60 SECCIÓN II Enzimas: cinética, mecanismo, regulación y función de los metales de transición

O
A B R′
N
.. C R
H H
O

.. ..
1
H

O O H O O
C C
A B
CH2 CH2

Asp Y Asp X

R′ O
N
.. C R
A B 2 H OH

H H
O O O O
C C
Figura 7-5 Representación bidimensional del modelo
de ajuste inducido de Koshland del sitio activo de una liasa. CH2 CH2
La unión del sustrato A — B induce cambios conformacionales
Asp Y Asp X
en la enzima que alinean los residuos catalíticos que
O
participan en la catálisis y tensan el enlace entre A y B, R′
facilitando su escisión. N H + C R
H HO

LOS SUSTRATOS INDUCEN 3 H

CAMBIOS CONFORMACIONALES O O O O

EN LAS ENZIMAS C C

Si bien el “modelo de cerradura y llave” de Fischer explicaba la ex-
quisita especificidad de las interacciones enzima-sustrato, la rigi-
dez implícita del sitio activo de la enzima no podía explicar los
cambios dinámicos que acompañan a las transformaciones catalíti-
cas. Este inconveniente fue abordado por el modelo de ajuste indu-
cido de Daniel Koshland, que establece que a medida que los sus-
tratos se unen a una enzima, inducen un cambio conformacional
que es análogo a colocar una mano (sustrato) en un guante (enzi-
ma) (figura 7-5). La enzima a su vez induce cambios recíprocos en
sus sustratos, aprovechando la energía de unión para facilitar la
transformación de sustratos en productos. El modelo de ajuste in-
ducido ha sido ampliamente confirmado por estudios biofísicos del
movimiento enzimático durante la unión del sustrato.
CH2 CH2
Asp Y Asp X
Figura 7-6 Mecanismo de catálisis por una proteasa as-
pártica como la proteasa del VIH. Las flechas curvas indican las
direcciones del movimiento del electrón. ① El aspartato X actúa
como una base para activar una molécula de agua mediante la
abstracción de un protón. ② La molécula de agua activada ataca
el enlace peptídico, formando un intermediario tetraédrico
transitorio. ③ El aspartato Y actúa como un ácido para facilitar la
descomposición del intermedio tetraédrico y la liberación de los
productos fraccionados mediante la donación de un protón al
grupo amino recién formado. El desplazamiento posterior del
protón en Asp X a Asp Y restaura la proteasa a su estado inicial.

LA PROTEASA DEL VIH
ILUSTRA LA CATÁLISIS ÁCIDO-BASE
Las enzimas de la familia de las proteasas aspárticas, que incluyen
la enzima digestiva pepsina, las catepsinas lisosómicas y la protea-
sa producida por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV,
human immunodeficiency virus), comparten un mecanismo común
que emplea dos residuos de aspartilo conservados como cataliza-
dores ácido-base. En la primera etapa de la reacción, un aspartato
funciona como una base general (Asp X, figura 7-6) que extrae un
protón de una molécula de agua para hacerlo más nucleófilico. El
nucleófilo resultante luego ataca el carbono carbonílico electrófilo
del enlace peptídico dirigido a la hidrólisis, formando un interme-
dio de estado de transición tetraédrico. Un segundo aspartato (Asp
Y, figura 7-6) facilita luego la descomposición de este intermedio
tetraédrico donando un protón al grupo amino producido por la
ruptura del enlace peptídico. Los dos aspartatos del sitio activo
pueden actuar simultáneamente como una base general o como un
ácido general porque su entorno inmediato favorece la ionización
de uno, pero no del otro.
LA QUIMOTRIPSINA Y LA
FRUCTOSA-2,6-BISFOSFATASA
ILUSTRAN LA CATÁLISIS COVALENTE
Quimotripsina
Mientras que la catálisis por proteasas aspárticas implica el ataque
hidrolítico directo de agua sobre un enlace peptídico, la catálisis
 CAPÍTULO 7 Enzimas: mecanismo de acción 61

por la serina proteasa quimotripsina implica la formación de un H O

intermediario covalente de acilo-enzima. Un residuo de seril con-
R1 N C R2
servado, serina 195, se activa a través de interacciones con histidi-
na 57 y aspartato 102. Si bien estos tres residuos están muy separa-
1 O O H N N H O
dos en la estructura primaria, en el sitio activo de la proteína C
madura plegada residen dentro de la distancia de formación de Ser 195
enlaces entre sí. Alineado en el orden Asp 102-His 57-Ser 195, este Asp 102 His 57
trío forma una red enlazada de carga que actúa como “transborda- H O
dor de protones”.
La unión del sustrato inicia desplazamientos de protones que R1 N C R2
en efecto transfieren el protón hidroxilo de Ser 195 a Asp 102 (fi-
gura 7-7). La nucleofilicidad mejorada del oxígeno serílico facilita 2 O O H N N H O
su ataque sobre el carbono carbonílico del enlace peptídico del Ser 195
sustrato, formando un intermediario de acilo-enzima covalente. Asp 102 His 57
El protón en Asp 102 luego lanza a través de His 57 al grupo ami- O
no liberado cuando se escinde el enlace peptídico. La porción del R1 NH2 C R2
péptido original con un grupo amino luego libre abandona el sitio
activo y se reemplaza por una molécula de agua. La red reguladora
3 O O H N N O
de carga ahora activa la molécula de agua al retirar un protón a
Ser 195
través de His 57 a Asp 102. El ion hidróxido resultante ataca el
Asp 102 His 57
intermediario de acilo-enzima, y un transbordador inverso de pro-
O
tones devuelve un protón a Ser 195, restaurando su estado original. H
Si bien se modifica durante el proceso de catálisis, la quimotripsi- C R2
O
na emerge sin cambios al finalizar la reacción. Las proteasas trip- O
4 O O H N N H
sina y elastasa emplean un mecanismo catalítico similar, pero la Ser 195
numeración de los residuos en sus transbordadores de protones
Ser-His-Asp difiere. Asp 102 His 57

O
H
Fructosa-2,6-bisfosfatasa O C R2
La fructosa-2,6-bisfosfatasa, una enzima reguladora de la gluco- 5 O O H N N H O
neogénesis (véase capítulo 19), cataliza la liberación hidrolítica del Ser 195
fosfato en el carbono 2 de la fructosa-2,6-bisfosfato. La figura 7-8 Asp 102 His 57
ilustra los roles de siete residuos de sitios activos. La catálisis impli- HOOC R2
ca una “tríada catalítica” que consiste en un Glu y dos residuos de
His, de los cuales un His forma un intermediario fosfohistidilo co- 6 O O H N N H O
valente. Ser 195
Asp 102 His 57

LOS RESIDUOS CATALÍTICOS
SON ALTAMENTE CONSERVADOS
Los miembros de una familia de enzimas tales como las proteasas
aspárticas o de serina emplean un mecanismo similar para catali-
zar un tipo de reacción común, pero actúan sobre diferentes sus-
tratos. La mayoría de las familias de enzimas parecen haber surgi-
do a través de eventos de duplicación de genes que crearon una
segunda copia del gen que codifica una enzima particular. Los dos
genes, y en consecuencia sus proteínas codificadas, pueden evolu-
cionar de forma independiente, formando homólogos divergentes
que reconocen diferentes sustratos. El resultado se ilustra median-
te la quimotripsina, que escinde los enlaces peptídicos en el lado
carboxilo terminal de los aminoácidos hidrófobos grandes, y la
tripsina, que corta los enlaces peptídicos en el lado carboxilo ter-
minal de los aminoácidos básicos. Se dice que las proteínas que se
derivaron de un ancestro común son homólogas entre sí. El ances-
tro común de las enzimas se puede deducir de la presencia de
aminoácidos específicos en la misma posición relativa en cada
miembro de la familia. Se dice que estos residuos están evolutiva-
mente conservados.
Figura 7-7 Catálisis por quimotripsina. ① El sistema regu-
lador de carga elimina un protón de Ser 195, lo que lo convierte
en un nucleófilo más fuerte. ② El Ser 195 activado ataca el enla-
ce peptídico, formando un intermediario tetraédrico transitorio.
③ La liberación de péptido del amino terminal se ve facilitada
por la donación de un protón al grupo amino recién formado por
His 57 del sistema de carga y retransmisión, produciendo un
intermediario acilo-Ser 195. ④ El His 57 y el Asp 102 colaboran
para activar una molécula de agua, que ataca al acilo-Ser 195,
formando un segundo intermedio tetraédrico. ⑤ El sistema de
regulación de carga dona un protón a Ser 195, lo que facilita la
descomposición del intermedio tetraédrico para liberar el pépti-
do carboxilo terminal ⑥.
LAS ISOZIMAS SON FORMAS
DE ENZIMAS DISTINTAS QUE
CATALIZAN LA MISMA REACCIÓN
Los organismos superiores a menudo elaboran varias versiones fí-
sicamente distintas de una enzima determinada, cada una de las
cuales cataliza la misma reacción. Al igual que los miembros de
62 SECCIÓN II Enzimas: cinética, mecanismo, regulación y función de los metales de transición

Los ensayos de la actividad catalítica de las enzimas se utilizan

Lys 356 Lys 356
con frecuencia tanto en la investigación como en los laboratorios
Arg Arg
+ 352 + 352 clínicos.
P + P +
6– 6–

2– 2–
Enzimología de una sola molécula
Arg 307 Arg 307
– O – O H+ La sensibilidad limitada de los ensayos enzimáticos tradicionales
Glu + Glu
+ H P P
327 + 327 + requiere el uso de un grupo grande, o conjunto, de moléculas de
His His
392 392 enzimas con el fin de producir cantidades medibles de producto.
Arg 257 His 258 1 Arg 257 His 258 2 Los datos obtenidos reflejan así la actividad promedio de las enzi-
mas individuales en múltiples ciclos de catálisis. Los recientes
E • Fru-2,6-P2 E-P • Fru-6-P
avances en nanotecnología e imagen han permitido observar even-
tos catalíticos que involucran enzimas discretas y moléculas de sus-
Lys 356 Lys 356 trato. En consecuencia, los científicos ahora pueden medir la tasa
+
Arg
352 +
Arg
352
de eventos catalíticos individuales, y algunas veces un paso especí-
H + + fico en la catálisis, mediante un proceso llamado enzimología de
H
O una sola molécula, cuyo ejemplo se ilustra en la figura 7-9.
Arg 307 Arg 307
Glu
–
+ H P
+ Glu
–
+
Pi + El descubrimiento de fármacos requiere
ensayos enzimáticos adecuados para
327 + 327 +
His His
392
3
392
4
el cribado de alto rendimiento
Arg 257 His 258 Arg 257 His 258
Las enzimas son objetivos frecuentes para el desarrollo de fárma-
E-P • H2O E • Pi
cos y otros agentes terapéuticos. Éstos generalmente toman la for-
Figura 7-8 Catálisis por fructosa-2,6-bisfosfatasa. ma de inhibidores de enzimas (véase capítulo 8). El descubrimien-
1) Lys 356 y Arg 257, 307 y 352 estabilizan la carga cuádruple to de nuevos fármacos se ve facilitado en gran medida cuando se
negativa del sustrato mediante interacciones carga-carga. Glu puede analizar simultáneamente un gran número de farmacóforos
327 estabiliza la carga positiva en His 392. 2) El nucleófilo His potenciales de forma rápida y automática, un proceso denominado
392 ataca al grupo fosforilo C-2 y lo transfiere a His 258, cribado de alto rendimiento (HTS, high-throughput screening). El
formando un intermedio fosforil-enzima. La fructosa-6-fosfato HTS emplea la robótica, la óptica, el procesamiento de datos y
ahora deja la enzima. 3) El ataque nucleofílico por una molécula microfluidos para conducir y monitorizar simultáneamente miles
de agua, posiblemente asistida por Glu 327 que actúa como una de ensayos paralelos de enzimas. Los dispositivos HTS emplean
base, forma fosfato inorgánico. 4) El ortofosfato inorgánico se
libera de Arg 257 y Arg 307. (Reproducida con autorización de
Pilkis SJ, et al. 6-fosfofructo-2-cinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa:
una enzima de señalización metabólica. Annu Rev Biochem
1995;64:799. © 1995 por Annual Reviews, www.annualreviews.org.)

otras familias de proteínas, estos catalizadores de proteínas o isozi-

mas surgen a través de la duplicación de genes. Mientras que las
proteasas homólogas descritas actúan sobre diferentes sustratos,
las isozimas difieren en características auxiliares tales como la sen-
sibilidad a factores reguladores particulares (véase capítulo 9) o la
ubicación subcelular que las adapta a tejidos específicos o circuns-
tancias en lugar de sustratos distintos. Las isozimas que catalizan la
reacción idéntica también pueden mejorar la supervivencia al pro-
porcionar una copia “de seguridad” de una enzima esencial.
1 2 3 4

LA ACTIVIDAD CATALÍTICA Figura 7-9 Observación directa de eventos de escisión

DE LAS ENZIMAS FACILITA
SU DETECCIÓN
Las cantidades relativamente pequeñas de enzimas contenidas típi-
camente en las células dificultan la determinación de su presencia
y abundancia. Sin embargo, la capacidad de transformar rápidamen-
te miles de moléculas de un sustrato específico en productos imbuye
a cada enzima de la capacidad de amplificar su presencia. En con-
diciones apropiadas (véase capítulo 8), la velocidad de la reacción
catalítica que está en monitorización es proporcional a la cantidad
de enzima presente, lo que permite inferir su concentración.
del DNA únicos catalizados por una endonucleasa de restric-
ción. Las moléculas de DNA inmovilizadas en perlas (azules) se
colocan en una corriente fluida de tampón (flechas negras), lo
que hace que asuman una conformación extendida. La escisión
en uno de los sitios de restricción (naranja) por una endonuclea-
sa conduce a un acortamiento de la molécula de DNA, que se
puede observar directamente en un microscopio ya que las
bases de nucleótidos en el DNA son fluorescentes. Aunque la
endonucleasa (rojo) no tiene fluorescencia, y por tanto es invisi-
ble, la forma progresiva en que se acorta la molécula de DNA
(1→4) revela que la endonucleasa se une al extremo libre de la
molécula de DNA y se mueve de sitio a sitio.