y luego a -20°C para su conservación. La integridad del
ADN en estudio se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE (Tris, acetato y
-1
EDTA) y teñido con bromuro de Etidio (0,5 mg mL ) (Sambrook y Russell, 2001).
Extracción de DNA mediante Plant Genomic DNA Kit (TIANGEN)

La extracción de DNA se llevó a cabo mediante el kit de extracción Plant Genomic DNA Kit (TIANGEN),
según las instrucciones del fabricante, con algunas modificaciones. Brevemente; por cada 100 µL de
muestra (macerado intestinal de abeja) se agrega 700 µL del buffer GP1 precalentado a 65ºC y 7 µL de 2
b-mercaptoetanol. Se agita en vortex por 20 segundos. Se incuba a 65ºC por 20 minutos. A continuación
se agrega 700 µL de cloroformo y se agita en vortex por 20 segundos. Se centrifuga a 12000 rpm por 5
minutos. Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se agregó 700 µL de buffer GP2, se mezcló por
inversión. Se transfirió la mezcla a una columna Spin Column CB3. Se ubica la columna en un tubo
colector proporcionado en el kit y se centrifuga a 12000 rpm por 30 segundos. Se descartó el filtrado y a
la columna se agregó 500 µL de buffer GD. Se centrifugó a 12000 rpm por 30 segundos, se descartó el
filtrado. Se agregó 700 µL de buffer PW a la columna. Se centrifugó 12000 rpm por 30 segundos, se
descartó el filtrado y se repitió el procedimiento con 500 µL de buffer PW, se centrifugó a 12000 rpm por
30 segundos. Se pone la columna en el tubo colector y se centrifugó a 12000 rpm por 2 minutos. Se
trasfiere la columna a un tubo de mircocentrífuga de 1,5 mL, se secó a temperatura ambiente y se agregó
100 µL de buffer TE a la columna Spin Column CB3. Se incubó 5 minutos a temperatura ambiente y se
centrifugó a 12000 rpm por 2 minutos para la elución del ADN. La integridad del ADN en estudio se
evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE (Tris, acetato y EDTA) y teñido con
-1
bromuro de Etidio (0,5 mg mL ) (Sambrook y Russell, 2001).
Cuantificación del DNA

La cuantificación del DNA se realizó mediante análisis fluorométrico utilizando un fluorómetro Qubit 2.0
Invitrogen (Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Reacción de PCR para la detección de Nosema ceranae y Nosema apis.

Para la detección de N. ceranae y N. apis mediante la reacción de PCR tiempo final, se utilizó la
metodología de Duplex PCR (Martín-Hernandez et al., 2007) seleccionando el locus 16s de RNA
ribosomal. Los partidores usados se muestran en la tabla a continuación.
Cuadro 2. Selección de primer utilizados en el ensayo.
Tamaño producto
Primer Secuancia (bp) Especificidad
218MITOC- 5′-CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAA-3′ 218-219 N. ceranae
FOR
218MITOC- 5′-CCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG-3′
REV
321APIS-FOR 5′-GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA-3′ 321 N. apis
321APIS-REV 5′-GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG-
3′
Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: 94ºC por 2 minutos, seguido de 30 ciclos de
denaturación a 94ºC por 15 segundos, un alineamiento a 61,8ºC por 30 segundos y una extensión a 72ºC
por 45 segundos. Los productos de PCR fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa al
-1
1% en buffer TBE y teñido posteriormente con Bromuro de etidio (0,5 mg mL ) (Sambrook y Rusell,
2001).
Metodología aceites esenciales y extractos de plantas
Obtención de aceites esenciales

Los aceites esenciales utilizados en el ensayo fueron adquiridos de una empresa fitoquímica de la región.
Los acetites utilizados fueron de boldo (Peumus boldus Molina), ciprés (Cupressus sempervirens L.),
eucaliptus (Eucalyptus globulus Labill.), hinojo (Foeniculum vulgare Miller), menta (Mentha piperita L.),
poleo (Mentha pulegium L.), romero (Rosmarinus officinalis L.), tomillo (Thymus vulgaris L.), y sus
características se detallan a continuación:
Boldo: es un árbol mediano que puede superar los 15 m de altura, perteneciente a la familia de las
Monimiaceae, nativo del Cono Sur. Entre los componentes principales de su aceite se encuentran 1,8-
cineol (36,72%), p-cimeno (26.79%); ascaridol (6,25%); sabineno (5.10%), 4-terpineol (4,39%), β-pineno
(4,16%) y limoneno (2,68%) y se caracteriza por presentar potentes propiedades insecticidas (Urzúa et
al., 2010).
Ciprés: ciprés común o ciprés mediterráneo, es una especie arbórea de hoja perenne de la familia
Cupressaceae, puede alcanzar de 20 a 30 m de altura. Presenta un total de 24 compuestos, que
representan el 92,95% del aceite esencial, siendo los compuestos dominantes en el aceite los
hidrocarburos monoterpénicos (84,38%), seguido por los monoterpenos oxigenados (3,81%),
hidrocarburos sesquiterpenos (3,07) y sequiterpenos oxigenados (1,69%), presentando una notable
actividad antioxidante y antimicrobiana (Boukhris et al., 2012).
Eucalipto: es una especie arbórea de la familia Myrtaceae. Entre sus principales componentes destacan
el eucaliptol (1,8-cineol) y alfapineno, siendo el limoneno el compuesto con la mayor actividad
antimicrobiana, por lo que se promueve su uso para el manejo de enfermedades de loque americana y
varroasis (Gende et al., 2010).
Hinojo: planta perenne de la familia Apiaceae. Su aceite esencial se compone de más de 35 moléculas
con efectos antifúngicos y antioxidantes (Singh et al., 20016).
Menta: planta vivas, con tallos muy ramificados, caracterizada por su aroma, olor y propiedades
terapéuticas. Pertenece a la familia Lamiaceae. Presenta aproximadamente 17 compuestos, siendo su
principal constituyente el mentol (53,28%), seguido de acetato de mentilo (15,1%) y mentofurano
(11,18%), con propiedades antimicrobianas (Saharkhiz et al., 2012).
Poleo: planta de 10 a 50 cm de alto perteneciente a la familia Lamiaceae. Su aceite esencial se compone

de un 99% de pulegona, monoterpeno, con acción acaricida (Rim y Jee, 2006).
Romero: es un arbusto aromático, leñoso de hojas perennes de la familia Lamiaceae. Presenta 37

compuestos diferentes que representan el 99,38% de su aceite, constituyendo los monoterpenos
oxigenados su principal clase química, y el 1,8 cineol (24,10%) su principal componente, presentando
potencial uso como antioxidante y agente antimicrobiano (Miladi et al., 2013).
Tomillo: subarbusto pequeño de hasta 40 cm de altura perteneciente a la familia Lamiaceae. Presenta

31 compuestos que representan el 99,64% del aceite, siendo el timol (41,33%) su principal componente.
Se caracteriza por actuar como un antioxidante natural con mayor efecto bactericida de romero (Miladi et
al., 2013).
Obtención de extractos acuosos

Para el caso de los extractos acuosos, las plantas fueron colectadas de diferentes sectores de la región y
luego fueron llevadas al Laboratorio de Bromatología de la Universidad Católica de Temuco para su
posterior extracción. El follaje de las plantas fue limpiado para eliminar el polvo y suciedad existente,
posteriormente se pesaron 400 g de hojas para ser cortado en trozos, agregando ½ litro de agua
destilada para su trituración en una licuadora. Luego, el extracto obtenido se filtró con la ayuda de una
gasa y enseguida una filtración al vacío. Con el fin de reducir la carga microbiana se calentó, el extracto
se calentó a 70°C por 5 min y una vez frío se transfirió a frascos de vidrio y luego se congeló a -80°C por
24 h, para posteriormente ser sometido a un equipo liofilizador a -70°C por 72 h, sublimando el hielo a
vapor. Una vez eliminado todo el contenido de agua del extracto preparado, se obtuvo un polvo fino y
100% soluble en agua y/o en solución azucarada. El material vegetal utilizado para la preparación de los
extractos acuosos correspondió a: Aloe vera (L.) Burm, F., canelo (Drimys winteri J.R.Forst. & G.Forst.),
limón (Citrus limon L.) maqui (Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz), ortiga (Urtica dioica L.), quillay
(Quillaja saponaria Molina) y romero (R. officinalis), cuyas características se detallan a continuación:
Aloe vera: es un arbusto acaule o con tallo corto cubierto de hojas, perteneciente a la familia
Xanthorrhoeaceae, con usos medicinales, cosméticos y alimenticios. Presenta ácido fumárico como
principal componente antibacteriano en A. vera (He et al., 2011).
Canelo: es un árbol siempreverde que habita en gran parte del territorio de Chile y zonas vecinas de
Argentina, árbol sagrado del pueblo mapuche. Pertenece a la familia Winteraceae y sus metabolitos han
demostrado actividad biológica importante contra microorganismos e insectos (Muñoz et al., 2001; Zapata
et al., 2009).
Limón: pequeño árbol perenne que puede alcanzar más de 4 m de altura, perteneciente a la familia
Rutaceae. Las especies de limón pueden tener actividad antimicrobiana frente a diferentes patógenos
Gram positivos, Gram negativos y levaduras y podrían utilizarse para la prevención de diversas
enfermedades causadas por estos organismos (Kadhim y Ghandi, 2013).
Maqui: es un pequeño árbol dioico con altura de 4 a 5 m, propia de Chile y zonas adyacentes del Sur de
Argentina, perteneciente a la familia Elaeocarpaceae. Se caracteriza por poseer una composición rica y
diversificada de compuestos bioactivos con propiedades que promueven la salud, atribuidos a
compuestos fenólicos y vitamina C, potencialmente protectora contra enfermedades caridovasculares y
cáncer (Schreckinger et al., 2010). Presenta alcaloides de indol y quinolina dentro del tejido de sus hojas
(Céspedes et al., 1990; He et al., 1997). Además, sus extractos de hojas han demostrado posibles
actividades nematicidas (Insunza et al., 2001) y antivirales (Pacheco et al., 1993).
Orego Stim: Suplemento nutricional, 100% natural a base de Origanum vulgare spp. hirtum. Aceite
natural de Origanum vulgare spp. hirtum al 5%. Fortalece la condición corporal de la abeja, estimula el
desarrollo de la colmena, protege a las abejas de factores anti-nutricionales, aumenta la palatabilidad,
hace más atractivo el alimento, antioxidante natural, mejora la salud intestinal de las abejas, mejora la
digestión, produce una protección natural a la colmena, puede ser usado en cualquier época del año,
bioestimulante 100% natural y no deja residuos.
Ortiga: alcanza 50 a 150 cm, caracterizada por presencia de pelos urticantes cuyo líquido produce
irritación y picor intenso en la piel. Pertenece a la familia Urticaceae. Se han identificado alrededor de 20
compuestos, siendo el más importante el neofitadieno (25%), ácido phtaleico (8,15%), dibutil phtaleato
(7,37%), bis (2-etil hexil) maleato (6,32%) y ácido carboxílico 1,2-benzenocli (7,62%), siendo mayor estos
compuestos en las hojas y sus extractos podrían ser adecuados como agentes antimicrobianos y
antibacterianos (Lahigi et al., 2011; Modarresi-Chahardehi et al., 2012).
Quillay: árbol endémico de la zona Central de Chile. Es un árbol perennifolio de 15 a 20 m de altura,

perteneciente a la familia Quillajaceae. Contiene varias saponinas triterpenoides y su extracto posee una
fuerte actividad antiviral en concentraciones más de 100 veces menores que las concentraciones que
exhiben citotoxicidad de las células (Roner et al., 2007).
Romero: su extracto acuoso se caracteriza por presentar flavonoides, polifenoles, taninos y saponinas,
con una baja actividad antioxidante, con posibles beneficios preventivos y curativos contra varias
enfermedades (Akrout et al., 2012).
Determinación dosis letal de aceites esenciales y extractos acuosos

Para testear los aceites esenciales y extractos acuosos a diferentes concentraciones en las abejas y
medir los parámetros fisiológicos a la infección por Nosema, fue necesario calcular la dosis letal media
(DL50), que representa la concentración del aceite y extracto a la cual muere el 50% de la población de
abejas. Para ello, se eligieron como mínimo cinco dosis, de modo que al menos tres de ellas estén en
ese rango. Así, las concentraciones utilizadas en los aceites (Cuadro 3) y extractos (Cuadro 4) se
detallan a continuación:
Cuadro 3. Concentraciones de aceites esenciales para determinación de DL50.
Aceite D1 (µL D2 (µL D3 (µL D4 (µL D5 (µL D6 (µL D7 (µL
-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1
abeja ) abeja ) abeja ) abeja ) abeja ) abeja ) abeja )
Boldo 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Ciprés 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Eucaliptus 1 0,04 0,06 0,08 0,1 0,2
Eucaliptus 2 0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,2
Hinojo 1 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Hinojo 2 2 4 6 8 10
Menta 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Poleo 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Romero 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Tomillo 1 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Tomillo 2 0,04 0,06 0,08 0,1 0,2
Cuadro 4. Concentraciones de extractos acuosos para determinación de DL50.

Aceite D1 (µg D2 (µg D3 (µg D4 (µg D5 (µg D6 (µg
-1 -1 -1 -1 -1 -1
abeja ) abeja ) abeja ) abeja ) abeja ) abeja )
Aloe vera 1 0,1 0,15 0,20 0,25 0,30
Aloe vera 2 5 10 15 20 25
Aloe vera 3 0,1 0,15 0,20 0,25 0,30
Aloe vera 4 3 5 10 15 20
Canelo 1 1 2 4 6 8 10
Canelo 2 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12
Canelo 3 3 5 10 15 20
Canelo 4 3 5 10 15 20
Limón 3 5 10 15 20
Maqui 1 0,1 0,15 0,20 0,25 0,30
Maqui 2 5 10 15 20 25
Maqui 3 3 5 10 15 20
Quillay 3 5 10 15 20
Romero 1 3 5 10 15 20
Orego Stim 0,1 0,3 0,5 1 1,5
Ortiga 3 5 10 15 20
Cuadro 5. Concentraciones de EPA / DHA para determinación de DL50.

- - - - -
Aceite D1 (µL abeja D2 (µL abeja D3 (µL abeja D4 (µL abeja D5 (µL abeja
1 1 1 1 1
) ) ) ) )
EPA / DHA 3624 0,1 0,3 0,5 1 1,5
EPA / DHA 4432 0,1 0,3 0,5 1 1,5
Análisis estadístico
Para determinar la presencia y distribución de N. ceranae en abejas de la Región de La Araucanía, los
datos fueron tabulados en Excel y ordenados por comuna, con sus respectivos conteos de esporas y los
resultados del PCR. Posteriormente, los datos fueron agrupados y se determinó la prevalencia en
porcentaje de la presencia de Nosema en cada comuna y se visualizó por espectofotometría la presencia
o ausencia de N. ceranae.
Para la determinación de la dosis letal media (DL50), se utilizó un grupo de 10 abejas por aceite y
extracto con cinco repeticiones por dosis más un control sin aceite ni extracto (sólo alimentadas con
jarabe de sacarosa) con cinco repeticiones.
La primera evaluación se llevó a cabo 5 h después de la aplicación del aceite esencial, y las siguientes
mediciones se realizaron a las 24 h, 48 h y 72 h; a excepción del aceite de hinojo cuyas mediciones se
realizaron a las 5 h, 16 h, 24 h, 29 h, 40 h, 48 h, 53 h, 64 h, 72 h, 88 h y 95 h; y a las 5 h, 12 h, 17 h y 24;
para el hinojo 1 y 2, respectivamente (Albo et al., 2008).
Para el caso de los extractos acuosos de aloe vera 1 y 3, canelo 3, maqui 1 y 3, romero y ortiga la
primera evaluación se realizó a las 5 h, y las siguientes mediciones a las 24 h, 48 h, 72 h y 96 h; y los
extractos de aloe vera 2, canelo 1 y 2, maqui 2, se midieron a las 5 h y luego a las 24 h, 48 h y 72 h (Albo
et al., 2008).
El DL50 fue determinado mediante análisis Probit, utilizado para analizar las respuestas de variables
binomiales mediante la transformación de la curva de dosis-respuesta sigmoidal mediante regresión
lineal, en la cual se puede analizar (Bliss, 1934), utilizando el programa estadístico SPSS, versión 15.0.
Metodología Objetivo específico 2: Evaluar tratamientos en abejas infectadas con esporas de N.
ceranae, según parámetros inmunológicos, tales como: contenido de proteína en la hemolinfa,
presencia de cuerpos grasos, recuento de hemocitos y actividad enzimática en tejidos.
Purficación de esporas de Nosema

Para la purificación de esporas de Nosema, se recolectaron abejas pecoreadoras a partir de colonias
infectadas por N. ceranae previamente verificando por PCR (Martin-Hernández et al., 2007). Aquí se
procedió a macerar 20 abdómenes de abejas adultas utilizando un mortero y se añadió 5 mL de agua
destilada, luego se filtró a través de un papel filtro Whatman N°4 y agregar 2 mL de agua destilada y
retirar del fondo los abdómenes en suspensión y dejar a un lado del filtro a fin de evitar la obstrucción de
la parte inferior. Luego, se centrifugó agregando 10 mL de agua destilada a 800 G a temperatura
ambiente durante 6 minutos (Higes et al., 2007). Después de centrifugar, el sobrenadante se eliminó y el
restante se suspendió en un volumen de 10 mL de agua destilada. Esta operación se repitió tres veces.
Para la tercera centrifugación se recogió las suspensiones en un solo tubo y luego se eliminó el
sobrenadante y suspendió en un volumen de agua destilada deseado. Posteriormente, para conocer la
concentración de esporas en solución se realizó el recuento de esporas usando un hemocitómetro, (5
(OIE, 2008) utilizando un microscopio óptico con un aumento de 400X (Cantwell, 1970), donde se
3
contabilizó 5 cuadrados que representan un volumen de 0,05 mm (5 veces el tamaño de un rectángulo:
longitud 0,25 mm x ancho 0,20 mm x profundidad de 0,20 mm). Este volumen de dilución de la muestra
es utilizado para obtener el número final de esporas, tal como se detalla a continuación:
N° de esporas contadas → 0,005 mm3 (cuenta total del volumen celular)

N° de esporas total (x) → volumen final de suspensión
Ejemplo:
Resultado de recuento: 300 esporas
3
Volumen de suspensión: 10 mL (10000 mm )
6
N° de esporas total: 60 X 10
Inoculación experimental con esporas de Nosema

Una vez determinado el DL50 de los aceites y extractos, se establecieron ensayos con abejas infectadas
y no infectadas para probar el efecto de éstos sobre Nosema.
Aquí se establecieron ensayos con cuatro tratamientos, donde T1: correspondió al aceite o extracto 1; T2:
aceite o extracto 2; T3: control con Nosema (CN) y T4: control sin Nosema (CSN), con 5 repeticiones por
tratamiento y cada uno con 15 abejas por repetición.
Para esto se escogieron marcos de cría operculados colectados de un colmenar experimental no
infectado con Nosema un día antes de la emergencia y se mantuvieron a 33° C en incubadora. Las
abejas recién nacidas se infectaron individualmente con una concentración conocida de esporas por
medio de una micropipeta con esporas de N. ceranae contenidas en una solución azucarada (Alaux et al.,
2009). El primer día (D0) de colocadas las abejas en sus respectivas cajas se procedió a infectarlas con
una solución de esporas en suspensión en una solución de de sacarosa al 50% (50 g de azúcar por 100
mL de agua destilada) colocadas en un alimentador vertical con una concentración final de 30 esporas
por abeja (dosis infecciosa considerada suficiente para que las abejas no mueran en respuesta a una
carga inicial demasiado alta del parásito (Fries, 1988)). Transcurridas 5 h de infección las abejas fueron
alimentadas con jarabe (solución de sacarosa al 50%). Al tercer día (D3) y sexto día (D6) se realizó la
evaluación de la infestación inicial (Higes et al., 2007), diseccionando los intestinos de 2 abejas por
tratamiento con el fin de tener el número promedio de esporas por abeja, incluido el grupo control para
asegurarse que las abejas no mostraran contaminación con Nosema, en caso de una posible
contaminación.
Luego de la infección se aplicaron los aceites a una concentración de 1 µL por abeja en 200 µL de
solución de azúcar (hinojo y poleo) y en los extractos de boldo, maqui, tomillo (1 µg por abeja). Cada
tratamiento se mantuvo con el aceite y extracto por un periodo de 5 h de incubación, y luego las abejas
fueron alimentadas nuevamente con jarabe. Las evaluaciones de infección se realizaron a los 10 (D10) y
13 días (D13) después de infección, con el fin de seguir la evolución de la infección inicial (Higes et al.,
2007; Costa et al., 2010), correspondiendo estos intervalos con diferentes ciclos de desarrollo del
parásito (Fries et al., 2006). La mortalidad por tratamiento se evaluó diariamente hasta el término del
ensayo.
Análisis de la expresión génica de los genes GOX (Glucosa oxidasa) y PO (polifenoloxidasa)

mediante PCR cuantitativo
Para este análisis mediante PCR cuantitativo, se estableció un ensayo para analizar la expresión de los
genes, en donde se dispuso de abejas sanas y enfermas tratadas con extractos naturales y aceites
esenciales. Para ello, se prepararon diferentes tratamientos con tres repeticiones y 20 individuos por
tratamiento.
Al día cero (D0) las abejas fueron colocadas en sus cajas y alimentadas con una solución de sacarosa al
50% con un alimentador vertical. Al tercer día (D3) los tratamiento con abejas enfermas fueron inoculados
con esporas de Nosema de manera individual con una concentración de esporas de 10.000 y con la
ayuda de una micropipeta. Al día 6 (D6) los tratamientos fueron suministrados con sus respectivos
extractos acuosos y aceites esenciales disuelto en una solución de sacarosa por un periodo de 5 h,
posteriormente fueron nuevamente alimentadas con sacarosa. Al noveno día (D9) se retiró una abeja por
tratamiento para los análisis de expresión génica.
Extracción de RNA
La extracción del RNA se llevó a cabo mediante el protocolo de TRIZOL (invitrogen) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Para esto se utilizó una abeja individualmente seleccionada, lavada con
agua con DEPC para evitar contaminación con polen u otros agentes que interfieran con la extracción e
integridad del RNA. Para esto, se sumerge la abeja en 1 mL de TRIZOL, se macera el tejido a
temperatura ambiente. Una vez disuelto todo el tejido se agita en vortex por 30 segundos; se agrega
cloroformo, se incuba a temperatura ambiente por 5 minutos. A continuación se centrifuga a 12000 x g
por 15 minutos a 4ºC en centrífuga refrigerada. Se transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo y se
mezcla con 500 µL de isopropanol frío. Se precipita el RNA a -20ºC por 30 minutos. Luego se centrifuga a
12000 x g por 10 minutos a 4ºC. Se descarta el isopropanol y se lava el pellet de RNA con etanol al 75%
con agua con DEPC. Se centrifuga a 7500 x g por 5 minutos. Se repite el lavado dos veces. Se deja
secar el pellet a temperatura ambiente por 5 minutos y se resuspende el pellet en 50 µL de aguda
desionizada estéril con DEPC. Se confirma la integridad del RNA mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1% en TAE 1X-DEPC.
Cuantificación del RNA

La cuantificación del RNA se realizó mediante análisis fluorométrico utilizando un fluorómetro Qubit 2.0
Invitrogen (Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Síntesis de cDNA mediante RT (transcripción reversa)

Para la síntesis del cDNA se utilizó el RNA de inmediato, una vez extraído y cuantificado. Se utilizaron
0,5 µg de RNA total en todas las muestras para la transcripción reversa. Para este procedimiento se usó
el kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) siguiendo las instrucciones del
facricante.
Reacción de PCR cuantitativo en tiempo real
La reacción se llevó a cabo mediante kit KAPA SYBR FAST qPCR Mster Mix (2x) Universal (KAPA
Biosystems) y partidores oligonucléotidos específicos para los genes b-actina (usado como gen de
referencia) Polifenol Oxidada (PO) y Glucosa Oxidasa (GOX). Las secuencias de los partidores se
muestran a continuación: PO (5-AATCCATTACCTGAAATTGATGCTTAT- 3 y
5´TAATCTTCCAACTAATTCATACGCTCTT-3), GOX (5GAGCGAGGTTTCGAATTGGA-3´) y 5-
GTCGTTCCCCCGAGATTCTT-3) y b-actina (5-ATGCCAACACTGTCCTTTCTGG-3´ y 5-
GACCCACCAATCCATACGGA-3´). La reacción de PCR se lleva a cabo en un volumen de 15 µL de
acuerdo a las instrucciones de kit KAPA SYBR FAST qPCR. Por cada reacción se usa, 6,2 µL de agua
desionizada grado biología molecular; 7,5 µL del MIX 2X Kapa Sybr Fast, 0,1 uM de cada partidor. Se
usó 1 µL de cDNA sin diluir. Las condiciones de la reacción sin 10 minutos de denaturación inicial a 95ºC;
seguido de 40 ciclos de 95°C por 30 segundos, 1 minuto de alineamiento a 59°C y una extensión de 72ºC
por 1 minuto. Las reacciones se realizan por triplicado; y se confirma con una electroforesis en gel de
agarosa, la amplificabilidad, la formación del amplicón, la especificidad, la no existencia de fragmentos
inespecíficos y el tamaño del fragmento esperado.
Determinación de glucosa oxidasa mediante kit enzimático

El Kit de Ensayo de actividad Glucosa Oxidasa (GOx) (Sigma-Aldrich catalogo N° MAK097) proporciona
un procedimiento simple y directo para medir la actividad GOx en una variedad de muestras biológicas.
En este caso se realizó la medición en hemolinfa recientemente colectada de abejas sometidas a
diferentes tratamientos y sin tratamientos (control). La actividad GOx se determinó por un ensayo
enzimático acoplado en el que GOx reduce la D-glucosa, lo que resulta en la producción de peróxido de
hidrógeno (H2O2) que reacciona con otro reactivo (desarrollador) y la enzima peroxidasa (POD) para
generar un producto colorimétrico cuya absorbancia se mide a 570 nm y que es proporcional a la
presencia de GOx.
β-D-Glucosa + O2 + H2O + GOx ⎯⎯⎯⎯→Ácido glucónico + H2O2

H2O2 + desarrollador+ POD ⎯⎯⎯⎯→ Quinona + H2O
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra

ensayada.
Una unidad de GOx se define como la cantidad de enzima que genera 1 pmoles de H2O2 por minuto a
37°C. El kit es suficiente para 100 ensayos en placas de 96 pocillos y debe ser almacenado lejos de la luz
y a -20 grados.
Metodología ensayo GOX

1. Configure las mezclas de reacción según el esquema en el Cuadro 1. Para cada reacción se necesitan
50 μL de la mezcla de reacción apropiada por pocillo.
Cuadro 1.Mezclas de reacción.

Reactivos Muestras y Estándares Muestra blanco
Buffer ensayo GOx 36 μL 46 μL
Desarrollador color GOx 2 μL 2 μL
Sustrato GOx 10 μL -
2. Se prepara curva estándar usando patrones de H2O2 a concentraciones entre 0 (control), 1, 2, 3, 4 y 5
nmoles/pocillo. Complete a 50 μL el volumen de reacción de mezcla para cada pocillo. Mezclar bien
usando un agitador horizontal o por pipeteado.
3. Pasado 5 minutos, tome la medición inicial (Tinicial). Para los ensayos colorimétricos, medir la
absorbancia a 570 nm (A570)inicial.
4. Incube la placa a 37 °C haciendo mediciones (A570) cada 3 minutos durante 30minutos. Proteja la placa
de la luz durante la incubación.
5. Siga tomando mediciones hasta que la absorbancia de la muestra más activa sea mayor que la
absorbancia del patrón de mayor concentración (10 nmol / pocillo). En ese momento, la muestra más
activa está cerca o supera el final del intervalo lineal de la curva de calibración preparada con los
estándares.
6. La medición final (A570) para el cálculo de la actividad de la enzima será la penúltima lectura o el valor
antes de que la más muestra activa esté cerca o supere la absorbancia de la concentración de 5 nmol,
que corresponde al rango linear de la curva de calibración. Consulte el paso 5. El tiempo de la penúltima
lectura es Tfinal (entre 20-40 min generalmente).
Es esencial que la medición final caiga dentro del intervalo lineal de la curva estándar. La curva estándar
debe configurarse cada vez que se realiza el ensayo.
Cálculos
Las correcciones del valor del blanco se realizó restando la medición (A570)final obtenida para el control de
las mediciones finales de cada estándar. Con estos valores se construye un gráfico para determinar el
coeficiente de correlación de los valores obtenidos y la ecuación para extrapolar los datos de las
muestras a analizar.
Calcular el cambio o variación en la medición de absorbancia inicial y final para las muestras y blancos de
muestra.
ΔA576 = (A570)inicial- (A570)final
Se toman estos valores y se interpolan en la curva de calibración preparada con los estándares para
obtener las concentraciones adecuadas de H2O2 en cada caso.
La actividad Glucosa Oxidasa de una muestra puede ser determinada por la siguiente ecuación:
Actividad GOx = B x Factor de dilución de la muestra / Tiempo de reacción x V
Donde:
B = Cantidad (nmol) de H2O2 generada entre el Tinicial y Tfinal

Tiempo de reacción = Tinicial - Tfinal (minutos)
V = volumen de la muestra (mL) añadido a pocillo.
Actividad GOx se informa como nmol / min / ml = miliunidades/mL
Una unidad de GOx se define como la cantidad de enzima que genera 1 pmoles de H2O2 por minuto a
37°C.
Determinación de polifenol oxidasa (PO), mediante kit enzimático
Tratamiento y almacenamiento de muestras

Centrifugar las muestras durante 20 minutos a 1000xg. Retire las partículas y realice el análisis
inmediatamente o almacene las muestras en alícuota a -20°C o -80ºC para su uso posterior. Evite
congelar y descongelar en forma repetida.
Las muestras que se utilizarán dentro de los 5 días se pueden almacenar a 4°C, de lo contrario las
muestras deben ser almacenadas a -20 °C (≤ 1 mes) o -80 °C (≤ 2 meses) para evitar la pérdida de
bioactividad y contaminación.
Al realizar el ensayo, mantener las muestras a temperatura ambiente.
1. Lleve todos los componentes del kit y muestras a temperatura ambiente (18-25°C) antes de su uso.
Preparación de la muestra
Para muestras de tejidos:

Pesar 0,1 g de muestra, homogenizar con 1 mL de extractante sobre hielo, centrifugar a 8000g a 4°C por
10 minutos, tomar el sobrenadante y guardar en otro tubo mantener en hielo hasta realizar el análisis.
Para muestras de hemolinfa:

Agregar 0,1 mL de muestra en 1 mL de extractante sobre hielo, centrifugar a 8000g a 4°C por 10 minutos,
tomar el sobrenadante y guardar en otro tubo mantener en hielo hasta realizar el análisis.
Procedimiento
Agregar los reactivos de acuerdo al esquema siguiente
Reactivo Experimento Control
Reactivo I 200 uL 200 uL

Reactivo II 50 uL 50 uL
Muestra 50 uL -
Mezclar, dejar a 25°C por 10 minutos, colocar en hielo inmediatamente
Reactivo III 100uL 100uL
Mezclar, centrifugar a 10000g por 10 minutos, extraer el sobrenadante colocarlo en un nuevo tubo,
tomar 200 uL, registrar la absorbancia medida a 525nm
Cálculos:
Definición de unidad (U)= una unidad está definida como el valor de la densidad óptica que cambia 0,005
en el sistema de reacción.
PPO en tejidos
1. De acuerdo a la concentración de proteínas
PPOU/mg prt = 400/50/10/0.005X(DO muestra –D O control)/Cpr

=160X (DO muestra –DO control)/Cpr
Cpr: concentración de proteína, mg/ml
2. De acuerdo al peso fresco de la muestra
PPOU/g mtra = 400/50/10/0.005X(DO muestra –D O control)/gr

=160X (DO muestra –DO control)/ gr
PPO en hemolinfa
PPOU/ml = 400/50/10/0.005X(DO muestra –D O control)/V muestra

=160X (DO muestra –DO control)/V muestra
V = volumen de muestra en mL
Contenido de cuerpos grasos

Las grasas son las reservas de proteínas del cuerpo (incluyendo las proteínas anti-patógenos), lípidos y
azúcares que se encuentran en el interior de los anillos abdominales.
Para determinar el cambio de volumen del cuerpo en las abejas en respuesta a la infección con Nosema,
se pesó cada abdomen de abeja recolectado en un tubo eppendorf una vez extraído los intestinos para el
seguimiento de la infección.
Los tubos eppendorf se colocaron en un horno a temperatura de 40°C durante 3 días para secar los
abdómenes. Posteriormente, los abdómenes fueron pesados y lavados con solución de éter etílico
durante 24 h para disolver las células que constituyen las grasas. La cuantificación de la grasa se calculó
por diferencia de peso antes y después de la disolución del éter etílico (Wilson-Rich et al., 2008).
Para la evaluación de este parámetro se estableció un ensayo con 4 tratamientos donde T1: correspondió
al aceite o extracto 1 más abejas con Nosema; T2: aceite o extracto 2 más abejas con Nosema; T3:
control con Nosema (CN) y T4: control sin Nosema (CSN), con 5 repeticiones por tratamiento y cada uno
con 15 abejas por repetición. Después de aplicados los tratamientos, las evaluaciones se hicieron a los 3,
6, 10 y 13 días después de aplicados los aceites o extractos.
Extracción de la hemolinfa
Se procedió a extraer 1 µL de hemofinfa de cada insecto (una abeja por tratamiento y repetición)
mediante la siguiente metodología:
1. Se toman las abejas y colocan en frascos debidamente individualizados, se llevan a un freezer

para así anestesiarlas a través de un choque térmico, esto durante 1,5 minutos
aproximadamente, ya que hay que ir revisándolas para que no se vayan a congelar.
2. Seguidamente se toma una abeja y le extraemos una de sus alas, la extracción se hace en
sentido contrario a las alas (hacia arriba), apretando suavemente con la pinza la región torácica
para extraer la hemolinfa, todo este procedimiento se realiza bajo una lupa estereoscópica
(Figura 1).
Figura 1. La foto de la izquierda muestra la extraccion del ala de la abeja y en la foto de la derecha
muestra la extracción de la hemolinfa de la abeja.
3. Una vez extraída la hemolinfa mediante la micropipeta (1 µL), ésta se deposita en un tubo de
eppendorf montados sobre hielo frappe para evitar la melanización de la hemolinfa (Figura 2).
Figura 2. Hielo frappe con el rack de tubos de eppendorf para evitar la melanización de la hemolinfa.
Disolver safranina en agua destilada estéril, la cantidad de safranina básica no es pesada, pero tiene que
quedar un color rojo más o menos intenso, este preparado puede durar bastante tiempo en refrigerador,
la dilución de la hemolinfa se realiza 1:10, es decir se agrega 9 µL de safranina a la muestra de hemolinfa
(1 µL) (Figura 3). Las muestras duran un periodo máximo de 1 semana refrigerada a 4°C.
Figura 3. La foto de la izquierda, muestra la toma de 9 µL de safranina y la de la izquierda agregando la
hemolinfa.
Una vez obtenidas las muestras de hemolinfa y posterior dilución de éstas con safranina (1:10),
procedemos a realizar el conteo de hemocitos.
Conteo de hemocitos
Para medir la producción de hemocitos se procedió a realizar el conteo total de hemocitos (CTH) a partir
de la mezcla hemolinfa/safranina siendo determinado mediante la utilización de una cámara de Neubauer
Bright Line y un microscopio de contraste (x 1000) (Alaux et al., 2010a; 2010b) utilizando la fórmula de
Jones (1962):
-3
CTH (células mm ) = α * β * ƴ
δ
Dónde:
α = número de hemocitos en 5 cuadrantes de 1 mm
β = Factor de dilución
ƴ = Factor de profundidad de la cámara
δ = Número de cuadrantes contados
Para la preparación de la muestra al microscopio y posterior conteo de hemocitos el procedimiento es el

siguiente:
1. Limpiar la cámara de Neubauer, seguidamente depositamos 5 µL de la dilución (hemolinfa +

safranina) en cada gradilla de la cámara de neubauer (superior e inferior), para realizar un conteo
doble y luego sacar un promedio (Figura 4).
2. Colocar un cubreobjeto en la cámara y esperamos unos segundos para que los hemocitos se
posen.
3. Luego se observa la muestra en el microscopio de contraste de fase, enfocando con el ocular 40x
y procedemos a realizar el conteo.
4. Para contar los hemocitos se realiza en 5 cuadrantes de 1 mm² (2 cuadrantes superiores de los
extremos, 2 cuadrantes inferiores de los extremos y el cuadrante central) en ambas gradillas del
hematocitometro (Figura 5).
Figura 4. A la derecha hematocitometro con 5 µL de la dilución por cada cara y la foto de la izquierda
muestra el microscopio junto al hematocitometro haciendo el conteo de hemocitos.
Figura 5. Conteo de hemocitos en muestras de abejas.

ANEXOS 2 TRAZABILIDAD EXTRACTOS NATURALES
Ficha registro de trazabilidad extractos acuosos
Registro de origen y entrada de las materias primas

Alcacho Aloe Aloe Canelo Limón Maqui Matico Ortiga Quillay Romero
fa vera vera
cáscara
Nombre Cynara Aloe Aloe Drimys Citrus × Aristoteli Buddleja Urtica Quillaja Rosmari
científico cardunc vera (L.) vera (L.) winteri limon a globosa dioica L. saponari nus
ulus var. Burm.f., Burm.f., J.R.Forst (L.) chilensis Hope a Molina officinali
scolymu 1768 1768 .& Burm.f., (Molina) s L., Sp.
s G.Forst. Fl. Stuntz Pl.,1, 23,
1776 Indica, 1914 1753
173,
1768,
non
Osbeck,
Reise
Ostindie
n, 250,
1765.
Colector Raúl Carlos Carlos Raúl Daniela Raúl Raúl Raúl Daniela Raúl
materia Flores Insunza Insunza Flores Nuñez Flores Flores Flores Nuñez Flores
prima
(nombre
persona, Alumno Alumno Alumna Alumna
cargo) Equipo tesista tesista Equipo tesista Equipo Equipo Equipo tesista Equipo
técnico técnico técnico técnico técnico técnico
Materia Hojas Hojas Cascara Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas
prima
extraída
(parte de
la planta)
Estado vegetativ vegetativ vegetativ vegetativ vegetativ vegetativ vegetativ vegetativ vegetativ vegetativ
fenológic o o o o o o o o o o
o en que
se
encontra
ba
Material Huerta Huerta Huerta Silvestre Huerta Silvestre Silvestre Silvestre Silvestre Silvestre
silvestre casera casera casera Jardín casera UCT Huerta Huerta
o domicilia domicilia domicilia botánico domicilia casera casera
cultivado ria ria ria UCT ria domicilia domicilia
(si es ria ria
cultivado
especific
ar
prácticas
de
cultivo)
Manejo Tijeras cuchillo Cuchillo Tijeras Tijeras Tijeras Tijeras Tijeras Tijeras Tijeras
de
extracció
n (tijeras,
machete,
mano,
etc.)
Almacen Bolsa de plástico plástico Bolsa de Bolsa de Bolsa de Bolsa de Bolsa de Bolsa de Bolsa de
amiento papel papel papel papel papel papel papel papel
en
campo
(bolsa
papel,
plástico,
caja)
Cantidad 500grs 1000g 500g 500g 500g 500g 500g 500g 500g 500g
material
colectado
Fecha de 30 29 Julio 29 Julio 20 julio 22 julio 20 julio 13 nov 20 julio 24 julio 29 julio
colecta agosto 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014
2014
Hora de 9 am 9 am 9 am 10 am 9 am 15pm 11 pm 9 am 9 am 9 am
colecta
Lugar de Temuco Rancagu Temuco Labranz Universi Temuco Temuco Rancagu Temuco
colecta Región a Región a región dad Región Región a Región
(lugar, Araucaní Región Araucaní Araucaní Católica Araucaní Araucaní Región Araucaní
ciudad, a del a a de a a del a
región, Libertad Temuco Libertad
país) or or
General General
Bernard Bernard
o o
O'Higgin O'Higgin
s. s.
Lugar de Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger
almacen ación ación ación ación ación ación ación ación ación ación
amiento 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C 4°C
Equipo Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger
de ador ador ador ador ador ador ador ador ador ador
almacen
amiento
Fecha de 30 29 Julio 29 Julio 20 julio 22 julio 20 julio 13nov 20 julio 24 julio 29 julio
almacen agosto 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014
amiento 2014
Hora de 12pm 11am 10am 11am 11am 17pm 17pm 16pm 17pm 16pm
almacen
amiento
Tiempo Se Se Se Se Se Se Se Se Se Se
de procesó procesó procesó procesó procesó procesó procesó procesó procesó procesó
almacen inmediat inmediat inmediat inmediat inmediat inmediat inmediat inmediat inmediat inmediat
amiento amente amente amente amente amente amente amente amente amente amente
una vez
ingresad
a al
laborator
io
Registro de los datos de producción
Alcacho Aloe Aloe Canelo Limón Maqui Matico Ortiga Quillay Romero
fa vera vera
cáscara
Nombre Cynara Aloe Aloe Drimys Citrus × Aristoteli Buddleja Urtica Quillaja Rosmari
científico cardunc vera (L.) vera (L.) winteri limon a globosa dioica L. saponari nus
ulus var. Burm.f., Burm.f., J.R.Fors (L.) chilensis Hope a Molina officinali
scolymu 1768 1768 t. & Burm.f., (Molina) s L., Sp.
s G.Forst. Fl. Stuntz Pl.,1, 23,
1776 Indica, 1914 1753
173,
1768,
non
Osbeck,
Reise
Ostindie
n, 250,
1765.
Materia Hojas Hojas Cascara Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas Hojas
prima
procesada
(parte de
la planta)
Elaborador M Isabel M Isabel M Isabel M Isabel M Isabel M Isabel M Isabel M Isabel M Isabel M Isabel
del Martínez Martínez Martínez Martínez Martínez Martínez Martínez Martínez Martínez Martínez
producto Químico Químico Químico Químico Químico Químico Químico Químico Químico Químico
(nombre encarga encargad encarga encarga encarga encarga encarga encarga encarga encarga
persona, da a da da da da da da da da
cargo) laborator laboratori laborator laborator laborator laborator laborator laborator laborator laborator
io o io io io io io io io io
Manejo de Lavado, Lavado, Lavado, Lavado, Lavado, Lavado, Lavado, Lavado, Lavado, Lavado,
elaboració troceado descasc troceado troceado troceado troceado troceado troceado troceado troceado
n , molido arado , molido , molido , molido , molido , molido , molido , molido , molido
(descongel escaldad troceado, escaldad escaldad escaldad escaldad escaldad escaldad escaldad escaldad
ado, o molido o o o o o o o o
troceado, macerad escaldad macerad macerad macerad macerad macerad macerad macerad macerad
congelado, o en o o en o en o en o en o en o en o en o en
lavado, agua macerad agua agua agua agua agua agua agua agua
macerado) destilada o en destilada destilada destilada destilada destilada destilada destilada destilada
a 70°C agua a 70°C a 70°C a 70°C a 70°C a 70°C a 70°C a 70°C a 70°C
Filtrado destilada Filtrado Filtrado Filtrado Filtrado Filtrado Filtrado Filtrado Filtrado
papel a 70°C papel papel papel papel papel papel papel papel
filtro N°1 Filtrado filtro N°1 filtro N°1 filtro N°1 filtro N°1 filtro N°1 filtro N°1 filtro N°1 filtro N°1
en papel en en en en en en en en
bomba filtro N°1 bomba bomba bomba bomba bomba bomba bomba bomba
de vacío en de vacío de vacío de vacío de vacío de vacío de vacío de vacío de vacío
bomba
de vacío
Almacena Frascos Frascos Frascos Frascos Frascos Frascos Frascos Frascos Frascos Frascos
miento de vidrio de vidrio de vidrio de vidrio de vidrio de vidrio de vidrio de vidrio de vidrio de vidrio
extracto
(bolsa
papel,
plástico,
caja,
vidrio)
Condicione ultra ultra ultra ultra ultra ultra ultra ultra ultra ultra
s de congela congelad congela congela congela congela congela congela congela congela
almacena dor a or a dor a dor a dor a dor a dor a dor a dor a dor a
miento (T°, menos menos menos menos menos menos menos menos menos menos
H°) 80°C 80°C 80°C 80°C 80°C 80°C 80°C 80°C 80°C 80°C
Cantidad 500ml 500ml 500ml 500ml 500ml 500ml 500ml 500ml 500ml 500ml
extracto
para
liofilizar
Cantidad 40gr 10gr 40gr 60gr 40gr 40gr 35gr 10gr 40gr 40gr
extracto
liofilizado
Fecha de 3 sept 8 agosto 8 agosto 31 julio 8 agosto 31 julio 17 11 8 agosto 8 agosto 8 agosto
elaboració 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014
n
Hora de
elaboració
n
Lugar de Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato
elaboració rio rio rio rio rio rio rio rio rio rio
n Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol
(laboratori ogía ogía ogía ogía ogía ogía ogía ogía ogía ogía
o)
Tiempo de 4 días 4 días 4 días 4 días 4 días 4 días 4 días 4 días 4 días 4 días
elaboració
n
(liofilizado)
Lugar de Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato Laborato
almacena rio rio rio rio rio rio rio rio rio rio
miento Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol Bromatol
ogía ogía ogía ogía ogía ogía ogía ogía ogía ogía
Equipo de Refriger Refrigera Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger Refriger
elaboració ador, dor, ador, ador, ador, ador, ador, ador, ador, ador,
n (modelo Licuador Licuador Licuador Licuador Licuador Licuador Licuador Licuador Licuador Licuador
y marca) a, a, bomba a, a, a, a, a, a, a, a,
bomba de vacío, bomba bomba bomba bomba bomba bomba bomba bomba
de ultra de de de de de de de de
vacío, congelad vacío, vacío, vacío, vacío, vacío, vacío, vacío, vacío,
ultra or , ultra ultra ultra ultra ultra ultra ultra ultra
congela Liofilizad congela congela congela congela congela congela congela congela
dor , or dor , dor , dor , dor , dor , dor , dor , dor ,
Liofilizad Liofilizad Liofilizad Liofilizad Liofilizad Liofilizad Liofilizad Liofilizad Liofilizad
or or or or or or or or or
Fecha de 3 sept 8 agosto 8 agosto 31 julio 8 agosto 31 julio 17 11 8 agosto 8 agosto 8 agosto
almacena 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014 2014
miento
Hora de 10 am 10am 10am 9am 10am 9am 10am 10am 10am 10am
almacena
miento
Tiempo de 6 7meses 7meses 7meses 7 meses 7 meses 5 meses 7 meses 7 meses 7 meses
almacena meses
miento
Destino del laborator laboratori laborator laborator laborator laborator laborator laborator laborator laborator
extracto io o io io io io io io io io
ANEXO 3 RESULTADOS
Resultados presencia Nosema Región de La Araucanía y Región del Bio Bio

En general, se observa que la presencia de Nosema se concentra principalmente en las comunas de
Pitrufquen y Padre las casas, en tanto las comunas con menos presencia de Nosema son Nueva Imperial
y Carahue Gorbea, mientras que Gorbea no tiene presencia de la enfermedad, no obstante el número de
muestras evaluadas en esta comuna es muy bajo, por lo que podría ser un factor de su baja presencia
(Cuadro 1).
En relación a la presencia de Nosema en las regiones, se observa que la VIII Región tiene la prevalencia
más alta en relación a la Región de La Araucanía (Cuadro 1).
Cuadro 1. Resumen de prevalencia Nosema sp. por comuna en la Región de La Araucanía y Región del
Bío Bío.
Comuna Código Prevalencia (%) Negativas (%)
Pitrufquén 14 72,73 27,27

Freire 5 28,95 71,05
Gorbea 7 0,00 100,00
Loncoche 9 25,00 75,00
Carahue 1 18,75 81,25
Nueva Imperial 11 18,18 81,82
Cunco 3 33,33 66,67
Padre Las Casas 12 66,67 33,33
IX Región 36,11 63,89
VIII Región 8 56,00 44,00
Determinación de Nosema ceranae mediante PCR

Una vez realizada las extracciones de ADN de las muestras de abejas para la determinación de Nosema
sp., se procedió a realizar PCR. En la Figura 2 se muestran las productos de PCR positivos para la
detección de N. ceranae en muestras de macerado intestinal de abeja, de acuerdo a las condiciones
antes descritas.
Detección de N. ceranae mediante PCR.

Resultados dosis letal DL50
A continuación se muestran los resultados de los DL50 de los aceites esenciales y extractos acuosos
utilizados en el proyecto.
Cuadro 2. Dosis DL50 aceites esenciales.

Dosis (µL/abeja)
Aceite esencial
24 h Error típico 48 h Error típico
Boldo 100,39 0,663 65,726 0,584
Ciprés 0,712 0,11 0,523 0,118
Eucaliptus 1 0,02 1,155 0,023 1,138
Eucaliptus 2 2522,5 0,466 1817,4 0,404
Hinojo 1* - - - -
Hinojo 2** 4,77 0,57 - -
Menta 0,762 0,116 0,527 0,121
Poleo 0,808 0,112 0,523 0,127
Romero 1,006 0,146 0,97 0,143
Tomillo 1 0,079 0,117 0,05 0,138
Tomillo 2 0,376 0,274 0,27 0,281
* Con las dosis utilizadas (muy bajas) no hubo DL50
** Con dosis más altas los individuos comenzaron a morir a las 12 h, a las 48 h ya había muerto el 100%.
Cuadro 3. Dosis DL50 extractos acuosos.

Dosis (µg/abeja)
Extractos acuosos
Alcachofa hoja 0,011 0,227 0,029 0,213
Aloe vera 1* - - - -
Aloe vera 2 0 0,204 0,001 0,179
Aloe vera 3 0,026 0,274 0,042 0,226
Aloe vera 4 3303,2 0,151 484,537 0,146
Canelo 1 0 0,335 0,006 0,209
Canelo 2 0,007 0,568 0,039 0,464
Canelo 3 0 0,864 0 0,546
Canelo 4* - - - - -
58 36
Limón 1,52 x 10 1,67 2,8 x 10 1,205
Maqui 1 341,876 1,477 53,701 0,835
Maqui 2 0,018 0,385 0,046 0,221
Maqui 3 0 0,557 0 0,536
Matico hoja 0 0,194 0 0,185
Orego Stim 194647,43 0,132 4909,309 0,105
Quillay 0 0,146 0 0,143
Romero 1379,909 0,362 1176,116 0,383
Ortiga 719,402 0,41 242,043 0,32
* No se calculó variable DL50 por dependencia lineal de covariables
Cuadro 4. Dosis DL50 EPA/DHA.
Dosis (µg/abeja)
Extractos acuosos
EPA/DHA 3624 0 0,214 0 0,197
EPA/DHA 3624 0 0,147 0 0,129
Cuadro 5. Dosis DL50 glucano

Dosis (µL/abeja)
Glucano
Cebada 0,002 3,630 0,063 0,456
Levadura 0,006 0,590 0,044 0,268
Extracto de pino 0 0,133 0 0,098
Cuadro 6. Dosis DL50 quitosano

Dosis (µL/abeja)
Quitosano
Quitosano 8,585 0,257 8,585 0,257
Resultados dosis letal DL1

A continuación se muestran los resultados de los DL1 de los aceites esenciales y extractos acuosos
utilizados en el proyecto.
Cuadro 7. Dosis DL1 aceites esenciales.

Dosis (µL/abeja)
Aceite esencial
Eucaliptus 1 0,182 1,168 0,209 1,152
Eucaliptus 2 0,000 0,203 0,000 0,201
Romero 0,406 0,147 0,392 0,144
* Con las dosis utilizadas (muy bajas) no hubo DL1
** Con dosis más altas los individuos comenzaron a morir a las 12 h, a las 48 h ya había muerto el 100%.
Cuadro 8. Dosis DL1 extractos acuosos.

Dosis (µg/abeja)
Extractos acuosos
Limón No se puede No se puede
Maqui 1 0,054 1,881 0,008 1,053
Maqui 2 11,084 0,385 27,949 0,221
Maqui 3 75,237 0,551 119,508 0,529
Matico hoja 11.472.660 0,194 154.698.423 0,186
Ortiga 1,365 0,410 0,459 0,320
25 32
Quillay 2,26x10 0,876 4,96x10 0,529
Romero 2,427 0,363 2,096 0,387
* No se calculó variable DL1 por dependencia lineal de covariables
Cuadro 9. Dosis DL1 glucano
Dosis (µL/abeja)
Aceite esencial
Cebada 0,082 3,630 2,915 0,456
Levadura 0,538 3,632
Cuadro 10. Dosis DL1 quitosano

Dosis (µL/abeja)
Quitosano
1,117 0,257 1,117 0,257
Resultados parámetros inmunológicos
Resultados actividad fenoloxidasa (PO) y glucosa oxidasa (GOX) mediante expresión génica
Evaluación de enzima polifenoloxidasa (PO)

En la Figura 1, se presenta la batería de tratamientos utilizados en este ensayo, tales como, extractos
acuosos: T1: canelo, T2: Aloe vera pulpa, T3: Matico, T4: romero y los controles: T0: abeja sana y T0/N:
abeja con Nosema. Se observa que ninguno de los tratamientos ayudo significativamente con aumentar
la expresión génica de la enzima Polifenol oxidasa (PO) de las abejas ya sean sanas o enfermas y con el
tratamiento.
En el caso de T4 (extracto de romero) se ve un leve aumento para alcanzar el valor basal de abejas
sanas, sin embargo este tratamiento no logra ser similar o superior.
Figura 1. Expresión génica de la actividad fenoloxidasa (PO) en abejas sanas e infectadas con N.
ceranae, tratadas con extractos acuosos. T0: abeja sana; T0N: abeja con Nosema; T1: abeja sana
tratada con canelo; T1N: abeja con Nosema tratada con canelo; T2: abeja sana con pulpa de aloe vera;
T2N: abeja con Nosema con pulpa de aloe vera; T3: abeja sana con matico; T3N: abeja con Nosema y
matico; T4: abeja sana con romero; T4N: abeja con Nosema con romero.
El mismo ensayo para evaluar la expresión génica de la PO en abejas sanas, enferma con el patógeno N.
ceranae y sus respectivos tratamientos a base de extractos acuosos se observan en la Figura 2.
Al comparar T5: limón, T6: alcachofa, T7: cascara de aloe vera, T8: ciprés (aceite esencial), destaca
claramente como único tratamiento que aumenta la expresión génica de la PO el tratamiento T6N:
alcachofa en abejas infectadas con Nosema sobre el valor basal de abejas sanas sin infección del
patógeno. También destacan aunque con valore inferiores el tratamiento T8 y T8N correspondientes a
abejas sanas con ciprés y abejas enfermas con ciprés respectivamente, como los único tratamientos que
se acercan más próximamente al valor basal.
tratada con limón; T5N: abeja con Nosema tratada con limón; T6: abeja sana con alcachofa; T6N: abeja
con Nosema con alcachofa; T7: abeja sana con cáscara de aloe vera; T7N: abeja con Nosema tratada
con cáscara de Aloe vera; T8: abeja sana aceite esencial de ciprés; T8N: abeja con Nosema con aceite
esencial de ciprés.
Para la evaluación de la enzima PO y los respectivos tratamientos, se puede observar que todos están
bajo el valor basal de abejas sanas e inclusive bajo el valor de abejas enfermas con Nosema (Figura 3).
Los tratamientos evaluados son aceites esenciales: T9: menta, T10: poleo, T11: romero, T12: hinojo, T13:
eucaliptus. Solo T13 destaca como levemente superior pero no alcanza el nivel basal de abejas sanas en
la expresión génica de la enzima PO. T11/N sube la expresión al compáralo con T11: abeja sana con
tratamiento al igual que T10/N con respecto a T10.
tratada con aceite esencial de menta; T9N: abeja con Nosema tratada con aceite esencial de menta; T10:
abeja sana con aceite esencial de poleo; T10N: abeja con Nosema con aceite esencial de poleo; T11:
abeja sana con aceite esencial de romero; T11N: abeja con Nosema con aceite esencial de romero; T12:
abeja sana aceite esencial de hinojo; T12N: abeja con Nosema con aceite esencial de hinojo; T13: abeja
sana aceite esencial de eucaliptus; T13N: abeja con Nosema con aceite esencial de eucaliptus.
Evaluación de enzima glucosa oxidasa (GOX)

Para evaluar la acción de la GOX en abejas sanas, enferma con Nosema y sus respectivos tratamientos
con aplicaciones de productos, se puede observar en la Figura 4 que el T3: extracto matico, T4: extracto
romero, donde Matico potencia la expresión de GOX cuando la abeja está sana, sin embargo abejas con
Nosema y tratadas con maticos su expresión de GOX se ve fuertemente disminuida simulara a abejas
enfermas sin tratamiento. De igual forma ocurre con extracto de romero, producto eleva la expresión de
GOX solo en abejas sanas y la deprime fuertemente en abejas con Nosema.
Figura 4. Expresión génica de la actividad glucosa oxidasa (GOX) en abejas sanas e infectadas con N.
tratada con canelo; T1N: abeja con Nosema tratada con canelo; T2: abeja sana con pulpa de aloe vera;
T2N: abeja con Nosema con pulpa de aloe vera; T3: abeja sana con matico; T3N: abeja con Nosema con
matico; T4: abeja sana con romero; T4N: abeja con Nosema con romero.
En la Figura 5 se puede observar donde destaca el T13: aceite esencial de eucaliptus aplicado en abeja
sana, no así al aplicarlo sobre abejas infectadas con Nosema donde la expresión del GOx baja.
Los aceites que potencia la expresión del GOX en abejas con nosema son T10: poleo T11: romero y T12:
hinojo, los 3 son aceites esenciales.
ceranae, tratadas con extractos acuosos. T0: abeja sana; T0N: abeja con Nosema; T10: abeja sana con
aceite esencial de poleo; T10N: abeja con Nosema con aceite esencial de poleo; T11: abeja sana con
aceite esencial de romero; T11N: abeja con Nosema con aceite esencial de romero; T12: abeja sana
aceite esencial de hinojo; T12N: abeja con Nosema con aceite esencial de hinojo; T13: abeja sana aceite
esencial de eucaliptus; T13N: abeja con Nosema con aceite esencial de eucaliptus.
Evaluación de péptidos antimicrobianos Himenoptecina

Se puede observar (Figura 6), primero que todo un aumento de la expresión de la Himenoptecina cuando
las abejas están infectadas con Nosema T0N, a su vez hay un aumento significativo en la expresión del
péptido antimicrobiano cundo se aplica el tratamiento T3N: extracto de matico en abejas con esporas
igual que T4 y T4N: extracto de romero en abejas infectadas con Josema. T5N: extracto de limón en
abejas infectadas con Nosema y en T13N: aceite esencial de eucaliptus en abejas infectadas con
Nosema.
Figura 6. Evaluación de péptidos antimicrobianos Himenoptecina en abejas sanas e infectadas con N.
ceranae, tratadas con extractos acuosos. T0: abeja sana; T0N: abeja con Nosema; T3: abeja sana con
matico; T3N: abeja con Nosema con matico; T4: abeja sana con romero; T4N: abeja con Nosema con
romero. T11: abeja sana con aceite esencial de romero; T11N: abeja con Nosema con aceite esencial de
romero; T13: abeja sana aceite esencial de eucaliptus; T13N: abeja con Nosema con aceite esencial de
eucaliptus.
Se puede observar que la infección de abejas con N. ceranae produce cambios significativos en la
expresión del ARNm abaecin, disminuyendo significativamente a los 7 días después de la infección por
N. ceranae la expresión de abaecin en comparación a los controles. Por su parte, la expresión de
defensina no tuvo cambios después de la infección con N. ceranae. Para el caso del ARNm
hymenoptaecin, N. ceranae disminuyó la expresión de éste en comparación con abejas infectadas con N.
apis, mientras que los niveles de ARNm de feniloxidasa no fueron afectados por la infección de N.
ceranae (Antúnez et al., 2009).
Al parecer N. ceranae parece suprimir la respuesta inmune mediante la reducción de la transcripción de
algunos de estos genes (Antúnez et al., 2009). Mientras que Higes et al. (2007) reportaron que la
infección con N. ceranae no afectó la expresión de los péptidos antibacterianos 4 días después de la
infección con este parásito, a pesar de que el patógeno ya había invadido el epitelio ventricular. Sin
embargo, 7 días después de la infección la expresión de abaecin e hymenoptaecin disminuyen de
manera significativa, lo que sugiere que N. ceranae suprime parcialmente los mecanismos de defensa
humoral y celular (Antúnez et al., 2009).
Chaimanee et al. (2012) observaron que los niveles de transcripción de la defensina y abaecin en abejas
-1
inoculadas con 106 esporas mL de N. ceranae eran más bajos que los controles después de 3, 6 y 12
días de inoculación y los niveles de ARNm de apidaecin e hymenoptaecin se suprimieron
significativamente en comparación a los controles.
En un nuevo ensayo de evaluación de GOX y PO:

En este caso la expresión en el gen de la glucosa oxidasa y PO para la abeja enferma infectada (T0N)
está claramente suprimida, tomando como referencia el valor 1,0 para la abeja sana (T0). Para las abejas
tratadas (T3), la expresión de ambos genes es mayor a una abeja enferma y en el caso de gox superior a
una abeja sana (Figura 7).
T0: corresponde a abeja sana, luego T0N abejas infectadas con Nosema se observa la dismunución dela
expersion genica para las enzimas GOX y PO. Al aplicar el tratamiento T3: extracto demaui se observa
un aumneto de la expersion genica en 1,18 veces con respecto a las abejas sanas.
Para los aceites T5:tomillo y T7:boldo no hay una respuesta se aumento significativo con relacion a
abejas sanas, solo levemente mayor que con la expresión en abejas infectadas con Nosema en caso de
la expresion de la enzima GOX.
Figura 7. Patrón de expresión del gen GOX (glucosa oxidasa) y PO (Fenoloxidasa) en las muestras
analizadas, tratadas con extractos acuosos. T0: abeja sana; T0N: abeja con Nosema; T3: abeja sana con
extracto de maqui; T3N: abeja con Nosema con extracto de maqui; T5: abeja sana con aceite esencial de
tomillo; T5N: abeja con Nosema con aceite esencial de tomillo; T7: abeja sana aceite esencial de boldo;
T7N: abeja con Nosema con aceite esencial de boldo.
Evaluación GOX
Se puede observar T5: extracto de ortiga en abeja sana y T6: extracto de ortiga en abeja con Nosema
como en ambos casos existe un aumento de la expresión génica. Siendo este producto una buen
potenciador de la expresión de la enzima GOX (Figura 8).
En el caso de T7: extracto de quillay también presenta un aumento de la expresión génica de la enzima
GOX en abeja sana que es significativo, no así en abeja infectada con Nosema donde la expresión es
levemente superior a una abeja enferma sin tratamiento.
ceranae, tratadas con extractos acuosos. 1: abeja sana; 2: abeja con Nosema; 3: abeja sana con romero;
4: abeja con Nosema con romero; 5: abeja sana con ortiga; 6: abeja con Nosema con ortiga; 7: abeja
sana con quillay; 8: abeja con Nosema y quillay.
Ensayo péptido antimicrobianos

Los péptidos antimicrobianos evaluado fueron: Abaecina y defensina (Figura 9), donde N. ceranea
disminuye significativamente la expresión de estos dos lo cual se puede observar en T0/N: abejas con
Nosema. Destaca T2: extracto de ortiga el cual aumenta la expresión de ambos péptidos antimicrobianos
(Abaecina y defensina) al ser aplicados en abeja sana, no ocurre lo mismo al aplicarlos en abejas
infectadas con Nosema. En el caso del extracto de quillay T3 se observa aumento de la expresión de
defensina en relación a abejas sin tratamiento y a un aumento mucho más significativo del uso del mismo
extracto sobre abejas infectadas con Nosema sobre el péptido antimicrobiano defensina.
Los péptidos antimicrobianos presentan variadas diferencias en su actividad y su sensibilidad puede estar
asociada en función de sus variables fuentes florales (Ayaad et al., 2012).
Figura 9. Evaluación de péptidos antimicrobianos abaecina y defensina en abejas sanas e infectadas con
N. ceranae, tratadas con extractos acuosos. T0: abeja sana; T0N: abeja con Nosema; T2: abeja sana con
ortiga; T2N: abeja con Nosema con ortiga; T3: abeja sana con quillay; T3N: abeja con Nosema con
quillay.
Los péptidos antimicrobianos son inducidos por la infección bacteriana proporcionando un amplio
espectro de defensa (Ayaad et al., 2012).
Además de la inmunidad social, la primera línea de defensa de las abejas a nivel individual frente a
patógenos son las defensas mecánicas, como ser las barreras epiteliales (cutícula, tráquea e intestino).
En los casos en que los patógenos logren franquear estas defensas, se activa el sistema inmune innato
(los insectos carecen de sistema inmune adaptativo). La respuesta inmune innata involucra respuestas
humorales y celulares. Las respuestas humorales se basan principalmente en la secreción a la hemolinfa
de péptidos antimicrobianos producidos por el cuerpo graso (Glinski y Jaroz, 2001; Hoffmann, 2003). En
las abejas se han identificado al menos cuatro de estos péptidos: apidecinas (Casteels et al., 1989),
abaecinas (Casteels et al., 1990), himenoptecinas (Casteels et al., 1993) y defensinas (Casteels-Jonsson
et al., 1994).
En el mismo ensayo para evaluar los péptidos antimicrobianos himenoptecina y la enzima lisozima (LYZ)
importante en la inmunidad de las abejas (Daffre et al., 1994; Lavine y Strand, 2001), por su actividad
frente a bacterias Gram positivas y Gram negativas, y su relación con la promoción de la expresión de
péptidos antimicrobianos (Imler y Bulet, 2005), se observa la alta expresión génica de la enzima lisozima
cada vez que se presenta abejas con Nosema, la cual aumenta más aun cuando se aplica el tratamiento
con ortiga T2 y especialmente con T3: quillay. En relación al péptido antimicrobiano himenoptecina se ve
disminuida su expresión cada vez que se presenta abejas con Nosema y los tratamiento ortiga y quillay
hacen disminuir aún más su expresión, solo se ve un leve aumento cuando se presenta el tratamiento de
ortiga en abeja sana (Figura 10).
Figura 10. Evaluación de péptidos antimicrobianos himenoptecina y la enzima lisozima (LYZ) en abejas
sanas e infectadas con N. ceranae, tratadas con extractos acuosos. T0: abeja sana; T0N: abeja con
Nosema; T2: abeja sana con ortiga; T2N: abeja con Nosema con ortiga; T3: abeja sana con quillay; T3N:
abeja con Nosema con quillay.
En este caso (Figura 11), la expresión de genes de péptidos antimicrobianos se ven más aumentada en
la muestra con esporas y con el tratamiento (extracto de maqui). En el caso de las abejas con esporas y
sin tratamiento y solo con aceite y sin esporas la expresión es más baja.
Figura 11. Expresión génica de genes de péptidos antimicrobianos en abejas sanas e infectadas con N.
ceranae, tratadas con extractos acuosos. T0= abejas sanas, T0N: abejas con Nosema; T1: abejas sanas
con extracto de maqui, T1N: abejas con Nosema con extracto de maqui.
Bioestimulante formulado
Finalmente en la evaluación del producto final formulado a base de 2 extractos acuosos seleccionados se
encontró lo siguiente:
En los ensayos de expresión génica (polifenoloxidasa, glucosa oxidasa y péptidos antimicrobianos) se
pudo observar que el producto bioestimulante aumentó los niveles de expresión génica de PO con
respecto a las abejas sanas sin el bioestimulante, no así en el caso de abejas enfermas, este parámetro
inmunológico se ve en este caso levemente suprimido para esta enzima y con la aplicación del
bioestimulante en abejas sanas la expresión de este gen es mayor. En el caso de la glucosa oxidasa,
esta expresión es superior cuando se tiene a una abeja enferma tratada con el bioestimulante siendo muy
similar a una abeja sana (Figura 12). La melanización que se relaciona con la inmunidad celular es
catalizada por la (profenol) fenoloxidasa (PO) (Decker y Jaenicke, 2004), y la síntesis de melanina
mediada por la PO juega un papel importante en la defensa inmune del insecto. Por otro lado, la
inmunidad social es analizada mediante la actividad enzimática de la glucosa oxidasa (GOX); la que se
expresa principalmente en las glándulas hipofaríngeas (Ohashi et al., 1999), catalizando la oxidación de
β-D-glucosa a ácido D-glucónico y peróxido de hidrogeno, donde éstos dos últimos presentan
propiedades antisépticas (White et al., 1963), los cuales son secretados en los alimentos de las larvas y
en la miel (Sano et al., 2004), contribuyendo a la esterilización de los alimentos de la colonia y por lo
tanto a la prevención de enfermedades.
En relación a los péptidos antimicrobianos, cuando las abejas son infectadas con Nosema ceranae, ésta
disminuye la expresión de estos péptidos (lisozina y defensina). Sin embargo, cuando las abejas son
tratadas con bioestimulante, éste aumenta la expresión de estos péptidos en las abejas sanas así como
en abejas enfermas. Los péptidos abaecina e himenoptaecina se ven aumentados por el bioestimulante
tanto en abeja sana como enferma (Figura 13).
SN CN SNP CNP
Figura 12. Patrón de expresión del gen GOX (glucosa oxidasa) y PO (Fenoloxidasa) en las
muestras analizadas, tratadas con bioestimulante. SN: abeja Sin Nosema sana; CN: abeja Con
Nosema enfermas; SNP: abeja sana con bioestimulante; CNP: abeja con Nosema con
bioestimulante.
SN SNP CN CNP
Figura 13. Expresión génica de genes de péptidos antimicrobianos en abejas sanas e infectadas
con N. ceranae, tratadas con bioestimulante. SN= abejas sanas, SNP: abejas Sin Nosema y con
bioestimulante; CN: abejas con Nosema; CNP: abejas Con nosema y con bioestimulante.
Resultados actividad glucosa oxidasa (GOX) mediante kit enzimático extractos acuosos
En la Figura 14 se muestra la curva de calibración que se obtuvo para este ensayo. Como puede
2
observarse, se logró una muy buena correlación lineal (R = 0,9981), lo que permitirá determinar las
concentraciones de H2O2 que se generen en un amplio rango de concentraciones y con alto nivel de
confianza.
Figura 14. Curva de calibración con patrones de H2O2.
Posteriormente, se procedió a medir la actividad de la GOX en las muestras de hemolinfas recién

colectadas. Para la medición de absorbancias se empleó un equipo ELISA ENx800 como se muestra en
la Figura 15.
Figura 15. Mediciones de actividad glucosa oxidasa (GOx) en hemolinfas de abejas usando kit GOx y
equipo ELISA para leer placas de 96 pocillos.
Los resultados obtenidos se muestran a continuación en la Figura 16.

10
9 c c c c
c c c c c c
8
Actividad GOx (mU/ml)
b
7
6
a
5
4
3
2
1
0
T0-SN T1-SN T2-SN T3-SN T4-SN T5-SN T0-CN T1-CN T2-CN T3-CN T4-CN T5-CN
Tratamientos
Figura 16. Actividad glucosa oxidasa (GOx) en muestras de hemolinfas extraídas desde abejas
sometidas a diferentes dietas con (CN) y sin inoculación (SN) con el patógeno Nosema. T0-SN: abejas
sanas sin tratamiento, T1-SN: abejas sanas con ortiga, T2-SN: abejas sanas con romero, T3-SN: abejas
sanas con limón, T4-SN: abejas sanas con quillay, T5-SN: abejas sanas con matico. T0-CN: abejas con
Nosema sin tratamiento, T1-CN: abejas con Nosema con ortiga, T2-CN: abejas con Nosema con romero,
T3-CN: abejas con Nosema con limón, T4-CN: abejas con Nosema con quillay, T5-CN: abejas con
Nosema con matico. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los tratamientos (p≤ 0,05,
test de Newman-Keuls). Los datos muestran el promedio + desviación estándar.
Como puede apreciarse, las muestras de abejas sometidas solamente a las diferentes dietas (SN) en
base a extractos naturales expresaron significativamente (p≤0,05) mayor actividad GOx que el
tratamiento control sin dieta (T0-SN), lo cual indica que las dietas aplicadas influyen sobre el sistema
inmune de las abejas produciendo un aumento de la expresión de esta enzima. Sin embargo, no se
observaron diferencias significativas en la actividad de la GOx para las dietas aplicadas (T1-SN a T5-SN).
Resultados similares obtuvieron otros autores (Alaux et al., 2010a) al demostrar que la aplicación de
dietas mono y poliflorales produjeron un aumento de las funciones inmune de abejas (Apis melifera), que
se evidenció como un aumento en la expresión de la actividad GOx. Esto significa que la diversidad de
componentes (más allá de los nutrientes básicos) presentes en partes de plantas podría conferir a las
abejas una mejor protección antiséptica en las colmenas. Lo anterior, se expresaría como una mejor
resistencia a enfermedades como la Nosema, lo que a posteriori provocaría mayor sobrevivencia en las
colmenas.
Por otra parte, en los tratamientos en los cuales se aplicaron las dietas + inoculación con Nosema (T1-CN
a T5-CN) no se observaron diferencias significativas (p>0,05) en la expresión de la GOx entre ellos, pero
sí respecto a su control (T0-CN). El tratamiento control con Nosema (T0-CN) es el peor de los
tratamientos y fue significativamente (p≤0,05) menor que todos los demás. Sin embargo, en los
tratamientos con Nosema y sin Nosema la expresión de la GOx no fue significativamente diferente,
excepto con el tratamiento (T0-SN). Esto indica que las dietas ayudan a las abejas a soportar el efecto de
la inmunosupresión producida por la presencia de esporas de Nosema.
Se conoce que para las abejas mantener los niveles de expresión de GOx en la colonia es importante
porque la secreción de antisépticos en los alimentos de la cría y la miel como la GOx constituyen un tipo
de inmunidad social. Por ejemplo, se ha demostrado que la interacción entre el parasitismo por Nosema y
la exposición a pesticidas neonicotinoides inducen una inmunosupresión a nivel social, causando una
disminución significativa de la actividad GOx (Alaux et al., 2010b). Esta enzima es esencial en la
producción del antiséptico y, por lo tanto, para la esterilización del alimento larval (Sano et al., 2004) y la
miel (Ohashi et al., 1999). Como resultado, si la colonia no es capaz de mantener los niveles de actividad
GOX se reclutarán más abejas obreras para esta tarea, una reducción de los antisépticos en la colonia no
sólo afectaría los adultos compañeros de nido, sino también la supervivencia de cría, es decir, se
debilitaría la colonia a largo plazo. Incluso si la colonia responde con precisión a la producción de
antiséptico por reclutamiento masivo de obreras, esto reduciría la asignación de las obreras en las demás
tareas (como la recolección de alimentos) y, por lo tanto, también tendría un costo para la colonia.
Finalmente, el uso de un suplemento alimenticio en dietas (que sea rico en polifenoles y otros
componentes naturales) que ayude a incrementar o sostener el sistema inmune de estos insectos frente
al ataque de patógenos, a través de la expresión de la enzima GOx, contribuiría a mejorar la
sobrevivencia futura no solo de los adultos sino de las propias larvas que están por nacer.
Resultados conteo total de hemocitos
Se puede observar que el extracto de maqui a las 48 h disminuyó la cantidad de hemocitos en las abejas
sanas y enfermas después de aplicar el extracto (Cuadro 1). Sin embargo, la cantidad de hemocitos fue
más alta en las abejas con Nosema y extracto de maqui en comparación al control con Nosema sin
extracto, al igual que las abejas sanas con extracto.
Cuadro 1. Recuento total de hemocitos en abejas sanas e inoculadas con N. ceranae tratadas con
-3
extracto de maqui (células mm ).
Tratamiento 0h 24 h 48 h
Con Nosema 470 a 840 a 177 a
Sin Nosema 340 a 413 a 213 a
Con Nosema + extracto de maqui 470 a 430 a 353 a
Sin Nosema + extracto de maqui 340 a 187 a 273 a
Se puede observar que existieron diferencias significativas entre los tratamientos a las 48 h después de
aplicado el tratamiento (Cuadro 2), observándose que el extracto de limón, quillay y romero disminuyeron
la cantidad de hemocitos en las abejas, incluso aquellas abejas que estaban infectadas con Nosema
también disminuyeron la cantidad de hemocitos con el extracto de quillay. Sin embargo, en los extractos
de limón y romero con abejas infectadas los recuentos de hemocitos aumentaron a las 48 h después de
haber aplicado el extracto. En relación a los controles se puede observar que las abejas enfermas
siguieron aumentando la cantidad de hemocitos, en tanto las abejas sanas los disminuyeron.
Cuadro 2. Recuento total de hemocitos en abejas sanas e inoculadas con Nosema ceranae tratadas con
-3
extracto de limón, matico, ortiga, quillay y romero (células mm ).
Con Nosema 110 a 130 a 160 ab
Sin Nosema 220 a 180 a 157 ab
Con Nosema + extracto de limón 110 a 60 a 263 a
Sin Nosema + extracto de limón 220 a 207 a 53 b
Con Nosema + extracto de matico 110 a 50 a 97 ab
Sin Nosema + extracto de matico 220 a 50 a 117 ab
Con Nosema + extracto de ortiga 110 a 203 a 103 ab
Sin Nosema + extracto de ortiga 220 a 167 a 73 ab
Con Nosema + extracto de quillay 110 a 60 a 37 b
Sin Nosema + extracto de quillay 220 a 107 a 113 ab
Con Nosema + extracto de romero 110 a 87 a 170 ab
Sin Nosema + extracto de romero 220 a 133 a 67b
Letras distintas señalan diferencias significativas según test de Tukey (p≤0,05).
Sin embargo, y a pesar de no existir diferencias significativas entre los tratamientos al ser todos
evaluados (sanas y enfermas), al observar los tratamientos por separado, abejas con Nosema (Cuadro 3)
los extractos de matico, ortiga y quillay disminuyeron la cantidad de hemocitos en relación al control con
Nosema y a las 48 h después de haber aplicado el tratamiento también se observó una disminución de
éstos; pero el extracto de limón y romero terminaron con un mayor número de hemocitos a las 48 h, por
lo que podría presumirse que no tuvieron un efecto sobre la respuesta inmune de la abeja.
Cuadro 3. Recuento total de hemocitos en abejas inoculadas con N. ceranae tratadas con diferentes
-3
extractos (células mm ).
Con Nosema 110 130 160
Con Nosema + extracto de limón 110 60 263
Con Nosema + extracto de matico 110 50 97
Con Nosema + extracto de ortiga 110 203 103
Con Nosema + extracto de quillay 110 60 37
Con Nosema + extracto de romero 110 87 170
En cambio, para los tratamientos sin Nosema (Cuadro 4), todos los extractos disminuyeron sus
hemocitos en relación al control sin extracto y además disminuyeron los hemocitos después de 48 h de
haber aplicado el tratamiento.
-3
Cuadro 4. Recuento total de hemocitos en abejas sanas tratadas con diferentes extractos (células mm ).
Sin Nosema 220 180 157
Sin Nosema + extracto de limón 220 207 53
Sin Nosema + extracto de matico 220 50 117
Sin Nosema + extracto de ortiga 220 167 73
Sin Nosema + extracto de quillay 220 107 113
Sin Nosema + extracto de romero 220 133 67
Resultados contenido de cuerpos grasos

En el Cuadro no se observa diferencias significativas en el contenido de grasas de las abejas en los
aceites de hinojo y poleo ni con los controles con y sin Nosema, debido probablemente a la mala
disolución del etil-éter con las células lipídicas contendidas en los cuerpos grasos o al hecho de que los
pesos de los abdómenes son muy diferentes entre sí, por lo que la desviación estándar es demasiado
grande para interpretar los resultados.
Cuadro. Contenido de cuerpos grasos en abejas (mg abeja-1)
Tratamientos 3 día 6 día 10 día 13 día
Hinojo 0,478 a ± 0,214 a 0,493 a ± 0,215 a 0,531 a ± 0,469 a 0,504 a ± 0,230 a
Poleo 0,465 a ± 0,107 a 0,530 a ± 0,150 a 0,938 a ± 1,886 a 0,701 a ± 0,651 a
Control con Nosema 0,525 a ± 0,325 a 0,540 a ± 0,124 a 0,745 a ± 0,661 a 0,385 a ± 0,186 a
Control sin Nosema 0,700 a ± 0,684 a 0,700 a ± 0,684 a 0,400 a ± 0,158 a 0,428 a ± 0,193 a
Diferencias según test de Tukey (p≤0,05).
± Desviación típica
Resultados viabilidad (sobrevivencia)
120 A 120 B
100 100
Sobrevivencia (%)
Sobrevivencia (%)
Control Control sano
80 80
Ortiga Ortiga
60 Romero 60 Romero
Limon Limon
40 Quillay 40 Quillay
Matico Matico
20 20
Maqui Maqui
0 0
0 días 5 días 10 días 15 días 18 días 19 días 0 días 5 días 10 días 15 días 18 días 19 días
Tiempo Tiempo
Figura 17. Tiempo de sobrevivencia en abejas sanas (A) e inoculadas con Nosema (B) tratadas con
diferentes extractos acuosos.
ANEXO 4 LITERATURA CITADA
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ANEXO 5 TESIS PREGRADO
UNIVERSIDAD CATÓLICA DE TEMUCO
FACULTAD DE RECURSOS NATURALES
ESCUELA DE AGRONOMÍA
“DETERMINACIÓN DE DL50 EN ABEJAS (Apis mellifera L.) CON EXTRACTOS ACUOSOS

LIOFILIZADOS DE PLANTAS ARBUSTIVAS Y HERBÁCEAS PARA FUTURO CONTROL
DE NOSEMOSIS (Nosema ceranae)”
Tesis de grado presentada a la Facultad de

Recursos Naturales como parte de los requisitos
para optar al título de:
INGENIERO AGRÓNOMO
CARLOS RODRIGO INZUNZA PINILLA

DANIELA ALEJANDRA NÚÑEZ
GONZÁLEZ TEMUCO-CHILE
2014
“DETERMINACIÓN DE DL50 EN ABEJAS (Apis mellifera L.) CON EXTRACTOS ACUOSOS
LIOFILIZADOS DE PLANTAS ARBUSTIVAS Y HERBÁCEAS PARA FUTURO CONTROL DE
NOSEMOSIS (Nosema ceranae)”
“Determination of DL50 in bees (Apis mellifera L.) with freeze-dried aqueous extracts of shrubs and
herbaceous plants for future control of nocemosis (Nosema ceranae)”
Carlos Rodrigo Inzunza Pinilla (1)

Daniela Alejandra Núñez González (1)
(1)
Alumnos tesistas, Universidad Católica de Temuco. Email: cinzun2007@alu.uct.cl; dnunez2007@alu.uct.cl
ABSTRACT
Nosema is a disease which affects bee caused by the microsporidian Nosema ceranae fungus. This disease
causes concern given its enormous capacity to harm and weaken the colonies. The search for a new
control, where a product aqueous extracts are underexploited and few studies based on them is needed. It is
also important to mention that these extracts may have different activities including antiparasitic, antibacterial
and antifungal.
The aim of this research was to identify the LD50 of aqueous extracts of some shrubs and herbaceous plants
for future control of Nosema. The extracts were tested: aloe vera (Aloe barbadensis), canelo (Drimys
winteri), lemon (Citrus limon), maqui (Aristotelia chilensis), nettle (Urtica dioica), quillai (Quillaja saponaria)
and rosemary (Rosmarinus officinalis L.). Lyophilized aqueous extracts were applied with syrup to bees in five
replicates, each with 10 bees and mortality at 24 and 48 hours was evaluated. The extracts used were no more
toxic to bees. Therefore the plants used do not affect the mortality of bees and could be evaluated for future
Nosemosis controls.
Key words: Apis mellifera, DL50, aqueous extract.
RESUMEN
Nosemosis es una enfermedad que afecta a la abeja, causada por el hongo microsporidio Nosema ceranae. Esta
enfermedad causa preocupación dada su enorme capacidad de dañar y debilitar a las colonias. Es necesaria la
búsqueda de nuevas alternativas de control donde los extractos acuosos son un producto escasamente
explotado y existen pocos estudios en base a ellos. Además, es importante mencionar que estos extractos pueden
poseer diferentes actividades como antiparasitarias, antibacterial y antifúngica.
El objetivo de esta investigación fue determinar el DL50 de algunos extractos acuosos de plantas arbustivas y
herbáceas para futuro control de nosemosis. Los extractos ensayados fueron: aloe vera (Aloe barbadensis),
canelo (Drimys winteri), limón (Citrus limon), maqui (Aristotelia chilensis), ortiga (Urtica dioica), quillay
(Quillaja saponaria) y romero (Rosmarinus officinalis L.). Se aplicaron extractos acuosos liofilizados con
jarabe a las abejas en cinco repeticiones, cada una con 10 abejas y se evaluó la mortalidad a las 24 y 48
horas. Los extractos utilizados no presentaron mayor toxicidad para las abejas. Por ende las plantas utilizadas
no afectan la mortalidad de las abejas y podrían ser evaluados para futuros controles de Nosemosis.
Palabras claves: Apis mellifera, DL50, extracto acuoso.
INTRODUCCIÓN
La producción de miel se ha convertido en un tema de relevancia para la agricultura mundial, donde las abejas
que la producen cumplen un rol en la polinización y en la producción de alimentos (Genersch,
2010).
Cabe mencionar que Chile es un país que tiene elevados ingresos por concepto de exportación de frutas
cumpliendo la abeja (Apis mellifera L.) un rol crítico en el incremento de la producción de frutos y
semillas por vía de la polinización (Ubal, 2007).
Los dos principales ejes de sustento económico de la apicultura son la producción de miel y la polinización.
Siendo la miel el principal producto pecuario de exportación en valor, superando a las carnes bovina y ovina. El
mercado de la miel produjo 27.174.648 USD-FOB en el año 2013 (ODEPA, 2014).
A pesar de lo prometedor del mercado apícola una amenaza silenciosa afecta a las abejas, Nosema spp.,
parásitos unicelulares obligados que pertenecen al phylum Microspora y se caracteriza por la producción de
una espora resistente que contiene un filamento polar que sirve para transmitir el material genético a la célula
huésped (Wittner y Weiss, 1999). Además, es importante agregar que el género Nosema posee más de 150
especies (Higes et al., 2007). Entre éstos, el parasito N. ceranae que pertenece a la clase
Microsporidia, infecta a la abeja asiática, A. cerana y la abeja europea A. mellifera (Fries et al., 1996; Higes et
al., 2006).
La infección por Nosema se produce principalmente por la ingestión de esporas a través de la comida y el agua.
Se reproducen en el intestino medio de la abeja y finalmente las esporas son eliminadas en las heces,
proporcionando nuevas fuentes de infección a través de la limpieza y las actividades de alimentación de la
colonia (Chen et al., 2009).
Los síntomas de infección por N. ceranae son poco evidentes; las colonias se debilitan (Bourgeois et al., 2010)
y es posible detectar al agente causante de la enfermedad durante todo el año (Higes et al., 2010) siendo además
identificado como el principal agente causante de la pérdida de colonias en diferentes regiones geográficas
(Martínez-Hernández et al., 2007; Higes et al., 2008) por lo que hace suponer que N. ceranae es más virulento
que N. apis (Higes et al., 2007).
En Chile se han registrado mayormente casos por N. apis en colmenas de la Región del Libertador
General Bernardo O´Higgins, con prevalencias durante primavera, debido a la alta contaminación fecal existente
dentro de las colonias a fines de invierno (Hinojosa y Gonzalez, 2004), y se a reportado un 10% del total de las
colonias con nosema en el Valle de Azapa, Región de Arica y Parinacota (Hualquil et al.,
2009). Sin embargo, en el año 2009, el SAG confirmó oficialmente la presencia de N. ceranae en apíarios de la
Región del Bío Bío (Fuentealba y Linero, 2010). Es así, como en la temporada 2010-2011, Martínez et al.
(2012) examinaron 240 colmenas de la Región del Bío Bío, destacando un 49% de las muestras positivas para N.
ceranae.
Las características morfológicas según Gisder et al. (2010), el ciclo de vida intracelular en N. ceranae consta de
dos fases, la primera fase de proliferación denominada merogonia y la segunda fase de multiplicación que se
conoce como esporogonia que termina con la formación de esporas. Una vez que el filamento penetra en la
célula, se produce la inyección del esporoplasma multiplicándose así en el citoplasma celular del huésped. En
esta epata se pueden diferenciar cuatro formas que va adquiriendo el esporo inyectado desde la espora madre.
Estas son formas esquizontes, esporontes, esporoblastos y esporas maduras que finalmente serán liberados al
ambiente para nuevamente volver a parasitar otra célula (Chen et al., 2009; Gisder et al., 2010).
Cuando las abejas no pueden controlar por sí solas un ataque de un parásito, es necesario encontrar algún método
alternativo que reduzca el daño provocado por la enfermedad, como los tratamiento farmacológicos. Es así, que
como Williams et al. (2008), estudiaron la fumagilina como método de control para N. ceranae, determinando
que este fármaco utilizado en otoño logra reducir la intensidad de invasión del parásito en la primavera siguiente.
Si bien este fármaco logra combatir la infección se debe considerar que la fumagilina ya no está autorizado en la
mayoría de los estados miembros de la Unión Europea por la alta concentración de residuos del fármaco en la
miel (Nozal et al., 2008, Porrini et al., 2010). Por ende es necesario encontrar algún medicamento que no
contamine la miel y menos aun que afecte la salud de los consumidores. Es así como toman importancia los
aceites esenciales y los extractos acuosos ya que son naturales y no producen resistencia. Es necesario conocer la
inocuidad de estos diversos compuestos naturales para la abeja y su potencial efecto sobre el patógeno N.
ceranae. Una forma de verificar la toxicidad de una sustancia es a través de evaluaciones de laboratorio en
animales de experimentación, entre las pruebas más conocidas se encuentra el cálculo de DL50 oral, dermal,
intravenosa, intramuscular e intraperitoneal.
En este contexto, se plantea en la presente investigación la búsqueda de nuevos extractos acuosos inocuos para
las abejas y con potencial de control. Para ello se trabajó con extracto acuoso liofilizado, los cuales presentan
una estable conservación y se facilita la aplicación de tratamientos, dado que se diluyen fácilmente en agua. Las
plantas para realizar los extractos se eligieron porque han sido aplicadas en la medicina natural además de
poseer cierta actividad: antibacterial, antimicrobiana y antifúngica.
El objetivo de la investigación fue evaluar el DL50 en abejas (A. mellifera) con extractos acuoso liofilizados de:
aloe vera (Aloe barbadensis), canelo (Drimys winteri), limón (Citrus limon), maqui (Aristotelia chilensis),
ortiga (Urtica dioica), quillay (Quillaja saponaria) y romero (Rosmarinus officinalis L.) para futuro control de
nosemosis (N. ceranae).
MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación
La investigación se llevó a cabo en el Laboratorio de Bromatología de la Universidad Católica de Temuco de la
Escuela de Agronomía, Campus San Juan Pablo II localizado en Rudecindo Ortega Nº02950, durante los meses
de julio-octubre en la comuna de Temuco, Región de La Araucanía.
Material biológico de investigación
Materia animal
Se utilizaron abejas A. mellifera tomadas desde el apiario de investigación del predio experimental
Pillanlelbún perteneciente a la Escuela de Agronomía de la Universidad Católica de Temuco localizado en la
comuna de Lautaro a 18,5 km al Norte de la ciudad de Temuco.
Material vegetativo
Se recolectaron cuatro plantas en la comuna y ciudad de San Fernando, Región del Libertador General
Bernardo O'Higgins durante el mes de julio y agosto. Estas fueron: aloe vera (A. barbadensis), limón (C.
limon), ortiga (U. dioica) y quillay (Q. saponaria). Otras tres plantas fueron recolectadas en la zona Sur del
país, Región de La Araucanía, Temuco y fueron: canelo (D. winteri), maqui (A. chilensis) y romero (R.
officinalis L.). De todas ellas sólo se utilizaron las hojas en estado fresco.
Elaboración de extractos
El material vegetal fue llevado al Laboratorio de Bromatología. Se lavaron las hojas con abundante agua, luego
se eliminó el exceso de agua y se pesó en balanza. Después las hojas fueron cortadas y licuadas con 500 mL de
agua destilada. El líquido resultante fue separado del material sólido y posteriormente se filtró en la bomba el
vacío. El líquido sin impurezas (Figura 1) fue llevado a un ultracongelador por 24 horas.
Figura 1. Extractos acuosos de: cáscara de aloe vera, pulpa de aloe vera, quillay y limón.
Figure 1. Aqueous extracts of: aloe vera peel, pulp of aloe vera, quillai and lemon.
Finalmente, el producto ultracongelado fue llevado a un liofilizador por 5 días.

El producto final liofilizado (Figura 2) es guardado en un lugar seco y oscuro para su posterior utilización como
extracto acuoso.
Figura 2. Extracto de pulpa de aloe vera liofilizado.

Figure 2. Extract aloe vera pulp lyophilized.
Este procedimiento se llevó a cabo con todo el material vegetal colectado. En el caso de aloe vera (A.
barbadensis) se separó previamente la cáscara de la pulpa obteniéndose dos productos diferentes que
fueron igualmente liofilizados.
Preparación de las dosis

Los extractos acuosos fueron formulados a partir de los productos liofilizados y la adición de jarabe al 2:1
(azúcar: agua) para su posterior aplicación como alimento en abejas.
Las dosis se calcularon en función de referencia bibliográficas de productos similares o aproximaciones según
estudios previos.
Las dosis evaluadas para cada extracto fueron: 3, 5, 10, 15 y 20 µg abeja-1, salvo en el caso de aloe vera
(cáscara) que se utilizó 5, 10, 15, 20, 25 µg abeja-1.
Establecimiento de los ensayos

Los ensayos consistieron en determinar el DL50 de los diversos extractos acuosos liofilizados en abejas A.
mellifera. Para ello, se diseñaron contenedores de experimentación consistentes en: una placa Petri de 110 x 15
mm sobre la cual se colocó un pote plástico invertido de 110 x 80 mm con perforación para la ventilación y la
colocación de un dispositivo de alimentación.
Dentro de cada contenedor de experimentación se colocaron 10 abejas adultas al azar de edades entre 3 a 7 días.
Los panales de origen fueron incubados en estufas con temperatura de 33ºC y humedad relativa controlada.
Para introducción de las abejas en los contenedores se utilizó CO2. Las abejas fueron alimentadas con jarabe
(2:1) azúcar + agua por 24 horas para estandarizar su viabilidad y comportamiento. Las abejas muertas o
moribundas son sustituidas por sanas antes de comenzar la
prueba (Figura 3).
Figura 3. Contenedores de experimentación.

Figure 3. Experiment containers.
Luego al día siguiente se inicia el ensayo donde se les quita el alimento durante 2 horas y luego se les suministra
los respectivos tratamientos con las dosis de extractos acuosos definidos.
Se aplicaron los tratamientos durante 5 horas alimentando cada unidad experimental con 200 µL de jarabe.
Posterior a ello se retiraron los tratamientos y se les aplicó jarabe solamente para alimentación. Se registró la
mortalidad a las 24 y 48 horas después de iniciada la prueba.
Diseño experimental y análisis estadístico

Se realizaron seis tratamientos con distintas dosis con cinco repeticiones. El análisis estadístico para la
determinación de DL50 fue mediante Probit y el programa SPSS 15.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para poder comparar los resultados obtenidos (Cuadro 1) en esta investigación, con los de diferentes
autores es necesario tener presente el método utilizado, ya que son muchas las variables que pueden influir en el
resultado obtenido.
Cuadro 1. DL50de los extractos acuosos liofilizados (µg abeja-1).

Table 1. DL50 of lyophilized aqueous extracts (µg abeja-1).
Extracto 24 h 48 h
Dosis DL50 Error típico Dosis DL50 Error típico
Pulpa de Aloe vera (A. 3303,2 0,151 484,537 0,146
barbadensis)
Cáscara de Aloe vera (A. 0,026 0,274 0,042 0,226
barbadensis)
Canelo (D. winteri) 0 0,864 0 0,546
Limón (C. limon) 1,52 x 1058 1,67 2,8 x 1036 1,205
Maqui (A. chilensis) 0 0,557 0 0,536
Ortiga (U. dioica) 719,402 0,41 242,043 0,32
Quillay (Q. saponaria) 0 0,146 0 0,143
Romero (R. officinalis) 1379,909 0,362 1176,116 0,383
Cabe señalar que no se alcanzó el DL50 en ningún tratamiento, pero se logró determinar la dosis DL50 para el
tratamiento de cáscara de aloe vera con 0,026 µg abeja-1 a las 24 horas y 0,042 µg abeja-1 a las 48 horas. Si
bien se obtuvo la dosis DL50 para: limón, ortiga, romero y pulpa de aloe vera, los resultados no son aplicables
en las abejas (A. mellifera), porque una abeja adulta consume 4 mg día-1 solamente de azúcar.
En el caso de R. officinalis (romero) Itako et al. (2008) informaron de la inhibición de 60% en Alternaria solani
cuando se utilizó R. officinalis en extracto acuoso. Además, el estudio de Dellavalle et al. (2011) afirman que R.
officinalis posee compuestos para la inhibición del crecimiento de Alternaria spp. incluso en bajas
concentraciones, esta especie mostró actividad antifúngica casi igual a la del fungicida químico. También Alves
et al. (2012) confirman que el extracto acuoso liofilizado de R. officinalis tiene actividad antifúngica contra
Candida globosa, Cryptococcus laurentii y Trichosporum assai. En el caso de A. chilensis (maqui) según Alonso
(2012) las hojas y tallo presentan actividad antibacteriana frente a Sarcinia lutea y Staphylococcus aureus.
Además, que sobre el estómago de rata (Rattus norvegicus), diferentes fracciones de extracto de A. chilensis
evidenciaron efectos gastroprotectores, esta información es de gran importancia ya que en este tratamiento
fue baja la mortalidad, eso puede ser gracias a su efecto gastroprotector y por lo tanto sería un extracto
interesante de estudiar como potencial controlador de esporas del patógeno, debido a que N. ceranae afecta el
intestino medio de la abeja.
El Q. saponaria (quillay) por su parte no presentó mayor mortalidad, esto puede deberse a que las saponinas de
éste posee una marcada acción inmunoestimulante, provocando cambios en la permeabilidad celular, y posee
acción antifúngica y antibacteriana. En el mercado existe el producto QL Agri 35 (Natural Response S.A.) que es
un nematicida y promotor radical en base a Q. saponaria 100% natural.
En el mercado apícola existe el producto APIFORME (Health & Vitality) en base a U. dioica (ortiga),
naturalmente rica en ácido fórmico, aminoácidos, elementos minerales y vitaminas. Este producto es un
sanitizante para las colmenas. Se puede inferir que la ortiga no afectó negativamente a las abejas, por ende su
baja mortalidad en este tratamiento.
La reducida mortalidad con el extracto de C. limon (limón) podría deberse a la baja palatabilidad del
extracto.
El A. barbadensis (aloe vera) en el estudio de Dellavalle et al. (2011) presentó una concentración mínima
inhibitoria, pero no mostró actividad fungistática contra Alternaria spp.
En el estudio de Rodríguez (2010) se evaluó in vitro aceite esencial de las hojas de canelo sobre el
crecimiento micelar de Botrytis cinerea y Penicillium los resultados arrojaron que el aceite de canelo presentó
actividad antifúngica contra los patógenos evaluados.
Los extractos acuosos liofilizados son solubles en agua y presentan baja toxicidad, ya que son menos
concentrados que los aceites esenciales, por otro lado los aceites esenciales son solubles en aceite y alcohol, se
evaporan rápidamente y pueden sufrir rápida oxidación. Su aplicación es más engorrosa que un extracto acuoso
liofilizado. Al ser utilizados en dosis apropiadas podría ser una alternativa al uso de fungicidas sintéticos, ya
que los hongos crean resistencia a los productos químicos.
Los resultados obtenidos se han de confirmar en condiciones de campo, porque los experimentos de DL50
consideran a las abejas como individuos solitarios, sin tener en cuenta que se pueden alterar también sus
relaciones sociales en la colonia.
Los extractos deben ser totalmente líquidos considerando que la dieta de las abejas adultas es en base a néctar y
no polen.
CONCLUCIONES
• Si bien se determinó el DL50 de: romero (R. officinalis L.), ortiga (U. dioica), limón (C. limón), pulpa y
cáscara de aloe vera (A. barbadensis) estos resultados no son concluyentes ya que superan la dosis que una
abeja morfológicamente puede consumir.
• No se logró determinar el DL50 de los extractos: maqui (A. chilensis), quillay (Q. saponaria) y canelo (D.
winteri).
• Los extractos acuosos son una alternativa para futuros controles en patógenos apícola debido a su baja
toxicidad en abejas y su facilidad para ser aplicadas en alimento acuoso.
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“USO DE ACEITES ESENCIALES DE PLANTAS COMO CONTROL ALTERNATIVO EN LAS

PRINCIPALES ENFERMEDADES APICOLAS”
Tesis de grado presentada a la Facultad de

Recursos Naturales como parte de los requisitos
para optar al título de:
INGENIERO AGRÓNOMO
CLAUDIO ENRIQUE VARGAS PALAVICINO

TEMUCO – CHILE
2015
“USO DE ACEITES ESENCIALES DE PLANTAS COMO CONTROL ALTERNATIVO EN LAS
PRINCIPALES ENFERMEDADES APICOLAS”
“Use of essential oils from plants as alternative control in the main bee diseases”
Claudio Enrique Vargas Palavicino (1)
(1)
Alumno Tesista, Universidad Católica de Temuco. E-mail: clvargascl@gmail.com.
ABSTRACT
The world worry for the rapid development of resistance of the illnesses bee to synthesis products, added to the
residues that generate these chemical compounds has derived in the search of alternative treatments. Really here
there arise complementary products originated from the essential oils of the plants, which for its chemical
composition have demonstrated to be capable of diminishing the illnesses incidence in the beekeeping. Certain
essential oils possess action of toxicity on fungi, bacteria and mites that they attack to the bees. In this review
there is done a compilation of information generated by different authors on a global scale, which announce the
results obtained in the treatment and control of the main illnesses apícolas present in Chile, using the essential
plants oils.
Key words: essential oils, illnesses, treatment, Apis mellifera.
RESUMEN
La preocupación mundial por el rápido desarrollo de resistencia de las enfermedades apícolas a productos de
síntesis, sumado a los residuos que generan estos compuestos químicos ha derivado en la búsqueda de
tratamientos alternativos. Es aquí que surgen productos complementarios provenientes de los aceites esenciales
de las plantas, que por su composición química han demostrado ser capaces de disminuir la incidencia de
enfermedades en la apicultura. Ciertos aceites esenciales poseen acción de toxicidad sobre hongos, bacterias y
ácaros que atacan a las abejas. En esta revisión se hace una recopilación de información generada por diferentes
autores a nivel mundial, los que dan a conocer los resultados obtenidos en el tratamiento y control de las
principales patologías apícolas presentes en Chile, utilizando los aceites esenciales de plantas.
Palabras clave: aceites esenciales, enfermedades, tratamiento, Apis mellifera.

INTRODUCCIÓN
Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) son afectadas por distintos agentes etiológicos como virus, bacterias,
hongos y parásitos. Se han descrito más de 35 enfermedades asociadas a esta especie de abeja, la mayoría
ocasiona daños considerables en la apicultura mundial (Ritter, 2001).
El uso indiscriminado y reiterado de algunos productos para el control de plagas y enfermedades ha originado
razas resistentes y problemas de contaminación de la miel y otros productos de la colmena (Calderone y Spivak,
1995; Lodesani y Spreafico, 1995; Hillesheim et al., 1996; Bogdanov, 2006; Martel et al, 2007).
Las plantas aromáticas han sido usadas tradicionalmente en medicina natural y su uso se ha extendido a los
alimentos, mostrando inhibición de bacterias, hongos y levaduras (Albo, 2010).
Los componentes volátiles provenientes de las plantas han atraído la atención del hombre desde la antigüedad,
como principios aromáticos o especies de gran complejidad en su composición.
La necesidad de desarrollar estrategias alternativas de tratamiento consiste en desarrollar sustancias
antibacterianas naturales, como los aceites esenciales (ae) de diferentes plantas (Genersch, 2009), los cuales
pueden ser una alternativa muy conveniente a los productos de síntesis (Turk, 2012).
Los pesticidas naturales basados en ae pueden presentarse como protectores alternativos a la apicultura, ya que
los ae de plantas se utilizan ampliamente como fragancias y perfumes que repelen insectos (Murray, 2000).
Las colonias de abejas son susceptibles a un número de plagas y enfermedades cuyos daños poseen impactos
económicos negativos en la industria de la apicultura y agricultura (Wahida et al., 2010). Un conjunto diverso y
excepcional de parásitos y agentes patógenos como ácaros (Varroa destructor, Acarapis woodi), hongos
(Nosema spp y Ascosphaera apis), bacterias (Paenibacillus larvae, Melissococcus plutonius), pueden afectar en
diferentes etapas de la vida a las abejas (Genersch, 2010).
El control de parásitos y patógenos de A. mellifera con sustancias naturales es de fundamental importancia, ya
que la miel es el principal producto de la colmena y debe estar libre de cualquier contaminante (Aronstein &
Hayes, 2004; Mourad et al., 2005).
Por ello, la tendencia actual para el control de plagas y enfermedades, es el uso de extractos y ae naturales y sus
componentes, que puedan incluirse en programas de control integrado (Damiani et al, 2009, 2011; Gende et al.,
2008ª, 2010; Porrini et al, 2011). Poseen según Isman, (2000) baja toxicidad en mamíferos, escasos efectos sobre
el medio ambiente y una vasta aceptación entre los productores.
Los ae, productos del metabolismo secundario de algunas plantas, están formados por mezclas complejas de
monoterpenos y sesquiterpenos principalmente, y constituyen una alternativa para el control de algunas plagas y
enfermedades apícolas.
La actividad in vitro antimicrobiana, antifúngica y acaricida de algunos ae han demostrado resultados efectivos
en el control de plagas y enfermedades en abejas (Fuselli et al., 2006, 2007) que ofrecen alternativas a los
antibióticos y otras sustancias químicas de síntesis.
Ciertos ae y sus componentes químicos tienen acción demostrable de toxicidad en plagas de insectos y ácaros
como Varroa destructor (Murray, 2000., Calderone et al., 1997).
Se ha demostrado que son eficaces para el control in vitro de Paenibacillus larvae (Albo et al., 2003; Fuselli et
al., 2006), Ascosphaera apis (Bailac et al., 2007) y V. destructor (Floris et al., 2004; Rufinengo et al., 2007;
Calderón et al., 2014).
En este contexto es necesario realizar una búsqueda bibliográfica que apunte a documentar la importancia de los
ae en el control de enfermedades apícolas en Chile como fuente de información y herramienta para futuras
estrategias de control.
Aceites esenciales
Los ae son conocidos desde la Edad Media por sus propiedades antisépticas, terapéuticas y por su intenso aroma
(Hernández, 2011).
El término ae es utilizado para referirse a sustancias volátiles, poco densas, líquidas, cristalinas, raramente
coloreadas, de carácter lipofílico, solubles en disolventes orgánicos y generalmente de menor densidad que el
agua y con fuertes propiedades aromáticas (Bauer et al., 2001; Hernández, 2011), dan el aroma característico a
algunas flores y semillas (Flores, 2010).
La cantidad y composición química de un ae depende a menudo sobre el cultivo y las condiciones climáticas
(Imdorf, et al., 1999) varia de una especie a otra y dentro de los mismos géneros de la planta (Meza et al., 2007;
Nejad et al., 2008).
Los ae presentan actividad antimicrobiana contra una variedad de bacterias y levaduras, incluyendo especies
resistentes a los antibióticos y anti fúngicos (Bertini et al., 2005; Lima et al., 2006).
Según Imdorf et al., (1999), dada la naturaleza volátil de estos productos, el método más apropiado para la
aplicación de ae y sus componentes es la evaporación pasiva, lo cual se logra mediante la utilización de sustratos
inertes, fácilmente disgregables, los cuales se impregnan con una solución líquida de los aceites que luego se
liberan lentamente. La facilidad de disgregación del sustrato, ayuda a que las abejas distribuyan dicho elemento
al interior de su colmena. (Vandame, 2000).
Los residuos en la miel son bajos, incluso después de tratamientos a largo plazo (Imdorf et al., 1999).
Al contrario de los ácidos orgánicos, los ae se acumulan temporalmente en la miel y cera, pero estos residuos no
son importantes desde el punto de vista toxicológico (Imdorf et al., 1996; Goodwin y Van Eaton, 2001).
Procedencia y funciones en la planta

Los ae son productos vegetales que se obtienen de flores, frutos, hojas, raíces, semillas y corteza, que se
almacenan en canales y células epidérmicas para su posterior secreción (Hernández, 2011 y Imdorf, et al 1999).
Se encuentran distribuidos en plantas compuestas, labiadas, lauráceas, mirtáceas, pináceas, rosáceas, rutáceas,
umbelíferas, entre otras (Figueroa, 2003).
Los ae tienen un papel muy importante en la protección de las plantas actuando como agentes antibacterianos,
antivirales, antifúngicos e insecticidas (Bauer et al., 2001), su olor atrae insectos polinizadores, protegen a la
planta de los insectos fitófagos y la deshidratación (Bogdanov, et al 1999; Fernández y Coineau, 2002).
Los ae de origen vegetal han demostrado poseer una amplia gama de actividades biológicas, que incluyen la
toxicidad, repelencia y efectos antialimentarios de los parásitos y también propiedades reguladores del
crecimiento (Turk, 2012).
Composición y propiedad físico-química

Los ae poseen una composición química compleja que consiste en una mezcla de sustancias orgánicas como
hidrocarburos, alcoholes, aldehídos, cetonas y ésteres (Bauer et al., 2001; Flores, 2010) en un 90% pertenecen al
grupo de los terpenoides, tales como monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos (Figueroa, 2003).
La composición de los aceites esenciales puede variar con el clima, área geográfica, temporadas, condiciones de
suelo, período de la cosecha y técnica de extracción (Bertini et al., 2005; Carvalho-Filho et al., 2006), se
clasifican con base en diferentes criterios: consistencia, origen y naturaleza química de los componentes
mayoritarios (Goñi et al., 2006).
Métodos de obtención de aceites esenciales

La extracción del ae de la planta consiste principalmente en una destilación a baja o alta presión mediante el uso
de agua (hidrodestilación), destilación por arrastre con vapor de agua, y destilación con vapor directo
(Hernández, 2011., Vargas y Bottia, 2008).
La hidrodestilación es un proceso en que el material vegetal se sumerge en agua en estado de ebullición, el agua
penetra en los tejidos de la planta, disuelve parte de los ae contenidos en la planta y pasa a ser recolectado por
condensación (Hernández, 2011).
La destilación en agua es llevar a estado de ebullición una suspensión acuosa de un material vegetal aromático,
de tal manera que los vapores generados puedan ser condensados y colectados. El ae es inmiscible en agua y es
posteriormente separado (Bandoni, 2000).
La destilación por arrastre de vapor, consiste en destilar dos líquidos inmiscibles en una vaporización a
temperaturas inferiores a ebullición de cada uno de los componentes volátiles por efecto de una corriente directa
de vapor de agua, la cual ejerce la doble función de calentar la mezcla hasta su punto de ebullición y disminuir la
temperatura de ebullición (Bandoni, 2000).
Otras técnicas de obtención de ae son en base a solventes como etanol, metanol, tolueno, acetona, cloroformo,
entre otros, obtención por prensado a mano o máquina y enfleurage, proceso en el cual se utiliza grasa como
disolvente (Hernández, 2011).
Mecanismo de acción
Estudios sobre la composición química de los ae han revelado que las propiedades de los mismos, son el
resultado de la unión de sus múltiples componentes (Carson et al., 2002). Poseen la capacidad de atravesar la
pared celular y las membranas citoplasmáticas, alterando la estructura química de polisacáridos, ácidos grasos y
fosfolípidos y permeabilizando las membranas (Hernández, 2011).
Diversos autores (Alonso, 1998; Wagner et al., 1996) han demostrado que los ae están constituidos
principalmente por compuestos terpénicos y fenólicos, siendo estos últimos los responsables de las propiedades
antimicrobianas (Sari et al., 2006) por su capacidad de afectar la permeabilidad de la membrana bacteriana, la
cual restringe la difusión de los compuestos hidrofóbicos a través de su cobertura lipopolisacárida.
Principales enfermedades de las abejas en Chile

Las principales enfermedades de las abejas en Chile son varroasis, nosemosis, acariosis traqueal, cría yesificada
o cría de tiza, loque americano, y en menor medida, loque europeo, estas afectan a las crías, a las abejas adultas o
a ambos estadíos (SAG, 2009).
Loque americana
Es una enfermedad que afecta a larvas y pupas de abejas melíferas y es causada por la bacteria Paenibacillus
larvae (Genersch et al., 2006) una bacteria capaz de formar endosporas muy resistentes. Esta plaga se controla
con antibióticos que dejan residuos tóxicos en miel y subproductos (Dorman y Deans, 2000; Mc Kee, 2004) y
que ya han generado resistencia en zonas de Europa, EE.UU., Canadá, Argentina y Asia (Alippi y Reynaldi,
2006).
Este patógeno afecta a la cría y a nivel de larva individual la infección es fatal, mientras que las abejas adultas no
son susceptibles a la enfermedad (Gende et al., 2008)
Control con aceites esenciales

Los ae provenientes de plantas aromáticas como tomillo (Thymus vulgaris), pasto limón (Cymbopogon citratus),
orégano (Origanum vulgare L.), eucalipto (Eucalyptus globulus), romero (Rosmarinus officinalis L.), albahaca
(Ocimun basilicum L.), entre otros (Alippi et al., 1996; Albo et al., 2001, 2003), juegan un rol relevante para el
control del agente etiológico de la loque americana, arrojando resultados satisfactorios, tendientes a reducir los
niveles de resistencia de la bacteria en la colonia de abejas.
Según estudios realizados por Gende et al., (2008) el aceite de canela exhibió mayor actividad antimicrobiana
frente a la bacteria P. larvae, con un valor de concentración inhibitoria mínima (CIM) entre 25 y 50 μg/mL,
mientras que el extracto etanólico de paraíso (M. azedarach) demostró tener menor actividad antimicrobiana,
con un valor de CIM de 5.000 μg/mL. Los aceites de menta (M. piperita) y lavanda (L. officinalis) presentaron
valores intermedios de CIM.
En estudio realizado in vitro Damiani, (2013) determinó que la actividad antimicrobiana del ae de laurel (Laurus
nobilis) osciló entre 600 y 1200 μg/mL de CIM clasificándola como media.
En estudios realizados en la ciudad de Mar del Plata, el ae de Eucalytus globulus posee una CIM que varía entre
600 a 700 μg/mL, y otro extraído en Conlara, entre 900 a 1.200 μg/mL, determinándose la influencia que ejercen
el medio ambiente sobre la composición química de los aceites (Gende et al., 2010)
Loque europea
Loque europea (EFB) es una enfermedad grave de la abeja de miel A. mellifera L. causada por la bacteria
GRAM + Melissococcus plutonius corregida por (ex. White, 1912) (previamente referida como M. pluton Bailey
y Collins, 1982, 1983).
Es una enfermedad bacteriana que afecta a la cría y provoca su muerte antes de la operculación de la celda. Son
susceptibles a M. plutonius las larvas de ≤48 horas (Roetschi et al., 2008), de tres a cuatro días, y más raramente
hasta siete, las que se infectan por vía oral, con el alimento (Lorenzo et al., 2010)
La mayoría de las larvas enfermas salen de su posición de enroscamiento en el fondo de sus celdas antes de
morir. Muchas son detectadas rápidamente y retiradas por las abejas nodrizas, dejando celdas vacías diseminadas
al azar entre las crías restantes. Algunas larvas infectadas sobreviven, alcanzan la fase de pupa y se convierten en
adultos. Estas larvas que sobreviven son capaces de defecar y sus heces infectadas contribuyen a la propagación
constante de la enfermedad (OIE, 2008).

El estudio de la actividad antibacteriana del ae de tomillo y de su componente mayoritario (carvacrol) mostró
distintos niveles de inhibición del crecimiento cuando se utilizaron por separado frente a especies gram (+) y
gram (-) (Dorman y Deans, 2000).
Ascosferosis
La Ascosferosis o cría yesificada o de tiza en A. mellifera es una micosis invasiva y altamente contagiosa
producida por el hongo Ascosphaera apis Massen ex Claussen (Oliver & Spiltoir, 1955) que afecta las pupas de
las abejas melíferas. La infección con cría yesificada ocurre casi exclusivamente cuando las larvas de 4 – 5 días
de edad consumen las esporas de A. apis, que germinan y crecen dentro del lumen intestinal (Theantana &
Chantawannakul, 2008). La enfermedad raramente mata a una colonia (Reynaldi et al., 2005) pero la perdida de
cría lleva a una reducción en la población que influye negativamente en la producción y en la eficiencia
polinizadora.
Las larvas de abeja melífera pueden ser alimentadas con esporas de A. apis y no desarrollar la enfermedad, deben
darse otras condiciones predisponentes como el enfriamiento del nido de cría por debajo de 35ºC, aumento de la
relación cría/abeja adulta por rápida expansión de las colonias en primavera, colonias incentivadas, producción
de núcleos, debilitamiento de las colonias por presencia de varroosis, loque europea y virosis (Borum & Ulgen,
2008).
Las larvas jóvenes infectadas (cría abierta), adquieren un color blanco opaco debido a la multiplicación de los
micelios del hongo y no suelen morir ni presentar síntomas de A. apis, sus cuerpos aumentan de tamaño debido
al desarrollo interno del hongo (Aldea, 2010).
Las pupas muertas al interior de las celdas operculadas se cubren de un micelio algodonoso blanco, se secan, y
finalmente se transforman en momias blancas, o en momias negras o pardas si ocurre la reproducción sexual
(Hornitzky, 2001). Los cuerpos de fructificación están conformados por esporocistos globosos, que contienen
ascoscistos con 108 – 109 de ascosporas las cuales son removidas al exterior por abejas limpiadoras.

Las medidas de control de esta enfermedad se basarían, fundamentalmente, en la potenciación del
comportamiento higiénico de las colonias de abejas (Palacio et al., 2000), junto con la aplicación de una terapia
clásica con sustancias fungicidas. Los ae poseen efectos antimicrobianos y han sido utilizados para el control de
cría yesificada (Albo et al, 2010).
Los ae de melisa (Melissa oficinales) y ajedrea (Satureja montana) presentan una gran capacidad inhibitoria del
crecimiento de A. apis. (Higes et al., 1998). La CIM para el aceite de melisa y el aceite de ajedrea se sitúa por
debajo de 2,5 µl/mL. En el caso de aceite de mejorana y salvia, este valor estaría entre 5 y 10 µl/mL. Esta
capacidad podría ser utilizada para combatir los brotes de esta enfermedad en las colmenas (Higes et al., 1998).
La dosis letal media para el ae de tomillo según (Albo, 2010) es de 100 µg de principio activo tomillo por abeja
en la época de otoño e invierno, por lo cual, se considera un producto virtualmente no toxico para las abejas
adultas.
Al adicionar 0,1 % de ae de ajedrea al jarabe de azúcar y proporcionarlo a las abejas, esta mezcla redujo en un
27,6% la presencia de larvas infectadas en las colmenas tratadas (Higes, et al., 1998) sin embargo, se hace
necesario desarrollar otros métodos de control (comportamiento higiénico, cambio de reinas, etc.).
La CIM para los ae obtenidos de clavo de olor (Sisygium aromaticum) fue de 250-300 ppm, canela
(Cinnamomum zeylanicum) de 25-50 ppm, Tomillo (Thymus vulgari) de 150 ppm, anís (Pimpinella anisum) de
300 ppm y para hinojo (Foeniculum vulgare) de 250 ppm (Bailac et al., 2006)
Se evaluó in vitro la concentración inhibitoria fungicida (CMF) del aceite de tomillo, los ensayos se realizaron
por triplicado y se determinó que la CMF fue de 250 ppm (Bailac et al., 2007).
Nosema apis
Nosemosis es una enfermedad causada por el microsporidium Nosema apis Zander, es un parásito obligado del
tejido del intestino de las abejas adultas (de Graaf et al., 1994), la transmisión de la enfermedad se produce a
través de la trofolaxia (Webster, 1993).
Los factores que predisponen a la enfermedad son inviernos largos, fríos y primaveras frescas y lluviosas, lo que
genera hacinamiento de las abejas dentro de las colmenas, estas defecan en los panales aumentando la cantidad
de esporas, incrementando la infestación entre individuos (CEAPIMAYOR, 2009).
Los síntomas de esta enfermedad no son claros, algunas veces, altos niveles de infestación son difíciles de
detectar, se observa incapacidad para mover las alas, abdomen abultado, desorientación o paralización de la
conducta de pecoreo (Sanford, 2003).

Se han evaluado el potencial de varios compuestos naturales en la inhibición del desarrollo de nosema en las
abejas criadas en jaulas (Maistrello et al., 2008), tanto timol y el resveratrol, administrado con el candy de
azúcar, disminuyeron significativamente la concentración de esporas y aumentaron la longevidad de las abejas
tratadas.
El ae de Timol inhibe el desarrollo del parásito, como el nivel de infestación en las abejas, la concentración de
esporas disminuyó en 11,5 veces más que las abejas no alimentadas con candy con ae de Timol. Estos hallazgos
pueden apoyar la hipótesis de Rice (2001) que el timol interrumpe la formación de la membrana plasmática e
impide la germinación de las esporas de N. apis.
Nosema ceranae
En 1994, Nosema ceranae se detectó por primera vez en Beijing (China) en miel producida por abejas asiáticas
(A. cerana) (Fries et al., 1996). Más tarde Higes et al. (2006) reportaron por primera vez la presencia de N.
ceranae infectando a A. mellifera en Europa.
El parásito Nosema pertenece a la clase Microsporidia, que a su vez es un gran grupo de organismos
intracelulares obligados, muy generalizados en la naturaleza y que con frecuencia infecta a insectos. La infección
se extiende desde la forma crónica y más común, a la forma aguda y menos frecuente de la enfermedad. Además,
es importante agregar que el género Nosema tiene más de 150 especies, que pueden infectar a hospederos
invertebrados como mínimo 12 órdenes de insectos.
Las características de esta enfermedad son una inexplicable desaparición de las abejas adultas, una falta de
atención de la cría, además se reduce el vigor de la colonia, y se presenta una mortalidad invernal sin previas
alteraciones patológicas (Higes et al., 2009ª). Martín-Hernández et al., (2007), mencionan que los signos de
debilidad de una colonia son evidentes cuando la reina no puede sustituir la pérdida de abejas infectadas. De
hecho, el riesgo de despoblación de una colonia es seis veces mayor en las colonias infectadas con N. ceranae
que en los no infectados.
Se ha demostrado que las abejas infectadas con N. ceranae reducen su vida util, debido al estrés energético,
también es afectado su comportamiento alimenticio (Mayack and Naug, 2009; Naug and Gibbs, 2009).
El efecto de resveratrol y timol administrado en candy en el desarrollo de Nosema ceranae y en la longevidad de
las abejas, ha sido investigado por Costa et al., 2010., llegando a la conclusión de que el jarabe tratado con timol
disminuye significativamente los niveles de infección desde 138±7 millones de esporas por abeja a 60±9
millones de esporas por abeja, lo cual indica que el jarabe tratado con timol parece ser promisorio en el control
por infección por Nosema.
Acariosis o Acarapisosis
Acariosis es una enfermedad que afecta las vías respiratorias, específicamente las tráqueas de abejas adultas de
A. mellifera y su agente patógeno es Acarapis woodi (NBII, 2011).
Se reproduce principalmente en la tráquea pro-torácica de su hospedero, alimentándose de hemolinfa. Esta se
obstruye y deteriora por el acúmulo de los propios ácaros y por los detritos, formados por excremento de ácaros,
ácaros muertos, huevos y diferentes estadios de desarrollo del ácaro (OIE, 2004).
Los signos clínicos de la acariosis no siempre se observan y generalmente solo son evidentes cuando los niveles
de infestación son muy altos, mayor a un 50%. Entre estos, alas dislocadas, abdomen distentido, presencia de
abejas muertas o moribundas frente a las piqueras (Campano, 2004).
El ambiente y la genética del hospedero contribuyen al aumento de la población de A. woodi, existiendo razas de
abejas más susceptibles, como las abejas italianas (Guzman et al., 2005) y razas de abejas más resistentes (Nasr
et al., 2001)
Acariosis asociado a otras patologías como varroasis ocasiona una rápida muerte de la colonia (Mcmullan y
Brown 2009).

Estudios realizados con ae de neem (Azaridachta indica) se ha observado, que es eficaz cuando se rocía seis
veces a intervalos de 4 días y no cuando se aplica tres veces a intervalos de 8 días (Melathopoulos et al, 2000ª).
El aceite de neem aplicado tópicamente sobre los marcos actuó protegiendo a las abejas de ser infestadas por A.
woodi (Melathopoulos et al, 2000b).
Tratamientos de rociado de aceite de neem no tuvieron ningún efecto negativo sobre las poblaciones de abejas
adultas, pero los tratamientos redujeron la cantidad de cría sellada en colonias en un 50% y causaron la pérdida
de la reina en dosis más altas (Melathopoulos et al, 2000).
Varroosis
El ácaro Varroa destructor Anderson & Trueman es uno de los problemas más serios para la actividad apícola
mundial (Eguaras et al., 2001 y Cruzat et al., 2009). Varroa es un ectoparásito con dimorfismo sexual y se
reproduce dentro de las celdillas de cría operculadas de abejas obreras y zánganos, durante la emergencia el
ácaro hembra inicia una fase forética sobre el cuerpo de su hospedero (Ifantidis, 1990; Fries, 1993). Se detectó
en 1992 en el sector de Aguas buenas, comuna de San Fernando, VI Región (Casanueva, 1992).
Ocasiona la muerte de las colonias, genera pérdidas de producción, debido a un debilitamiento general de las
colmenas. Causa dos tipos de daños; físico al disminuir el contenido de proteínas y un daño tóxico infeccioso,
debido a la transmisión de microorganismos causantes de enfermedades virales y bacterianas (Cruzat et al.,
2009).
Según Aldea (2010) V. destructor Anderson & Trueman ocasiona alteraciones en el desarrollo de las abejas, se
presentan malformaciones en alas (atrofia, disminución del tamaño), patas (disminución del número de artejos),
y abdomen, además se observa mal desarrollo glandular. La falta de vitalidad, muerte prematura y debilitamiento
de la colonia, la familia desaparece lentamente, pudiendo llegar incluso a un punto que no se encuentren abejas
en su interior (Cruzat et al., 2009). Además de la pérdida económica de las abejas y la producción de miel, la
colonia infestada puede morir o migrar (De Jong et al., 1984).
Diferentes agentes patógenos como el virus de la parálisis aguda (APV), de las alas deformadas y hongos son
probablemente trasladados por V. destructor (Allen & Ball, 1996). La sintomatología se evidencia luego que el
APV ingresa a la hemolinfa de la abeja adulta, producto del proceso de alimentación de varroa, lo cual sugiere
que los ácaros puedan actuar como vector y/o activador de virus latentes, en abejas melíferas (Goodwin y Van
Eaton, 2001).

Imdorf, et al (1996) señalan que muchos de los aceites esenciales y sus componentes exhiben actividades
acariciadas, actuando ya sea como repelente, atrayente o bien teniendo efectos sobre la reproducción de varroa.
Amrine et al., (1996), agregan que se han encontrado algunos aceites y compuestos derivados de estos que
pueden causar la muerte, o efectos adversos sobre varroa, a través de dos mecanismos de acción; Toxicidad por
contacto directo y disminución de la reproducción de los ácaros, por medio de la alimentación con jarabes que
contengan aceites esenciales.
Según Imdorf et al., (1999), en el control de varroa, han sido probados cerca de 150 diferentes tipos de aceites
esenciales, pero solo unos pocos han resultado efectivos en pruebas de campo, de los cuales, el efecto acaricida
ha sido evaluado y demostrado por diversos investigadores, entre los que destacan; Gal et al., (1992), Amrine et
al.,(1996), Calderone y Spivak (1995), entre otros, los cuales señalan que su utilización es influenciada por la
temperatura, ya que en climas o estaciones frías la volatilización se ve afectada negativamente y no produce el
efecto deseado en los ácaros, que es eliminar o repeler (Montero, 2006).
Timol compuesto químico natural extraído de la planta aromática llamada tomillo Thymus vulgaris. Los
resultados de los ensayos realizados por Imdorf et al., (1995b), mostraron que concentraciones de timol de 5 a 15
µg de timol, 50 a 150 µg de alcanfor y 20 a 60 µg de mentol por litro de aire, mataron cerca del 100% de ácaros
sin evidenciarse efectos adversos en abejas.
Entre los ae, el Timol es uno de los más utilizados con una eficiencia que varía entre 66% a 98%, dependiendo
del método de aplicación, dosis, concentración, tipo de colmena y condiciones ambientales. En Europa presentó
una eficacia de 82,6% (Imdorf, et al., 2003 y Baggio, et al., 2004).
Vandame (2000), señala la utilización de cristales de timol, en dosis de 8 g por colmena disueltos en alcohol o
simplemente en polvo. Para una aplicación que dura siete días, consistiendo el tratamiento de 2 a 3 aplicaciones,
obteniendo una eficiencia cercana al 82%.
Cuadro 1. Principales vegetales utilizados para la extracción de aceites esenciales empleados en el control de V.
destructor.
Nombre Aceite esencial Concentración
Nombre científico
común Inhibitoria Mínima Fuente
(CIM)
Thymus vulgaris L. Tomillo
Eucalyptus globulus Eucalipto
Labill.
Mentha x piperita Menta
var.piperita L.
Cinnamomum canphora Alcanforero
L.
Thymus capitatum L. Orégano
Salvia officinalis L. Salvia
FUENTE: Adaptado de Gal et al., (1992); Calderone y Spivak (1995); Amrine et al., (1996); United States
Department Of Agriculture (U.S.D.A.) (2005).
Productos comerciales
Apilife Var® es un producto comercial indicado en el control de la varroasis que contiene un 76% de timol,
alcanfor (3,8%), mentol (3,8%) y eucaliptol (16,4%). Consiste en tabletas de vermiculita (cerámica porosa)
embebidas con timol las cuales se colocan sobre los marcos (Calatayud, 2000).
En estudios realizados por Schmidt et al., (2008), se evaluó el índice de caída de ácaros entre Bayvarol
(flumetrina 3,6 mg) y Apilife Var®, este último tuvo una eficiencia de 90% en comparación con Bayvarol de un
69%.
El producto orgánico Apilife Var® se revela efectivo contra Varroa sp. y contra Acarapis woodi Rennie,
alcanzando valores de 75,88 % y 65,54 %, respectivamente que se pueden considerar aceptables.
Cuadro 2. Productos comerciales de acción acaricida, formulados con aceites esenciales.
Productos Laboratorio Componentes (aceites esenciales)
Comerciales
Thymovar ®© HyFarmax Timol
Biologic V ® (b) Aceite de salvia y timol
Apiguard ® (a) Vita Europe Ltda. Timol gel
Apitimol® (d) Calier S.A. Timol microencapsulado
Bienenwohl® (e) Mezcla de aceites esenciales, ácido cítrico, ácido oxálico, alcohol, propóleo
Thymix ® (a) Timol, eucaliptol, mentol y alcanfor

Biovarroin ® (a) Timol, eucaliptol, mentol y alcanfor
Apilife-Var ® (a) Chemical Laif Timol, eucaliptol, mentol y alcanfor
FUENTE: Goodwin y Van Eaton (2001) (a). Imdorf et al., (1999) (b). Marinelli et al., (2001) (c). Pajuelo (2004)
(d). Argentina, SENASA (2004) (e).
CONCLUSIONES
El uso de aceites esenciales es una estrategia compatible con la producción más limpia, sin embargo, se
necesitan mayores investigaciones a nivel de campo aplicando y evaluando dosis, formas de aplicación, efectos
climáticos y manejos asociados que permitan validar y determinar la mejor eficacia y eficiencia de los ae, para el
control de las patologías apícolas.
LITERATURA CITADA
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“EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN ABEJAS (Apis mellifera L.) PARASITADAS con

Nosema ceranae, TRATADAS CON EXTRACTO ACUOSO DE MAQUI (Aristotelia chilensis), Y
ACEITES ESENCIALES DE TOMILLO (Thymus vulgaris M.) Y BOLDO (Peumus boldus M.)”
Tesis de grado presentada a la Facultad

de Recursos Naturales como parte de los
requisitos para optar al título de:
INGENIERO AGRÓNOMO
ANDRÉS IGNACIO GUTIÉRREZ COÑA

TEMUCO-CHILE
2015
“EVALUACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA EN ABEJAS (Apis mellifera L.) PARASITADAS con
Nosema ceranae, TRATADAS CON EXTRACTO ACUOSO DE MAQUI (Aristotelia chilensis), Y
ACEITES ESENCIALES DE TOMILLO (Thymus vulgaris M.) Y BOLDO (Peumus boldus M.)”
“Evaluation of gene expression in honeybees (apis mellifera L.) parasitized with nosema ceranae treated
with aqueous extract of maqui (Aristotelia chilensis), essential oils and thyme (Thymus vulgaris m.) and
boldo (Peumus boldus M.)”
Andrés Ignacio Gutiérrez Coña (1)
(1)
Alumno tesista, Universidad Católica de Temuco. Email: andresgutierrezcona@gmail.com
ABSTRACT
Nosema ceranae, a microsporidium fungus, alters the health of parasitized bees (Apis mellifera L.) affecting in
that way the immune system. Fumagillin is the only effective treatment for control of N. ceranae, prohibited in
several member states of the European Union. It is important to find new control alternatives for N. ceranae,
where the aqueous extracts and essential oils have various properties such as antimicrobial, antifungal,
gastroprotective, among others, could be a alternative of potential control.
In this context, it was possible to analyze the genetic expression through the quantification of individual and
social immunity parameters, as activity of phenoloxidase (PO) and glucose oxidase (GOX), respectively.
Moreover, it was possible to analyze the expression of antimicrobial peptides which have a broad spectrum
against microorganisms, in parasitized bees with N. ceranae, treated with one (1) freeze-dried aqueous extract of
maqui (Aristotelia chilensis), and two (2) Essential oils, boldo (Peumus boldus) and thyme (Thymus vulgaris M
.) as enhancers of the immunological condition.
The results showed that the aqueous extract treatment of maqui raised GOX over the witnesses (T0: Healthy bee,
T0 + N: parasitized honeybee with N. ceranae) in parasitized honeybees N. ceranae, in the same way, occurred
for antimicrobial peptides, specifically abaecin and hymenopteacin, results that are encouragers considering in
product formulation as immune system enhancer in the bee. Meanwhile, concerning thyme and boldo essential
oils, there was no response of significant increase in relation to healthy bees in both, GOX and PO.
Keywords: GOX, PO, antimicrobial peptides.

RESUMEN
Nosema ceranae, hongo microsporidio, altera el estado de salud de las abejas (Apis mellifera L.) parasitadas
afectando el sistema inmunológico. La fumagilina es el único tratamiento efectivo para el control de N. ceranae,
prohibido en varios estados miembros de la Unión Europea. Es importante encontrar nuevas alternativas de
control para N. ceranae, donde los extractos acuosos y aceites esenciales al poseer propiedades diversas como
antimicrobianas, antifúngicas, gastroprotectoras, entre otras podrían ser una alternativa de control potencial.
En este contexto, se analizó la expresión génica mediante la cuantificación de parámetros de inmunidad
individual y social, como actividad de la fenoloxidasa (PO) y glucosa oxidasa (GOX), respectivamente, además
fue analizada la expresión de péptidos antimicrobianos, que tienen un amplio espectro contra microorganismos,
en abejas parasitadas con N. ceranae, tratadas con un (1) extracto acuoso liofilizado de maqui (Aristotelia
chilensis), y dos (2) aceites esenciales, boldo (Peumus boldus) y tomillo (Thymus vulgaris M.) como
potenciadores de la condición inmunológica.
En los resultados se observó que el tratamiento extracto acuoso de maqui elevó la GOX por sobre los testigos
(T0: abeja sana, T0+N: abeja parasitada con N. ceranae) en abejas parasitadas con N. ceranae, de igual manera
ocurrió para los péptidos antimicrobianos, específicamente la abaecina y la himenopteacina, resultados que son
alentadores pensando en formulación de un producto como potenciador del sistema inmunológico en la abeja.
Mientras tanto que para los aceites esenciales de tomillo y boldo no hubo una respuesta de aumento significativo
con relación a abejas sanas tanto para GOX como PO.
Palabras clave: GOX, PO, péptidos antimicrobianos.
INTRODUCCIÓN
La demanda de alimentos en este último tiempo se ha incrementado, debido al aumento de la población mundial,
en este sentido para satisfacer tales demandas, se tiene que aumentar la productividad de algunos alimentos
agrícolas, de los cuales un alto porcentaje (39 de los 57 cultivos más importantes del mundo) dependen de la
polinización de las abejas Apis mellifera. Sobre todo la industria del sector frutícola que está estrechamente
relacionada con esta actividad (Pizarro y Montenegro, 2012; Williams et al., 2013). Las abejas son polinizadoras
de mucha importancia económica y un estado de salud alterado puede causar una reducción de la vitalidad,
productividad y polinización por lo tanto el tratamiento de enfermedades infecciosas es de vital importancia
(Botias et al., 2013).
Según Barrera (2015), el negocio de la miel se ve prometedor, en un avance de enero-junio año 2015 la miel
produjo retornos de 27.020.040 USD-FOB, con respecto al mismo periodo del año pasado donde tuvo aumento
en un 43,1% en valor de las exportaciones. El principal destino de las exportaciones de miel es la Unión
Europea, Alemania, Francia, Luxemburgo e Italia donde se va el 90% aproximadamente de la producción
nacional.
Sin embargo, muchas plagas amenazan la salud de las poblaciones de abejas, tales como bacterias, hongos, virus
y ácaros (Diamani et al., 2014; Brutscher et al., 2015). Los hongos microsporidios, Nosema spp., son parásitos
intracelulares obligados, causantes de la nosemosis en la abeja. Existen 2 especies, Nosema apis y Nosema
ceranae (Botias et al., 2013; Gisder and Genersch, 2015; Tsagkarakis et al., 2015). Nosema ceranae, hasta hace
un tiempo específico de Apis cerana, se descubrió en el año 2005 infectado a la abeja europea Apis mellifera L.,
además investigaciones demuestran que Nosema apis está siendo reemplazada por Nosema ceranae (Higes et
al., 2006; 2007; Chen et al., 2009; Mayack y Naug, 2009; Forsgren and Fries, 2010; Alaux et al., 2011; Martínez
et al., 2012).
N. ceranae altera el estado de salud de las abejas lo que se traduce en desnutrición y acortamiento de la vida útil
sin embargo, el efecto más importante es la disminución del sistema inmunológico de las abejas parasitadas
(Dussaubat, 2013; Martínez et al., 2012; Chen et al., 2009; Roberts and Hughes, 2014). Este patógeno no tiene
síntomas externos (Fries, 2010), la fuente de inóculo es principalmente por la heces, que es por donde eliminan
las esporas (Chen et al., 2009).
Las abejas por su estructura cuentan con una barrera física importante que impide la fácil entrada de cualquier
microorganismo. Además poseen dos vías inmunológicas, que son la inmunidad celular en donde implica
procesos como la fagocitosis, nodulación, encapsulación y melanización, todos estos mecanismos están
catalizados por la fenoloxidasa (PO) y la glucosa deshidrogenasa (GLD). Y la segunda vía es la inmunidad
humoral, que implica la síntesis de los péptidos antimicrobianos en respuesta a la infección de un patógeno. Se
han descrito al menos cuatro (4) péptidos antimicrobianos, tales como apideacina, abaecina, himenoptaecina y
defensina, que tienen un amplio espectro contra microorganismos (Antúnez et al., 2009; Chaimane et al., 2012).
Las abejas no solo dependen de inmunidad individual, sino también del funcionamiento general de la colonia en
donde la glucosa oxidasa (GOX) cataliza la oxidación de D-glucosa a ácido glucónico y peróxido de hidrogeno
(H202) las cuales tienen propiedades antisépticas. Esta enzima es secretada en el néctar durante la preparación de
la miel. GOX puede prestar protección inmunológica a nivel de la colonia y prevenir algunas enfermedades de
los estados inmaduros (Alaux et al., 2010a; 2010b, Bucekova et al., 2014). Además, el nivel de GOX en la miel
podría ser uno de los factores que participan en la prevención de las infecciones bacterianas y fúngicas en las
colonias (Bucekova et al., 2014).
El único tratamiento efectivo para el control de N. ceranae es la fumagilina (Botias et al., 2013), este es un
antibiótico que interrumpe la replicación del ADN de este parásito (Williams et al., 2008). Sin embargo, este
fármaco no está autorizado en la mayoría de los estados miembros de la Unión Europea debido a los posibles
residuos en la miel y además el uso reiterado de este tratamiento puede causar resistencia (Porrini et al., 2011;
Botias et al., 2013; Gisder and Genersch, 2015). Debido a lo anterior, es importante encontrar nuevas
alternativas de control para esta patología, de ahí que sustancias naturales como extractos o aceites esenciales de
plantas (Damiani et al., 2014), toman protagonismo.
Las plantas producen metabolitos secundarios con importantes propiedades biológicas, la tendencia hoy en día es
buscar y seleccionar plantas, y usarlas como antimicrobianos naturales, por ser más seguros con el medio
ambiente y la salud humana (Diamani et al., 2014). La flora nativa chilena posee una rica variedad de especie,
que en tiempos prehispánicos fueron utilizadas para varios fines, entre los que destacan alimentación, medicina,
entre otros (Fredes, 2009). El extracto de maqui (Aristotelia chilensis) muestra una interesante capacidad
antioxidante como antimicrobiana debido a la composición fenólica de sus hojas (Avello et al., 2009), así
también el aceite esencial de boldo (Peumus boldus) posee una actividad antifúngica frente a diferentes cepas
hongo (Lima, et al., 2006). El aceite esencial de tomillo originario del mediterráneo, es uno de los más potentes
antimicrobianos, destacando entre sus ingredientes activos el timol y carvacrol (Rosas-Gallos y Lopez-malo,
2011).
En este contexto, el objetivo de esta investigación fue evaluar la expresión génica de enzimas y péptidos
antimicrobianos asociados a la inmunidad de abejas parasitadas con N. ceranae, tratadas con un (1) extracto
acuoso liofilizado (hidrolatos) de maqui (Aristotelia chilensis), y dos (2) aceites esenciales, boldo (Peumus
boldus) y tomillo (Thymus vulgaris M.) como potenciadores de la condición inmunológica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de muestras de abejas

Las abejas (Apis mellifera L.), fueron tomadas de la Estación Experimental de la Escuela de Agronomía, de la
Universidad Católica de Temuco, ubicada en la comuna de Lautaro, sector Pillanlelbun a 14 km al norte de
Temuco, donde se colectaron marcos con pupas a punto de eclosionar que fueron trasladadas a estufa a 27°C y
humedad relativa de 70%. Las abejas fueron utilizadas a los 3 días después de nacidas. Los ensayos se realizaron
en el Laboratorio de Sanidad Vegetal de la Escuela de Agronomía, Campus San Juan Pablo Segundo de la
Universidad Católica de Temuco, ubicado en Rudecindo Ortega N°02950.
Montaje del experimento en laboratorio

El ensayo constó con dos (2) testigos, ambos testigos fueron alimentados con jarabe de azúcar al 50%. Al primer
testigo se le denominó T0, estas abejas eran sanas y al segundo testigo se le denominó T0+N estas abejas fueron
inoculadas con esporas de N. ceranae. Los tratamientos utilizados en este experimento fue un extracto acuoso de
maqui (Aristotelia chilensis), y dos aceites esenciales; boldo (Peumus Boldus M.) y tomillo (Thymus vulgaris
M.), evaluamos 2 tratamientos por cada extracto acuoso o aceite esencial y en uno de los tratamientos las abejas
fueron inoculados con esporas de N. ceranae. Este experimento constó con 3 repeticiones y cada repetición con
20 abejas.
Purificación de esporas de Nosema ceranae
Estas muestras fueron colectadas dentro de la Región de la Araucanía. El análisis consistió en triturar 20
abdómenes de las abejas en 5ml de agua en un mortero, Posteriormente fueron llevados al microscopio de luz y
se vieron a 400x, para ver si había presencia de Nosema spp. Una vez confirmada, se analizaron mediante PCR
en tiempo real para identificar la especie de Nosema. Encontrando la presencia de N. ceranae en estas muestras,
a continuación se purificaron según lo descrito por Dussaubat (2012), que consiste en filtrar con un papel filtro
whatman N°4 todos los abdómenes y seguidamente centrifugar 4 veces a 800g, y hacer tres lavados con agua
destilada, por cada centrifugada se eliminó el sobrenadante. El producto final fue una concentración de esporas
en 2 ml de agua destilada.
Cuantificación de esporas de Nosema ceranae en el hematocitómetro

El conteo de esporas se realizó en el hematocitómetro o cámara de Neubauer bajo un microscopio de luz, además
se ocupó un cubreobjetos especial para este instrumento, el procedimiento utilizado fue el descrito por Dussaubat
(2012), en donde se toman 15 µl de la muestra por cada lado del hematocitómetro y se contaron cinco cuadros de
manera diagonal desde izquierda a derecha en forma descendente, del cuadro de al medio del hematocitómetro,
después se suman los cinco conteos y se dividen por 0,005, las que nos da un catastro de las esporas.
Preparación de inóculo e inoculación de abejas

La preparación de inóculo fue mediante la dilución del concentrado obtenido después de la purificación de
esporas, este caso se complementó con un jarabe de azúcar al 50% (agua-azúcar, 2:1). Este procedimiento fue
basado en lo descrito por Fries et al., (2013) (véase en la ecuación 1)
V1*C1=V2*C2 (ecuación 1)
Dónde:
V1: es el volumen inicial
C1: concentración inicial
V2: volumen a diluir
C2: concentración final
La aplicación de esta fórmula nos da la concentración final de esporas a la dilución, en este caso se añade 2ml de
jarabe de azúcar al 50% (agua-azúcar, 2:1).
La inoculación de abejas se hizo mediante la técnica descrita por Higes et al., (2007), en donde se toman las
abejas, y con la ayuda de una micropipeta de 1-10 µl se le suministran las esporas diluidas en la boca a cada una,
y se espera a que las abejas se tomarán todo el inóculo, las que no se descartaron, para este trabajo se le
suministraron 3 µl de inóculo, dando 3.200 esporas /µl, alrededor de 10.000 esporas por cada abeja inoculada
aproximadamente.
Preparación de extractos acuosos y aceite esencial.
El extracto acuoso de maqui liofilizado, se diluyó 5000 µg /ml en jarabe de azúcar al 50%(agua-azúcar, 2:1), de
esta dilución, tomamos 180 µl y le añadimos 2820 µl de jarabe de azúcar al 50%, obteniendo un volumen final
de 3000µl de extracto diluido en jarabe al 50%, a cada tratamiento se le suministró 400 µl del extracto diluido en
jarabe al 50%, obteniendo una dosis por abeja de 2µg/abeja del extracto liofilizado.
Para el aceite esencial de tomillo la dosis fue de 0,1 µl/abejas, la dilución se realizó de la siguiente manera se
tomaron 15 µl de aceite de tomillo y se le añadió 2985 µl jarabe al 50%, obteniendo un volumen final de 3000 µl
de aceite diluido en jarabe al 50%, a cada tratamiento se le suministroó 400 µl.
Y para el aceite esencial de boldo la dosis fue de 1 µl/abeja, la dilución fue de 150µl + 2850 µl de jarabe al 50%,
el volumen final fue de 3000 µl del aceite diluido en jarabe al 50%, al igual que los anteriores se le suministro
400µl de la dilución a cada tratamiento.
Extracción de RNA y obtención de cDNA.

Se tomaron las muestras de los ensayos, una muestra por cada tratamiento y seguidamente se procedió a la
extracción de RNA, siguiendo el protocolo del fabricante del kit de extracción TRIzol Reagent, 2012. Para esto,
se sumerge la abeja en 1 mL de TRIZOL, se macera el tejido a temperatura ambiente, una vez disuelto el tejido
se agita en vortex por 30 segundos, seguidamente se agregaron 200µl de cloroformo y se dejó encubar por 5
minutos a temperatura ambiente, transcurrido el tiempo se llevó a la centrifuga por 15 minutos a 12000*g a 4°C
en centrifuga refrigerada, a continuación se toma el sobrenadante o fase acuosa y lleva a otro tubo de eppendoft
en donde se le agrega 500µl de isopropanol, se deja 10 minutos a -20 °C, luego se llevó a la centrifuga por 10
minutos a 12000*g a 4°C, posteriormente se retira el sobrenadante y se le agrega 1ml de etanol al 75 % y se
llevó a la centrifuga por 5 minutos a 7500*g, este procedimiento se realiza 2 veces, finalmente se retira el
sobrenadante y se suspende con 50µl de agua desionizada estéril con DEPC y se deja a 4°C en el refrigerador. Se
confirma la integridad del RNA mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% en TAE 1X-DEPC.
Para la obtención de cDNA se usó el kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)
siguiendo las instrucciones del facricante. Primero se diluyó la muestra de RNA en 1:100 (99 µl de DEPC y un
(1) µl de RNA). Seguidamente utilizamos tubos de eppendorf transparentes, con un volumen final de 20 µl se le
agregaron 5µl de dilución de RNA de 1:100, 5µl de DEPC y 10 µl de mix de cDNA, el mix consistió en 20µl de
10x rt buffer, 8µl de 25x dNTPs mix, 20µl de10x RT rondem primers, 10µl de multibalbue recesse troceptase y
42µl de DEPC y seguidamente se dejaron en un termociclador multigene labnet international con 25°C por 25
minutos, 37°C por 120 minutos, 85°C por 5 minutos y las muestras se mantuvieron a 4°C hasta que fueron
retiradas.
PCR en tiempo real para glucosaoxidasa (GOX) y fenoloxidasa (PO)

Las reacciones se llevaron a cabo mediante kit KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2x) Universal (KAPA
Biosystems) y partidores específicos para cada gen (GOX, PO y B-actina como gen de referencia). Las
secuencias de los partidores se muestran a continuación: PO (5-AATCCATTACCTGAAATTGATGCTTAT- 3
y 5´TAATCTTCCAACTAATTCATACGCTCTT-3), GOX (5GAGCGAGGTTTCGAATTGGA-3´) y 5-
GTCGTTCCCCCGAGATTCTT-3) y b-actina (5-ATGCCAACACTGTCCTTTCTGG-3´ y 5-
GACCCACCAATCCATACGGA-3´). La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen final de 15 µL de
acuerdo a las instrucciones de kit KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2x), que consistían en 6,2 µl de agua
DEPC, 7,5 µl del KAPA SYBR FAST qPCR master MIX 2X y 0,15 µl de primers F y primers R y 1µl de
cDNA. La programación del termociclador consistió en una etapa de activación inicial de denaturación, 10
minutos 95°C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95°C, 1 minuto a 59°C, 1minuto a 72°C y una extensión
final de 5 minutos a 72°C, esto según lo descrito por Yang and Cox-Foster, (2005), después fue almacenado a
4°C, el termociclador utilizado fue Eco™ Real-Time PCR system y el software Eco™ Software v4.1.2.0.
Péptidos antimicrobianos del maqui (Aristotelia chilensis)

Las reacciones se llevaron a cabo mediante kit KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2x) Universal (KAPA
Biosystems) y partidores específicos para cada gen (abaecina, defensina, hymenopteacina, la enzima lisozima y
la B-actina como gen de referencia). La secuencia de los partidores se muestran a continuación: Abaecina-F 5´-
CAGCATTCGCATACGTACCA-3´ y Abaecina-R 5´-GACCAGGAAACGTTGGAAAC-3´, Defensina-F 5´-
TGTCGGCCTTCTCTTCATGG-3´ y Defensina-R 5´-TGACCTCCAGCTTTACCCAAA-3´, Himenopteacina-F
5´-CTCTTCTGTGCCGTTGCATA-3´ y Himenopteacina-R 5´-GCGTCTCCTGTCATTCCATT-3´ y LYS-F 5´-
ACACGGTTGGTCACTGGTCC-3´ y LYS-R 5´-GTCCCACGCTTTGAATCCCT-3´. El volumen final fue de
15 µl que consistió en 5 µl de agua DEPC, 7,5 µl de 2x kapa sybr fast qPCR master MIX 2X y 0,75µl del
primers F y primers R 0,5µM y un (1) µl de cDNA. La programación del ciclado contó con una
desnaturalización por 10 minutos a 95°C, y 40 ciclos de 95°C por 10 segundos, 60°C por 20 segundos y 72°C
por 40 segundos, esto según lo descrito por Garrido et al, (2013). El termociclador utilizado fue Eco™ Real-
Time PCR system y el software Eco™ Software v4.1.2.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación de GOX y PO
Los resultados obtenidos se pueden obsevar en la figura N°1. En este caso la expresión, en el gen de la glucosa
oxidasa (GOX) y fenoloxidasa (PO), enzimas que actuan catalizando la oxidación de D-glucosa a ácido
glucónico y peróxido de hidrogeno (H202) las cuales tienen propiedades antisépticas (Alaux et al., 2010a) y en
procesos como la fagocitosis, nodulación, encapsulación y melanización (Antúnez et al., 2009) respectivamente,
donde se puede observar que para la abeja enferma infectada (T0+N) está claramente suprimida, tomando como
referencia el valor 1,0 para la abeja sana (T0). Para las abejas tratadas (T1+N), la expresión de ambos genes es
mayor a una abeja enferma y en el caso de GOX superior a una abeja sana (Figura 1).
T0: corresponde a abeja sana, luego T0+N abejas infectadas con N. ceranae se observa la disminución de la
expresión génica para las enzimas GOX y PO. Al aplicar el tratamiento T1+N: extracto de maqui se observa un
aumento de la expresión génica, llegando a 1,18 con respecto a las abejas sanas (1,0).
Para los aceites T2+N:tomillo y T3+N:boldo no hubo una respuesta de aumento significativo con relación a
abejas sanas, solo levemente mayor que con la expresión en abejas infectadas con N. ceranae en caso de la
expresión de la enzima GOX. En el caso del tomillo (T2+N) la PO se ve levemente más alta que el testigo con
nosema (T0N).
Figura 1. Patrón de expresión del gen GOX (glucosa oxidasa) y PO (Fenoloxidasa) en las muestras analizadas,
tratadas con extractos acuosos. T0: abeja sana; T0+N: abeja con N. ceranae; T1+N: abeja con N. ceranae con
extracto de maqui; T2+N: abeja con N. ceranae con aceite esencial de tomillo; T3+N: abeja con N. ceranae con
aceite esencial de boldo.
Figure 1. Pattern of gene expression of GOX (glucose oxidase) and PO (phenoloxidase) in the samples
analyzed, treated with aqueous extracts. T0: Healthy honeybee; T0 + N: honeybee with N. ceranae; T1 + N:
honeybee with N. ceranae maqui extract; T2 + N: honeybee with N. ceranae with essential oil of thyme; T3 + N:
honeybee with N. ceranae with essential oil of boldo.
Evaluación de péptidos antimicrobianos

Los resultados obtenidos se pueden ver en la figura N°2. En este caso, la expresión de genes de péptidos
antimicrobianos se ven más aumentada en el tratamiento de extracto de maqui en abejas inoculadas con Nosema
ceranae(T1+N), tanto para abaecina como para la himenpteacina con respecto al testigo (T0). En el caso de las
abejas con esporas y sin tratamiento (T0+N) se ve claramente suprimida la expresión de los péptidos
antimicrobianos, con respecto al testigo (T0), el caso del tratamiento sin esporas y con el extracto acuoso de
maqui se ven suprimido para todos los péptidos antimicrobianos, excepto para la enzima lisozima que se
encuentra elevada por sobre el testigo.
Figura 2. Expresión génica de genes de péptidos antimicrobianos en abejas sanas e infectadas con N. ceranae,
tratadas con extractos acuosos. T0: abejas sanas, T0+N: abejas con Nosema; T1: abejas sanas con extracto de
maqui, T1+N: abejas con Nosema con extracto de maqui.
Figure 2. Gene expression of antimicrobial peptide genes in healthy and infected with N. ceranae honeybees,
treated with aqueous extracts. T0: healthy honeybee, T0 + N: honeybees with Nosema; T1: healthy honeybee
extract maqui, T1 + N: honeybees with Nosema maqui extract.
En el presente estudio, se evaluó un extracto acuoso de maqui y dos aceites esenciales, de tomillo y boldo, sobre
la expresión génica de la abeja. Tanto para enzimas que intervienen en procesos de inmunidad celular, como la
fenoloxidasa, y enzima que intervienen en la inmunidad social, y en la asepsia de la colonia de abejas, como lo
es la glucosa oxidasa, además evaluamos la expresión de los péptidos antimicrobianos, frente al tratamiento del
extracto de maqui, resultados que fueron muy alentadores.
Según Alaux et al., (2010a) estudiando la actividad de la fenoloxidasa, observaron un ligero efecto del polen en
las dietas, con una actividad PO superior en abejas alimentadas con una dieta rica en proteínas de mezcla
polifloral en comparación a las abejas control. Por otra parte Lee et al., (2008) señalan que la actividad
fenoloxidasa no es afectada por la calidad de la dieta, pero la actividad antibacteriana es mayor para los insectos
con dietas de alta calidad. Además, es conocido en otros insectos que el nivel de PO puede estar influenciado por
la calidad de la dieta (Lee et al., 2006; 2008). Es también probable que la expresión de la PO se haya visto
afectada por la calidad de la dieta, ya que la alimentación suministrada se basó solamente en jarabe de azúcar al
50% (agua:azúcar/ 2:1).
Sin embargo, Wilson-Rich et al., (2008) y Alaux et al., (2010a) observaron un efecto significativo en relación a
la edad con los diferentes parámetros inmunológicos, donde la actividad de la fenoloxidasa aumenta con la edad.
Quizás a esto se deba que los niveles en general de PO se presenten bajos, ya que se trabajó con abejas jóvenes
que no superaban los 10 días de vida. Así mismo, Schmid et al., (2008) confirman que la actividad fenoloxidasa
en las abejas aumenta con la edad y alcanza una meseta en la primera semana de la vida adulta. Así también, es
probable que los niveles de fenoloxidasa no fueran deprimidos por N. ceranae, si no que le faltaba madurez al
sistema inmune de las abejas. Por su parte Antunez et al., (2009) señalan que la infección de N. ceranae no
afectó la expresión de los niveles de ARNm de fenoloxidasa (PO), confirmando que Nosema ceranae no
interviene en la expresión de la PO. Por otra parte Roberts and Hughes, (2014) señalan que los niveles de PO se
vieron afectados significativamente tiempo después de la exposición a N. ceranae, los niveles más altos fueron a
los 5 días post-exposición, los siguientes días fueron generalmente similares o inferiores. Así también, Di
Pasquale et al., (2013), señalaron que N. ceranae indujo un aumento significativo de la actividad fenoloxidasa en
abejas privadas de polen, en cambio en las abejas saludables en el consumo de polen tuvo un efecto limitado
sobre la actividad PO.
Según Alaux et al., (2010a) El consumo de polen también aumentó en gran medida la actividad glucosa oxidasa,
y además dependiendo del tipo de dieta ésta tenía un efecto pronunciado sobre su actividad, la GOX también
está regida por la edad de la abeja, la cual aumenta con la edad. El extracto de maqui parece tener una buena
reacción frente a la expresión de la GOX, en comparación con los aceites de tomillo y boldo. Por otro lado Alaux
et al. (2010b) evaluando los efectos combinados de infección por Nosema ceranae y la exposición al
neonicotinoide imidacloprid encontraron que disminuyó significativamente la actividad GOX específica en
comparación con los grupos de control, Nosema y imidacloprid, lo que demuestra un efecto sinérgico entre los
dos factores estresantes. En ausencia de factores estresantes la GOX se vio fuertemente deprimida, tanto para el
testigo con N. ceranae, como para los aceites esenciales de tomillo y boldo.
Según Avello et al., (2009), el extracto liofolado de maqui (Aristotelia chilensis) evaluado frente a Candida
albicans, muestra una potente actividad antifúngica, resultado que enriquece las posibilidades del extracto
seleccionado como antimicrobiano. Por otra parte Alonso, (2012), señala que las hojas de maqui mostraron
actividad antibacteriana frente Sarcinia lutea y Staphylococcus aureus. Además sobre el estómago de rata
(Rattus norvegicus), diferentes fracciones de extractos de maqui evidenciaron efectos gastroprotector. Cabe
destacar que Nosema ceranae es un microsporidio que infecta las células epitetiales del intestino medio de las
abejas (Fries, 2010; Higes et al., 2010). También sería interesante analizar, además expresión de genes que
intervienen la inmunidad de las abejas, ver el efecto del extracto de maqui sobre la carga de esporas.
El extracto de boldo presenta un potente efecto antifúngico con diferentes cepas de Candida spp (Lima et al.,
2006). Sin embargo, un estudio realizado por Bravo (2014) señala que los resultados obtenidos del ensayo de
toxicidad se identificó a la esencia de boldo como la más tóxica frente a A. mellifera. A esto se debe que el
tratamiento con boldo los genes tanto para GOX como PO, sean más bajos que incluso el testigo con N. ceranae.
En el caso del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris), según Rosas-Gallo y López-Malo (2010), señalan
que es uno de los aceites esenciales con más propiedades antimicrobianas, siendo el Timol y carvacrol los
ingredientes activos más potentes para una amplia gama de microorganismos. Además el aceite esencial de
tomillo posee una actividad antimicrobiana frente a gérmenes Gran positivos y Gran negativos, además el timol
y carvacrol tienen efectos antimicóticos frente a Candida albicans (Cañigueral y Vanaclocha, 2000). Es posible
entonces que los efectos combinados de los componentes del aceite esencial de tomillo (principalmente el timol
y carvacrol) hayan sido tóxicos para la abeja, ya que en estudios donde evaluaron el efecto del timol en abejas
parasitadas con N. cerane, este era efectivo para bajar la carga de esporas en la abeja (Costa et al., 2010), si bien
en este estudio se evalúo los efectos sobre la expresión génica en las abejas, quizás sería bueno realizar nuevos
experimentos y evaluar los efectos del aceite esencial del tomillo y el timol, tanto para la cargas de esporas como
para expresión de genes relacionados con la inmunidad de la abeja, pues es posible que tanto el timol como el
aceite esencial del tomillo bajen las cargas de esporas, pero depriman el sistema inmunológico, dejando a la
abeja expuesta a otro tipo de patógenos.
Según Antúnez et al., (2009), N. ceranae parece suprimir la respuesta inmune mediante la reducción de la
transcripción de algunos genes de péptidos antimicrobianos. En su estudio reportaron que la infección con N.
ceranae no afectó la expresión de los péptidos antibacterianos 4 días después de la infección con este parásito, a
pesar de que el patógeno ya había invadido el epitelio ventricular. Sin embargo, 7 días después de la infección la
expresión de abaecina e himenoptaecina disminuyeron de manera significativa, lo que sugiere que N. ceranae
suprime parcialmente los mecanismos de defensa humoral y celular. Esto coincide con los resultados obtenidos,
donde el testigo con N. ceranae se ve claramente deprimido, pero al aplicar el tratamiento con maqui ambos
péptidos se elevan considerablemente frente ambos testigos. Así también lo confirman Chaimanee et al. (2012)
donde observaron que los niveles de transcripción de la defensina y abaecin en abejas inoculadas con 10^6
esporas mL-1 de N. ceranae eran más bajos que los controles después de 3, 6 y 12 días de inoculación, y los
niveles de ARNm de apidaecin e hymenoptaecin se suprimieron significativamente en comparación a los
controles.
CONCLUSIONES
• Fue posible evaluar la expresión génica de enzimas y péptidos antimicrobianos asociados a la inmunidad
de abejas parasitadas con N. ceranae, tratadas con un (1) extracto acuoso liofilizado (hidrolatos) de maqui
(Aristotelia chilensis), y dos (2) aceites esenciales, boldo (Peumus boldus) y tomillo (Thymus vulgaris M.)
como potenciadores de la condición inmunológica resultando uno de ellos una alternativa de estimulante.
• El extracto de maqui presentó una mayor reacción en la expresión génica tanto para la glucosa oxidasa
como para algunos péptidos antimicrobianos, abaecina e himenopteacina, resultados que pueden ser
considerados en la formulación de un producto que potencie el sistema inmunológico de la abeja.
• Es necesaria la búsqueda e investigación de nuevas y mayor cantidad de plantas nativas y exóticas que
puedan tener propiedades como posibles estimuladores del sistema inmune de la abeja.
LITERATURA CITADA
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ANEXO 6 PLOTER CONGRESO FILAPI
"Título del Proyecto: Desarrollo y evaluación de un producto bioestimulante en
base a compuestos naturales que potencien la respuesta inmunológica de la
abeja Apis mellifera para el control de Nosema ceranae".
INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO
REALIZADOS POR EL PROYECTO
OBSERVACIÓN: El límite máximo de este documento es de 4 páginas, aparte de

la portada
1
Objetivo específico 1: Seleccionar y caracterizar los compuestos naturales con mayor potencial
inmunológico
En una primera etapa para este objetivo se procedió a colectar, purificar e indentificar esporas de Nosema
ceranae en la Región de La Araucanía y parte de la Región del Bio Bio para mantener un stock de esporas para
realizar los futuros ensayos.
La colecta se realizó durante los meses de verano y otoño 2014. Para esto se determinó la muestra mínima a
muestrear según fórmula descrita por Duffau (1999), determinándose un total de 202 colmenas en la región.
Una vez colectadas las muestras, éstas fueron llevadas al Laboratorio de Sanidad de la Universidad Católica de
Temuco y fueron almacenadas a medida que llegaban las muestras hasta su posterior análisis. Posteriormente,
para diagnosticar la presencia de Nosema spp. en las muestras colectadas de toda la región se siguió el
protocolo propuesto por OIE (2008) mediante el recuento de esporas, y luego fueron clasificadas en categorías
de acuerdo a la presencia y cantidad de esporas. Luego, cuando se detectaba la presencia de esporas, las
muestras eran llevadas al Laboratorio de Biotecnología de la misma universidad para realizar pruebas de ADN y
mediante pruebas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y partidores específicos se procedió a detectar
la presencia de Nosema ceranae o Nosema Apis (ANEXO 3: Resultados presencia Nosema Región de La
Araucanía y Región del Bio Bio), mediante la metodología de Duplex PCR (Martín-Hernández et al., 2007)
seleccionando el locus 16s de ARN ribosomal (ANEXO 1: metodologías objetivo específico 1).
Además, en paralelo con la detección de Nosema ceranae, se comenzó a seleccionar y caracterizar los
compuestos (aceites y extractos) a utilizar en el proyecto. Tanto los aceites esenciales como los extractos
iniciales para evaluación fueron elegidos en función de datos bibliográficos (ANEXO 1: metodología objetivo
específico 1). Para elegir los aceites y extractos se evaluaron una cantidad de productos mayor a la propuesta
inicialmente. Se evaluaron 8 aceites esenciales, donde inicialmente se proponía evaluar solo 5. Además, se
incorporaron y cambiaron a nuevos aceites en función de sus características asociadas a control de plagas y
enfermedades en diversos sistemas biológico. También se incorporaron evaluaciones de 5 extractos acuosos
que no estaban considerados inicialmente y que resultaron interesantes de considerar por sus propiedades
funcionales.
Para el caso de la obtención de los aceites esenciales, éstos fueron adquiridos de una empresa fitoquímica de la
región. Los acetites utilizados fueron de boldo (Peumus boldus Molina), ciprés (Cupressus sempervirens L.),
eucaliptus (Eucalyptus globulus Labill.), hinojo (Foeniculum vulgare Miller), menta (Mentha piperita L.), poleo
(Mentha pulegium L.), romero (Rosmarinus officinalis L.), tomillo (Thymus vulgaris L.). Para el caso de los
extractos acuosos, las plantas fueron colectadas de diferentes sectores de la región y luego fueron llevadas al
Laboratorio de Bromatología de la Universidad Católica de Temuco para su posterior extracción y liofilización
Una vez eliminado todo el contenido de agua del extracto preparado, se obtuvo un polvo fino y 100% soluble en
agua y/o en solución azucarada. El material vegetal utilizado para la preparación de los extractos acuosos
correspondió a: Aloe vera (L.) Burm, F., canelo (Drimys winteri J.R.Forst. & G.Forst.), limón (Citrus limon L.)
maqui (Aristotelia chilensis (Molina) Stuntz), ortiga (Urtica dioica L.), quillay (Quillaja saponaria Molina) y romero
(R. officinalis). Además, para los extractos se realizó una ficha de registro de la trazabilidiad con su origen y
entradas de las materias primas y el registro de los datos de producción de estos extractos (ANEXO 2:
Trazabilidad extractos naturales).
Para testear los aceites esenciales y extractos acuosos a diferentes concentraciones en las abejas y medir los
parámetros fisiológicos a la infección por Nosema, fue necesario calcular la dosis letal media (DL50), que
representa la concentración del aceite y extracto a la cual muere el 50% de la población de abejas. Para ello, se
eligieron como mínimo cinco dosis, de modo que al menos tres de ellas estén en ese rango (ANEXO 1:
metodologías objetivo específico 1). También se evaluaron las moléculas tradicionales que son usadas
generalmente por su reconocida actividad biológica: ácidos grasos y glucanos, dichas sustancia no presentan
actividad toxicológica sobre estos insectos por lo cual no fue necesario su cálculo de DL50. Cabe señalar que
los ácidos grasos evaluados no fueron consumidos por las abejas posiblemente por sus características
organolépticas y baja palatabilidad por lo cual no pudieron ser considerados como alternativas, de igual forma
los glucanos no presentan solubilidad y no fue posible su aplicación y evaluación inicial como los otros productos
y no presentaron aceptación por parte de las abeja.
Para la determinación de la dosis letal media (DL50), ésta se calculó mediante análisis Probit, utilizado para
analizar las respuestas de variables binomiales mediante la transformación de la curva de dosis-respuesta
sigmoidal mediante regresión lineal, en la cual se puede analizar (Bliss, 1934), mediante el programa estadístico
SPSS, versión 15.0. (ANEXO 3: Resultados dosis letal DL50).
Los productos seleccionados fueron: extractos de maqui, ortiga; quillay, limón, matico, romero y alcachofa
además de aceite esencial de romero y eucaliptus. Igualmente, para la determinación de las dosis finales en los
productos elegidos se calculó el DL1 como una forma de exigirles mayor seguridad frente al control del patógeno
y resguardo de las abejas, y bajo o igual a este valor se comenzaron las nuevas evaluaciones para los ensayos
de pruebas inmunológicas en las abejas tratadas (ANEXO 3: Resultados dosis letal DL1).
2
Objetivo específico 2: Evaluar tratamientos en abejas infectadas con esporas de N. ceranae, según
parámetros inmunológicos, tales como: presencia de cuerpos grasos, recuento de hemocitos y actividad
enzimática en tejidos.
Con las nuevas dosis definidas se iniciaron ensayos nuevamente de expresión génica, actividad enzimática,
recuento de hemocitos, mediciones de variabilidad y longevidad de las abejas. Las principales desviaciones con
respecto a la planificación y metodologías originales fueron las determinaciones de expresión génica, ya que
constituyen una herramienta de alta tecnificación, precisión y mucho uso, y que actualmente son utilizadas en las
principales investigaciones apícolas asociadas al comportamiento de la abeja y sobre todo en relación al
patógeno Nosema.
Para el análisis de expresión génica de los genes de glucosa oxidasa (GOX), polifenoloxidasa (PO) y péptidos
antimicrobianos se utilizó la técnica de PCR cuantitativo, donde se establecieron ensayos con abejas sanas y
enfermas (inoculadas con N. ceranae) donde posteriormente fueron tratadas con extractos naturales y aceites
esenciales. Para ello, se prepararon diferentes tratamientos con tres repeticiones y 20 individuos por
tratamiento. Al día cero (D0) las abejas fueron colocadas en sus cajas y alimentadas con una solución de
sacarosa al 50% con un alimentador vertical. Al tercer día (D3) los tratamientos con abejas enfermas fueron
inoculados con esporas de Nosema de manera individual con la ayuda de una micropipeta y una concentración
de esporas de 10.000 (ANEXO 1: metodologías objetivo específico 2). Al día 6 (D6) los tratamientos fueron
suministrados con sus respectivos extractos acuosos y aceites esenciales disuelto en una solución de sacarosa
por un periodo de 5 h, posteriormente fueron nuevamente alimentadas con sacarosa. Al noveno día (D9) se
retiró una abeja por tratamiento para los análisis de expresión génica (ANEXO 1: metodologías obejtivo
específico 2). La determinación de glucosa oxidasa y polifenoloxidasa también fueron comprobadas por un Kit
enzimático (Sigma-Aldrich catalogo N° MAK097) proporcionando un procedimiento simple y directo para medir la
actividad GOX y PO. En este caso se realizó la medición en hemolinfa recientemente colectada de abejas
sometidas a diferentes tratamientos y sin tratamientos (control) siendo sometidas al protocolo del kit (ANEXO 1:
metodologías objetivo específico 2) (ANEXO 3: resultados parámetros inmunológicos).
Para el caso de las determinaciones de cuerpos grasos (ANEXO 1: metodologías objetivo específico 2), ésta no
resultó ser confiable, ya que esta determinación considera la grasa total del cuerpo de la abeja la cual puede
estar asociada a la producción de cera, grasas cuticulares y otras, y no necesariamente a una respuesta inmune
(ANEXO 3: resultados contenido de cuerpos grasos).
Para el cálculo de nivel de infección (esporas por abeja) y el peso de la grasa (mg por abeja) se utilizó un
análisis de varianza (ANDEVA), para probar el efecto infección y tratamiento y el efecto peso de la grasa y
tratamiento. Para comparar las diferencias entre los grupos en términos de tratamiento se utilizó la prueba de
comparación múltiple de media de Tukey con un 5% de significancia. Los datos fueron analizados con el
programa SPSS, versión 15.0.
Para medir la producción de hemocitos se procedió a realizar el conteo total de éstos a partir de la mezcla
hemolinfa/safranina siendo determinado mediante la utilización de una cámara de Neubauer Bright Line y un
microscopio de contraste (x 1000) (Alaux et al., 2010a; 2010b) utilizando la fórmula de Jones (1962) (ANEXO 2:
metodologías objetivo específico 2). Para el análisis estadístico en el conteo de hemocitos se realizó un análisis
de varianza (ANDEVA) utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey (p≤0,05), mediante el programa
estadístico SPSS, versión 15.0 (ANEXO 3: resultados parámetros inmunológicos). Sin embargo, en cuanto a los
hemocitos se pudo observar que los tratamientos con extractos acuosos no tuvieron un efecto sobre la cantidad
de hemocitos en las abejas sanas ni enfermas (ANEXO 3: resultados parámetros inmunológicos), ya que la
edad de las abejas es un factor clave que regula los componentes de la respuesta inmune. Este hecho reflejaría
el efecto de inmunosenescencia observado en las abejas obreras, que se caracteriza por una reducción de las
funciones inmunológicas asociada a la edad (Amdam et al., 2005), y al contrario la actividad fenol oxidasa se
incrementa con la edad de las abejas.
Medición de la longevidad
Para determinar el efecto de las sustancias activas y las dietas definidas sobre la longevidad de las abejas
obreras adultas, se siguió los métodos del procedimiento para el estudio de la longevidad en abejas enjauladas
descrito por Schmidt et al. (1987). Se colocaron panales con cría operculada de 20 días de desarrollo en una
caja de emergencia. Todas las abejas obreras adultas se cepillaron de los marcos antes de colocar los panales
en la caja. El panal de la emergencia fue colocado en una estufa incubadora de ambiente controlado a 32-34 °C
y 70% de humedad relativa.
Para probar la longevidad (sobrevivencia) de las abejas alimentadas con extractos, las abejas obreras fueron
removidas de la caja de emergencia y se colocaron 15 abejas obreras por repetición en cajas de acrílico de 10,0
cm de ancho y 11,5 cm de altura equipada con un tubo de vidrio que contiene la dieta líquida para alimentación,
3
totalizando tres repeticiones por tratamiento. Las abejas una vez aplicados los tratamientos fueron alimentados
con jarabe proporcionado ad libitum a través de un tubo plástico con orificios y con tapa rosca.
Todos los tratamientos (extractos) fueron acompañados de sus respectivos controles (abejas sanas sin
extractos y enfermas sin extracto). La mortalidad en cada caja se registró diariamente, durante 30 días. Una vez
contabilizadas las abejas muertas, éstas se retiraron de la caja experimental.
Una vez terminados los ensayos se procedió a analizar los datos mediante estadística descriptiva y luego se
procedió a graficar los datos en Excel. Las curvas de supervivencia fueron generadas a partir del porcentaje de
abejas vivas versus los días desde el inicio del experimento hasta el final de ensayo. En este ensayo las abejas
tratadas con los extractos bajo condiciones de laboratorio y sólo siendo alimentadas con jarabe, se pudo
observar que el extracto de maqui y ortiga a parte de mejorar la expresión génica del sistema inmune (glucosa
oxidasa y polifenoloxidasa) también tendrían un efecto en la sobrevivencia de las abejas, al extender el periodo
de vida en abejas enfermas, al comportarse de manera similar al testigo sano (sobreviviendo entre 18 a 19 días,
comparadas con los otros extractos donde las abejas murieron a los 10 días) y además sin causar un efecto
perjudicial en abejas sanas (al presentar sobrevivencias similares al control sano) (ANEXO 3: resultados
viabilidad (sobrevivencia)).
Objetivo específico 3: Desarrollar un producto bioestimulante a nivel de prototipo.
Para el desarrollo del producto bioestimulante se seleccionaron los extractos de ortiga y maqui para la
formulación, mezclados con quitosano, azúcar y un antioxidante.
Para ello se disolvieron 1 g de quitosano en 60 mL de agua más 1 ml de ácido acético glacial, adicionando
primero el agua desionizada y luego el ácido. Posteriormente, se procedió a calentar la solución a 70 °C
adicionando muy lentamente el quitosano para que no se formen grumos. Luego se deja agitando hasta
disolución completa, si al cabo de dos horas no está disuelta la solución se debe adicionar 0,2 mL más del
ácido. Una vez disuelto se dejó enfriar. A continuación, se midió el volumen final de la mezcla y se calculó el
porcentaje en peso del producto en esta solución. La solución final se dividió en dos partes iguales en volumen.
En el caso de los extractos se pesaron 0,3 g de cada uno (ortiga y maqui, previamente liofilizados) de forma
independiente y se disolvieron en 20 mL de agua desionizada por separado. Paralelamente, se disolvieron 2 g
de sacarosa en 40 mL de agua y se adicionó 0,1 g de ácido ascórbico a la solución y se agitó hasta disolución
total. Luego se dividió la solución en dos partes.
Para la preparación de la formulación se mezclaron 20 mL de solución de extracto de ortiga y maqui (cada uno
por separado) con 20 mL de la solución de azúcar y antioxidante. Posteriormente, se agitó esta solución hasta
que se observó una mezcla homogénea. Después se adicionó gota a gota y con agitación vigorosa todo el
volumen de la solución de quitosano que correspondió aproximadamente a 30-35 mL para cada una de las
soluciones por separado, observándose la aparición de una turbidez en la mezcla. Luego se dividió en dos
partes iguales cada formulación de extracto, donde una parte se centrifugó y la otra no. Ambas se colocaron a
liofilizar.
Para la realización de los ensayo se resuspendieron ambas formulaciones sólidas en agua (sin necesidad de
mezclar con azúcar) para alimentar las abejas.
En los ensayos de expresión génica (polifenoloxidasa, glucosa oxidasa y péptidos antimicrobianos) se pudo
observar que el producto bioestimulante aumentó los niveles de expresión génica de PO con respecto a las
abejas sanas sin el bioestimulante, no así en el caso de abejas enfermas, este parámetro inmunológico se ve
en este caso levemente suprimido para esta enzima y con la aplicación del bioestimulante en abejas sanas la
expresión de este gen es mayor. En el caso de la glucosa oxidasa, esta expresión es superior cuando se tiene a
una abeja enferma tratada con el bioestimulante siendo muy similar a una abeja sana (Figura 12). La
melanización que se relaciona con la inmunidad celular es catalizada por la (profenol) fenoloxidasa (PO) (Decker
y Jaenicke, 2004), y la síntesis de melanina mediada por la PO juega un papel importante en la defensa inmune
del insecto. Por otro lado, la inmunidad social es analizada mediante la actividad enzimática de la glucosa
oxidasa (GOX); la que se expresa principalmente en las glándulas hipofaríngeas (Ohashi et al., 1999),
catalizando la oxidación de β-D-glucosa a ácido D-glucónico y peróxido de hidrogeno, donde éstos dos últimos
presentan propiedades antisépticas (White et al., 1963), los cuales son secretados en los alimentos de las larvas
y en la miel (Sano et al., 2004), contribuyendo a la esterilización de los alimentos de la colonia y por lo tanto a la
prevención de enfermedades.
En relación a los péptidos antimicrobianos, cuando las abejas son infectadas con Nosema ceranae, ésta
disminuye la expresión de estos péptidos (lisozina y defensina). Sin embargo, cuando las abejas son tratadas
con bioestimulante, éste aumenta la expresión de estos péptidos en las abejas sanas así como en abejas
enfermas. Los péptidos abaecina e himenoptaecina se ven aumentados por el bioestimulante tanto en abeja
sana como enferma (Figura 13).
4
En cuanto a los hemocitos se pudo observar que el bioestimulante no tuvo un efecto sobre la cantidad de
hemocitos en las abejas sanas ni enfermas, ya que la edad de las abejas es un factor clave que regula los
componentes de la respuesta inmune. Este hecho reflejaría el efecto de inmunosenescencia observado en las
abejas obreras, que se caracteriza por una reducción de las funciones inmunológicas asociada a la edad
(Amdam et al., 2005), y al contrario la actividad fenol oxidasa se incrementa con la edad de las abejas.
En relación a la sobrevivencia de las abejas tratadas con el bioestimulante bajo condiciones de laboratorio y sólo
siendo alimentadas con jarabe, se pudo concluir que el bioestimulante a base de maqui y ortiga además de
mejorar la expresión génica del sistema inmune también tuvo un efecto en la sobrevivencia de las abejas, al
extender el periodo de vida en abejas enfermas, al comportarse de manera similar al testigo sano (sobreviviendo
entre 18 a 19 días, comparadas con los extractos donde las abejas murieron a los 10 días) y además sin causar
un efecto perjudicial en abejas sanas (al presentar sobrevivencias similares al control sano).
Por lo tanto, el uso de un suplemento alimenticio en dietas (que sea rico en polifenoles y otros componentes
naturales) que ayude a incrementar o sostener el sistema inmune de estos insectos frente al ataque de
patógenos, contribuiría a mejorar la sobrevivencia futura no solo de los adultos sino de las propias larvas que
están por nacer. Además, el maqui se caracteriza por ser rico en compuestos bioactivos (Schreckinger et al.,
2010) y sus extractos de hojas han demostrado posibles actividades nematicidas (Insunza et al., 2001) y
antivirales (Pacheco et al., 1993) y los extractos de ortiga podrían ser adecuados como agentes antimicrobianos
y antibacterianos (Lahigi et al., 2011; Modarresi-Chahardehi et al., 2012).
5
Propuesta de Valor Características
Bioestimulante
Fortalecimiento A partir de material vegetal como ortiga y maqui, cuyos aceites esenciales posee
Sistema una alto grado de efectividad otorgando al producto final la propiedades de
inmunológico de vigorizar el sistema inmunológico de Apis mellifera y con ello fortalecer las
Apis mellifera defensas y respuesta ante ataques de Nosema ceranae
Origen Natural El producto se elabora a partir de material vegetal desde plantas arbustivas como
maqui, especie que forma parte del sotobosque de los bosques nativos del centro
sur de Chile y ortiga herbácea presente naturalmente en la zona centro y sur de
Chile. Sus compuestos que forman la base del producto final presentan un efecto
en mejorar la respuesta inmunológica de Apis mellifera, observados en las pruebas
de laboratorio y cuyos residuos no generan alguna contaminación o impacto
negativo en el suelo agua o atmosfera. Además que no ocasiona ningún efecto
dañino a la salud de los consumidores.
Aumento de la Como efecto de las características y propiedades anteriormente indicadas, las

colonias se ven fortalecidas en su sanidad y por consecuencia en un aumento de la
sanidad y producción vida de cada unidad productiva, esto se refleja en los rendimientos en la
producción de miel y en disminución de los repetitivos costos por tratamientos y
en la disminución de la mortalidad.
Relaciones Participación
Red de alianzas El modelo de negocio se apoya en los socios estratégicos que son Universidad
Católica de Temuco, Consorcio apícola, junto al financiamiento y apoyo de Fondef.
El Consorcio Apícola es una La empresa que realiza investigación, desarrollo e

innovación junto a centros de investigación, para luego comercializar ésta
tecnología a empresas que llevan los productos a los consumidores de todo el
mundo. Esta empresa ha manifestado su interés por el producto formulado.
Esta integración y vinculación permitió desarrollar el producto bioestimulante,

generando las bases de un prototipo probado y listo para ser transferido a la
empresa privada encargada de articular su red de comercialización y asistencia para
el consumidor final, quien además será una fuente continua de retroalimentación
para la empresa y desde ahí a la Universidad.
Recursos y Universidad Católica de Temuco, proveyó la infraestructura y plataformas para

actividades claves desarrollar la investigación referida. Además proporcionó a los investigadores y
profesionales para gestionar el proyecto. Ahora posee los protocolos y
metodologías disponibles para ser transferido al intermediario, así como
proporcionar las asesorías y capacitaciones durante y posterior de la elaboración
del producto bioestimulante comercial.
Canal de distribución Punto de venta principal del Consorcio Apícola, sucursales, pagina web, venta
directa en terreno, farmacias veterinarias y clínicas veterinarias, etc
Relación con el La empresa Consorcio apícola, es quien finalmente tendrá contacto directo con el
consumidor final consumidor final, puede ser empresa de diverso tamaño, organizaciones,
cooperativas, clínicas veterinarias, farmacias veterinarias, pequeños productores y
centros comerciales especializados. La empresa genera programas de capacitación
y difusión, así como también pruebas de campo y paralelamente recibirá
retroalimentación desde sus clientes.
Cliente final Clientes finales estará formado por empresa de diverso tamaño, organizaciones,
cooperativas, clínicas veterinarias, farmacias veterinarias, pequeños productores y
centros comerciales especializados, se relacionaran con la empresa privada por
medio de programas de difusión y asistencia técnica que genere la empresa, a su
vez los participante proveerán de información proveniente del estado de sus
colonias durante y posterior de la aplicación de los tratamientos, datos de
producción y rendimiento, mortalidad y población
V. ANEXOS
ANEXO 1. EVALUACIÓN ECONÓMICA SOCIAL Y PRIVADA 1

A1.1. Evaluación Económica Social
A1.1.1. ¿Qué productos, servicios o procesos se ha considerado en la evaluación

económica social?
A1.1.2. ¿Cuáles son los beneficios y tipo de impactos económico-sociales

cuantificados?
a) Indique cuáles serán los principales ítems de beneficios a nivel país.
b) Indique cuáles son las variables más críticas
c) Indique cuál es la velocidad de logro del impacto.
1
Utilizando el formato de evaluación desarrollado para la presentación inicial del proyecto,
recalcule los indicadores económicos del proyecto con base en los resultados obtenidos, el análisis
del estado del arte y las condiciones económicas actuales. Analice las principales diferencias con la
evaluación ex–ante (Informe de síntesis enviado a las instituciones en la adjudicación). Informe los
indicadores obtenidos. Incluya los detalles de la evaluación económica social, económica privada y
memoria de cálculo utilizada. Esta evaluación debe ser consistente con los impactos indicados en el
punto 4.3. (INCLUYA FORMATO ACTUALIZADO QUE SE UTILIZA EN LA POSTULACION)
1
A1.1.3. ¿Cuál es el horizonte de evaluación y la curva de adopción?
A1.1.4. ¿Cuál es la situación actual? (En la cual no se consideran proyecciones

con el proyecto).
A1.1.5. ¿Cuál será la situación futura a causa de la ejecución del proyecto?
A1.1.6. ¿Cuáles son los beneficios económico-sociales no cuantificados?
A1.1.7. ¿Cuál es el impacto regional del proyecto?
A1.1.8. ¿Cuáles son los indicadores de la evaluación económica-social?
VAN (8%) TIR

millones de pesos %
2
A1.2. Evaluación Económica Privada
A1.2.1. ¿Cuáles son los negocios considerados en la evaluación económica

privada?
a) Negocio Tecnológico para la Institución y Contrapartes (Considere el principal).
b) Negocio Productivo o de Servicios (Considere el principal)
A1.2.2. ¿Qué horizonte de evaluación se ha considerado?
1
A1.2.3. ¿Cuáles son los indicadores económicos del negocio tecnológico
principal para la institución de I&D?
Tasa de TIR
VAN
descuento %
MM$ 10% 1
A1.2.4. ¿Cuáles son los indicadores económicos del negocio productivo o de

servicios principal para un agente intermedio tipo?
Tasa de TIR
VAN
descuento %
MM$ 10%
A1.2.5. ¿Cuáles son los indicadores económicos del negocio productivo o de

servicios principal para la suma de todos los posibles agentes intermedios?
Tasa de TIR
VAN
descuento %
MM$ 10%
1 Es posible utilizar otra tasa pertinente para el sector en la ev. del negocio tecnológico o productivo
2
A1.3. Memorias de Cálculo.
A1.3.1. Memoria de cálculo de la evaluación económico-social.
Situación Sin Proyecto
a) Identificación de Variables Críticas:
b) Cálculo de Ingresos:
c) Cálculo de Costos:
d) Cálculo de Inversiones:
Situación Con Proyecto
a) Identificación de Variables Críticas:
b) Cálculo de Ingresos:
c) Cálculo de Costos:
d) Cálculo de Inversiones:
A1.3.2. Memoria de cálculo de la evaluación económica privada
Negocio Tecnológico para la Institución (Considere el principal)
a) Cálculo de Ingresos
b) Cálculo de Costos
c) Cálculo de Inversiones
Negocio Productivo o de Servicios Tecnológicos (Considere el principal)
a) Cálculo de Ingresos
b) Cálculo de Costos
c) Cálculo de Inversiones
1
A.2.1 Listado de obras de infraestructura
Nombre y Unidad
descripción de la Institucional
Nº infraestructura Usos Dirección (Calle,Nº,ciudd)
1 NO HAY OBRAS DE INFRAESTRUCTURA
A.2.2 Listados de bienes(equipos y otros)
Precio Unidad
Nº Nombre del equipo Marca Serie Modelo Nº Inventario de compra(MM$) Usos Institucional Dirección
1 Freezer vertical ultracongelador HAIER BE06R001T00B2A8B2VL8 DW-86L388 36234 2100000 Mantención muestras de ADN de abejas y Nosema Escuela de Agronomía Rudecindo Ortega 02950, Temuco
2 Spectrophotom eter, cuantificador ác. Nucleicos Life Technologies Invitrogen 2286613180 QUBIT 2.0 FLOROMETER 36235 1545031 Cuantificador de muestras de ADN Escuela de Agronomía Rudecindo Ortega 02950, Temuco
3 Cámara electroforesis horizontal Labnet USA 130306412 ENDURO 15x15 cm E1015-15 34949 364521 Corrida de muestras para observar expresión genica Escuela de Agronomía Rudecindo Ortega 02950, Temuco
4 Sistema de fotocaptura de geles Cleaver Scientific G 15-131205A021 SCL-MICRODOC 36420 2468100 Captura de imágenes para lectura de geles con ADN Escuela de Agronomía Rudecindo Ortega 02950, Temuco
A.2.3 Plan De Mantenimiento
Período entre Unidad
Nº Nombre del equipo Actividades Principales de mantención mantenciones Institucional
1 NO HAY PLAN DE MANTENIMIENTO

Desarrollo y Evaluación de Un Producto Bioestimulante

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Desarrollo y Evaluación de Un Producto Bioestimulante

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PROYECTO FONDEF DE INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO

TITULO DEL PROYECTO: DESARROLLO Y EVALUACIóN DE UN PRODUCTO BIOESTIMULANTE EN

CÓDIGO DEL PROYECTO: CA13I10140

FECHA DE EMISION: 29/01/2016

FIRMA DEL (DE LA) DIRECTOR(A) DEL PROYECTO

1.1 Identificación del proyecto

2.1 Resumen Ejecutivo

En el proyecto se evaluaron 8 aceites esenciales y 7 extractos acuosos de

RESULTADO DE PRODUCCIóN CIENTíFICA (EX "OTROS")

Monto por Reintegrar 3.304.309

El(la) Representante Institucional de cada Institución Beneficiara

El(la) Director(a) del proyecto

3.1.2 Objetivos Específicos

3.3.2 Gastos Ejecutados vs. Presupuesto inicial

3.3.3 Participación de las instituciones y Empresas

3.3.5 Participación de las instituciones y Empresas

4.1 Negocios Tecnológicos y Productivos

4.2.1 Síntesis de las actividades realizadas en Transferencia no existen acciones de transferencia

4.3.2 Impactos científicos-tecnológicos

4.3.3 Impactos Institucionales

4.3.4 Impactos Ambientales

4.3.5 Impactos Regionales

Trámites y servicios - Solicitud de Patente RODRIGO SAMMUT

N° Atención: 151203151306459. Presentación de Escritos

Rut Nombre Domicilio Email Teléfono

Título: Uso de extractos naturales bioestimulantes para abejas Apis mellifera

Hoja Técnica: 41.Hoja Tecnica.pdf

Dibujo Resumen: Untitled.jpg

Instituto Nacional de Propiedad Industrial (INAPI). RUT: 65.999.669-3.

ANEXO 1: METODOLOGÍAS INVESTIGACIÓN Y DESARROLLO

ANEXO 2: TRAZABILIDAD EXTRACTOS NATURALES

ANEXO 4: LITERATURA CITADA

ANEXO 6: PLOTER CONGRESO FILAPI

Metodología Objetivo específico 1: Seleccionar y caracterizar los compuestos naturales con

Obtención de muestras de abejas

Los individuos de Apis mellifera serán colectados y transportados al Laboratorio de Bromatología de la

Cuadro 1. Clasificación según categoría.

Extracción de ADN mediante protocolo de Paolocci et al. (1999)

Extracción de DNA mediante Plant Genomic DNA Kit (TIANGEN)

Cuantificación del DNA

Reacción de PCR para la detección de Nosema ceranae y Nosema apis.

Metodología aceites esenciales y extractos de plantas

Obtención de aceites esenciales

Poleo: planta de 10 a 50 cm de alto perteneciente a la familia Lamiaceae. Su aceite esencial se compone

Romero: es un arbusto aromático, leñoso de hojas perennes de la familia Lamiaceae. Presenta 37

Tomillo: subarbusto pequeño de hasta 40 cm de altura perteneciente a la familia Lamiaceae. Presenta

Obtención de extractos acuosos

Quillay: árbol endémico de la zona Central de Chile. Es un árbol perennifolio de 15 a 20 m de altura,

Determinación dosis letal de aceites esenciales y extractos acuosos

Cuadro 4. Concentraciones de extractos acuosos para determinación de DL50.

Cuadro 5. Concentraciones de EPA / DHA para determinación de DL50.

Purficación de esporas de Nosema

N° de esporas contadas → 0,005 mm3 (cuenta total del volumen celular)

Inoculación experimental con esporas de Nosema

Análisis de la expresión génica de los genes GOX (Glucosa oxidasa) y PO (polifenoloxidasa)

Cuantificación del RNA

Síntesis de cDNA mediante RT (transcripción reversa)

Determinación de glucosa oxidasa mediante kit enzimático

β-D-Glucosa + O2 + H2O + GOx ⎯⎯⎯⎯→Ácido glucónico + H2O2

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra

Metodología ensayo GOX

Cuadro 1.Mezclas de reacción.

ΔA576 = (A570)inicial- (A570)final