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TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
Bióloga
Rodolfo Mejía
Director
APROBADO
APROBADO
1. Introducción………………………………………………………………………...1
2. Marco teórico y revisión de literatura………………………………………………2
2.1. Género Dracula…………………………………………………………………...2
2.1.1. Clasificación taxonómica……………………………………………………….2
2.1.2. Características morfológicas……………………………………………………2
2.1.3. Hábitat…………………………………………………………………………..3
2.2. Cultivo in vitro……………………………………………………………………4
2.2.1. Ventajas y desventajas del cultivo in vitro……………………………………..4
2.2.2. Cultivo in vitro de Orquídeas…………………………………………………...4
2.2.3. Etapas de la micropropagación…………………………………………………6
2.2.3.1. Preparación del explante……………………………………………………...6
2.2.3.2. Crecimiento del inóculo………………………………………………………7
2.2.4. Factores que afectan el desarrollo in vitro……………………………………...7
2.2.5. Problemas del cultivo in vitro…………………………………………………..8
2.2.5.1. Contaminación………………………………………………………………..8
2.2.5.2. Clorosis……………………………………………………………………….8
2.2.5.3. Oxidación fenólica……………………………………………………………8
2.2.5.4. Hiperhidratación…..…...……………………………………………………..9
2.2.5.5. Variación somaclonal……………………………………………………….10
2.2.5.6. Recalcitrancia………………………………………………………………..10
2.3. Reguladores de crecimiento……………………………………………………..10
2.4. Respuesta morfogénica del explante…………………………………………….12
2.4.1. Embriogénesis somática………………………………………………………12
2.4.2. Organogénesis…………………………………………………………………13
2.4.3. Cuerpos protocórmicos………………………………………………………..13
3. Formulación del problema y justificación………………………………………...14
3.1. Formulación del problema………………………………………………………14
3.2. Preguntas de investigación……………………………………………………...14
3.3. Justificación de la investigación………………………………………………...15
4. Objetivos…………………………………………………………………………..16
4.1. Objetivo general………………………………………………………………....16
4.2. Objetivos específicos……………………………………………………………16
5. Materiales y métodos……………………………………………………………...17
5.1. Diseño de la investigación………………………………………………………17
5.2. Población de estudio y muestra……………………………….………………...18
5.3. Variables del estudio……………………………………………………………20
5.4. Métodos.………………………………………………………………………...20
5.4.1. Desinfección…………………………………………………………………..20
5.4.2. Inducción de respuesta morfogénica...……………………………………...…22
5.6. Recolección de la información………………………………………………….25
5.7. Análisis de información…………………………………………………………25
6. Resultados y discusión…………………………………………………………….26
6.1. Desinfección…………………………………………………………………….26
6.2. Inducción de respuesta morfogénica…...………………………………………..40
7. Conclusiones…………………………………………………………………...….42
8. Recomendaciones………………………………………...……………………….43
9. Referencias………………………………………………………………………...45
10. Anexos…………………………………………………………………………...50
Resumen. La técnica de cultivo de tejidos se ha empleado en muchos géneros de
orquídeas de interés comercial. Aproximadamente el 55% de las especies de Dracula
son exclusivas de Colombia y tienen un gran valor como especies ornamentales, el
estudio de la propagación in vitro será fundamental para la comercialización y
conservación de estas especies.
El objetivo general de este trabajo fue desarrollar una metodología adecuada para la
introducción in vitro de segmentos de hojas de Dracula chimaera. Los objetivos
específicos fueron: 1. Establecer un protocolo de desinfección eficaz para los
explantes de Dracula chimaera y 2. Estudiar el efecto de diferentes concentraciones
de las hormonas ANA, k, 2,4-D y BAP en la inducción de respuestas morfogénicas de
los explantes de Dracula chimaera.
Young leaves of mature plants of D. chimaera were sterilized with 70% ethanol and
different concentrations of NaClO in different times. The number of contaminated,
phenolized and chlorotics explants were measured. Three tests of disinfection were
made, the best result was obtained with treatment 4 (2.5% NaClO 5 minutes) of the
third test. This treatment was applied to explantes of the hormonal treatments for
which was used NAA (0, 0.5, 1, 2, 3mg/L), BAP (0, 0.5, 1, 2, 3mg/L), 2,4-D (1,
2mg/L) and Kinetin (0.2, 0.5, 1, 2mg/L). Any answer of the explants was observed to
the hormonal treatments.
When the explantes come from adult plants is necessary a suitable treatment of
disinfection and the use of antioxidant. Tissue culture responses are influenced by
three main factors the physiology of the donor plant, in vitro manipulation and in
vitro plant stress physiology.
Sin embargo, antes de optar por esta técnica se debe analizar muy bien la situación
de costo – beneficio del cultivo a producir, pues esta es una técnica costosa, por lo
que se debe conocer con certeza los campos en los que la técnica tiene aplicabilidad
para tomar una decisión adecuada. Los costos se deben a la mano de obra
especializada, a que las tasas de producción durante la micropropagación son
limitadas, al pobre enraizamiento y a las bajas tasas de supervivencia de las plántulas
durante la aclimatación, además se necesita tecnología avanzada y métodos
específicos para obtener buenos resultados. Otro inconveniente es que se pueden
producir variaciones no deseadas en los especimenes (Alonso, 2002).
Para la propagación clonal se han utilizado diferentes órganos: hojas (Arditti et al.,
1971; Nasiruddin et al., 2003), tallos (Tokuhara & Mii, 2001), raíces y rizomas
(Kerbauy & Maranhão, 1996; Bekele et al., 1995) e inflorescencias (Arditti & Ernest,
1993). En el caso de las orquídeas y de otras plantas ornamentales las hojas pueden
ser utilizadas para la propagación de plantas de interés comercial. La mayoría de las
investigaciones de cultivo de tejidos realizadas con ápices de hojas utilizan plantas
obtenidas de semillas sembradas in vitro, sin embargo estas plantas presentan gran
variabilidad genética. Una solución para esto es utilizar explantes de plantas adultas
con características comerciales deseables (Arditti et al., 1971; Ignacimuthu et al.,
1999).
Para la desinfección del explante se utiliza etanol al 70% para eliminar las burbujas
de aire para que el desinfectante, clorox (hipoclorito de sodio) o hipoclorito de
calcio, tenga mejor contacto con el explante. Luego se utiliza un desinfectante que
puede ser hipoclorito de calcio o hipoclorito de sodio, se puede agregar Tween 20
para reducir la tensión superficial posteriormente se lava el explante con agua
destilada (Pierik, 1990). Para lograr una desinfección más efectiva se puede hacer
una inmersión del explante en un funguicida en la cámara de flujo laminar antes de
sumergirlo en alcohol.
2.2.5.1. Contaminación
2.2.5.2. Clorosis
La clorosis es una alteración en las plantas que se manifiesta por el color amarillento
de los tejidos verdes, puede ser una respuesta al lavado de los explantes con
hipoclorito de sodio debido a las altas concentraciones y tiempos de inmersión que
causan inhibición de la biosíntesis de la clorofila y los carotenoides (Rivera, 1998).
El ennegrecimiento de los tejidos ocurre por acción de enzimas oxidasas que son
secretadas, sintetizadas o están presentes en los tejidos heridos o senescentes. Dichos
exudados varían de especie a especie y suelen ser mezclas de complejos de sustancias
fenólicas. La práctica más común para contrarrestar el efecto de la oxidación
fenólica, es agregar antioxidantes al medio de cultivo que pueden ser inhibidores de
la polifenoloxidasa o adsorbentes, entre los más empleados están el ácido ascórbico,
el ácido cítrico, el ácido málico y el carbón activado (Pierik, 1990).
2.2.5.4. Hiperhidratación
2.2.5.6. Recalcitrancia
La capacidad de regenerar una planta completa que tienen las células vegetales
cuando están sometidas a estímulos adecuados se denomina totipotencia. Así, las
células somáticas de cualquier tejido podrían formar tallos, raíces o embriones
somáticos de acuerdo con la competencia que posean y el estímulo que reciban. Esta
regeneración ocurre en fases consecutivas: la fase de desdiferenciación, donde las
células responden ante cualquier estímulo organogénico o embriogénico; la fase de
inducción, donde las células se determinan para formar un órgano o embrión, y la
fase de realización, donde se forma el órgano o embrión. Estas fases están
directamente afectadas por el balance hormonal del medio de cultivo, por lo cual la
optimización de los protocolos de regeneración debe realizarse teniendo en cuenta los
requerimientos intrínsecos de cada genotipo en cada fase del cultivo (Lindsey, 1989).
2.4.2. Organogénesis
4. Objetivos
Tabla 1. Factores de diseño con sus respectivos niveles y variables respuesta para la fase de
desinfección y de inducción de respuesta morfogénica de los segmentos de hoja de D. chimaera.
Número de explantes
contaminados
Número de explantes
oxidados
Porcentaje de
sobrevivencia
Número de explantes
contaminados
Número de explantes
oxidados
Porcentaje de
sobrevivencia
Número de explantes
que producen
regeneración directa
Número de explantes
sin respuesta
Porcentaje de
sobrevivencia
Número de explantes
que producen
regeneración directa
Número de explantes
sin respuesta
Número de explantes
que producen
regeneración directa
Número de explantes
sin respuesta
Número de explantes
que producen
regeneración directa
Número de explantes
sin respuesta
1. Sin respuesta
Hoja joven Desinfección Respuesta 2. Cultivo contaminado
3. Tejido oxidado
Explante 4. Regeneración indirecta
Medio de cultivo 5. Regeneración directa
Planta adulta
5.2. Métodos
5.2.1. Desinfección
Medio de cultivo
En las pruebas de desinfección se utilizó un medio sólido Murashige and Skoog
MSMA (Medio A para multiplicación de brotes) (34700mg/L) de Sigma (Anexo 2)
suplementado con Mioinsitol (100mg/L), Sacarosa (10000mg/L), Agar de Sigma
(Cultivo de tejido vegetal) (8000mg/L) y con pH ajustado a 5.8.
Se realizaron dos experimentos con tratamientos hormonales para los cuales se utilizó
el tratamiento de desinfección más exitoso del tercer experimento (tratamiento 4):
lavado con jabón Protex, inmersión en Tween 20 al 0.1% durante 20 minutos,
inmersión en Venturina (2ml/L) durante 20 minutos, seguida de alcohol etílico al
70% durante 30 segundos y finalmente inmersión en Clorox® (2.5 % v/v) durante 5
minutos, posteriormente se cortaron los explantes y se sembraron en el medio de
cultivo.
ANA
BAP 0mg/L 0.5mg/L 1mg/L 2mg/L 3mg/L
0mg/L T1 T2 T3 T4 T5
0.5mg/L T6 T7 T8 T9 T10
1mg/L T11 T12 T13 T14 T15
2mg/L T16 T17 T18 T19 T20
3mg/L T21 T22 T23 T24 T25
Medio de cultivo
Los explantes se sembraron en medio Murashige & Skoog basal salt mixture
(4.33g/L) de Phytotechnology, enriquecido con Tiamina (0.1mg/L), Glicina (2mg/L),
Piridoxina (0.5mg/L), Inositol (100mg/L), Niacina (0.5mg/L) y con las hormonas
ANA (Acido naftaleno-acético) (0, 0.5, 1, 2, 3mg/L) y BAP (Bencil-amino-purina)
(0, 0.5, 1, 2, 3mg/L). El pH se ajustó a 5.8. El BAP se agregó al medio antes de
autoclavar y el ANA se esterilizó con un filtro Millipore (0.22µm).
Medio de cultivo
Los explantes se sembraron en medio Murashige & Skoog basal salt mixture
(4.33g/L) de Phytotechnology, enriquecido con Tiamina (0.1mg/L), Glicina (2mg/L),
Piridoxina (0.5mg/L), Inositol (100mg/L), Niacina (0.5 mg/L), Carbón activado
(20mg/L), Ácido cítrico (1000mg/L) y con las hormonas ANA (0.5, 1mg/L), 2,4-D
(1, 2mg/L) y Kinetina (0.2, 0.5, 1, 2mg/L). El pH se ajustó a 5.8.
Frascos de cultivo
Se utilizaron frascos de cultivo de vidrio con tapas de aluminio selladas con
Parafilm®. Los frascos fueron autoclavados a 121 ºC por 40 minutos y 1.2kg/cm2 de
presión.
Condiciones de cultivo
Los frascos se mantuvieron bajo una fuente de luz proporcionada por un tubo
fluorescente de 36 W, con un fotoperíodo de 15 horas luz y una temperatura de 21-
25º C.
6. Resultados y discusión
6.1. Desinfección
Los mayores contaminantes en el cultivo de tejidos son los hongos y las bacterias que
comúnmente se encuentran en las plantas en condiciones naturales, pero debido a que
el medio de cultivo es rico en nutrientes estos hongos y bacterias crecen causando
casi siempre la muerte del explante (Skirvin et al., 1999). Algunos estudios sugieren
que el estrés que se causa a los explantes al cultivarlos in vitro puede ocasionar la
propagación de bacterias endógenas y algunas veces a pesar de que bacterias, como
las Xanthomonas, pueden causar gran pérdida de explantes conforme crecen y se
multiplican, algunos explantes pueden sobrevivir y continuar su desarrollo junto a la
bacteria (Hine-Gómez y Valverde-Cerdas, 2003).
120
T1: 100%
100 T2: 66%
Contaminación (%)
T3:66%
80
T4: 100%
A
60 T5: 100%
T6:66%
40
T7: 66%
20 T8: 66%
T9: 100%
0
1 2 3
Semanas
120
80
T12: 66%
B 60 T13: 77%
T14: 100%
40
T15: 33%
20 T16: 100%
T17: 100%
0
T18: 100%
1 2 3
-20
Semanas
120
100
T 19: 0%
Contaminación (%)
80 T 20: 50%
T 21: 0%
60
C T 22: 0%
40 T 23: 16%
T 24: 100%
20
0
1 2 3
Semanas
Otro aspecto importante que se debe tener en cuenta cuando se utilizan explantes que
no provienen de plántulas germinadas in vitro es que generalmente la contaminación
es alta, por ejemplo, en el estudio realizado por Goh y Tan (1979) con hojas jóvenes
de plantas adultas de Renantanda (Orchidaceae) el mayor porcentaje de
contaminación fue del 54% y el menor fue del 30% (Arditti & Ernest, 1993). En este
trabajo se obtuvieron muy buenos resultados en cuanto a la desinfección de los
explantes con el tratamiento 4 del tercer experimento, además cuando se aplico este
tratamiento para la fase de tratamientos hormonales solo el 4% de los explantes
presentaron contaminación.
Contaminación (%)
80
60
Fúngica
40 Bacterial
A
20 A B B A A B B B A
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tratamiento
100
Contaminación (%)
80
60 Fungica
B Bacterial
40
20
A A B B A C A A A
0
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tratamiento
100
Contaminación (%)
80
60 Fúngica
C
40 Bacterial
20
C B C C C A
0
19 20 21 22 23 24
Tratamiento
Figura 4. Porcentaje de la contaminación causada por hongos y bacterias en cada uno de los
tratamientos con NaClO de los experimentos de desinfección a las tres semanas de observación: A.
Primer experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer experimento. Los tratamientos con letras
iguales no son significativamente diferentes.
A B
C
D
E F
Figura 5. Segmentos de hoja de D. chimaera: A. Contaminado por una bacteria lisa, B. Contaminado
por una bacteria rugosa, C, D, E y F. Contaminados por hongos.
Tanto para el primer experimento como para el segundo, el porcentaje de clorosis fue
muy alto. Para el primer experimento se presentaron diferencias significativas entre
los tratamientos 5, 6, 7 8 y 9 donde el 100% de los explantes presentaron clorosis y
los tratamientos 1, 2 y 3 donde el porcentaje fue menor (77,77%, 66,66% y 77,77%
respectivamente) (Anexo 9). En cuanto al segundo experimento no se presentaron
diferencias significativas entre los tratamientos debido a que el 100% de los explantes
de todos los tratamientos presentaron clorosis (Anexo 10). En el tercer experimento
se presento una diferencia significativa entre los tratamientos 19 y 23 que presentaron
clorosis y los tratamientos 20, 21, 22 y 24 en los que los explantes no presentaron
ningún tipo de clorosis (Anexo 11).
Clorosis (%)
A T4: 88%
60 T5: 100
T6: 100%
40
T7: 100%
20 T8: 100%
T9: 100%
0
1 2 3
Semanas
120
T12: 100%
60 T13: 100%
B
T14: 100%
40
T15: 100%
20 T16: 100%
0 T17: 100%
1 2 3 T18: 100%
Semanas
120
100
T 19: 50%
80 T 20: 0%
Clorosis (%)
T 21: 0%
C 60
T 22: 0%
40 T 23: 83%
T 24: 0%
20
0
1 2 3
Semanas
Figura 6. Porcentaje de explantes con clorosis por tratamiento 1, 2 y 3 semanas después de la siembra
para cada experimento de desinfección realizado: A. Primer experimento, B. Segundo experimento y
C. Tercer experimento.
100
80
Totalmente
Clorosis (%)
60 clorótico
A Bordes
40
cloróticos
20
B B B B A A A A A
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tratamiento
120
100
80
Clorosis (%)
Totalmente
cloróticos
60
B
Bordes
40 cloróticos
20
A A A A A A A A A
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tratamiento
100
80
Totalmente
Clorosis (%)
60 cloróticos
C 40 Bordes
cloróticos
20
B C C C A C
0
1 2 3 4 5 6
Tratamiento
Figura 7. Porcentaje de la clorosis en bordes y en todo el explante para cada uno de los tratamientos
con NaClO de los experimentos de desinfección a las tres semanas de observación: A. Primer
experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer experimento. Los tratamientos con letras iguales no
son significativamente diferentes.
Aunque la mayoría de los explantes solo se tornaban cloróticos en los bordes,
principalmente en el primer y segundo experimento de desinfección, algunos con el
tiempo se tornaron completamente blancos (Figura 8). Por esto, es muy importante
tener en cuenta las dosis y los tiempos de inmersión utilizados pues todos los
desinfectantes son tóxicos para los tejidos (Sánchez-Cuevas & Salaverría, 2004).
A B C
Oxidación (%)
80
T4: 100%
60 T5: 100%
T6: 100%
A 40
T7: 100%
20 T8: 100%
T9: 100%
0
1 2 3
Semanas
120
T10:33%
100 T11: 55%
T12: 44%
Oxidación (%)
80
T13: 88%
60 T14: 100%
T15: 44%
B 40
T16: 11%
20 T17: 77%
T18: 44%
0
1 2 3
Semanas
120
100
T19: 66%
80 T20: 100%
Oxidación
T21: 100%
60
T22: 0%
C
40 T23: 33%
T24: 100%
20
0
1 2 3
Semanas
Figura 9. Porcentaje de oxidación por tratamiento 1, 2 y 3 semanas después de la siembra para cada
experimento de desinfección realizado: A. Primer experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer
experimento.
A B C
El hecho de utilizar plantas adultas puede ser un factor importante para explicar los
altos niveles de oxidación. Alonso (2002) encontró al comparar la oxidación en
explantes procedentes de plantas in vitro con explantes de plantas de invernadero de
Geranio que los explantes de plántulas in vitro no presentaban oxidación mientras que
los explantes de plantas de invernadero presentan un porcentaje de oxidación muy
alto, ya sea colocándolos en oscuridad o en luz. Esto se puede deber a que las
plantas pequeñas tienen menor tendencia a producir exudados fenólicos que las
plantas adultas. A diferencia de lo sucedido con D. chimaera donde la oxidación de
los explantes fue muy alta, sobre todo en los bordes de los explantes (Figura 11), en
los experimentos con hojas de plantas adultas de Phalaenopsis y Renantanda no se
hace mención a ningún tipo de oxidación a pesar de que en dichos estudios se
utilizaron concentraciones de hipoclorito mayores y por tiempos más largos.
100
80
Totalmente
Oxidación (%)
60 oxidados
A
40
Bordes
oxidados
20
A A A A A A A A A
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Tratamiento
100
80
Oxidación (%)
Totalmente
60 oxidados
B
40 Bordes
oxidados
20
B B B A A B C A B
0
10 11 12 13 14 15 16 17 18
Tratamiento
100
80
Oxidación (%)
60 Totalmente
C oxidados
40 Bordes
oxidados
20
B A A C B A
0
1 2 3 4 5 6
Tratamiento
Figura 11 Porcentaje de oxidación en bordes y en todo el explante para cada uno de los tratamientos
con NaClO de los experimentos de desinfección a las tres semanas de observación: A. Primer
experimento, B. Segundo experimento y C. Tercer experimento. Los tratamientos con letras iguales no
son significativamente diferentes.
Los explantes de diferentes partes de la planta responden de manera muy diferente
durante la fase de iniciación del cultivo y por lo tanto los niveles de estrés oxidativo
varían de un explante a otro, esto es algo que se debe tener en cuenta a la hora de
elegir el tipo de estructura para tomar el explante ya que de esto depende el éxito del
cultivo (Benson, 2000a).
Cuando un tejido vegetal se somete a algún tipo de estrés por una patología,
envejecimiento o daño físico, se da una producción incontrolada de radicales libres
que son componentes esenciales del metabolismo normal. Está producción
incontrolada es muy nociva debido a que son moléculas altamente reactivas por que
tienden a aparear el electrón libre con los dominios celulares ricos en electrones como
la membrana lipídica. Aunque las plantas han desarrollado un sistema complejo de
antioxidantes para protegerse contra el ataque de los radicales libres cuando se da el
estrés la protección antioxidante se satura y los radicales libres atacan la membrana
lipídica produciéndose productos de descomposición tóxicos que causan el estrés
oxidativo secundario. La oxidación de las membranas produce la pérdida de la
integridad estructural y por tanto de la funcionalidad que a su vez pueden conducir a
la necrosis y a la muerte del tejido (Benson, 2000a).
80
Sobrevivencia (%) 60
40
20
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Tratamiento de desinfección
Chen y Chang (2001) encontraron que las auxinas 2,4-D, AIA, AIB y ANA retardan
la capacidad de formar embriones en los explantes de Oncidium e inclusive pueden
inhibirla completamente a bajas concentraciones mientras que todas las citoquininas
promovieron su formación (2iP, zeatina, BA, kinetina y TDZ). Además encontraron
que se da un mayor porcentaje de formación de embriones por la parte adaxial del
explante. Sheelavanthmath et al. (2005) compararon el porcentaje de formación de
cuerpos protocórmicos usando protocormos y segmentos de hojas de plántulas con
diferentes hormonas (ANA, AIA, BA, TDZ y K) y encontraron que el mayor
porcentaje de producción se dio en los tratamientos a los que se les aplicó únicamente
BA.
7. Conclusiones
En cuanto a la recalcitrancia de los explantes, esta se puede dar por muchos factores
entre ellos la fisiología de la planta donadora (ciclo de vida), la manipulación in vitro
(componentes del medio de cultivo, la relación de las concentraciones hormonales y
condiciones de cultivo) y el estrés fisiológico que sufre el explante por los métodos
de desinfección y los cortes que pueden generar estrés oxidativo.
8. Recomendaciones
Para controlar la oxidación de los explantes de hojas de D. Chimaera, que fue un gran
obstáculo para la introducción in vitro, se podría evaluar la eficacia de otros
antioxidantes como PVP y cisteina que han sido utilizados con éxito en otros
estudios, también se podría utilizar un medio líquido o realizar cambio del medio de
cultivo cada cierto tiempo, pero esto sería más dispendioso.
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Vargas, W. 2002. Guía ilustrada de las plantas de las montañas del Quindío y los
Andes Centrales. Editorial Universidad de Caldas, Manizales. p. 720-727.
22cm
5cm
Anexo 2. Composición del medio de cultivo Murashige & Skoog (MS).
Experimento: Fecha:
Número de tratamientos: Número de repeticiones:
Número de explantes por repetición:
Unidad experimental variables
Tratamiento Repetición Explante Contaminación Oxidación Clorosis Observaciones
No Bacterial Fúngica si no Si No generales
1
1 2
3
1
1 2 2
3
1
3 2
3
1
1 2
3
1
2 2 2
3
1
3 2
3
1
1 2
3
1
3 2 2
3
1
3 2
3
1
1 2
3
1
4 2 2
3
1
3 2
3
Anexo 4. Formato donde se consignaron los datos obtenidos con los tratamientos
hormonales realizados, teniendo en cuenta la fecha de la observación, los diferentes
tratamientos y las variables a observar. Contaminación: N= no, B= bacterial, F=
fúngica; Oxidación: M= en el medio de cultivo, B= bordes del explante, T= todo el
explante.
Fecha
Experimento Desinfección Contaminación
Tratamiento Repetición Explante Fúngica Bacterial Total Clorosis Oxidación
1 1
2
1 2 1
2
3 1
2
1 1
2
2 2 1
2
3 1
2
1 1
2
3 2 1
2
3 1
2
1 1
2
4 2 1
2
3 1
2
1 1
2
5 2 1
2
3 1
2
Anexo 6. Análisis de varianza para los datos de contaminación del primer
experimento de desinfección con las pruebas de Diferencia mínima significativa
(DMS), Duncan y Turkey.
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
3.51 * 0.1313 77.0817
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
4.91 ** 0.1745 97.2899
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
28.50 ** 0.6660 101.5090
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
2.98 * 0.1138 51.6953
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
0.63 ns 0.0264 120.7863
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
26.36 ** 0.6485 123.8386
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
1.37 ns 0.0558 71.9637
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
2.50 * 0.0973 147.8053
Fuente de variación GL SC CM
F R2 CV
18.17 ** 0.5598 56.5868