Facultad de Bioquimica, Quimica y Farmacia Universidad Nacional de Tucuman GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS N°3 Hemograma-Hemoglobina-Hematocrito- indices hematimétricos- Morfologia de los eritrocitos-Velocidad de sedimentacion globular- Control de calidad en hematologia.HEMOGLOBINA DEFINICION La hemoglobina (Hb), componente principal de los glbulos rojos, es una proteina conjugada, formada por una parte proteica: la globina (96%) y una parte prostética: el grupo hemo (Figura N°1). La globina es una proteina basica del grupo de las histonas, consta de dos pares de cadenas polipeptidicas, cada cadena esta asociada a un grupo hemo, de modo que cada molécula de hemoglobina esta formada por 4 grupos hemo y 4 cadenas polipeptidicas. EI hemo esta formado por un grupo tetrapirrdlico (protoporfirina) asociado al hierro (Fe) en forma ferrosa (Fe++). El hemo es la parte coloreada de la molécula y el que acta fijando el Oz y el CO2 en forma reversible; se localiza cerca de la superficie de la molécula en una bolsita hidréfoba de una cadena polipeptidica El grupo hemo es igual en todas las hemoglobinas; las mismas se diferencian en sus cadenas polipeptidicas, por ejemplo la Hb A esta formada por 4 grupos hemo + 2 cadenas alfa + 2 cadenas beta; la Hb F esta formada por 4 grupos hemo + 2 cadenas alfa + 2 cadenas gamma FIGURA N° Representacién de la molécula de hemoglobina HEMOGLOBINA Jobina grupo hemo iproteina) Los atomos de Fe tienen 6 enlaces de coordinacién, 4 para los nucleos pirrélicos del hemo, 1 para el N de la cadena polipeptidica, y 1 que se une reversiblemente al O2. A medida que aumenta la presion de Oz, los 4 grupos hemo se unen respectivamente a 1 molécula de oxigeno. Cada gramo de hemoglobina fija 1,36 ml de O2: es la capacidad de O, de la hemoglobina. En su sintesis debemos considerar la sintesis del hemo y de la globina. Sintesis del grupo hemo: se realiza en todas las células de la serie eritroide, excepto los eritrocitos maduros. Sintesis de la globina: se produce en el citoplasma de los eritroblastos y de los reticulocitos. Destruccién de los eritrocitos y degradacién de la hemoglobina: desde el momento en que un eritrocito entra en la circulacién y pierde su ARN, sufre de forma gradual cambios metabélicos a lo largo de sus 120 dias de vida. La célulamenos viable, que empieza a envejecer, es retirada de circulacién por las células del sistema mononuclear fagocitico, alli se desintegra en sus tres constituyentes: Fe-Protoporfirina-Globinas. El hierro queda depositado y puede ser utilizado nuevamente; en la protoporfirina el anillo se desdobla, se convierte en bilirrubina (se excreta como urobilinégeno fecal) mas CO; y con respecto a las globinas, las cadenas polipeptidicas son degradadas y devueltas al pool de aminoacidos. La Hb debe ser el unico pardmetro a emplear para definir si hay 0 no anemia; es decir, sdlo si las cifras de Hb son inferiores a los valores normales puede asegurarse que existe anemia. FUNCION DE LA HEMOGLOBINA La funcién de la Hb es el transporte de O» desde lugares donde la presién del mismo es elevada (pulmones) hacia los tejidos donde es baja El Fe de la hemoglobina se mantiene en forma ferrosa, si se oxida a su estado fétrico, como en la hemiglobina o metahemoglobina, pierde su capacidad de combinacién con el O> y el didxido de carbono. La hemoglobina con el Fe sin asociar con el O, es Hb reducida, oxigenada es Hb oxidada. Hb+0, 0 = HbO> Fijacién reversible del oxigeno A.una tensién de 2 de 100 mm Hg (capilares pulmonares) el 95-98% de la Hb se combina con el Q2, mientras que a una tensién de 20 mm Hg (tejidos) el O2 se disocia facilmente. DERIVADOS DE LA HEMOGLOBINA Las dos Hb fisiolégicas, oxiHb y Hb reducida, se convierten con facilidad en una serie de compuestos derivados por la accién de sustancias oxidantes y reductoras, el calor y otros agentes. Su presencia en altas concentraciones se puede distinguir en el espectrofotémetro, pero para pequerias concentraciones deben realizarse ademas pruebas gasométricas y colorimétricas. * Metahemogiobina (Hi): en condiciones normales se forma continuamente pero es reducida inmediatamente por enzimas eritrocitarias, por lo que su concentracion es un 1,5% a 2% de la Hb total. El Fe ++ se oxida a Fe +++ por lo que es incapaz de unirse al oxigeno. En condiciones patolégicas su aumento se debe a deficiencias de enzimas como la — glutation Hb reductasa, metahemoglobina reductasa (enzimas de la glucdlisis), presencia de sustancias oxidantes de la sangre, o en tratamientos con sulfonas, utlizados en dermatologia. * Sulfohemoglobina (SHb): es otro pigmento hemoglobinico, su concentracin es menor al 1%. En presencia de O», la Hb reacciona con SH; (sulfuro de H) para formar un derivado verdoso de SHb, sustancia estable e irreversible, incapaz de transportar Oz, pero si CO. Puede formarse en respuesta a un stress oxidativo; luego se produce la desnaturalizacién de la Hb en forma de cuerpos de Heinz * Carboxihemoglobina (COHb): no fija el Oz por lo tanto no puede transportarlo. El CO producido en la degradacion del hemo a bilirrubina produce un 0,5 % del COHb de la sangre y se incrementa en la anemia hemolitica. La afinidad de la Hb por el CO es 250 veces mayor que por el OzDETERMINACION DE HEMOGLOBINA (Hemoglobinometria) La determinacién de la concentracién de Hb en sangre es fundamental para el diagnéstico de anemia, por ello se deben emplear metadologias fiables y basadas en las propiedades fisicoquimicas de la Hb. La concentracién de Hb de una solucién puede calcularse por medicién de su color, de su poder de combinacién con el oxigeno 0 con el mondxido de carbono o por su contenido en hierro. Existen métodos colorimétricos, gasométricos, densimétricos y quimicos. Desde 1.967, el Comité Internacional de Estandarizacién en Hematologia (ICSH) recomienda el método colorimétrico de la cianmetahemoglobina basado en el calculo de la absorbancia (A) luminica de una solucién de Hb transformada previamente en un derivado coloreado. Método colorimétrico de la clanmetahemogiobina o clanhemiglobina (CNHI): De elecoién en la practica diaria, presenta las siguientes ventajas: > Testigo estable: que es una solucion de CNHi cuyas propiedades fisicoquimicas han sido definidas por el ISCH y reconocidas por la OMS. Se procesa como la muestra y permite el control de las condiciones de trabajo, reactivo, operador y aparato. > La reaccidn es rapida, la banda de absorcién a 540 nm es amplia y plana lo que permite una buena lectura empleando fotocolorimetro 0 espectrofotometro. > El producto cianmetahemoglobina (CNHI) es un pigmento estable. > El pH de la reaccién permite el dosaje de todos los hemocromégenos excepto la SHb > Con el agregado de NaHCO3 el pH de 9 bajé a 7,2, desarrollandose la reaccién en sdlo 3 minutos. > La incorporacién de un tensioactivo no iénico elimina la turbidez producida por las proteinas y lisa los eritrocitos. Los inconvenientes son > Inestabilidad del reactivo: las preparaciones comerciales mantienen separados el cianuro del ferricianuro y la mezclan en el momento de preparar el reactivo de trabajo, que dura 6 meses (el cianuro es oxidado por el ferricianuro a cianato reduciéndose a su vez a ferrocianuro). > El uso de sales de cianuro, pero las concentraciones usadas son mucho menor a la dosis letal para una persona de 70 kg. Fundamento del método: la sangre se diluye con una solucién de ferricianuro de potasio y cianuro de potasio (CNK). El primero oxida las Hb (excepto la SHb) a metahemoglobina o hemiglobina (Hi, el Fe++ pasa a Fe+++) que a su vez reacciona con el CNK pata dar el cianuro de hemiglobina o cianmetahemogiobina (CNHi), pigmento estable, que se lee a 540 nm. Hemoglobina + ferricianuro de K — metahemoglobina (Hi) Hi + cianuro de K > cianmetahemoglobina (HICN) pigmento estable que se lee a 540 nm Muestra: sangre capilar 0 venosa recogida con anticoagulante (K2EDTA).4 Conservacién de la muestra: a 4°C (2°-10°C) en refrigerador es estable varios dias. Es importante llevar a temperatura ambiente en el momento de la prueba. No se debe congelar. Reactivo: se lo debe conservar al abrigo de la luz, dura 6 meses. No se debe congelar. Interferencias y causas de error: proteinas plasmaticas anormales, hiperlipemias, grandes leucocitosis, éxtasis prolongado en las extracciones de sangre venosa, exceso de presion en muestras capilares, errores de pipeteo o dilucién, exposicién de reactivos y muestras a la luz Técnica Blanco Estandar Desconocido Reactivo de Hb [~ 5 mL 5 mL SmL HO. dest 20 HL Estandar de Hb 20 pL Muestra 20 pL. Mezclar los tubos y luego de 3 minutos leer en espectrofotometro a 540 nm, llevando el aparato a 0 con HO> destilada. El color es estable por 24 hs. CAlculo de los resultados: Hemoglobina g/L = Absorbancia x factor factor = Estandar g/L. Absorbancia Estdndar g/L: contenido de Hb correspondiente al lote en uso. El uso del cianuro de potasio se ha considerado como un riesgo potencial; por eso, se han propuesto reactivos alternativos inocuos como la azida sédica y el lauril sulfato sédico, que convierten la hemoglobina en azidahemoglobina y en sulfato de hemoglobina respectivamente. Se utilizan en algunos sistemas automatizados, pero no hay patrones estables disponibles y son también sustancias toxicas que deben manejarse con cuidado. VALORES DE REFERENCIA: dependen de la edad, sexo, altitud sobre nivel del mar, régimen alimenticio y otros factores individuales. A 2.000 metros puede aumentar 10 g/L, a 3.000 metros 20 g/L, dependiendo siempre de la duracién y continuidad del grado de hipoxia. También esta relacionado con el ejercicio fisico, con el que puede aumentar hasta un 15 g/L. En el embarazo puede disminuir por la hemodilucion sangre de cordon 137-201 1-3dias 145 - 225 4/semana 125 - 205 2 meses. 110-140 6 meses 100 - 150 tao 90 - 146 Saiios 100 - 155 107-155 mujeres 120-160 varones, 140-180HEMATOCRITO Resulta de la relacién entre el volumen de eritrocitos y el volumen de sangre total. Existen los métodos manuales donde este volumen se obtiene centrifugando la sangre en determinadas condiciones y en tubos especiales, como veremos mas adelante, y los métodos electrénicos donde se obtiene por calculo. Los primeros se basan en medir el empaquetamiento de la columna de eritrocitos cuando la sangre total anticoagulada se somete a la accién de una fuerza centrifuga. > Método por centrifugacion Muestra: sangre entera obtenida con anticoagulante KsEDTA Microhematocrito: Se utilizan tubos capilares (microhematocrito) de 7 cm de largo y 1 mm de diémetro que vienen con anticoagulante (heparina 1-2 Ultubo, marca roja), con los que se puede trabajar directamente con sangre capilar. y tubos sin anticoagulante (marca azul). Se llenan por atraccién capilar hasta no menos de 2 cm del otro extremo y se cierran a la llama. Se colocan en la centrifuga especial para microhematocrito, que produce campos de 8.000 a 12.000 rpm lo que reduce el tiempo de centrifugacin a 5 minutos. Cuando el hematocrito (Hto) es mayor de 0,5 puede ser necesario centrifugar durante otros 5 minutos. Los tubos no estan graduados, se emplea un abaco 0 lector de Hto; se regula el 0 con el comienzo de la columna de GR y el 100% con el nivel superior del plasma. Si no disponemos del abaco podemos usar una regla milimetrada y una lupa (Figura N°2). Constituye el método de referencia si se realiza en las condiciones recomendadas por el ICSH. > Métodos electronicos Con los instrumentos automatizados la derivacién del recuento de glébulos rojos (GR), Hto y volumen corpuscular medio (VCM) estan estrechamente relacionados. El pasaje de una célula a través de la apertura de un contador de impedancia oa través del rayo de luz en los instrumentos de dispersién luminica, genera un pulso eléctrico cuya altura es proporcional al volumen celular. El ntimero de pulsos generado determina el recuento de GR. El andlisis de la altura del pulso permite la determinacién del VCM o del Hto. Si se computa el promedio de la altura del pulso, este indica el VCM y el Hto puede ser derivado multiplicando el VCM. estimado por el recuento de GR. Similarmente, si las alturas de los pulsos son sumadas, esta figura indica el Hto y el VCM se calcula, en cambio, por divisién del Hto en el numero de GR. Cuando el Hto se obtiene por calculo presenta una diferencia de 1 0 2 unidades menos (1,5%-3% menor que el valor del microhematocrito centrifugado). Algunos autores lo denominan Hto real, porque no existe el factor de dilucién del plasma atrapado entre los GR. Causas de error en la determinacién del Hto: = La muestra con EDTA se puede conservar hasta 24 hs a 4°C, si la dejamos a temperatura ambiente los GR se hinchan y entre las 6 hs y 24 hs el Hto aumenta.+ Se recomienda el uso del K-EDTA, porque el Ks-EDTA produce la contraccion Ge los eritrocitos, reduciendo el Hto en cerca de un 2% + Relacién sangre/anticoagulante incorrecta. Un exceso de EDTA produce contraccién celular y por lo tanto disminuye el Hto * Extraccién defectuosa de la muestra (hemoconcentracién, hemodilucién, hemélisis). » Homogenizacién defectuosa de la sangre antes de llenar los tubos. * Fuerza centrifuga inadecuada o temperatura de centrifugacién excesiva (mayor de 40°C), » Existencia de alteraciones electroliticas 0 proteicas del plasma, leucocitosis intensa 0 alteraciones del equipo electrénico. * Variaciones inherentes el material de vidrio (variaciones en los didmetros interiores de los tubos), FIGURA N°2: Abaco utilizado en la lectura del microhematocrito APARATOS PARA LABORATORIOS E INDUSTRIAS San Luis 3147 (1186) Buenos Aires Tols.: (01) 961-1887 / 7283 / 0635 "10 4 3 i _4 a 30 : 2 a i J 0 0 ABACO PARA LA LECTURA DE MICROHEMATOCRITOS CAPILARESVALORES DE REFERENCIA DEL HEMATOCRITO Sangre de cordon 0,46- 0,60 13 dias 0.48 -0,68 1'semana 0,44- 0,60 2meses 0,31 -0,45 6 meses 0.31-0,41 taio 0,30 -0,40 5 afios 0,32 -0,42 8-43 afios 0,34 -0,44 Adultos mujeres 0,37 -0.47 varones 0,42 -0,52 VALORES DE REFERENCIA DE ERITROCITOS ‘Sangre de cordén 1 5,2 1-3 dias 0 5.6 semana 0 5.2 2meses 8 45 6 meses 3 46 Tafio 5 46 2-5 afios: 3 46 6-12 afios 4 46 ‘Adultos -Mujeres 2 46 -Hombres 0 5.2 INDICES HEMATIMETRICOS Los indices hematimétricos son valores absolutos que resultan de la relacién entre el numero de GR, el Hto y la concentracién de Hb. Son utiles en la clasificacién morfolégica de las anemias, en su diagnéstico y tratamiento. Volumen corpuscular medio (VCM): es el volumen medio de cada GR expresado en femtolitros. (1fL = 10 litros) VCM = Hematocrito(L/L) / N* de GR (x10"7L) Ejemplo: Si el Hto es 0,45, quiere decir que 1 L de sangre posee 0,45 L de eritrocitos. Si el recuento de GR es de 5 x 10/L, el volumen ocupado por cada uno. de ellos sera:VCM= 045LL_ =90x10"°L=90fL 5x10" Si el VCM es menor o igual a 80 fL se considera microcitosis, si el VCM es mayor 0 igual a 100 fL macrocitosis y mayores a 110 fL se considera megalocitosis: si esta comprendido entre 82 y 95 la poblacién es normocitica Hemoglobina corpuscular media (HCM): es la Hb contenida en cada GR expresada en picogramos (1 pg = 10° gramos) HCM = Hemoglobina (g/L) / N° de GR (x10"/L) Ejemplo: Si la muestra contiene 150 g/L de Hb y 5 x 10"/L de GR, la hemoglobina de cada GR sera: e HCM= 150q/L__ = 30x 10 g = 30 pg 5x 1077 Se hablara de hipocromia y normocromia cuando el valor de la HCM sea subnormal 0 normal, respectivamente Concentracién de hemoglobina corpuscular media (CHCM): es la concentracién media de Hb por cada L de eritrocitos (sin considerar el plasma, no confundir con L de sangre) CCMH = Hemoglobina (g/L) / Hematocrito (L/L) Ejemplo: Si la concentracién de Hb es 150 g/L y el Hto es 0,45 L/L, la CHCM sera: CHCM= _150q/_ = 333 g/l 0,45 UL VALORES DE REFERENCIA DE LOS iNDICES HEMATIMETRICOS SEGUN LA EDAD Recien nacido 95-125 fL 30-42 pg 300-400 g/L 1 semana 95-115 fl 30-42 pg 300-340 g/L 1-2 meses 83-107 fL. 27-37 pg 310-360 g/L 1-7 afios 76-92 fL 23-31 pg 320-360 g/L 8-13 aos 80-94 fL 27-32 pg 320-360 g/L adultos 80-95 fL 27-32 pg 320-360 g/L En las técnicas manuales los indices son calculados, en el recuento automatico se miden simultaneamente con el recuento de hematies. La CHCM es la constante globular mas confiable cuando se usa método manual, por que relaciona dos determinaciones precisas, la Hb y el Hto. Disminuye en las anemias microciticas hipocrémicas y es normal en las macrociticas. La CHCM es independiente del tamafio de los GR, en la esferocitosis por ejemplo estaaumentada pues los GR pierden superficie para un mismo volumen, sin un descenso proporcional de Hb. En las anemias megaloblasticas es normal, lo que aumenta en este caso es la HCM Amplitud de Distribucién Eritrocitarla (ADE) (en Inglés, Red blood cell Distribution Width, RDW): el contador hematolégico realiza una curva de distribucién del tamafio (VCM) de los GR (histograma), donde grafica en las abscisas el VCM medido en femtolitros (fL) y en las ordenadas la frecuencia relativa de los volumenes, expresada en porcentaje (%). Es un indice de anisocitosis, ya que mide la variacion de volumen celular. Se puede expresar como coeficiente de variacién (ADE-CV 6 RDW-CV) 6 como desvio estandar (ADE-DE 6 RDW-DE). -El ADE-CV se calcula directamente a partir del histograma como el coeficiente de variacién (CV) de la distribucién del volumen eritrocitario, con valores de referencia de 11,5-14,8 % (Figura N°3) ADE-CV 6 RDW-CV = _DE_ x 100 DE: desviaci6n estandar vcM FIGURA N° 3: ADE-CV 0 RDW-CV en el histograma de GR 60.65%] ROW-CY = 1SDx100 MC -El ADE-DE 6 RDW-SD es el ancho de la distribucion de aritmética de eritrocitos medida en el 20% de la altura de la curva eritrocitaria, informado en fL con un intervalo de referencia de 37-54 fL (Figura N°4). FIGURA N° 4: ADE-CV 0 RDW-CV y ADE-DE 0 RDW-SD en el histograma de GR10 ADE expresado como CV tiene cierto valor para distinguir entre la deficiencia de hierro (ADE usualmente aumentado) y el rasgo talasémico (ADE usualmente normal); y entre la anemia megaloblastica (ADE frecuentemente aumentado) y otras causas de macrocitosis (ADE mas frecuentemente normal). MORFOLOGIA ERITROCITARIA La observacién microscépica de un extendido de sangre bien realizado y teflido es imprescindible en el estudio etioldgico de toda anemia. En ciertas anemias constituye un procedimiento de muchisimo valor diagndéstico (esferocitosis hereditaria, eliptocitocis congénita, anemia hemolitica microangiopatica 0 mecanica). Ante una anemia de origen desconocido, resulta util valorar la intensidad de la policromatofilia (indice de reticulocitosis), anisopoiquilocitosis con dacriocitos y presencia de algunos eritroblastos (metaplasia mieloide), punteado baséfilo (saturnismo, talasemia), y anillos de Cabot y cuerpos de Howel-Jolly (diseritropoyesis, postesplenectomia). Las alteraciones morfolégicas eritrocitarias se clasifican en 4 grupos: Alteraciones del tamajio Alteraciones del color Alteraciones de la forma Presencia de inclusiones vv VARIACIONES DE TAMANO DE LOS ERITROCITOS El diametro promedio de un GR es de 7.5 jim, y el espesor de 2 um en los bordes y 1,2 um en el centro. Las diferencias de tamafio se perciben directamente en el frotis con una observaci6n atenta del diametro de los efitrocitos en el mismo. Como guia, el tamafio de un GR normal (GR normocitico) parece ser el mismo que el del nticleo de un linfocito pequefio en el extendido. Actualmente las variaciones del tamafio se basan en los datos cuantitativos de VCM, obtenidos en el contador hematolégico. Los términos utilizados en su informe son Anisocitosis: hay una variacién del tamario de los GR, que se traduce en el extendido por la coexistencia simultanea de eritrocitos de diametros desiguales En el contador hematolégico se indica por un aumento de ADE. Microcitos: hay una disminucién del volumen. Se observan en las anemias ferropénicas, en las talasemias y en la anemia de trastomos crénicos. VCM< 80 fL Macrocitos: hay un aumento de volumen, persiste la zona clara central. Se observan en hepatopatias y alcoholismo. VCM 100 fL a 109 fL Megalocitos: hay un aumento de volumen, son ovalados, sin zona clara central. Se observan en las anemias megaloblasticas. VCM> 110 fL.1 VARIACIONES EN LA COLORACION DE LOS GLOBULOS ROJOS Los hematies normales presentan un color rosado mas intenso en los bordes que en el centro, poniendo de relieve la distribucién y el contenido de Hb. En general las variaciones del color se deben a trastornos en el contenido de hemoglobina Los términos utilizados para su descripcién son: Normocromos: hematies con tincién normal, centro mas claro que la periferia Hipocromos: es consecuencia de la disminucién del contenido de Hb, con la coloracién convencional, se tirien débilmente, la parte central aparece mas grande y mas palida. La HCM y CHCM estan generalmente disminuidas, se ven en anemias ferropénicas (defecto en la sintesis del Hemo por deficit de Fe) y en las talasemias (defecto en la sintesis de globina) Hipercromos (seudohipercromia): los GR pierden su palidez central y se tifien mas profundamente (esferocitos y megalocitos), Isocromia: coloracion uniforme, todo el extendido presenta el mismo aspecto. Anisocromia (0 doble poblacién): presencia de células normocromas e hipocromas en la misma extension de sangre (luego de transfusiones o de tratamiento con Fe). Discromia: distribucién irregular de la Hb en el eritrocito (leptocitos, células en diana o target cells). Policromatofilia: tincién gris azulada en eritrocitos de mayor tamatio y sin la palidez central. Esto se debe a la presencia de RNA residual, lo que indica células. jévenes. Con la coloracién vital de azul brillante de cresilo se pone en evidencia la existencia de reticulocitos (Anemias regenerativas: anemias hemoliticas y hemorragicas agudas) VARIACIONES DE LA FORMA DE LOS ERITROCITOS Un examen minucioso del extendido sanguineo sigue siendo el mejor método para estudiar la morfologia del GR. La forma normal y necesaria para sus funciones es la de disco bicdncavo; éste puede adoptar oiras formas ya sea por alteraciones de la composicion de la membrana, de la Hb, del medio ambiente, etc. La variacion de la forma del eritrocito se denomina poiquilocitosis (Figura N°6) Estos cambios de forma se pueden producir: a) por un defecto en la eritropoyesis, hereditario 0 adquirido: diseritropoyesis b) por un defecto en el eritrocito, hereditario 0 adquirido: eritropatia. Entre las alteraciones de las formas mas frecuentes podemos citar: Esferocito: eritrocito esférico sin palidez central, hay una disminucién de la superficie manteniendo el volumen (aqui el defecto se presenta en el citoesqueleto del GR). Conservan el VCM y la HCM, la CHCM esta aumentada. Se presentan en la Esferocitosis hereditaria, 0 en procesos en que hubo lesion12 celular de origen fisico o quimico, y en la anemia hemolitica del recién nacido por incompatibilidad ABO. Codocitos (dianocitos o target cells): estas células tienen un exceso de membrana, es decir hay ganancia de superficie con respecto al volumen, y en la regién central aparece un area con mayor contenido de Hb. Se observan en las hemoglobinopatias (talasemias, hemoglobinopatia C), anemias ferropénicas y en ciertas hepatopatias, que cursan con aumento de colesterol y fosfolipides de membrana del eritrocito. Acantocitos: son eritrocitos esferoidales con prominencias superficiales alargadas, de distribucién irregular, también presentan exceso de membrana, es decir hay un aumento en la relacion Sup/Vol. Esto ocurre en casos de deficiencia de la enzima lecitin colesterol acil transferasa (LCAT), que al no esterificar el colesterol, éste no puede salir y se acumula. En el extendido se observan acantocitos en la Acantocitosis hereditaria, en la insuficiencia hepatocelular grave, y también en la post esplenectomla, ya que al no existir el bazo no se remueven ios pedazos de membranas excedentes. Estomatocitos: eritrocitos que en su regién clara central posee una hendidura en forma de boca. En el frotis se observan en la enfermedad conocida como Estomatocitosis congénita, que cursa con una alteracidn de la bomba Na/K (con aumento de entrada de agua, que produce un aumento en el volumen del eritrocito). También se observan en cirrosis y en alcoholismo, y en algunas eritroenzimopatias. Equinocitos (crenocitos 0 glébulos rojos espiculados): son eritrocitos cuya superficie se encuentra repleta de prominencias superficiales cortas, distribuidas regularmente. Se observan como artefactos de la coloracién, o por la hiperosmolaridad de la misma; por envejecimiento del GR in vitro, por descenso de ATP. También se pueden presentar debido a un defecto en la membrana (predominio exagerado de los complejos de espectrina polimerizada), a deficiencia de piruvatokinasa y en casos de insuficiencia renal Esquizocitos 0 esquistocitos: son fragmentos celulares de diversas formas (triangulares, alargadas, en casco) y de diémetro muy pequefio. Se producen por darios en la microcirculacién (en las microangiopatias), en las anemias hemoliticas de origen mecanico (prétesis valvulares), y en todo proceso en que se produzea un impacto del GR Eliptocitos (u ovalocitos): son eritrocitos alargados u ovales, se producen por defectos hereditarios en la composicién de la membrana. Se encuentran en la Eliptocitosis hereditaria, aunque pueden observarse de forma adquirida en el curso de una talasemia, en deficiencia de Fe, en anemia megaloblastica y en la Mielofibrosis medular. Presentan discromia: hay acumulo de Hb en las puntas de los GR. Drepanocitos (0 eritrocitos falciformes): su aparicién es propia de la presencia de hemoglobina S, que en ausencia de oxigeno, produce una polimerizacién de la13 Hb, que precipita en forma de cristales, dando la forma de célula en forma de hoz © media luna. Dacriocitos (0 célula en ldgrima): son eritrocitos en forma de lagrima o raqueta. Indican sufrimiento medular, se observan en trastomos de la eritropoyesis (anemia ferropénica, megaloblastica, talasemia), y fundamentalmente en la mielofibrosis medular. Excentrocitos: eritrocitos con distribucién anormal de la Hb, esta aparece como desplegada de la parte intema de la membrana y concentrada en uno de los extremos. Suele aparecer en anemias hemoliticas inducidas por agentes oxidantes (medicamentos 0 sustancias quimicas) y en el déficit de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa Leptocitos 0 anulocitos: son hematies de espesor muy disminuido, que se presentan en la deficiencia severa de hierro o en las talasemias. Los eritrocitos podrian colorearse como anillos de Hb con una gran zona central casi incolora Células mordidas (bite cells): son eritrocitos que han perdido una parte de la membrana celular. Varias mordidas acaban produciendo fragmentos de hematies. Se observan en la deficiencia de glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, donde se produce la formacién de cuerpos de Heinz, los que son répidamente eliminados por el bazo dando lugar a la aparicién de las “bite cells”. INCLUSIONES ERITROCITARIAS Punteado Basofilo: es la presencia de agregados baséfilos abundantes que varian desde puntos hasta grnulos, que con la coloracién convencional se colorean de azul oscuro. Se debe a la precipitacién de RNA persistente en los eritrocitos. Se trata de una patologia madurativa. Se observan cuando existe un defecto en la degradacién del ARN (déficit de pirimidina-5-nucleotidasa eritrocitaria). En el saturnismo (intoxicacién con plomo) existe un déficit adquirido de esta enzima, que puede ser la causa del punteado baséfilo. También se ve en las diseritropoyesis, anemias megaloblasticas y talasemias. Cuerpos de Howell Jolly: granulos azuréfilos de ADN residual, son lisos y Tedondeados, desde pequefios a grandes. Se observan en las anemias megaloblasticas, como signo periférico de eritropoyesis ineficaz. Anillos de Cabot: estructuras en forma de anillo, ocho o asa formadas por restos de los microtubulos del huso acromatico, que quedan luego de una mitosis anormal. Se observan en anemias por trastornos de la eritropoyesis Siderocitos: presencia de granulaciones de Fe inorganico, hay un trastorno en la sintesis de la Hb pero no por déficit de Fe, sino por una alteracién en la sintesis del grupo Hemo. Se encuentran en la Anemia siderobléstica. Se observan usando la coloraci6n de Perls.14 Eritrocitos nucleados: son eritroblastos circulantes y su presencia constituye un signo de intensa regeneracién eritroblastica, se observan en anemias hemoliticas agudas Granulaciones por pardsitos: |a parasitosis intraeritrocitaria mas caracteristica es el paludismo o malaria, en la que durante los procesos febriles pueden observarse a los parasitos, en las formas anulares con un pequeiio nucleo central ‘También pueden encontrarse las babesias en forma intraeritrocitaria. Otras inclusiones: la Hb desnaturalizada precipita dentro del GR. Puede aparecer como un cuerpo nico de inclusién adherido a la membrana eritrocitaria, en este caso toma el nombre de Cuerpos de Heinz, tipioos de las Hb inestables y del déficit de glucosa-6-fosfato deshidrogenada; 0 como inclusiones multiples redondas y pequefias azul-verdosas, distribuidas por todo el citoplasma, éstas se pueden observar tipicamente en las alfa talasemias, representan la hemoglobina H (tetramero de cadenas de globinas beta B,), también se los denomina eritrocitos en forma de pelota de golf. Ambas inclusiones se observan con coloraciones supravitales como el azul brillante de cresilo. FIGURA N°6: Variaciones de color, tamaiio y forma del GR e inclusiones eritrocitarias, | Dianocitos Eliptocttos. —-Drepanocitos. —_Acantocitos y ovalocitos e 2| lee! [0 77|| 0! |0° Esquistocilos _Cétulas Cuerpos de mordidas Howell Jolly15 VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR (VSG) La VSG es equivalente a la longitud de! recorrido descendente de los glébulos Tojos (desde la parte superior del tubo 0 pipeta) en un intervalo de tiempo. La VSG forma parte de las pruebas de respuesta de la fase aguda y de la fase activa de las afecciones crénicas junto a la Proteina C reactiva, fibrinégeno y viscosidad del plasma, La velocidad de caida se halla influenciada por una serie de factores que interaccionan. Basicamente depende de la diferencia de gravedad especifica entre los hematies y el plasma, y la capacidad de los hematies para formar rouleaux (pila de moneda), que sedimentan mas rapido que los hematies solos. La formacién de rouleaux esta controlada principalmente por la concentracién de fibrindgeno y otras proteinas de fase aguda Por lo tanto, la VSG esta influenciada tanto por factores plasmaticos como eritrocitarios, siendo los primeros més importantes. “Factores plasmaticos: niveles elevados de fibrinégeno y en menor medida de alfa, beta y gamma globulinas favorecen la aceleracién de la VSG. Estas proteinas de asimetria molecular disminuyen la carga negativa de los eritrocitos (potencial Z) que tiende a separarios, y promueve el apilamiento o formacién de pila de moneda que sedimentan mas rapido que las células aisladas. La presencia de albumina disminuye la VSG *Factores eritrocitarios: tamatio y forma de los GR, la VSG es directamente proporcional al peso del agregado celular e inversamente proporcional al area superficial. El apilamiento de GR acelera la VSG, pues tenemos unidades de mayor tamatio y peso, pero con superficie disminuida. Los GR de forma anormal dificultan la formacién de rouleaux, por lo tanto disminuye la VSG, de la misma forma los microcitos que presentan una menor superficie con relacién al volumen. *Factores técnicos: 1) Anticoagulantes: usamos citrato u oxalato que no alteran el potencial Z, a diferencia de la heparina y el EDTA 2) Hemdlisis 0 indicios de coagulacién: son inadecuados para la prueba. 3) Tiempo de extraccién y realizacién de la prueba: antes de 2hs, pues con el tiempo los GR tienden a adoptar forma esférica con menos posibilidades de formar apilamiento, lo que retrasaria la VSG. 4) Temperatura ambiente: entre 22° y 27°C; menores retardan, mayores aceleran. No exponer a la luz solar. 5) Tubos de eritrosedimentacién: se debe eliminar todo indicio de alcohol y éter, también de sangre para evitar aglutinaciones con sangre compatible. Deben estar perfectamente calibrados (entre 2-5 mm), limpios y al llenarlos evitar la formacién de burbujas. 6) Verticalidad del tubo, éste no debe estar inclinado, basta una inclinacién de 7° para duplicar un resultado.16 FASES DE LA VSG 1) Periodo inicial de agregacién, aqui los GR se apilan y la sedimentacion es lenta. Dura 10 minutos. 2) Perlodo de sedimentacién, caida répida y constante de los GR. Dura 40 minutos. 3) Periodo final, de apilamiento de GR en el fondo del tubo. Dura 10 minutos. METODOS DE DETERMINACION DE LA VSG > Método de Westergreen: es el mas usado y el mas exacto. El equipo minimo necesario consta de pipetas y soporte para pipetas. Las pipetas tienen las. siguientes caracteristicas: 2,5 mm de diametro, capacidad de 1 mL, y una graduaci6n de 0-200 en mm REACTIVO: Citrato de Na al 3,8 % (solucién isotonica para realizar dilucién de la sangre) MUESTRA: sangre venosa anticoagulada directamente con el reactivo. TECNICA: en un tubo con 0,5 mi de anticoagulante, se agrega 2 mL de sangre (dilucién 1/5), es decir 1 parte de citrato por 4 de sangre, y se mezcla, Antes de las 2 hs se debe cargar la pipeta hasta la marca 0, se coloca en el soporte en forma vertical, sin espuma, apretada en la base de goma y el extremo superior introducido en el resorte que la sostiene. Se anota el tiempo y se lee los mm que sedimentan los GR al cabo de 1 hora (h). VALORES DE REFERENCIA: expresado en mm/h Nifios: 0-10 Varones: < 50 afios 0-15 > 50 afios 0-20 Mujeres: < 50 afios 0-20 > 50 afios 0-30 > Micrométodo de Chattas: es el de eleccién en bebés y nifios, o en pacientes adultos con venas dificiles. El equipo consta de pipetas [diametro: 1 mm, largo: 13 cm] y soporte para pipetas. REACTIVO: citrato de Na al 3,8% MUESTRA: sangre venosa 0 sangre capilar obtenida por puncién del talon o dedo de la mano, con todas las precauciones para favorecer la circulacion sanguinea fluida. TECNICA: se carga citrato de Na hasta la letra C, luego se aspira la muestra hasta S, se deposita en un portaobjeto el contenido de la pipeta, se mezcla y se llena hasta 0. Se coloca en el soporte y se lee a los 60 minutos. Los valores de este método no son andlogos a los de Westergren, por lo tanto, para su conversion se recurre a la siguiente tabla17 TABLA DE CONVERSION DEL METODO DE CHATTAS AL DE WESTERGREEN (deducido del nomograma de Chattas) 1 2 3 a 5 6 7 8 9 120 Mas de 120 > VSG descartable: En la actualidad hay equips comerciales descartables, que presentan tapones de seguridad para las pipetas, y que permiten que la sangre alcance la marca 0 con exactitud, eliminando el error del llenado manual hasta la marca 0. Ademas, transforma las pipetas en un sistema cerrado, minimizando la contaminacién con las muestras (Figura N°5). FIGURA N°5: Sistema descartable para VSG 'REBALSADOR ee TAPON. PERFORABLE, as ué OE oukee / i — | |18 > VSG automatizada: Existen en el mercado, nuevos sistemas que consiguen una completa automatizacién del proceso. Entre los mas empleados se destacan: Ves-Matis 60 (Menarini), Sediscan (Becton-Dickinson) y Sedimatic 100 (Ral). Los tres realizan un mezclado automético de la muestra con el anticoagulante y finalizan el proceso a los 30 min de su inicio. Tienen capacidad para 50 a 100 tubos, los volimenes de muestra oscilan entre 1 y 5 mL, y la expresion de los resultados es en mm/h. Todos ellos permiten ademas de reducir el tiempo, eliminar la contaminacién biolégica del personal técnico, disminuir el numero de errores y mejorar la reproducibilidad. El sistema Ves-Matic, es un analizador de mesa, disefiado para determinar la VSG, mediante un sensor optoelectrénico que mide el cambio de opacidad de una columna de sangre a medida que sedimentan los GR. Los tubos se colocan en el aparato, la aceleracion de la sedimentacién se logra al colocar los tubos en un Angulo de 18° con respecto al eje vertical, y los resultados que se obtienen a los 20 minutos son compatibles con el método de Westergren en 1 h SITUACIONES QUE MODIFICAN LA VSG: A) Aumento de la VSG: 4) Fisiolégicas:_embarazo, puerperio, crecimiento, envejecimiento, estado del ciclo menstrual, consumo de drogas (anticonceptivos, corticoides) 2) Patolégicas: infecciones agudas 0 crénicas, procesos inflamatorios crénicos (sifilis, TBC, AR, LES), donde se utiliza como indice de progreso de la enfermedad; anemias intensas, presencia de crioaglutininas, enfermedades neoplasicas, infarto de miocardio, insuficiencia renal, gammapatias monocionales (mieloma, enfermedad de Waldestron) B) Disminucion de la VSG: 1) Policitemia vera 2) Alteraciones congénitas eritrocitarias (poiquilocitosis, esferocitosis, células falciformes) 3) Hipofibrinogenemia 4) Insuficiencia cardiaca congestiva 5) Mecanismo desconocido19 GARANTIA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO DE HEMATOLOGIA La garantia de calidad comprende a todas aquellas acciones planificadas y sistematicas necesarias para proporcionar adecuada confianza de que un producto, proceso o servicio cumple determinados requerimientos para la calidad. EI control de calidad (CC) nos asegura que cada resultado informado laboratorio sea valido y confiable. El objetivo del CC es alcanzar pre exactitud. Para ello se basa en 4 pilares fundamentales 1. Control de calidad interno 2. Evaluacion externa de calidad 3. Esténdares y estandarizacion 4. Vigilancia de la calidad Conceptos basicos: Error aleatorio: error que afecta la reproducibilidad de un método (precision) Error sistematico: error no aleatorio que afecta la media de una poblacién de datos. Exactitud: se refiere a la capacidad de un método analitico de obtener el resultado verdadero. Precision: se refiere a la reproducibilidad de un resultado, ya sea exacto o inexacto. La inexactitud y la imprecision ocurren como resultado de estandares y reactivos inadecuados, calibracién incorrecta de los instrumentos, o técnica pobre, © el uso de un método que da una reaccién incompleta o inespecifica para la prueba La precision puede ser controlada por pruebas replicadas, chequeos de especimenes previamente medidos y evaluacién estadistica de los resultados. La exactitud puede ser controlada sélo con el uso de materiales de referencia que han sido ensayados por métodos independiente de precisién conocida. Un programa de control de calidad incluye el control de calidad interno y una evaluacién de calidad externa El control de calidad interno esté basado en el monitoreo de las pruebas hematolégicas que se realizan en el laboratorio. Incluye medidas de materiales especialmente preparados y medidas repetidas de los especimenes de rutina, también como analisis estadisticos, dia a dia, de los datos obtenidos. Este control chequea la precision o reproducibilidad pero no necesariamente la exactitud La evaluacién externa de calidad es la evaluacién objetiva de una agencia externa del desemperio de un numero de laboratorios sobre un material que es suministrado especialmente para este propdsito. Usualmente es organizado por entidades nacionales o regionales. E! objetivo es equiparar los resultados, pero nuevamente no necesariamente se logra exactitud a menos que los especimenes hayan sido ensayados por un laboratorio de referencia, usando métodos de precisién conocida, con una preparacién de referencia de valor conocido Un material estandar o preparacién de referencia se define como un material 0 sustancia con una o mas caracteristicas lo suficientemente homogéneas y perfectamente establecidas. Es usado para calibrar instrumentos analiticos y para asignar un valor cuantitativo a los calibradores.20 Un material de control se define como una sustancia usada de forma rutinaria en el laboratorio para monitorear el desempefio de un proceso analitico. Un método de referencia es una técnica exactamente definida la cual provee suficiente seguridad y datos precisos para ser usado en la evaluacién de la validez de otros métodos. Las principales autoridades internacionales sobre los esténdares en hematologia es la Organizacién Mundial de la Salud y el International Council for Standartization in Haematology (ICSH) CONTROL DE CALIDAD INTERNO (CC!) EI CCI es el conjunto de procesos que proveen una vigilancia continua de los procedimientos analiticos que se llevan a cabo en el laboratorio y de la evaluacion de los resultados, con el objeto de decidir si son lo suficientemente confiables para ser emitidos. Incluye: 1. Medicién de materiales de control 2. Mediciones repetidas sobre muestras de pacientes 3. Analisis estadistico, dia a dia, de los datos obtenidos en las pruebas de rutina 4) Analisis de material comercial preservado: son provistos por los fabricantes y se usan tres niveles de control diferentes: bajo, medio y alto. Se analizan por lo menos una vez al dia. Al principio se trabaja con los valores provistos por el fabricante, y luego de un nimero de determinaciones que permitan aplicar métodos estadisticos, se obtienen los valores de dispersion de los materiales de control, medidos en el propio aparato. Es conveniente hacer graficos de control para visualizar las tendencias. Estos materiales tienen sus inconvenientes: > Son estables por sélo 30-90 dias > Son especificos para cada tecnologia empleada > Son costosos 2)Examenes repetidos de muestras conservadas de los pacientes: los resultados deben haber sido obtenidos con la certeza que el sistema estaba bajo control. Tienen la ventaja de que se utiliza sangre fresca y el uso de dicho material aporta informacion sobre la imprecisién pero no sobre la exactitud. Sirven como controles en el mismo dia, aunque algunos extienden su uso hasta 24 horas. Tienen como desventaja la falta de estabilidad de algunos pardmetros como el VCM, el recuento total y diferencial de leucocitos y el recuento de plaquetas. La Hb y el recuento de GR son estables durante 24 horas. Este procedimiento sirve para detectar deterioro del aparato y reactivos que podria haberse desarrollado entre las pruebas, si los especimenes fueron bien conservados durante el almacenamiento. 3) Andlisis estadistico: al correr los controles, si todos los valores directamente medidos se encuentran dentro de las 2 DE de la media, es factible que el andlisis, esté bajo control. Si cualquier resultado de control se encuentra a mas de 3 DE de la media tomar acciones correctivas. Si 2 de 3 resultados de control estan a mas de 2 DE de la media, tomar acciones correctivas. En los laboratorios que usan métodos manuales se usa la CHCM, para el CCI. Se establecen las medias diarias de 11 dias de trabajo consecutivos de trabajo y se determina la DE. Luego la media de CHCM se calcula al final de cada dia. Si no varia en mas de 2 DE se considera que el resultado es satistactorio, ya que no hay un error simultaneo en la misma direccién en hemoglobina y hematocrito.21 CONTROL DE CALIDAD EXTERNO (CCE) A pesar de tener implementado un programa de control de calidad interno hay efrores que sdlo pueden ser detectados con una evaluacién externa. Centros regionales o nacionales envian el mismo material a un gran numero de laboratorios. Luego todos los laboratorios envian sus resultados al centro donde seran analizados e interpretados Con los resultados enviados se calcula la media y la DE. Un laboratorio individual puede comparar su desemperio en la enouesta con los otros laboratorios que usan analizadores iguales o similares. Los datos del CCE pueden emplearse para 4) Establecer el error sistematico caracteristico de un método 2) Establecer una clasificacion de los métodos existentes en funcién de su nivel de calidad 3) Escoger un método entre varios o descartar un método por su nivel de calidad 4) Averiguar cudles son los métodos mas utilizados 5)En relacién a la evaluacion del laboratorio participante, permite el andlisis continuo y a largo plazo del error sistematico de las mediciones BIBLIOGRAFIA * Diagnéstico citolégico de las hemopatias. Grignaschi. Ed. Médica Panamericana. 1991. * Diagnéstico y tratamiento clinico. John Bernard Henry. 9* edicién. Ed. Masson. 1993 * Dacie y Lewis Hematologia Practica. S. M. Lewis, B. Bain, |. Bates. 10° edici6n. Churchill y Livingstone. 2008 * Manual de técnicas de laboratorio en hematologia. Vives J y Aguilar J. 2° edicién. Ed. Masson. 2006. + Hematologia. Fundamentos y Aplicaciones Clinicas. Rodak B. 2 edicién. Ed Medica Panamericana. 2005. * Fundamentos de Hematologia. G.J. Ruiz ArgUelles. 4° edici6n. Ed. Médica Panamericana. 2009 * Informe automatizacién del hemograma: Entre la ayuda, la confusién y la controversia. Carbia C, Fink N y Lazarowski A. XIX Congreso de Hematologia. 2009