UNIVERSIDAD DE SONORA

División de Ciencias e Ingeniería

Departamento de Ciencias Químico Biológicas y
Agropecuarias

QUIMICA ANALITICA II

Preparado por:
Dr. Jesús Ortega García

H. Caborca, Sonora, México, 2023

 UNIVERSIDAD DE SONORA
División de Ciencias e Ingeniería
Departamento de Ciencias Químico Biológicas y
Agropecuarias

4. Espectroscopia de Fluorescencia

Preparado por:
Dr. Jesús Ortega García

H. Caborca, Sonora, México, 2023

 4.1. Fundamento de la Fluorescencia

relajación vibracional

S2 conversión interna IC

relajación vibracional
cruce intersistemas ISC

S1 T1
kNR IC

huA huF
kNR ISC
huP

S0
fluorescencia fosforescencia
LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado

§ Se alcanza el estado excitado por absorción de luz en:

FLUORESCENCIA estado singulete excitado, transición permitida, ns

FOSFORESCENCIA estado triplete excitado, transición prohibida, ms

§ Se alcanza el estado excitado por una reacción química:

QUIMIOLUMINISCENCIA
OBSERVAR: la escala de tiempo de los procesos:
• ABSORCION: ~ 10-15 seg
• CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg
• FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg
• FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transición “prohibida” )
• RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg
Los pasos propiamente dichos de absorción y de emisión son extremadamente
rápidos, tanto que los núcleos no llegan a moverse (principio de Franck-
Condon). La absorción sólo da información del entorno inmediato a la
molécula que absorbe.
La relajación vibracional por lo general es mucho más rápida que la
fluorescencia, entonces la molécula se relaja completamente y (en general)
sólo vemos la emisión desde el estado S1.
La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de
movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia posee
información de un entorno más amplio que el de absorción.
 FLUORESCENCIA
• 1er. paso: absorción o excitación
energía suficiente para llegar a nivel
electrónico superior S1 o S2
λexc

ESTADO EXCITADO

• 2do. paso: emisión de luz

energía radiativa emitida menor que la
absorbida, λem > λexc

Corrimiento de Stokes
 RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA (Q):

Rendimiento (Q) = fotones emitidos <1

fotones absorbidos

en términos cinéticos de cada proceso:

= constante de velocidad de emisión

= constante de velocidad de decaimiento no radiativo

TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluoróforo pasa en el estado
excitado antes de volver al estado basal (por cualquier vía)

= tiempo de vida medida

TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si sólo volviera al estado basal

por fluorescencia

= tiempo de vida intrínseca o natural,

sin ningún proceso no radiativo

Se relacionan:
 Parámetros a medir en fluorescencia

• Intensidad de fluorescencia (ISS)

• Espectros de excitación y emisión (IF vs λ)

• λmax(ex), λmax(em)

• Rendimiento cuántico de fluorescencia (Q)

• Vida media del fluoróforo (t)

• Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional)

• Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)

Intensidad de fluorescencia
Intensidad resuelta en el tiempo (t)
(estado estacionario) ISS

Pulso de luz
Iluminación continua
 4.2. Instrumentación

ESPECTROFLUORÍMETRO
 ESPECTROFLUORÍMETRO

FUENTE DE LUZ: Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (laser, LED)

MONOCROMADORES: excitación y emisión vs FILTROS

ancho de banda
polarizadores

DETECTOR: tubo fotomultiplicador (PMT)

MUESTRA: geometría de iluminación de la muestra

La medida de IF es relativa a la
geometría del equipo
Intensidad de Fluorescencia y concentración del fluoróforo

Efecto de filtro interno

 Cuantificación del fluoróforo
midiendo Intensidad de fluorescencia IF

IF (λex, λem) = IA Φ Z Z = factor instrumental

Φ= rendimiento cuántico de F

IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l)
ε = coef. Absortividad a λexc
c = concentración del fluoróforo

IF (λex, λem) = I0 Φ Z 2.3 ε c l

IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas

Usar soluciones diluidas A < 0.05

Control con solo solvente

Usar adecuada λexc, filtro, conc. fluoróforo

Filtrar la solución
 4.3. Aplicaciones

Fluoróforos en bioquímica

• Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural, propia del

sistema

• Fluorescencia extrínseca agrego a la muestra un

fluoróforo externo (sonda fluorescente)
Fluorescencia en:

• Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos aminoacídicos

aromáticos, predomina el triptofano.

Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP y

derivados.

• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca, se agregan sondas

fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI).

• Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas liposolubles con

baja fluorescencia en agua (DPH, ANS) o fosfolípidos marcados.
Fluorescencia en:
• NAD(P)H
• FAD, FMN
• Piridoxal fosfato (PLP)

• Clorofilas

• Indicadores fluorescentes
(pH, Na+, Cl-, Ca2+, O2)
 4.7 ns en solución
0.4 ns en solución (2.3 ns FMN)
1-5 ns unido a DH 0.3-1 ns unido a prot.
Phe Abundancia: 3.5%
lex = 260 nm, lem= 282 nm
(Q.e ~ 5)
Insensible al entorno

Tyr Abundancia: 3.5%

lex = 275 nm, lem= 303 nm
(Q.e ~ 220)
Insensible al entorno,
quencheable
Ionizable, tirosinato emite (<Q)

Trp Abundancia: 1.1%

lex = 295 nm, lem= 350 nm
(Q.e ~ 770)
Sensible al entorno, quencheable
Varias t
 Usos de fluorescencia en bioquímica

• Localización sub-celular
• Cambios en la concentración
• Interacciones moleculares
• Cambios conformacionales
• Distancias intra/intermoleculares
• Difusión rotacional
• Caracterización estructural
• Actividad enzimática
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