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Muestreo para ensayos Microbiolgicos

En El ExamEn dE cualquiEr producto alimEnticio Es importantE la adEcuada sElEccin dE la muEstra, la toma corrEcta dE la misma, su consErvacin y transportE al laboratorio, y la prEparacin para su anlisis. los rEsultados obtEnidos En El anlisis microbiolgico dE las muEstras y su intErprEtacin son nicamEntE vlidos para la muEstra quE sE analiza y sErn tambin vlidos para El lotE dE dondE proviEnE, slo si la muEstra Es rEprEsEntativa y sE tomaron las mEdidas nEcEsarias para prEvEnir cualquiEr contaminacin o altEracin dE sus caractErsticas fisicoqumicas y microbiolgicas.

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escriben: lic. en ciencias biolgicas corina e. Meier

cmeier@fibertel.com.ar
dra. celia l. MelaMed

casos hay dos resultados posibles: positivo o insatisfactorio y negativo o satisfactorio. un plan de dos clases se encuentra definido por los siguientes dos valores: n = nmero de unidades de muestreo a analizar. c = mxima cantidad de unidades de muestreo en las que se puede obtener un resultado insatisfactorio (presencia de un microorganismo o un valor superior a un lmite preestablecido). _Ejemplo: un plan de muestreo para Salmonella con n = 5, c =0 implica que se toman y analizan 5 unidades de muestreo; si no se detecta la presencia de Salmonella en ninguna unidad, el lote es aceptado; si se detecta la presencia de Salmonella en al menos una unidad, el lote es rechazado. b_planes de muestreo de atributos de tres clases: se aplican a anlisis cuantitativos, en los que se definen tres calidades del producto: satisfactoria, marginalmente aceptable e inaceptable. un plan de tres clases se encuentra definido por los siguientes valores: n = nmero de unidades de muestreo a analizar. M = recuentos superiores a este valor son inaceptables y si al menos en una unidad se obtiene un resultado superior a m el lote es rechazado. m = delimita una calidad satisfactoria ( m) de una marginalmente aceptable (> m y m). c = mxima cantidad de unidades de muestreo en las que se puede obtener un resultado en el rango de calidad marginalmente aceptable. _Ejemplo: un plan de muestreo para coliformes con n = 5, c =2, m= 10 ufc/g, m= 100 ufc/g implica que se toman y analizan 5 unidades de muestreo; el lote ser aceptado si todos los recuentos se encuentran por debajo de 10 ufc/g, o si como mximo en 2 unidades los recuentos se encuentran entre 10 y 100 ufc/g; el lote ser rechazado si al menos en una unidad se obtiene un recuento superior a 100 ufc/g, o si en ms de 2 unidades se obtiene un recuento superior a 10 ufc/g. _Planes de muestreo de variables: se aplican a datos cuantitativos y se puede utilizar slo si se conoce previamente que los microorganismos (el logaritmo de su recuento) se distribuyen en el lote con una frecuencia normal. como generalmente esto no ocurre, estos planes son poco aplicables en microbiologa.

clmelamed@infovia.com.ar resulta importante contar con procedimientos escritos que describan cmo realizar el muestreo y planillas en las que se registren todos los datos del muestreo. El conocimiento de las definiciones involucradas en la temtica tambin es fundamental. veamos algunas de ellas: _lote: cantidad de un alimento que es producido en condiciones uniformes (Ejemplo: produccin de un turno de un determinado da o produccin delimitada por dos procedimientos de limpieza y desinfeccin completos). _Muestra: grupo de unidades tomadas de una poblacin para estimar uno o varios parmetros. para que la muestra sea representativa las unidades deben ser seleccionadas en forma aleatoria de manera que reflejen, tanto como sea posible, el lote del cual proceden. _Unidad de muestreo: porcin individual que se extrae de una muestra (Ejemplo: una botella de agua). _Unidad analtica: parte de la muestra que es utilizada en el laboratorio para el anlisis (Ejemplo: 100 ml para el recuento de coliformes).

Planes de MUestreo
un plan de muestreo es un procedimiento de extraccin de una muestra, el anlisis de una determinada cantidad de unidades de muestreo y la toma de decisin al comparar los resultados obtenidos respecto a un criterio establecido (estndares, especificaciones o guas). los planes de muestreo pueden ser de atributos o de variables. _Planes de muestreo de atributos: se aplican a datos cualitativos y cuantitativos; se utiliza cuando no se posee informacin previa del producto (proceso, datos de muestreo anteriores, etc.), como suele ocurrir en la mayora de los casos. Este tipo de plan de muestreo se divide adems en planes de atributos de dos clases y de tres clases. a_planes de muestreo de atributos de dos clases: se aplican generalmente a anlisis cualitativos, es decir cuando se determina la presencia/ausencia de un microorganismo. puede aplicarse tambin a anlisis cuantitativos si se define previamente un valor lmite que defina si un resultado es no satisfactorio (si supera ese valor) o satisfactorio (si se encuentra por debajo de ese valor). En ambos

eleccin de Un Plan de MUestreo

la icmsf ha sugerido una clasificacin de planes de muestreo que comprende 15 casos, definidos por el tipo y severidad del peligro de los microorganismos y por otra parte considerando la manipulacin que tendr el producto luego del muestreo y cmo ser consumido. la clasificacin es la siguiente: (cuadro 1) nivel de peligro para la salud_condiciones en las cuales el producto ser manipulado y consumido luego del muestreo. En la eleccin del/los microorganismo/s a analizar se debe tener en cuenta el tipo de producto, su historial como productor de enfermedades transmitidas por alimentos (en el caso de patgenos), la determinacin de su vida til, etc. a continuacin se detalla una clasificacin de microorganismos o grupos de microorganismos de acuerdo a la severidad de su peligrosidad: _Peligro severo: patgenos que presentan un peligro alto; ejemplo: Clostridium botulinum,
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nivel de Peligro Para la salUd

condiciones en las cUales el ProdUcto ser ManiPUlado y consUMido lUego del MUestreo condiciones producen una condiciones no condiciones reduccin producen un cambio puede incrementar se reduce la vida til caso 3 3 clases n= 5, c= 1 El peligro se incrementa caso 6 3 clases n= 5, c= 1 caso 9 3 clases n= 10, c= 1 caso 12 2 clases n= 20, c= 0 caso 15 2 clases n= 60, c= 0

si el producto est destinado a una poblacin susceptible se deben aplicar planes de muestreo ms exigentes.

sin peligro directo para la salud aumenta la vida til sin cambio contaminacin caso 1 general, vida til, etc. 3 clases n= 5, c= 3 con peligro para la salud bajo, indirecto (indicadores) moderado, directo, diseminacin limitada moderado, directo, diseminacin potencial severo, directo reduccin del peligro caso 4 3 clases n= 5, c= 3 caso 7 3 clases n= 5, c= 2 caso 10 2 clases n= 5, c= 0 caso 13 2 clases n= 15, c= 0 caso 2 3 clases n= 5, c= 2 sin cambio en el peligro caso 5 3 clases n= 5, c= 2 caso 8 3 clases n= 5, c= 1 caso 11 2 clases n= 10, c= 0 caso 14 2 clases n= 30, c= 0

eleccin de M y m El valor m se encuentra definido por un nivel de peligro o de una contaminacin inaceptable. El valor m se encuentra definido por buenas prcticas; en los planes de dos clases para patgenos, m es cero o un valor pequeo. los valores m y m son independientes. eleMentos de MUestreo
_Utensilios de muestreo: se pueden utilizar cucharas, cuchillos, bistures, pipetas, marcos, tijeras de un material resistente que no provoque cambio alguno que pueda afectar los resultados de los anlisis. sus superficies deben ser lisas, libres de asperezas y con esquinas redondeadas. si el utensilio presenta soldaduras, stas deben soportar la temperatura de esterilizacin. tambin se pueden realizar muestreos mediante hisopos o esponjas. En todos los casos los elementos de muestreo deben estar limpios, secos y estriles. _recipientes para la muestra: deben ser de un material no txico, impermeable, con cierre hermtico, tales como frascos de vidrios o plstico de boca ancha, o bolsas de plstico descartables. los recipientes deben estar limpios, secos y estriles. la capacidad debe ser la adecuada para tomar la unidad de muestra deseada. En el caso de recipientes reutilizables, la calidad de los mismos debe ser la adecuada como para tolerar esterilizaciones repetidas. _esterilizacin de los elementos de muestreo: los mtodos de esterilizacin recomendados son los siguientes: a_En autoclave a 121c durante 15 minutos, especialmente para los materiales que no soporten el calor seco. b_En estufa a 160-180c durante 2 horas. alternativamente se pueden utilizar los siguientes mtodos, teniendo en cuenta que no eliminan todas las esporas: a_inmersin del utensilio en alcohol etlico 95% y posterior flameado; este procedimiento se repite dos veces ms asegurndose que se haya apagado la llama antes de sumergirlo nuevamente en alcohol. b_inmersin en una solucin de hipoclorito de sodio de 50 ppm de cloro libre durante al menos 30 segundos (este mtodo no es esterilizante).

_cUadro 1 Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Vibrio cholerae o1, Listeria monocytogenes para grupos de riesgo. _Peligro moderado con diseminacin potencial: patgenos que presentan un menor peligro y la posibilidad de producir infecciones secundarias a partir de personas infectadas; generalmente poseen dosis infectivas bajas y pueden producir una enfermedad grave en personas susceptibles; ejemplo: Escherichia coli patgena, otras serovariedades de Salmonella no consideradas en el punto anterior, Listeria monocytogenes. _Peligro moderado con diseminacin limitada: patgenos que producen enfermedades sin provocar en general infecciones secundarias; ejemplo: Bacillus cereus, Clostridium perfringens A, Staphylococcus aureus. _Peligro bajo, indirecto: microorganismos o grupos de microorganismos que se consideran indicadores de falta de higiene, de un subproceso, etc., pero no se puede establecer una relacin entre su presencia y la de patgenos; ejemplo: coliformes, enterobacterias. _sin peligro para la salud: microorganismos o grupos de microorganismos que pueden dar una idea de las condiciones de higiene durante el proceso, o bien de la vida til de un producto, y que no estn relacionados con un peligro para la salud; ejemplo: recuento de aerobios, lactobacilos. con respecto a la manipulacin del producto luego del muestreo se pueden considerar las siguientes posibilidades: _reduccin del peligro: el producto estar expuesto a una condicin que reducir el peligro; ejemplo: Salmonella o Brucella en leche cruda que ser pasteurizada. _sin cambio en el peligro: el producto no estar expuesto a condiciones en que los microorganismos se puedan multiplicar; ejemplo: Salmonella en yogurt. _el peligro puede incrementarse: el producto estar expuesto a la posibilidad de un incremento en los microorganismos; ejemplo: Escherichia coli en zumos de fruta no pasteurizados.

obtencin de la MUestra
El objetivo del muestreo es obtener una muestra representativa del alimento y que el

traslado de la muestra se efecte de manera tal que al llegar al laboratorio tenga las mismas condiciones que tena en el momento de haber sido tomada la muestra. Es importante que el operador que efecta la toma de muestras sea una persona idnea. para que la muestra obtenida pueda representar de la mejor manera al lote de la que fue tomada se deber evitar subjetividades. una forma de asegurar esto es a travs de un muestreo mediante nmeros aleatorios. Esto permite que todas las unidades del lote tengan igual posibilidad de formar parte de la muestra. Este tipo de muestreo tiene la desventaja que no asegura que las muestras obtenidas sean iguales al lote del cual proviene, pero asegura que hayan sido tomadas objetivamente. un programa estratificado de muestreo aleatorio se utiliza cuando se sabe o se supone que el lote no es uniforme. Esta estratificacin permite controlar las variables conocidas de un proceso. los resultados de los distintos estratos se valoran separadamente y luego se unifican si resultan homogneos. Ejemplo: mercadera transportada en distintos contenedores. un fenmeno anlogo

al anterior es el de heterogeneidad, donde se espera que en determinados alimentos la carga bacteriana no sea homognea dentro de la misma unidad de muestreo. Es importante planear el momento de muestreo teniendo en cuenta el tiempo de envo y recepcin de las muestras en el laboratorio para su anlisis y plazos de tiempos que se deban cumplir como por ejemplo las horas desde el ordee hasta la llegada de la leche al laboratorio de la usina.

recoleccin de las MUestras

se extrae un nmero de unidades de muestreo especificado en el programa de muestreo. si es de tipo oficial (ordenado por organismos de control), las muestras se tomarn por triplicado y en acuerdo a lo establecido por el cdigo alimentario argentino a fin de permitir, mediante el anlisis de las contramuestras, la verificacin de los resultados analticos, en caso de ser necesario. siempre que sea posible es conveniente tomar envases cerrados tal como se venden al pblico. En caso contrario, se trasvasa aspticamente una porcin a un envase estril, quitando previamente la contaminacin superficial,

lavando, pasando alcohol 70% o eliminando la parte externa en caso que se trate de envases de papel. para la extraccin de muestras se utilizan instrumentos adecuados al estado de las mismas (sacabocados, palas o paletas, pipetas u otros) y recipientes apropiados para el traslado de modo que no haya prdida de contenido. En caso de un alimento a granel, se extraen porciones de diferentes puntos del contenedor (si no se puede homogeneizar previamente), a menos que se conozca por experiencia previa la homogeneidad del alimento o que se haya determinado un punto especfico que resulte representativo. si se toma una muestra de un conducto de salida, se debe evitar tomar de las primeras fracciones con el fin de limpiar la salida del flujo. En caso que el operador no pueda tomar una muestra en forma estril por la naturaleza de la misma, deber informarlo al laboratorio y extremar los cuidados durante el transporte a fin de evitar al mximo la proliferacin microbiana. Es recomendable registrar la temperatura del alimento del que se obtiene la muestra, as como la temperatura ambiente donde se almacena.

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taMao de la Unidad de MUestreo

la unidad de muestreo debe tener un tamao mnimo de alrededor de 200 gramos que permita la bsqueda de distintos microorganismos a travs de diferentes procesos (por ejemplo Salmonella spp. y coliformes) y que sea suficiente para repetir el anlisis en caso de ser necesario. En ese caso debe procurarse que la reserva se mantenga en condiciones como para que su carga microbiana no se vea alterada.

ejeMPlos de Planes de MUestreo

Zumos de frutas y hortalizas no pasteurizados (listos para el consumo) (segn reglaMento 2073/2005 de la Unin europea) MicroorganisMo Escherichia coli Plan de MUestreo y lMites n=5, c=2, m=100 ufc/g m= 1000 ufc/g n=5, c=0, ausencia en 25 g Mtodo analtico iso 16649-1 o 2 fase en la QUe se aPlica el criterio proceso de elaboracin productos comercializados durante su vida til

identificacin de las Unidades de MUestreo

Es importante registrar toda la informacin necesaria para su correcta identificacin. Ejemplo: nmero de unidad de muestreo, contenedor, identificar muestra original y contramuestras, nmero de acta, firma y aclaracin del responsable del muestreo, etc.

salmonella

En/iso 6579

leches fermentadas (segn cdigo alimentario argentino art.576 5.4) MicroorganisMo coliformes/g (30c) coliformes/g (45c) Hongos y levaduras/g criterio de acePtacin n= 5 c = 2 m= 10 m= 100 n= 5 c= 2 m< 3 m= 10 n= 5 c= 2 m= 50 m=200 categora 4 4 2 norMa fil 73 a: 1985 apHa: 1992 c 24 (1) fil 94b: 1990 (2)

acondicionaMiento y transPorte de las MUestras

se debe evitar durante el transporte al laboratorio cualquier alteracin de las muestras de modo de asegurar que stas al ser examinadas por el laboratorio sean las mismas recogidas y documentadas por la persona que efectu el muestreo. El tipo de acondicionamiento depender del estado fsico del producto (lquido, slido o semislido). deber tomarse en cuenta la naturaleza del producto, y su presentacin. El transporte debe realizarse en recipientes adecuados donde se respeten las temperaturas de conservacin del producto. las muestras deben ser enviadas con la mayor brevedad posible al laboratorio. los productos lquidos deben ser analizados dentro de las 24 horas desde el momento de muestreo, los productos refrigerados, dentro de las 36 horas de su recoleccin.

BiBLiogrAfA: fdA. BACtErioLogiCAL AnALytiCAL MAnuAL onLinE: www.CfSAn.fdA.goV/~EBAM/BAM-1.htML (10/2007) / fSiS-uSdA. ProCEdurES for CoLLECting And SuBMitting doMEStiC SAMPLES for MiCroBioLogiCAL AnALySiS: www.fSiS.uSdA.goV/oPPdE/rdAd/fSiSdirECtiVES/10230-2.Pdf / iCMSf. 1986. MiCroorgAniSMS in foodS, VoLuMEn 2. SAMPLing for MiCroBioLogiCAL AnALySiS: PrinCiPLES And SPECifiC APPLiCAtionS. 2nd Ed. uniVErSity of toronto PrESS, toronto./ iCMSf. 1981. MiCroorgAniSMoS dE LoS ALiMEntoS. MtodoS dE MuEStrEo PArA AnLiSiS MiCroBioLgiCoS: PrinCiPioS y APLiCACionES ESPECfiCAS. VoLuMEn ii. EditoriAL ACriBiA, ZArAgoZA (ESPAA)/ LEy 18284 (Cdigo ALiMEntArio ArgEntino) LoS dAtoS PErtEnECEn A dE LA CAnAL y ASoC. S.r.L. www.dELACAnAL.CoM.Ar, tELfono: (+541) 322-3232. E-MAiL: dELACAnAL@ESCAPE.CoM.Ar

inforMe de toMa de MUestra

Es necesario elaborar un informe detallado del muestreo, firmado por la persona responsable de la obtencin de las muestras y refrendado por los representantes de las partes interesadas, si estn presentes. <<

PErfiL dE LAS AutorAS: CorinA E. MEiEr y CELiA L. MELAMEd SE dESEMPEAn En LA SuBCoMiSin dE ACrEditACin dE LABorAtorioS dE MiCroBioLogA dE ALiMEntoS - diViSin dE ALiMEntoS, MEdiCAMEntoS y CoSMtiCoS ASoCiACin ArgEntinA dE MiCroBioLogA.