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ADN
-INTRODUCCIÓN:
Los nucleótidos son los constituyentes de los ácidos nucleicos: acido desoxirribonucleico
(ADN) y ácido ribonucleico (ARN), depositarios moleculares de la información genética.
La estructura de todas las proteínas y en último término de todas las macromoléculas, es
producto de la información programada en la secuencia de nucleótidos de la célula.
-CONSTITUCIÓN MOLECULAR:
Los nucleótidos están formados por una pentosa, una base nitrogenada y un fosfato. En el
caso de DNA, la pentosa es 2-desoxi-D-ribosa (ausencia del –OH en C2´) y en el RNA, es
una D-ribosa (-OH presente en el C2). En cuanto a las bases nitrogenadas, las hay de 2
tipos, las pirimidínicas, cuyo compuesto parental es la pirimidina, de 1 anillo aromático, y
las purínicas, donde la purina es el compuesto parental, de 2 anillos aromáticos.
Dentro de las purínicas se encuentran: adenina y guanina, ambas presentes en DNA y
RNA, y en las pirimidínicas se encuentran: citosina, presenten en ambos ácidos nucleicos,
timina (solo en DNA) y uracilo (solo en RNA).
Si bien, existen 2 características claves que diferencian el DNA del RNA (el azúcar y la
base nitrogenada), lo que le da la identidad a los ácidos es la pentosa, es decir: si existe una
2-desoxi-D-ribosa con unos cuantos uracilos, igualmente, es DNA.
UNIONES EN LOS NUCLEÓTIDOS:
Las bases nitrogenadas se encuentran unida por un enlace N-glicosídico (N9 en las
purínicas y N1 en las pirimidínicas) al C1´ de la pentosa. El fosfato se encuentra
esterificado al C5´ de la pentosa. Los nucleótidos entre sí, se unen por enlaces fosfodiester,
también llamados, puentes fosfatos.
Los esqueletos covalentes del DNA y RNA son hidrofílicos y están constituidos por
residuos alternos de fosfatos y pentosas, mientras que las bases nitrogenadas son
hidrofóbicas y se disponen como grupos laterales unidos al esqueletos covalente a
intervalos regulares. Los grupos fosfatos con un Pka cercano a cero, a Ph 7 se encuentran
totalmente ionizados y cargados negativamente. Esas cargas negativas generalmente son
neutralizadas por cargas positivas de proteínas, poliaminas o metales.

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HIDRÓLISIS DEL DNA Y RNA:

El esqueleto covalente de los ácidos nucleicos experimenta una lenta hidrolisis no
enzimática de los enlaces fosfodiester. El RNA en tubo de ensayo se hidroliza más
rápidamente en condiciones alcalinas, donde sus grupos –OH en C2´ están implicados en
el proceso.
PROPIEDADES DE LAS BASES DE LOS NUCLEÓTIDOS:
Las bases nitrogenadas al ser moléculas aromáticas, tienen efecto sobre la estructura, la
distribución electrónica y la absorción de la luz UV. La deslocalización de los electrones
entre los átomos del anillo, le confiere a la mayoría de los enlaces, el carácter de doble
enlace parcial. Predominan a Ph 7 en su forma tautomérica y presentan una fuerte
absorción de la luz UV a una λ 260nm.
Las bases experimentan interacciones de apilamiento que sitúan paralelamente a los
planos de los anillos de 2 o más bases y uniones por puentes de hidrogeno, que
constituyen el eje mayor de la doble hélice.
Las interacciones de apilamiento están dadas por interacciones Van der Walls (ion-dipolo,
dipolo-dipolo, dipolo-dipolo inducido, o bien, fuerzas de dispersión (London)).
DESNATURALIZACIÓN E HIBRIDACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS:
Una muestra de DNA cuidadosamente aislada es muy viscosa a PH 7 y temperatura de
25°C. Al someterla a valores extremos de PH, temperatura mayor a 80°C y/o con solutos
que compitan con la formación de puentes de hidrogeno que estabilizan la doble hélice, esa
viscosidad disminuye abruptamente, es decir, el DNA experimenta un cambio físico.
La desnaturalización o fusión del DNA implica la rotura de las interacciones de apilamiento
y puentes de hidrogeno. A mayor cantidad de Citosina y Guanina, mayor será la
temperatura requerida para la fusión de las hebras, ya que a deferencia de A y T, las
primeras forman 3 puentes de hidrogeno, mientras que las demás, solo 2.
-Temperatura de Melthing: temperatura a la cual el 50% de la doble hélice de DNA se
encuentra como hebra sencilla.
La hibridación o renaturalización del DNA puede ser un proceso de un solo paso y rápido
en el caso de que al menos una docena de nucleótidos se mantengan aún, en doble hélice.
Por lo tanto, al retornar a las condiciones de PH y temperatura dentro del rango biológico,
las hebras volverán a hibridar constituyendo la doble hélice.

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Cuando las hebras se han separado por completo, la hibridación consta de dos pasos, el
primero es lento, donde mediante colisiones al azar se aparean constituyendo un corto
segmento de DNA y el segundo paso, es rápido, donde las bases se aparean por
complementariedad de bases en un efecto cremallera, dando lugar al dúplex intacto.
PCR: (de suma importancia!! Una de las técnicas moleculares más utilizadas para
amplificar!!)
Se la define como la Reacción en Cadena de la Polimerasa. Es una técnica que permite
ampliar copias de DNA de secuencia determinada. Los reactivos que requiere son:
(importante saberlos!!)
-DNA molde (es decir, el que me interesa amplificar)
-Primers
-dNTPs (desoxiNTPs)
-DNA polimerasa (Taq. Abajo explico porqué Taq)
-Mg++, como cofactor de la Taq
-Buffer
Los primers (se mandar a comprar) van a hibridar en regiones flanqueantes del DNA molde
por complementariedad de bases, indicándole a la polimerasa su sitio de arranque. La
polimerasa utilizada es la Taq por el hecho de que es aislada de organismos que viven en
ambientes con altas temperaturas, de modo que puedan seguir ejerciendo su función en el
termociclador.
Procedimientos: en un termociclador se colocan los reactivos (mencionados arriba) y se
repiten 3 secuencias:
1) Aumento de la temperatura por encima de 90°C para desnaturalizar las hebras de
DNA
2) Disminución de la temperatura a 60°C para que se produzca la hibridación de los
primers
3) Aumento de la temperatura a 72°C para inducir la actividad de la Taq.
https://www.youtube.com/watch?v=TalHTjA5gKU (Ctrl + Clic y los lleva a la
publicación)

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(*) Ojo!! Los pasos detallados son de manera general, cabe destacar que para cada Taq,
y demás factores, las temperaturas pueden variar. Igualmente con que digan lo que está
detallado, está perfecto.
SECUENCIACIÓN DE DNA (método de Sangher):
Es una técnica electroforética que permite separar hebras de DNA que difieran en
solo un nucleótido.
Se basa en la técnica de la PCR con la incorporación de ddNTPs, conocida también por el
método de los didesoxi. Estos carecen del –OH en C3´ (los dNTPs solo carecían del –OH
en C2´), de modo que cuando la Taq incorpore uno de estos a la secuencia que viene
sintetizando, la síntesis se frenará ya que no puede formarse el enlace fosfodiester con el
nucleótido siguiente.
Procedimientos: en un termociclador se colocan 4 tubos con todos los reactivos de la PCR
y un ÚNICO tipo de ddNTP en cada tubo. La incorporación de cada ddNTP está sujeta a
la [] de los mismos. Si bien, la probabilidad de incorporar uno es baja, es la suficientemente
alta como para al menos, incorporar uno solo en cada hebra sintetizada, generando
fragmentos de distintas longitudes.
Finalizada la amplificación, se realiza una electroforesis, donde cada tubo se siembra en
un punto de siembra distinto, de modo que aquel fragmento que migre más, corresponderá
al primers (de secuencia conocida) más un único ddNTP. Como la síntesis ocurre en
sentido 5´3´, la secuencia puede leerse desde abajo hacia arriba en el mismo sentido.
Recordar: la secuencia obtenida es la complementaria a la molde (interés).
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA:
Se basa en el principio de Sangher, con las diferencias que los 4 tipos de ddNTPs se
incorporan en un solo tubo y además, están unidos covalentemente a una molécula
fluorescente, por lo que, al realizar la electroforesis en un gel contenido en un tubo capilar,
la secuencia se identifica, por el color característico emitido por cada fragmento, al ser
iluminado con un láser.

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ELECTROFORESIS:
Consiste en la separación de moléculas cargadas (en este caso, DNA) a través de un
campo eléctrico, sobre un medio soporte. Para DNA se utilizan geles de agarosa en
distintas concentraciones, según el tamaño de las moléculas a separar. La velocidad de
migración es directamente proporcional a las cargas e inversamente proporcional a la masa.
Las partículas con cargas más negativas migrarán más hacia el polo positivo, y aquellas
con menos cargas negativas, migrarán menos. Como en el DNA la relación carga/masa es
constante, la migración es en función a la masa y el superenrrollamiento de la
molécula.

TP N° 1: ELECTROFORESIS DE DNA:
El gel de agarosa se preparó disolviendo agarosa en buffer TBE (tris-borato-EDTA, este
último impide la degradación del DNA por nucleasas) en una proporción del 1, 1.5 o 2%,
según el tamaño de los fragmentos a separar: a mayor [], < el tamaño de los poros. Esta
mezcla se la homogeniza mediante agitación y calor (microondas). También se le debe
añadir un agente que permite la visualización de las bandas de DNA (ya que son
transparentes) una vez finalizada la electroforesis. Puede utilizarse Br - de etidio, que es un
agente intercalante entre las bases del DNA, cuyos electrones desapareados, interactúan
con los electrones no comprometidos de las bases nitrogenadas, generando así, una nube
electrónica que, al aplicarle luz UV, emite fluorescencia. Este compuesto tiene la
desventaja de ser mutagénico, lo que implica gran peligro su manipulación en el
laboratorio, por lo que, generalmente se utiliza Gel-Red o Syber-Green, ya que estos
compuestos, solamente interactúan con el surco menor del DNA.
Esta preparación se vierte en un portagel para dejar solidificar. Antes de que solidifique, se
le debe agregar una peineta (no debe tocar el fondo), encargada de formar los pocillos para
la siembra. Una vez sólida, se retira con cuidado la placa y se introduce el gel en la cuba
electroforética, el cual es totalmente cubierto por buffer de corrida TAE (tris-acético-edta).
Luego, con micropipetas se realiza la siembra, cuyas muestras (incógnitas y patrón) se
encuentran en un buffer de siembra que contiene: TAE, glicerol (aumenta la densidad de
las muestras y permite un correcto asentamiento de las misma en el gel) y azul de bromo
fenol (permite la visualización del frente de avance y poder reconocer cuando cortar la
corriente). Por último se colocan los electrodos.
Al cabo de varios minutos, se desconecta la corriente eléctrica y se coloca el gel en un
transiluminador UV para visualizar las bandas que aparecen en forma de bandas

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fluorescentes. A partir de ahí, se realiza una gráfica con la muestra patrón (de pb conocido)
del log de pb en función de la distancia recorrida a partir del PUNTO DE SIEMBRA.
Luego se interpolan las distancias migradas de las muestras incógnitas y se obtiene el log
de pb, al cual se le aplica anti log y se obtienen los pb constituyentes.

TP N° 2: TEMPERATURA DE MELTHING: con el objetivo de poder determinar el efecto

de la temperatura en la fusión de las hebras.
Se tomaron 3 muestras de DNA:
-una con el agregado de úrea (agente desnaturalizante ya que es formadora de puentes de
H, impidiendo que se formen entre las bases para mantener la estructura del dúplex),
-otra con H2Odestilada,
-y la última con NaCl (agente estabilizante de la doble hélice ya que apantalla las cargas
negativas de los grupos fosfatos, produciendo un aumento en la estabilización del dúplex
al disminuir la repulsión).
A su vez, cada muestra se la subdividió en alícuotas de distintas temperaturas: 60, 75,
80, 85 y 90°C. A medida que alcanzaban la temperatura, eran introducidas en un
espectrofotómetro, que arrojaba el valor de Absorbancia, en base a la cual, se realizó una
gráfica de la ABS en función de la temperatura.
Resultados:
Como fue esperado, la muestra con úrea tuvo una TM inferior a las demás y la TM de la
muestra con NaCl fue la mayor, justamente por el incremento en la estabilización al
neutralizar las cargas negativas de los fosfatos.

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SOUTHERN BLOT:
Técnica que permite la identificación de una muestra de DNA en particular. Consiste
en 3 pasos:
1) Electroforesis para la separación de los fragmentos.
2) Transferencia de las bandas desde el gel de agarosa hacia una membrana de nylon
que posee afinidad por los ácidos nucleicos.
3) Incubación de la membrana con una sonda específica marcada radioactivamente,
capaz de hibridar con la secuencia de DNA de interés.
4) Se cubre la membrana de nylon con rayos X, que revelan las posiciones de las
muestras y las hace visible.

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PROTEÍNAS
INTRODUCCIÓN:
Las proteínas son polímeros de aminoácidos, donde los residuos están unidos
covalentemente por enlaces peptídicos (amida sustituido). Se los denomina residuos
porque en la unión de 2 aa se pierden los elementos de una molécula de agua (reacción de
condensación). Los aa constituyentes se los denomina α-L-aminoácidos, y tienen unido al
mismo C un grupo hidroxilo y carboxilo.
Todos los aminoácidos excepto la Glycina, tienen el C α quiral, es decir, tiene 4
sustituyentes distintos: un carboxilo, un amino, un H y un grupo R (en la glycina, el R es
un H también, motivo por el cual, no es quiral). Por lo tanto, dichos C tienen actividad
óptica, es decir, desvían el plano de la luz polarizada.
Los aminoácidos se clasifican en función a su polaridad, es decir, la tendencia a
interaccionar con el agua a Ph biológico y sus grupos –R difieren en carga, tamaño y
solubilidad. Se distinguen los siguientes tipos:
*Grupos –R apolares alifáticos: importantes en la estabilización de proteínas mediante
interacciones hidrofóbicas.
*Grupos –R aromáticos: son un poco más hidrofílicos que los anteriores. La Tyrosina
tienen la capacidad de formar puente de hidrogeno con el H2O debido a su grupo –OH y
tiene un papel muy importante en algunas enzimas. El triptófano, la tirosina y en menor
grado, la fenilalanina, absorben la luz UV. Esto explica la fuerte absorción de las proteínas
a una λ 280nm. (recordar en qué longitud de onda era máxima la absorción del DNA)
*Grupos –R polares sin carga
*Grupos –R cargados positivamente: Lisina, Arginina e Histidina. La Historia Argentina
es básica.
*Grupos –R cargados negativamente: aspartato, glutamato.
La absorbancia que presentan los anillos bencénicos permite la determinación de la [] de
una muestra de proteínas mediante la ley de Lambert-Beer = ϵ.b.c
Donde ϵ es el coeficiente de extinción (aumentado por el colorante azul de coomasie, ver
más adelante TP), b es el recorrido de la luz y c es la concentración.

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ZWITTERIÓN: estado de ion dipolar, se produce cuando el Ph es igual al Pi (punto

isoeléctrico). Las sustancias de esta naturaleza se las denomina anfóteras, es decir, pueden
comportarse tanto como ácidos o como bases.
TITULACIÓN DE UN AMINOÁCIDO: se denomina titulación a la adición o eliminación
gradual de H+. En el caso de la Glycina, posee 2 etapas, donde cada una corresponde a la
eliminación del protón de un grupo funcional distinto, primeramente el COOH con un pka
más bajo que el del NH2, desprotonado en segunda instancia. En el punto medio de
cualquier titulación se encuentra el punto isoeléctrico, en el cual la molécula tiene carga
neta = 0 (gran variación del Ph en cuanto varia la [H+], o sea, poco poder buffer).
El pka es una medida de la tendencia de un grupo a ceder un protón. Medida que desciende
en un factor de 10 conforme el pka aumenta en una unidad.
NIVELES JERÁRQUICOS DE LAS PROTEÍNAS:
-Estructura 1ria: estructura covalente y secuencia (número, tipo y orden) de aminoácidos.
-Estructura 2ria: plegamiento regular y repetitivo adoptado por la cadena, mediante
puente de H entre carbonilos y aminos. Lamina β, o bien, α-hélice.
-Estructura 3ria: plegamiento de la estructura 2ria sobre sí misma, además intervienen
interacciones hidrofóbicas y/o puentes disulfuro.
-Estructura 4ria: no presentes en todas las proteínas. Implica la unión de 2 o más proteínas
con estructura 3ria. Dicha unión se produce por puentes disulfuro, e interacciones débiles.
A cada cadena individual de la proteína, se pasa a llamar, subunidad proteica.

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SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS:
Existen 2 tipos de métodos:
-Secuenciación por el método de Sangher, cuyo reactivo es 1-fluoro-2,4-dinitrobenceno
(FDNB)
-Secuenciación por degradación de Edman, cuyo reactivo es fenilisotiocianato.
 Sangher: es un método que permite el reconocimiento del aminoácido del extremo
amino terminal. Una vez marcado, se hidroliza el resto del péptido con HCL 6M,
liberando los aminoácidos constituyentes para poder identificar al marcado. El
compuesto FDNB-NH3+ es estable frente a la hidrolisis ácida. Si bien, no es un método
que sirva para la identificación del péptido, por el hecho de que se hidroliza, se puede
identificar las subunidades que componen la proteína siempre que contengan distintos
extremos aminos terminales.
 Edman: este método, a diferencia del de Sangher, permite la identificación del péptido
entero, ya que el reactivo utilizado, se une al aminoácido del extremo amino
terminal, dejando intacto al resto de los enlaces peptídicos. La reacción de unión del
compuesto con el aa del extremo amino terminal se lleva a cabo en condiciones
alcalinas, y la fase extracción en condiciones acidas. El hecho de primero utilizar
condiciones alcalinas y luego acidas, es para establecer un mayor control a lo largo del
procedimiento. La reacción se repite n-1 veces, siendo n la cantidad de aa.
Los resultados pueden ser observados por electroforesis, cromatografía, o bien, por
el secuenciador mismo.

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PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS:
Existen varios métodos para la purificación de proteínas, generalmente, para una que nunca
ha sido aislada, la elección del método se rige por el sentido común, y muchas veces, se
prueban varios de ellos hasta dar con el correcto. Se recomienda comenzar desde los más
sencillos y baratos, hacia los más complejos y caros.
1) Salting-out seguido de diálisis: la precipitación selectiva de proteínas con SO 4NH4+
resulta una buena práctica inicial. Luego se recomienda realizar una diálisis para
eliminar el exceso de sales, ya que a través de una membrana semipermeable, o de
permeabilidad selectiva (membranas naturales) solo pasan los iones y no las
macromoléculas como las proteínas.

2) Cromatografía: se basa en una técnica de separación de proteínas a través de una

columna utilizando una fase estacionaria y una móvil. Esta técnica aprovecha las
diferencias en carga, tamaño, afinidad de unión, etc. para poder purificarlas.
a. De exclusión molecular: aprovecha las diferencias en tamaño de las proteínas. La
fase estacionaria consiste en pequeñas perlas de biogel P constituido por
acrilamida y n-metilen-bis-acrilamida, las cuales actúan como un tamiz
molecular, donde las proteínas más pequeñas atraviesan sus poros formados por
el material entrelazado, dando como resultado, un mayor tiempo de elución. En
cambio, las proteínas más grandes, al no poder ingresar en el interior de las
cavidades calibradas, escogen el camino más fácil y rápido, bordeando la
columna y eluyendo primero.
b. De intercambio iónico: aprovecha las diferencias en la carga y la magnitud del
signo para la separación de las proteínas. La fase estacionaria está constituida por
polímeros de resina cargados. Si el intercambiador es aniónico, está cargado
positivamente y viceversa. Las proteínas que no se han unido se eluyen y las que
sí lo han hecho, pueden ser eluídas con NaCl. Esta separación puede optimizarse
estableciendo un gradiente de Ph, ya que las proteínas se eluirán a medida que
alcancen su PI (Ph en el cual su carga neta = 0).
c. De afinidad de unión: aprovecha la afinidad que tengan las proteínas para unirse
a un ligando especifico. la fase estacionaria está conformada por un polímero de
resina unido covalentemente a ligando específicos que se unan a la proteína de
interés. Al introducir las proteínas, las que tengan afinidad se unen y las que no,
eluirán. Luego, pueden eluirse las que se unieron con un buffer a ph 3.

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3) Electroforesis: técnica que consiste en el desplazamiento de moléculas cargadas (en este

caso, proteínas) a través de un campo eléctrico, sobre un medio soporte. Se lleva a cabo
en geles de poliacrilamida. La velocidad de migración es directamente proporcional a
su carga e inversamente proporcional a su masa. µ= Z/f. La migración también está
afectada por la forma.
SDS: dodecil-sulfato-sódico, es un detergente biológico que posee carga negativa y
se une de manera proporcional a la masa de las proteínas (aprox una molécula de
SDS cada 2 aa), por lo que le confiere igual relación carga/masa a todas las proteínas
y además, al ser un agente desnaturalizante, les confiere también, la misma forma a
todas. Por lo que la migración con SDS es única y exclusivamente en función a la
masa.
Luego de la electroforesis, las proteínas se visualizan añadiendo un colorante (azul
de coomasie r-250) que se une a las proteínas y no al gel, luego se retira el exceso
de colorante sobre el gel con agua destilada y se lo coloca en una disolución
decolorante por unos minutos. Luego se coloca el gel, en un transiluminador UV.

4) Isoelectroenfoque: es una técnica que permite la separación de proteínas en función a

PI. En un tubo capilar se prepara un gel con una disolución de anfolitos y se estable un
campo eléctrico. Luego, se añaden las proteínas y vuelve a establecerse el campo
eléctrico. Estas se van a distribuir hasta que lleguen al sitio donde el Ph=PI.

5) Electroforesis bidimensional: es la acción secuencial del Isoelectroenfoque y la

electroforesis con SDS, permitiendo separar proteínas de igual PM pero distintos PI y
viceversa.

6) HPLC: cromatografía liquida de alta resolución/performance. Utiliza bombas de alta

presión que aceleran el flujo de las moléculas de proteínas en la columna y utiliza
materiales de calidad superior que puedan resistir la fuerza de compresión de flujo
presurizado.

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TP N° 3: MÉTODO DE BRADFORD:
Método que permite la determinación de la concentración de proteína en una muestra
incógnita. Se utiliza el colorante azul de coomasie g-250 que en su estado independiente
presenta un color rojizo y abs a una λ 465nm y al unirse a proteínas, forma un complejo
colorante-proteina mediante uniones con aminoácidos básicos, principalmente la
arginina y aromáticos, produciendo un corrimiento de la ABS a λ 595nm y una coloración
azul. La ventaja del colorante es que produce un aumento en el ϵ, y la intensidad de la
absorción va a depender de los aminoácidos básicos y aromáticos. En condiciones
experimentales se calcula la diferencia de abs a λ 465 y 595 nm.
Se utilizó BSA (seratoalbumina bobina) como muestra patrón. A diluciones de [] creciente
se le midió la absorbancia y se realizó una curva de calibración de la absorbancia en función
de la []. Si dicha muestra tuvo que ser diluida para medir su abs, a dicho valor de [] arrojado,
se le debe multiplicar el factor de dilución.
Establecida la curva de calibración, se procede a medir la abs de la muestra incógnita, en
nuestro caso, homogenato de hígado de ratón. Dicha muestra fue separada en dos alícuotas,
con buffer TE y buffer de lisis (con sds). Al valor arrojado de abs de dichas muestras, se lo
interpola en la gráfica y se obtiene la concentración.
Como fue de esperar, la muestra en buffer de lisis presentó mayor [] proteica debido a que
el SDS facilitó la ruptura de las membranas lipídicas, permitiendo la salida de un mayor
número de proteínas.
TP N° 4: ELECTROFORESIS DESNATURALIZANTE:
Se realizó una electroforesis con SDS y β-mercaptoetanol, un compuesto que rompe los
puentes disulfuros intra e intercatenarios.
Al sembrar los extractos, los posillos contenían gel stacking que al poseer poros más
grandes permite el apilamiento de las proteínas y que entren al mismo tiempo al gel
de poliacrilamida.
Como muestra patrón se utilizó BSA y como incógnita, caseína. Al terminar la
electroforesis, se realiza una curva de calibración del log del PM en función de la distancia
migrada desde el punto de siembra de la muestra patrón. Luego, se mide la distancia de la
incógnita y se interpola.

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TP N° 5: CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:

La fase solida utilizada fue biogel P (acrilamida y n-metilen-bis-acrilmida) que es un
material poroso, hidrofílico, libre de carga e inerte. Y la fase móvil fue un buffer salino
fosfatado (PBS). Las proteínas se fueron eluyendo en tubos de ensayos que contenían
reactivo de Bradford, el cual consiste en el colorante azul de coomasie g-250, que vira de
rojo a azul, ante la presencia de proteínas.

ENZIMAS
Catalizadores biológicos de naturaleza proteica. Su función es acelerar reacciones
químicas, permitiendo que las reacciones que mantiene a los organismos vivos, ocurran
con tal velocidad para cumplir dicho propósito.
CARACTERÍSTICAS:
-no se consume enzima en la reacción, es decir, la cantidad de enzima inicial y final es la
misma
-tienen alto grado de especificidad con respecto a su sustrato
-no modifican el equilibrio de la reacción
La mayoría de las enzimas son proteínas, con excepción de un pequeño grupo de RNA
catalítico (ribozimas).
Algunas enzimas, solo requieren de sus residuos aminoacídicos para cumplir su función,
mientras que otras requieren:
-cofactores: iones inorgánicos como Fe, Mn, Mg, etc.
-coenzimas: moléculas orgánicas no proteicas. Actúan como carriers, es decir,
transportadores transitorios de grupos funcionales específicos.
Tanto el cofactor, como la coenzima, unidos covalentemente a la enzima, se los denomina
GRUPO PROSTETICO.
HOLOENZIMA: enzima + grupo prostético.
APOENZIMA: parte proteica de la enzima.

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REACCIÓN Y CARACTERÍSTICAS:
La reacción catalizada enzimáticamente ocurre en el sitio activo de la enzima, y la
molécula allí fijada se denomina: sustrato. El sitio activo, está tapizado de aminoácidos
con grupo funcionales específicos que se unen al sustrato para llevar a cabo la catálisis.
El aumento de la velocidad de las reacciones se produce por una disminución en la energía
de activación, es una barrera energética, necesaria para el alineamiento de grupos
funcionales, formación de cargas inestables, etc. En la cumbre de la colina energética,
se encuentra un “punto” denominado estado de transición. Si bien, no es un intermediario
de reacción ya que no posee una estabilidad significativa, se lo considera como un estado
molecular fugaz, en el que la probabilidad de caída hacia sustrato o producto es la misma.
Dato: para que una especie producida en una reacción sea considerada un estado de
transición, debe tener un tiempo de vida finito, pero mayor al de una vibración molecular
10-13 seg.
Sin estas barreras energéticas, formadas por la energía de activación, no podrían existir los
grandes complejos moleculares, ya que revertirían de manera espontánea, a moléculas
sencillas.

PODER CATALÍTICO:
La disminución de la energía de activación, es producto de 2 tipos de interacciones:
-covalentes: entre aminoácidos específicos del sitio activo de la enzima, con el sustrato, y
-débiles: entre el sustrato y la enzima.
La mayor parte de la energía necesaria para disminuir la energía de activación, proviene de
las interacciones débiles. En el establecimiento de cada interacción, se libera una pequeña
cantidad de energía, llamada energía de fijación. La necesidad de múltiples interacciones
débiles entre enzima y sustrato, explica el porqué del gran tamaño de las enzimas.

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MODELOS TEÓRICOS:
Existen 2 modelos de la unión enzima/sustrato
-Modelo de llave y cerradura: implica que el sustrato sea totalmente complementario a
la enzima, de modo que cuando se unan, el complejo, ES sea por demás de estable y
provoque un aumento en la energía de activación (energía necesaria para alcanzar el
estado de transición). Este modelo, hoy en día, está desestimado, ya que una enzima con
tales condiciones sería inviable.
-Modelo de encaje inducido: implica que el sustrato, al unirse al sitio activo, induce a un
cambio de conformación de la enzima, por lo tanto, el sustrato no es complementario a la
enzima, sino, al estado de transición.

CINÉTICA ENZIMÁTICA:
Consiste en la determinación de la velocidad de una reacción y del modo en que esta cambia
al variar las condiciones experimentales.
Aclaración => [] es = concentraciones.
A [] es de sustrato relativamente bajas, Vo aumentan casi linealmente con el agregado de
sustrato. A [] es de sustrato mayores, el aumento de Vo, cada vez es menor.
Ecuación de Michaelis-Menten:
Vo= Vmax.[S]/(Km+[S]). Se define Km, como la [S] a la cual, Vo=1/2Vmax. Entonces,
queda claro que Km tiene unidad de [], no de velocidad.
La gráfica de la doble recíproca se establece para obtener con mayor precisión los valores
de Vmax y Km. La ordenada al origen= 1/Vmax, y la raíz= -1/Km.
UNIDADES:
-Kcat (constante catalítica): número de moléculas de sustrato convertidas en producto por
una única molécula de enzima cuando se encuentra saturada.
-Katal: cantidad de enzima que cataliza la aparición de 1mol de producto por segundo.
-UI: cantidad de enzima que cataliza la aparición de un 1µmol de producto por minuto.

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FÓRMULAS:
-Act enzimática específica: act total/mg de proteína. UI/mg proteína.
-N° de purificaciones: act especifica del paso/act específica anterior.
-Rendimiento del paso: act total del paso/act total del paso anterior.
INHIBIDORES:
Son moléculas que interfieren en la catálisis, enlenteciéndola, o deteniéndola por completo.
Existen 2 tipos de inhibiciones: reversibles y las irreversibles.
-Reversibles: los inhibidores se unen a la enzima mediante interacciones débiles, no
modifican la estructura de la enzima y pueden establecer un equilibrio con la E, con el
complejo ES o con ambos.
1) Competitivos: compiten con el sustrato por el sitio activo de la enzima. Mientras el
inhibidor esté unido a la enzima, el sustrato no podrá unirse. La forma de cambiar el
sentido de la reacción es agregar más sustrato. Por esta razón, la velocidad máxima
es la misma, pero aumenta la Km.
2) Acompetitivos: el inhibidor se une solamente al complejo ES. Disminuye la Km y
la Vmax.
3) No competitivos: el inhibidor se une a la E, al complejo ES o a ambos. Disminuye
Vmax pero la Km es la misma.
-Irreversibles: modifican químicamente a la enzima. Algo de esta se elimina del sistema.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

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GLUCÓLISIS
Es la degradación (oxidación) de una molécula de glucosa (6C) a 2 moléculas de piruvato
(3C) mediante 10 reacciones catalizadas enzimáticamente, 3 de las cuales, son
irreversibles.
La glucolisis implica 2 fases: una de preparación (desde glucosa hasta 2 G3P) donde se
invierten 2 ATP, y otra de beneficios (desde G3P a Piruvato), donde se obtienen 4 ATP,
por lo que, el balance neto es de 2ATP/glucosa.
REACCIONES:
La glucosa es fosforilada en C6 por una hexoquinasa, para dar glucosa-6-fosfato, la cual,
por una hexosa fosfato isomerasa es convertida en fructosa-6-fosfato. Esta es sustrato para
la PFK-1, que la va a convertir en fructosa-1,6-bifosfato (único destino: glucolisis), la cual
es convertida por una aldolasa en G3P y dihidroxiacetona-fosfato. Para dar fin a la fase
de preparación, la DHAP en convertida por una triosa-fosfato-isomerasa en otra molécula
de G3P.
Estas 2 moléculas de G3P dan fin a la fase de preparación y comienzo a la de beneficios.
Por una G3P-deshidrogenasa, son convertidas en 1,3-bifosfoglicerato, liberando 2 NADH.
Estas por una fosfoglicerato-kinasa, son convertidas en 3-fosfoglicerato, liberando 2 ATP.
El 3PG es convertido en 2PG por una fosfoglicerato mutasa, que por una enolasa, se
convierte en PEP. Por último, éste mediante la piruvato-kinasa, es convertido en piruvato,
liberando 2 ATP.
Glucosa + 2pi + 2NAD+ + 2ADP  2 Piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H20
DESTINOS DEL PIRUVATO:
-En condiciones aeróbicas, el piruvato sufre una descarboxilación oxidativa por el
complejo de la PDH para dar acetil-CoA, el cual va a ser oxidado hasta CO2 en el ciclo de
Krebs.
-En condiciones anaeróbicas o de hipoxia, el piruvato va a sufrir lo que se denomina,
fermentación, la cual puede ser:
 Láctica: el piruvato es reducido a lactato por la lactato-deshidrogenasa y el NADH
obtenido en la glucolisis, es regenerado a NAD+.
 Alcohólica: el piruvato por medio de la piruvato-descarboxilasa es convertido en
acetaldehído, el cual por la acción de la alcohol-deshidrogenasa es convertido en
etanol, regenerando así, el NAD +.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

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IMPORTANCIA DE LOS INTERMEDIARIOS FOSFORILADOS:

-Los azucares fosforilados no tienen transportadores de membrana, por lo cual, la célula
no gasta energía en retenerlos, a pesar, de la diferencia de [].
-Además, son una forma de conservar la energía metabólica, ya que al romperse un enlace
fosfoanhídrido (ATP), parte de la energía liberada se almacena en forma de éster fosfato
(glucosa-6-fosfato).
-Los grupos fosfatos en los sitios activos de las enzimas, aumentan la especificidad y
disminuyen la energía de activación, logrando llegar al estado de transición de manera más
rápida.

METABOLISMO DEL GLUCÓGENO

El exceso de glucosa, es convertido en formas poliméricas para su almacenamiento:
glucógeno en vertebrados y otros microorganismo y almidón en vegetales.
El hígado y el músculo son los principales órganos de almacenamiento de glucógeno.
En el músculo es utilizado para obtener energía y en el hígado, principalmente para servir
de glucosa a otros tejidos, es como una especie de almacén.
La estructura del glucógeno consiste en un polímero de glucopiranosas unidas por enlaces
O-glicosídicos α14, y cada 10 residuos aproximadamente, presenta ramificación en
α16. El fin de las ramificaciones, es aumentar la solubilidad del glucógeno.
GLUCOGENÓLISIS: proceso de degradación del glucógeno. Participan 2 tipos de
enzimas: una glucógeno fosforilasa y una enzima desramificante con 2 funciones:
glucantransferasa (transferir el trisacárido terminal a una hebra vecina en α14) y α16
glucosidasa (dejar libre la glucosa por la adición de una molécula de agua).
 Mecanismo: la glucógeno fosforilasa cataliza una reacción de fosforolísis (por
adición de un Pi) en un enlace O-glicosídico α14 que une 2 residuos de glucosa
en un extremo no reductor del glucógeno, dando como resultado α-D-glucosa-1-
fosfato. La enzima va a trabajar hasta que llega a un punto en que se encuentra a 4
residuos de un enlace α16. Es ahí cuando le cede el cargo a la enzima
desramificante, primeramente, con acción glucantransferasa, que va a transferir el
trisacárido terminal a una hebra vecina en α14, y luego, la α16 glucosidasa, que
va a eliminar la glucosa restante como tal, por adición de una molécula de agua.
Luego puede volver a trabajar la glucógeno fosforilasa.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

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Las α-D-glucosa-1-fosfato, por acción de una fosfoglucomutasa, son convertidas

en α-D-glucosa-6-fosfato, las cuales pueden entrar a glucolisis, o bien, por acción
de la glucosa-6-fosfatasa, ser convertidas en glucosas y ser liberadas al torrente
sanguíneo para mantener la homeostasis.

GLUCOGENOGÉNESIS: proceso de síntesis del glucógeno.

Es un proceso en el cual, se va a almacenar la glucosa en exceso en forma de glucógeno.
Participan la enzima glucógeno-sintasa, una enzima ramificante (glucosa 46
transferasa), la UDP-glucosa pirofosforilasa, una fosfoglucomutasa y la glucogenina.
 Mecanismo: la síntesis comienza con la glucosa-6-fosfato, producto de la
hexoquinasa, la cual por la fosfoglucomutasa, es convertida en glucosa-1-fosfato.
Esta es transformada en UDP-glucosa, por la acción de la UDP-glucosa-
pirofosforilasa, dando PPi.
La UDP-glucosa, es sustrato de la glucógeno-sintasa, pero ésta, no puede comenzar
su síntesis de cero, por lo que requiere un primers de al menos 8 residuos de glucosa
α14. Para esto, una proteína llamada glucogenina, cataliza la unión de una UDP-
glucosa a un residuo de tirosina de la propia proteína, y estira la cadena, unos 7
monómeros más. Luego, comienza a trabajar la glucógeno-sintasa y la enzima
ramificante (glucosa-4,6-transferasa) que se encarga de transferir un segmento
terminal a un residuo anterior o a otra cadena en α16, creando varios extremos NO
reductores que aumentan la solubilidad del polímero.
Dato: la glucogenina permanece unida al único extremo reductor del glucógeno.

GLUCONEOGÉNESIS: proceso en el que se lleva a cabo la síntesis de glucosa a partir de

piruvato y de compuestos de 3 o 4 C relacionados (glicerol, lactato, oxalacetato).
En mamíferos, la gluconeogénesis tiene lugar en el hígado principalmente, el intestino
delgado y la medula renal. Siete de las diez reacciones de la gluconeogénesis son la inversa
de la glucolisis, pero existen 3 que están rodeadas por un conjunto de reacciones altamente
exergónicas ya que son muy irreversibles. Ellas son:
-de piruvato a PEP
-de F16BP a F6P
-de G6P a glucosa

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1) El piruvato entra a la mitocondria donde es convertido por la piruvato carboxilasa

(requiere Mg y biotina) en oxalacetato, el cual es reducido a malato por la malato
deshidrogenasa. Este sale de la mitocondria al citosol, donde es nuevamente oxidado
a oxalacetato, y la PEP-carboxikinasa lo convierte en PEP.
Cuando el precursor gluconeogénico es lactato (luego de una actividad vigorosa), es
oxidado a piruvato por la lactato-deshidrogenasa, el cual entra a la mitocondria,
donde una piruvato-carboxilasa lo convierte en oxalacetato. Allí mismo, una enzima
PEP-carboxikinasa mitocondrial (en el caso anterior, esta era citosólica) lo convierte
en PEP, el cual sale al citosol para continuar con la gluconeogénesis.
2) Esta reacción está catalizada por un F16BP-asa I, la cual requiere Mg++ como
cofactor, promueve la hidrolisis del fosfato del C1.
3) Esta reacción esta cataliza la conversión de la G6P a glucosa por medio de la
Glucosa-6-fosfatasa, presente en la cara de la luz del RE de los enterozitos,
hepatocitos y células de la medula renal.
DESTINOS DE LA GLUCOSA-6-FOSFATO EN UN HEPATOCITO:
-glucolisis
-glucosa (G6P-asa)
-Acetil-CoA
-síntesis de otros azucares
ISOENZIMAS DE LA HEXOQUINASA:
Existen 4 tipos de isoenzimas que están codificadas por genes distintos, pero que
cumplen la misma función. La isoenzima hexoquinasa II es la predominante en el
musculo, la cual tiene una elevada afinidad por su sustrato (glucosa) y se encuentra
semisaturada a una [glucosa] 0,1mM. Debido a que la [glucosa sanguínea] es de 5mM
aprox, esta enzima trabaja mayormente, a Vmax.
Las isoenzimas I, II, III presentan el mismo comportamiento y se encuentran
inhibidas de manera reversible, alostérica y temporal por su producto G6P.
La isoenzima Hexoquinasa IV (glucoquinasa) se encuentra semisaturada a []es mucho
mayores (10mM aprox) que la [glucosa sanguínea], por lo que a medida que aumenta
la [glucosa], la glucoquinasa continua aumentando su actividad. Por lo contrario,
cuando la [glucosa] es baja en relación a la Km de la enzima, abandona la célula antes
de ser fosforilada, uno de los motivos por el cual, el hígado no compite por la glucosa
con otros órganos.

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 23

A diferencia de las demás isoenzimas, la glucoquinasa no es inhibida por su producto

(G6P), pero si por una proteína de arrastre nuclear. Cuando aumenta la [F6P], estimula
a la proteína de arrastre a anclar la glucoquinasa en el núcleo del hepatocito (otro de los
motivos por el cual, el hígado no compite por la glucosa con otros órganos, ej: en un
ayuno, que la [glucosa] es baja, la F6P tiene inhibida la glucoquinasa). Cuando la
[glucosa] aumenta, y se equilibra con los niveles de glucosa en el núcleo, mediante
poros nucleares, produce la desinhibición de la enzima, ya que compite con la F6P,
liberándola al citosol nuevamente.
REGULACIÓN GLUCÓLISIS/GLUCONEOGÉNESIS:
-Hexoquinasa/glucosa-6-fosfatasa: la hexoquinasa IV (glucoquinasa) está controlada por
la proteína de arrastre nuclear que tiene como efector positivo a la F6P y como efector
negativo a la glucosa. La glucoquinasa no está inhibida por su producto como sí las demás
hexoquinasas (I, II y III). Además, la glucoquinasa y la glucosa-6-fosfatasa están reguladas
a nivel de transcripción:
*situaciones que indiquen mayor demanda de energía como baja [ATP] o alta
[AMP], o bien, mayor consumo de glucosa (liberación de insulina), como alta [glucosa
sanguínea], producen un aumento en la transcripción de la hexoquinasa IV.
*situaciones que indiquen mayor producción de glucosa, como la liberación de
glucagón, producen un aumento en la transcripción de la glucosa-6-fosfatasa.
-PFK-I/FBP-asa I:
*la PFK-I es activada por: alta [AMP], [ADP] y F26BP, condiciones que estimulan
la glucolisis.
*la PFK-I es inhibida por: alta [ATP] y citrato (no hace falta energía, por lo tanto,
deja de estimular la glucolisis).
+la FBP-asa I es activada por: citrato (estimula la gluconeogénesis porque existe
suficiente E)
+la FBP-asa I es inhibida por: F26BP, AMP y ADP.
A su vez, la F26BP es sintetizada en una ruta alternativa a la glucolisis a partir de F6P por
medio de una PFK-II. Esta enzima tiene 2 dominios:
*fosforilada con función fosfatasa
*desfosforilada con función quinasa.

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 24

Es fosforilada por medio de una proteína kinasa dependiente de AMPc que es activada ante
la liberación de glucagón, y es desfosforilada por una proteína fosfatasa que es activada
ante la liberación de insulina.
-Piruvato quinasa:
Está inhibida por alta [ATP], citrato y ácidos grasos de cadena larga.
La isoenzima hepática L, y no así la muscula M, está sujeta a una regulación por
fosforilación. Al disminuir la [glucosa en sangre] se libera glucagón, que activa una
proteína quinasa dependiente de AMPc que fosforila la isoenzima hepática L,
inactivándola. Esto permite que disminuya la utilización de glucosa en el hígado,
permitiendo la exportación a otros tejidos. Al disminuir la [glucagón], se activa una
proteína fosfatasa que desfosforila la isoenzima, reactivándola.

REGULACIÓN GLUCOGENÓLISIS: (la glucógenofosforilasa activa, está fosforilada).

La glucógenofosforilasa del musculo presenta dos formas interconvertibles: la A,
catalíticamente activa, y la B, menos activa. La forma B predomina en el musculo en
reposo, pero ante un ejercicio vigoroso, la adrenalina desencadena la fosforilación de un
residuo de Ser específico de B, transformándola en A.
*mecanismo: la adrenalina liberada a la sangre, es captada por receptores del sarcolema,
produciendo una cascada enzimática que termina activando una proteína G. Esta, activa la
adenilciclasa, que produce AMP a partir de ATP, por lo que el aumento resultante de la
[AMP], activa alostericamente una PK, la cual, fosforila y activa una fosforilasa B quinasa,
transformándola en fosforilasa A quinasa. Por último, ésta, cataliza la fosforilación de la
glucógenofosforilasa B, para convertirla en su forma activa A.
En el musculo, además de la regulación covalente, la glucógenofosforilasa es activada por
Ca++ y AMP acumulado.
En la isoenzima del hígado, la activación no es por adrenalina, sino, por glucagón.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

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REGULACIÓN GLUCOGENOGÉNESIS:
Al aumentar la [glucosa sanguínea], el páncreas libera insulina, que inactiva una proteína
del hígado llamada GSK-3, la cual, cuando se encuentra activa, reprime la
glucógenosintasa mediante una modificación covalente, por fosforilación.
De manera contraria, la insulina, activa una proteína fosfatasa I (PP-I) que elimina el
fosfato de la glucógenosintasa, desfosforilándola y activándola. Esta PP-I también es
activada por G6P e inhibida por glucagón (hígado) y adrenalina (musculo).

CICLO DE KREBS (la succinato deshidrogenasa está anclada en la mmi, todas las otras
en la matriz).
Es una ruta metabólica que se lleva a cabo en la matriz mitocondrial, en la cual se obtiene
energía a partir de la oxidación de Acetil-CoA hasta CO2.
El piruvato obtenido en la glucolisis, ingresa a la matriz mitocondrial donde sufre una
descarboxilación oxidativa por el complejo de la PDH para dar NADH, Acetil-CoA y CO2.
La PDH es un complejo formado por 3 enzimas que se inhiben con alta [Acetil-CoA] ya
que tal exceso, produce la activación de una proteína kinasa que fosforila la PDH y la
inactiva. Esta kinasa, también es activada por un exceso de NAHD, y desactivada por alta
[piruvato, NAD+ y ADP] (demanda energética).
La PDH puede ser activada por una PP (proteínas fosfatasa) que en presencia de su cofactor
Ca++, la desfosforila.
*ciclo: el Acetil-CoA se combina con el oxalacetato en una reacción de condensación para
formar CITRATO. El citrato es deshidratado e hidratado por una aconitasa para dar D-
isocitrato. Este, sufre una descarboxilación oxidativa formando α-cetoglutarato y liberando
NADH. El α-cetoglutarato sufre otra descarboxilación oxidativa para dar succinil-CoA y
NADH. El succinil-CoA es disociado, dando succinato y CoA-SH, generando GTP. El
succinato se oxida a fumarato y produce FADH2. El fumarato se hidrata y se convierte en
malato, que luego se oxida, dando oxalacetato y NADH.
RENDIMIENTO POR MOLECULA DE PIRUVATO:
4NADH + 1FADH2 + 1GTP, por glucosa= 8NADH, 2FADH2 y 2GTP
GLUCOLISIS + KREBS: 9NADH, 2ATP, 2GTP Y 2FADH2.

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REGULACION:
1) La reacción de condensación del oxalacetato con el Acetil-CoA para dar citrato (6C)
por la citrato sintasa. Inhibida por alta [ATP, citrato, NADH, succinil-CoA] y
activada por acumulación de ADP.
2) La reacción de la descarboxilación oxidativa del D-isocitrato, catalizada por la
isocitrato deshidrogenasa, para dar α-cetoglutarato. Inhibida por exceso de ATP y
activada por ADP y Ca++.
3) La reacción de la descarboxilación oxidativa del α-cetoglutarato por la α-
cetoglutarato deshidrogenasa, para dar Succinil-CoA. Inhibida por sus productos:
Succionil-CoA y NADH y activada por su cofactor: Ca++.

CADENA DE TRANSPORTE Y FOSFORILACIÓN OXIDATIVA

Es la etapa final de la respiración. La cadena transportadora de electrones está constituida
por una serie de proteínas y moléculas orgánicas presentes en la membrana mitocondrial
interna. Los electrones pasan de un miembro de la cadena a otro en una serie de reacciones
redox, donde la energía liberada en dichas reacciones se utiliza para bombear H+ hacia el
espacio intermembrana, por lo tanto, se genera un gradiente electroquímico, que se utiliza
para formar ATP, en un proceso llamado quimiosmosis. En conjunto, la quimiosmosis y la
cadena transportadora de electrones constituyen la fosforilación oxidativa.
*quimiosmosis: proceso en el cual se genera ATP a partir de un gradiente de H +.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

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COMPONENTES DE LA CADENA TRANSPORTADORA:

-Complejo I/NADH deshidrogenasa: acepta los electrones del NADH para convertirlo
en NAD+. Luego, el complejo, cede los electrones a la Ubiquinona, bombeando protones
en el proceso (hacia el EI).
-Complejo II/Succinato deshidrogenasa: oxida el succinato a fumarato a expensas de
FADH, transformándolo en FADH2. Inmediatamente después, cede sus electrones a la
Ubiquinona. No existe bombeo de protones.
-Ubiquinona/Q: coenzima liposoluble que circula libremente en la MMI, y es la encargada
de captar los electrones del complejo I y II para cederlos al III.
-Complejo III/Cytocromo-c reducatasa: acepta los electrones de Q y los cede al Cyt-c,
bombeando protones en el proceso.
-Cyt-c: proteína hidrosoluble del espacio intermembrana que capta los electrones del
complejo III y los cede al IV.
-Complejo IV/Cyt-c oxidasa: capta los electrones del Cyt-c y reduce al O2, para formar
2 moléculas de agua y bombear protones en el proceso.
-ATP-sintasa: complejo enzimático que realiza la fosforilación oxidativa y contiene 2
subunidades. Fo, situada en la MMI, que es el motor impulsado por el paso de los protones
que ingresan a la matriz a través de él, y F1, situada en la matriz, y que a causa de ese
motor, cataliza la síntesis de ATP a partir de ADP y Pi, mediante cambios de conformación.

TP N°6: METABOLISMO:
Las levaduras, al igual que el resto de los organismos eucariotas, poseen mitocondrias con
las que realizan la respiración celular para obtener ATP. La principal fuente de C de las
levaduras es la glucosa, la cual, es sometida a glucolisis y luego, en presencia de O2, el
piruvato sigue su camino por el ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa para seguir
generando ATP.
Las levaduras poseen en su membrana plasmática una ATP-sintasa, pero con un
mecanismo inverso a la mitocondrial ya que hidroliza ATP en el citosol para bombear
protones al medio extracelular. Esto provoca un gradiente de H+ que lo utilizan para la
asimilación de glucosa por cotransporte. Este bombeo al medio extracelular, acidifica el
medio, disminuyendo el Ph.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

 28

-Procedimientos: se realizaron 3 experimentos.

1) En un vaso de precipitados se colocaron levaduras en H2Odestilada y se medió el
Ph. Se repitió la medición cada 3 minutos 2 veces más. Luego se agregó glucosa al
medio, se agitó y se midió el Ph. Volvió a medirse cada 5 minutos 4 veces y cada 10
minutos 2 veces más.
2) Los mismos pasos que en el experimento anterior con la diferencia que antes de
agregar la glucosa, se añadió 2,4-dinitrofenol, el cual es un agente desacoplante que
permeabiliza la MMI disipando el gradiente de protones.
3) Los mismos pasos que en el experimento anterior, pero en vez de agregar 2,4-
dinitrofenol, se añadió azida de sodio, un agente inhibidor del complejo IV (Cyt-c
oxidasa), por lo que afecta directamente a la cadena respiratoria.
-Resultados: como era de esperarse, en el experimento 1 se observó una disminución
del Ph conforme avanzaba el tiempo, ya que las levaduras hidrolizaban ATP para el
bombeo de H+ hacia el medio extracelular, logrando así, el ingreso de glucosa. En el
experimento 2, el Ph permaneció igual en cada una de las mediciones ya que al disiparse
el gradiente de H+ de la matriz y el EI, no se llevó a cabo la síntesis de ATP, por lo que
tampoco, se pudo hidrolizar para bombear protones al espacio extracelular. En el
experimento 3, tampoco se observaron variaciones en el Ph debido a que la azida de
sodio, al inhibir el complejo IV, no permitió la reducción del O2 para formar las
moléculas de agua y toda la cadena se detuvo.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

 29

Metabolismo de lípidos
Los humanos y la mayoría de los mamíferos obtenemos ácidos grasos a través de 3 fuentes:
-ingerimos en la dieta
-movilizamos del tejido adiposo
-sintetizamos ac grasos a partir del exceso de glúcidos en el hígado.
Digestión:
Los TAGs consumidos en la dieta al llegar al intestino son atacados por sales biliares (ac
taurocólico) que son sintetizadas en el hígado a partir del colesterol y liberadas al intestino
luego de una comida rica en grasas. Las sales biliares transforman los TAGs en micelas
microscópicas las cuales, aumentan la fracción accesible a las lipasas hidrosolubles del
intestino. Estas lipasas convierten los TAGs en mono, diglicéridos, ac grasos y glicerol.
Estos productos ingresan al enterozito (cel. del epitelio intestinal) donde son nuevamente
convertidos en TAGs y se combinan con colesterol y proteínas, formando los llamados
QUILOMICRONES. Según la asociación de lípidos y proteínas, pueden formarse
partículas de muy baja densidad como lo son los quilomicrones y vldl, o bien, partículas
de alta densidad como vhdl. Los quilomicrones que contengan la apoproteina C-II, van a
pasar al sistema linfático, desde el cual pasan a la sangre para poder llegar al musculo y
tejido adiposo. En los capilares de estos tejidos, la enzima extracelular lipoproteína-
lipasa convierte los TAGs en ácidos grasos libres y glicerol que son captados por las
células diana (miocito o adipocito). El musculo lo va a utilizar como fuente de energía y el
adipocito, lo va a ressterificar en TAGs nuevamente para ser almacenado.

Almacenamiento: IMPORTANTE!
En los adipocitos, los TAGs se almacenan en forma de gotículas formadas por esteres de
colesterol con TAGs y se encuentran rodeados por una monocapa de fosfolípidos. Este
conjunto se encuentra b rodeado por PERIPILINAS, familia de proteínas que protegen a la
goticula de la acción de las lipasas sensibles a hormonas, evitando la movilización de éstos.
Movilización: IMPORTANTE!
Cuando las hormonas señalan una necesidad de energía metabólica, los TAGs almacenados
en los adipocitos son movilizados a los órganos que pueden oxidarlo para la obtención de
energía.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

 30

Al disminuir la [glucosa sanguínea] la liberación de adrenalina y glucagón, activan una

proteína adenil ciclasa (de la membrana plasmática de los adipocitos) vía proteína G, la
cual produce un aumento en la [AMPc]. Este aumento de AMPc produce la activación de
un proteína kinasa dependiente de AMPc, la cual fosforila la peripilina, permitiendo que la
LPSH se posicione sobre la superficie de la goticula e hidrolice los TAGs en ácidos grasos
libres y glicerol. A su vez, la proteína kinasa AMPc dependiente, también fosforila la
LPSH, duplicando o triplicando su actividad.
Los ac grasos libres, pasan al torrente sanguíneo, donde se unen a la albumina sérica, que
los transporta al corazón, hígado (productor de cuerpos cetónicos), corteza suprarrenal.
En estos tejidos, los ácidos grasos se disocian de la albumina sérica y vía transportador de
la membrana plasmática, ingresan al interior de las células para servir como fuente de
energía (B-oxidación, ciclo de Krebs, CRM).
El glicerol, resultante de la acción de la LPSH, es la única fracción que puede
transformarse en glúcido. En una primera instancia es fosforilado por la glicerol kinasa,
para dar Glicerol-3-fosfato, el cual es oxidado a Dihidroxiacetona-fosfato. Esta última, por
acción de la triosa-fosfato-isomerasa, es transformada en Gliceraldehido-3-fosfato, el cual
entra a la glucolisis.
Activación de los FFA y transporte a las mitocondrias: (los ácidos grasos ya se
encuentran en el miocito, o cualquier otro tejido que lo requiera. Ahora, debe ingresar a la
mitocondria para ser oxidado).
Las enzimas de la oxidación de los ácidos grasos se encuentran en la matriz mitocondrial,
por lo que, los ácidos grasos, deben ingresar a la misma para producir ATP.
Aquellos ácidos grasos de 12C o menos, ingresan a la matriz por simple difusión, sin la
necesidad de algún transportador de membrana, pero aquellos de 14C o más, deben ser
sometidos a la acción de las reacciones de la lanzadera de carnitina:
1) La acil-CoAsintetasa del citosol, cataliza la reacción de un ácido graso con una
molécula de CoA-SH para dar, acil-CoA, con gasto de ATP. Este acil-CoA tiene dos
destinos: formar parte de lípidos de membrana, o bien, la producción de energía.
Aquellos destinados a la producción de energía sufren la segunda reacción.
2) La carnitina-aciltranferasa I de la MME, cataliza la reacción de un acilgraso-CoA
con una molécula de carnitina para dar acil-carnitina y CoA-SH libre. El acilgraso-
carnitina, ingresa a la matriz mitocondrial por el transportador acilcarnitina/carnitina
y sufre la 3ra reacción.

Apuntes Bioquímica – Acosta, B.

 31

3) El acilgraso-carnitina, por acción de la carnitina-aciltranferasa II, se convierte en

acilgraso-CoA y carnitina libre. La molécula de carnitina regresa al espacio
intermembrana vía transportador acilcarnitina/carnitina y el acilgraso-CoA queda en
la matriz.
DATO: el CoA-SH del citosol, es utilizado para biosíntesis de ácidos grasos, y el de la
matriz, para la producción de energía.
 Regulación: la carnitina-aciltranferasa I es inhibida por malonil-CoA (1er
intermediario de la síntesis de ácidos grasos). Esta inhibición evita la síntesis y
oxidación de ácidos grasos simultánea.
El paso limitante de la oxidación es donde interviene la carnitina, luego en la
mitocondria, el proceso es rápido.
Oxidación de los ácidos grasos:
Ya con los ácidos grasos en el interior de la matriz, puede comenzar la oxidación. Este
proceso completo, implica 3 fases:
-β-oxidación: proceso de 4 pasos repetitivos donde los ácidos grasos son convertidos a
moléculas de acetil-CoA a partir del extremo carboxilo de la cadena.
-ciclo de Krebs: el grupo acilo del acetil-CoA es oxidado hasta CO2 en el ciclo de Krebs.
-CTE: las moléculas reducidas producto del ciclo de Krebs y de la β-oxidación, son
reoxidadas a través de la cadena transportadora de electrones.
 β-oxidación de ácidos grasos saturados pares: partiendo del palmitoil-CoA. (Oxi,
hidr, oxi, tiolisis)
o La acil-CoA deshidrogenasa, cataliza la oxidación, creando un doble enlace
entre el C α y β, para dar enoil-CoA.
o La enoil-CoA hidratasa, cataliza la adición de una molécula de H20 al doble
enlace para dar β-hidroxiacil-CoA.
o La β-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, cataliza la oxidación del β-hidroxiacil-
CoA para dar β-cetoacil-CoA.
o Una tiolasa, cataliza la adición de una molécula de CoA-SH al β-cetoacil-
CoA, para dar acetil-CoA y acil-CoA.
Las 4 reacciones se repiten sucesivamente hasta que todo el ácido graso se convierte en
acetil-CoA.

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DATO: las ultimas 3 reacciones son catalizadas por distintos complejos enzimáticos, según
la longitud del acil-CoA.
 Si posee 12 C o más, es oxidado por un complejo multienzimatico asociado a la
MMI.
 Si posee menos de 12 C, es oxidado por enzimas solubles de la matriz

 β-oxidación de ácidos grasos insaturados:

Como sus dobles enlaces se encuentran en posición CIS, no pueden actuar como
sustrato de la enoil-CoA hidratasa, por lo que se requieren dos enzimas adicionales:
isomerasa y reductasa.

REGULACIÓN:
 La carnitina-aciltranferasa I es inhibida por malonil-CoA, por lo tanto, permite que
en el hígado, el exceso de glucosa se convierta en ácidos, cuya primer intermediario
es el malonil-CoA. Evita la síntesis y oxidación simultanea de ácidos grasos.
 La β-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa es inhibida por elevada relación
[]NADH/[NAD+].
 La tiolasa es inhibida por elevada [acetil-CoA].
Ej: ante un ayuno prolongado o una contracción muscular vigorosa, al disminuir la [ATP]
y aumentar la [AMP], se activa una PK que fosforila e inactiva la acetil-CoA carboxilasa,
que cataliza la síntesis de malonil-CoA. Por lo tanto, al disminuir la [malonil-CoA] se
desinhibe la carnitina-aciltranferasa I, lo que permite que la β-oxidación reponga la
demanda de ATP.

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CUERPOS CETÓNICOS: Cetogénesis: mitocondrias del hígado. Cetolísis: tejidos

extrahepáticos.
El acetil-CoA producido en el hígado tiene 2 destinos:
-ingresar al ciclo de Krebs, o bien,
-la formación de cuerpos cetónicos, ellos son, acetona (volátil, toxica y de olor
característico), aceoacetato y β-hidroxibutirato. Estos serán enviados a tejidos
extrahepáticos, donde serán oxidados por una tioforasa a acetil-CoA, el cual, es
utilizado para la obtención de energía.

Si bien el hígado es productor de CC, no es consumidor, ya que carece de la tioforasa

necesaria para convertirlos en acetil-CoA.
Durante la inanición, la gluconeogénesis consume los intermediarios del ciclo de Krebs,
desviando el acetil-CoA hacia la formación de CC. Estos serán exportados a otros tejidos
hasta un punto en el que se supera la capacidad de oxidarlos, por lo que comenzaran a
acumularse (condensación de 2 moléculas de acetil-CoA, donde interviene una tiolasa) y

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el aumento de la [acetoacetato, y β-hidroxibutirato], provoca una disminución en el Ph,

induciendo un estado de acidosis.
Ej: en diabetes no tratada, la insuficiente cantidad de insulina, hace que las células no
puedan absorber glucosa de la sangre, evitando su oxidación o formación de ácidos
grasos. Al no haber síntesis de ácidos grasos, disminuye la [malonil-CoA] por lo que se
desinhibe la carnitina-aciltranferasa I, y los ácidos grasos que entran en la mitocondria,
donde son degradados a acetil-CoA, al no poder entrar estos últimos ingresar al ciclo de
Krebs, se acumulan y se forman los cuerpos cetónicos.
Cetosis: estado metabólico en el cual, el organismo utiliza las grasas para la obtención de
energía.

SÍNTESIS DE ACIDOS GRASOS: ocurre la mayor parte en el citosol, donde se

encuentra el complejo de la acido-graso sintasa.
El acetil-CoA proveniente de la glucolisis, se combina con el oxalacetato para dar citrato
(primera del ciclo Krebs) el cual, sale al citosol cuando existe un exceso de energía. Ya en
el citosol se fragmenta nuevamente en oxalacetato (el cual reingresa a la matriz
mitocondrial) y acetil-CoA, que a través de la acetil-CoA carboxilasa, es convertido en
malonil-CoA. En este punto comienza un proceso de 4 reacciones catalizadas
colectivamente por la acido-graso sintasa, y en cada paso, la cadena acilo se alarga 2C.

Bibliografía consultada:
Lehninger Principles of Biochemistry 6th Edition

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